Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους.

Transcript

1 Βλαστικά κύτταρα: Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Είναι σε θέση να δρουν επισκευαστικά, αναδημιουργώντας κύτταρα των οργάνων κατά την διάρκεια της ζωής ενός οργανισμού

2 Βλαστικό κύτταρο: Έχει την ικανότητα να αναπαράγει τον εαυτό του ή άλλα βλαστικά κύτταρα (Αυτοανανέωση) καθώς και κυτταρικούς τύπους (Διαφοροποίηση) Αυτοανανέωση Αυτοανανέωση Διαφοροποίηση Διαφοροποίηση

3 Ο όρος Βλαστικά κύτταρα περιλαμβάνει κυτταρα με διαφορετικές ιδιότητες: Πολυδύναμα (Pluripotent) Embryonic Stem Cells (Εμβρυονικά Βλαστικά κύτταρα), ips Ολιγοδύναμα/ Πλειοδύναμα (Multipotent) Βλαστικά κύτταρα (ώριμων/εμβρυικών) Ιστών Adult Stem Cells Totipotent Ολοδύναμα/Παντοδύναμα Ζυγωτό Βλαστομερή μέχρι και το στάδιο των τεσσάρων κυττάρων

4 Πολυδύναμα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (Embryonic Stem Cells - ESCs) Προέλευση Απομόνωση των κυττάρων Τεχνικές καλλιέργειας Η χρησιμότητά τους στην Αναγεννητική Ιατρική

5 Τα κίνητρα για την ανάπτυξη της τεχνολογίας των πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων: Α) ανθρώπινη εμβρυολογία: για να αναπαραχθούν in vitro στάδια της πρώιμης διαφοροποίησης που ειναι αδύνατον να μελετηθούν διαφορετικά Β) γονιδιακή λειτουργία (functional genomics): μελέτη και χειραγώγηση λειτουργιών ειδικών γονιδίων σε διπλοιδικά ανθρώπινα κύτταρα Γ) φαρμακολογικες αναλύσεις: Για την παραγωγή μεγάλου αριθμού φαινοτυπικά καθορισμένων κυττάρων για φαρμακολογική και τοξικολογική δοκιμασία Δ) αναπλαστική/αναγενητική ιατρική: δημιουργία απεριόριστης δεξαμενής κυττάρων για κυτταρική ανταλλαγή, επιδιόρθωση ιστών και παροχή γονιδιακής θεραπείας.

6 Τα τέσσερα διαφορετικά είδη βλαστικών κυττάρων για θεραπείες

7 Τι υπόσχονται οι κυτταρικές θεραπείες? Αντικατάσταση των ενδογενών βλαστικών κυττάρων Θεραπεία σε ασθένειες και τραύματα που δεν έχουν αντιμετωπ Alzheimer s, Huntigton s, Parkinson, καρδιομυοπάθειες, Τραυματισμός νωτιαίου μυελού, Αυτισμός, Αμυοτροφική Πλάγια Σκλήρυνση (ALS).. κλπ

8 Προέλευση των ES κυττάρων Προέρχονται από το στάδιο της βλαστοκύστης που σχηματίζεται κατά την πρώιμη εμβρυογέννεση VIDEO 1 : EMBRYO DEVELOPMENT

9 Ειδικότερα απο την Εσωτερική Κυτταρική Μάζα (ICM) της βλαστοκύστης και συγκεκριμένα από την επιβλάστη

10 ΓΕΝΙΚΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΠΛΑΝΟ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΊΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΩΝ ΕΜΒΡΥΟΝΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΆΡΩΝ (ανθρώπου και ποντικού) Α) ΒΛΑΣΤΟΚΥΣΤΗ - ΑΝΟΙΓΜΑ Β) ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝΟΝΤΑΙ Γ) ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ ΣΕ ΤΡΟΦΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΙΔΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΜΕΣΑ επιζούν πολύ λίγα Δ) ΕΠΑΝΑΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ (όσων επιζούν) ΣΕ ΤΡΟΦΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Όσα επέζησαν σχηματίζουν ταχύτατα αναπτυσσόμενες αποικίες

11 Απομόνωση εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων ποντικού (Embryonic Stem ES cells) (1981) Απομόνωση πρωτογενών εμβρυικών κυττάρων απο την ICΜ Τα τροφικά κύτταρα (Feeder Cells) Οι παράγοντες LIF Leukemia Inhibitory Factor (mouse) ή FGF2 (human) O παράγοντας BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) ES πολυδύναμα ES διαφοροποιημένα

12 Πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου (human Pluripotent Stem Cells hpscs) Απομόνωση κυττάρικών σειρών έγινε απο βλαστοκύστεις δωρητών (Thomson et al. 1998). Η διαδικασία απομόνωσης έγινε παρόμοια με αυτήν που ακολουθήθηκε για την απομόνωση των ESC ποντικού ποντικού VIDEO 2: creating ES lines ανθρώπου

13 Η βλαστοκύστη αποτελεί την πηγή για την απομόνωση των πολυδύναμων εμβρυονικών κυττάρων Σχηματισμός βλαστοκύστης ανθρώπου in vitro 3 μέρες μετά την 04/15/13 απόψυξη από το στάδιο των 8 κυττάρων

14 Στάδια για την απομόνωση και καλλιέργεια των πολυδύναμω Βλαστικών κυττάρων από τη Βλαστοκύστη: 1. Απομάκρυνση της Zona Pellucida μετά απο επεξεργασία με διάλυμα Acid Tyrode 2. Λύση των κυττάρων του τροφοεξωδέρματος μετά από Ανοσο-χειρουργική αντίδραση (immunosergury) 3. Απομάκρυνση των κυττάρων του τροφοεξωδέρματος 4. Έκπτυξη των κυττάρων της Εσωτερικής κυτταρικής μάζας (ICM) σε στρώμα τροφικών κυττάρων

15 1. Απομάκρυνση της Zona Pellucida μετά απο επεξεργασία με διάλυμα Acid Tyrode

16 2. Λύση των κυττάρων του τροφοεξωδέρματος μετά από Ανοσο-χειρουργική αντίδραση (immunosergury)

17 3. Απομάκρυνση των κυττάρων του τροφοεξωδέρματος

18 4. Έκπτυξη των κυττάρων της Εσωτερικής κυτταρικής μάζας (ICM) σε στρώμα τροφικών κυττάρων

19 Video 3- Human ES Isolation

20 ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΕΜΒΡΥΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ (hescs) Για να χρησιμοποιηθούν στην κλινικές εφαρμογές: Η καλλιέργεια των hescs να γίνεται σε συνθήκες πλήρως «ανθρωποποιημένες», έτσι ώστε να αποκλείεται η παρουσία μη ανθρώπινων βιολογικών προιόντων Συνθήκες καλλιέργειας απουσία ορού, με θρεπτικό μέσο συγκεκριμένης σύστασης ώστε οι συνθήκες να είναι κατά το δυνατόν ελεγχόμενες Θρεπτικό μέσο που διατίθεται με την εμπορική ονομασία MTEASR

21 Βελτιστοποίηση χημικά καθωρισμένου θρεπτικού για γενωμική σταθερότητα των hpscs Εισαγωγή πρωτοκόλλων κυτταρικής καλλιέργειας GMP (Good Manufacturing Procedures) Καθορισμός πρωτοκόλλων για την έκπτυξη και διαφοροποίηση hpscs ελεύθερων από ογκογονικές και ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες Αυτοματοποιημένα συστήματα καλλιέργειας hpscs για κλινική χρήση

22 Η ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Αυτά τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να μετατραπούν σε κύτταρα οποιουδήποτε ιστού ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ

23 Δυναμικό διαφοροποίησης των ESCs προς πολλαπλές ιστικές κατευθύνσεις

24 Τα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα έχουν δυναμικό διαφοροποίησης προς όλες τις ιστικές κατευθύνσεις

25 Από διαφοροποίηση των ES μπορουν να παραχθουν σε μεγάλο αριθμό σπάνιοι κυτταρικοί τύποι (πχ καρδιομυοκύτταρα ή νευρικά κύτταρα), για να χρησιμοποιηθούν στην Αναγεννητική Ιατρική

26 Διαφοροποίηση in vitro Αφαίρεση LIF/feeder Δημιουργία εμβρυοιδικων σωματίων (embryoid bodies)

27 «Καθοδήγηση» προς συγκεκριμένες κατευθύνσεις είναι δυνατή με τη προσθήκη κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων με τη χειραγώγηση των μηχανικών ιδιοτήτων του κυτταρικού περιβάλλοντος Απομόνωση συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών Το ζητούμενο είναι η εύρεση κατάλληλων συνθηκών για την μεγιστοποίηση και την περαιτέρω ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρων που μας ενδιαφέρει στο εργαστήριο.

28 Στοχευμένη διαφοροποίηση και απομόνωση ομοιογενών κυτταρικών πληθυσμών ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ΕΙΔΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ

29 Κυτταρική διαλογή μέσω κυτταρομετία ροής FACS Fluorescence-activated cell sorting

30