ΙΙΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ και ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

Transcript

1 Ιικοίφορείς ΙΙΚΟΙΦΟΡΕΙΣκαιΙΑΤΡΙΚΕΣΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Ολοιοιιοίμολύνουντουςξενιστέςτουςκαιεισάγουντογενετικότουςυλικόστακύτταρατουξενιστή στα πλαίσια του αναπαραγωγικού τους κύκλου. Το ιικό γενετικό υλικό περιέχει τις βασικές οδηγίες γιαναπαράξειπεραιτέρωαντίγραφατωναρχικώνιώνχρησιμοποιώνταςτηνκυτταρικήαναπαραγωγική μηχανήγιαναεξυπηρετήσειτιςανάγκεςτου(εικόνα1).τομολυσμένοκύτταρο ξενιστήςθαεκτελέσει αυτές τις οδηγίες και θα παράξει επιπρόσθετα αντίγραφα του ιού, μολύνοντας όλο και περισσότερα κύτταρα. Μερικοί τύποι ιών εισάγουν τα γονίδιά τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, γεγονός που ουσιαστικά σημαίνει ότι τα ιικά γονίδια ενσωματώνονται ανάμεσα στα γονίδια του κυττάρου ξενιστή γιατονυπόλοιποχρόνοτηςζωήςτου( Τέτοιοι ιοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως οχήματα μεταφοράς καλών γονιδίων στο ανθρώπινο κύτταρο. Πρώτα, όμως ο επιστήμονας θα πρέπει να απομακρύνει τα ιικά γονίδια που προκαλούν ασθένεια. Κατόπιν, θα πρέπει να αντικαταστήσει τα γονίδια αυτά με εκείνα που κωδικοποιούν την παραγωγή της θεραπευτικά επιθυμητής πρωτεϊνης, όπως για παράδειγμα την παραγωγή ινσουλίνης στη περίπτωση των διαβητικών( Σημειωτέον είναι ότι η εργαστηριακή διαδικασία θα πρέπει να γίνει με τέτοιο τρόπο, ώστε τα υπεύθυναγονίδιαενσωμάτωσηςτουιούστογονιδίωματουξενιστήναπαραμείνουνανέπαφα. Εικόνα1.Οκύκλοςζωήςτωνιών. Πολλάπειράματαγονιδιακήςμεταφοράςβασίζονταισερετροϊούςκαιαδενοϊούςγιατηνμεταφοράτου επιθυμητού γονιδίου. Άλλοι ιοί που χρησιμοποιήθηκαν σαν φορείς περιλαμβάνουν αδενοσχετιζόμενουςιούς,αργάπολλαπλασιαζόμενουςρετροϊούς(lentiviruses),αλφα ιούςκαιερπητοϊούς.οι ιοί αυτοί διαφέρουν στο πόσο αποτελεσματικά μεταφέρουν γονίδια στα κύτταρα που αναγνωρίζουν, καιστοανμπορούνναμεταβάλλουντοdnaτουκυττάρουμόνιμαήπαροδικά(εικόνα2). 1

2 Εικόνα 2. Σύγκριση διαφορερικών ιικών φορέων που χρησιμοποιούνται για γονιδιακή θεραπεία: σύνοψη πλεονεκτημάτων και μεινονεκτημάτων. Οι *Αδενο σχετιζόμενοι ιοί είναι ικανοί να ενσωματώνονται με χαμηλή συχνότητα στο χρωμόσωμα 19. Οι αργά πολλαπλασιαζόμενοι ρετροϊοί (Lentiviruses) μολύνουν επίσης μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Ιικήενθετικήμεταλλαξιγένεση Ο όρος της ιικής ενθετικής μεταλλαξιγένεσης αναφέρεται στη μετάλλαξη που προκαλείται από την ένθεση επιπρόσθετων βάσεων DNA στο προϋπάρχον γονιδίωμα του κυττάρου. Επειδή πολλοί ιοί(όχι όλοι) ενσωματώνουν το γονιδίωμά τους στο γονιδίωμα των κυττάρων του ξενιστή τους με σκοπό την αναπαραγωγή τους, η μεταλλαξιγένεση είναι συχνό επακόλουθο της ιικής μόλυνσης. Όμως δεν προκαλούνόλοιοιενσωματώσιμοιιοίενθετικήμεταλαξιγένεση. ΠρέπεινατονιστείότιδενθαοδηγήσουνόλεςοιενθέσειςστοDNAτουξενιστήσεεμφανήμετάλλαξη. Στην πραγματικότητα, μόνο λίγες θα έχουν αυτό το αποτέλεσμα. Παρ όλα αυτά, αποτελεί κοινή πρακτικήστουςερευνητές,πουασχολούνταιμετηγονιδιακήςθεραπεία,νααποφεύγουντηνχρήσηιών που ενσωματώνουν το DNA τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, όταν αυτό δεν είναι απαραίτητο. Aντ 2

3 αυτού επιλέγουν ιούς που εκφράζουν παροδικά το DNA τους (το DNA τους επιπλέει μέσα στο κύτταρο αντί να ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή). Στην περίπτωση των ιών που ενσωματώνουν το DNA τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, η βαρύτητα της προκαλούμενης μετάλλαξης εξαρτάται αποκλειστικά από την θέση ενσωμάτωσης του ιικού DNA μέσα στο γονιδίωμα. Εάν η ενσωμάτωσησυμβείστηνκωδικοποιούσαπεριοχήενόςαπαραίτητουγονιδίου,τααποτελέσματαγιατο κύτταροθαείναισοβαρά.επίσης,ηενσωμάτωσηστονυποκινητή(promoter)ενόςγονιδίουμπορείνα προκαλέσει εξίσου σοβαρά επακόλουθα(εικόνα 3). Για παράδειγμα, αν το ιικό DNA ενσωματωθεί σε ένα καταστολέα, το γονίδιο που επηρρεάζεται από αυτόν μπορεί να υπερεκφρασθεί οδηγώντας σε υπερπαραγωγήτουπρωτεϊνικούπροϊόντοςτουμεσυνέπειατηναλλαγήτηςλειτουργίαςτουκυττάρου. Εάν ενσωματωθεί στην περιοχή ενός επαυξηντή, το γονίδιο μπορεί να υποεκφρασθεί οδηγώντας σε σχετικήαπουσίατουπροϊόντοςτουπουμπορείναεπηρρεάσεισημαντικάτηλειτουργίατουκυττάρου. Εικόνα 3. Ο ρετροϊός μολύνοντας τα κύτταρα του ξενιστή προκαλεί μεταλλάξεις με πολλαπλούς τρόπους μέσω ενσωμάτωσης του στο γονιδίωμα του ξενιστή (πράσινο πλαίσιο). Οι ενσωματώσειςπροϊώνμπορούννα επάγουν την υπερέκφραση ή μηέκφραση κυτταρικών γονιδίων μέσω επαυξηντών (ενσωματώσεις επαυξηντών) που βρίσκονται στις περιοχές των μακρών τελικών επαναλήψεων (LTR) ή μέσω ενσωματώσεων σε υποκινητές δημιουργώντας ένα συντηγμένο μεταγράφημα ιού ξενιστή. Κολοβώματα ή απενεργοποιούσες μεταλλάξεις μπορούν να προκληθούναπόιικήενσωμάτωση σεγονίδιοτουξενιστή.τακύτταρα μπορούν να επαναμολυνθούν από τον ιό και έτσι να συσσωρευθούν πολλαπλές μεταλλάξεις που επάγουντηνογκογένεση. Ημεταβολήτηςέκφρασηςδιαφορετικώνγονιδίωνθαέχειμίαποικιλίααποτελεσμάτωνστοκύτταρο.Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός δεν θα επηρρεασθεί σημαντικά από όλες τις μεταλλάξεις. Όμως, εάν η ενσωμάτωση συμβεί σε ένα απαραίτητο γονίδιο ή ένα γονίδιο που εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (cellular replication) ή τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (programmed cell 3

4 death),τότεηενσωμάτωσηαυτήμπορείναεκθέσεισεκίνδυνοτηνβιωσιμότητατουκυττάρουήακόμη ναπροκαλέσειτονατελεύτητοπολλαπλασιασμότουοδηγώνταςστοσχηματισμόενόςόγκουπουείναι δυνατόναγίνεικαρκινικός(βλέπεεικόνα3). Ρετροϊικοίφορείς ΡετροϊόςείναικάθειόςπουανήκειστηνοικογένειατωνRetroviridae.Τογενετικόυλικότωνρετροϊών βρίσκεταιστημορφήτουrna,ενώτογενετικόυλικότωνξενιστώντουςείναιστημορφήτουdna.όταν ορετροϊόςμολύνειένακύτταρο ξενιστήεισάγειστοκύτταροτοrnaτουμαζίμεμερικάένζυμα.τοrna αυτόθαπρέπειπρώταναμετατραπείσεένααντίγραφοdna,πρίνθεωρηθείμέροςτουγονιδιώματος του ξενιστή κυττάρου. Το γονιδίωμα των ρετροϊών συνήθως περιέχει τρία (3) ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν για πρωτεϊνες που απαντούν στον ώριμο ιό. Συγκεκριμένα, το gag κωδικοποιεί για ενδοκαψιδιακές δομικές πρωτεϊνες, το pol για τα ένζυμα της αντίστροφης μεταγραφάσης, πρωτεάσης και ιντεγκράσης ενώ το env για τις εξωτερικές πρωτεϊνες της ιικής κάψας (Εικόνα4). Εικόνα 4. Η οργάνωση του γονιδιώματος των ρετροϊών. LTR: μακρές τελικέςεπαναλήψεις. Η διαδικασία παραγωγής ενός αντιγράφου DNA από ένα μόριο RNA, ορίζεται ως αντίστροφη μεταγραφή και επιτελείται μέσω του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης. Μετά την παραγωγή του αντιγράφου DNA, αυτό είναι ελεύθερο στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή και πρέπει να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου. Δηλαδή θα πρέπει να ενσωματωθεί στα χρωμοσώματα. ΑυτήηδιαδικασίαπραγματοποιείταιαπότοένζυμοτηςιντεγκράσηςόπωςπαρουσιάζεταιστηνΕικόνα 5( Εικόνα5.Ηρετροϊική ενσωμάτωση 4

5 Τογεγονόςότιτογενετικόυλικότουιούενσωματώνεταικαιαποτελείπλέονμέροςτουγονιδιώματος τουξενιστήκυττάρου,μαςεπιτρέπειναπούμεότιτοκύτταρο ξενιστήςέχειτροποιηθείπεριέχονταςένα νέο γονίδιο. Εάν αργότερα το κύτταρο αυτό του ξενιστή πολλαπλασιασθεί, οι απόγονοί του θα περιέχουντονέογονίδιο.μερικέςφορέςταιικάγονίδιαδενεκφράζουναμέσωςτηνπληροφορίατους. Εικόνα 6. Η παραγωγή ανασυνδυασμένων ρετροϊικών φορέων Οι ρετροϊικοί φορείς δημιουργούνται με αφαίρεση τωνρετροϊικώνγονιδίωνgag,pol και env. Τα γονίδια αυτά αντικαθίστανται από το θεραπευτικό γονίδιο. Για να παραχθούν ιικά σωματίδια φορέα,απαιτείταιμίακυτταρική σειρά πακεταρίσματος. Οι κυτταρικέςσειρές πακεταρίσματος παρέχουν όλες τις ιικές πρωτεϊνες που απαιτούνται για την παραγωγή καψιδίων και την ωρίμανση των ιικών σωματιδίων του φορέα. Αυτέςοικυτταρικέςσειρέςέχουν δημιουργηθεί με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχουν τα γονίδια gag, pol και env. Η δυνατότητα εισαγωγής του επιθυμητού γονιδίου στο ρετροϊικό DNAφορέα και η διαθεσιμότητα των κατάλληλων κυτταρικών σειρών πακεταρίσματοςκαθιστούνπλέοναπλήυπόθεσητηνπαρασκευήρετροϊικώνφορέων(εικόνα6). Ένααπόταπροβλήματατηςγονιδιακήςθεραπείαςμερετροϊικούςφορείςαποτελείηαυθαίρετηένθεση γονιδιακού υλικού του φορέα σε τυχαίες θέσεις στο γονιδίωμα του ξενιστή από το ένζυμο της ιντεγκράσης. Εάν συμβεί το γενετικό υλικό να ενσωματωθεί μέσα σε ένα γονίδιο του ξενιστή, τότε η λειτουργία του γονιδίου αυτού θα διαταραχθεί (ενθετική μεταλλαξιγένεση). Αν δε το γονίδιο αυτό τυχαίνει να ρυθμίζει την κυτταρική διαίρεση, τότε μπορεί να συμβεί ανεξέλεκτη κυτταρική διαίρεση που να οδηγήσει σε δημιουργία καρκίνου. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, σήμερα 5

6 γίνονται προσπάθειες χρησιμοποίησης εξειδικευμένων νουκλεασων (zinc finger nucleases) ή συγκεκριμένων αλληλουχιών της περιοχής ελέγχου του γενετικού τόπου της β σφαιρίνης για να κατευθύνουντοσημείοτηςενσωμάτωσηςσεειδικέςχρωμοσωμικέςπεριοχές. ΙΑΤΡΙΚΕΣΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Γονιδιακήθεραπεία Γονιδιακήθεραπείαείναιηένθεση,τροποποίηση,ήαφαίρεσηγονιδίωνσεκύτταραήιστούςανθρώπων μεσκοπότηνθεραπείααυτώναπόνόσους.οιπροσεγγίσειςγιαγονιδιακήθεραπείαπεριλαμβάνουν,α) την αντικατάσταση ενός μεταλλαγμένου νοσογόνου γονιδίου με το φυσιολογικό, β) την απενεργοποίηση ή απάλλειψη (knock out) του μεταλλαγμένου γονιδίου που δεν λειτουργεί φυσιολογικάκαιγ)τηνεισαγωγήενόςνέουγονιδίουστονοργανισμόπουκαταπολεμάτηνασθένεια. Γενικά, ένα γονίδιο δεν μπορεί να εισαχθεί απευθείας στο ανθρώπινο κύτταρο. Κατά συνέπεια θα πρέπει να εισαχθεί χρησιμοποιώντας ένα μεταφορέα ή φορέα. Οι φορείς μπορούν να διακριθούν σε ιικούς και μη ιικούς. Σήμερα το πιο κοινό τύπο φορέων αποτελούν οι ιοί που έχουν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να μεταφέρουν φυσιολογικό ανθρώπινο DNA (Wiley database on vectors used in gene therapy trials)( Οι ιοί έχουν εξελίξει τρόπους ενθυλάκωσηςκαιμεταφοράςτωνγονιδίωντουςστακύτταρατουξενιστή.oιεπιστήμονεςπροσπαθούν νατιθασσεύσουντηνικανότητάτουςαυτή,χειριζόμενοιτοιικόγονιδίωμααπομακρύνονταςταγονίδια πουπροκαλούνασθένειααντικαθιστώνταςταμεαντίστοιχαθεραπευτικά. Κατάτηνδιαδικασίατηςγονιδιακήςθεραπείας,τακύτταρα στόχοι,όπωςπ.χ.ταηπατικάκύττατατουή τα κύτταρα του πνεύμονα, μολύνονται από τον ρετροϊικό φορέα. Κατόπιν, ο φορέας αδειάζει το γενετικό του υλικό, που περιέχει το θεραπευτικό γονίδιο, στο κύτταρο στόχο. Έτσι, η παραγωγή του λειτουργικής πρωτεϊνης από το θεραπευτικό γονίδιο επαναφέρει το κύτταρο στόχο στη φυσιολογική τουκατάσταση.σχεδόνόλατακύτταρατουανθρώπινουσώματοςαποτελούνδυνητικούςστόχουςγια γονιδιακή θεραπεία και μπορούν να διαιρεθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τα σωματικά (τα περισσότερακύτταρατουσώματος)καιταγαμετικά(ωάριακαισπερματοζωάρια). Ηγονιδιακήθεραπείαμεχρήσηγαμετικώνκυττάρωνεπιφέρειμόνιμεςαλλαγέςπουμεταφέρονταισε μεταγενέστερεςγενεές.ανγίνειπρώϊμακατάτηνεμβρυϊκήανάπτυξη,όπωςπ.χ.κατάτοδιάστηματης προεμφυτικής διάγνωσης και της in vitro γονιμοποίησης, η γονιδιακή μεταφορά μπορεί να συμβεί σε όλα τα κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Η ελκυστικότητα της θεραπείας σε γαμετικά κύτταρα βασίζεται στην δυνατότητα επίτευξης ενός μόνιμου θεραπευτικού αποτελέσματος για όλους εκείνους πουθακληρονομήσουντογονίδιο στόχοεξαλείφονταςγιαπάνταμερικέςπαθήσειςαπόσυγκεκριμένες οικογένειες,καιτελικάαπότογενικόπληθυσμό.όμως,αυτόεγείρειαντιπαραθέσεις.μερικοίθεωρούν αυτότοτύποθεραπείαςωςαφύσικο,ενώάλλοιανησυχούνγιατιςτεχνικέςτηςδιαστάσεις.ανησυχούν ότιηγενετικήαλλαγήπουθαμεταδοθείαπότηγονιδιακήθεραπείασεγαμετικάκύτταραμπορείστην πραγματικότηταναείναιεπιζήμιαμεαπρόβλεπτααρνητικάαποτελέσματασεμελλοντικέςγενεές. 6

7 Η γονιδιακή θεραπεία σε σωματικά κύτταρα θεωρείται ως πιο συντηρητική και ασφαλής, επειδή επηρρεάζειμόνοτακύτταρα στόχουςτουασθενήκαιδενμεταφέρεταισεμελλοντικέςγενεές.δηλαδή, τοθεραπευτικόαποτέλεσμαπεριορίζεταικαιτελειώνειμετοάτομοπουθαλάβειτηνθεραπεία.όμως αυτός ο τύπος θεραπείας παρουσιάζει από μόνος του προβλήματα. Συχνά τα αποτελέσματα της σωματικής γονιδιακής θεραπείας είναι μικρής χρονικής διάρκειας, επειδή τα κύτταρα των περισσότερων ιστών τελικά πεθαίνουν και αντικαθίστανται από νέα. Έτσι η θεραπευτική διαδικασία απαιτεί την επανάληψή της κατά την διάρκεια ζωής του ασθενή για να διατηρηθεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Η μεταφορά του γονιδίου στα κύτταρα στόχους ή ιστούς είναι επίσης προβληματική. Παρά τις δυσκολίες αυτές, η σωματική γονιδιακή θεραπεία είναι κατάλληλη και αποδεκτή για πολλές διαταραχές που περιλαμβάνουν την κυστική ίνωση, την μυϊκή δυστροφία, τον καρκίνο και αρκετές μολυσματικές ασθένειες. Οι κλινικοί ιατροί μπορούν να πραγματοποιήσουν τη θεραπεία αυτή ακόμη και σε πρώϊμο εμβρυϊκό στάδιο ανάπτυξης (in utero), δυνητικά διορθώνοντας ή θεραπευοντας μία απειλητική για τη ζωή διαταραχή που μπορεί να επηρεάσει αρνητικά την υγεία ή την ανάπτυξη του νεογένητου,εάνδεναντιμετωπισθείπρίντηνγέννηση. Ησωματικήγονιδιακήθεραπείαμπορείναχωρισθείσεδύοκατηγορίες: 1. Ex vivo, που σημαίνει εξωτερική (όπου τα κύτταρα τροποποιούνται εκτός σώματος και μετά εμφυτεύονταιπάλισεαυτό).σεμερικέςκλινικέςδοκιμές,κύτταρααπότοαίμαήτομυελόοστούτου ασθενούςαφαιρούνταικαικαλλιεργούνταιστοεργαστήριο.τακύτταραεκτίθενταιστονιικόφορέαπου φέρει το επιθυμητό γονίδιο. Ο ιός εισερχόμενος στα κύτταρα εισάγει το επιθυμητό γονίδιο στο DNA των κυττάρων. Τα κύτταρα αναπτύσσονται περαιτέρω στο εργαστήριο και μετά επιστρέφονται στον ασθενή με ενδοφλέβια ένεση. Αυτός ο τύπος γονιδιακής θεραπείας ονομάσθηκε ex vivo γιατί τα κύτταραυφίστανταιτηδιαδικασίατηςθεραπείαςεκτόςσώματος. 2. In vivo, που σημαίνει εσωτερική, όπου τα κύτταρα τροποποιούνται με το επιθυμητό γονίδιο, ενώ είναιστοσώματουασθενούς. ΑναγεννητικήΙατρική(επαναπρογραμματισμέναπολυδύναμαβλαστικάκύτταρα,iPScells) Βασικός στόχος της αναγεννητικής ιατρικής είναι η επιδιόρθωση, η αντικατάσταση, ή η αναγέννηση ιστώνκαιοργάνωνπουδυσλειτουργούνήέχουνκαταστραφείαπότραυματισμόδιαμέσουκυτταρικής θεραπείας. Ετσι, χρησιμοποιεί τη γνώση αυτή για την πρόληψη και θεραπεία χρόνιων εκφυλιστικών νοσημάτων (π.χ. διαβήτης, οστεοαρθρίτιδα, εκφυλιστικά νοσήματα της καρδιάς και του νευρικού συστήματος) και την αποκατάσταση τραυματικών βλαβών. Τα βλαστικά κύτταρα είναι βασικό συστατικότηςσναγεννητικήςιατρικής.πράγματι,ταεμβρυικάβλαστικάκύτταραμπορούνπρακτικάνα αναγενήσουν όλους τους ιστούς του σώματος (Εικόνα 7), ενώ τα βλαστικά κύτταρα ενηλίκων έχουν στενότεροεύροςδιαφοροποίησης.έχειγραφείότιηθεραπείαμεβάσηταβλαστικάκύτταρα(stemcellbasedtherapy)πρόκειταινααποτελέσειστομέλλοντηντρίτηθεραπευτικήαρχή,μετάτηχειρουργική καιτηδιαφαρμάκωνθεραπεία.ηχρήσηεμβρυικώνβλαστικώνκυττάρων(embryonicstem ES cells) καιβλαστικώνκυττάρωνενηλίκου(adultstemcells)στηθεραπευτικήέχεισυζητηθείευρύτατακαιέχει 7

8 πρόσφατα αρχίσει να δοκιμάζεται (ο αμερικανικός οργανισμός F.D.Α ενέκρινε τις πρώτες κλινικές δοκιμέςμεανθρώπιναesκύτταρατονιανουάριοτου2009). Εικόνα 7. Τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα είναι πολυδύναμα και προέρχονται από τη εσωτερική κυτταρική στοιβάδα της βλαστοκύστης. Τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να γίνουν οποιοσδήποτε ιστός του σώματος, εκτός από πλακούντα. Η χρησιμοποίηση, όμως, των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων προσκρούει σε δύο προβλήματα. Η δημιουργία των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων από ανθρώπινα έμβρυα ή υλικό της in vitro γονιμοποίησης δεν είναι ηθικά αποδεκτή. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση τέτοιων εμβρυικών βλαστικών κυτταρικώνσειρών,σεκάποιουςασθενείς,δενθατελεσφορήσειλόγωανοσολογικήςαπόρριψης.όπως προκύπτειαπόμιασειράπρωτοποριακώνμελετών,αυτάταπροβλήματαπαρακάμπτονταιμετηχρήση τωνεπαναπρογραμματισμένωνβλαστικώνκυττάρων(induced pluripotent stem cells ips cells),όπου τελικώςδιαφοροποιημένακύτταρα(ινοβλάστες,κερατινοκύτταρα)απόκάποιοασθενήμετατρέπονται ex vivo σε βλαστικά κύτταρα με παροδική έκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων (πχ., Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 (Εικόνα 8). Σειρά μελετών έδειξε ότι τα ips κύτταρα έχουν τις ιδιότητες των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων διαφοροποιούμενα προς όλους τους ιστούς του σώματος, αν και το σημείοαυτόακόμαεξετάζεται.ετσι,μπορούννααντικαταστήσουνταεμβρυικάβλαστικάκύτταραστις θεραπευτικέςπροσεγγίσειςτηςαναγεννητικήςιατρικής.τοσύστημααυτό,πουανακαλύφθηκεαπότον Yamanaka και τους συνεργάτες του και αναπτύχθηκε αλματωδώς τα τελευταία χρόνια(takahashi and Yamanaka, 2006), είναι απαλλαγμένο από τους συνήθεις περιορισμούς που συνοδεύουν τη χρήση εμβρυικώνβλαστικώνκυττάρων(ανοσολογικήαπόρριψη,προβλήματαβιοηθικής)καιέχειπολύκαλές προοπτικές σε ό,τι αφορά την ανάπτυξη κυτταρικών προτύπων που αναπαράγουν την παθογένεια συγκεκριμένων νόσων (disease specific models), διευκολύνουν τον έλεγχο νέων φαρμάκων και υποβοηθούντηνεπινόησησχημάτωνεξατομικευμένηςκυτταρικήςθεραπείας. 8

9 Ο Δρ. Shinya Yamanaka ( επέτυχε το γενετικό επαναπρογραματισμόδιαφοροποιημένωνκυττάρωνανθρώπινουιστούδέρματοςχρησιμοποιώνταςένα ρετροϊικόφορέαπουέφερεταγονίδιατωντεσσάρων(4)μεταγραφικώνπαραγόντων:oct3/4,sox2,c MycκαιKlf4(Εικόνα9). Εικόνα9.Σχηματικήαπεικόνισητουρετροϊικούφορέαπουφέρει τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων: Klf4, Oct 3/4, Sox2 και c Myc (κόκκινα βέλη) μεταξύ των 5 LTR & 3 LTR, μακρών τελικών ακολουθιών. Το ανοικτό μπλέ βέλος (CMV) αντιπροσωπεύει ένα εσωτερικό υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού. Η εκθετική πρόοδος που έχει γίνει τα δύο τελευταία χρόνια σε ότι αφορά φορείς (vectors) και καλλιεργητικάμέσαεπιτρέπειτώρατονμετασχηματισμόδιαφοροποιημένωνσωματικώνκυττάρωνσε «πολυδύναμα» βλαστικά κύτταρα σε αρκετά υψηλό ποσοστό και χωρίς τη χρήση ιικών στοιχείων. Η σχετική σταδιακή πειραματική διαδικασία μεταφοράς των μεταγραφικών παραγόντων σε σωματικά κύτταρα,μέσωρετροϊών,γιατηλήψηipsαπεικονίζεταισυνοπτικάστηνεικόνα10. Εικόνα8.Διαγραμματικόσχέδιο(flowchart) της δημιουργίας κυττάρων ips με τον επαναπρογραμματισμό διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά μπορουν να επαναχορηγηθούν στο άτομο απότοοποίοελήφθηαρχικάτουλικοήνα χρησιμοποιηθούν για πειραματικούς σκοπούς. 9

10 Εικόνα 10. Σχηματική απεικόνιση των σταδίων γένεσης επαναπρογραμματισμένων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων. (1) απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων δότη. (2) μεταφοράγονιδίωνπουεπαναπρογραμματίζουντακύτταρατουδότημέσωιικώνφορέων.τα κόκκινα κύτταρα δείχνουν τα κύτταρα εκείνα που εκφράζουν τα εξωγενή γονίδια. (3) απομόνωσηκαικαλλιέργειατωνκυττάρωναυτών.(4)μίαμικρήομάδααπότακύτταραπου εκφράζουν τα μεταφερθέντα γονίδια γίνονται πολυδύναμα βλαστικά ips και παράγουν αποικίεςκυττάρωνπουομοιάζουνμεεμβρυικάβλαστικάκύτταρα. Παραδείγματα video σε πραγματικό χρόνο επαναπρογραμματισμού σωματικών κυττάρων προς ips σε συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας μπορεί κανείς να παρακολουθήσει σε ινοβλάστες ποντικού ( της διαφοροποίησης των προς νευρικά κύτταρα ( ή και προς παραγωγή καρδιομυοκυττάρων ( Ηχρησιμοποίηση,όμως,τωνiPSκυττάρωνενέχειτονκίνδυνοτηςενθετικήςμεταλλαξιγένεσηςαπότους ιικούς φορείς. Ετσι, η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου στο σημείο που ενοφθαλμίζονται τα κύτταρα αυτά δεν είναι αμελητέα αποτρέποντας την χρήση τους στον άνθρωπο. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια δημιουργίας ips κυττάρων με μεθόδους που δεν επιτρέπουν την δημιουργία ενθετικήςμεταλλαξιγένεσης. 10