Περίληψη Δ.Δ ΚΟΨΑΧΕΙΛΗΣ

Transcript

1 Περίληψη Δ.Δ ΚΟΨΑΧΕΙΛΗΣ Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η δημιουργία ενός ολοκληρωμένου συστήματος για παραγωγή οίνου και αιθανόλης, που θα προσφέρει αναμφισβήτητα πλεονεκτήματα όσον αφορά το κόστος της διεργασίας και την ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος. Στο πρώτο μέρος της διατριβής έγινε ανασκόπηση της βιβλιογραφίας που αφορά τις βιοτεχνολογικές διεργασίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται μέχρι και σήμερα για παραγωγή οίνου και αιθανόλης. 'Εμφαση δόθηκε στην αλκοολική ζύμωση, τα παραγόμενα αρωματικά συστατικά και στην ακινητοποίηση κυττάρων. Επίσης γίνεται αναφορά στις ιδιαιτερότητες των ζυμώσεων σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες. Κατόπιν περιγράφεται το πειραματικό μέρος που πραγματοποιήθηκε και μετά παρουσιάζονται και σχολιάζονται τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων της διατριβής. Κατ αρχάς έγινε επιλογή του φορέα ακινητοποίησης. Ως φορείς ακινητοποίησης των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν BSG, που είναι ένα αγροτοβιομηχανικό απόρριμμα της ζυθοποιίας φθηνό, άφθονο και κατάλληλο για τρόφιμα. 'Εγινε αξιολόγηση διαφόρων τύπων BSG (επεξεργασμένα ή μη) ως φορείς ακινητοποίησης για παραγωγή αιθανόλης από μελάσσα, με γνώμονα την ποιότητα του προϊόντος, την παραγωγικότητα, την ευκολία χρήσης και το κόστος. Τελικά επιλέχθηκαν τα BSG που δεν είχαν υποστεί καμία χημική επεξεργασία (απολιγνινοποίηση) για τη συνέχιση της έρευνας. Στη συνέχεια ο ακινητοποιημένος αυτός βιοκαταλύτης κατανεμήθηκε σε βιοαντιδραστήρα πολλαπλών σταθερών κλινών (MFBT) και χρησιμοποιήθηκε στη ζύμωση μελάσσας σε ένα εξαιρετικά μεγάλο και πρωτοαναφερόμενο εύρος θερμοκρασιών. Συγκεκριμένα το σύστημα ήταν ικανό να ζυμώσει μελάσσα στο εύρος 3-40 o C, καθιστώντας το μοναδικό στο είδος του. Το γεγονός αυτό προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα με κυριότερο το ότι, μειώνει αισθητά το κόστος συστημάτων ψύξης. Αυτή η ιδιότητα του S. cerevisiae ΑΧΑΖ-1 δεν έχει παρουσιαστεί άλλη φορά εώς τώρα σε κανένα άλλο μη-γενετικά τροποποιημένο στέλεχος. Αυτό μας προέτρεψε για μοριακή του ταυτοποίηση, η οποία έδειξε πως το στέλεχος είναι πραγματικά μοναδικό. Μάλιστα, επέδειξε μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα με εμπορικά τροπικά στελέχη, παρά με ελληνικής προέλευσης εμπορικές ή άγριες ζύμες. Σημαντικό ήταν

2 επίσης πως εκτός των υψηλών παραγωγικοτήτων που παρατηρήθηκαν σε όλες τις θερμοκρασίες ζύμωσης με τη χρήση του προτεινόμενου συστήματος, το παραγόμενο προϊόν ήταν υψηλής ποιότητας, λόγω των χαμηλών συγκεντρώσεων ανώτερων αλκοολών. Το ίδιο αυτό σύστημα χρησιμοποιήθηκε για ζύμωση μελάσσας σε συνεχές σύστημα, όπου έγινε και σύγκριση του MFBT με βιοαντιδραστήρα σταθερής κλίνης (PB), με τον πρώτο να πλεονεκτεί. Ο ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης παρουσίασε λειτουργική σταθερότητα για χρονική περίοδο 55 ημερών σε θερμοκρασίες ζύμωσης 30 έως 40 C. Το σύστημα μάλιστα έδωσε υψηλές παραγωγικότητες και στη συνεχή ζύμωση μη-αποστειρωμένης μελάσσας. Στις 32 ημέρες συνεχούς λειτουργίας του ακόμα και σε υψηλές θερμοκρασίες δεν παρατηρήθηκε οποιαδήποτε μόλυνση, ενώ οι συγκεντρώσεις των πτητικών παραπροϊόντων κυμάνθηκαν σε απολύτως κανονικάεπιθυμητά επίπεδα. Εξίσου θετικά ήταν τα αποτελέσματα της χρήσης του ακινητοποιημένου BSG βιοκαταλύτη στην παραγωγή οίνου σε αντιδραστήρα MFBT διαλείποντος έργου. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων με GC-MS, αναδεικνύουν πως οι οίνοι που παρασκευάστηκαν με το προτεινόμενο σύστημα μπορούν να χαρακτηριστούν καλής ποιότητας. Ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ζύμωσης το ισοζύγιο των εστέρων προς τις αλκοόλες εμφανίστηκε θετικό, γεγονός που είναι επιθυμητό για την ποιότητα του παραγόμενου οίνου. Επίσης η εμφάνιση ενώσεων που προσδίδουν διακριτό, χαρακτηριστικό άρωμα στον οίνο ακόμα και στους 37 C είναι ένα πολύ θετικό αποτέλεσμα. H χρησιμοποίηση του συστήματος MFBT είναι ελπιδοφόρα, ιδιαίτερα για παραγωγή οίνου σε θερμές χώρες όπου υπάρχουν μεγάλες διακυμάνσεις θερμοκρασίας. Ο οίνος δεν παρουσίασε μεγάλες διάφορες όσον αφορά τη σύστασή του είτε παράγεται σε συνήθεις είτε σε υψηλές θερμοκρασίες. Το σύστημα MFBT μελετήθηκε και για συνεχή παραγωγή οίνου σε θερμοκρασιακό εύρος C. Το σύστημα επέδειξε αξιοσημείωτη λειτουργική σταθερότητα και αντοχή, παρά το μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, αλλά και ροών που μελετήθηκαν. Σε όλες τις θερμοκρασίες, οι συγκεντρώσεις των πτητικών παραπροϊόντων στον παραγόμενο οίνο κυμάνθηκαν σε επιθυμητά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι πολύ σημαντικό, αφού η ποιότητα ενός οίνου εξαρτάται από τα περιεχόμενα πτητικά παραπροϊόντα. Το αποτέλεσμα αυτό, σε συνδυασμό με τις πολύ υψηλές, μεγαλύτερες από άλλα αντίστοιχα συνεχή συστήματα, ημερήσιες παραγωγικότητες οίνου που επιτεύχθηκαν, καθιστά το προτεινόμενο συνεχές

3 σύστημα κατάλληλο για παραγωγή οίνου και μάλιστα σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών. Ακόμα όμως σημαντικότερο είναι πως τα ακινητοποιημένα κύτταρα S. cerevisiae AXAZ-1 σε BSG, σε συνδυασμό με τη χρήση αντιδραστήρα πολλαπλών σταθερών κλινών (MFBT), γίνονται ελκυστικότερα για βιομηχανική χρήση ακόμα και σε συνεχές σύστημα. Αυτό γιατί εκτός του πλεονεκτήματος των υψηλών παραγωγικοτήτων και μάλιστα σε μεγάλο θερμοκρασιακό εύρος, το σύστημα έχει δοκιμαστεί με επιτυχία και με αντίστοιχες συνθήκες και σε ζύμωση μελάσσας. Άρα η λειτουργία του συστήματος καθ όλη τη διάρκεια του έτους είναι εφικτή, γεγονός που πολλαπλασιάζει τα οικονομικά οφέλη μίας βιομηχανίας. Τέλος, μελετήθηκε σύστημα MFBT που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά, αν υπάρξει πρόβλημα έλλειψης BSG. Χρησιμοποιήθηκε μήλο ως φορέας ακινητοποίησης και ο βιοκαταλύτης κατανεμήθηκε στις μισές κλίνες του αντιδραστήρα. Το σύστημα απεδείχθηκε ότι ήταν αποτελεσματικό για παραγωγή οίνου χωρίς μεγάλες λειτουργικές, οικονομικές και ποιοτικές παρεκκλίσεις σε σχέση με το προαναφερθέν. Ως γενικό συμπέρασμα μπορούμε να πούμε ότι η παρούσα διατριβή προτείνει ένα ολοκληρωμένο σύστημα για παραγωγή αιθανόλης και ποιοτικού οίνου. Το σύστημα αυτό περιλαμβάνει βιοαντιδραστήρα πολλαπλών σταθερών κλινών, ένα μοριακά ταυτοποιημένο μοναδικό στέλεχος (S. cerevisiae AXAZ-1), και ένα αγροτοβιομηχανικό απόβλητο (BSG) ως φορέα ακινητοποίησης. H ιδιαιτερότητα του συστήματος είναι η ικανότητά του να παρέχει υψηλές παραγωγικότητες και να παράγει ποιοτικά προϊόντα με συνεχή ή ασυνεχή διεργασία σε εξαιρετικά μεγάλο εύρος θερμοκρασίας, χωρίς ως εκ τούτου να απαιτεί μεγάλο κόστος ψύξης. Επιπλέον το σύστημα αυτό επέδειξε λειτουργική σταθερότητα για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα, γεγονός επίσης πολύ σημαντικό. Τα πλεονεκτήματά του αυτά το καθιστούν κατάλληλο για βιομηχανική χρήση. Επιπλέον είναι σημαντικό να αναφερθεί πως μετά το τέλος των διεργασιών ζύμωσης μπορεί να αποφευχθεί η απόρριψη του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη στο περιβάλλον αφού, λόγω της πλούσιας σε πρωτεΐνες και διαιτητικές ίνες σύστασής του, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή.

4 4.2 Abstract The main interest of this thesis was to propose an integrated system for alcohol and wine production, which would be advantageous as far as production cost and product quality are concerned. The biotechnological processes concerning wine making and alcohol production and particularly alcoholic fermentation, volatile flavour compounds and cell immobilization were reviewed in the first section of this thesis. After a description of the materials and methods that were used, we continue with the result section. Brewer s spent grains (BSG) a cheap and abundant waste of the brewing industry has been selected as immobilization support. Several types of BSG (with and without chemical treatment) were evaluated and compared as supports for yeast immobilization, for use in alcoholic fermentation of molasses, in terms of operational stability, ethanol productivity, quality of the fermentation products, and cost effectiveness of the proposed processes. Finally the untreated BSG were selected as the most suitable support and were used for all other experiments. The immobilized biocatalyst was introduced in an MFBT bioreactor and was used for molasses fermentation at an extremely wide temperature range. More specific the system was able to ferment 10 o Be molasses at 3-40 o C. To the best of our knowledge this is the first report of ethanol production at such high concentrations at temperatures ranging 3-40 o C using non genetic modified strain of S. cerevisiae. These results led us to identify AXAZ-1 at the species level by sequencing analysis of two informative rdna regions. Its genetic similarity to other wild and commercialised S. cerevisiae strains was also evaluated through restriction analysis of mtdna. Strain AXAZ-1 was most closely related, though rather distant, to two starters of exotic origin rather than to Greek isolates. It was also notable, that except the high fermentation efficiency the system produced high quality products ought to the low concentrations of higher and amyl alcohols at both high and low fermentation temperatures. The same system was applied for continuous molasses fermentation, where MFBT bioreactor was also compared with a PB bioreactor. The MFBT system was

5 advantageous and the immobilized biocatalyst showed high operational stability during 55 working days at o C. Moreover, the obtained ethanol productivities were high, even at high fermentation temperatures. Same results were observed during 32 days of continuous non-sterilized molasses fermentation, while concentrations of volatiles by-products remained at normal levels. The MFBT bioreactor with the BSG immobilized biocatalyst was also used for batch type wine making. Ethanol and wine productivities were relatively high, while the major volatile by-products ranged in levels that contribute to the pleasant flavour of wines. GC-MS analysis confirmed the quality of the product at all studied temperatures, as the produced wines contained more esters than alcohols. This was a key point observation proving the suitability of the system for wine making at hot climates. The next step was to produce wine at o C in a continuous mode using the proposed system. The MFBT bioreactor with the BSG immobilized biocatalyst showed high operational stability during 96 days of continuous wine making. Volatile by-products concentrations were in the levels of commercial wines. These results in addition with the obtained high ethanol and wine productivities made the system suitable for wine making in wide temperature range. More important was that S. cerevisiae AXAZ-1 cells immobilized on BSG, in combination with the MFBT bioreactor could be proposed for industrial use. This is due to the ability of the system to work continuously throughout the year for both alcohol and wine production, making it cost effective. The final study was conducted in order to propose an alternative system, to be used in the case of BSG deficiency. The system included apple as immobilization support, which was placed in half the floors of the MFBT bioreactor. The results showed that the system could be used as an alternative without significant operational, economic and quality differences in comparison with the aforementioned system. The general conclusion of this thesis is that an integrated system composed of an MFBT bioreactor, a unique S. cerevisiae (AXAZ-1) strain and an agro industrial waste (BSG) as immobilization support, can be used for high quality wine and alcohol production. The distinctiveness of the proposed system is the ability to provide high productivities and to produce quality products, with both batch and continuous fermentations at an extremely wide temperature range. This fact reduces the cooling device cost at a minimum level, which is very important for an industry. Furthermore

6 the system is capable to ferment throughout the year and even when the fermentation process stops, the disposal of the immobilized biocatalyst in the environment can be avoided as it can be used as an animal feed due to its rich in dietary fibers and protein content.