ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Κλινικές Κλινικοεργαστηριακές Ιατρικές Ειδικότητες» Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας Διευθυντής: Καθηγητής Δημήτριος Καρδαμάκης «ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΚΤΙΝΟΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΦΑΙΝΟΜΕΝΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΤΗΡΟΥΝΤΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΙΟΝΤΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΧΑΜΗΛΗΣ ΔΟΣΗΣ. Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΞΗ» Διδακτορική Διατριβή ΜΑΡΙΑ Δ. ΜΑΡΤΙΝΟΥ Ιατρός-Ακτινοθεραπεύτρια Ογκολόγος Πάτρα 2013

2 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΚΑΡΔΑΜΑΚΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, Καθηγητής Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπων καθηγητής). ΚΟΥΚΟΥΡΑΚΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, Καθηγητής Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Αλεξανδρούπολης. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, Καθηγητής Ιατρικής Φυσικής, Πανεπιστημίου Πατρών. ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΚΑΡΔΑΜΑΚΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, Καθηγητής Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών. ΚΟΥΚΟΥΡΑΚΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, Καθηγητής Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Αλεξανδρούπολης. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, Καθηγητής Ιατρικής Φυσικής, Πανεπιστημίου Πατρών. ΚΑΛΟΦΩΝΟΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ, Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, Καθηγητής Νευροχειρουργικής, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών. ΖΟΛΩΤΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ, Αναπλ Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομίας, τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών. ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ, Καθηγήτρια Μοριακής Φαρμακολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών. 2

3 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Α. Δημοσιεύσεις σε περιοδικά Martinou M.,Giannopoulou E., Malatara G., Argyriou A.A., Kalofonos H.P. and Kardamakis D., Ionizing radiation affects epidermal growth factor receptor signalling and metalloproteinase secretion in glioma cells. Cancer Genomics Proteomics, 8(1):33-8, Β. Ανακοινώσεις σε συνέδρια 1. Μ. Μαρτίνου, Ε. Γιαννοπούλου, Φ. Τζωρτζίδης, Χ.Π. Καλόφωνος, και Δ. Καρδαμάκης, Μελέτη του φαινομένου εκ διαφυγής (Bystander effect/abscopal effect ) σε κύτταρα πλειόμορφου γλοιοβλαστώματος, 3 0 Πανελλήνιο Διεταιρικό Αντικαρκινικό Συνέδριο, Απριλίου, Μ. Μαρτίνου, Ε. Γιαννοπούλου, Γ.Μαλαταρά, Χ.Π. Καλόφωνος, και Δ. Καρδαμάκης In vivo μελέτη του φαινομένου εκ διαφυγής σε κύτταρα πλειόμορφου γλοιοβλαστώματος, 9 ο Πανελλήνιο συνέδριο ακτινοθεραπευτικής ογκολογίας. Αλεξανδρούπολη Ιουνίου,

4 Ευχαριστίες Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί μέρος μιας σημαντικής έρευνας και εργασίας που επιτελείται τα τελευταία χρόνια στο τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, καθώς και στο Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας. Η διατριβή αυτή δεν θα μπορούσε να έχει εκπονηθεί χωρίς τη συμβολή και συνεργασία αρκετών άξιων επιστημόνων τους οποίους θα ήθελα να ευχαριστήσω. Αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω τη βαθειά μου ευγνωμοσύνη και εκτίμηση προς το πρόσωπο του Δασκάλου και Καθηγητή μου, κου Δημητρίου Καρδαμάκη, ο οποίος υπήρξε ο εμπνευστής της ιδέας της παρούσας διατριβής και τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη συνεχή και αδιάλειπτη επιστημονική του καθοδήγηση και επαγρύπνηση καθώς και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Τον ευχαριστώ επίσης θερμά, διότι ως δάσκαλος, από τα πρώτα βήματα της καριέρας μου διαμόρφωσε την επιστημονική μου ταυτότητα και με ενέπνευσε να αγαπήσω την ειδικότητα μου, αλλά κυρίως με δίδαξε να την ασκώ συνετά, ταπεινά και με αξιοπρέπεια. Θα ήθελα να εκφράσω θερμές ευχαριστίες στα μέλη της συμβουλευτικής επιτροπής, τον Καθηγητή Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης κο Μιχαήλ Κουκουράκη και τον Καθηγητή Ιατρικής Φυσικής του Πανεπιστημίου Πατρών κο Γεώργιο Παναγιωτάκη για τη συμβολή τους στη περάτωση της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής για τη συμβολή τους στη διόρθωση και τελική διαμόρφωση της μελέτης αυτής. Σημαντική και ουσιαστική ήταν επίσης η συμβολή του Καθηγητή Παθολογικής Ογκολογίας κου Χαράλαμπου Καλόφωνου για τη διάθεση των χώρων και της υποδομής του Εργαστηρίου Κλινικής Ογκολογίας όπου και πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα της παρούσας διατριβής. Ιδιαίτερης αξίας ήταν και η συμβολή της Ακτινοφυσικού του Τμήματος μας κας Γεωργίας Μαλαταρά την οποία ευχαριστώ για τις επιστημονικές λύσεις στους προβληματισμούς μoυ. Τέλος θα ήθελα να σταθώ ιδιαιτέρως στην αμέριστη βοήθεια που έλαβα από τη Δρ κα Ευσταθία Γιαννοπούλου Χημικό του Πανεπιστημίου Πατρών, τόσο στο στάδιο της εργαστηριακής έρευνας όσο και στη συγγραφή της μελέτης. Την ευχαριστώ από καρδιάς. 4

5 Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφιερώνεται στο σύζυγο μου Σταύρο και τον γιο μου Νικόλα που με την αγάπη, την κατανόηση και την υπομονή τους με στήριξαν στην ολοκλήρωση αυτής μου της προσπάθειας. Αφιερώνεται επίσης στους γονείς μου, τη μητέρα μου Αναστασία και τον προσφάτως εκλιπόντα πατέρα μου Δημήτριο για τις αρχές και το ήθος που με δίδαξαν. Η απουσία του πατέρα μου στη σημαντική αυτή στιγμή της ζωής μου με γεμίζει θλίψη, η ανάμνηση του αποτελεί φάρο για τη ζωή μου. 5

6 Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή Γενικό Μέρος 1.2 Η επίπτωση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας στο κύτταρο Βιολογικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας στο DNA Βιολογικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας στην κυτταρική μεμβράνη Χρωμοσωμικές ανωμαλίες ωφελούμενες στην ακτινοβολία Ακτινοβολία και καρκινογένεση Δομικές αλλαγές στο DNA και μεταλλαξιογένεση Επιδιόρθωση του DNA Ακτινο-προκλητές μεταλλάξεις Διερεύνηση του αρχικού συμβάματος στην καρκινογένεση από ακτινοβολία Ογκογονίδια και όγκο- κατασταλτικά γονίδια Γενετικές αλλοιώσεις έμμεσα σχετιζόμενες με την ακτινοβολία που οδηγούν σε καρκινογένεση Γενετική αστάθεια από ακτινοβολία Ακτινοβολία και κυτταρικός θάνατος Επιδιόρθωση των κυτταρικών βλαβών που προκαλεί η ιοντίζουσα ακτινοβολία 1.3 Το φαινόμενο εκ διαφυγής Ορισμός Τεκμηρίωση του φαινομένου εκ διαφυγής Χαρακτηριστικά του φαινομένου εκ διαφυγής Ο μηχανισμός του φαινομένου εκ διαφυγής Πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής με επικοινωνία μέσω χασματοσυνδέσμων (gap junctions) Πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής με μεταφορά κυτταρικού μέσου Σήματα που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής 6

7 1.3.8 Ο ρόλος της κυκλο-οξυγενάσης-2 (COX-2) στην επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής Ο ρόλος του παράγοντα NF-kB (nuclear factor kb) στο φαινόμενο εκ διαφυγής Η επίπτωση των κυτταροκινών στο φαινόμενο εκ διαφυγής Ο ρόλος των ελευθέρων ριζών στο φαινόμενο εκ διαφυγής Ο ρόλος των μιτοχονδρίων στο φαινόμενο εκ διαφυγής Συνοπτικό μοντέλο του φαινομένου εκ διαφυγής 1.4 Το φαινόμενο εκ διαφυγής στην κλινική πράξη Η σημασία του φαινομένου εκ διαφυγής στην ακτινοθεραπεία Το φαινόμενο εκ διαφυγής και η καρκινογένεση Εφαρμογή του φαινομένου εκ διαφυγής στην ακτινοπροστασία Παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής 1.5 Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) EGFR και ακτινοβολία Η προγνωστική αξία της υπέρ-έκφρασης του EGFR Αναστολή της δράσης του EGFR 1.6 Μεταλοπρωτεϊνάσες O ρόλος των MMPs στην ογκογένεση MMPs της μεμβράνης (Membrane-Type) Γελατινάσες (Gelatinases) Στρωμελυσίνες (Stromelysins) Κολλαγενάσες (Collagenases) Ειδικό Μέρος 2.1 Σκοπός 2.2 Υλικό και μέθοδος Καλλιέργεια ανθρώπινων καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων 7

8 2.2.2 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο ΝEUBAUER Μέθοδοι ακτινοβόλησης για in vitro μελέτη του φαινομένου εκ διαφυγής Έλεγχος της επίδρασης της ακτινοβολίας στο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μελέτη της απόπτωσης Προσδιορισμός του φωσφορυλιωμένου EGFR Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών (αντίδραση Bradford) Ζυμογράφημα για τη μελέτη της ποσότητας της μεταλλοπρωτεϊνασών 2 (MMP-2) που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 2.3 Αποτελέσματα Κυτταρικός πολλαπλασιασμός Άμεση επίδραση χαμηλών δόσεων ακτινοβολίας Έμμεση επίδραση της ακτινοβολίας σε με ακτινοβολημένα κύτταρα Απόπτωση Φωσφορυλιωμένο EGFR (phegfr) Προσδιορισμός εκκρινόμενων μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) 2.4 Συζήτηση 2.5 Συμπεράσματα Περίληψη Summary Βιβλιογραφία 8

9 1. Εισαγωγή Η ακτινοβιολογία μελετά τα φαινόμενα που προκαλούνται από την ιοντίζουσα ακτινοβολία. Για χρόνια η επιστήμη αυτή βασίζονταν στο δόγμα ότι τα βιολογικά φαινόμενα παρατηρούνται μόνο στα κύτταρα από όπου διέρχεται η ακτινοβολία. Ωστόσο, κατά την τελευταία δεκαετία, έχουν προκύψει στοιχεία από πολλές ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες που δείχνουν βλάβη σε μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων από αυτά που πλήττονται άμεσα από την ακτινοβολία. Το φαινόμενο αυτό έχει ονομαστεί φαινόμενο «εκ διαφυγής» (Bystander effect) και βασίζεται στη διαπίστωση ότι βιολογικά φαινόμενα όπως θραύσματα της διπλής έλικας του DNA, σχηματισμός μικροπυρήνων, γονιδιακή αστάθεια και αναστολή του κυτταρικού κύκλου παρατηρούνται και σε κύτταρα που δεν αποτελούν τον άμεσο στόχο της ακτινοβολίας. Το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει καταγραφεί κυρίως σε πειράματα in vitro με πολύ χαμηλές δόσεις α-σωματιδίων αλλά και μετά από συμβατική ακτινοβόληση (ακτίνες Χ, ακτίνες γ) σε χαμηλές αλλά και συμβατικές δόσεις. Οι μηχανισμοί του φαινομένου εκ διαφυγής είναι περίπλοκοι και επί του παρόντος ανεπαρκώς κατανοητοί. Πιστεύεται ότι μοριακά σήματα που απελευθερώνονται από τα ακτινοβολημένα κύτταρα προκαλούν μεταβολές στα μη ακτινοβολημένα γειτονικά κύτταρα. Τα μοριακά σήματα μπορούν να μεταδοθούν μέσω χασματοσυνδέσμων (gap junction) και μέσω του εξωκυττάριου υλικού. Η φύση των παραγόντων που μεταφέρονται ποικίλει και παραμένει αδιευκρίνιστη. Είναι πιθανό, το φαινόμενο εκ διαφυγής να έχει σημαντική επίπτωση στον κίνδυνο της υγείας που απορρέει από την έκθεση σε ακτινοβολία. Ενδεχομένως, το φαινόμενο αυτό να προκαλεί επιπλοκές στον οργανισμό ή εντοπισμένες παρενέργειες στους ιστούς στο πεδίο ακτινοβόλησης ακόμα και σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας. Παράγοντες που εκπέμπονται από τα ακτινοβολημένα κύτταρα μπορεί να οδηγήσουν σε γενετική αστάθεια, μεταλλάξεις, και σε δεύτερο χρόνο σε καρκινογένεση. Επιπλέον, οι παράγοντες αυτοί ενδεχομένως να έχουν ρόλο στην πρόκληση αλλά και την διατήρηση των παρενεργειών που παρατηρούνται στους φυσιολογικούς ιστούς μετά από ακτινοβολία. Το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να είναι δυνητικά επιβλαβές ή χρήσιμο στην ακτινοθεραπεία. Η αύξηση της βλάβης στα καρκινικά κύτταρα που δεν 9

10 ακτινοβολούνται άμεσα ή η έναρξη της διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων αυξάνουν τον θεραπευτικό λόγο. Ωστόσο, όταν τα καρκινικά κύτταρα που ακτινοβολούνται εκκρίνουν μοριακούς παράγοντες που προκαλούν βλάβη στις παρακείμενες δομές τότε το φαινόμενο εκ διαφυγής είναι επιβλαβές και αυξάνει τις παρενέργειες στους φυσιολογικούς ιστούς. Το γεγονός αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό στις τεχνικές της σύγχρονης ακτινοθεραπείας, όπως τη 3D-CRT και την IMRT οι οποίες αποβλέπουν στη μείωση της δόσης της ακτινοβολίας στους φυσιολογικούς ιστούς. Για τους παραπάνω λόγους, η κλινική σημασία του φαινομένου εκ διαφυγής καθώς και η αξία του στην ακτινοθεραπεία παραμένουν υπό συζήτηση. 10

11 1.2 Η επίπτωση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας στο κύτταρο Σύμφωνα με τη θεωρεία του στόχου (target theory) προκειμένου να προκληθεί κυτταρική βλάβη, η ακτινοβολία θα πρέπει να πλήξει μία ευαίσθητη περιοχή των κυττάρων[1],[2]. Εφόσον η ακτινική βλάβη δεν επηρεάζει ευαίσθητες κυτταρικές δομές δεν μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο. Είναι κοινός αποδεκτό ότι το DNA του πυρήνα αποτελεί έναν σημαντικό στόχο της ακτινοβολίας που μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Σύμφωνα με μελέτες η βλάβη του DNA είναι 3000 φορές πιο αποτελεσματική από τη βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης για τη καταστροφή των κυττάρων in vitro[3]. Ωστόσο όπως έχει δειχθεί και η κυτταρική μεμβράνη μπορεί να αποτελέσει στόχο της ακτινοβολίας και σε αρκετές περιπτώσεις να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο[4;5]. Όταν ένας ιστός απορροφήσει ιοντίζουσα ακτινοβολία, δεσμεύει ενέργεια που οδηγεί στη παραγωγή ηλεκτρονίων ταχείας παλινδρόμησης. Τα ηλεκτρόνια αυτά μπορούν να προκαλέσουν βλάβη είτε άμεσα, επιδρώντας στο DNA, είτε έμμεσα μέσω παραγωγής ελευθέρων ριζών (σχήμα 1), οι οποίες μπορούν να προκαλέσουν θραύσματα στις έλικες του DNA. Φορτισμένα σωματίδια υψηλής γραμμικής ενεργειακής μεταφοράς (LET) όπως το 3 He 2+ ή α-σωματίδια προκαλούν κυρίως άμεση βλάβη ενώ ακτινοβολία χαμηλής LET (ακτίνες γ και χ) προκαλεί έμμεση βλάβη μέσω δράσης ελευθέρων ριζών[6]. Σχήμα 1: Άμεση και έμμεση επίδραση της ακτινοβολίας. Στην άμεση δράση ένα δευτερογενές ηλεκτρόνιο (e - ), το οποίο προήλθε από την απορρόφηση ενός φωτονίου, αλληλεπιδρά με το γενετικό υλικό (DNA) προκαλώντας μία αλλαγή. Στην έμμεση δράση, το δευτερογενές ηλεκτρόνιο αντιδρά με ένα μόριο, πχ Η 2 Ο και παράγει μία υδροξυλική ρίζα (ΗΟ. ) η οποία στη συνέχεια προκαλεί βλάβη στο DNA. Η έμμεση δράση είναι χαρακτηριστική για τις λιγότερο ιοντίζουσες ακτινοβολίες όπως είναι η ακτινοβολία Χ (E.J. Hall: Radiobiology for the Radiologist, 5 th Ed). 11

12 Οι ελεύθερες ρίζες είναι μη δεσμευμένα άτομα ή μόρια τα οποία έχουν ένα μονήρες τροχιακό ηλεκτρόνιο στην εξωτερική τους στοιβάδα. Σε ένα άτομο ή μόριο με συζευγμένα ηλεκτρόνια οι περιστροφές των ηλεκτρονίων εξισορροπούνται ανά δυο ενώ αντίθετα όταν υπάρχει μονός αριθμός ηλεκτρονίων υπάρχει ένα ηλεκτρόνιο στην εξωτερική στοιβάδα του οποίου η περιστροφή δεν εξισορροπείται από άλλο ηλεκτρόνιο και η κατάσταση αυτή χαρακτηρίζεται από σημαντικού βαθμού χημική αστάθεια. Κατά την ακτινοβόληση ιστών, όπου ένα πολύ μεγάλο μέρος τους είναι νερό, τα φωτόνια ακτίνων Χ αλληλεπιδρούν με τα μόρια του νερού και μπορούν να προκαλέσουν ιοντισμό των μορίων αυτών: H 2 O H 2 O.+ + e -. Η ιοντική ρίζα του H 2 O.+ αλληλεπιδρά με άλλο μόριο H 2 O και σχηματίζουν την ισχυρά δραστική ελεύθερη ρίζα HO., H 2 O + H 2 O.+ H 3 O + + HO.. Η ρίζα του υδροξυλίου μπορεί να διαχυθεί σε μικρές αποστάσεις και να προσεγγίσει διάφορους στόχους στο κύτταρο. Εκτιμάται ότι περίπου το 65% των καταστροφών που προκαλούν οι ακτίνες Χ στο DNA στα κύτταρα των θηλαστικών οφείλονται στην ελεύθερη ρίζα ΟΗ Βιολογικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας στο DNA Το DNA αποτελεί τον κύριο στόχο της ακτινοβολίας και συνοδεύεται από βιολογικά αποτελέσματα όπως τον κυτταρικό θάνατο, την απόπτωση, μεταλλάξεις και καρκινογένεση. Οι σημαντικότερες βλάβες στο DNA μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία είναι, τα θραύσματα μονής έλικας (single strand brakes SBs) που παρατηρούνται κυρίως μετά από την εναπόθεση ακτινικής ενέργειας στην έλικα του DNA, τα θραύσματα διπλής έλικας (double strand brakes DSBs) και οι βλάβες στις βάσεις του DNA που παρατηρούνται όταν η ακτινοβολία πλήττει τις βάσεις της πουρίνης και της πυριμιδίνης του DNA[7] (σχήμα 2). 12

13 Σχήμα 2: Οι τρείς πιθανοί τύποι της βλάβης του DNA από την ακτινοβολία (E.J. Hall: Radiobiology for the Radiologist, 5 th Ed) Στο ακέραιο DNA τα θραύσματα του μονού κλώνου έχουν μικρή βιολογική σημασία και σπανίως οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο δεδομένου ότι επιδιορθώνονται γρήγορα χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο τον αντίθετο κλώνο (σχήμα 3). Ωστόσο όταν η επιδιόρθωση αυτή είναι ανακριβής μπορεί να οδηγήσει σε μετάλλαξη. Σχήμα 3: Μονό και διπλό σπάσιμο της έλικας του DNA, το οποίο προκαλείται από την ακτινοβολία. Α. Δισδιάστατη παρουσία του φυσιολογικού DNA με διπλή έλικα. Β. Ένα σπάσιμο σε μία έλικα είναι μικρής σημασίας, επειδή επιδιορθώνεται γρήγορα χρησιμοποιώντας την αντίθετη έλικα σα μήτρα. Γ. Σπασίματα και στις δύο έλικες, τα οποία αν και καλά διαχωρισμένα, επιδιορθώνονται σαν δύο ανεξάρτητα. Δ. Αν τα σπασίματα έχουν συμβεί και στις δύο έλικες και είναι αντίθετα ή χωρισμένα από λίγα κοντινά ζευγάρια βάσεων, αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διπλό σπάσιμο της έλικας και η χρωματίδα να σπάσει σε δύο κομμάτια. (E.J. Hall: Radiobiology for the Radiologist, 5 th Ed) 13

14 Σε περιπτώσεις όπου παρατηρείται θραύση και των δυο κλώνων του DNA (DSBs) εφόσον τα ανοίγματα είναι καλώς διαχωρισμένα η επιδιόρθωση επιτυγχάνεται γρήγορα σαν να ήταν δυο ανεξάρτητα ανοίγματα (σχήμα 3). Σε αντίθετη περίπτωση όταν δηλαδή τα θραύσματα στους δυο κλώνους είναι αντίθετα το ένα του άλλου ή όταν διαχωρίζονται από λίγα ζεύγη βάσεων παρατηρείται σπάσιμο της διπλής έλικας. Το σπάσιμο της διπλής έλικας αποτελεί τη πιο σημαντική βλάβη που δημιουργείται στα χρωμοσώματα από την ακτινοβολία και μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο, μεταλλάξεις ή καρκινογένεση. Η ακτινική βλάβη στο DNA μπορεί να επιδιορθωθεί. Διακρίνουμε 3 τύπους επιδιόρθωσης: η επιδιόρθωση χωρίς λάθη, είναι επιλεκτική επιδιόρθωση και δεν συνοδεύεται από μεταλλάξεις ή θνητότητα. Η επιδιόρθωση με λάθη μπορεί να οδηγήσει σε θανατηφόρες ή μη μεταλλάξεις, ενώ η ατελής επιδιόρθωση δεν συνοδεύεται από επανάκτηση της συνέχειας στην αλληλουχία του DNA και για το λόγο αυτό μπορεί να θεωρείται θανατηφόρα [8]. Όταν τα θραύσματα του DNA δεν επιδιορθώνονται μπορεί να προκύψουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Διακρίνουμε πολλούς τύπους χρωμοσωμικών ανωμαλιών με μερικούς να είναι θανατηφόροι (ασταθείς ανωμαλίες δακτύλιοι, θραύσματα) και άλλους μη θανατηφόρους (σταθερές ανωμαλίες αμοιβαίες μετακινήσεις). Οι μη θανατηφόρες βλάβες μπορεί να οδηγήσουν σε καρκινογένεση. Οι ασταθείς ανωμαλίες μπορεί να οδηγήσουν στο σχηματισμό μικροπυρήνων οι οποίοι είναι τα αποτέλεσμα του διαχωρισμού έκκεντρων τμημάτων ή ολόκληρου χρωμοσώματος κατά τη μίτωση, και είναι συνήθως ορατοί στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της πρώτης μίτωσης μετά από την έκθεση στην ακτινοβολία[9]. Τα κύτταρα μπορεί να ανταποκριθούν άμεσα στην ακτινοβολία μέσω ενεργοποίησης ποικίλων βιολογικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν έναρξη μετάδοσης σημάτων, ενεργοποίηση γονιδιακής μεταγραφής και αναστολή κυτταρικού κύκλου. Οι πρώιμες αυτές μεταβολές προκαθορίζουν και τις απώτερες επιπτώσεις της ακτινοβολίας. Ανάλογα με την αποτελεσματικότητα του μηχανισμού επιδιόρθωσης τα τραυματισμένα κύτταρα μπορεί να οδηγηθούν σε νέκρωση, απόπτωση, θάνατο μέσω πολλαπλασιασμού, πρώιμη διαφοροποίηση ή μπορεί να επιβιώσουν και τελικά να πολλαπλασιαστούν[8]. Απώτερα αποτελέσματα της ακτινοβόλησης μπορεί να καταγραφούν σε απόγονους των ακτινοβολημένων κυττάρων πολλές γενεές μετά από την ακτινοβόληση. Εφόσον ένα κύτταρο επιβιώνει και πολλαπλασιάζεται τότε η αρχική 14

15 βιολογική απάντηση στην ακτινοβόληση μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική διαφοροποίηση να μειώσει τη διάρκεια επιβίωσης, να προκαλέσει γενετική αστάθεια [10] ή καρκινογένεση [11] Βιολογικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας στην κυτταρική μεμβράνη Η ιοντίζουσα ακτινοβολία έχει σημαντική επίδραση στη δομή αλλά και στη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης. Η δομή της κυτταρικής μεμβράνης επηρεάζεται από την ακτινοβόληση λόγο της αλληλεπιδράσεις των λιπιδίων της μεμβράνης με ρίζες ΗΟ., ιόντα Η+ και ηλεκτρόνια. Οι ελεύθερες αυτές ρίζες δρουν άμεσα στα μόρια των λιπιδίων και οδηγούν στο σχηματισμό υπεροξειδίων των λιπιδίων καθώς και προϊόντων καταβολισμού αυτών όπως α και β ακόρεστες αλδεΰδες. Η μεταβολή αυτή στη λιπιδιακή σύσταση της μεμβράνης έχει ως αποτέλεσμα τη μεταβολή στη διαπερατότητα της σε μικρά μόρια και ιόντα. Συνοψίζοντας οι δομικές αλλαγές της κυτταρικής μεμβράνης έχουν ως εξής : Τροποποίηση της ρευστότητας της μεμβράνης μέσω υπεροξείδωσης των λιπιδίων και μετάβασή της από μια φάση <υγρού κρυστάλλου> σε μια φάση ζέλης. Η παραπάνω διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της μεμβρανικής μικρογλοιώτητας και μείωση του πλάτους της διπλοστοιβάδας που οδηγεί σε απώλεια της πλαστικότητας της κυτταρικής μεμβράνης η οποία γίνεται πιο άκαμπτη. Η υπεροξείδωση των κυτταρικών λιπιδίων έχει ως αποτέλεσμα τη μεταβολή της διαπερατότητας της μεμβράνης σε ιόντα και μικρά μόρια. Καθώς η επιφάνεια της μεμβράνης γίνεται πιο άκαμπτη πολλά συστήματα μεταφοράς ιόντων και μορίων καταργούνται με άμεσο αποτέλεσμα την απώλεια της ομοιόστασης και τον κυτταρικό θάνατο. 15

16 1.2.3 Χρωμοσωμικές ανωμαλίες ωφελούμενες στην ακτινοβολία Οι μεταβολές που επιφέρει η ακτινοβολία στο κυτταρικό κύκλο είναι γνωστή στους ακτινοβιολόγους από την δεκαετία του Τα πιο χαρακτηριστικά φαινόμενα που παρατηρούνται σε όλα τα φυσιολογικά διπλοείδη κύτταρα των θηλαστικών μετά από έκθεση σε ακτινοβολία είναι η παράταση των φάσεων G2/M και της G1/S. Σε γενικές γραμμές τα κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία όταν βρίσκονται στις φάσεις M και G2 και πιο ανθεκτικά στη φάση S. Η παράταση της φάσης G2/M σύμφωνα με δεδομένα φαίνεται ότι οφείλεται στη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης κυκλίνη Β μετά από την έκθεση στην ακτινοβολία. Η καθυστέρηση της φάσης G2 αποκαθίσταται όταν τα επίπεδα της κυκλίνης Β επανέρχονται στα φυσιολογικά [12]. Ως επί τω πλείστο η επίδραση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας στα χρωμοσώματα έχει μελετηθεί στη φάση G1 όπου η δομή των χρωμοσωμάτων είναι πιο ευδιάκριτη. Συνοπτικά η θραύση της έλικας του DNA μετά από έκθεση σε ακτίνες Χ μπορεί να έχει τα ακόλουθα αποτελέσματα : Τα θραύσματα αποκαθίστανται στη αρχική τους μορφή με αποτέλεσμα στην επακόλουθη μίτωση να μην παρατηρείται χρωμοσωμική ανωμαλία. Τα θραύσματα δεν επανασυνδέονται και στην επακόλουθη μίτωση καταγράφεται χρωμοσωμική ανωμαλία η οποία αναγνωρίζεται ως διαγραφή. Τα θραύσματα συνδέονται με τυχαία ακολουθία και στην επόμενη μίτωση τα χρωμοσώματα που προκύπτουν εμφανίζουν σημαντικές δομικές αλλαγές. Με βάση τα παραπάνω η βιολογική σημασία των θραυσμάτων που προκύπτουν από την ακτινοβολία είναι άγνωστη. Σε γενικές γραμμές η ανωμαλίες κατατάσσονται σε δυο ομάδες τις χρωμοσωμιακές και τις χρωματιδιακές. Οι χρωμοσωμιακές ανωμαλίες παρατηρούνται όταν ένα κύτταρο ακτινοβοληθεί νωρίς στη μεσόφαση πριν τον χρωμοσωμικό διπλασιασμό. Στη περίπτωση αυτή τα θραύσματα που προκύπτουν στον ένα κλώνο της χρωματίνης οδηγούν στο σχηματισμό έτερου σπασμένου κλώνου κατά τον διπλασιασμό και ως εκ τούτου σε χρωμοσωμική ανωμαλία ενός ζεύγους χρωματιδικών κλώνων στην επόμενη μίτωση. 16

17 Οι χρωματιδιακές ανωμαλίες προκύπτουν όταν το κύτταρο ακτινοβοληθεί μετά τη μεσόφαση και αφότου το υλικό του DNA έχει διπλασιαστεί και τα χρωμοσώματα αποτελούνται από δυο κλώνους χρωματίνης. Με βάση τα παραπάνω είναι προφανές ότι οι βιολογικές επιπτώσεις της ακτινοβολίας στα κύτταρα εξαρτώνται από τη κυτταρική φάση του κύκλου που βρίσκονται όταν ακτινοβολούνται Ακτινοβολία και καρκινογένεση Η επίπτωση της ακτινοβολίας στην καρκινογένεση έγινε γνωστή άμεσα μετά την ανακάλυψη των ακτινών Χ από τον Roentgen το 1895 και το 1902 αναφέρθηκε για πρώτη φορά ανάπτυξη καρκίνου μετά από ακτινοβολία που αφορούσε μία εξελκωμένη περιοχή δέρματος. Τα αμέσως επόμενα χρόνια οι αναφορές παρόμοιων καρκινικών βλαβών αυξήθηκαν και το 1911 αναφέρθηκαν πέντε περιστατικά λευχαιμίας σε εργάτες που εκτίθονταν σε ακτινοβολία [13]. Πειραματικά μοντέλα για την μελέτη της οφειλόμενης στην ακτινοβολία καρκινογένεσης αναπτύχθηκαν μετά τον 2 ο παγκόσμιο πόλεμο ενώ μελέτες μεγάλης κλίμακας ακολούθησαν τις επόμενες τρείς δεκαετίες [14]. Οι μελέτες αυτές καθόρισαν πολλά από τα γενικά χαρακτηριστικά της οφειλόμενης στην ακτινοβολία καρκινογένεσης και τα αποτελέσματα τους υποστηρίχτηκαν από επακόλουθες επιδημιολογικές μελέτες με ανθρώπους που εκτίθονταν σε ακτινοβολία στον εργασιακό τους χώρο, για ιατρικούς λόγους ή εξαιτίας ατυχημάτων. Οι περισσότερες πληροφορίες προέρχονται από την μακροχρόνια παρακολούθηση των ασθενών που επιβίωσαν από την ατομική βόμβα στο Nagasaki και τη Hiroshima[15]. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η ακτινοβολία είναι ένα παγκόσμιο καρκινογόνο το οποίο θα οδηγήσει στην ανάπτυξη καρκίνου στους περισσότερους ιστούς και σε όλες τις ηλικίες συμπεριλαμβανομένου και των νεογνών. Ο χαρακτηρισμός της ακτινοβολίας ως ισχυρό καρκινογόνο βασίζεται στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της ιοντίζουσας ακτινοβολίας τα οποία την διαφοροποιούν από άλλους χημικούς-τοξικούς παράγοντες και φυσικά καρκινογόνα που η δράση τους καθορίζεται από τον ιστό. Σε αντίθεση με τα παραπάνω η ιοντίζουσα ακτινοβολία χαρακτηρίζεται από την υψηλή της κυτταρική διήθηση και μεταφορά ενέργειας στο εσωτερικό των κυττάρων ανεξάρτητα από τους κυτταρικούς φραγμούς που παρουσιάζονται σε χημικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό όλα τα κύτταρα του 17

18 ανθρώπινου σώματος είναι ευάλωτα στην ιοντίζουσα ακτινοβολία και ο βαθμός της κυτταρικής βλάβης καθορίζεται από φυσικές παραμέτρους όπως η δόση της ακτινοβολίας που πλήττει τα κύτταρα και τους ιστούς. Στη δεκαετία του 1970 αναπτύχθηκαν κυτταρικά συστήματα για τη μελέτη της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων in vitro [16];[17]. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών επιβεβαίωσαν τα συμπεράσματα που είχαν εξαχθεί σε προγενέστερες μελέτες με πειραματόζωα και πιο συγκεκριμένα την άποψη ότι η ακτινοβολία έχει μικρή καρκινογόνο και μεταλλαξιογόνο δράση συγκριτικά με συγκεκριμένους χημικούς παράγοντες όπως οι πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες, ωστόσο η δράση της επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από ποικίλους δευτερογενείς παράγοντες. Έως τη δεκαετία του 1980 ελάχιστα ήταν γνωστά ως αναφορά τα γενικά χαρακτηριστικά του ακτινο-προκλειτού καρκίνου in vivo και της κυτταρικής εξαλλαγής in vitro. Αντιθέτως, η έρευνα κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες είχε επικεντρωθεί στους κυτταρικούς και μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν τη δράση της ακτινοβολίας στα κύτταρα των θηλαστικών. Σε αυτά τα πλαίσια, η ιοντίζουσα ακτινοβολία έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που διέπουν τις βλάβες στο DNA και την επακόλουθη καρκινογένεση Δομικές αλλαγές στο DNA και μεταλλαξιογένεση Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει ευρέος φάσματος βλάβες στο DNA όπως βλάβες στις βάσεις των νουκλεοτιδίων, crosslinking και θραύση μονής ή διπλής αλύσου (double strand breaks-dsbs) στο DNA. Αρχικώς οι DSBs θεωρήθηκαν ως οι σημαντικότερες κυτταροτοξικές βλάβες, ενώ οι βλάβες στις βάσεις και πιο συγκεκριμένα στη θυμίνη συσχετίζονταν με την ανάπτυξη μεταλλάξεων. Στις μέρες μας, έχει πλέον αποδειχθεί ότι η ανορθόδοξη σύζευξη των DSBs αποτελεί τη πρωταρχικής σημασίας βλάβη για την ανάπτυξη χρωμοσωμικών ανωμαλιών και γονιδιακών μεταλλάξεων [18;19]. Το παραπάνω συμπέρασμα ενισχύεται από μελέτες όπου χρησιμοποιήθηκε ράδιο-σημασμένη με 125 I ιωδο-δεοξυουριδίνη ([ 125 I]Urd) η οποία συνδέονταν με το κυτταρικό DNA. To 125 I είναι ένα ραδιο-νουκλεοτίδιο με μεγάλη τάση απελευθέρωσης ηλεκτρονίων και η αποδόμηση του συνοδεύεται από ένα κύμα απελευθέρωσης 21 ηλεκτρονίων χαμηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό 18

19 ατόμου 21 πρωτονίων. Το [ 125 I]Urd θεωρήθηκε αρχικώς ότι είναι αποκλειστικά ένας ισχυρός κυτταροτοξικός παράγοντας. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το [ 125 I]Urd είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό στην πρόκληση κακοήθους εξαλλαγής [20] αλλά και ισχυρό μεταλλαξιογόνο [21]. Η καμπύλη δόσης-ανταπόκρισης για την πρόκληση μεταλλάξεων παρουσιάζεται στη γραφική παράσταση 1 όπου καταγράφεται και η συσχέτιση με άλλους τύπους ακτινοβολίας. Συγκριτικά με τις ακτίνες Χ το [ 125 I]Urd είναι πολύ πιο ισχυρό μεταλλαξιογόνο [21]. Τα παραπάνω αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η ατελής επιδιόρθωση των DSBs είναι σημαντική για την ανάπτυξη μεταλλάξεων. Πρόσφατες μελέτες της επίδρασης των ακτινών Χ στο DNA έχουν δείξει στοιχεία συρρεόντων βλαβών οι οποίες συνοδεύονται από μεγάλη πιθανότητα ανάπτυξης DSBs [18]. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η δράση της ακτινοβολίας συνοδεύεται από παραγωγή στενά σχετιζόμενων ιοντικών ζευγών. Περαιτέρω στοιχεία έχουν προκύψει από μοριακές μελέτες για τη σημασία των DSBs στην βιολογική επίδραση της ακτινοβολίας σε σειρές μεταλλαγμένων κυττάρων τα οποία παρουσιάζουν ελλιπή ικανότητα επιδιόρθωσης των απορρεόντων από την ακτινοβολία βλαβών [22] Επιδιόρθωση του DNA Σημαντική πρόοδος έχει καταγραφεί κατά την τελευταία δεκαετία ως προς την κατανόηση των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA και πιο συγκεκριμένα ως αναφορά την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στα συγκεκριμένα μονοπάτια. Το φαινόμενο της επιδιόρθωσης του DNA μέσω αντιγραφής όπου οι έλικες που φέρουν συγκεκριμένα γονίδια αντιγράφονται πιο γρήγορα από ότι το υπόλοιπο γονιδίωμα έχει χαρακτηριστεί και η συσχέτιση του με την ακτινοβολία έχει περιγραφεί [23]. Τέλος, η ανορθόδοξη σύζευξη γονιδίων που σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA έχει δειχθεί σε περιπτώσεις ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου. Η βιολογικώς σημαντικότερη βλάβη που παρατηρείται στο DNA των ακτινοβολημένων κυττάρων φαίνεται ότι είναι οι DSBs. Οι DSBs φαίνεται ότι επιδιορθώνονται μέσω μίας διαδικασίας όπου η ανάπτυξη λαθών είναι πολύ πιθανή. 19

20 Για τον λόγο αυτό, η ανάπτυξη πολλαπλών DSBs σε ένα ακτινοβολημένο κύτταρο συνοδεύεται από χρωμοσωμικές ανακατανομές και αλλαγές ευρείας κλίμακας Ακτινο-προκλητές μεταλλάξεις Παρότι η μεταλλαξιογόνος δράση της ακτινοβολίας είχε πρώτο-περιγραφεί από τον Muller το 1927 η μοριακή δομή των μεταλλάξεων στα κύτταρα των θηλαστικών έγινε γνωστή κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Προγενέστερες μελέτες με γονίδια HPRT είχαν δείξει ότι η ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει εστιακές μεταλλάξεις και αφαιρέσεις βάσεων με τις τελευταίες σε ορισμένες περιπτώσεις να αφορούν ολόκληρα γονίδια [24]. Ωστόσο, προκειμένου να προκύψουν βιώσιμα κύτταρα, το μέγεθος των μεταλλάξεων θα πρέπει να είναι περιορισμένο λόγο της παρουσίας παρακείμενων σημαντικών γονιδίων. Όταν αναπτύχθηκε ένα μοντέλο για τη μελέτη μεταλλάξεων σε μία αυτοσωμική περιοχή όπου εντοπίζονταν και τα δύο αντίγραφα ενός γονιδίου, δείχθηκε ότι η διαδικασία αφορά ευρείας κλίμακας αλλαγές με πιο συχνές εξ αυτών την απώλεια της ετεροζυγότητας (LOH) [25]. Αυτή η LOH ήταν συχνά εκτεταμένη και περιελάμβανε παρακείμενα γονίδια στο ίδιο χρωμόσωμα σε περιοχές πλησίον του γονιδίου στόχου [26]. Παρότι η LOH ήταν συνήθως το αποτέλεσμα μίας μόνο αφαίρεσης, σε ορισμένες περιπτώσεις έχει δειχθεί ότι παρατηρούνται διαδικασίες ανασύνθεσης [26;27]. Για τους παραπάνω λόγους, οι κύριες μοριακές- δομικές αλλαγές που παρατηρούνται σε ακτινο-προκλητές μεταλλάξεις αφορούν διαδικασίες ευρείας κλίμακας συμπεριλαμβανομένου των LOH ενός γονιδίου που μπορεί να εντοπίζεται και σε άλλες περιοχές σε ένα χρωμόσωμα. Οι κύριες μεταβολές που μπορεί να παρατηρηθούν αφορούν εξάλειψη γονιδίων, γονιδιακές μετατροπές και ανακατανομή χρωμοσωμάτων. Οι μεταλλαξιογόνες αυτές αλλαγές είναι αναμενόμενες μετά από DSBs. Με βάση τα παραπάνω το αρχικό σύμβαμα στην καρκινογένεση από ακτινοβολία είναι πιο πιθανό να αφορά απενεργοποίηση ενός όγκο- κατασταλτικού γονιδίου μέσω LOH παρά την ενεργοποίηση ενός πρώτο-ογκογονιδίου όπως το RAS. 20

21 % του συνόλου των μεταλλάξεων Διερεύνηση του αρχικού συμβάματος στην καρκινογένεση από ακτινοβολία Ογκογονίδια και όγκο- κατασταλτικά γονίδια Η αναζήτηση γενετικών αλλαγών που συνοδεύουν την έκθεση στην ακτινοβολία ήταν ιδιαίτερα απογοητευτική. Με βάση τα σημερινά δεδομένα οι μεταλλάξεις που οφείλονται στην ακτινοβολία δεν αναπτύσσονται σε συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος. Το φάσμα των μοριακών- δομικών αλλαγών που παρατηρούνται στις ακτινο-προκλητές μεταλλάξεις παρουσιάζει μεγάλο εύρος και διαφέρει σημαντικά από τις αυτόματες μεταλλάξεις όπου οι εστιακές μεταλλάξεις κυριαρχούν. Το γεγονός αυτό παρουσιάζεται στο σχήμα 4. Ωστόσο, όπως έχει φανεί σε μελέτες των ακτινο-προκλητών εστιακών μεταλλάξεων οι περιοχές θραύσης του DNA που οδηγούν σε αφαίρεση γονιδίων δεν παρουσιάζουν συγκεκριμένη εντόπιση[28]. Επιπλέον, οι γενετικές αλλαγές που παρατηρούνται στους ακτινοπροκλητούς όγκους δεν σχετίζονται αποκλειστικά με την ακτινοβολία. Εστιακές μεταλλάξεις Σύνολο αφαιρέσεων Μερικές αφαιρέσεις Αριθμός μεταλλάξεων CONTROL (Αυτόματες) Ακτίνες Χ (Άμεσες) Ακτίνες Χ (Όψιμες) Άλφα σωματίδια (Όψιμες) Σχήμα 4: Η μοριακή δομή των HPRT μεταλλάξεων σε CHO κύτταρα. Άμεσες μεταλλάξεις είναι αυτές που παρατηρούνται άμεσα μετά από ακτινοβολία στη περιοχή της βλάβης του DNA. Όψιμες μεταλλάξεις παρατηρούνται στους απόγονους των ακτινοβολημένων κυττάρων μετά από πολλές σειρές πολλαπλασιασμού. Τροποποιηθέν από Little JB. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis.2000 Mar;21(3):

22 Τα καρκινικά κύτταρα είναι ανευπλοϊδικά και περιέχουν πολλαπλές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Σε ορισμένες περιπτώσεις, συγκεκριμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες έχουν συνδυαστεί με ανάπτυξη συγκεκριμένων μορφών καρκίνου όπως οι λευχαιμίες. Ωστόσο, οι ανωμαλίες αυτές παρατηρούνται τόσο μετά από ακτινοβολία όσο και στις σποραδικές μορφές λευχαιμίας. Παρότι στην πλειοψηφία των ακτινοπροκλητών καρκίνων παρατηρούνται πολλαπλές χρωμοσωμικές μεταβολές, σε λίγες περιπτώσεις παρατηρούνται μετακινήσεις ή εξαιρέσεις που οδηγούν σε ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή όγκο-κατασταλτικών γονιδίων[29]. Καθότι ορισμένες μορφές καρκίνου που οφείλονται στην ακτινοβολία (όπως ορισμένες μορφές λευχαιμίας και τα σαρκώματα) παρατηρούνται μετά από αφαιρέσεις βάσεων στο DNA, έχει προταθεί ότι η αρχική μετάλλαξη που θα οδηγήσει σε καρκινογένεση μετά από ακτινοβολία είναι η LOH σε όγκο-κατασταλτικά γονίδια 28. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα του φαινομένου αυτού είναι το όγκοκατασταλτικό γονίδιο Retinoblastoma (RB) που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 13q14. Η τάση των ασθενών με ρετινοβλάστωμα να αναπτύσσουν δευτερογενείς καρκίνουςκυρίως οστεοσαρκώματα- στην περιοχή ακτινοβόλησης μετά από ακτινοθεραπεία οφείλεται κυρίως σε ακτινο-προκλητή LOH στο γονίδιο RB[30]. Ωστόσο, το ρετινοβλάστωμα είναι μία σπάνια νόσος και ως εκ τούτου δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία από κλινικές και πειραματικές μελέτες για να στηριχτεί η παραπάνω θεωρεία. Παρότι τα ετερόζυγα ως προς το όγκο-κατασταλτικό γονίδιο p53 ποντίκια είναι ευάλωτα για ανάπτυξη ακτινο-προκλητών καρκίνων δεν έχει αποδειχθεί ότι η LOH στην περιοχή αυτή θα οδηγήσει σε ανάπτυξη καρκίνου[31]. Η δράση ποικίλων ογκογονιδίων στην ανάπτυξη της καρκινογένεσης τόσο στον άνθρωπο όσο και σε πειραματικά μοντέλα είναι αποδεδειγμένη. Ωστόσο, έως σήμερα δεν υπάρχουν δεδομένα που να αναδεικνύουν ενεργοποίηση συγκεκριμένων ογκογονιδίων σε ακτινο-προκλητούς καρκίνους. Η ενεργοποίηση ογκογονιδίων της οικογένειας RAS έχει αναφερθεί σε μικρό ποσοστό λεμφωμάτων σε ποντίκια ενώ η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων C-MYC έχει συσχετιστεί με ανάπτυξη ακτινοπροκλητών οστεοσαρκωμάτων. Ωστόσο, τα παραπάνω αποτελούν ευρήματα περιορισμένων μελετών και όχι σταθερά ευρήματα σε όλες τις σχετικές μελέτες. Με μόνη εξαίρεση το θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς το οποίο στα παιδιά έχει δειχθεί ότι οφείλεται σε ενεργοποίηση του ογκογονιδίου ret[32] η ενεργοποίηση συγκεκριμένων ογκογονιδίων σε ακτινο-προκλητούς καρκίνους δεν είναι αποδεδειγμένη. 22

23 Τα παραπάνω στοιχεία οδηγούν στην υπόθεση ότι υπάρχουν πολλά μονοπάτια για την ανάπτυξη μεταλλάξεων σε μερικά εκ των οποίων πιθανόν εμπλέκονται ογκογονίδια και όγκο-κατασταλτικά γονίδια που δεν έχουν ακόμα χαρτογραφηθεί [33]. Το συμπέρασμα αυτό είναι συμβατό με την μη ειδική φύση των βλαβών που προκαλούνται στο DNA μετά από ακτινοβολία καθώς και με τις επακόλουθες μεταλλάξεις Γενετικές αλλοιώσεις έμμεσα σχετιζόμενες με την ακτινοβολία που οδηγούν σε καρκινογένεση. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι το αρχικό γενετικό σύμβαμα που προκαλείται από την ακτινοβολία στα κύτταρα των θηλαστικών οφείλεται σε βλάβη του DNA που δεν αποκαθίσταται σωστά από τους μεταβολικούς επιδιορθωτικούς μηχανισμούς. Το παραπάνω έχει ως αποτέλεσμα γενετικές αλλαγές όπως μεταλλάξεις και χρωμοσωμικές αλλαγές στα ακτινοβολημένα κύτταρα στην περιοχή της βλάβης του DNA. Σήμερα, υπάρχουν ενδείξεις ότι η έκθεση κυτταρικών πληθυσμών σε ιοντίζουσα ακτινοβολία συνοδεύεται από γενετικές αλλαγές σε περιοχές εκτός της ζώνης ακτινοβόλησης Γενετική αστάθεια από ακτινοβολία Το 1980 σε μία πειραματική μελέτη των μεταλλάξεων από ακτινοβολία σε κύτταρα ποντικού 10Τ 1/2 παρουσιάστηκαν ενδιαφέροντα συμπεράσματα[34]. Σύμφωνα με την παραπάνω μελέτη οι μεταλλάξεις παρατηρούνται μετά από δύο διαφορετικές διαδικασίες. Η πρώτη διαδικασία παρατηρείται με σχετικώς μεγάλη συχνότητα και αφορά μεγάλο τμήμα (20-30%) του πληθυσμού των ακτινοβολημένων κυττάρων. Η δεύτερη διαδικασία είναι ένα σπάνιο σύμβαμα που παρατηρείται σε 10-6 των περιπτώσεων και αφορά μετάλλαξη ενός ή περισσοτέρων απόγονων από τα αρχικώς ακτινοβολημένα κύτταρα μετά από πολλούς κύκλους πολλαπλασιασμού. Το δεύτερο αυτό σύμβαμα παρατηρείται με σταθερή συχνότητα ανά γενεά κυττάρων κατά την ανάπτυξη της κυτταρικής σειράς που ακτινοβολήθηκε και έχει χαρακτηριστικά μεταλλαξιογόνου συμβάματος[35]. Με βάση τα παραπάνω, ειπώθηκε ότι η ακτινοβολία προκαλεί μία γενετική αστάθεια στα κύτταρα στόχο η οποία 23

24 μεταδίδεται και στους απόγονους τους. Η αστάθεια αυτή προκαλεί αύξηση στη συχνότητα ανάπτυξης αυτόματων μεταλλάξεων και ο ασταθής φαινότυπος που προκύπτει παραμένει έως και μετά από 25 κυτταρικούς πολλαπλασιασμούς. Η παραπάνω υπόθεση η οποία περιγράφεται στο σχήμα 5, έχει τεκμηριωθεί με πολλά πειραματικά μοντέλα με τελικά σημεία μελέτης τη μεταλλαξιογένεση, τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες και τον καθυστερημένο κυτταρικό θάνατο[36;37]. Σχήμα 5: Σχηματική παράσταση της γονιδιακής αστάθειας από ακτινοβολία (C και D). Οι ανοικτοί κύκλοι παριστάνουν φυσιολογικά κύτταρα και οι κλειστοί μεταλλαγμένα κύτταρα. (B) Παράδειγμα κυττάρων που μεταλλάσσονται άμεσα μετά από έκθεση σε ακτινοβολία και όπου η μετάλλαξη μεταδίδεται σε όλα τα απόγονα κύτταρα. Ωστόσο, τα περισσότερα κύτταρα του πληθυσμού που ακτινοβολείται θα διατηρήσουν τον αρχικό τους φαινότυπο (A). (C και D) Παραδείγματα μεταλλάξεων ως επακόλουθο γονιδιακής αστάθειας μετά από έκθεση σε ακτινοβολία. Τα ακτινοβολημένα κύτταρα και οι άμεσοι απόγονοι τους διατηρούν το φυσιολογικό τους φαινότυπο ωστόσο η συχνότητα ανάπτυξης μεταλλάξεων αυξάνει στους μεταγενέστερους απογόνους. (Little JB. Radiation-induced genomic instability:implications for radiation protection*. Radioprotection. 2002;37: ) Σε μελέτες μεταλαξιογένεσης, το 10% του πληθυσμού των κλώνων που προέρχονται από κύτταρα που επιβιώνουν μετά από έκθεση σε ακτινοβολία, παρουσιάζει σταθερή αύξηση στη συχνότητα ανάπτυξης μεταλλάξεων[38;39]. Στα κύτταρα αυτά, η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης μεταλλάξεων παραμένει έως και 30 κύκλους πολλαπλασιασμού μετά την έκθεση στην ακτινοβολία. Όπως φαίνεται στο 24

25 σχήμα 4, το μοριακό φάσμα των όψιμα παρατηρούμενων μεταλλάξεων διαφέρει σημαντικώς από τις μεταλλάξεις που συνοδεύουν την άμεση έκθεση σε ακτίνες Χ. Αντιθέτως, οι μεταλλάξεις αυτές παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα με τις αυτόματες μεταλλάξεις καθότι στην πλειονότητα των περιπτώσεων πρόκειται για εστιακές μεταλλάξεις[39;40]. Τα ευρήματα αυτά είναι συμβατά με την υπόθεση ότι η γενετική αστάθεια που προκαλείται από την ακτινοβολία συνοδεύεται από αύξηση στη συχνότητα ανάπτυξης αυτόματων μεταλλάξεων στους απόγονους των ακτινοβολημένων κυττάρων. Επιπλέον στοιχεία που συνηγορούν υπέρ της ανάπτυξης υπό-πληθυσμού γενετικά ασταθών κυττάρων σε πληθυσμό ακτινοβολημένων κυττάρων, προέρχονται από τη παρατήρηση αυξημένης συχνότητας μεταλλάξεων που παρατηρούνται επιλεκτικά σε ακτινοβολημένα κύτταρα στη θέση ΤΚ[41]. Αυξημένη συχνότητα μη-κλωνικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών καταγράφηκε για πρώτη φορά σε απόγονους αιμοποιητικών πρόγονων κυττάρων ποντικού γενεές μετά από έκθεση σε ακτινοβολία με α-σωματίδια. Η επαγωγή της μεταδιδόμενης χρωμοσωμικής αστάθειας από την ακτινοβολία έχει έκτοτε δειχθεί ότι παρατηρείται σε πολλά κυτταρικά συστήματα [42-45]. Η μετάδοση αυτής της χρωμοσωμικής αστάθειας έχει επιπλέον δειχθεί και σε in vivo μελέτες[46;47]. Επιπλέον μια σταθερή αύξηση στο ρυθμό κυτταρικού θανάτου έχει παρατηρηθεί σε κυτταρικούς πληθυσμούς πολλές γενεές μετά την έκθεση στην ακτινοβολία[48;49]. Για τους παραπάνω λόγους είναι πλέον γνωστό ότι η ακτινοβολία από μόνη της μπορεί να προκαλέσει έναν τύπο μεταδιδόμενης γενετικής αστάθειας στα κύτταρα που συνοδεύεται από αυξημένη πιθανότητα ανάπτυξης πολλαπλών γενετικών συμβαμάτων στον κυτταρικό πληθυσμό που επιβιώνει και μετά από πολλές γενεές πολλαπλασιασμού. Οι ακριβείς μηχανισμοί ανάπτυξης του παραπάνω φαινομένου παραμένουν άγνωστοι και υπό διερεύνηση. Παρότι οι μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη και τη συντήρηση του παραπάνω φαινομένου παραμένουν άγνωστοί, πρόσφατα στοιχεία αναδεικνύουν ότι το DNA αποτελεί στόχο για την ανάπτυξη αυτής της γενετικής αστάθειας[50] ενώ το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την αύξηση της απόπτωσης ανεξάρτητης του p53, μπορεί επίσης να συμβάλει στη διατήρηση του γενετικά ασταθούς φαινοτύπου[51]. Έχει ειπωθεί ότι πολλές στενά συσχετιζόμενες κυτταρικές διαδικασίες μπορεί να διακοπούν από την ακτινοβολία, γεγονός που οδηγεί σε μια κατάσταση χάους, η οποία με τη σειρά της εμποδίζει τα φυσιολογικά μονοπάτια ελέγχου και μετάδοσης σημάτων με αποτέλεσμα να αποσυντονίζεται η κυτταρική 25

26 ομοιόσταση και να δημιουργείται μία κατάσταση από την οποία το κύτταρο δεν αναρρώνει ποτέ[50]. Για τους λόγους αυτούς, παρότι ο πυρήνας του κυττάρου αποτελεί τον πρώτο στόχο της ακτινοβολίας για την ανάπτυξη της γενετικής αστάθειας, τα γενετικά αποτελέσματα της ακτινοβολίας μπορεί να παρατηρηθούν στους απόγονους των ακτινοβολημένων κυττάρων και σε άλλες θέσεις εκτός από τον πυρήνα. Παρότι η σημασία της προκαλούμενης γενετικής αστάθειας μετά από ακτινοβόληση για την ανάπτυξη καρκινογένεσης in vivo παραμένει άγνωστη το φαινόμενο έχει πλέον τεκμηριωθεί σε ποικίλα in vitro συστήματα και έχει αλλάξει τον τρόπο σκέψης όσο αναφορά την έναρξη της καρκινογένεσης. Επί παράδειγμα μια ελκυστική υπόθεση είναι ότι μια γενετική αστάθεια αυξάνει την πιθανότητα ανάπτυξης πολλαπλών γενετικών συμβαμάτων σε μια κυτταρική σειρά και οδηγεί στην ανάπτυξη καρκίνου Ακτινοβολία και κυτταρικός θάνατος Η καμπύλη της κυτταρικής επιβίωσης περιγράφει τη σχέση ανάμεσα στη δόση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας και στο ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν (σχήμα 6). Σχήμα 6: Καμπύλη επιβίωσης κυτταρικού πληθυσμού μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία. Τροποποιηθέν από Puck TT, Markus PI, Action of X-rays on mammalian cells, J. Exp. Med.,

27 Το μεγαλύτερο τμήμα της καμπύλης είναι ευθύγραμμο γεγονός που αναδεικνύει τη γραμμική σχέση μεταξύ της απορροφόμενης δόσης και του κλάσματος των επιζώντων κυττάρων που μπορούν να πολλαπλασιαστούν. Η κλίση της καμπύλης προσδιορίζει τη δόση Do η οποία απαιτείται για να ελαττώσει τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα κατά 37%. Το αρχικό τμήμα της καμπύλης παρουσιάζει έναν ώμο που σημαίνει ότι οι μικρές δόσεις δεν είναι αποτελεσματικές. Εάν προεκταθεί το ευθύγραμμο τμήμα της καμπύλης και συναντήσει τον κάθετο άξονα τότε το σημείο της τομής καλείται αριθμός προσεκβολής (n) και αντιστοιχεί στον αριθμό των ευαίσθητων θέσεων του κυττάρου. Υποδηλώνει δηλαδή πόσα ευαίσθητα σημεία έχει κάθε κύτταρο στην ιοντίζουσα ακτινοβολία. Μια τρίτη παράμετρος, που χαρακτηρίζει την καμπύλη επιβίωσης των κυττάρων είναι η δόση κατωφλίου (quasi-threshold dose, Dq), που αντιστοιχεί στη δόση που αναλώνεται για την επιδιόρθωση της μη θανατηφόρου βλάβης. Η δόση αυτή αντιστοιχεί στο σημείο όπου η προέκταση του ευθύγραμμου τμήματος της καμπύλης τέμνει τον οριζόντιο άξονα στο επίπεδο της 100% επιβίωσης. Φυσιολογικά ή καρκινικά ανθρώπινα κύτταρα που εκτίθενται σε ακτίνες Χ παρουσιάζουν τιμές Do 1-2Gy, Dq 0,5-4Gy και τιμές n μεταξύ 1 και 10. Ο ορισμός του κυτταρικού θανάτου καθορίζεται από την κατάσταση αναπαραγωγής των κυττάρων. Έτσι για διαφοροποιημένα κύτταρα που δεν πολλαπλασιάζονται ως κυτταρικός θάνατος ορίζεται η απώλεια μιας ειδικής λειτουργίας. Αντίθετα για τα αναπαραγόμενα κύτταρα ως κυτταρικός θάνατος ορίζεται η απώλεια πολλαπλασιασμού. Σε γενικές γραμμές μια εφάπαξ δόση των 100Gy είναι ικανή να καταστρέψει την κυτταρική λειτουργία σε μη αναπαραγωγικά συστήματα ενώ η μέση θανατηφόρα δόση που απαιτείται για την αναστολή της αναπαραγωγικής ικανότητας είναι συνήθως μικρότερη των 2 Gy Επιδιόρθωση των κυτταρικών βλαβών που προκαλεί η ιοντίζουσα ακτινοβολία Η έκθεση των κυττάρων σε ιοντίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιεί ταυτόχρονα μηχανισμούς κυτταρικής βλάβης και επιδιόρθωσης. Οι βλάβες από ιοντίζουσα ακτινοβολία στα κύτταρα διακρίνονται σε τρείς κατηγορίες: α ) Θανατηφόρος βλάβη: είναι μη αναστρέψιμη και οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο 27

28 β ) Υποθανατηφόρος βλάβη: πρόκειται για βλάβη η οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες μπορεί να επιδιορθωθεί μέσα σε ώρες εκτός και αν προστεθεί μια νέα βλάβη η οποία θα αθροιστεί με την προηγούμενη και θα οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Μερικά κύτταρα μπορεί να έχουν αθροίσει βλάβες, που από μόνες τους δεν είναι θανατηφόρες. Με την πάροδο του χρόνου και την παροχή ενέργειας και θρεπτικών συστατικών, τα κύτταρα μπορεί να επιδιορθώσουν αυτές τις βλάβες και να συνέλθουν εντελώς από τα αποτελέσματα τους. Ο απαραίτητος χρόνος για την επιδιόρθωση μίας υποθανατηφόρου βλάβης είναι περίπου μία ώρα. Η μοριακή βάση της υποθανατηφόρου βλάβης και της επιδιόρθωσης της δεν είναι πλήρως κατανοητή. Μπορεί να θεωρηθεί ότι αναπαριστά βλάβη στη μία έλικα του DNA. Με την πάροδο του χρόνου, επιδιορθωτικά ένζυμα απομακρύνουν το κατεστραμμένο κομμάτι του κυτταρικού γονιδιώματος και έτσι προκύπτει ένα νέο αντίγραφο με τη χρήση της άλλης αλυσίδας του DNA ως υπόστρωμα. Πιο εκτεταμένη χρωμοσωμική καταστροφή, ειδικά αν περιλαμβάνει σπάσιμο και στους δύο κλώνους του DNA, μπορεί να προκαλέσει θανατηφόρο βλάβη. Έχει επίσης βρεθεί ότι η υποθανατηφόρος βλάβη είναι φαινόμενο που δεν εξαρτάται από τη σύνθεση του DNA, του RNA και τη πρωτεϊνοσύνθεση. Η χαμηλή θερμοκρασία μειώνει σημαντικά τη δυνατότητα επιδιόρθωσης της υποθανατηφόρου βλάβης, ενώ η δυνατότητα αυτή αυξάνει όταν τα κύτταρα βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. γ ) Δυνητικά θανατηφόρος βλάβη: είναι η βλάβη που μπορεί να επιδιορθωθεί εφόσον οι συνθήκες που επικρατούν στο μικροπεριβάλλον του κυττάρου μετά την ακτινοβόληση το επιτρέπουν. Η βλάβη αυτή καλείται δυνητικά θανατηφόρος, διότι υπό φυσιολογικές συνθήκες προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Εφόσον μεταβληθούν οι συνθήκες στο περιβάλλον του κυττάρου, τότε η δυνητικά θανατηφόρος βλάβη δύναται να επιδιορθωθεί. Η δυνητικά θανατηφόρος βλάβη μπορεί να επιδιορθωθεί εφόσον οι συνθήκες μετά την ακτινοβόληση δεν είναι ιδανικές για ανάπτυξη, οπότε τα κύτταρα δεν εισέρχονται στην πολύπλοκη διαδικασία της μίτωσης όταν τα χρωμοσώματα τους είναι ακόμα κατεστραμμένα. Εφόσον η μίτωση καθυστερεί λόγω μη ιδανικών συνθηκών ανάπτυξης, η βλάβη στο DNA επιδιορθώνεται. Η σημασία της επιδιόρθωσης της βλάβης αυτής στην κλινική ακτινοθεραπεία είναι πεδίο διαφωνιών. Έχει προταθεί ότι η αντοχή σε ακτινοβόληση που παρατηρείται σε ορισμένους όγκους, όπως το μελάνωμα, οφείλεται σε μεγάλο 28

29 ποσοστό σε επιδιόρθωση της βλάβης αυτής. Παρόλο που αυτή είναι μία ελκυστική υπόθεση, δεν υπάρχουν επαρκείς αποδείξεις για να την τεκμηριώσουν. 29

30 1.3 ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΚ ΔΙΑΦΥΓΗΣ Ορισμός Νωρίς, από τη δεκαετία του 1940 υπήρχαν αναφορές σύμφωνα με τις οποίες η αδρανοποίηση κυτταρικών λειτουργιών μπορούσε να προκληθεί από την ακτινοβόληση τόσο του κυττάρου όσο και του κυτταρικού μέσου που το περιβάλλει[52]. Το 1947 οι Kotval και Gray έδειξαν ότι όταν α-σωματίδια περνούσαν κοντά ή μέσα από νημάτια χρωματίνης, αυξάνονταν η πιθανότητα χρωματιδιακών θραυσμάτων ή χρωματιδικών ανταλλαγών[53]. Ο όρος που χρησιμοποιείται σήμερα προκειμένου να περιγράψει τα παραπάνω φαινόμενα είναι το φαινόμενο εκ διαφυγής. Ο ορισμός αυτός έχει δανειστεί από το χώρο της γονιδιακής θεραπείας όπου χρησιμοποιείται προκειμένου να περιγράψει τη θανάτωση πολλών σειρών κυττάρων μέσω της στόχευσης μιας μόνο σειράς σε έναν μεικτό κυτταρικό πληθυσμό[54]. Το οφειλόμενο στην ακτινοβολία φαινόμενο εκ διαφυγής χαρακτηρίζεται από κυτταρικές βλάβες όπως ανταλλαγή αδελφών χρωματίδων[55;56], χρωμοσωμικές ανωμαλίες[57-59], απόπτωση[57], μικροπυρήνωση[60], μεταλλάξεις[61-63] και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση[64-66], σε κύτταρα που δεν εκτίθενται άμεσα σε ακτινοβολία αλλά που γειτνιάζουν με κύτταρα που αποτελούν τον στόχο της ακτινοβολίας (σχήμα 7). Ακτινοβολία Σχήμα 7: Το φαινόμενο εκ διαφυγής. Τα κύτταρα που καταστρέφονται άμεσα από την ακτινοβολία (μαύρα) και τα παρακείμενα κύτταρα που επηρεάζονται μέσο φαινομένου εκ διαφυγής (λευκά). (Belyakov.O: Non-targeted effects of ionizing radiation) 30

31 1.3.2 Τεκμηρίωση του φαινομένου εκ διαφυγής Στην ακτινοβιολογία είναι γνωστό ότι υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων που εκτίθενται σε ακτινοβολία και κυττάρων που δεν ακτινοβολούνται. Πολλά δεδομένα προέρχονται από μελέτες με χρωμοσωμικές βλάβες σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ακτινοθεραπεία[67;68] ή σε ασθενείς μετά από έκθεση σε ακτινοβολία λόγω ατυχήματος[69]. Τα αποτελέσματα αυτά οφείλονται σε απελευθέρωση παραγόντων όπως υπεροξυδασών[70], ιονισμένων νουκλεοτιδίων[71], κυτταροκινών[72], και ελευθέρων ριζών οξυγόνου όπως οι ρίζες υπεροξειδίου[73]. Κατά τα τελευταία χρόνια έχουν δημοσιευθεί πολλές μελέτες που παρέχουν επαρκή δεδομένα για το φαινόμενο εκ διαφυγής[74;75]. Οι Nagasawa και Little ήταν οι πρώτοι που δημοσίευσαν μια μελέτη όπου περιγράφουν το φαινόμενο εκ διαφυγής[56;76] το οποίο χαρακτηρίζεται από αύξηση στην ανταλλαγή των αδελφών χρωματίδων. Στη μελέτη αυτή ωοθηκικά κύτταρα κινέζικου Hamster ακτινοβολήθηκαν με χαμηλές δόσεις α-σωματιδίων από μια συμβατική πηγή και με τρόπο τέτοιο ώστε μόνο ορισμένα κύτταρα μέσα στον πληθυσμό να πλήττονται από α- σωματίδια. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής μεγαλύτερο ποσοστό ανταλλαγής αδελφών χρωματίδων παρατηρήθηκε συγκριτικά με το αναμενόμενο και με βάση τον αριθμό των κυτταρικών πυρήνων που στοχεύτηκαν. Πιο συγκεκριμένα σε 30% των κυττάρων του πληθυσμού καταγράφηκε αύξηση στην ανταλλαγή των αδερφών χρωματίδων παρότι μόνο σε 1% αυτού υπήρξε διέλευση α-σωματιδίων από τον κυτταρικό πυρήνα. Σύμφωνα με τους συγγραφείς της μελέτης η ακτινοβόληση των κυττάρων έχει κάποιες έμμεσες επιπτώσεις σε παρακείμενα κύτταρα μέσω ελευθέρων ριζών ή μονοπατιών μεταφοράς μηνυμάτων. Σε πρόσφατες δημοσιεύσεις παρέχονται στοιχεία για το φαινόμενο εκ διαφυγής που προέρχονται από μελέτες όπου χρησιμοποιήθηκε ακτινοβολία με α- σωματίδια τα οποία εκπέμπονταν από ειδικά κατασκευασμένες πηγές χαμηλών δόσεων[77]. Στη περίπτωση αυτή η ακτινοβολία πλήττει μόνο ορισμένα κύτταρα σε ένα πληθυσμό κυττάρων. Ο Hickman μέτρησε αλλαγές στην έκφραση του TP53 σε πνευμονικά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού μετά από έκθεση σε χαμηλές δόσεις α- σωματιδίων και παρατήρησε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του TP53 σε μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων συγκριτικά από αυτά που πλήττονταν άμεσα από α- σωματίδια[78]. 31

32 Μια σειρά δημοσιεύσεων από το εθνικό εργαστήριο του Los Alamos έδειξε ότι η ανταλλαγή αδερφών χρωματίδων μετά από χαμηλές δόσεις α-σωματιδίων οφείλεται και σε εξωκυττάριους παράγοντες. Ο Deshpande και οι συνεργάτες του ακτινοβόλησαν κυτταρικές σειρές ανθρώπινων ινοβλαστών με α-σωματίδια και παρατήρησαν μια αυξημένη ανταλλαγή αδελφών χρωματίδων (ΑΑΧ)[55]. Το ποσοστό των κυττάρων όπου παρατηρήθηκε ΑΑΧ ήταν 9 φορές υψηλότερο από ότι αναμένονταν με βάση τον αριθμό των πυρήνων που πλήττονταν. Οι συγγραφείς παρείχαν πιστικές αποδείξεις παραγωγής εξωκυττάριων παραγόντων οι οποίοι απελευθερώνονταν στο κυτταρικό μέσο[79]. Αργότερα, η ίδια ερευνητική ομάδα απέδωσε το παρατηρούμενο φαινόμενο εκ διαφυγής στη δράση του TGF-β1 και σε αντιδρώσες ρίζες οξυγόνου[80]. Σε μια σειρά μελετών οι Mathersill και Seymour έδειξαν ότι η μεταφορά κυτταρικού μέσου από πληθυσμό κυττάρων που είχαν ακτινοβοληθεί με ακτίνες-γ σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα οδηγούσε σε μειωμένη επιβίωση των τελευταίων[81-84]. Στα πλαίσια του παραπάνω πρωτοκόλλου το υπερκείμενο υγρό ακτινοβολημένων κυττάρων μεταφέρονταν σε κυτταροκαλλιέργειες όπου με το ποσοτικό προσδιορισμό των Puck και Marcus[85] καταγράφονταν η παρουσία μικροπυρήνων, η απόπτωση, και οι κυτταρικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Μελέτες από το αντικαρκινικό ινστιτούτο Gray σε κύτταρα V79 από κινέζικα hamster τα οποία υποβάλλονταν σε ακτινοβόληση με α- σωματίδια, έδειξαν ότι για να παρατηρηθούν χρωμοσωμικές βλάβες ο στόχος θα πρέπει να είναι μεγαλύτερος από το πυρήνα[86]. Στο ινστιτούτο Gray με τη χρήση μικροδέσμης φορτισμένων σωματιδίων το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει δειχθεί σε ανθρώπινους ινοβλάστες της κυτταρικής σειράς AG01522B[60;87]. Η ακτινοβόληση ενός ινοβλάστη με ένα μόνο σωματίδιο φορτισμένο με 3He2+ συνοδεύονταν από σημαντική αύξηση της κυτταρικής βλάβης μέσω φαινομένου εκ διαφυγής καθώς και από αύξηση των μικροπυρήνων και των αποπτωτικών κυττάρων. Σε γενικές γραμμές η βλάβη των κυττάρων που παρατηρήθηκε ήταν 2-3 φορές μεγαλύτερη συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Άλλες ερευνητικές ομάδες έχουν μελετήσει το φαινόμενο εκ διαφυγής με τη χρήση μικροδέσμης σωματιδίων. Στοιχεία για τη παρουσία στόχων της ακτινοβολίας έξω από τον κυτταρικό πυρήνα έχουν δειχθεί σε μια μελέτη όπου ακτινοβολήθηκε το κυτταρόπλασμα υβριδιακών ανθρώπινων hamster Α(L) κυττάρων χωρίς να ακτινοβολείται ο πυρήνας [88]. Στη μελέτη αυτή η ακτινοβόληση του 32

33 κυτταροπλάσματος συνοδεύονταν από σημαντικές μεταλλάξεις στη θέση CD59 (S1) και μικρή κυτταροτοξικότητα. Οι μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν ήταν εντελώς διαφορετικές από αυτές που παρουσιάζονταν μετά από ακτινοβόληση του πυρήνα και η ακτινοβόληση του κυτταροπλάσματος συνοδεύονταν από παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου. Το τελικό συμπέρασμα της παραπάνω μελέτης ήταν ότι η ακτινοβόληση του κυτταροπλάσματος μπορεί να είναι πιο επικίνδυνη από την ακτινοβόληση του πυρήνα καθώς οι μεταλλάξεις που προκαλούνται συνοδεύονται από μικρή καταστροφή των κυττάρων στόχων. Ο Zhou και οι συνεργάτες του παρουσίασαν το φαινόμενο εκ διαφυγής με τη χρήση μικροδέσμης α- σωματιδίων [62]. Στη μελέτη αυτή τα κύτταρα που ακτινοβολούνταν από τη μικροδέσμη α- σωματιδίων προκαλούσαν μεταλλάξεις σε γειτονικά κύτταρα τα οποία δεν πλήττονταν άμεσα από τα α- σωματίδια. Σε αυτές τις συνθήκες, η διακυττάρια επικοινωνία παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία του φαινομένου εκ διαφυγής. Στη μελέτη αυτή δείχθηκε ότι η ακτινοβόληση του 20% τυχαίως επιλεγμένων κυττάρων Α(L), με 20 α σωματίδια στο καθένα, συνοδεύονταν από αύξηση των μεταλλάξεων 3 φορές περισσότερο από ότι αναμένονταν. Η ανάλυση με PCR έδειξε ότι οι τύποι των μεταλλάξεων που προκαλούνταν ήταν διαφορετικοί από τις αυτόματες -τυχαίες μεταλλάξεις. Ένα σημαντικό ερώτημα είναι το κατά πόσο το φαινόμενο εκ διαφυγής συμβάλει στη καρκινογένεση. Ο Lewis και οι συνεργάτες του [89] μελέτησαν την ανταπόκριση σε μη ακτινοβολημένες κυτταρικές σειρές που εκτίθονταν στο μέσο από υβριδιακά ανθρώπινα CGL1 κύτταρα που είχαν ακτινοβοληθεί με ακτίνες-χ. Στη μελέτη αυτή οι συγγραφείς αναφέρουν μια αύξηση των νεοπλασματικών κυττάρων στη κυτταρική σειρά που εκτίθονταν στο μέσο από τα ακτινοβολημένα κύτταρα. Το μέσο που εκτίθονταν σε ακτινοβολία με 5ή 7Gy προκαλούσε αύξηση στη συχνότητα της νέο-εξαλλαγής από 6.3x10-6 σε 2.3x10-5 (περίπου 4 φορές ) Χαρακτηριστικά του φαινομένου εκ διαφυγής Συγκριτικά με τα αποτελέσματα της συμβατικής ακτινοβολίας το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει 3 χαρακτηριστικά: 33

34 1. Το φαινόμενο εκ διαφυγής επικρατεί στο φάσμα χαμηλών δόσεων ακτινοβολίας (μικρότερες από 0.5 Gy) 2. Το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει μη γραμμική σχέση με τη δόση της ακτινοβολίας και η ενεργοποίηση του είναι άμεση ή καθόλου 3. Η μέγιστη ενεργοποίηση του φαινομένου εκ διαφυγής παρατηρείται σε πολύ χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας. Οι Nagasawa και Little έδειξαν πρώτοι ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να παρατηρηθεί σε πολύ χαμηλές δόσεις της τάξης των 0.16 mgray και ο κορεσμός επέρχονταν στα 0.31 mgray χωρίς να παρατηρείται περαιτέρω στατιστικώς σημαντική αύξηση με μεγαλύτερες δόσεις έως τα 4.9 mgray [56]. Αντίστοιχα ο Hickman στη δική του μελέτη σε ακτινοβόληση επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα ποντικού έδειξε ότι η επίπτωση της δόσης της ακτινοβολίας στην έκφραση του TP53 ήταν διαφορετική μετά από ακτινοβόληση με α-σωματίδια συγκριτικά με τις ακτίνες- Χ [78]. Στην ακτινοβόληση με α-σωματίδια δεν υπήρχε κάποια συγκεκριμένη δόση ακτινοβόλησης πέραν της οποίας να καταγράφονταν αυξημένη ανταπόκριση ενώ αντίθετα στις ακτίνες- Χ παρατηρούνταν αυξημένη ανταπόκριση σε χαμηλές δόσεις της τάξης του 0.1 Gy. Σε γενικές γραμμές η καμπύλη δόσης-ανταπόκρισης και για τους δυο τύπους ακτινοβολίας έχει τάση οριζοντίωσης μετά από έκθεση σε δόσεις Gy και δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική αύξηση της ανταπόκρισης με περαιτέρω αύξηση των δόσεων της ακτινοβολίας. Ο Deshpande και οι συνεργάτες του δεν παρατήρησαν συσχέτιση του φαινομένου εκ διαφυγής με τη δόση της ακτινοβολίας για δόσεις μεγαλύτερες από 0.02 Gy ενώ σε μεγαλύτερες δόσεις ακτινοβολίας δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του φαινομένου [55]. Επιπλέον ο Zhou έδειξε ότι οι μεταλλάξεις που προκαλούνται από το φαινόμενο εκ διαφυγής μετά από ακτινοβολία με μικροδέσμη α-σωματιδίων είναι ανεξάρτητο από τον αριθμό των σωματιδίων που χρησιμοποιούνται [63;90]. Τέλος ο Lewis έδειξε ότι ο κυτταρικός θάνατος που οφείλεται στο φαινόμενο εκ διαφυγής είναι ανεξάρτητος από τη δόση της ακτινοβολίας [89]. Το φαινόμενο εκ διαφυγής συμβάλει κατά ένα μεγάλο βαθμό στη συνολική κυτταρική βλάβη που παρατηρείται σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας και με μηχανισμό ξεκάθαρα διαφορετικό από τον αντίστοιχο της κλασικής άμεσης ακτινοβόλησης. Στοιχεία από πρόσφατες μελέτες [58;60] έδειξαν ότι ο βαθμός της 34

35 βλάβης (μικροπυρήνες και αποπτωτικά κύτταρα) σε ανθρώπινους ινοβλάστες ήταν ανεξάρτητος από τον αριθμό των φορτισμένων σωματιδίων που έπλητταν τα κύτταρα στόχους. Ένα ιόν 3He 2+ που πλήττει τον πυρήνα ενός κυττάρου μεταξύ εκατοντάδων μη ακτινοβολημένων γειτονικών κυττάρων μπορεί να προκαλέσει το φαινόμενο εκ διαφυγής στο μέγιστο βαθμό. Περαιτέρω αύξηση της δόσης στα κύτταρα στόχους δεν προκαλεί περαιτέρω αύξηση του φαινομένου. Ομοίως το φαινόμενο παρατηρείται ανεξάρτητα από τον αριθμό των κυττάρων που ακτινοβολούνται και ο ίδιος βαθμός βλάβης παρατηρείται είτε ακτινοβολούνται ένα ή τέσσερα κύτταρα. Το φαινόμενο εκ διαφυγής συγκριτικά με την άμεση ακτινοβόληση παρουσιάζεται στο σχήμα 8. Με βάση τις περισσότερες μελέτες το φαινόμενο εκ διαφυγής παρουσιάζει κορεσμό σε κάποια συγκεκριμένη δόση (κατά προσέγγιση 0.2 Gy) και δεν παρατηρείται η γραμμική αύξηση που χαρακτηρίζει την άμεση ακτινοβόληση[91]. Φαινόμενο εκ διαφυγής Κλασσική Ακτινοβολία Σχήμα 8: Συγκριτική παράσταση του φαινομένου εκ διαφυγής και της κλασσικής ακτινοβολίας. (Prise KM et al.studies of bystander effects in human fibroblasts using a charged particle microbeam. Int J Radiat Biol Dec;74(6):793-8) Δόση Το μοντέλο που παρουσιάζεται παραπάνω έρχεται σε πλήρη αντίθεση με το αντίστοιχο που προτείνεται από τον Brenner [92] για τον ποσοτικό προσδιορισμό του 35

36 Συχνότητα εμφάνισης καρκινογένεσης φαινομένου εκ διαφυγής και για τον προσδιορισμό του κινδύνου καρκινογένεσης. Το μοντέλο BaD (Bystander and direct) της ανταπόκρισης στην ακτινοβολία στηρίζεται σε δεδομένα της ίδιας ερευνητικής ομάδας σε in vitro μετάλλαξη ογκογονιδίων μετά από ακτινοβολία ευρέος φάσματος ή με ακτινοβολία με μικροδέσμη α-σωματιδίων [93]. Σύμφωνα με το μοντέλο BaD το φαινόμενο εκ διαφυγής είναι δυαδικό, μπορεί δηλαδή να παρατηρηθεί στη μέγιστη ισχύ του ή καθόλου (all or nothing), και πιθανόν να εκφράζεται σε ένα μικρό ευαίσθητο υποσύνολο του πληθυσμού των γειτονικών κυττάρων [94] και δεν αφορά το σύνολο του κυτταρικού πληθυσμού. Οι συγγραφείς πιστεύουν ότι υπάρχουν αμιγώς γεωγραφικά αίτια για την παρουσία υποπληθυσμού ευαίσθητων στο φαινόμενο εκ διαφυγής κυττάρων και υποστηρίζουν ότι ο πιθανός παράγοντας που προκαλεί το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει περιορισμένη διείσδυση στα παρακείμενα κύτταρα. Ωστόσο στη περίπτωση αυτή θα έπρεπε να παρατηρείται μια συνάθροιση κατεστραμμένων κυττάρων στην περιοχή της ακτινοβόλησης. Έως σήμερα δεν υπάρχουν ενδείξεις για συνάθροιση κυττάρων ενώ αντίθετα σύμφωνα με δημοσιευμένα δεδομένα [87] η κυτταρική βλάβη παρουσιάζει ομοιόμορφη κατανομή σε όλη την έκταση του κυτταρικού πληθυσμού. Συνολική επίπτωση Επίπτωση άμεσης ακτινοβολίας Επίπτωση φαινομένου εκ διαφυγής Δόση (cgy) Σχήμα 9: Η επίπτωση του φαινομένου εκ διαφυγής και της άμεσης ακτινοβόλησης στην ανάπτυξη καρκινογένεσης σύμφωνα με το μοντέλο BaD. (Brenner DJ et al. The bystander effect in radiation oncogenesis: II. A quantitative model. Radiat Res Mar;155(3):402-8.) 36

37 Το μοντέλο BaD υποστηρίζει ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να παρατηρηθεί μόνο σε χαμηλές δόσεις (σχήμα 9). Στις χαμηλές δόσεις το φαινόμενο αυτό επικρατεί της άμεσης ανταπόκρισης στην ακτινοβολία. Οι συγγραφείς υπογραμμίζουν ότι το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε υποβάθμιση των κινδύνων που σχετίζονται με τις χαμηλές δόσεις συγκριτικά με τις υψηλές δόσεις όπου κυριαρχούν οι άμεσες επιπτώσεις της ακτινοβόλησης. Σύμφωνα με το μοντέλο BaD η συνολική ανταπόκριση του κυτταρικού συστήματος στην ιοντίζουσα ακτινοβολία έχει 2 στοιχεία: την άμεση βλάβη και την βλάβη που συνοδεύει το φαινόμενο εκ διαφυγής. Η άμεση βλάβη έχει γραμμική συσχέτιση με τη δόση της ακτινοβολίας ενώ το φαινόμενο εκ διαφυγής προκαλείται στο μέγιστο βαθμό του σε πολύ χαμηλές δόσεις (μικρότερες από 1 Gy). Οι συγγραφείς πιστεύουν ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής θα πρέπει να εξασθενεί με την αύξηση των δόσεων καθότι τα ευαίσθητα κύτταρα των οποίων οι πυρήνες πλήττονται άμεσα δεν θα μπορούσαν να αναπαράγουν το φαινόμενο. Για τον λόγο αυτό η συνολική ανταπόκριση, όπως φαίνεται στο σχήμα 9, θα πρέπει να είναι το αποτέλεσμα σύμπτυξης του φαινομένου εκ διαφυγής και της άμεσης ανταπόκρισης στην ακτινοβολία στο φάσμα χαμηλών δόσεων (έως 30 cgy). Σε υψηλότερες δόσεις πρωτίστως κυριαρχεί η άμεση ανταπόκριση στην ακτινοβολία. Ωστόσο έως σήμερα δεν υπάρχουν επαρκή πειραματικά δεδομένα που να δείχνουν ότι η άμεση πλήξη κυττάρου θα εμπόδιζε την απελευθέρωση παραγόντων που θα προκαλούσαν το φαινόμενο εκ διαφυγής. Για τον παραπάνω λόγο ένα διαφορετικό μοντέλο θα πρέπει να υιοθετηθεί (σχήμα 10) σύμφωνα με το οποίο παρατηρείται μια χαρακτηριστική επίπεδη φάση στο φάσμα χαμηλών δόσεων γεγονός που συνάδει με τα έως σήμερα δημοσιευμένα πειραματικά δεδομένα. Το μοντέλο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί καλύτερα για να περιγράψει τη συσχέτιση της δόσης με την κυτταρική βλάβη ενώ αντίθετα το μοντέλο BaD είναι προτιμότερο για την εκτίμηση του κινδύνου καρκινογένεσης. 37

38 Κυτταρική βλάβη Συνολική Οφειλόμενη στο φαινόμενο εκ διαφυγής Οφειλόμενη στο φαινόμενο εκ διαφυγής Δόση Σχήμα 10: Η συνεισφορά του φαινομένου εκ διαφυγής και της άμεσης ακτινοβόλησης στην πρόκληση κυτταρικής βλάβης. (Brenner DJ et al. The bystander effect in radiation oncogenesis: II. A quantitative model. Radiat Res Mar;155(3):402-8.) Ο μηχανισμός του φαινομένου εκ διαφυγής Ο ακριβής μηχανισμός του φαινομένου εκ διαφυγής δεν είναι ακόμα γνωστός. Ωστόσο είναι σαφές ότι τα μηνύματα που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής και η κυτταρική απάντηση σε αυτά, μπορούν να αφορούν διαφορετικά μονοπάτια [75]. Η παραγωγή σημάτων που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής αποτελούν ένα πολύπλοκο και καλά ρυθμισμένο σύστημα το οποίο πιθανότητα αφορά περισσότερα του ενός μηνύματα και συνδέεται με σήματα από το μικροπεριβάλλον των ιστών [95;96]. Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα στο φαινόμενο εκ διαφυγής η μεταφορά σημάτων που προκαλούν βλάβη από τα ακτινοβολημένα κύτταρα στα μη ακτινοβολημένα γειτονικά τους κύτταρα μπορεί να επιτευχθεί μέσω δύο διαφορετικών οδών : 38

39 α ) με επικοινωνία των κυττάρων μέσω χασματοσυνδέσμων (gap junction) β ) με παράγοντες που απελευθερώνονται στο κυτταρικό μέσο των ακτινοβολημένων κυττάρων Πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής με επικοινωνία μέσω χασματοσυνδέσμων (gap junctions) Τα χάσματα μεταξύ των κυττάρων αποτελούνται από πολλούς μικρούς πόρους. Κάθε πόρος σχηματίζεται από 6 πρωτεΐνες στη μεμβράνη (connexins) οι οποίες σχηματίζουν ένα εξάγωνο (connexon). Όταν οι πρωτεΐνες αυτές συνδέονται μεταξύ τους ο πόρος ανοίγει επιτρέποντας την επικοινωνία και την ανταλλαγή προϊόντων μεταβολισμού μεταξύ των κυττάρων [97]. Ο Azzam και οι συνεργάτες του [98] σε μια μελέτη με 5 διαφορετικά είδη ανθρώπινων διπλοϊδικών ινοβλαστών οι οποίοι εκτίθονταν σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας με α-σωματίδια έδειξαν ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής επάγεται σε μεγάλο βαθμό με επικοινωνία των κυττάρων μέσω χασματοσυνδέσμων (gap junction). Πιο συγκεκριμένα έδειξαν ότι η έκφραση του TP53 και του CDKN1A ενεργοποιείται σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα όταν παρακείμενα τους κύτταρα ακτινοβολούνται με α-σωματίδια. Η χορήγηση lindane, η οποία αναστέλλει την επικοινωνία των κυττάρων μέσω χασματοσυνδέσμων, συνοδεύονταν από δραματική μείωση στα επίπεδα των TP53 και CDK1A στα μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Σε μια πρόσφατη μελέτη της ίδιας ερευνητικής ομάδας αποδεικνύεται ξεκάθαρα η σημασία της διακυττάριας επικοινωνίας μέσω χασματοσυνδέσμων στη μεταφορά σημάτων που προκαλούν κυτταρική βλάβη από ακτινοβολημένα σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα [65]. Σε μια άλλη μελέτη δείχθηκε ότι η χορήγηση lindane συνοδεύονταν από αναστολή του θανάτου κυττάρων ποντικού V79 με μηχανισμό που οφείλεται στο φαινόμενο εκ διαφυγής [99]. Το φαινόμενο εκ διαφυγής εξασθενούσε σημαντικά σε κύτταρα στα οποία χορηγούνταν 1 mm οκτανόλης (octanol) η οποία αναστέλλει επίσης τη διακυττάρια επικοινωνία μέσω χασματοσυνδέσμων [63]. Ελάχιστα είναι γνωστά όσον αναφορά τα σήματα που μεταδίδονται μέσω χασματοσυνδέσμων. Οι πρωτεΐνες που σχηματίζουν τους χασματοσυνδέσμους επιτρέπουν σε ιόντα και μικρά μόρια να διακινούνται μεταξύ των κυττάρων, ενώ η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών αυτών μπορεί να ανοίξει ή να κλείσει τους πόρους. 39

40 Καθότι οι χασματοσύνδεσμοι είναι πολύ μικροί για να διέλθουν πρωτεΐνες, είναι πιθανόν το φαινόμενο εκ διαφυγής να οφείλεται στην απελευθέρωση ελεύθερων ριζών [100]. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου όπως έχει δειχθεί σε πολλές μελέτες, αποτελούν ένα σημαντικό παράγοντα στο φαινόμενο εκ διαφυγής που προκαλείται από τη μεταφορά κυτταρικού μέσου από ακτινοβολημένα σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα [ ]. Ο Hu και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν DMSO, μια ουσία που δεσμεύει μέρος της ακτινοβολίας πριν από ακτινοβόληση με α-σωματίδια και κατέγραψαν μείωση κατά 19% στην έκφραση της θέσης H2AX σε ινοβλάστες η οποία ωστόσο ήταν κατά 2 φορές μεγαλύτερη συγκριτικά με την ομάδα αναφοράς. Καθότι ούτε η lindane ούτε το DMSO ανέστειλαν πλήρως το φαινόμενο εκ διαφυγής είναι πιθανό τα σήματα που προκαλούν το φαινόμενο να μεταφέρονται τόσο μέσω χασματοσυνδέσμων όσο και με απελευθέρωση τους στο κυτταρικό μέσο Πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής με μεταφορά κυτταρικού μέσου Ο δεύτερος πιθανός μηχανισμός με τον οποίο επάγεται το φαινόμενο εκ διαφυγής είναι μέσω απελευθέρωσης παραγόντων στο κυτταρικό μέσο. Πειραματικές μελέτες με μεταφορά του κυτταρικού μέσου αναδεικνύουν τη παρουσία παραγόντων με μακρά ημίσεια ζωή οι οποίοι δεν μπορούν να απομακρυνθούν από το κυτταρικό μέσο με τη διαδικασία του φιλτραρίσματος [57;84]. Σύμφωνα με μια σειρά μελετών τα κύτταρα που ακτινοβολούνται εκκρίνουν κυτταροκίνες ή άλλους παράγοντες οι οποίοι δρουν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να αυξάνεται η ενδοκυττάρια συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών οξυγόνου στα μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Ο Lehnert και οι συνεργάτες του [79] έδειξαν ότι το μέσο από κύτταρα που είχαν ακτινοβοληθεί με χαμηλές δόσεις α-σωματιδίων μπορούσε να προκαλέσει αύξηση στην ανταλλαγή αδερφών χρωματίδων όταν φυγοκεντρούνταν με μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Σύμφωνα με μελέτες [79;105] τα κύτταρα που ακτινοβολούνται με α- σωματίδια εκκρίνουν στο μέσον που τα περιβάλλει κάποιους παράγοντες με βραχεία ημίσεια ζωή. Έχει δειχθεί ότι η δράση των παραγόντων αυτών μπορεί να ανασταλθεί από τη δισμουτάση του υπεροξειδίου, ενώ μπορούν να επιβιώσουν στο ψύχος αλλά όχι και στη θερμότητα. Σε μία μελέτη, ο Lewis [89] χρησιμοποιώντας ερευνητικό πρωτόκολλο με μεταφορά κυτταρικού μέσου παρατήρησε καθυστερημένο θάνατο και νεοπλασματική εξαλλαγή. Τέλος οι Mothersill και Seymour [81] ανακοίνωσαν 40

41 κάποια αποτελέσματα σύμφωνα με τα οποία το φαινόμενο εκ διαφυγής δεν οφείλεται στη επικοινωνία των κυττάρων με χασματοσυνδέσμους αλλά αντίθετα είναι αποκλειστικά το αποτέλεσμα απελευθέρωσης παραγόντων από τα ακτινοβολημένα κύτταρα Σήματα που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής Η ακριβής φύση των παραγόντων που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής δεν είναι γνωστή. Σύμφωνα με τους δύο μηχανισμούς που προαναφέρθηκαν, τα σήματα που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής παράγονται στα ακτινοβολημένα κύτταρα και απελευθερώνονται στο κυτταρικό μέσο που τα περιβάλλει ή μεταφέρονται μέσω χασματοσυνδέσμων στα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα [75]. Σύμφωνα με τους παραπάνω μηχανισμούς είναι πιθανό να υπάρχουν τουλάχιστον δύο διαφορετικοί τύποι σημάτων που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής. Τα πρωτογενή σήματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα στόχους, έχουν βραχεία ημίσεια ζωή, δεν είναι πολύ σταθερά, μεταφέρονται μέσω χασματοσυνδέσμων, είναι υδατοδιαλυτά και ως επί τω πλείστο δεν είναι πρωτεΐνες. Ένας πιθανός παράγοντας θα μπορούσε να είναι μία οργανική ρίζα με μακρά ημίσεια ζωή ικανή να μεταφέρεται μέσω χασματοσυνδέσμων. Τέτοιες ρίζες θα μπορούσαν να έχουν χρόνο ζωής έως και 20 ώρες [106;107]. Μεταξύ άλλων, σήματα που θα μπορούσαν να επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής μέσω χασματοσυνδέσμων είναι τα αντιοξειδωτικά (θειόλες) [108], τα Ca 2+ [109], τα IP 3 (αποθηκευμένη μορφή ενδοκυττάριου ασβεστίου) και το CAMP [110] ο οποίος είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τον μεταβολισμό του ασβεστίου. Τα δευτερογενή σήματα που επάγουν το φαινόμενο εκ διαφυγής θα πρέπει να έχουν μακρά ημίσεια ζωή, να είναι πιο σταθερά, να απελευθερώνονται και όχι να ενεργοποιούνται από την ακτινοβολία και να μην διαπερνούν άμεσα τα κύτταρα. Πρόκειται συνήθως για παράγοντες που απελευθερώνονται στο κυτταρικό μέσον οι οποίοι ως επί τω πλείστο είναι πρωτεΐνες. Τέτοιες ουσίες είναι η λιπιδική υδροπεροξειδάση [111] και η σεραμίδη (Ceramide) [5]. Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα, κυτταροκίνες όπως ο TNF-α [70;112], ο TGF-β [80;96] και η IL-1 [70] είναι μόρια με σημαντική δράση στην επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής. 41

42 Υπάρχει ένα φάσμα ουσιών που πιθανών να έχουν δράση στην επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής. Οι παράγοντες αυτοί, δημιουργούνται στο κυτταρικό μέσον και μπορεί να είναι κύρια ή δευτερεύοντα σήματα. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου έχουν προταθεί ως πιθανά σήματα για την ανάπτυξη του φαινομένου εκ διαφυγής [80;113], ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να έχει και το NO [114;115]. Τέλος, είναι πιθανό ο μηχανισμός ανάπτυξης του φαινομένου να εξαρτάται και από τον τύπο των κυττάρων, γεγονός που αιτιολογεί τη διάσταση των απόψεων που παρατηρείται στη βιβλιογραφία ως αναφορά τις εμπλεκόμενες διαδικασίες Ο ρόλος της κυκλο-οξυγενάσης-2 (COX-2) στην επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής Σε μια μελέτη [116] ο Zhou και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες (NHLF) από πνεύμονα προκειμένου να εντοπίσουν γονίδια που εκφράζονται διαφορετικά σε άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα και στα παρακείμενα τους μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Μεταξύ των 96 γονιδίων που μελετήθηκαν η έκφραση του COX-2 ήταν σταθερά υψηλή έως και 3 φορές ενώ αντίθετα τα επίπεδα του RNA για την IGFBP 3 (insulin growth factor binding protein-3) ήταν σταθερώς χαμηλότερα έως και 7 φορές σε πολλές αναλύσεις διαφόρων δειγμάτων. Η ημιποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει τα επίπεδα έκφρασης των δύο αυτών γονιδίων και τα σύγκρινε με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου για την GAPDH (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase). Επιπλέον τα επίπεδα της COX-2 πρωτεΐνης στα μη ακτινοβολημένα παρακείμενα κύτταρα μελετήθηκαν επίσης με Western blotting. Η προσθήκη του αναστολέα της COX-2 NS-398 (50μΜ) κατέστειλε τη δράση της COX-2 στα κύτταρα NHLF καθώς και την μετάλλαξη στη θέση της HPRT (hypoxanthin, guanine phosphoribosyltransferase) [117] (σχήμα 11). Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν ότι η COX-2 σχετίζεται στενά με το φαινόμενο εκ διαφυγής. 42

43 Η επίδραση του αναστολέα του COX-2 στην μεταλλαξιογένεση που προκαλείται από το φαινόμενο εκ διαφυγής Σχήμα 11: Η επίδραση του αναστολέα του COX-2 στην μεταλλαξιογένεση που προκαλείται από το φαινόμενο εκ διαφυγής. Τροποποιηθέν από Zhou H et al. Mechanism of radiation-induced bystander effect: role of the cyclooxygenase-2 signaling pathway. (2005).Proc. Natl Acad. Sci.102: Ο ρόλος του παράγοντα NF-kB (nuclear factor kb) στο φαινόμενο εκ διαφυγής Είναι δεδομένο ότι ο NF-kB είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής πολλών γονιδίων συμπεριλαμβανομένου του Cox-2 και για τον λόγο αυτό είναι πιθανόν να συμμετέχει και στο φαινόμενο εκ διαφυγής. Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι η ακτινοβολία με α-σωματίδια αυξάνει τη δέσμευση του NF-kB τόσο στα άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα όσο και στα παρακείμενα τους, ενώ η προσθήκη Bay ενός φαρμακευτικού αναστολέα της κινάσης IkB καταστέλλει αποτελεσματικά την παραπάνω αύξηση και μειώνει τα επίπεδα της NF-kB σε κατώτερες από της φυσιολογικές τιμές [118]. Αυτός ο αναστολέας της NF-kB καταστέλλει επίσης αποτελεσματικά την έκφραση της Cox-2 τόσο στους άμεσους ακτινοβολημένους ινοβλάστες όσο και στα παρακείμενα τους κύτταρα. Προγενέστερες μελέτες όπου 43

44 χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες από ανθρώπινο δέρμα οι οποίοι ακτινοβολήθηκαν με χαμηλές δόσεις α-σωματιδίων έδειξαν μια ταχεία αύξηση του NF-kB του c-jun N- terminal kinase και του ERK στο πληθυσμό των κυττάρων που εκτέθηκε σε ακτινοβολία [119], γεγονός που ερμηνεύεται ως ενεργοποίηση των μονοπατιών αυτών στα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Καθότι η επαγωγή της δεσμευτικής ικανότητας του NF-kB παρατηρείται τόσο στα άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα όσο και στα μη ακτινοβολημένα, ο ρόλος τους στο φαινόμενο εκ διαφυγής είναι αμφιλεγόμενος και αποτελεί αντικείμενο μελλοντικής μελέτης Η επίπτωση των κυτταροκινών στο φαινόμενο εκ διαφυγής Σύμφωνα με πρόσφατα στοιχεία ο εξωγενής TNF-α σε συνδυασμό με την IL- 1β έχουν άμεση επίδραση στην έκφραση της Cox-2 σε NHLF [120]. Τόσο ο TNF-a όσο και η IL-1β έχει δειχθεί ότι αυξάνονται μετά από έκθεση των NHLF σε ακτινοβολία με α-σωματίδια. Η χορήγηση ανασταλτικών μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά του TNF-α στο κυτταρικό μέσο οδηγεί σε σημαντική μείωση στα επίπεδα του NF-κB και της JNK και συνοδεύονται από σημαντική μείωση της Cox-2 τόσο στα άμεσα ακτινοβολημένα NHLF αλλά κυρίως στα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα [118]. Επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις ότι η χορήγηση ανασταλτικών μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά του TNF-α έχει κατασταλτικό ρόλο στη δράση του ERK μεταξύ των παρακείμενων μη ακτινοβολημένων κυττάρων [118]. Η παραπάνω μελέτη αναδεικνύει ξεκάθαρα τη συσχέτιση που υπάρχει ανάμεσα στη σύνδεση ποικίλων κυτταροκινών με τους υποδοχείς τους στη κυτταρική επιφάνεια και την ενεργοποίηση των NF-κB και MAPK Ο ρόλος των ελευθέρων ριζών στο φαινόμενο εκ διαφυγής Η επίδραση των ελευθέρων ριζών οξυγόνου, συμπεριλαμβανομένου των ριζών υδροξυλίου και των ανιόντων υπεροξειδίου στην έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής έχει δειχθεί σε διάφορες μελέτες με μεταφορά κυτταρικού μέσου [119; ]. Καθότι σχεδόν όλες οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου έχουν σχετικά μικρή ημίσεια ζωή, προκειμένου να συσχετιστούν με το φαινόμενο εκ διαφυγής θα πρέπει να 44

45 δημιουργούνται είτε πολύ κοντά στη θέση στόχο ή να παράγονται μέσα από μια συνεχή αλληλουχία γεγονότων. Επιπλέον, οι βραχύβιες αυτές ελεύθερες ρίζες πιθανολογείται ότι έχουν σημαντική δράση στη παραγωγή δευτερογενών μακρόβιων οργανικών ριζών οι οποίες προκαλούν μεταλλάξεις και εξαλλαγές στα ανθρώπινα κύτταρα. Ο ρόλος των ριζών του αζώτου, ιδιαιτέρως το NO στο φαινόμενο εκ διαφυγής έχει μελετηθεί εκτενώς και με ποικίλες παραμέτρους. Οι μελέτες του Matsumoto και των συνεργατών του έδειξαν ότι η ακτινοβολία-χ προκαλεί ενεργοποίηση της επαγώγιμης ΝΟ συνθάσης (inducible NO synthase, inos) η οποία διαρκεί μέχρι και 3 ώρες μετά από την ακτινοβολία και έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ακτινοαντίστασης στα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα [114]. Σε παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα όπου χορηγήθηκε c-ptio (2-(4- cybroxyphenyl)-4,4,4,4-tetramethyl,midyroline-1-oxyl-3-oxide), ένωση η οποία δεσμεύει ΝΟ, ο σχηματισμός μικροπυρήνων [124;125] καθώς και η επαγωγή του γη2αχ ήταν σημαντικώς μειωμένη [126] γεγονός που υποδηλώνει τον σημαντικό ρόλο του NO στο φαινόμενο εκ διαφυγής Ο ρόλος των μιτοχονδρίων στο φαινόμενο εκ διαφυγής Η παρατήρηση ότι η εξωκυττάρια χορήγηση αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως η SOD [127] και η καταλάση [104] αναστέλουν το φαινόμενο εκ διαφυγής που προκαλείται με τη μεταφορά κυτταρικού μέσου υποδηλώνει το ρόλο των ελεύθερων ριζών στη διαδικασία του φαινομένου εκ διαφυγής. Καθότι τα μιτοχόνδρια αποτελούν τη βασική πηγή παραγωγής ενέργειας καθώς και δημιουργίας ελευθέρων ριζών στα κύτταρα, ιδιαιτέρως σε παθολογικές καταστάσεις, ενισχύει την υπόθεση ότι αποτελούν τον κύριο στόχο αυτών των ελεύθερων ριζών. Σύμφωνα με πρόσφατα στοιχεία, εστιακές μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα [128] καθώς και αύξηση της μιτοχονδριακής μάζας [129], παρατηρούνται σε άμεσα ακτινοβολημένα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (human papiloma Virus immortalized human keratinocytes) με δόση γ-ακτινοβολίας 5 Gy ή με έκθεση σε παράγοντες που απελευθερώνονται από τα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Μελέτες σε ανθρώπινους ινοβλάστες που στερούνται το μιτοχονδριακό DNA παρέχουν 45

46 αποδεικτικά στοιχεία ότι τα μιτοχόνδρια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του φαινομένου εκ διαφυγής που προκαλούνται από την ακτινοβολία Συνοπτικό μοντέλο του φαινομένου εκ διαφυγής Ο ακριβής μηχανισμός του φαινομένου εκ διαφυγής, είτε προκαλείται μέσω επικοινωνίας των κυττάρων είτε μέσω απελευθέρωσης διαλυτών παραγόντων στο κυτταρικό μέσο, δεν είναι σαφής και είναι πιθανό να εμπλέκονται πολλαπλά μονοπάτια. Ωστόσο, είναι ξεκάθαρο ότι η λειτουργία του γονιδίου P53 δεν είναι αναγκαία για την επαγωγή του φαινομένου, καθότι τα κύτταρα που δεν έχουν φυσιολογική λειτουργία του P53 όπως τα κύτταρα CHO, παρουσιάζουν μεγάλη έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής. Είναι πιθανό ότι πολλαπλές αλληλουχίες σημάτων που αφορούν τόσο την πρώτη εκδήλωση όσο και τα περαιτέρω βήματα σηματοδότησης είναι αναγκαίες για την ανάπτυξη του φαινομένου. Προηγούμενες μελέτες, έχουν δείξει ότι η Cox-2 έχει σημαντική συσχέτιση με το φαινόμενο εκ διαφυγής που επάγεται από την ακτινοβολία σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες [117]. Επιπλέον, υπάρχουν στοιχεία ότι το NO μπορεί να προκαλέσει την έκφραση της Cox-2 σε κύτταρα από δέρμα ποντικού και σε καλλιεργημένα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών, καθώς επίσης και ότι το μονοπάτι του NF-kB εμπλέκεται στη διαδικασία [130;131]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 12, η σύνδεση ποικίλων κυτταροκινών στους υποδοχείς τους στη μεμβράνη, αποτελεί τον πιθανό μηχανισμό ανάπτυξης του φαινομένου εκ διαφυγής. Η ιοντίζουσα ακτινοβολία αποτελεί έναν ισχυρό επαγωγέα του μονοπατιού ATM (ataxia telangiectasia mutated)-ikk/nf-kb [132] το οποίο σχετίζεται περαιτέρω με την ενεργοποίηση της γονιδιακής έκφρασης του TNF-α [133]. O NF-κB ελέγχει άμεσα τη γονιδιακή έκφραση των Cox-2 και της inos, ενώ ο TNF-α είτε σε ελεύθερη μορφή, είτε συνδυασμένος με τη κυτταρική μεμβράνη, μπορεί να προκαλέσει το φαινόμενο εκ διαφυγής σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα μέσω ενεργοποίησης της γονιδιακής έκφρασης του Cox-2 [120]. 46

47 Μηχανισμός πρόκλησης του φαινομένου εκ διαφυγής Επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής Σχήμα 12: Συνοπτικό μοντέλο του φαινομένου εκ διαφυγής. Τροποποιηθέν από Zhou, H et al. Mechanism of radiation-induced bystander effect: role of the cyclooxygenase-2 signaling pathway. Proc. Natl Acad. Sci. (2005). H2O2: hydrogen peroxide, IL: interleukin, OH: hydroxyl radicals, ONOO: peroxynitrite anions, PTIO: 2-4-(-carboxyphenyl-4,4,5,5,- tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (an NO scavenger), - R:receptor, PG-E2: prostaglandin E2, ROS: reactive oxygen species, TGF: transforming growth factor, TNF: tumour necrosis factor, TRAIL: TNF-related apoptosis-inducing ligand. Η Cox-2 αποτελεί μέρος της οικογένειας γονιδίων Cox τα οποία έχουν σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα του κυττάρου. Η Cox-2 ενεργοποιείται μετά από θεραπεία με διάφορους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες όπως ο TGF β (transforming growth factor), ο TNF-α η ιντερλευκίνη IL 1β και από διάφορους άλλους στρεσογόνους παράγοντες [134]. Όλα αυτά τα ερεθίσματα προκαλούν ενεργοποίηση μονοπατιών που τελικώς οδηγούν στη γονιδιακή μεταγραφή του Cox-2. Ο Cox-2 αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για το μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνες [135], οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής φλεγμονής, στη καρκινογένεση και τη γονιδιακή αστάθεια. Δεδομένου ότι η φλεγμονώδης απάντηση συμπεριλαμβάνει και παραγωγή ελεύθερων οργανικών ριζών, με το μηχανισμό αυτό ενεργοποιούνται τόσο τα μιτοχόνδρια όσο και άλλες δομές στη κυτταρική μεμβράνη οι οποίες με τη σειρά τους επάγουν την απελευθέρωση ελεύθερων ριζών. 47

48 Σε κύτταρα με λειτουργικά μιτοχόνδρια έχει παρατηρηθεί επαγωγή του Cox-2 τόσο σε άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα όσο και σε παρακείμενα μη ακτινοβολημένα [118]. Για το λόγο αυτό η παρατήρηση ότι ο αναστολέας ενεργοποίησης του IKK- NF-κB, Bay μπορεί να αναστείλει το φαινόμενο εκ διαφυγής αποτελεί ένδειξη ότι τα μονοπάτια NF-κB- Cox-2- PGE2 και NF-κB-iNOs-NO είναι σημαντικά για τη πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής μετά από ακτινοβολία σε κύτταρα με λειτουργικά μιτοχόνδρια. Η αυξημένη έκφραση των inos και Cox-2 προκαλεί την παραγωγή NO και ελεύθερων ριζών οξυγόνου τα οποία καταστρέφουν τη φυσιολογική λειτουργία των μιτοχονδρίων. Η βλάβη των μιτοχονδρίων που προκαλείται έχει ως αποτέλεσμα τη θραύση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και την απελευθέρωση ανιόντων υπεροξειδίου στο κυτταρόπλασμα γεγονός που αυξάνει το οξειδωτικό στρες των κυττάρων [120]. Η παρατήρηση ότι το SOD και η καταλάση τα οποία είναι και τα δύο μεγάλα μόρια που δεν μπορούν να διέλθουν εύκολα από τη κυτταρική μεμβράνη, μπορούν να μειώσουν την ένταση του φαινομένου εκ διαφυγής, θα πρέπει να αποδοθεί στην ακόλουθη διαδικασία γεγονότων που οδηγεί στη δημιουργία ελεύθερων ριζών οξυγόνου. Υπεροξείδιο Υπεροξείδιο του υδρογόνου Ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου μπορεί να διέλθει εύκολα μεταξύ ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων περιοχών και η απομάκρυνση του με τη χορήγηση καταλάσης ή SOD έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του οξειδωτικού στρες στο κύτταρο. Η μείωση του οξειδωτικού στρες έχει ως αποτέλεσμα τον περιορισμό της βλάβης στη μιτοχονδριακή μεμβράνη και ως εκ τούτου τη μείωση της έντασης του φαινομένου εκ διαφυγής. 48

49 1.4 Το φαινόμενο εκ διαφυγής στην κλινική πράξη Η σημασία του φαινομένου εκ διαφυγής στην ακτινοθεραπεία Το φαινόμενο εκ διαφυγής παρατηρείται κυρίως σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας έως 200mGy και για το λόγο αυτό, είναι αμφίβολο το κατά πόσο μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην ακτινοθεραπεία η οποία λειτουργεί σε πολύ υψηλότερες δόσεις. Ωστόσο το σχετικά υψηλό ποσοστό των ασθενών που υποβάλλονται σε ακτινοθεραπεία και αναπτύσσουν δευτεροπαθείς καρκίνους υποδηλώνει κάποια συμμετοχή του φαινομένου εκ διαφυγής [136]. Η θεραπευτική αξία του φαινομένου εκ διαφυγής ενισχύεται με δεδομένα από πρόσφατη μελέτη όπου χρησιμοποιήθηκε ακτινοθεραπεία με μικροδέσμες [137]. Στη μελέτη αυτή δείχθηκε ότι συστοιχίες παράλληλων μικροδεσμών ακτινών-χ μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά σε καρκίνους του κεντρικού νευρικού συστήματος και να προκαλέσουν ελάχιστη βλάβη στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς. Σε άλλες πειραματικές σειρές [ ] όπου μελετάται η ακτινοθεραπεία όγκων του εγκεφάλου με μικροδέσμες αναδεικνύεται ασυνήθιστα υψηλή αντίσταση των φυσιολογικών ιστών στην ακτινοβολία με συστοιχίες μικροδεσμών και η μέθοδος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί επιτυχώς στη ριζική ή παρηγορητική θεραπεία των όγκων του εγκεφάλου. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το προκαλούμενο από μικροδέσμες φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να αποκλείσει όλους τους δυνητικούς στόχους στους φυσιολογικούς ιστούς καθιστώντας τους πιο ακτινοανθεκτικούς. Το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει εφαρμογή και στη γονιδιακή θεραπεία όπου απαιτείται κυτταρικός θάνατος σε περισσότερα κύτταρα από αυτά που πλήττονται με βιοδραστικούς ή χημειοτοξικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό η κατανόηση του φαινομένου εκ διαφυγής τονίζει τη δυνατότητα νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων που περιλαμβάνουν μηχανισμούς που σχετίζονται με διακυττάρια επικοινωνία και επιτρέπουν τη μεγέθυνση των κυτταροτοξικών αποτελεσμάτων. Επί παράδειγμα, πρόσφατα έχει δειχθεί ότι σήματα εξαρτώμενα από το NO απαιτούνται από τα καρκινικά κύτταρα προκειμένου να εκφραστεί το φαινόμενο εκ διαφυγής [141]. Οι παρατηρήσεις αυτές συμπίπτουν με τις προσπάθειες της γονιδιακής θεραπείας να εισάγουν inos στα καρκινικά κύτταρα για θεραπευτικούς σκοπούς [142], καθώς 49

50 επίσης και της στοχευμένης ακτινοβολίας για την αύξηση της έκφρασης της inos στα καρκινικά κύτταρα [143]. Η παραγωγή του NO επηρεάζει μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων από εκείνα που πλήττονται από την ακτινοβολία γεγονός που αυξάνει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας. Για το λόγο αυτό ο συνδυασμός της γονιδιακής θεραπείας και της στοχευμένης ακτινοθεραπείας μπορεί να αυξήσει τον κυτταρικό θάνατο λόγο του φαινομένου εκ διαφυγής [144]. Είναι ξεκάθαρο ότι απαιτούνται περισσότερες πληροφορίες ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου εμπλέκεται η ακτινοθεραπεία προτού να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για τον θεραπευτικό ρόλο του φαινομένου εκ διαφυγής Το φαινόμενο εκ διαφυγής και η καρκινογένεση Το φαινόμενο εκ διαφυγής όπως συνοψίζεται στον πίνακα 1, μπορεί να έχει σοβαρή επίπτωση τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στην αντιμετώπιση του με ακτινοθεραπεία. Ο μηχανισμός με τον οποίο το φαινόμενο αυτό προκαλεί ανεπιθύμητες κλινικές καταστάσεις παραμένει υπό διερεύνηση [145;146]. Είναι πιθανόν το φαινόμενο εκ διαφυγής να λειτουργεί ως ρυθμιστής των δόσεων ιοντίζουσας ακτινοβολίας που χορηγούνται με τη κλασματικοποιημένη ακτινοθεραπεία. Επί παραδείγματι πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι στα κύτταρα στα οποία προκαλείται μείωση της απάντησης του TP53/CDKN1A μέσω φαινομένου εκ διαφυγής δεν επιτυγχάνουν την αύξηση των επιπέδων του TP53 όταν ακτινοβοληθούν εκ νέου με χαμηλές δόσεις ιοντίζουσας ακτινοβολίας [147] και το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να λειτουργήσει αυξάνοντας ή μειώνοντας την ακτινοευαισθησία των παρακείμενων ιστών με μη προβλέψιμο τρόπο [114;148;149] [150]. Η έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής σε in vivo μελέτες είναι επί του παρόντος περιορισμένη. Ο Nagarkatti και οι συνεργάτες του [151] αναφέρουν ότι η εισπνοή ραδίου από ποντικούς μπορεί να προκαλέσει μεταβολές σε εξωπνευμονικές εστίες όπως ο σπλήνας, ο θύμος αδένας και οι περιφερικοί λεμφαδένες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκθεση σε α-σωματίδια μπορεί να προκαλέσει τη δημιουργία βιολογικώς ενεργών διαλυτών προϊόντων τα οποία μπορεί να δράσουν σε απομακρυσμένες μη ακτινοβολημένες περιοχές του σώματος. 50

51 Πληροφορίες σχετικά με τη πρόκληση καρκίνου δια μέσου φαινομένου εκ διαφυγής προέρχονται από τη βιβλιογραφία της ακτινοθεραπευτικής ογκολογίας όπου διάφοροι ερευνητές έχουν καταγράψει την ανάπτυξη δευτεροπαθών καρκίνων σε περιοχές απομακρυσμένες από το πεδίο ακτινοβόλησης. Οι μελέτες αυτές θα πρέπει να αντιμετωπιστούν με προσοχή δεδομένου ότι ακόμα και απομακρυσμένες ή αποκλεισμένες περιοχές μπορεί να απορροφήσουν χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας κατά την ακτινοθεραπεία. Επιπλέον με βάση τα ισχύοντα δεδομένα στην ακτινοθεραπεία, τα όρια του ακτινοθεραπευτικού πλάνου καθορίζονται από το 50% της ισοδοσιακής γραμμής γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα μικρό, πάντως όχι μηδενικό, μέρος της ακτινοβολίας μεταφέρεται ορισμένα εκατοστά πέρα των ορίων του πεδίου. Ένα επιπλέον στοιχείο που αυξάνει την πολυπλοκότητα της ανάλυσης των ασθενών με ανάπτυξη δεύτερων καρκίνων μετά από ακτινοθεραπεία είναι το γεγονός ότι οι ασθενείς αυτοί συχνά έχουν λάβει χημειοθεραπεία η οποία μπορεί να προκαλέσει άμεσα καρκινογένεση ή να μεταβάλλει τη κυτταρική ανταπόκριση στην ακτινοθεραπεία. Πίνακας 1: Η επίδραση της ακτινοβολίας σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα. (Goldberg Z, Lehnert BE. Radiation-induced effects in unirradiated cells: a review and implications in cancer. Int J Oncol Aug;21(2): ) Ανταλλαγή αδερφών χρωματίδων Σχηματισμός μικροπυρήνων Καταστροφή κυττάρων/ Όψιμος κυτταρικός θάνατος Αυξημένη συγκέντρωση ενδοκυττάριων ελεύθερων ριζών Απόπτωση Μεταβολές στην έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών Αυξημένη ακτινο-ανθεκτικότητα Μεταλλαξιογένεση Χρωμοσωμική αστάθεια Νεοπλασία 51

52 1.4.3 Εφαρμογή του φαινομένου εκ διαφυγής στην ακτινοπροστασία Σύμφωνα με το μοντέλο LNT (linear non Threshold) το οποίο στις μέρες μας αποτελεί το ισχύον δόγμα στην ακτινοπροστασία, ο κίνδυνος καρκινογένεσης εκτιμάται με βάση επιδημιολογικά δεδομένα που βασίζονται σε υψηλές δόσεις ακτινοβολίας και προέρχονται κυρίως από σειρές που μελετούν επιζήσαντες από ατομική βόμβα [152]. Η μέση δόση ακτινοβολίας στους επιζήσαντες από ατομική βόμβα ήταν περίπου 0,3Gy και αντιστοιχεί σε κυτταρικό επίπεδο και αγνοώντας το μικρό ποσοστό των νετρονίων σε 300 ηλεκτρόνια που πλήττουν το κύτταρο σε μικρό χρονικό διάστημα. Η χαμηλής δόση περιβαλλοντολογική έκθεση αντιστοιχεί σε περίπου 1 mgy ανά έτος χαμηλής LET ακτινοβολίας, το οποίο κατά προσέγγιση αντιστοιχεί σε ένα ηλεκτρόνιο ανά κύτταρα ανά χρόνο. Ο κίνδυνος σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας μπορεί να είναι διαφορετικός από ότι προβλέπεται από τα επιδημιολογικά δεδομένα από υψηλές δόσεις ακτινοβολίας και δεν υπάρχουν αξιόπιστα επιδημιολογικά δεδομένα για τις χαμηλές αυτές δόσεις. Το φαινόμενο εκ διαφυγής δεν έχει γραμμική συσχέτιση με τη δόση και προκαλείται στο μέγιστο βαθμό του σε πολύ χαμηλές δόσεις γεγονός που υποδηλώνει μηχανισμό άμεσης ενεργοποίησης. Στη γενική της μορφή η καμπύλη ανταπόκρισης του φαινομένου εκ διαφυγής μπορεί να έχει εφαρμογή για τη διερεύνηση των κινδύνων της ακτινοβολίας στη περιοχή των χαμηλών δόσεων. Το κύριο λοιπόν ερώτημα είναι το κατά πόσο το φαινόμενο εκ διαφυγής είναι ένας προστατευτικός μηχανισμός ή μια μη ειδική βλάβη από την ακτινοβολία. Υπάρχουν ενδείξεις σύμφωνα με τις οποίες το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να είναι επιβλαβές. Πολλές ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες έχουν παρουσιάσει στοιχεία μεταλλαξιογένεσης από το φαινόμενο εκ διαφυγής [61;63;90], και έχει αποδειχθεί χρωμοσωμική βλάβη στα παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα μετά από χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας [89;93]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα στοιχεία το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να προκαλέσει αύξηση του κινδύνου καρκινογένεσης ακόμα και σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας. Τα περισσότερα δεδομένα που δείχνουν τον επιζήμιο χαρακτήρα του φαινομένου εκ διαφυγής προέρχονται από in vitro μελέτες σε φυσιολογικές ή γονιδιακά τροποποιημένες κυτταρικές σειρές. Το γεγονός καθιστά δύσκολη την εφαρμογή των δεδομένων αυτών στο προσδιορισμό του κινδύνου καρκινογένεσης στους ανθρώπους. Υπάρχουν ωστόσο στοιχεία της προστατευτικής φύσης του 52

53 φαινομένου εκ διαφυγής. Αυξημένη διαφοροποίηση έχει δειχθεί σε παρακείμενα της ακτινοβολίας ουροεπιθηλιακά κύτταρα καθώς και μικρός βαθμός κυτταρικής βλάβης μετά από ακτινοβόληση με μικροδέσμες. Ο Matsumoto [114;115] έδειξε ότι η επιβίωση αυξάνει σε κύτταρα όπου μεταφέρεται το υπερκείμενο μέσο από ακτινοβολημένα κύτταρα. Παρόμοια δεδομένα με αύξηση του πολλαπλασιασμού έχουν αναφερθεί από τον Iyer [153], παρότι άλλοι συγγραφείς ερμηνεύουν τα δεδομένα αυτά ως ένα βήμα προς τη καρκινογένεση. Τέλος ο Barcellos-Hoff [96] δημοσίευσε δεδομένα σύμφωνα με τα οποία προτείνει μια θεωρεία όπου το φαινόμενο εκ διαφυγής λειτουργεί ως μηχανισμός για τη διατήρηση της δομής των ιστών. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να μειώνει τον κίνδυνο καρκινογένεσης σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας. Ο μικρός βαθμός κατανόησης των μηχανισμών πρόκλησης του φαινομένου εκ διαφυγής in vivo από την ακτινοβολία δεν επιτρέπει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων όσο αναφορά την αύξηση ή τη μείωση του κινδύνου ανάπτυξης καρκίνου στον άνθρωπο. Η δυνατότητα εφαρμογής των συμπερασμάτων που προκύπτουν από in vitro μελέτες στην in vivo κατάσταση παραμένει αβέβαιη. Ο κίνδυνος σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας μπορεί να είναι υψηλότερος ή χαμηλότερος από ότι προβλέπεται με βάση τη γραμμική συσχέτιση που παρατηρείται σε υψηλές δόσεις. Ωστόσο το φαινόμενο εκ διαφυγής ξεκάθαρα συνδέεται με ένα κίνδυνο που δεν έχει γραμμική συσχέτιση με τη δόση. Επί του παρόντος δεν είναι ασφαλής ο υπολογισμός του κινδύνου καρκινογένεσης στη βάση των in vitro και in vivo μελετών του φαινομένου εκ διαφυγής Παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής Είναι γνωστό από την ακτινοθεραπεία ότι πολλοί σημαντικοί παράγοντες καθορίζουν την ανταπόκριση στην θεραπεία και ως εκ τούτου την αποτελεσματικότητα της. Τέτοιοι παράγοντες είναι η κατανομή του κυτταρικού κύκλου, η επιδιόρθωση των κυττάρων καθώς και η ακτινοευαισθησία τους [154]. Επιπρόσθετα άλλοι σημαντικοί παράγοντες είναι η ποιότητα της ακτινοβολίας, η συχνότητα των συνεδριών και η κλασματοποίηση των δόσεων [155]. Θα ήταν ενδιαφέρον να γνωρίζουμε τον ρόλο των παραπάνω παραγόντων στην έκφραση του φαινομένου εκ διαφυγής. Παρότι ως σήμερα οι πληροφορίες είναι περιορισμένες, 53

54 έχουν προκύψει πρόσφατα στοιχεία που αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της βλάβης στο DNA καθώς και των επιδιορθωτικών μηχανισμών που εμπλέκονται σε κύτταρα παρακείμενα της ζώνης ακτινοβόλησης [156;157]. Ένα σημαντικό στοιχείο το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μελλοντικές θεραπείες είναι η διαφορετική ανταπόκριση στη βλάβη του DNA που παρατηρείται στα άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα και στα παρακείμενα γειτονικά τους [158]. Στα άμεσα ακτινοβολημένα κύτταρα οι κινάσες ATM, DNAPK και ATR λειτουργούν ως αισθητήρες της βλάβης του DNA και η αναστολή τους αυξάνει την ακτινοευαισθησία. Αντίθετα στα παρακείμενα κύτταρα η αναστολή των ATR ή ATM περιορίζει τον θάνατο. Στην ακτινοθεραπεία η κλασματοποίηση των δόσεων έχει χρησιμοποιηθεί προκειμένου να βελτιωθεί ο λόγος θανάτου των καρκινικών κυττάρων προς τα φυσιολογικά κύτταρα καθότι ο κερματισμός της δόσης δίνει χρόνο στα φυσιολογικά κύτταρα να επιδιορθωθούν μεταξύ των δόσεων. Ένα ανάλογο αποτέλεσμα επιτυγχάνεται με τη μείωση της συχνότητας των συνεδριών. Ωστόσο σχεδόν όλες οι μελέτες του φαινομένου εκ διαφυγής χρησιμοποιούν εφάπαξ συνεδρία (single fraction) υψηλής δόσης. Σε μια μελέτη εξετάστηκε η επίδραση της συνεχούς προσθήκης υποστρώματος από ακτινοβολημένα κύτταρα σε παρακείμενα μη ακτινοβολημένα κύτταρα καθώς επίσης και η συνεχόμενη έκθεση σε ακτινοβολία σε κύτταρα που παράγουν σήματα που προκαλούν το φαινόμενο εκ διαφυγής μιμούμενοι με αυτόν τον τρόπο τη κλασματικοποιημένη έκθεση στην ακτινοβολία. Οι συγγραφείς της παραπάνω μελέτης συμπεραίνουν ότι η κλασματικοποιημένη θεραπεία, μέσω φαινομένου εκ διαφυγής, δεν συνοδεύεται από την κλασική απώλεια δόσεων που παρατηρείται στη κλασματικοποιημένη ακτινοθεραπεία λόγο του κενού μεταξύ των συνεδριών που εξασφαλίζουν χρόνο για την επιδιόρθωση του DNA [159]). Λόγο της σημαντικής προόδου στην εξωτερική ακτινοθεραπεία και ιδίως με τη τρισδιάστατη σύμμορφη ακτινοθεραπεία (3D CRT) είναι πλέον εφικτή η ακτινοβόληση όγκων υψηλής αναπαραγωγικότητας [160]. Η 3D CRT ως πρώτο βήμα αναγνωρίζει τον μακροσκοπικό όγκο στόχο (GTV/ gross tumor volume) που αντιπροσωπεύει τον ορατό όγκο (όπως εντοπίζεται κλινικά ή απεικονιστικά με CT). Με τη προσθήκη ενός περιθωρίου προκειμένου να συμπεριλαμβάνεται και η μικροσκοπική επέκταση του όγκου το GTV μετατρέπεται σε κλινικό όγκο στόχο (CTV/ clinical tumor volume). Ο όγκος στόχου για σχεδιασμό ακτινοθεραπείας (PTV/ planning target volume) είναι ο CTV και ένα όριο προκειμένου να 54

55 συμπεριλαμβάνονται και οι κινήσεις των οργάνων ή οι πιθανές δυσμορφίες. Τα ακτινοθεραπευτικά πλάνα αξιολογούνται με βάση την ομοιογένεια της δόσης στο PTV καθώς επίσης και από τη δόση που μεταφέρεται στα όργανα σε κίνδυνο (OR/ organs at risk). Τα κριτήρια αυτά προσδιορίζονται με τη χρήση ιστογραμμάτων δόσης-όγκου (DVH/ dose volume histograms). Σήμερα υπάρχουν επαρκεί κλινικά δεδομένα που σχετίζουν το DVH με τα αποτελέσματα που οφείλονται στην τοξικότητα της ακτινοθεραπείας [161]. Η ακτινοθεραπεία με χρήση πεδίων ακτινοβολίας διαμορφούμενης έντασης (ΙΜRΤ/ indensity modulated radiation therapy) αποτελεί μια εξέλιξη του 3D CRT στην οποία η διαφοροποίηση της ένταση της δέσμης στο χώρο και το χρόνο επιτρέπει τη διαμόρφωση υψηλής δόσης ακτινοβολίας που είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία μεγάλων σύνθετων όγκων [162]. Η τεχνική αυτή έχει ως αποτέλεσμα τα OR να εκτίθενται στις χαμηλότερες δόσεις ακτινοβολίας. Είναι λογικό να υποθέτει κανείς ότι οι μεγαλύτεροι όγκοι ακτινοβολημένων ιστών συνοδεύονται από μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης φαινομένου εκ διαφυγής, ενώ αντίθετα η προσεκτική στόχευση του όγκου έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της δόσης στη περιοχή του PTV. Στο μέλλον μπορεί να είναι επίσης εφικτή η κλιμάκωση των δόσεων σε συγκεκριμένες περιοχές μέσα στον όγκο όπως σε ακτινοανθεκτικές περιοχές γεγονός που θα οδηγήσει σε βελτίωση του θεραπευτικού αποτελέσματος και θα περιορίσει τη διάχυση της δόσης στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό επιτυγχάνεται με οριοθέτηση του βιολογικού TV (target volume) όγκου-στόχου, έτσι ώστε επιπλέων δόσεις ακτινοβολίας να πλήττουν τον όγκο αυξάνοντας τη συνολική δόση που αυτός λαμβάνει [163]. Τα οφέλη της ακτινοθεραπείας με τη χρήση του IMRT μπορεί να γίνουν πλήρως κατανοητά με τη χρήση απεικονιστικά καθοδηγούμενης ακτινοθεραπείας (IGRT/ image guided radiation therapy). Η τεχνολογία αυτή χρησιμοποιεί ποικίλες τεχνικές για να απεικονίσει τον όγκο-στόχο ενώ οι ασθενείς ταυτόχρονα αντιμετωπίζονται από ένα γραμμικό επιταχυντή. Με την ελαχιστοποίηση των τεχνικών σφαλμάτων η IGRT εξασφαλίζει την ακρίβεια της θεραπείας και μειώνει τα όρια που προστίθενται στο CTV [164]. Ελάχιστα είναι γνωστά για το βαθμό που το φαινόμενο εκ διαφυγής επηρεάζει το ακτινοθεραπευτικό αποτέλεσμα. Σε μια πρόσφατη μελέτη ο Suchowerska και οι συνεργάτες του [165] μελετούν την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας σε διάφορες δόσεις. Στη μελέτη αυτή μέτρησαν την επιβίωση των κυττάρων που εκτίθονταν σε ακτίνες Χ 6MV από δέσμες διαμορφούμενης έντασης τα οποία είχαν 55

56 τοποθετηθεί σε διαμερισματοποιημένο ειδικό τρυβλίο έτσι ώστε τα κύτταρα να ακτινοβολούνται ξεχωριστά και να μοιράζονται το ίδιο υπόστρωμα. Κύτταρα τα οποία μπορούσαν να επικοινωνούν μέσω του ίδιου κυτταρικού μέσου είχαν χαμηλότερη επιβίωση από την αναμενόμενη σε χαμηλές δόσεις ακτινοβόλησης και υψηλότερη επιβίωση από την αναμενόμενη σε υψηλές δόσεις. Τα αποτελέσματα αυτά μεταβάλλονταν όταν η επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων παρεμποδίζονταν γεγονός που υποδηλώνει σημαντική μεταβολή του αποτελέσματος σε καταστάσεις όπου παρατηρείται διακύμανση των δόσεων. Ο δεύτερος σημαντικός ρόλος του φαινομένου εκ διαφυγής αφορά την ακτινοπροστασία και τη καρκινογένεση. Στις περισσότερες εξωτερικές ακτινοθεραπείες χρησιμοποιούνται πολλαπλές δέσμες από διαφορετικές κατευθύνσεις προκειμένου να αυξηθεί η δόση στον όγκο και να ελαχιστοποιηθεί η έκθεση των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Αποτέλεσμα της χρήσης του IMRT είναι μεγαλύτερος όγκος φυσιολογικού ιστού να εκτίθεται σε χαμηλότερες δόσεις ακτινοβολίας από ότι στη κλασική ακτινοθεραπεία. Αυτό είναι πρωτίστως το αποτέλεσμα της χρήσης πολλαπλών δεσμών καθώς και της αύξησης του χρόνου που απαιτείται για τη χορήγηση της προαποφασισμένης δόσης. Οι νεότερες εξελίξεις στις θεραπείες διαμορφωμένων δεσμών περιλαμβάνουν την κυλιόμενη χορήγηση της ακτινοβολίας με τη χρήση της τομοθεραπείας του Rapid Arc και του VMAT (volumetric modulated arc therapy) τα οποία έχουν ως αποτέλεσμα τη συγκέντρωση μεγαλύτερης δόσης ακτινοβολίας στον όγκο συγκριτικά με το 3D CRT και το IMRT. Ωστόσο, έχει ειπωθεί ότι η αύξηση της περιοχής που εκτίθεται σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας μπορεί να οδηγήσει μακροπρόθεσμα σε δυο έως τρείς φορές αύξηση της συχνότητας εμφάνισης δεύτερων καρκίνων. Είναι λοιπόν σημαντικό να ξεκαθαριστεί το κατά πόσο οι παραπάνω μορφές χορήγησης ακτινοβολίας επιδρούν στην υγεία των ασθενών [166]. Ένα άλλο πεδίο όπου το φαινόμενο εκ διαφυγής μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο είναι η θεραπευτική χρήση των ραδιονουλεοτιδίων. Το φαινόμενο εκ διαφυγής έχει μελετηθεί τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo μελέτες με τη χρήση ποικίλων ραδιονουκλεοτιδίων. Οι πρώτες μελέτες του προκαλούμενου από ραδιονουκλεοτίδια φαινομένου εκ διαφυγής χρησιμοποίησαν σεσημασμένο με 3 H DNA το οποίο παράγονταν από τη φυγοκέντριση κυττάρων με [ 3 H] θυμιδίνη. Η μέση ενέργεια των ακτινών Β είναι 5.67KeV και το μέσο βεληνεκές τους είναι 1μm. Ο Bishayee και οι συνεργάτες του συνέκριναν την αποτελεσματικότητα αδρανοποίησης που 56

57 προκαλούσαν ραδιοσημασμένα κύτταρα όταν τοποθετούνταν σε μικρά πολυκυτταρικά σφαιρίδια διαμέτρου 1.6μm τα οποία αποτελούνταν από 4x10 6 κύτταρα V79. Παρατήρησαν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα σε καταστάσεις όπου σημαίνονταν μόνο το 50% των κυττάρων συγκριτικά με καταστάσεις όπου σημαίνονταν το 100% των κυττάρων, γεγονός που αποδόθηκε στο φαινόμενο εκ διαφυγής. Επιπλέον μελέτησαν τη διακυττάρια επικοινωνία μέσω χασματοσυνδέσμων με τη χρήση Lindane, ενός παράγοντα που αναστέλλει τη λειτουργία των χασματοσυνδέσμων, και βρήκαν σημαντικές ενδείξεις άμεσης διακυττάριας επικοινωνίας [167]. Μελέτες του φαινομένου εκ διαφυγής, με τη χρήση ραδιονουκλεοτιδίων, έχουν πραγματοποιηθεί και σε in vivo συνθήκες. Σε μία μελέτη, όπου κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου παχέος εντέρου LS174T τα οποία είχαν προσημανθεί με [ 125 I] ουριδίνη και είχαν εγχυθεί υποδορίως σε ποντικούς μαζί με μη σημασμένα κύτταρα, δημιουργώντας αναλογίες 1:1 και 1:5 σημασμένων προς μη σημασμένα κύτταρα, καταγράφηκε σημαντική μείωση του καρκίνου στα μη σημασμένα κύτταρα [168]. Σε περαιτέρω μελέτες όπου χρησιμοποιήθηκε σήμανση με 125 I και 123 I καταγράφηκε αναστολή του φαινομένου εκ διαφυγής όταν η σήμανση γινόταν με 125 I και επαγωγή του φαινομένου όταν η σήμανση γινόταν με 123 I παρατήρηση που επιβεβαιώθηκε και με in vitro μελέτες. Ο λόγος για τη διαφορά αυτή δεν είναι ξεκάθαρος αλλά πιθανώς να οφείλεται στη διαφορά της ημίσειας ζωής (το 123 I έχει ημίσεια ζωή 13.3 ώρες και το 125 I 60.5 ημέρες). Η πρόκληση του φαινομένου εκ διαφυγής από ραδιονουκλεοτίδια έχει σημαντική αξία στη κλινική πράξη και έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος με τη χρήση ραδιονουκλεοτιδίων. Επί παραδείγματι είναι πλέον εφικτό να στοχεύονται μικρές μεταστατικές εστίες που δεν είναι προσπελάσιμες με τη κλασική εξωτερική ακτινοθεραπεία ενώ επιπλέον μπορούν να εφαρμοστούν θεραπευτικά πρωτόκολλα με ειδικότητα σε συγκεκριμένα καρκινικά κύτταρα [ ]. Παλαιότερες μελέτες έχουν προβλέψει ότι η χρήση ραδιονουκλεοτιδίων που παράγουν ηλεκτρόνια σε σχετικά μεγάλο βεληνεκές και ως εκ τούτου αλληλεπιδρούν με πολλά κύτταρα θα ήταν ωφέλιμη λόγο της μεγάλης διασποράς. Επί παραδείγματι μελέτες σε πολυκυτταρικά συστήματα έχουν δείξει ότι η αποτελεσματικότητα ( 131 I) MIBG είναι διπλάσια από αυτή που παρατηρείται σε μελέτες με μονοστοιβάδες κυττάρων γεγονός που οφείλεται στη διάχυση της δόσης που οφείλεται στο μεγάλο βεληνεκές των ακτινών Β [172]. Εφόσον οι πρόσφατες μελέτες επικεντρωθούν στη 57

58 καταστροφή του καρκίνου καθίσταται σαφές ότι το φαινόμενο εκ διαφυγής και η διάχυση της δόσης μπορούν να επιτύχουν επιπλέον κυτταρικό θάνατο. Μελλοντικές θεραπείες με ραδιονουκλεοτίδια θα πρέπει εκ πρωίμου να συμπεριλαμβάνουν και το φαινόμενο εκ διαφυγής στο τελικό αποτέλεσμα. Η υπόθεση ότι η συχνότητα των δόσεων μπορεί να είναι σημαντική θα πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω τόσο στην εξωτερική ακτινοθεραπεία όσο και στη θεραπεία με τη χρήση ραδιονουκλεοτιδίων καθότι μπορεί να επηρεάσει ακόμη και τη προσέγγιση με βραχυθεραπεία. Μέχρι σήμερα οι γνώσεις μας για την επαγωγή του φαινομένου εκ διαφυγής από ραδιονουκλεοτίδια είναι σχετικά περιορισμένη. Επιπλέον δεν γνωρίζουμε τις επιπτώσεις της έκθεσης σε χαμηλές δόσεις ραδιονουκλεοτιδίων όπου το φαινόμενο εκ διαφυγής που περιγράφεται σε in vitro μελέτες αναπαραχθεί και in vivo θα μπορούσε να επηρεάσει τη χρήση των ραδιονουκλεοτιδίων σε θεραπευτικές και απεικονιστικές εφαρμογές. 58

59 1.5 Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) Στις μέρες μας η έρευνα έχει επικεντρωθεί σε μια προσπάθεια διερεύνησης των διαφορών μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων προκειμένου να αναπτυχθούν θεραπείες κατά των καρκινικών κυττάρων. Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας- EGF (epidermal growth factor) καθώς και οι υποδοχείς του (EGFR, ErbB-1, or HER-1) έχει δειχθεί ότι έχουν σημαντικό ρόλο τόσο στο πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών κυττάρων όσο και στην καρκινογένεση καθώς και την εξάπλωση της κακοήθους νόσου [173]. Ο EGFR ανευρίσκεται στην επιφάνεια των φυσιολογικών κυττάρων ωστόσο παρατηρείται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στην επιφάνεια ποικίλων επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων. Η ενεργοποήση του EGFR συνοδεύεται από αυξημένο πολλαπλασιασμό καθώς και επαγωγή άλλων καρκινικών δραστηριοτήτων γεγονός που αιτιολογεί την ανάγκη ανάπτυξης θεραπειών έναντι αυτού του υποδοχέα. Κατά την τελευταία δεκαετία η έρευνα είχε επικεντωθεί στην ανάπτυξη μοριακών θεραπειών. Σήμερα, ο EGFR αποτελεί κύριο στόχο της αντικαρκινικής θεραπείας, με μεγάλο φάσμα αναστολέων του συγκεκριμένου υποδοχέα να είναι υπό διερεύνηση [174]. Ο EGFR είναι μία γλυκοπρωτεϊνη 170 kda, η οποία προέρχεται από ένα γονίδιο που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7p12 [175]. Ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων ErbB (EGFR ή Her-1, Her-2, Her-3, and Her-4). Οι υποδοχείς αυτοί αποτελούνται από μία εξωκυτάρια θέση σύζευξης, μία υδρόφοβη μοίρα που διαπερνά την μεμβράνη και από μία ενδοκυττάρια μοίρα κινάσης της τυροσίνης. Η σύζευξη του EGFR με τον EGF ή με τον TGF-α (transforming growth factor alpha) συνοδεύεται από δομικές αλλάγές στον υποδοχέα γεγονός που οδηγεί στον όμο-δυμερισμό με άλλα μόρια EGFR ή σε έτερο-δυμερισμό με άλλα μέλη της οικογένειας HER και πιο συγκεκριμένα με τον Her-2. Οι δομικές αυτές αλλαγές έχουν ως αποτέλεσμα την αυτοενεργοποίηση της κινάσης της τυροσίνης στην ενδοκυτταρική μοίρα του υποδοχέα. Η διαδικασία αυτή, οδηγεί στην ενεργοποίηση ενδοκυττάριων μονοπατιων επαγωγής σημάτων με αποτέλεσμα την αναστολή της 59

60 απόπτωσης, την ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού και της αγγειογέννεσης καθώς και τη αύξηση της μεταστατικής διασποράς [176] EGFR και ακτινοβολία Η επίπτωση της ακτινοβολίας στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων έχει μελετηθεί εκτενώς σε μελέτες με ακτινοθεραπεία καρκίνων κεφαλής και τράχηλου. Η αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία είναι υπεύθυνη, τουλάχιστο μερικώς, για την άκτινο-ανθεκτικότητα που παρουσιάζουν οι καρκίνοι της κεφαλής και του τράχηλου. Στοιχεία από προκλινική μελέτη αναδεικνύουν τη σημαντική δράση του EGFR στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία καθώς και την ανταγωνιστική του δράση στην τοξικότητα της ακτινοθεραπείας [177]. Πράγματι, η ακτινοθεραπεία μπορεί να συνοδεύεται από πρώιμη ενεργοποίηση του EGFR μέσω απελευθέρωσης TGF-α ή άλλων συνδέσμων του EGFR [178]. Η αναστολή της ενεργοποίησης του EGFR που προκαλείται από την ακτινοβολία, αποτελεί σημαντικό βήμα για τη συνέργεια της ακτινοθεραπείας με αναστολείς του EGFR και όπως έχει δειχθεί σε in vitro μελέτη [179] οδηγεί σε άκτινο-ευαισθησία. Ωστόσο, θα πρέπει να υπογραμμιστεί, ότι δεν υπάρχει ξεκάθαρη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του EGFR και του βαθμού άκτινο-ευαισθησίας που επιτυγχάνεται με τη χρήση αντί-egfr παραγόντων. Επιπρόσθετα, δεν έχει καταστεί δυνατή η ταυτοποίηση συγκεκριμένων καρκίνων που παρουσιάζουν άκτινοανθεκτικότητα λόγω αυξημένης δράσης του EGFR, ώστε να καταστεί δυνατή η θεραπεία τους με χρήση αναστολέων του EGFR [180] Η προγνωστική αξία της υπέρ-έκφρασης του EGFR Στα φυσιολογικά κύτταρα, η ανεύρεση του EGFR κυμαίνεται από 40,000 έως100,000 υποδοχείς ανά κύτταρο [181]. Σε καρκίνους της κεφαλής και του 60

61 τραχήλου, ο EGFR και ο σύνδεσμος του TGF-α, υπέρ-εκφράζονται στο 80-90% των περιπτώσεων και σε βαθμό 1,7 και 1,9 φορές περισσότερο, αντίστοιχα, συγκριτικά με τα φυσιολογικά κύτταρα [182]. Η υπέρ-έκφραση αυτή του EGFR έχει δειχθεί ότι είναι ανάλογη με την παρατηρούμενη ιστολογική ανωμαλία και η αύξηση είναι εκθετική κατά την μετάπτωση από τη δυσπλασία στον διηθητικό καρκίνο [183]. Το πλείστο των προ-κλινικών και κλινικών μελετών, έχουν δείξει μικρότερο βαθμό τοπικού ελέγχου της νόσου σε καρκίνους που παρουσιάζουν υπέρ-έκφραση του EGFR [184]. Σε μία πρόσφατη μελέτη σε 140 ασθενείς με καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του λάρυγγα, δείχθηκε ότι η πενταετής επιβίωση ήταν 81% σε ασθενείς όπου δεν παρατηρήθηκε υπέρ-έκφραση του EGFR και 25% σε ασθενείς με όγκους που παρουσίαζαν υπέρ-έκφραση του EGFR (P<0,0001) [185]. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν υποστηριχθεί και από άλλη μελέτη [186], γεγονός που αναδεικνύει την σημαντική αξία της υπέρ-έκφρασης του EGFR ως προγνωστικό παράγοντα Αναστολή της δράσης του EGFR Πρόσφατα, η έρευνα έχει επικεντρωθεί στην ανάπτυξη θεραπειών με τη χρήση αντί-egfr παραγόντων. Επί του παρόντος δύο θεραπευτικές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί. Στην πρώτη περίπτωση, η εξωκυττάρια μοίρα του υποδοχέα στοχεύετε με μονοκλωνικά αντισώματα (cetuximab, C225, ή Erbitux ) με αποτέλεσμα τη σύζευξη του αντισώματος με τον EGFR γεγονός που εμποδίζει την σύζευξη του με τον ενδογενή του σύνδεσμο και κατά επέκταση την ενεργοποίηση του. Επιπλέον, με τη θεραπεία αυτή επιτυγχάνεται η αποδόμηση του συμπλέγματος αντισώματος-υποδοχέα και η αναστολή της υπέρ-έκφρασης του EGFR [187]. Κατά τη δεύτερη θεραπευτική προσέγγιση, η ενδοκυττάρια μοίρα του υποδοχέα στοχεύετε με χαμηλού μοριακού βάρους αναστολείς της κινάσης της τυροσίνης (gefitinib, ZD 1839, Iressa ; erlotinib, OSI 774, Tarceva ) οι οποίοι ανταγωνίζονται με το ATP στις θέσεις σύζευξης στην ενδοκυττάρια μοίρα του EGFR [187]. Οι παραπάνω θεραπευτικές προσεγγίσεις, δεν συνοδεύτηκαν από 61

62 ικανοποιητικά κλινικά αποτελέσματα όταν χρησιμοποιήθηκαν ως μονοθεραπείες και παρατηρήθηκε περισσότερο κυτταροστατικό παρά κυτταροτοξικό αποτέλεσμα [188]. Επιπλέον, η χρήση αναστολέων του EGFR σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία συνοδεύτηκε εξίσου από απογοητευτικά αποτελέσματα [189]. Το 2000, ο Bonner και οι συνεργάτες του παρουσίασαν μία σειρά καρκινικών πλακωδών κυττάρων του λάρυγγα όπου με συνδυασμό cetuximab (5 μg/l) και ακτινοθεραπείας (3Gy) επιτυγχάνονταν σημαντικότερος βαθμός αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συγκριτικά με τη χρήση των παραπάνω παραγόντων ως μονοθεραπεία, ανεξάρτητα από τον βαθμό έκφρασης του EGFR στην κυτταρική σειρά [190]. Τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα αποτέλεσαν το υπόβαθρο πολλών προκλινικών και κλινικών μελετών. Ωστόσο, θα πρέπει να υπογραμμιστεί, ότι η παραπάνω μελέτη πραγματοποιήθηκε σε μία εποχή όπου σύμφωνα με το ισχύον δόγμα η ακτινοθεραπεία ως μονοθεραπεία ήταν αποδεκτή για καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου. Σήμερα, ο συνδυασμός χημειοθεραπείας- ακτινοθεραπείας θεωρείται πιο αποτελεσματική θεραπεία για τους ασθενείς αυτούς. Το γεγονός αυτό έχει οδηγήσει την έρευνα σε μελέτες με συνδυασμό cetuximab, χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας και επί του παρόντος μεγάλες σειρές κλινικών μελετών είναι σε εξέλιξη. 62

63 1.6 Μεταλοπρωτεϊνάσες To εξωκυττάριο δίκτυο (ECM) συντίθεται από πρωτεΐνες ινικής διασκορπισμένες σε γέλη πολυσακχαριτών. Το ECM περιλαμβάνει δύο ομάδες μακρομορίων- το κολλαγόνο και τα γλυνοαμινογλυκίδια. Εκτός από το κολλαγόνο, υπάρχουν επίσης και τα μόρια της ελαστίνης τα οποία σχηματίζουν δίκτυα ινικής. Τα μόρια της φιμπρονεκτίνης (fibronectin) επάγουν την προσκόλληση των κυττάρων σχηματίζοντας μεγάλες συναθροίσεις κυττάρων στον εξωκυττάριο χώρο [191]. Η αναδόμηση του ECM είναι σημαντικό βήμα για την μετακίνηση των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη [192]. Οι μεταβολές στο ECM ελέγχονται από ένα σύστημα πρωτεολυτικών ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την πρωτεόλυση σημαντικού αριθμού παραγόντων του ECM. Μέσω ελέγχου της σύνθεσης και της δομής του ECM τα ένζυμα αυτά επιτελούν σημαντική λειτουργία στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση καθώς στη διαδικασία της απόπτωσης [193]. Η διαδικασία της ανασύνθεσης του ECM θα πρέπει να πραγματοποιείται υπό στενό έλεγχο καθώς η άναρχη συνάθροιση στοιχείων του ECM ή η ανεξέλεγκτη πρωτεόλυση μπορεί να οδηγήσει σε ποικίλες παθολογικές καταστάσεις. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα που εμπλέκονται στις μεταβολικές διαδικασίες του ECM είναι οι πρωτεάσες του ασπαρτικού (aspartyl), της κυστεϊνης (cystyl), της σερίνης (serine) και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες [191]. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του δικτύου (matrix metallopreinases- MMPs) αποτελούν την κύρια ομάδα πρωτεάσων που ελέγχουν την δομή του ECM. Είναι ενδοπεπτίδια, εξαρτώμενα από μόρια ψευδαργύρου (Zn 2+ ) και ασβεστίου, τα οποία έχουν μία κοινή πεπτιδική άλυσο, γλυκοσυλιωμένη σε ποικίλους βαθμούς και θέσεις (3/4). Οι MMPs έχουν σημαντικό ρόλο στην αναδόμηση των ιστών που παρατηρείται σε ποικίλες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένου της ογκογένεσης και της μετάστασης. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν κοινή δομή που αποτελείται από τέσσερις κύριες περιοχές: το προ-πεπτίδιο, την καταλυτική θέση, τον δακτύλιο της αιμοπεξίνης (haemopexin) και τη δια-μεμβρανική περιοχή (σχήμα 13) [194]. Η προ-πεπτιδική περιοχή περιλαμβάνει ένα μόριο κυστεϊνης που συνδέεται με ψευδάργυρο στην θέση ενεργοποίησης σχηματίζοντας τον «διακόπτη» (switch) της κυστεϊνης. Η σύνδεση της κυστεϊνης στην καταλυτική θέση απομονώνει την θέση ενεργοποίησης του 63

64 ψευδάργυρου και διατηρεί την ανενεργό κατάσταση [195]. Παρότι, υπάρχει συνεχής παραγωγή MMPs, τα ένζυμα αυτά παραμένουν ανενεργά μέχρι να ενεργοποιηθούν από ελεύθερες ρίζες ή ένζυμα που απελευθερώνουν τον δεσμό της κυστεϊνης ή διακόπτουν την προ-πεπτιδική περιοχή. Σχήμα 13: Ένα πεπτίδιο σε μία περιοχή του προπεπτιδίου σχηματίζει ένα μέρος του διακόπτη της κυστεϊνης και σχηματίζει πτυχή στην καταλυτική περιοχή του ψευδάργυρου με αποτέλεσμα το μόριο να παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση. Μία περιοχή αποδόμησης επιτρέπει στο ένζυμο της Furin να ενεργοποιεί τις MMPs μέσω αποδόμησης του προπεπτιδίου. Μία περιοχή δέσμευσης της FN ανευρίσκεται στις MMP2 και MMP9 και τις συνδέει με τη βασική μεμβράνη. Η καταλυτική περιοχή του ψευδάργυρου ανεβρίσκεται σε όλες τις MMPs. AP=activator protein. C/EBP=CCAAT/enhancer-binding protein. CIZ=CAS-interacting zinc-finger protein. CREB=cyclic AMP response-element binding protein. EGR=early growth response site. FN=fibronectin. HP= haemopexin. ISE=immortalisation-sensitive element. KRE=keratinocyte differentiation-factor responsive element. MMP=matrix metalloproteinase. MT=membrane type. NF-κB=nuclear factor-κb. PEA= polyomavirus enhancer-a binding-protein. Pre-Pro= prepropeptide. RCE=retinoblastoma control element. SP= specificity protein. SPRE=stromelysin-1 platelet-derived growth factor β responsive element. STAT=signal transducer and activator of transcription. TBS=translocation-ETS-leukaemia binding site. TCF=T-cell factor site. TIE=transforming growth factor β inhibitory element. TMD= transmembrane domain. ZBP=zincbinding protein. Τροποποιηθέν από: Overall CM, Lopez-Otin C. Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for the post-trial era. Nat Rev Cancer 2002; 2: