ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ ΥΠΟΕΡΓΟ 8 ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Δοκιμές των ενσιρωμάτων ζωοτροφής σε ζώα

Transcript

1 ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ ΥΠΟΕΡΓΟ 8 ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Δοκιμές των ενσιρωμάτων ζωοτροφής σε ζώα Υπεύθυνος Παραδοτέου: Καθ. Παναγιώτης Γούλας Επιστημονικός Υπεύθυνος : Κωνσταντίνος Πετρωτός

2 1. Εισαγωγή Στα πλαίσια του πακέτου εργασίας 5.2. τα παραγόμενα ενσίρωματα τύπου Γ στο πακέτο εργασίας 5.1. ενσωματώθηκαν σε σιτηρέσια και πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες δοκιμές διατροφής σε κοτόπουλα και χοίρους με προσδιορισμό τόσο της πάχυνσης και της αποδοχής της τροφής όσο και των αντιοξειδωτικών δεικτών ευζωίας των ζώων κατά την διατροφή τους με τα φυσικώς παραγόμενα σιτηρέσια που ήταν ενισχυμένα με φυσικές πολυφαινόλες ελιάς. Ο σκοπός της εν λόγω πειραματικής διαδικασίας ήταν να αξιοποιηθούν παραγωγικά και αειφορικά τα κλάσματα του αποβλήτου που περισσεύουν από την διαδικασία παραγωγής της πολυφαινόλης ώστε να πραγματοποιηθεί πλήρης αξιοποίηση του αποβλήτου και κατά συνέπεια εξαφάνιση του ώστε να μην υπάρχει ανάγκη περαιτέρω βιολογικής επεξεργασίας οποιασδήποτε μορφής. Για τον προσδιορισμό των αντιοξειδωτικών δεικτών ευζωίας και μείωσης του οξειδωτικού στρές των ζώων χρησιμοποιήθηκαν δείγματα τόσο αίματος όσο και ιστών και προσδιορίστηκαν σ αυτά οι παρακάτω παράμετροι : α) Συγκέντρωση της Ανηγμένης Γλουταθειόνης. β) Δραστηριότητα της Καταλάσης. γ) Ολική Αντιοξειδωτική Ικανότητα δ) Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS ε) Πρωτεϊνικά Καρβονύλια. Τα αποτελέσματα της διαδικασίας παραγωγής του ενσιρώματος και των δοκιμών διατροφής και ευζωίας των ζώων καταγράφονται στην συνέχεια όπως και τα συμπεράσματα που συνηγορούν στην βιωσιμότητα και στην καταλληλότητα της λύσης της εξαφάνισης του υγρού υπολειμματικού κλάσματος που προκύπτει από την παραγωγή της υψηλής προστιθέμενης αξίας πολυφαινόλης

3 2. Μελέτη της επίδρασης της διατροφής κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής με σιτηρέσιο παρασκευασμένο με ενσιρώματα. Ι. ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΑΙΜΑ ΤΩΝ ΚΟΤΟΠΟΥΛΩΝ 2.1. Υλικά και Μέθοδοι Γενικά. Από τον Νοέμβριο του 2012, έως και τον Απρίλιο του 2013 εκτελέστηκαν τα παρακάτω: Στο εργαστήριο Μηχανικής Τροφίμων - Βιοσυστημάτων και στο αγρόκτημα του ΤΕΙ / Θεσσαλίας: Εκτροφή κοτόπουλων (Εφαρμογή σιτηρεσίου και συνθηκών ομαλής διαβίωσης ανάπτυξης). Παρακολούθηση ανάπτυξης κοτόπουλων (Ημερήσια αύξηση ζωϊκού βάρους, ημερήσια κατανάλωση τροφής). Εκτέλεση τριών (3) αιμοληψιών (Στις 10, 20 και 30 Δεκ.2012). Στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωϊκών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας: Ταχεία και ασφαλή μεταφορά των δειγμάτων των αιμοληψιών (120 δείγματα) και την τοποθέτησή τους σε ψυγείο στους -80 ο C. Επεξεργασία του αίματος. (Λήψη πλάσματος αιμολύματος). Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες Περιγραφή σιτηρεσίου. Στις παρελήφθησαν στο αγρόκτημα του ΤΕΙ Λάρισας σαρανταοκτώ (48) κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής (Hubbard), ηλικίας έξη (6) ημερών, από το πτηνοτροφείο Κακανούδη Ανδρέα με έδρα τις Νέες Καρυές Λάρισας. Μέχρι και στις τα κοτόπουλα ελάμβαναν κοινό σιτηρέσιο. Από τις , δημιουργήθηκαν τέσσερεις ομάδες οι οποίες ελάμβαναν το παρακάτω σιτηρέσιο.

4 ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Σιτηρέσιο κοτόπουλων πάχυνσης. ΥΛΙΚΟ ΠΟΣΟΣΤΟ % ΒΑΡΟΣ 250 kg Καλαμπόκι A/Β/Γ/Δ ομάδας. 55, ,00 Σογιάλευρο 42/8 31, ,50 Λίπος Σκόνη (Λεκιθ) 5, ,50 Ιχθυάλευρο 70/10 4, ,00 Ισορροπιστής Broiler 2,5% 2,5 25 6,25 Μαρμαρόσκονη 1,5 15 3,75 ΣΥΝΟΛΟ ,00 Εικόνα 1. Κλωβοί ανάπτυξης. Ως καλαμπόκι, αναφέρεται το ενσίρωμα όπου περιέχει μεγάλα ποσοστά υγρασίας, οργανικά οξέα, όπως γαλακτικό οξύ και χορηγείται στα ζώα σαν χονδροειδής ζωοτροφή. Η ενσίρωση είναι μια μέθοδος διατήρησης των χλωρών ζωοτροφών σε αναερόβιες συνθήκες. 1. Καλαμπόκι Α ομάδας: (Νερό + Καλαμπόκι). Σύνολο 60% Στερεά. 2. Καλαμπόκι Β ομάδας: (Διήθημα επεξεργασμένων υγρών απόβλητων ελαιοτριβείου, μερικώς αποφαινολοποιημένο, που προήλθε από μικροδιήθηση με κεραμικά φίλτρα, με 4% στερεά + Καλαμπόκι με 56% στερεά). Σύνολο 60% Στερεά. 3. Καλαμπόκι Γ ομάδας: (Κατακράτημα επεξεργασμένων υγρών απόβλητων ελαιοτριβείου, που προήλθε από μικροδιήθηση με κεραμικά φίλτρα, πολυφαινολοποιημένο με 4% στερεά + Καλαμπόκι με 56% στερεά). Σύνολο 60% Στερεά. 4. Καλαμπόκι Δ ομάδας:(υπολείμματα απόσταξης τριαντάφυλλου + Καλαμπόκι με 40% στερεά). Σημείωση: Προστέθηκαν γαλακτικά βακτήρια ενσίρωσης.

5 Αιμοληψία. Εκτελέστηκαν τρεις (3) αιμοληψίες ακολουθώντας την διαδικάσία που περιγράφεται από τους Ison A.J.et.al.(2005), όταν τα κοτόπουλα ήταν ηλικίας 30, 40 και 50 ημερών, τα οποία ελάμβαναν το ειδικό σιτηρέσιο για 17, 27 και 37 ημέρες αντιστοιχα. Σύμφωνα με μελέτη συλλογής αίματος των πουλερικών Spiegle S, et. al.,(2005), η μέγιστη ποσότητα του αίματος που μπορεί να συλλεχθεί από ένα υγιές κοτόπουλο, είναι το 1% του σωματικού του βάρους. Έτσι, για τις πειραματικές ανάγκες αποφασίστηκε να λαμβάνονται 4 ml αίματος. Χρησιμοποιήθηκαν: Μίας χρήσεως σύριγγες με βελόνα (Penta Ferte ), χωρητικότητας 5 ml., που μετά την χρήση τους απομακρύνονταν σε δοχεία περισυλλογής αιχμηρών αντικειμένων. Mίας χρήσεως αποστειρωμένα σωληνάρια συλλογής αίματος, (BD Vacutainer EDTA Tubes, με Ref. nr ), που περιήχαν 7,2 mg Κ3Ε. Το αντιπηκτικό EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ) δεσμεύει τα άλατα του ασβεστίου στο αίμα με χηλίωση (αποσιδήρωση), έτσι ώστε να διατηρηθούν τα κύτταρα. Το αίμα από τα κοτόπουλα λαμβάνονταν από την μεγάλη φλέβα κάτω από το φτερό (βραχίονα φλέβα - brachial vein). Με ιδιαίτερη προσοχή στο κοτόπουλο, ανοίγονταν οι πτέρυγες, καθαρίζονταν τα πούπουλα και απολυμαίνονταν οι περιοχές της αιμοληψίας, με 70% αλκοόλη. Η βελόνα εισχωρούσε προοδευτικά στην φλέβα και γινόταν η εξαγωγή του αίματος. Εικόνες 2 και 3. Αιμοληψία από βραχίονα φλέβα και τοποθέτηση αίματος σε σωληνάρια περισυλλογής. Εφαρμόζονταν πίεση στην φλέβα, για αποφυγή αιμορραγίας και το αίμα μεταφέρονταν στα σωληνάρια συλλογής. Το ληφθέν αίμα ανακατεύονταν απαλά

6 αναστρέφοντας τον σωλήνα αρκετές φορές. Αυτό διασφάλιζε τη σωστή ανάμιξη του αντιπηκτικού με το αίμα. Τα δείγματα τοποθετούνταν σε φορητό ψυγείο που έφεραν παγοκύστες και μεταφέρονταν στο εργαστήριο σε μισή ώρα, μετά το πέρας της αιμοληψίας Επεξεργασία Αίματος. Στο εργαστήριο αμέσως μετά από κάθε αιμοληψία, εκτελείτο επεξεργασία των δειγμάτων για την συλλογή αιμολύματος και πλάσματος. (V. Ramnath, et. al., 2007). Στο ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα για τον προσδιορισμό της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) και της καταλάσης και στο πλάσμα για τον προσδιορισμό των TBARS, των πρωτεϊνικών καρβονυλίων και της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας. Περιγραφή Μεθόδου. 1. Τοποθετούμε τα σωληνάρια συλλογής αίματος στην φυγόκεντρο και φυγοκεντρούμε στα 1370 g, για 10 λεπτά, στους 4 o C. 2. Συλλέγουμε το υπερκείμενο (πλάσμα) και το χωρίζουμε σε φιαλίδια eppendorf, ανάλογα με τις μετρήσεις που θα γίνουν. 3. Προσθέτουμε απιονισμένο νερό (1:1 v/v) στα ερυθροκύτταρα, τα οποία μετά τη φυγοκέντρηση βρίσκονται στο κάτω μέρος του falcon. 4. Ανακινούμε βίαια και φυγοκεντρούμε στα 4020 g, για 15 λεπτά, στους 4 o C. 5. Συλλέγουμε το υπερκείμενο, που είναι το ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα. Οι μεμβράνες των ερυθροκυττάρων μένουν ως ίζημα πολύ μικρού όγκου (10-20 μl). 6. Χωρίζουμε σε eppendorf το αιμόλυμα ανάλογα με τις μετρήσεις που θα γίνουν. Διατήρηση στους -20 o C.

7 Εικόνα 4. Διατήρηση πλάσματος και αιμολύματος σε φιαλίδια eppendorf. Στην συνέχεια καθαρίζεται το αιμόλυμα για τον προσδιορισμό της γλουταθειόνης. 1. Προσθέτουμε 500 μl αιμολύματος σε 500 μl 5% TCA σε eppendorf και ανακινούμε στο vortex. 2. Φυγοκεντρούμε στα g για 5 min στους 5 o C. 3. Συλλέγουμε το υπερκείμενο σε eppendorf και προσθέτουμε 5% TCA με την εξής αναλογία: 300 μl αιμολύματος / 90 μl 5% TCA και ανακινούμε στο vortex. 4. Φυγοκεντρούμε στα g για 5 min στους 5 o C. 5. Μεταφέρουμε το καθαρό υπερκείμενο σε eppendorfs, τα οποία αποθηκεύονται στον καταψύκτη και θα χρησιμοποιηθούν για την μέτρηση της γλουταθειόνης Προσδιορισμός Δεικτών Οξειδωτικού Στρες Γενικά. Για την αξιολόγηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης των ερυθροκυττάρων προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης καθώς και η δραστικότητα της καταλάσης. Για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας συχνά προσδιορίζεται η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος του αίματος. Για την αξιολόγηση του οξειδωτικού στρες, ένας από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της υπεροξείδωσης των λιπιδίων είναι οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ, ενώ για την καταστροφή των πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται τα πρωτεϊνικά καρβονύλια.

8 Μέθοδοι. Οι δείκτες οξειδωτικού στρες μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά και η αρχή προσδιορισμού του καθενός αναφέρεται αναλυτικά παρακάτω. Α. GSH στο ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα. Η γλουταθειόνη (γ-γλουταμυλοκυστέινογλυκίνη) είναι η πιο άφθονη θειόλη (SH) στους ιστούς των ζώων και του ανθρώπου. Είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη και κυστεΐνη. Οι αναγωγικές (αντιοξειδωτικές) της ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια όπως και στο αντιοξειδωτικό σύστημα των περισσότερων αερόβιων κυττάρων. Η γλουταθειόνη απαντάται κυρίως στην ανηγμένη (GSH) και λιγότερο στην οξειδωμένη της μορφή (δισουλφίδιο της γλουταθειόνης, GSSG). Συνήθως, η GSSG είναι το 10% της GSH. Η GSH χρησιμοποιείται ως δείκτης της αντιοξιδωτικής ικανότητας Pastore et al. (2003). Εικόνα 5. Συντακτικός τύπος της γλουταθειόνης. Η GSH λειτουργεί ως συνένζυμο σε πολλά ένζυμα. Ενδεικτικά αναφέρονται η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης και η θειολτρανσφεράση. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των φαρμάκων και του ασβεστίου καθώς και στη λειτουργία των αιμοπεταλίων και των κυτταρικών μεμβρανών. Είναι επίσης ζωτική η συμμετοχή της στην απομάκρυνση των ξενοβιοτικών ουσιών από τον οργανισμό, στην απομάκρυνση των υπεροξειδίων και των ελεύθερων ριζών αλλά και στη μεταφορά των αμινοξέων διαμέσου των μεμβρανών. Αρχή της μεθόδου.

9 Το πειραματικό πρωτόκολλο βασίζεται στην οξείδωση της GSH από το διθειόδυο νιτροβενζοϊκό οξύ (DTNB) και μετριέται σε αιμόλυμα. Η GSH αντιδρά με το DTNB παράγοντας GSSG και 2-νιτρο-5-θειοβενζοΐκό οξύ σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση, το οποίο είναι έγχρωμο προϊόν που απορροφάει στα 412 nm. Y.N. Reddy, et.al. (2004). 2 GSH + DTNB GSSG + 2-nitro-5- thiobenzoic acid Η GSH παράγεται από την GSSG μέσω της δράσης της αναγωγάσης της γλουταθειόνης. Εικόνα 6. Ανακύκλωση και αρχή προσδιορισμού της γλουταθειόνης. Αντιδραστήρια. Phosphate buffer 67 mm (ph 7.95). ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να δημιουργήσουμε 500 ml από το phosphate buffer φτιάχνουμε 25 ml KH 2 PO 4 (67 mm) και 500 ml Na 2 HPO 4 (67 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε g και τα διαλύουμε σε 25 ml νερού. Για το Na2HPO4 ζυγίζουμε 5.94 g και τα διαλύουμε σε 475 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως αναμιγνύουμε τα δύο διαλύματα. Διορθώνουμε με NaOH or HCl, 1 N μέχρι το ph να φτάσει την τιμή DTNB (1mM) σε 1% κιτρικό νάτριο (sodium citrate) σε νερό. (39.6 mg DTNB σε 100 ml του 1% διαλύματος του κιτρικού νατρίου, για να δώσει μία συγκέντρωση του 1 mm). DTNB [5,5 -Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)], ΜΒ: Κιτρικό Νάτριο. (C 6 H 5 Na 3 O 7 2H 2 O, διένυδρο τρινάτριο, tri-sodium dihydrate), ΜΒ: Το DTNB διαλύεται σε κιτρικό νάτριο το οποίο εμποδίζει σημαντικές αλλαγές στο ph.

10 Πειραματικό πρωτόκολλο. Προθέτουμε τις παρακάτω ποσότητες σε φιαλίδια eppendorf: ΠΙΝΑΚΑΣ 2. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της GSH. Blank Sample Phosphate buffer 67 mm, ph μl 660 μl DTNB 1 mm 330 μl 330 μl Απεσταγμένο νερό 20 μl - Αιμόλυμα - 20 μl Αναδεύουμε τα eppendorfs και τα επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Η διατήρησή τους στο σκοτάδι έχει ως στόχο την πραγματοποίηση της αντίδρασης μεταξύ του DTNB και της GSH. Μεταφέρουμε το περιεχόμενό τους σε μια πλαστική κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 412 nm. (Roland F. Beers, Jr. and Irwin W. Sizer. 1952) Υπολογισμοί. Δραστικότητα της GSH (mmol/l) = (Αbsδείγματος ΔAbsτυφλού / 13.6) x 262.6, όπου το είναι ο συντελεστής αραίωσης, που προκύπτει διαιρώντας τον τελικό όγκο (1010 μl) με τον όγκο του αιμολύματος (20 μl) (1010 / 20 = 50.5), πολλαπλασιάζοντας με 2 για να συνυπολογίσουμε την 1:1 αραίωση που έγινε για τη λύση των ερυθροκυττάρων και με 2 x 1.3 για να συνυπολογίσουμε την πρώτη (500 μl αιμολ. / 500 μl 5% TCA) και τη δεύτερη αραίωση (390 μl / 300 μl) που έγιναν από το TCA 5%. Το 13.6 είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του DTNB. Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης μιας ουσίας ισούται με την απορρόφηση της ουσίας αυτής σε συγκέντρωση 1 mol/l. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της GSH εκφράζεται ως προς την αιμοσφαιρίνη. Η αιμοσφαιρίνη υπολογίζεται με τη βοήθεια ενός kit και πρέπει να εκφραστεί σε g/l ώστε η μονάδα αυτή να είναι σε συμφωνία με τη συγκέντρωση της GSH που υπολογίστηκε προηγουμένως (mmol/l). Έτσι, μετά τη φωτομέτρηση η τιμή της αιμοσφαιρίνης υπολογίζεται σε g/dl. Πολλαπλασιάζοντας την τιμή αυτή με 10 x

11 2, τη μετατρέπουμε σε g/l και ταυτόχρονα λαμβάνουμε υπόψη την 1:1 αραίωση κατά τη λύση των ερυθροκυττάρων. Έτσι λαμβάνουμε την συγκέντρωση της GSH ανά γραμμάριο αιμοσφαιρίνης. GSH (mmol/ g Hb). Β. Δραστηριότητα της Καταλάσης. Αρχή της μεθόδου. Η καταλάση είναι ένα κοινό ένζυμο, το οποίο απαντάται σε όλους σχεδόν τους ζωντανούς οργανισμούς που έρχονται σε επαφή με το οξυγόνο. Το υπεροξείδιο υδρογόνου διαμορφώνεται ως προϊόν μεταβολισμού σε πολλούς οργανισμούς. Είναι τοξικό και πρέπει να μετατραπεί γρήγορα σε άλλο, λιγότερο επικίνδυνη χημική ουσία. Για να διαχειριστεί αυτό το πρόβλημα, η ενζυμική καταλάση χρησιμοποιείται συχνά για να καταλύσει γρήγορα την αποσύνθεση του υπεροξειδίου υδρογόνου σε αβλαβή οξυγόνο και νερό. Chelikani P, et. al., (2004). Ένα μόριο καταλάσης μπορεί να μετατρέψει μόρια H 2 O 2 το δευτερόλεπτο σε νερό και οξυγόνο. Βρίσκεται στα υπεροξεισώματα, στα μιτοχόνδρια και το κυτταρόπλασμα. Είναι ένα τεραμερές με 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες μεγέθους τουλάχιστον 500 αμινοξέων. Boon EM, et. al. (2007). Στο τετρεμερές αυτό υπάρχουν 4 πορφυρινικές ομάδες αίμης, οι οποίες επιτρέπουν στην καταλάση να αντιδρά με το H 2 O 2. Το ιδανικό της ph είναι το ουδέτερο. Η αντίδραση διάσπασης του H 2 O 2 από την καταλάση είναι η ακόλουθη: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Η αντίδραση πραγματοποιείται σε 2 στάδια: H 2 O 2 + Fe(III)-E H 2 O + O=Fe(IV)-E H 2 O 2 + O=Fe(IV)-E H 2 O + Fe(III)-E + O 2 (Όπου το σύμπλοκο Fe-E αντιπροσωπεύει το κέντρο με το σίδηρο της ομάδας της αίμης που είναι προσδεδεμένη στο ένζυμο). Εικόνα 7. Μονοπάτι αναγωγής του H 2 O 2 σε H 2 O

12 Επίσης η καταλάση μπορεί να χρησιμοποιήσει το H 2 O 2 για την απομάκρυνση τοξικών ουσιών (Η 2 Α) με τη χρησιμοποίηση υποστρώματος (αιθανόλη), σύμφωνα με την ακόλουθη αντίδραση: CAT H 2 O 2 + H 2 A (substrate) 2 H 2 O + A. Για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της Καταλάσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του Aebi et al., (1984). Αντιδραστήρια. Phosphate buffer 67mM (ph 7.4) ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 και ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να παρασκευάσουμε 500 ml του phosphate buffer ξεκινάμε πρώτα με 100 ml KH 2 PO 4 (67 mm) και 400 ml Na 2 HPO 4 (67 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε 0.91 g και τα διαλύουμε σε 100 ml νερού. Για το Na 2 HPO 4 ζυγίζουμε 4.77 g και τα διαλύουμε σε 400 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως αναμιγνύουμε τα διαλύματα. Αν χρειαστεί προσθέτουμε NaOH ή HCl, 1 N ώστε το ph του παραγόμενου διαλύματος να είναι % υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ). Το διάλυμα H 2 O 2 είναι έτοιμο προς χρήση. Πειραματικό πρωτόκολλο. Προσθέτουμε τους παρακάτω όγκους σε πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες: ΠΙΝΑΚΑΣ 3. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της Καταλάσης. Δείγμα Phosphate buffer 67 mm, ph 7.4 Αιμόλυμα αραιωμένο 1/ μl 4 μl

13 Αναδεύουμε στο vortex και επωάζουμε στον κλίβανο στους 37 o C για 10 λεπτά. Είναι πιο πρακτικό να επωάζουμε 2 δείγματα κάθε φορά ώστε να είμαστε σίγουροι ότι τα δείγματα φωτομετρούνται αμέσως μετά την επώαση. Κατόπιν, μεταφέρουμε το περιεχόμενο του πλαστικού κυλίνδρου σε μία κυψελίδα για μέτρηση στο υπεριώδες (UV). Τέλος, προσθέτουμε 5 μl 30% H 2 O 2 στην κυψελίδα, την ανακινούμε τρεις φορές χρησιμοποιώντας παραφίλμ στην κορυφή της και μετράμε την απορρόφηση στα 240 nm για 130 δευτερόλεπτα. Υπολογισμοί Δραστικότητα της καταλάσης (U/mg Hb) = (ΔΑbs sample per min / 40) x(750 x 1000 x 10 x 2) / Conc. Hb (mg/ml). Όπου, το 40 (mol/l) είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του H 2 O 2 πολλαπλασιαζόμενος με 1000 για τη μετατροπή του σε μmol/ml. Το 750 είναι ο παράγοντας αραίωσης που προκύπτει από τη διαίρεση του τελικού όγκου του κυλίνδρου (3000 μl) με τον όγκο του αιμολύματος (4 μl) (3000 / 4 = 750), το 10 προκύπτει από την 1:10 αραίωση του δείγματος και το 2 από την 1:1 λύση των ερυθροκυττάρων. Ο υπολογισμός της δραστικότητας της καταλάσης εκφράζεται ως προς την αιμοσφαιρίνη. Η αιμοσφαιρίνη υπολογίζεται με τη βοήθεια ενός kit και πρέπει να εκφραστεί σε g/l. Έτσι, μετά τη φωτομέτρηση η τιμή της αιμοσφαιρίνης υπολογίζεται σε g/dl. Πολλαπλασιάζοντας την τιμή αυτή με 10 x 2, την μετατρέπουμε σε g/l και ταυτόχρονα λαμβάνουμε υπόψη την 1:1 αραίωση κατά τη λύση των ερυθροκυττάρων. Δ Αbs (min) = η μεταβολή της απορρόφησης σε ένα λεπτό. Η συγκέντρωση του H 2 O 2 στην κυψελίδα είναι περίπου16 mm. U = μmol/min. ΔAbs blank είναι πάντοτε μηδέν και έτσι δεν απαιτείται μέτρηση του τυφλού. Γ. Ολική Aντιοξειδωτική ικανότητα (Total Antioxidant Capacity, TAC). Ο όρος ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) αναφέρεται στην ικανότητα των συστατικών του πλάσματος του αίματος να εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες.

14 Κάθε συστατικό του πλάσματος έχει αντιοξειδωτική δράση. Ωστόσο, κάθε ένα συνεισφέρει με διαφορετικό τρόπο στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος, η οποία είναι γενικά ένα μέτρο της αντιοξειδωτικής κατάστασης ολόκληρου του οργανισμού. Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τρόποι προσέγγισης της ποσοτικοποίησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας του πλάσματος. Ο πρώτος είναι το άθροισμα της αντιοξειδωτικής ικανότητας του κάθε συστατικού του πλάσματος ξεχωριστά. Αυτός είναι ο πιο επίπονος τρόπος επειδή υπάρχουν πολλά μόρια που συνεισφέρουν στην αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος. Ο δεύτερος τρόπος είναι η μέτρηση της TAC ως σύνολο. Το ουρικό οξύ φαίνεται να είναι το μόριο που έχει τον πιο ισχυρό ρόλο στον καθορισμό της τιμής της TAC στο πλάσμα (55-60%) προκαλώντας μεγάλη αύξησή της όταν η συγκέντρωσή του αυξάνεται. Το ουρικό οξύ βρίσκεται σε πολύ πιο υψηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα σε σχέση με άλλα μόρια με εξαίρεση τις θειόλες. Η βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) είναι το δεύτερο πιο ισχυρό μόριο στον καθορισμό της τιμής της TAC και ακολουθούν κατά σειρά οι βιταμίνες E και A. Οι βιταμίνες C και E μάλιστα είναι πιθανό να αποτελούν το 25 % της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του πλάσματος. Αρχή της μεθόδου Η TAC του ορού στη συγκεκριμένη μέθοδο υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Παρουσία ενός δότη υδρογόνων που υπάρχει στον ορό, η παραπάνω ρίζα (DPPH ) ανάγεται προς σχηματισμό της αντίστοιχης υδραζίνης (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine). Ο προσδιορισμός της TAC βασίστηκε στη μέθοδο των Janaszweska και Bartosz, (2002). Η μετατροπή της ρίζας υπολογίζεται με φωτομέτρηση στα 520 nm. Αντιδραστήρια Phosphate buffer 10 mm (ph 7.4). ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 και ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να φτιάξουμε 500 ml του phosphate buffer φτιάχνουμε 100 ml KH 2 PO 4 (10 mm) και 400 ml Na 2 HPO 4 (10 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε g και τα διαλύουμε σε 100 ml νερό. Για το Na 2 HPO 4 ζυγίζουμε g και τα διαλύουμε σε

15 400 ml νερό. Σε ένα ποτήρι ζέσεως χύνουμε τα διαλύματα και προσθέτουμε NaOH ή HCl, 1 N μέχρι το ph να φτάσει την τιμή 7.4. DPPH 0.1 mm. ΜΒ: Διαλύουμε 0.02 g DPPH σε 5 ml μεθανόλης και τα αναμιγνύουμε με μαγνητάκι (10 mm). Μετά αραιώνουμε 100 φορές με μεθανόλη και τα αναμιγνύουμε ξανά με μαγνητάκι. Για παράδειγμα, αραιώνουμε 200 μl του 10 mm διαλύματος του DPPH σε 19.8 ml μεθανόλης (ποσό αρκετό για 10 δείγματα, συν το τυφλό και τον θετικό έλεγχο). Εξαιτίας της αραίωσης, ο αρχικός όγκος των 5 ml είναι πάντα αρκετός για πολλούς προσδιορισμούς. Καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο το ποτήρι ζέσεως, στο οποίο φτιάχνουμε το DPPH για να αποφύγουμε τη φωτόλυση. Το συγκεκριμένο διάλυμα φτιάχνεται τη μέρα του πειράματος. Ασκορβικό οξύ 10 mm. Είναι έτοιμο προς χρήση. Φυσιολογικά, η τιμή της απορρόφησης για το δείγμα που περιέχει το ασκορβικό οξύ (Positive Control) θα πρέπει να είναι χαμηλότερη και από την τιμή των δειγμάτων αλλά και του τυφλού. Ο λόγος είναι η συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος (ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό μόριο) που έχουμε επιλέξει. Η τιμή της απορρόφησης των δειγμάτων, θα πρέπει να βρίσκεται ανάμεσα στις τιμές του τυφλού (η μεγαλύτερη τιμή) και του θετικού ελέγχου (η μικρότερη τιμή). Πειραματικό πρωτόκολλο. Προσθέτουμε τις ακόλουθες ποσότητες στα Εppendorfs: ΠΙΝΑΚΑΣ 4. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της TAC.. Blank Θετικός control Δείγμα Phosphate buffer 10 mm, ph μl 495 μl 480 μl DPPH 0.1 mm 500 μl 500 μl 500 μl Ασκορβικό Οξύ 10 mm - 5 μl - Πλάσμα μl

16 Ανακινούμε τα Eppendorfs μερικές φορές και τα επωάζουμε στο σκοτάδι για 60 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της επώασης η αντιοξειδωτικές ουσίες του ορού εξουδετερώνουν τη ρίζα DPPH μετατρέποντάς τη στην πιο σταθερή ένωση υδραζίνη. Φυγοκεντρούμε για 3 λεπτά στα g στους 25 o C (για την καταβύθιση σωματιδίων που θα αυξήσουν την απορρόφηση). Μεταφέρουμε 900 ml από το υπερκείμενο με πιπέτα σε πλαστική κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 520 nm. Επειδή είναι πιθανό η απορρόφηση του τυφλού να αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου, είναι σκόπιμη η επανάληψη της μέτρησης του τυφλού κάθε 5 περίπου δείγματα. Υπολογισμοί. Τα αποτελέσματα μπορούν να εκφραστούν ως: i) % μείωση της απορρόφησης (Abs) σε σχέση με το τυφλό, πχ, % Abs μείωση = (Abs τυφλού Abs δείγματος) / Abs τυφλού x 100 ii) μmol DPPH που απομακρύνθηκαν / ml πλάσματος = [(% Abs μείωση / 100) x 50 x 50] / α) Διαιρούμε με το 100 με σκοπό να μετατρέψουμε την ποσοστιαία μείωση της απορρόφησης σε απλή μείωση της απορρόφησης. β) Πολλαπλασιάζουμε με το 50 διότι η συγκέντρωση του DPPH στην κυψελίδα είναι 50 μmol/l της κυψελίδας. γ) Πολλαπλασιάζουμε με το 50 διότι η αραίωση του πλάσματος στην κυψελίδα είναι 50-πλάσια (1000 μl στην κυψελίδα / 20 μl πλάσματος του δείγματος στην κυψελίδα = 50). δ) Διαιρούμε με το 1000 για να μετατρέψουμε τα L του πλάσματος σε ml ορού. Παράδειγμα. Αν η % μείωση της απορρόφησης είναι 20, τα μmol του DPPH που απομακρύνθηκαν / ml πλάσματος είναι: 20/ 100 x 50 x 50 / 1000 = 0.5 μmol DPPH που απομακρύνθηκαν / ml πλάσματος ή 0.5 mmol DPPH που απομακρύνθηκαν / L πλάσματος ή 0.5 mmol DPPH/L.

17 Δ. Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) Αρχή της μεθόδου. Το οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό άκρως ενεργών και ασταθών υπεροξειδίων των λιπιδίων από τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Προϊόν της διάσπασης αυτών των ασταθών μορίων είναι η μαλονδιαλδεΰδη. Η μαλονδιαλδεΰδη μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της αντίδρασής της με το θειοβαρβιτουρικό οξύ. Έτσι, τα TBARS εκφράζονται σαν ισοδύναμα της μαλονδιαλδεΰδης, η οποία σχηματίζει μία ένωση με το θειοβαρβιτουρικό οξύ με αναλογία μαλονδιαλδεΰδης προς θειοβαρβιτουρικό οξύ 1/2. Η μέτρηση της μαλονδιαλδεΰδης είναι μία φωτομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό του βαθμού υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Εικόνα 8. Αντίδραση TBA (1) με MDA (2), που οδηγεί στην παραγωγή του μορίου TBA-MDA. Για τον προσδιορισμό των TBARS χρησιμοποιήθηκε μια ελαφρά τροποποιημένη μέθοδος του Keles et al., (2001). Πριν ξεκινήσει η πειραματική διαδικασία ρυθμίζουμε το υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 o C. Αντιδραστήρια. Tris-HCl 200 mm (ph 7.4). ΜΒ (Tris): ΜΒ (HCl): (stock 37%) [10.1 N]. Για να παρασκευάσουμε 100 ml του Tris-HCl buffer φτιάχνουμε 25 ml Tris (200 mm) και 42 ml HCl (0.1 N). Για το Tris ζυγίζουμε 0.61 g και τα διαλύουμε σε 25 ml νερού. Για το HCl διαλύουμε 0.42 ml του stock 37% HCl (10.1 N) σε 42 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως ρίχνουμε τα 25 ml από το Tris και προσθέτουμε αργά τα 42 ml του HCl και μετά προσθέτουμε νερό ως τα 100 ml. Ελέγχουμε το ph αν είναι στο 7.4.

18 Το Tris είναι συντομογραφία του τρισυδροξυμεθυλαμινομεθάνιου (trishydroxymethylaminomethane). Το Tris είναι κατάλληλο για τη δημιουργία ρυθμιστικών διαλυμάτων με ph από 6,5 μέχρι 9,7. Διάλυμα Na 2 SO 4 (2 M) TBA (55 mm). ΜΒ (TBA): και ΜΒ (Na 2 SO 4 ): Για την παρασκευή10 ml διαλύματος, ζυγίζουμε 2.84 g Na 2 SO 4 και 0.08 g θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA). Τα μεταφέρουμε σε ένα ποτήρι ζέσεως και προσθέτουμε 10 ml νερού. Θερμαίνουμε και ανακατεύουμε με το μαγνητάκι μέχρι να διαλυθούν τα συστατικά πλήρως. Το συγκεκριμένο διάλυμα πρέπει να φτιάχνεται πάντοτε την ημέρα του πειράματος. TCA 35%: Ζυγίζουμε 35 g TCA και τα διαλύουμε σε απεσταγμένο νερό ώστε ο τελικός όγκος να φτάσει τα 100 ml νερού (σε θερμοκρασία δωματίου). TCA 70%: Ζυγίζουμε 70 g TCA και τα διαλύουμε σε απεσταγμένο ώστε ο τελικός όγκος να φτάσει τα 100 ml νερού (σε θερμοκρασία δωματίου). Πειραματικό Πρωτόκολλο. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες Falcon (15 ml) προσθέτουμε 100 μl πλάσματος (για τα δείγματα) ή απεσταγμένο νερό (για το τυφλό). Προσθέτουμε 500 μl TCA 35% και 500 μl Tris-HCl και αναδεύουμε. Επωάζουμε για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθέτουμε 1 ml Na 2 SO 4 TBA και επωάζουμε στους 95 o C για 45 min στο υδατόλουτρο. Κατόπιν, μεταφέρουμε τους Falcon στον πάγο και τους αφήνουμε να κρυώσουν για 5 min. Προσθέτουμε 1 ml TCA 70% και αναδεύουμε. Μεταφέρουμε 1 ml σε eppendorfs και φυγοκεντρούμε στα g (10000 rpm) στους 25 o C για 3 min. Τέλος, μεταφέρουμε με πιπέτα 900 μl από το υπερκείμενο σε κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 530 nm. Υπολογισμοί. Η συγκέντρωση των TBARS (μmol/l) = (Abs δείγματος Abs τυφλού) / x 31, όπου το 31 είναι ο συντελεστής αραίωσης, που προέρχεται από τη διαίρεση του τελικού όγκου (3100 μl) με τον όγκο του πλάσματος (100 μl) (3100 / 100 = 31). Το προέρχεται από το συντελεστή μοριακής απόσβεσης της MDA που είναι (mol/l) διαιρούμενου με 10-6 με σκοπό να μετατραπούν τα mol/l to μmol/l.

19 Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης μιας ουσίας ισούται με την απορρόφηση της ουσίας αυτής σε συγκέντρωση 1 mol/l. Ε. Πρωτεϊνικά καρβονύλια. Αρχή της μεθόδου. Οι πρωτεΐνες και τα αμινοξέα είναι ευαίσθητα σε βλάβες προκαλούμενες από τις ελεύθερες ρίζες. Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια είναι ένας δείκτης της οξείδωσης ων πρωτεϊνών και χρησιμοποιείται ευρέως. Οι καρβονυλικές ομάδες (αλδεΰδες και κετόνες) που αποτελούνται από ένα άτομο άνθρακα σε διπλό δεσμό με ένα άτομο οξυγόνου C = O, ως συνήθως αποτελούν μέρος σε άλλες μεγαλύτερες λειτουργικές ομάδες. Παράγονται κυρίως στις προσθετικές ομάδες της προλίνης (pro), της αργινίνης (arg), της λυσίνης (lys) και της θρεονίνης (thr). Είναι ένας αξιόπιστος δείκτης οξείδωσης των πρωτεϊνών καθώς τα καρβονύλια είναι σταθερά μόρια. Οι πρωτεΐνες που καρβονυλιώνοται υφίστανται μη αναστρέψιμες βλάβες καθώς εκτρέπονται από τη φυσιολογική τους λειτουργία. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες σε μέτριο βαθμό, διασπώνται από το πρωτεόσωμα αλλά αν υποστούν πολύ δριμείες βλάβες τότε δεν μπορούν να διασπαστούν και συγκεντρώνονται σε συσσωματώματα υψηλού μοριακού βάρους. Η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών όχι μόνο επηρεάζει τη δική τους λειτουργία αλλά και τον τρόπο με τον οποίο λειτουργούν και άλλα βιομόρια. Για παράδειγμα, αν υποστούν καρβονυλίωση ένζυμα όπως εκείνα που επισκευάζουν το DNA ή οι DNA πολυμεράσες, το DNA δε θα επιδιορθώνεται ούτε θα αντιγράφεται με την απαραίτητη πιστότητα. Ο σχηματισμός των καρβονυλίων συνήθως ανιχνεύεται με την αντίδρασή τους με το DNPH (2,4-δίνιτριφαινυλυδραζίνη) προς σχηματισμό του 2,4- δίνιτροφαινυλυδραζονίου. Ο προσδιορισμός των καρβονυλίων βασίστηκε στη μέθοδο Patsoukis et. al., (2004).

20 Εικόνα 9. Σύνδεση πρωτεΐνης με την DNPH (δίνιτριφαινυλυδραζίνη) και σχηματισμός του δίνιτροφαινυλυδραζονίου. Αντιδραστήρια Διάλυμα HCl 2.5 N. HCl: ΜΒ 36.46; stock 37% (10.1 N) Για να παρασκευάσουμε 100 ml διαλύματος 2.5 N HCl, προσθέτουμε αργά 24.6 ml του 37% HCl (ίσο με 10.1 N HCl) σε 70 ml απεσταγμένου νερού και το φέρνουμε σε τελικό όγκο 100 ml με απεσταγμένο νερό. Κατά την παρασκευή του διαλύματος του 2,5 N HCl χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή επειδή το διάλυμα του 37 % είναι πολύ καυστικό. Πάντα η παρασκευή γίνεται κάτω από τον απαγωγό και φορώντας γάντια. DNPH 14 mm. (ΜΒ: 198.1) Για να φτιάξουμε 100 ml 14 mm DNPH διαλύουμε g DNPH σε 100 ml 2.5 N HCl. Το διάλυμα αυτό φτιάχνεται πάντα τη μέρα του πειράματος. Όταν το ετοιμάσουμε το καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο γιατί είναι φωτοευαίσθητο. Απαιτούνται 0.5 ml για κάθε δείγμα. Φτιάχνουμε και ένα τυφλό για κάθε δείγμα. Ουρία 5 M (ph 2.3). (ΜΒ: 60.06) Για να φτιάξουμε 100 ml 5 M ουρίας (ph 2.3, το οποίο ρυθμίζεται με 2N HCl), διαλύουμε 30 g ουρίας in 70 ml απεσταγμένου νερού και το φέρνουμε σε τελικό όγκο 100 ml με απεσταγμένο νερό.

21 Πειραματικό πρωτόκολλο. Σε 50 μl πλάματος προσθέτουμε 50 μl 20% TCA σε eppendorfs και αναδεύουμε στο vortex (κάθε δείγμα έχει το τυφλό του). Το 20% TCA προστίθεται με σκοπό να κατακρημνιστούν οι πρωτεΐνες του πλάσματος. Το TCA (τριχλωροοξικό οξύ) χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοχημεία για την κατακρήμνιση μακρομορίων όπως πρωτεΐνες, DNA και RNA. Επωάζουμε στον πάγο για 15 λεπτά και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Κατόπιν, προσθέτουμε στο ίζημα (πελέτα) 0.5 ml του 14 mm DNPH (διαλυμένο σε 2.5 N HCL) για τα δείγματα ή 0.5 ml 2.5 N HCL για τα τυφλά (κάθε δείγμα έχει το δικό του τυφλό), διαλύουμε με την πιπέτα το ίζημα, αναδεύουμε και επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ενδιάμεση ανάδευση στο vortex κάθε 15 λεπτά. Μετά την πάροδο της μίας ώρας, φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml από το 10% TCA, αναδεύουμε (διαλύουμε με την πιπέτα το ίζημα αν χρειάζεται) και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 0.5 ml αιθανόλης και 0.5 ml οξικού ειθυλεστέρα (αναλογία μίγματος, 1:1 v/v), κάνουμε vortex και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Το ίζημα πλένεται με 10% TCA και με μίγμα αιθανόλης και οξικού αιθυλεστέρα για να απομακρυνθεί το DNPH που δεν έχει αντιδράσει. Αυτήν την διαδικασία την επαναλαμβάνουμε άλλες δύο (2) φορές και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Προσθέτουμε 1 ml 5 M ουρία (ph 2.3), αναδεύουμε και επωάζουμε στους 37 o C για 15 λεπτά. Η ουρία προκαλεί μετουσίωση των πρωτεϊνών (διασπώντας τους ομοιπολικούς δεσμούς) αυξάνοντας έτσι τη διαλυτότητά τους. Φυγοκεντρούμε στα g για 3 λεπτά στους 4 o C. Τέλος, μεταφέρουμε με την πιπέτα 900 ml σε μία κυψελίδα και μετράμε την απορόφηση στα 375 nm. (Κάθε δείγμα έχει το τυφλό του. Το τυφλό περιέχει τα πάντα εκτός από τα 0.5 ml DNPH, τα οποία αντικαθίστανται 0.5 ml HCL 2.5 N).

22 Υπολογισμοί. Συγκέντρωση πρωτεϊνικών καρβονυλίων (nmol/ml) = A δείγματος A τυφλού / x 1000/50. Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του DNPH είναι 22 mm x cm -1. Το 1000/50 είναι ο συντελεστής αραίωσης (1000 μl στην κυψελίδα /50 μl δείγματος) Αποτελέσματα βιοδραστικών μετρήσεων στο αίμα των κοτόπουλων. Control. Permeate (processed OMWW). Retentate (processed OMWW). Distilling Rose Residues. Γράφημα 1. GSH στο Αιμόλυμα των Κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά Αιμοληψία). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε Ρ < 0,05.

23 Cat. (U/mg Hb) Η Α ομάδα (Control) στην 1η αιμοληψία (κοτόπουλα 30 ημερών και μέσου βάρους 650 γραμμαρίων), παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με τις C και D ομάδες. Επίσης, στην πρώτη αιμοληψία και σε όλες τις ομάδες παρατηρούνται τιμές GSH στατιστικά σημαντικά μικρότερες, από τις άλλες δύο αιμοληψίες με τις υψηλότερες να παρατηρούνται στην ομάδα του μάρτυρα. 25 CATALASE (Chickens RBCL) A B C D Groups Control. Permeate (processed OMWW). Retentate (processed OMWW). Distilling Rose Residues. Γράφημα 2. Καταλάση στο Αιμόλυμα των Κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά Αιμοληψία). Η Α ομάδα (Control) και η Β στην 1η αιμοληψία (κοτόπουλα 30 ημερών), παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικά μειωμένες τιμές καταλάσης, σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες.

24 Η C ομάδα παρουσιάζει τις υψηλότερες τιμές καταλάσης στις δύο (2) τελευταίες αιμοληψίες. Κατά την 3η αιμοληψία παρουσιάζονται οι μεγαλύτερες τιμές σε σύγκριση (στατιστικά σημαντικές) με τις υπόλοιπες ομάδες.. Control. Permeate (processed OMWW). Retentate (processed OMWW). Distilling Rose Residues. Γράφημα 3. TAC στο Πλάσμα των Κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά Αιμοληψία). Η Α ομάδα (Control) και η Β στην 1η αιμοληψία (κοτόπουλα 30 ημερών), παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικά μειωμένη TAC (total antioxidant capacity), σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες.

25 Η C ομάδα παρουσιάζει τις υψηλότερες τιμές ΤΑC σε όλες τις αιμοληψίες. Κατά την 3η αιμοληψία παρουσιάζονται οι μεγαλύτερες τιμές, στατιστικά σημαντικές με τις υπόλοιπες ομάδες. Control. Permeate (processed OMWW). Retentate (processed OMWW). Distilling Rose Residues. Γράφημα 4. TBARS στο Πλάσμα των Κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά Αιμοληψία). Η Α ομάδα (Control) στην 1η αιμοληψία (κοτόπουλα 30 ημερών), παρουσιάζει στατιστικά σημαντικά αυξημένα TBARS σε σχέση με τις υπόλοιπες αιμοληψίες όχι μόνο στην ίδια ομάδα, αλλά και σχέση με τις υπόλοιπες. Η C ομάδα παρουσιάζει τις χαμηλότερες τιμές TBARS σε όλες τις αιμοληψίες. Κατά την 3η αιμοληψία παρουσιάζονται οι μικρότερες τιμές TBARS, στατιστικά σημαντικές με τις υπόλοιπες ομάδες.

26 Control. Permeate (processed OMWW). Retentate (processed OMWW). Distilling Rose Residues. Γράφημα 5. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στο Πλάσμα των Κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά Αιμοληψία). Η Α ομάδα (Control) στην 1η αιμοληψία (κοτόπουλα 30 ημερών), παρουσιάζει στατιστικά σημαντικά αυξημένα πρωτεϊνικά καρβονύλια, σε σχέση με τις υπόλοιπες αιμοληψίες όχι μόνο στην ίδια ομάδα, αλλά και σε σχέση με τις υπόλοιπες. Η C ομάδα παρουσιάζει τις χαμηλότερες τιμές καρβονυλίων σε όλες τις αιμοληψίες. Κατά την 3η αιμοληψία παρουσιάζονται οι μικρότερες τιμές, στατιστικά σημαντικές με τις υπόλοιπες ομάδες. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εκτραφούν τέσσερεις (4) ομάδες κοτόπουλων πάχυνσης με πολυφαινολικά πρόσθετα, έτσι ώστε να ελεγχθούν οι

27 δείκτες του οξειδωτικού στρες, στο πλάσμα και το αιμόλυμά τους. Με την ανάλυση των αποτελεσμάτων, δεν εντοπίστηκε μόνον η συμπεριφορά των δεικτών, σε σχέση με τον χρόνο, αλλά και μεταξύ των ομάδων. Οι δείκτες του οξειδωτικού στρες που ελέγχθηκαν ήταν: Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η δραστηριότητα της καταλάσης (Catalase activity), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC Total antioxidant capacity), οι ουσίες που αντιδρουν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS Thiobarbituric acid reactive substances) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. Το σπουδαιότερο σε αυτήν την εργασία είναι πως οι δείκτες δεν διαφοροποιούνται μόνον από αιμοληψία σε αιμοληψία, αλλά τα πολυφαινολικά πρόσθετα διαφοροποιούν τους δείκτες και μεταξύ των ομάδων ακόμα και στην ίδια αιμοληψία. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στις παρακάτω παρατηρήσεις και συμπεράσματα: Συγκεκριμένα, στην πρώτη αιμοληψία η ομάδα C, που ελάμβανε το πλήρως εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες εκχύλισμα από ΥΑΕ, είχε αυξημένες τιμές γλουταθειόνης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου περίπου στο τετραπλάσιο (από 1,1 σε 4 μmol/gr αιμοσφαιρίνης), που σημαίνει πως τα νεαρά κοτόπουλα με την χορήγηση πολυφαινολικών προσθέτων, αυξάνουν τα επίπεδα της γλουταθειόνης. Με την πάροδο του χρόνου και μετά την 1η αιμοληψία, παρουσιάζεται μεγάλη αύξηση της GSH στο αιμόλυμα, όσον αφορά στην ομάδα του μάρτυρα (αύξηση επιπέδων πάνω από 14 φορές). Παράλληλα, οι άλλες τρεις (3) ομάδες παρουσιάζουν μικρότερες τιμές, στατιστικά σημαντικές. Το ίδιο συμπέρασμα ισχύει και στην τρίτη (3) αιμοληψία, με την υψηλότερη τιμή να παρατηρείται στην ομάδα ελέγχου και οι χαμηλώτερες τιμές στις ομάδες C and D αντίστοιχα. Αυτό ερμηνεύεται ως απόκριση του οργανισμού στα εξωγενή αντιοξειδωτικά τα οποία παρέχονται. Έτσι, με αυτόν τον τρόπο, ο οργανισμός καθορίζει την αντιοξειδωτική του άμυνα. Όσον αφορά στην δραστηριότητα της καταλάσης, με την πάροδο του χρόνου υπάρχει μία αύξηση, στην ομάδα του μάρτυρα, η οποία είναι και στατιστικά σημαντική. Μία άλλη παρατήρηση είναι πως η ομάδα ελέγχου, παρουσιάζει τις χαμηλότερες τιμές, σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Σε κάθε συλλογή αίματος η ομάδα C, αυξάνει την δραστηριότητα της καταλάσης, με μεγαλύτερη τιμή αυτήν της τρίτης αιμοληψίας, η οποία και είναι στατιστικά σημαντική. Αυτό σημαίνει πως τα πολυφαινολικά πρόσθετα της ομάδας C, υποβοηθούν στην δραστηριότητα του ενζύμου, με

28 αποτέλεσμα την αύξηση της διάσπασης του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο. ΟΙ τιμές των δεικτών του οξειδωτικού στρες στο πλάσμα, παρουσιάζουν ιδιέτερο ενδιαφέρον και ερμηνεύονται ως ακολούθως: Με την πάροδο του χρόνου, η ομάδα ελέγχου παρουσιάζει αύξηση στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα, η οποία δεν είναι στατιστικά σημαντική (2.4%). Σε αντίθεση, η ομάδα C, αυξάνει στατιστικά σημαντικά τις τιμές της TAC, σε σχέση με τις άλλες ομάδες Αυτό σημαίνει πως οι πολυφαινόλες που λαμβάνονται από αυτήν την ομάδα, υποβοηθούν στην αύξηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας. Η ομάδα D, παρουσιάζει την δεύτερη υψηλότερη τιμή TAC. Η ομάδα ελέγχου κατά την διάρκεια της πρώτης αιμοληψίας, παρουσιάζει στατιστικά αυξημένες τιμές TBARS, σε σύγκριση με τις άλλες αιμοληψίες, όχι μόνον στην ίδια ομάδα, αλλά και σε σχέση με τις υπόλοιπες. Η ομάδα C παρουσιάζει τις χαμηλότερες τιμές TBARS, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με τις άλλες ομάδες και μειώνει συνεχώς τις τιμές, που ερμηνεύεται πως η παρουσία των πολυφαινολών, δρα αντιοξειδωτικά και έτσι συνεισφέρει στην μείωση της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η ομάδα D παρουσιάζει την δεύτερη χαμηλότερη τιμή TBARS. Τελικά, μελετήθηκε και η οξείδωση των πρωτεϊνών. Η ομάδα ελέγχου παρουσιάζει αυξημένες τιμές, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Η ομάδα C μειώνει συνεχώς την συγκέντρωση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων, το οποίο σημαίνει πως οι πολυφαινόλες που υπάρχουν σ αυτήν την ομάδα υποβοηθούν στην μείωση της οξείδωσης των πρωτεϊνών. Η ομάδα D παρουσιάζει την δεύτερη χαμηλότερη τιμή συγκέντρωσης των καρβονυλίων. Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω, εξάγεται το συμπέρασμα πως τα πολυφαινολικά πρόσθετα, στο σιτηρέσιο των κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής, δρούνε ως αντιοξειδωτικά διότι, για παράδειγμα, η ομάδα C σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, κατά την τρίτη αιμοληψία αυξάνει την τιμή της TAC κατά 15% και παρουσιάζονται στατιστικά σημαντικές μειωμένες συγκεντρώσεις στην οξείδωση των πρωτεϊνών κατά 43%, των λιπιδίων κατά 54%, αλλά και αυξημένη δραστηριότητα της καταλάσης κατά 58%. Τέλος, η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), ως ενδογενές αντιοξειδωτικό, εμφανίζει μία αλλαγή, μετά την πρώτη αιμοληψία. Ενώ, μέχρι εκείνη την χρονική στιγμή η ομάδα ελέγχου παρουσίαζε μικρότερες τιμές, σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες, κατόπιν παρατηρήθηκε ότι η ομάδα ελέγχου, στην δεύτερη και τρίτη

29 αιμοληψία, παρουσίαζε τις μεγαλύτερες τιμές GSH, σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες. Αυτό ερμηνεύεται ως απόκριση του οργανισμού στα εξωγενή αντιοξειδωτικά, που χορηγούντο με το σιτηρέσιο. Έτσι, με αυτόν τον τρόπο, ο οργανισμός καθορίζει την αντιοξειδωτική του άμυνα. Η χρήση των πολυφαινολικών προσθέτων από τα επεξεργασμένα ΥΑΕ και τα υπολείμματα της απόσταξης τριαντάφυλλου, απέδειξαν την αντιοξειδωτική τους δράση, πάνω στα κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής. Ένα άλλο σπουδαίο όμως κεφάλαιο που πρέπει να επισημανθεί, είναι πως οι πολυφαινόλες αποτελούν την κύρια ρυπαντική παράµετρο, η οποία ευθύνεται για τις σηµαντικότατες περιβαλλοντικές επιπτώσεις των ΥΑΕ. Άρα, εάν προκύψουν μέθοδοι απομόνωσής των πολυφαινολών, τότε τα απόβλητα ελαιοτριβείου, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για παράδειγμα στην ενσίρωση για τα οικότροφα ζώα και στην υδρολίπανση. Αντίστοιχα, εφόσον απομονωθούν οι πολυφαινόλες και εκτιμηθούν οι αντιοξειδωτικές ικανότητές τους, θα μπορούσε να προκύψει ένα προϊόν με αυξημένη προστιθέμενη αξία. Το ίδιο ακριβώς ισχύει και για τα υπολείματα απόσταξης του τριαντάφυλλου, που με μελέτες έχει αποδειχθεί η ύπαρξη ισχυρών πολυφαινολών όπως η απιγενίνη και η καμφερόλη. Μετά τα παραπάνω, προτείνεται περαιτέρω έρευνα, σε επίπεδο ιστών, έτσι ώστε να ερευνηθεί και εκεί η αντιοξειδωτική δράση των πολυφαινολικών προσθέτων. Επιπλέον, η έρευνα θα πρέπει να εφαρμοσθεί και σε άλλα ζώα. Οι χοίροι είναι ένα παράδειγμα, λόγω των γενετικών ομοιοτήτων με τους ανθρώπους. (Kararli TT 1995, Vaclavikova R., et.al., 2004). ΙΙ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΤΩΝ ΚΟΤΟΠΟΥΛΩΝ 2.3. Υλικά και Μέθοδοι Λήψη Ιστών - Ομογενοποίηση. Στις 02 Ιαν τα κοτόπουλα και σε ηλικία 52 ημερών, μεταφέρθηκαν από το αγρόκτημα του Τ.Ε.Ι. Θεσσαλίας, στο πτηνοτροφείο Κακανούδη Ανδρέα με έδρα τις Νέες Καρυές Λάρισας. Κατόπιν, οδηγήθηκαν στο συγκρότημα σφαγής. Όλες οι διαδικασίες (αναισθητοποίησης, σφαγής, αφαίμαξης, απομάκρυνσης πούπουλων, εκσπλαχνισμός, διαχωρισμός εντοσθίων και πλύση), πραγματοποιήθηκαν από ειδικά

30 μηχανήματα και καταρτισμένο προσωπικό που ελέγχε στο σύνολο την ορθή διεξαγωγή της διαδικασίας, σύμφωνα με την οδηγία 2007/43/ΕΚ. Τα 105 δείγματα του τετρακέφαλου, του ήπατος και της καρδιάς, αφαιρέθηκαν χειρουργικά, τοποθετήθηκαν σε Eppendorf Tubes 1,5mL, ψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους C μέχρι τη βιοχημική τους ανάλυση. Εικόνες 10 & 11. Πτηνοτροφείο Κακανούδη. Αναισθητοποίηση για λήψη Ιστών. Ο ιστοί ομογενοποιήθηκαν (Μυϊκός 1:2 και Ηπατικός Καρδιακός 1:3) σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS ph 7,4 που περιείχε 138mM NaCL, 2,7mM KCL και 1mM EDTA καθώς και ένα μίγμα αναστολέων πρωτεασών (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets - Roche Diagnostics GmbH), όπως: Απροτινίνη (10mg/mL), η οποία αναστέλει την θρυψίνη και άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα. Λιουπεπτίνη (1mg/mL), η οποία αναστέλλει πεπτιδάσες όπως την κυστεΐνη, την σερίνη και την θρεονίνη. PMSF (9mg/mL), κλπ. Κατά την προετοιμασία για τη βιοχημική ανάλυση του ιστού τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με γουδί και γουδοχέρι χρησιμοποιώντας υγρό άζωτο.

31 Εικόνες 12 & 13. Ομογενοποίηση Ιστών με Υγρό Άζωτο. i. Επεξεργασία Ιστών. Ακολούθως, το ομογενοποίημα υπέστη επεξεργασία με υπερήχους για την απελευθέρωση της μεγαλύτερης δυνατής ποσότητας πρωτεΐνης και φυγοκεντρήθηκε.( g - 5 min - 4 o C) Προσδιορισμός Δεικτών Οξειδωτικού Στρες Γενικά. Για την αξιολόγηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης των ιστών προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης καθώς και η δραστικότητα της καταλάσης. Για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας συχνά προσδορίζεται η

32 ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στους ιστούς. Για την αξιολόγηση του οξειδωτικού στρες, ένας από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της υπεροξείδωσης των λιπιδίων είναι οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ, ενώ για την καταστροφή των πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται τα πρωτεϊνικά καρβονύλια Μέθοδοι. Οι δείκτες οξειδωτικού στρες μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά και η αρχή προσδιορισμού του καθενός αναφέρεται αναλυτικά παρακάτω. Πρωτόκολλα Δεικτών Οξειδωτικού Στρες. Γενικά. Για την αξιολόγηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης των ιστών προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης καθώς και η δραστικότητα της καταλάσης. Για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας συχνά προσδορίζεται η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα των ιστών. Για την αξιολόγηση του οξειδωτικού στρες, ένας από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, είναι οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ, ενώ για την καταστροφή των πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. Α. Μέτρηση Γλουταθειόνης (Μέθοδος για μέτρηση τους σε ιστούς). Η γλουταθειόνη (γ-γλουταμυλοκυστέινογλυκίνη) είναι η πιο άφθονη θειόλη (SH) στους ιστούς των ζώων και του ανθρώπου. Είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη και κυστεΐνη. Οι αναγωγικές (αντιοξειδωτικές) της ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια όπως και στο αντιοξειδωτικό σύστημα των περισσότερων αερόβιων κυττάρων. Η γλουταθειόνη απαντάται κυρίως στην ανηγμένη (GSH) και λιγότερο στην οξειδωμένη της μορφή (δισουλφίδιο της γλουταθειόνης, GSSG). Συνήθως, η GSSG είναι το 10% της GSH.

33 Η GSH χρησιμοποιείται ως δείκτης της αντιοξιδωτικής ικανότητας Pastore et al. (2003). Εικόνα 15. Συντακτικός τύπος της γλουταθειόνης. Η GSH λειτουργεί ως συνένζυμο σε πολλά ένζυμα. Ενδεικτικά αναφέρονται η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης και η θειολτρανσφεράση. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των φαρμάκων και του ασβεστίου καθώς και στη λειτουργία των αιμοπεταλίων και των κυτταρικών μεμβρανών. Είναι επίσης ζωτική η συμμετοχή της στην απομάκρυνση των ξενοβιοτικών ουσιών από τον οργανισμό, στην απομάκρυνση των υπεροξειδίων και των ελεύθερων ριζών αλλά και στη μεταφορά των αμινοξέων διαμέσου των μεμβρανών. Αρχή της μεθόδου. Το πειραματικό πρωτόκολλο βασίζεται στην οξείδωση της GSH από το διθειόδυο νιτροβενζοϊκό οξύ (DTNB) και μετριέται σε αιμόλυμα. Η GSH αντιδρά με το DTNB παράγοντας GSSG και 2-νιτρο-5-θειοβενζοΐκό οξύ σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση, το οποίο είναι έγχρωμο προϊόν που απορροφάει στα 412 nm. Y.N. Reddy, et.al. (2004). 2 GSH + DTNB GSSG + 2-nitro-5- thiobenzoic acid Η GSH παράγεται από την GSSG μέσω της δράσης της αναγωγάσης της γλουταθειόνης.

34 Εικόνα 16. Ανακύκλωση και αρχή προσδιορισμού της γλουταθειόνης. Αντιδραστήρια. Phosphate buffer 67 mm (ph 8). ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να δημιουργήσουμε 500 ml από το phosphate buffer φτιάχνουμε 25 ml KH 2 PO 4 (67 mm) και 500 ml Na 2 HPO 4 (67 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε g και τα διαλύουμε σε 25 ml νερού. Για το Na 2 HPO 4 ζυγίζουμε 5.94 g και τα διαλύουμε σε 475 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως αναμιγνύουμε τα δύο διαλύματα. Διορθώνουμε με NaOH or HCl, 1 N για ph = 8. DTNB (1mM) σε 1% κιτρικό νάτριο (sodium citrate) σε νερό. (39.6 mg DTNB σε 100 ml του 1% διαλύματος του κιτρικού νατρίου, για να δώσει μία συγκέντρωση του 1 mm). DTNB [5,5 -Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)], ΜΒ: Κιτρικό Νάτριο. (C 6 H 5 Na 3 O 7 2H 2 O, διένυδρο τρινάτριο, tri-sodium dihydrate), ΜΒ: Το DTNB διαλύεται σε κιτρικό νάτριο το οποίο εμποδίζει σημαντικές αλλαγές στο ph. Πειραματικό πρωτόκολλο. 100μL ιστού προστέθηκαν σε 100μL TCA 5% και φυγοκεντρήθηκαν στα g για 5 min στους 5 o C. Το υπερκείμενο συλλέχτηκε καιδιατηρήθηκε σε ένα φιαλίδιο eppendorf. 20 μl ιστού, αραιωμένου 1/2 αναμίχθηκαν με 660 μl ρυθμιστικού διαλύματος 67mM (ph 8.0) και 330μL DTNB. Προθέτουμε τις παρακάτω ποσότητες σε φιαλίδια eppendorf:

35 ΠΙΝΑΚΑΣ 5. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της GSH. Blank Sample Phosphate buffer 67 mm, ph μl 660 μl DTNB 1 mm 330 μl 330 μl Απεσταγμένο νερό 20 μl - Ομογενοποιημένος Ιστός - 20 μl Αναδεύουμε τα eppendorfs και τα επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Η διατήρησή τους στο σκοτάδι έχει ως στόχο την πραγματοποίηση της αντίδρασης μεταξύ του DTNB και της GSH. Μεταφέρουμε το περιεχόμενό τους σε μια πλαστική κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 412 nm. (Roland F. Beers, Jr. and Irwin W. Sizer. 1952). Absorption spectrum of 2-Nitro-5-thiobenzoic acid. Technologies). (Dojindo Molecular Υπολογισμοί Δραστικότητα GSH (μmol/mg total prot.) = (Absδείγματος - Δabsτυφλού/13.6) 2 3 ή 4 (λόγω αραιώσεων) 50.5 / Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml). Όπου το 50.5 είναι ο συντελεστής αραίωσης που προκύπτει διαιρώντας τον τελικό όγκο (1010μL) με τον όγκο του αιμολύματος (20μL) (1010/20=50.5), πολλαπλασιάζουμε με 2 και την πρώτη αραίωση που έγινε από το TCA 5% (1:1), πολλαπλασιάζουμε με 3 για τον μυϊκό και με 4 για καρδιακό ηπατικό ιστό, για να

36 συνυπολογίσουμε την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης. To 13.6 είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του DTNB. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης, υπολογίστηκε βάσει της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης, με εξίσωση y=0,0002x + 0,0705 και R 2 = 0,9935, όπου ο άξονας y = Abs στα 595 nm και ο x = Συγκέντρωση (μg/ml). Κατόπιν, με το Bradford test, λαμβάνονταν η τιμή της απορρόφησης και υπολογίζονταν αντίστοιχα η συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης. Β. Δραστηριότητα της Καταλάσης. (Μέθοδος για μέτρηση τους σε ιστούς). Αρχή της μεθόδου. Η καταλάση είναι ένα κοινό ένζυμο, το οποίο απαντάται σε όλους σχεδόν τους ζωντανούς οργανισμούς που έρχονται σε επαφή με το οξυγόνο. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου διαμορφώνεται ως προϊόν μεταβολισμού σε πολλούς οργανισμούς. Είναι τοξικό και πρέπει να μετατραπεί γρήγορα σε άλλο, λιγότερο επικίνδυνη χημική ουσία. Για να διαχειριστεί αυτό το πρόβλημα, η ενζυμική καταλάση καταλύει γρήγορα την αποσύνθεση του υπεροξειδίου υδρογόνου, σε αβλαβή οξυγόνο και νερό. Chelikani P, et. al., (2004). Ένα μόριο καταλάσης μπορεί να μετατρέψει μόρια H 2 O 2 το δευτερόλεπτο σε νερό και οξυγόνο. Βρίσκεται στα υπεροξεισώματα, στα μιτοχόνδρια και το κυτταρόπλασμα. Είναι ένα τεραμερές με 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες μεγέθους τουλάχιστον 500 αμινοξέων. Boon EM, et. al. (2007). Στο τετρεμερές αυτό υπάρχουν 4 πορφυρινικές ομάδες αίμης, οι οποίες επιτρέπουν στην

37 καταλάση να αντιδρά με το H 2 O 2. Το ιδανικό της ph είναι το ουδέτερο. Η αντίδραση διάσπασης του H 2 O 2 από την καταλάση είναι η ακόλουθη: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Η αντίδραση πραγματοποιείται σε 2 στάδια: H 2 O 2 + Fe(III)-E H 2 O + O=Fe(IV)-E H 2 O 2 + O=Fe(IV)-E H 2 O + Fe(III)-E + O 2 (Όπου το σύμπλοκο Fe-E αντιπροσωπεύει το κέντρο με το σίδηρο της ομάδας της αίμης που είναι προσδεδεμένη στο ένζυμο). Εικόνα 17. Μονοπάτι αναγωγής του H 2 O 2 σε H 2 O Επίσης η καταλάση μπορεί να χρησιμοποιήσει το H 2 O 2 για την απομάκρυνση τοξικών ουσιών (Η 2 Α) με τη χρησιμοποίηση υποστρώματος (αιθανόλη), σύμφωνα με την ακόλουθη αντίδραση: CAT H 2 O 2 + H 2 A (substrate) 2 H 2 O + A. Για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της Καταλάσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του Aebi et al., (1984). Αντιδραστήρια. Phosphate buffer 67mM (ph 7.4) ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 και ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να παρασκευάσουμε 500 ml του phosphate buffer ξεκινάμε πρώτα με 100 ml KH 2 PO 4 (67 mm) και 400 ml Na 2 HPO 4 (67 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε 0.91 g και τα διαλύουμε σε 100 ml νερού. Για το Na 2 HPO 4 ζυγίζουμε 4.77 g και τα διαλύουμε σε 400 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως αναμιγνύουμε τα διαλύματα. Αν χρειαστεί προσθέτουμε NaOH ή HCl, 1 N ώστε το ph του παραγόμενου διαλύματος να είναι 7.4.

38 30% υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ). Το διάλυμα H 2 O 2 είναι έτοιμο προς χρήση. Πειραματικό πρωτόκολλο. Προσθέτουμε τους παρακάτω όγκους σε πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες: ΠΙΝΑΚΑΣ 6. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της Καταλάσης. Δείγμα Phosphate buffer 67 mm, ph 7.4 Ομογενοποιημένος Ιστός 2955 μl 40 μl Αναδεύουμε στο vortex και επωάζουμε στον κλίβανο στους 37 o C για 10 λεπτά. Είναι πιο πρακτικό να επωάζουμε 2 δείγματα κάθε φορά ώστε να είμαστε σίγουροι ότι τα δείγματα φωτομετρούνται αμέσως μετά την επώαση. Κατόπιν, μεταφέρουμε το περιεχόμενο του πλαστικού κυλίνδρου σε μία κυψελίδα για μέτρηση στο υπεριώδες (UV). Τέλος, προσθέτουμε 5 μl 30% H 2 O 2 στην κυψελίδα, την ανακινούμε τρεις φορές χρησιμοποιώντας παραφίλμ στην κορυφή της και μετράμε την απορρόφηση στα 240 nm για 130 δευτερόλεπτα. Υπολογισμοί Δραστικότητα της καταλάσης (U/mg Hb) = (ΔΑbs sample per min / 40) x(75 x 1000 x 3 ή 4 x 2) / Conc. Protein (mg/ml). Όπου, το 40 (mol/l) είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του H 2 O 2 πολλαπλασιαζόμενος με 1000 για τη μετατροπή του σε μmol/ml. Το 75 είναι ο παράγοντας αραίωσης που προκύπτει από τη διαίρεση του τελικού όγκου του κυλίνδρου (3000μL) με τον όγκο του δείγματος (40μL) (3000/40=75). Πολλαπλασιάζουμε με 3 για τον μυϊκό και με 4 για καρδιακό ηπατικό ιστό, για να συνυπολογίσουμε την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης.

39 Ο υπολογισμός της δραστικότητας της καταλάσης εκφράζεται ως προς την συγκέντρωση της της ολικής πρωτεΐνης. Δ Αbs = η μεταβολή της απορρόφησης σε ένα λεπτό. Η συγκέντρωση του H 2 O 2 στην κυψελίδα είναι περίπου16 mm. U = μmol/min. ΔAbs blank είναι πάντοτε μηδέν και έτσι δεν απαιτείται μέτρηση του τυφλού. Γ. Ολική Aντιοξειδωτική ικανότητα (Total Antioxidant Capacity, TAC). (Μέθοδος για μέτρηση τους σε ιστούς). Ο όρος ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) αναφέρεται στην ικανότητα των συστατικών των ιστών να εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες. Κάθε συστατικό έχει αντιοξειδωτική δράση. Ωστόσο, κάθε ένα συνεισφέρει με διαφορετικό τρόπο στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος, η οποία είναι γενικά ένα μέτρο της αντιοξειδωτικής κατάστασης ολόκληρου του οργανισμού. Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τρόποι προσέγγισης της ποσοτικοποίησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Ο πρώτος είναι το άθροισμα της αντιοξειδωτικής ικανότητας του κάθε συστατικού ξεχωριστά. Αυτός είναι ο πιο επίπονος τρόπος επειδή υπάρχουν πολλά μόρια που συνεισφέρουν στην αντιοξειδωτική ικανότητα. Ο δεύτερος τρόπος είναι η μέτρηση της TAC ως σύνολο. Αρχή της μεθόδου. Η TAC των ιστών στη συγκεκριμένη μέθοδο υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Παρουσία ενός δότη υδρογόνων που υπάρχει στον ορό, η παραπάνω ρίζα (DPPH ) ανάγεται προς σχηματισμό της αντίστοιχης υδραζίνης (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine). Ο προσδιορισμός της TAC βασίστηκε στη μέθοδο των Janaszweska και Bartosz, (2002). Η μετατροπή της ρίζας υπολογίζεται με φωτομέτρηση στα 520 nm. Αντιδραστήρια. Phosphate buffer 10 mm (ph 7.4). ΜΒ (KH 2 PO 4 ): 136 και ΜΒ (Na 2 HPO 4 ): 178. Για να φτιάξουμε 500 ml του phosphate buffer φτιάχνουμε 100 ml KH 2 PO 4 (10 mm) και 400 ml Na 2 HPO 4 (10 mm). Για το KH 2 PO 4 ζυγίζουμε g και τα

40 διαλύουμε σε 100 ml νερό. Για το Na 2 HPO 4 ζυγίζουμε g και τα διαλύουμε σε 400 ml νερό. Σε ένα ποτήρι ζέσεως χύνουμε τα διαλύματα και προσθέτουμε NaOH ή HCl, 1 N μέχρι το ph να φτάσει την τιμή 7.4. DPPH 0.1 mm. ΜΒ: Διαλύουμε 0.02 g DPPH σε 5 ml μεθανόλης και τα αναμιγνύουμε με μαγνητάκι (10 mm). Μετά αραιώνουμε 100 φορές με μεθανόλη και τα αναμιγνύουμε ξανά με μαγνητάκι. Για παράδειγμα, αραιώνουμε 200 μl του 10 mm διαλύματος του DPPH σε 19.8 ml μεθανόλης (ποσό αρκετό για 10 δείγματα, συν το τυφλό και τον θετικό έλεγχο). Εξαιτίας της αραίωσης, ο αρχικός όγκος των 5 ml είναι πάντα αρκετός για πολλούς προσδιορισμούς. Καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο το ποτήρι ζέσεως, στο οποίο φτιάχνουμε το DPPH για να αποφύγουμε τη φωτόλυση. Το συγκεκριμένο διάλυμα φτιάχνεται τη μέρα του πειράματος. Ασκορβικό οξύ 10 mm. Είναι έτοιμο προς χρήση. Φυσιολογικά, η τιμή της απορρόφησης για το δείγμα που περιέχει το ασκορβικό οξύ (Positive Control) θα πρέπει να είναι χαμηλότερη και από την τιμή των δειγμάτων αλλά και του τυφλού. Ο λόγος είναι η συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος (ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό μόριο) που έχουμε επιλέξει. Η τιμή της απορρόφησης των δειγμάτων, θα πρέπει να βρίσκεται ανάμεσα στις τιμές του τυφλού (η μεγαλύτερη τιμή) και του θετικού ελέγχου (η μικρότερη τιμή). Πειραματικό πρωτόκολλο. Προσθέτουμε τις ακόλουθες ποσότητες στα Εppendorfs: ΠΙΝΑΚΑΣ 7. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, για την μέτρηση της TAC. Blank Θετικός control Δείγμα Phosphate buffer 10 mm, ph μl 495 μl 460 μl DPPH 0.1 mm 500 μl 500 μl 500 μl Ασκορβικό Οξύ 10 mm - 5 μl - Ιστός (Αραίωση 1/5) μl

41 Ανακινούμε τα Eppendorfs μερικές φορές και τα επωάζουμε στο σκοτάδι για 60 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της επώασης η αντιοξειδωτικές ουσίες του ιστού, εξουδετερώνουν τη ρίζα DPPH μετατρέποντάς τη στην πιο σταθερή ένωση υδραζίνη. Φυγοκεντρούμε για 3 λεπτά στα g στους 25 o C (για την καταβύθιση σωματιδίων που θα αυξήσουν την απορρόφηση). Μεταφέρουμε 900 ml από το υπερκείμενο με πιπέτα σε πλαστική κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 520 nm. Επειδή είναι πιθανό η απορρόφηση του τυφλού να αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου, είναι σκόπιμη η επανάληψη της μέτρησης του τυφλού κάθε 5 περίπου δείγματα. Υπολογισμοί. Τα αποτελέσματα μπορούν να εκφραστούν ως: i) % μείωση της απορρόφησης (Abs) σε σχέση με το τυφλό, πχ, % Abs μείωση = (Abs τυφλού Abs δείγματος) / Abs τυφλού x 100 ii) μmol DPPH που απομακρύνθηκαν / ml πλάσματος = [(% Abs μείωση / 100) x 50 x 25 x 3 ή 4 x 5] / α) Διαιρούμε με το 100 με σκοπό να μετατρέψουμε την ποσοστιαία μείωση της απορρόφησης σε απλή μείωση της απορρόφησης. β) Πολλαπλασιάζουμε με το 50 διότι η συγκέντρωση του DPPH στην κυψελίδα είναι 50 μmol/l της κυψελίδας. γ) Πολλαπλασιάζουμε με το 25 διότι η αραίωση του ιστού στην κυψελίδα είναι 25 πλάσια (1000 μl στην κυψελίδα / 40 μl ιστού του δείγματος στην κυψελίδα = 25). δ) Πολλαπλασιάζουμε με 3 για τον μυϊκό και με 4 για καρδιακό ηπατικό ιστό, για να συνυπολογίσουμε την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης και με 5 επειδή το δείγμα αραιώνεται 1/5 κατά τη μέτρηση. ε) Διαιρούμε με το 1000 για να μετατρέψουμε τα L σε ml. Η διόρθωση με βάση την ολική πρωτεΐνη έγινε σύμφωνα με τον ακόλουθο τρόπο: mmol DPPH / mg total prot. Δ. Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS). (Μέθοδος για μέτρηση τους σε ιστούς). Αρχή της μεθόδου.

42 Το οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό άκρως ενεργών και ασταθών υπεροξειδίων των λιπιδίων από τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Προϊόν της διάσπασης αυτών των ασταθών μορίων είναι η μαλονδιαλδεΰδη. Η μαλονδιαλδεΰδη μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της αντίδρασής της με το θειοβαρβιτουρικό οξύ. Έτσι, τα TBARS εκφράζονται σαν ισοδύναμα της μαλονδιαλδεΰδης, η οποία σχηματίζει μία ένωση με το θειοβαρβιτουρικό οξύ με αναλογία μαλονδιαλδεΰδης προς θειοβαρβιτουρικό οξύ 1/2. Η μέτρηση της μαλονδιαλδεΰδης είναι μία φωτομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό του βαθμού υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Εικόνα 18. Αντίδραση TBA (1) με MDA (2), που οδηγεί στην παραγωγή του μορίου TBA-MDA. Για τον προσδιορισμό των TBARS χρησιμοποιήθηκε μια ελαφρά τροποποιημένη μέθοδος του Keles et al., (2001). Πριν ξεκινήσει η πειραματική διαδικασία ρυθμίζουμε το υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 o C. Αντιδραστήρια. Tris-HCl 200 mm (ph 7.4). ΜΒ (Tris): ΜΒ (HCl): (stock 37%) [10.1 N]. Για να παρασκευάσουμε 100 ml του Tris-HCl buffer φτιάχνουμε 25 ml Tris (200 mm) και 42 ml HCl (0.1 N). Για το Tris ζυγίζουμε 0.61 g και τα διαλύουμε σε 25 ml νερού. Για το HCl διαλύουμε 0.42 ml του stock 37% HCl (10.1 N) σε 42 ml νερού. Σε ένα ποτήρι ζέσεως ρίχνουμε τα 25 ml από το Tris και προσθέτουμε αργά τα 42 ml του HCl και μετά προσθέτουμε νερό ως τα 100 ml. Ελέγχουμε το ph αν είναι στο 7.4.

43 Το Tris είναι συντομογραφία του τρισυδροξυμεθυλαμινομεθάνιου (trishydroxymethylaminomethane). Το Tris είναι κατάλληλο για τη δημιουργία ρυθμιστικών διαλυμάτων με ph από 6,5 μέχρι 9,7. Διάλυμα Na 2 SO 4 (2 M) TBA (55 mm). ΜΒ (TBA): και ΜΒ (Na 2 SO 4 ): Για την παρασκευή10 ml διαλύματος, ζυγίζουμε 2.84 g Na 2 SO 4 και 0.08 g θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA). Τα μεταφέρουμε σε ένα ποτήρι ζέσεως και προσθέτουμε 10 ml νερού. Θερμαίνουμε και ανακατεύουμε με το μαγνητάκι μέχρι να διαλυθούν τα συστατικά πλήρως. Το συγκεκριμένο διάλυμα πρέπει να φτιάχνεται πάντοτε την ημέρα του πειράματος. TCA 35%: Ζυγίζουμε 35 g TCA και τα διαλύουμε σε απεσταγμένο νερό ώστε ο τελικός όγκος να φτάσει τα 100 ml νερού (σε θερμοκρασία δωματίου). TCA 70%: Ζυγίζουμε 70 g TCA και τα διαλύουμε σε απεσταγμένο ώστε ο τελικός όγκος να φτάσει τα 100 ml νερού (σε θερμοκρασία δωματίου). Πειραματικό Πρωτόκολλο. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες Falcon (15 ml) προσθέτουμε 100 μl ομογενοποιημένου ιστού (για τα δείγματα) ή απεσταγμένο νερό (για το τυφλό). Προσθέτουμε 500 μl TCA 35% και 500 μl Tris-HCl και αναδεύουμε. Επωάζουμε για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθέτουμε 1 ml Na 2 SO 4 TBA και επωάζουμε στους 95 o C για 45 min στο υδατόλουτρο. Κατόπιν, μεταφέρουμε τους Falcon στον πάγο και τους αφήνουμε να κρυώσουν για 5 min. Προσθέτουμε 1 ml TCA 70% και αναδεύουμε. Μεταφέρουμε 1 ml σε eppendorfs και φυγοκεντρούμε στα g (10000 rpm) στους 25 o C για 3 min. Τέλος, μεταφέρουμε με πιπέτα 900 μl από το υπερκείμενο σε κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 530 nm. Υπολογισμοί. Η συγκέντρωση των TBARS (nmol/mg total protein) = (Abs δείγματος Abs τυφλού) / x 31 x 2 ή 3 x 3, όπου το 31 είναι ο συντελεστής αραίωσης, που προέρχεται από τη διαίρεση του τελικού όγκου (3100 μl) με τον όγκο του ομογενοποιημένου ιστού (100 μl) (3100 / 100 = 31). Το προέρχεται από το συντελεστή μοριακής απόσβεσης της MDA που είναι 156 (mol/l) διαιρούμενου με 10-6 με σκοπό να μετατραπούν τα mol/l σε μmol/l. Πολλαπλασιάζουμε με 3 για τον

44 μυϊκό και με 4 για καρδιακό ηπατικό ιστό, για να συνυπολογίσουμε την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης και με 3 επειδή το δείγμα αραιώνεται 3 φορές κατά τη μέτρηση. Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης μιας ουσίας ισούται με την απορρόφηση της ουσίας αυτής σε συγκέντρωση 1 mol/l. Ε. Πρωτεϊνικά καρβονύλια (Μέθοδος για μέτρηση τους σε ιστούς). Αρχή της μεθόδου. Οι πρωτεΐνες και τα αμινοξέα είναι ευαίσθητα σε βλάβες προκαλούμενες από τις ελεύθερες ρίζες. Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια είναι ένας δείκτης της οξείδωσης ων πρωτεϊνών και χρησιμοποιείται ευρέως. Οι καρβονυλικές ομάδες (αλδεΰδες και κετόνες) που αποτελούνται από ένα άτομο άνθρακα σε διπλό δεσμό με ένα άτομο οξυγόνου C = O, ως συνήθως αποτελούν μέρος σε άλλες μεγαλύτερες λειτουργικές ομάδες. Παράγονται κυρίως στις προσθετικές ομάδες της προλίνης (pro), της αργινίνης (arg), της λυσίνης (lys) και της θρεονίνης (thr). Είναι ένας αξιόπιστος δείκτης οξείδωσης των πρωτεϊνών καθώς τα καρβονύλια είναι σταθερά μόρια. Οι πρωτεΐνες που καρβονυλιώνοται υφίστανται μη αναστρέψιμες βλάβες καθώς εκτρέπονται από τη φυσιολογική τους λειτουργία. Οι καρβονυλιωμένες πρωτείνες σε μέτριο βαθμό, διασπώνται από το πρωτεόσωμα αλλά αν υποστούν πολύ δριμείες βλάβες τότε δεν μπορούν να διασπαστούν και συγκεντρώνονται σε συσσωματώματα υψηλού μοριακού βάρους. Η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών όχι μόνο επηρεάζει τη δική τους λειτουργία αλλά και τον τρόπο με τον οποίο λειτουργούν και άλλα βιομόρια. Για παράδειγμα, αν υποστούν καρβονυλίωση ένζυμα όπως εκείνα που επισκευάζουν το DNA ή οι DNA πολυμεράσες, το DNA δε θα επιδιορθώνεται ούτε θα αντιγράφεται με την απαραίτητη πιστότητα. Ο σχηματισμός των καρβονυλίων συνήθως ανιχνεύεται με την αντίδρασή τους με το DNPH (2,4-δίνιτριφαινυλυδραζίνη) προς σχηματισμό του 2,4- δίνιτροφαινυλυδραζονίου. Ο προσδιορισμός των καρβονυλίων βασίστηκε στη μέθοδο Patsoukis et. al., (2004).

45 Εικόνα 19. Σύνδεση πρωτεΐνης με την DNPH (δίνιτριφαινυλυδραζίνη) και σχηματισμός του δίνιτροφαινυλυδραζονίου. Αντιδραστήρια Διάλυμα HCl 2.5 N. HCl: ΜΒ 36.46; stock 37% (10.1 N) Για να παρασκευάσουμε 100 ml διαλύματος 2.5 N HCl, προσθέτουμε αργά 24.6 ml του 37% HCl (ίσο με 10.1 N HCl) σε 70 ml απεσταγμένου νερού και το φέρνουμε σε τελικό όγκο 100 ml με απεσταγμένο νερό. Κατά την παρασκευή του διαλύματος του 2,5 N HCl χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή επειδή το διάλυμα του 37 % είναι πολύ καυστικό. Πάντα η παρασκευή γίνεται κάτω από τον απαγωγό και φορώντας γάντια. DNPH 14 mm. (ΜΒ: 198.1) Για να φτιάξουμε 100 ml 14 mm DNPH διαλύουμε g DNPH σε 100 ml 2.5 N HCl. Το διάλυμα αυτό φτιάχνεται πάντα τη μέρα του πειράματος. Όταν το ετοιμάσουμε το καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο γιατί είναι φωτοευαίσθητο. Απαιτούνται 0.5 ml για κάθε δείγμα. Φτιάχνουμε και ένα τυφλό για κάθε δείγμα. Ουρία 5 M (ph 2.3). (ΜΒ: 60.06) Για να φτιάξουμε 100 ml 5 M ουρίας (ph 2.3, το οποίο ρυθμίζεται με 2N HCl), διαλύουμε 30 g ουρίας in 70 ml απεσταγμένου νερού και το φέρνουμε σε τελικό όγκο 100 ml με απεσταγμένο νερό. Πειραματικό πρωτόκολλο. Σε 50 μl ομογενοποιημένου ιστού προσθέτουμε 50 μl 20% TCA σε eppendorfs και αναδεύουμε στο vortex (κάθε δείγμα έχει το τυφλό του). Το 20% TCA προστίθεται με σκοπό να κατακρημνιστούν οι πρωτεΐνες του πλάσματος. Το TCA

46 (τριχλωροοξικό οξύ) χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοχημεία για την κατακρήμνιση μακρομορίων όπως πρωτεΐνες, DNA και RNA. Επωάζουμε στον πάγο για 15 λεπτά και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Κατόπιν, προσθέτουμε στο ίζημα (πελέτα) 0.5 ml του 14 mm DNPH (διαλυμένο σε 2.5 N HCL) για τα δείγματα ή 0.5 ml 2.5 N HCL για τα τυφλά (κάθε δείγμα έχει το δικό του τυφλό), διαλύουμε με την πιπέτα το ίζημα, αναδεύουμε και επωάζουμε στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ενδιάμεση ανάδευση στο vortex κάθε 15 λεπτά. Μετά την πάροδο της μίας ώρας, φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml από το 10% TCA, αναδεύουμε (διαλύουμε με την πιπέτα το ίζημα αν χρειάζεται) και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 0.5 ml αιθανόλης και 0.5 ml οξικού ειθυλεστέρα (αναλογία μίγματος, 1:1 v/v), κάνουμε vortex και φυγοκεντρούμε στα g για 5 λεπτά στους 4 o C. Το ίζημα πλένεται με 10% TCA και με μίγμα αιθανόλης και οξικού αιθυλεστέρα για να απομακρυνθεί το DNPH που δεν έχει αντιδράσει. Αυτήν την διαδικασία την επαναλαμβάνουμε άλλες δύο (2) φορές και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Προσθέτουμε 1 ml 5 M ουρία (ph 2.3), αναδεύουμε και επωάζουμε στους 37 o C για 15 λεπτά. Η ουρία προκαλεί μετουσίωση των πρωτεϊνών (διασπώντας τους ομοιoπολικούς δεσμούς) αυξάνοντας έτσι τη διαλυτότητά τους. Φυγοκεντρούμε στα g για 3 λεπτά στους 4 o C. Τέλος, μεταφέρουμε με την πιπέτα 900 ml σε μία κυψελίδα και μετράμε την απορόφηση στα 375 nm. (Το τυφλό περιέχει τα πάντα εκτός από τα 0.5 ml DNPH, τα οποία αντικαθίστανται 0.5 ml HCL 2.5 N). Υπολογισμοί. Συγκέντρωση πρωτεϊνικών καρβονυλίων (nmol/mg total prot.)= Aδείγματος- Ατυφλού/ /50 x 2 ή 3 x 2/Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml). Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του DNPH είναι 22 mm x cm -1. Το 1000/50 είναι ο συντελεστής αραίωσης (1000 μl στην κυψελίδα /50 μl δείγματος). Πολλαπλασιάζουμε με 3 για τον μυϊκό και με 4 για καρδιακό ηπατικό ιστό, για να συνυπολογίσουμε την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης και

47 με 2 επειδή το δείγμα αραιώνεται 2 φορές κατά τη μέτρηση, διότι προσθέτουμε TCA 20% αρχικά) Αποτελέσματα βιοδραστικών μετρήσεων σε ιστούς των κοτόπουλων. ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control). ΤΕΤΡΑΚΕΦΑΛΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 8,2 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 17,2% Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 19,4% KAΡΔΙΑΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 26,2 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 43,8 % Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 31,5% ΗΠΑΤΙΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 13 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 38,1% Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 31,6%

48 ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control). ΤΕΤΡΑΚΕΦΑΛΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 38,5% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 44,3% Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 26,7% KAΡΔΙΑΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 9,3% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 33,9% Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 4% ΗΠΑΤΙΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 17,9% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 23 % Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ 9,2%

49 ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control). ΤΕΤΡΑΚΕΦΑΛΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 10,5% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 18,1% Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 6,4% KAΡΔΙΑΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 7,6% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 19,2% Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 9,1% ΗΠΑΤΙΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 3,4% Η C ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 14,8 % Η D ΟΜΑΔΑ ΑΥΞΑΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 3,8%

50 ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control). ΤΕΤΡΑΚΕΦΑΛΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 13,6% Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 50,7% Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 23,8% KAΡΔΙΑΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 11,8% Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 33,5% Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 7,8% ΗΠΑΤΙΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 12,5% Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 21,4 % Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 16%

51 ( p < 0,05 σε σύγκριση με το Control). ΤΕΤΡΑΚΕΦΑΛΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 16,6 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 52,7 % Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 14,6 % KAΡΔΙΑΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 26,8 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 55,4 % Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 30,9 % ΗΠΑΤΙΚΟΣ (ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ): Η Β ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 37,1 % Η C ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 58,6 % Η D ΟΜΑΔΑ ΜΕΙΩΝΕΙ ΤΗΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΤΑ 38,2 %

52 Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εκτραφούν τέσσερεις (4) ομάδες κοτόπουλων πάχυνσης με πολυφαινολικά πρόσθετα και να ελεγχθούν οι δείκτες του οξειδωτικού στρες, στους ιστούς των (τετρακέφαλος καρδιακός ηπατικός), έτσι ώστε με την ανάλυση των αποτελεσμάτων να καταδειχθεί η συμπεριφορά των δεικτών και να επισημανθούν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων. Με την ανάλυση των αποτελεσμάτων, εντοπίστηκε η συμπεριφορά των δεικτών μεταξύ των ομάδων. Οι δείκτες του οξειδωτικού στρες που ελέγχθηκαν ήταν: Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η δραστηριότητα της καταλάσης (Catalase activity), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC Total antioxidant capacity), οι ουσίες που αντιδρουν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS Thiobarbituric acid reactive substances) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. Το σπουδαιότερο σε αυτήν την εργασία είναι πως τα πολυφαινολικά πρόσθετα διαφοροποιούν τους δείκτες μεταξύ των ομάδων. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στις παρακάτω παρατηρήσεις και συμπεράσματα: Συγκεκριμένα, όσον αφορά στην συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), διαπιστώνεται πως η ομάδα ελέγχου παρουσιάζει αυξημένες τιμές, στατιστικά σημαντικές, σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες. Την μεγαλύτερη συγκέντρωση την παρουσιάζει ο καρδιακός ιστός της ομάδας ελέγχου (0,237 μmol/mg Tot. Prot.) και την μικρότερη η ομάδα C, κατά 43,8%, που ελάμβανε το πλήρως εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες εκχύλισμα από ΥΑΕ. Το ίδιο παρατηρείται και στον ηπατικό ιστό με μείωση συγκέντωσης κατά 38,1% στην ομάδα C. Τέλος, στον τετρακέφαλο παρατηρείται η μικρότερη μείωση στην συγκέντρωση της GSH, στην ομάδα C κατά 17,2%, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Έτσι οι ομάδες Β,C και D παρουσιάζουν μικρότερες τιμές, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Το ίδιο παρατηρήθηκε και στην τρίτη αιμοληψία που εκτελέστηκε τρεις (3) ημέρες πριν την λήψη των ιστών, σε αντίθεση με την πρώτη αιμοληψία που εκτελέστηκε είκοσι τρεις (23) ημέρες νωρίτερα και οι ομάδες με τα πολυφαινολικά πρόσθετα, παρουσίασαν αυξημένες τιμές στην συγκέντρωση της GSH. Συγκεκριμένα η ομάδα C, είχε αυξημένες τιμές γλουταθειόνης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου περίπου στο τετραπλάσιο (από 1,1 σε 4 μmol/gr αιμοσφαιρίνης), που σημαίνει πως τα νεαρά κοτόπουλα με την χορήγηση πολυφαινολικών προσθέτων, αυξάνουν τα επίπεδα της γλουταθειόνης. Αυτό ερμηνεύεται ως απόκριση του οργανισμού στα εξωγενή αντιοξειδωτικά τα οποία

53 παρέχονται. Έτσι, με αυτόν τον τρόπο, ο οργανισμός καθορίζει την αντιοξειδωτική του άμυνα. Όσον αφορά στην στην καταλάση, οι πολυφαινολικές ομάδες παρουσιάζουν αύξηση δραστηριότητας του ενζύμου, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Η μεγαλύτερη τιμή στην δραστηριότητα της καταλάσης (330 Units/mg Prot.), παρουσιάζεται στην ομάδα C στον ηπατικό ιστό, με μία αύξηση 23 %, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Την μεγαλύτερη εκατοστιαία αύξηση παρουσιάζει ο τετρακέφαλος της ομάδας C κατά 44,3% και ακολουθεί ο καρδιακός κατά 33,9%, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Αυτό σημαίνει πως όλες οι πολυφαινολικές ομάδες και ιδιαίτερα η ομάδα C, υποβοηθούν στην δραστηριότητα του ενζύμου, με αποτέλεσμα την αύξηση της διάσπασης του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο. Οι τιμές των δεικτών του οξειδωτικού στρες της TAC στους ιστούς, παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον και ερμηνεύονται ως ακολούθως: Στατιστικά σημαντικά αυξημένες τιμές, και στους τρεις (3) ιστούς, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, παρουσίασε η ομάδα C, με αύξηση κατά 19,2% στον καρδιακό, κατά 18,1% στον τετρακέφαλο και τέλος κατά 14,8% στον ηπατικό ιστό. Οι ομάδες Β και D, δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά στον ηπατικό ιστό. Παρουσίασαν όμως στατιστικά αυξημένες τιμές TAC στον καρδιακό κατά 7,6% και 9,1% και στον τετρακέφαλο κατά 10,5% και 6,4% αντίστοιχα. Η ομάδα C παρουσιάζει τις χαμηλότερες τιμές TBARS, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με τις άλλες ομάδες και ερμηνεύεται πως η παρουσία των πολυφαινολών, δρα αντιοξειδωτικά και έτσι συνεισφέρει στην μείωση της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η ομάδα D παρουσιάζει την δεύτερη χαμηλότερη τιμή TBARS. Τελικά, μελετήθηκε και η οξείδωση των πρωτεϊνών. Η ομάδα ελέγχου παρουσιάζει αυξημένες τιμές, στατιστικά σημαντικές σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Η ομάδα C παρουσιάζει την μικρότερη συγκέντρωση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων, που σημαίνει πως οι πολυφαινόλες που υπάρχουν σ αυτήν την ομάδα υποβοηθούν στην μείωση της οξείδωσης των πρωτεϊνών. Η ομάδα D παρουσιάζει την δεύτερη χαμηλότερη τιμή συγκέντρωσης των καρβονυλίων. Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω, εξάγεται το συμπέρασμα πως τα πολυφαινολικά πρόσθετα, στο σιτηρέσιο των κοτόπουλων κρεατο-παραγωγής, δρούνε ως αντιοξειδωτικά διότι, για παράδειγμα, η ομάδα C σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, σε όλους τους ιστούς που ελέγχθησαν, αυξάνει την τιμή της TAC από 14,8% έως 19,2%.

54 Παρουσιάζει στατιστικά σημαντικές μειωμένες συγκεντρώσεις στην οξείδωση των πρωτεϊνών μέχρι και 58,6% στον ηπατικό ιστό, στην οξείδωση των λιπιδίων κατά 50,7% στον τετρακέφαλο, αλλά και αυξημένη δραστηριότητα της καταλάσης κατά 23% στον ηπατικό ιστό. Τέλος, η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), ως ενδογενές αντιοξειδωτικό, εμφανίζει, τις μεγαλύτερες τιμές της στην ομάδα ελέγχου, σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες. Αυτό ερμηνεύεται ως απόκριση του οργανισμού στα εξωγενή αντιοξειδωτικά, που χορηγούντο με το σιτηρέσιο. Έτσι, με αυτόν τον τρόπο, ο οργανισμός καθορίζει την αντιοξειδωτική του άμυνα. Η χρήση των πολυφαινολικών προσθέτων από τα επεξεργασμένα ΥΑΕ και τα υπολείμματα της απόσταξης τριαντάφυλλου, απέδειξαν την αντιοξειδωτική τους δράση, πάνω στα κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής. Ένα άλλο σπουδαίο όμως κεφάλαιο που πρέπει να επισημανθεί, είναι πως οι πολυφαινόλες αποτελούν την κύρια ρυπαντική παράµετρο, η οποία ευθύνεται για τις σηµαντικότατες περιβαλλοντικές επιπτώσεις των ΥΑΕ. Άρα, εάν προκύψουν μεθόδοι απομόνωσής των πολυφαινολών, τότε τα απόβλητα ελαιοτριβείου, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για παράδειγμα στην ενσίρωση για τα οικότροφα ζώα και στην υδρολίπανση. Αντίστοιχα, εφόσον απομονωθούν οι πολυφαινόλες και εκτιμηθούν οι αντιοξειδωτικές ικανότητές τους, θα μπορούσε να προκύψει ένα προϊόν με αυξημένη προστιθέμενη αξία. Το ίδιο ακριβώς ισχύει και για τα υπολείματα απόσταξης του τριαντάφυλλου, που με μελέτες έχει αποδειχθεί η ύπαρξη ισχυρών πολυφαινολών όπως η καμφερόλη και η απιγενίνη. Μετά τα παραπάνω, προτείνεται περαιτέρω έρευνα και σε άλλα ζώα. Οι χοίροι είναι ένα παράδειγμα, λόγω των γενετικών ομοιοτήτων με τους ανθρώπους. (Kararli TT1995,VaclavikovaR.,et.al.,2004)..

55 ΤΥΠΟΣ ΤΡΟΦΗΣ 16/12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/2012 ΖΩΝ ΒΑΡΟΣ 2/1/2013 ΣΦΑΓΗ Απόδωση σε κρέας % ΤΥΠΟΣ ΤΡΟΦΗΣ 23/11/ /11/ /11/ /11/2012 1/12/2012 2/12/2012 3/12/2012 4/12/2012 5/12/2012 6/12/2012 7/12/2012 8/12/2012 9/12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ /12/ Κατανάλωση τροφής και ρυθμός πάχυνσης κοτόπουλων (Ποσοτικές μετρήσεις) Στον ΠΙΝΑΚΑ 8 που ακολουθεί παρουσιάζονται τόσο ο ρυθμός αύξησης του μέσου βάρους των κοτόπουλων που διατρέφονται με σιτηρέσια με τους τέσσερεις διαφορετικούς τύπους ενσιρωμάτων Α, Β, Γ και Δ όσο και το τελικό μέσο βάρος τους μετά την σφαγή και η απόδοση τους σε καθαρό κρέας ΗΜΕΡΑ ΤΡΙ ΤΕΤ ΠΕΜ ΠΑΡ ΣΑΒ ΚΥΡ ΔΕΥ ΤΡΙ ΤΕΤ ΠΕΜ ΠΑΡ ΣΑΒ ΚΥΡ ΔΕΥ ΤΡΙ ΤΕΤ ΠΕΜ ΠΑΡ ΣΑΒ Α 0,143 0,309 0,345 0,380 0,442 0,461 0,521 0,554 0,598 0,682 0,634 0,691 0,720 0,781 0,833 0,886 0,959 Β 0,147 0,250 0,272 0,332 0,402 0,416 0,472 0,481 0,531 0,626 0,623 0,627 0,663 0,730 0,779 0,816 0,878 Γ 0,143 0,298 0,331 0,377 0,457 0,468 0,535 0,509 0,583 0,676 0,684 0,676 0,695 0,803 0,831 0,870 0,983 Δ 0,149 0,320 0,354 0,367 0,441 0,425 0,467 0,473 0,508 0,553 0,597 0,562 0,558 0,675 0,668 0,696 0,811 ΗΜΕΡΑ ΚΥΡ ΔΕΥ ΤΡΙ ΤΕΤ ΠΕΜ ΠΑΡ ΣΑΒ ΚΥΡ ΔΕΥ ΤΡΙ ΤΕΤ ΠΕΜ ΠΑΡ ΣΑΒ ΚΥΡ ΔΕΥ ΔΕΥ ΤΕΤ Α 1,051 1,022 1,124 1,216 1,309 1,368 1,449 1,545 1,642 1,708 1,807 1,912 1,975 2,050 2,138 2, ,9 1764,5 77,9 Β 0,921 0,995 1,057 1,137 1,137 1,194 1,261 1,323 1,402 1,474 1,553 1,643 1,712 1,790 1,853 1, ,1 1505,0 75,7 Γ 1,061 1,098 1,159 1,216 1,234 1,369 1,445 1,535 1,600 1,695 1,790 1,885 1,964 2,035 2,227 2, ,3 1852,9 79,7 Δ 0,892 0,933 0,974 1,038 1,053 1,108 1,215 1,307 1,306 1,379 1,476 1,527 1,640 1,701 1,788 1, ,5 1437,5 75,7

56 Από τα δεδομένα του ΠΙΝΑΚΑ 8 συμπεραίνεται ότι το μεγαλύτερο μέσο ζων βάρος και καθαρό βάρος όσο και την μεγαλύτερη απόδοση σε καθαρό βάρος παρουσίασαν τα κοτόπουλα που διατράφηκαν με σιτηρέσιο που παρασκευάστηκε με χρήση ενσιρώματος τύπου Γ. Αμέσως μετά το Γ κατατάσσεται το Α και στην συνέχεια το Β και τελευταίο το Δ. Αντίστοιχα, στον ΠΙΝΑΚΑ 9 που ακολουθεί : ΜΕΣΗ ΗΜΕΡΗΣΙΑ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΤΡΟΦΗΣ ΣΕ ΓΡΑΜΜΑΡΙΑ ΑΝΑ ΚΟΤΟΠΟΥΛΟ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ Α Β Γ Δ 27/11/ ,18 44,97 62,36 86,78 28/11/ ,74 47,78 66,86 98,66 29/11/ ,57 35,86 64,96 95,58 30/11/ ,55 46,87 82,00 103,08 1/12/ ,33 76,33 86,14 124,92 2/12/ ,11 81,69 92,33 139,20 3/12/ ,97 72,13 84,22 125,00 4/12/ ,50 76,00 87,58 127,50 5/12/ ,83 67,00 57,92 105,00 6/12/ ,58 83,50 87,50 116,25 7/12/ ,70 82,90 118,09 137,33 8/12/ ,88 116,72 116,07 140,70 9/12/ ,30 101,83 106,95 73,20 10/12/ ,92 181,67 108,18 96,25 11/12/ ,75 118,33 115,45 119,58 12/12/ ,00 107,51 132,34 209,09 13/12/ ,15 141,74 154,82 175,86 14/12/ ,50 141,11 167,27 216,36 15/12/ ,33 150,00 140,91 180,00 16/12/ ,67 127,78 171,82 186,36 17/12/ ,50 162,22 89,09 160,91 18/12/ ,00 122,22 125,56 157,27 19/12/ ,73 148,89 156,67 150,00 20/12/ ,09 138,89 138,89 153,00 21/12/ ,27 185,56 177,78 232,00 22/12/ ,45 152,22 158,89 202,00 23/12/ ,73 160,00 170,00 230,00 24/12/ ,91 162,22 162,22 208,89 25/12/ ,91 158,89 157,78 227,78 26/12/ ,36 193,33 206,67 253,33 27/12/ ,64 213,33 197,78 238,89 28/12/ ,27 164,44 137,78 243,75 29/12/ ,45 174,44 187,78 270,00 30/12/ ,00 215,56 188,75 262,50 ΣΥΝΟΛΟ 4924, , , ,03

57 καταγράφεται η μέση κατανάλωση τροφής από τα κοτόπουλα των τεσσάρων μεταχειρίσεων Α, Β, Γ, Δ. Η μέση κατανάλωση τροφής είναι μεγαλύτερη για τα κοτόπουλα της ομάδας Δ και στην συνέχεια κατά μειούμενη σειρά έρχονται τα κοτόπουλα των ομάδων Α, Γ και Β. Σαν αντικειμενικό κριτήριο εμπορικής αποδοτικότητα της διατροφής για σύγκριση των τεσσάρων μεταχειρίσεων επιλέχθηκε ο λόγος μέσης παραγωγής κρέατος προς μέση συνολική τροφοδοσία τροφής που παρίσταται γραφικά σε σχέση με τις διάφορες μεταχειρίσεις (Α, Β, Γ, Δ) στο Διάγραμμα που ακολουθεί: Από την μελέτη της γραφικής παράστασης αυτής προκύπτει ότι η πλέον αποδοτική μεταχείριση όσον αφορά την απόδοση της τροφής σε κρέας είναι και πάλι η Γ που εμφανίζεται κατά 20% αυξημένη σε σχέση με τις Α και Β που ακιλουθούν κατά σειρά και κατά 67% αυξημένη σε σχέση με την μεταχείριση Δ

58 2.6. Μετρήσεις βιοδραστικότητας των ενσιρωμάτων σε χοίρους Γενικά Ο σκοπός του παρόντος τμήματος της εργασίας ήταν η προσθήκη πολυφαινολικών προσθέτων στο σιτηρέσιο χοίρων κρεατοπαραγωγής στην περίοδο απογαλακτισμού, από επεξεργασμένα Υ.Α.Ε. και η μέτρηση των δεικτών του οξειδωτικού στρες στο αίμα, στον ηπατικό, καρδιακό, νεφρικό, μυϊκό και πνευμονικό ιστό, έτσι ώστε με την ανάλυση των αποτελεσμάτων, να διερευνηθεί αν θα υπήρχε ενίσχυση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών τους σε νεαρή ηλικία καθώς και να εκτιμηθούν τυχόν επιδράσεις σε παραγωγικά μεγέθη (π.χ. κρεατοπαραγωγή ή/και σχέση ποσότητας παραγόμενου κρέατος με την παρεχόμενη μέσω της διατροφής ποσότητα τροφής. Η εκτίμηση των βιοδραστικών επιδράσεων της προσθήκης πολυφαινολών στους χοίρους παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι η φυσιολογία του χοίρου προσομοιάζει μ αυτή των ανθρώπων. Η εν λόγω μελέτη αποφασίστηκε να πραγματοποιηθεί σε δύο στάδια από τα οποία το ένα ήταν πιλοτικό και το δεύτερο δοκιμή πλήρους μεγέθους. Τα αποτελέσματα των δύο αυτών σταδίων περιγράφονται χωριστά παρακάτω Πιλοτική μελέτη Στο εργαστήριο Μηχανικής Τροφίμων - Βιοσυστημάτων και στο χοιροστάσιο του ΤΕΙ Θεσσαλίας πραγματοποιήθηκε εκτροφή χοιριδίων (Εφαρμογή σιτηρεσίου και συνθηκών ομαλής διαβίωσης ανάπτυξης). Συγκεκριμένα, στις 12 Οκτωβρίου 2013 γεννήθηκαν έντεκα (11) χοίροι από μια (1) χοιρομητέρα. Το γενετικό υπόβαθρο της χοιρομητέρας προήλθε από τη διασταύρωση Landrace (μητέρα) Χ Large White Duroc Pietrain (πατέρας). Εικόνα 20. Οι Χώροι Εγκατάστασης Στις Οποίες Εκτράφηκαν οι Χοίροι Που Συμμετείχαν Στην Παρούσα Μελέτη.

59 Κατά την διάρκεια του πιλοτικού πειράματος, τόσο οι συνθήκες διαβίωσης τους όσο ο τρόπος θανάτωσης του για τη λήψη των ιστών έγιναν σύμφωνα με τις Οδηγίες 2010/63/ΕΕ του Ε. Κ. και του Συμβουλίου της 22/10/2010 περί προστασίας των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς. Επίσης στην διάρκεια της πιλοτικής μελέτης; Λήφθηκαν μετρήσεις ανάπτυξης των χοίρων (Ημερήσια αύξηση ζωικού βάρους, ημερήσια κατανάλωση τροφής). Γράφημα 6. Ημερήσια Κατανάλωση Σιτηρεσίου Από Τη Μέρα Της Γέννησης Μέχρι Τη Θανάτωση Τους. Όπως βλέπουμε χαρακτηριστικά στο Γράφημα 6, μετά την απομάκρυνση της χοιρομητέρας, η κατανάλωση και των δύο σιτηρεσίων υπερδιπλασιάστηκε. Πέρα από την ημερήσια μέτρηση της κατανάλωσης σιτηρεσίου γινόταν και καθημερινές μετρήσεις στα βάρη των χοίρων. Στο Γράφημα 7 που ακολουθεί φαίνεται η εκθετική αύξηση στα βάρη των χοίρων με το πέρας των ημερών και μέχρι το τέλος του πειράματος.

60 Γράφημα 7. Αύξηση Στα Βάρη Των Χοίρων Σε Σχέση Με Το Χρόνο Δεκαεννέα (19) ημέρες από τη γέννησή τους, ξεκίνησε ο απογαλακτισμός τους και τα επτά (7) εναπομείναντα χοιρίδια, χωρίστηκαν σε δύο (2) ομάδες, εκ των οποίων τρία (3) επιλέχθηκαν στην ομάδα Α (ελέγχου) και τέσσερα (4) στην ομάδα Β, όπου στο σιτηρέσιό της υπήρχαν πολυφαινολικά πρόσθετα. Κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας του απογαλακτισμού, τα χοιρίδια απομακρύνονταν καθημερινά από τη χοιρομητέρα τους σε διαφορετικά κελιά για χρονικό διάστημα οκτώ (8) ωρών, ενώ κατά τη δεύτερη βδομάδα του απογαλακτισμού η καθημερινή απομάκρυνση από τη χοιρομητέρα αυξήθηκε σε δέκα (10) ώρες. Στην διάρκεια του πιλοτικού πειράματος, εκτελέστηκαν τρείς (3) λήψεις ηπατικού, καρδιακού, μυϊκού και νεφρικού ιστού και 2 λήψεις πνευμονικού ιστού στο Μικροσφαγείο που υπάρχει στο αγρόκτημα του ΤΕΙ Θεσσαλίας. Επίσης πραγματοποιήθηκαν και πέντε αιμοληψίες Ακολούθως, στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας πραγματοποιήθηκε: Ταχεία και ασφαλή μεταφορά των δειγμάτων των ιστών και τοποθέτησή τους σε ψυγείο στους -80 ο C. Επεξεργασία των δειγμάτων-ομογενοποίηση ιστών. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες.

61 με την χρήση των μεθόδων που προαναφέρθηκαν για τα κοτόπουλα. Οσον αφορά τα σιτηρέσια που χρησιμοποιήθηκαν κατά την διατροφή της ομάδας Control και της ομάδας Β η οποία κατανάλωνε πολυφαινόλες, στους πίνακες που ακολουθούν παρουσιάζεται η σύσταση καθενός σιτηρεσίου, καθώς και οι μεταξύ τους διαφορές. ΠΙΝΑΚΑΣ 10. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού ομάδας Α (ελέγχου). ΤΡΟΦΕΣ ΠΟΣΟΣΤΟ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗΣ % ΚΑΛΑΜΠΟΚI A 50,0 ΣΟΓΙΑΛΕΥΡΟ 42/8 20,0 ΚΡΙΘΑΡΙ 5,5 ΙΧΘΥΑΛΕΥΡΟ 72 7,0 ΟΡΟΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ 11% 15,0 ΙΣΟΡΡΟΠΙΣΤΗΣ Prevent Piglets Corn 2,5% ΣΥΝΟΛΟ 100 Το σιτηρέσιο της ομάδας Β, περιείχε κατά 2/3 το σιτηρέσιο της Α Ομάδας και κατά 1/3 το παρακάτω σιτηρέσιο. ΠΙΝΑΚΑΣ 11. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας (Β) με Πολυφαινολικά Πρόσθετα. ΤΡΟΦΕΣ ΠΟΣΟΣΤΟ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗΣ % ΚΑΛΑΜΠΟΚI Β 55,2 ΣΟΓΙΑΛΕΥΡΟ 42/8 31,8 ΛΙΠΟΣ ΣΚΟΝΗ (Λεκιθίνη) 5,0 ΙΧΘΥΑΛΕΥΡΟ 70/10 4,0 ΜΑΡΜΑΡΟΣΚΟΝΗ 1,5 ΙΣΟΡΡΟΠΙΣΤΗΣ Prevent Piglets Corn 2,5% ΣΥΝΟΛΟ 100 Ως καλαμπόκι B, αναφέρεται το ενσίρωμα όπου περιέχει μεγάλα ποσοστά υγρασίας, οργανικά οξέα, όπως γαλακτικό οξύ και χορηγείται στα ζώα σαν χονδροειδής

62 DPPH Inhibiton % DPPH Inhibition % ζωοτροφή. Η ενσίρωση είναι μια μέθοδος διατήρησης των χλωρών ζωοτροφών σε αναερόβιες συνθήκες. Καλαμπόκι Β: (Κατακράτημα επεξεργασμένων μικροδιηθημένων υγρών απόβλητων ελαιοτριβείου, πολυφαινολοποιημένο με 4% στερεά + Καλαμπόκι με 56% στερεά). Σύνολο 60% Στερεά. Για να ελέγξουμε την αντιοξειδωτική δράση των σιτηρεσίων των ομάδων, τόσο μεμονωμένα όσο και μεταξύ τους, εκτελέσαμε τη μέθοδο DPPH. Τα αποτελέσματα αυτής της μέτρησης φαίνονται στα παρακάτω διαγράμματα. 50 Pigs - Ablactation Feed. (Control Group). 100 Pigs - Ablactation Polyphenolic Feed IC 50 =17 mg/ml mg/ml mg/ml Γράφημα 8. Αντιοξειδωτική Δράση Σιτηρεσίων. Παρατηρείται ότι το πολυφαινολικό σιτηρέσιο έχει την τριπλάσια αντιοξειδωτική δράση από ότι το σιτηρέσιο της ομάδας Α.

63 Τα αποτελέσματα της πιλοτικής μελέτης όσον αφορά τους βιοδραστικούς δείκτες σε αίμα και ιστούς των χοίρων Α. Αποτελέσματα Μέτρησης Γλουταθειόνης (GSH) Α1. Καρδιακός ιστός Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε p < 0,05 Γράφημα 9. GSH στον καρδιακό ιστό των χοίρων Η Β ομάδα (Πολυφαινολικά πρόσθετα) στην τελευταία δειγματοληψία (γουρούνια 47 ημερών και μέσου βάρους 12,5 kgr), παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 9,25% στον καρδιακό ιστό.

64 Α2. Νεφρικός ιστός Γράφημα 10. GSH στο νεφρικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα (Πολυφαινολικά πρόσθετα) στην τελευταία δειγματοληψία (γουρούνια 47 ημερών και μέσου βάρους 12,5 kgr), παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 7,95% στο νεφρικό ιστό. Α3. Μυϊκός ιστός Γράφημα 11. GSH στο μυϊκό ιστό των χοίρων.

65 Η Β ομάδα (Πολυφαινολικά πρόσθετα) στην τελευταία δειγματοληψία (γουρούνια 47 ημερών και μέσου βάρους 12,5 kgr), παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 17,51% στο μυϊκό ιστό. Α4. Πνευμονικός ιστός Γράφημα 12. GSH στον πνευμονικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα (Πολυφαινολικά πρόσθετα) στην τελευταία δειγματοληψία (γουρούνια 47 ημερών και μέσου βάρους 12,5 kgr), παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 28,26% στον πνευμονικό ιστό.

66 Α5. Ηπατικός ιστός Γράφημα 13. GSH στον ηπατικό ιστό των χοίρων Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), ως ενδογενές αντιοξειδωτοτικό, εμφανίζει αύξηση στην ομάδα Β στατιστικά σημαντική σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, γεγονός που σημαίνει ότι στα χοιρίδια η χορήγηση πολυφαινολικού σιτηρεσίου αυξάνει την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού.

67 Α6. Αίμα (RBCL-Eρυθροκύταρα) Γράφημα 14. GSH στα ερυθροκύτταρα του αίματος των χοίρων Η Β ομάδα (Πολυφαινολικά πρόσθετα) στην τελευταία αιμοληψία (γουρούνια 47 ημερών και μέσου βάρους 12,5 kg), παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές GSH σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 23,3 %, Β. Αποτελέσματα Μέτρησης Δραστηριότητας της Καταλάσης (CAT). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε p < 0,05

68 U / mg Tot. Protein Β1. Καρδιακός ιστός Γράφημα 15. Catalase στον καρδιακό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 10,95% στον καρδιακό ιστό. Β2. Νεφρικός ιστό 700 Kidney Tissue Days after Birth. Γράφημα 16. Catalase στο νεφρικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 43,4% στο νεφρικό ιστό.

69 U/mg Tot. Protein Β3. Μυϊκός ιστός Γράφημα 17. Catalase στο μυϊκό ιστό των χοίρων.. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 10,96% στο μυϊκό ιστό. Β4. Πνευμονικός ιστός Lung Tissue Days after Birth. Γράφημα 18. Catalase στον πνευμονικό ιστό των χοίρων.

70 Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 31,76% στον πνευμονικό ιστό. Β5, Ηπατικός Ιστός Γράφημα 19. Catalase στον ηπατικό ιστό των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 20% στον ηπατικό ιστό.

71 Β6. Αίμα Γράφημα 20. Catalase στο αίμα των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές δραστηριότητας της Καταλάσης, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 2 % Γ. Αποτελέσματα Μέτρησης της Ολικής Αντιοξειδωτικής Ικανότητας (TAC). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε p < 0,05

72 Γ1. Καρδιακός ιστός Γράφημα 21. TAC στον καρδιακό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 5,6% στον καρδιακό ιστό. Γ2. Νεφρικός ιστό Γράφημα 22. TAC στο νεφρικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αύξηση στις τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 2,96% στο νεφρικό ιστό, η οποία όμως δεν είναι στατιστικά σημαντική.

73 Γ3. Μυϊκός ιστός Γράφημα 23. TAC στον μυϊκό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 8,13% στον μυϊκό ιστό. Γ4. Πνευμονικός ιστός Γράφημα 24. TAC στον πνευμονικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 11% στον πνευμονικό ιστό

74 Γ5. Ηπατικός ιστός Γράφημα 25. TAC στον ηπατικό ιστό των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 17%, ενώ στον ηπατικό ιστό παρατηρείται μια αύξηση 2,5% που, όμως, δε θεωρείται στατιστικά σημαντική. Γ6. Αίμα (πλάσμα) Γράφημα 26. TAC στο πλάσμα αίματος των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει αυξημένες στατιστικά σημαντικές τιμές TAC, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 17%,

75 Δ. Αποτελέσματα μέτρησης ουσιών που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε p < 0,05 Δ1. Καρδιακός ιστός Γράφημα 27. TBARS στον καρδιακό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές TBARS, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 24,69%, στον καρδιακό ιστό

76 Δ2. Νεφρικός ιστό Γράφημα 28. TBARS στο νεφρικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές TBARS, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 22,7%, στο νεφρικό ιστό. Δ3. Μυϊκός ιστός Γράφημα 29. TBARS στο μυϊκό ιστό των χοίρων.

77 nmol / mg Protein. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές TBARS, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 58,8%, στον μυϊκό ιστό. Δ4. Πνευμονικός ιστός 18 Lung Tissue Days after Birth. Γράφημα 30. TBARS στον πνευμονικό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές TBARS, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 6,4%, στον πνευμονικό ιστό. Δ5. Ηπατικός Ιστός Γράφημα 31. TBARS στον ηπατικό ιστό των χοίρων

78 Παρατηρείται σημαντική βιοδραστικότητα των πολυφαινολών στον ηπατικό ιστό όπως προκύπτει από την πολύ χαμηλότερη τιμή της μέτρησης TBARS. Δ6. Αίμα (πλάσμα) Γράφημα 32. TBARS στο πλάσμα αίαμτος των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές TBARS, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 39%, Ε Αποτελέσματα Μέτρησης Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Εκτελέστηκε μονόδρομη ανάλυση διασποράς (one way ANOVA), με το πρόγραμμα PASW Statistics 18 (πρώην SPSS Statistics), κατά Tukey και Dunett. Το επίπεδο σημαντικότητας προσδιορίστηκε σε p < 0,05

79 Ε1. Καρδιακός ιστός Γράφημα 33. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στον καρδιακό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 35,97% στον καρδιακό ιστό Ε2. Νεφρικός ιστό Γράφημα 34. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στο νεφρικό ιστό των χοίρων.

80 Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 19,37% στο νεφρικό ιστό. Ε3. Μυϊκός ιστός Γράφημα 35. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στον μυϊκό ιστό των χοίρων. Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 13,02% στον μυϊκό ιστό. Ε4. Πνευμονικός ιστός Γράφημα 36.. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στον πνευμονικό ιστό των χοίρων.

81 Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 41,86% στον πνευμονικό ιστό. Ε5. Ηπατικός ιστός Γράφημα 37. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στον ηπατικό ιστό των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία δειγματοληψία, παρουσιάζει ευνοϊκά μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), στον ηπατικό ιστό

82 Ε6. Αίμα (πλάσμα) Γράφημα 38. Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στο πλάσμα αίματος των χοίρων Η Β ομάδα στην τελευταία αιμοληψία, παρουσιάζει μειωμένες στατιστικά σημαντικές τιμές Καρβονυλίων, σε σχέση με την Α ομάδα (Control), κατά 18%, Συνοψίζοντας, στο παρόν τμήμα της έρευνας που αφορά την πιλοτική μελέτη εκτράφηκαν έντεκα (11) χοίροι, που διαχωρίστηκαν σε δύο (2) ομάδες που εκτρέφονταν με δύο (2) διαφορετικά σιτηρέσια ανάλογα της ομάδας στην οποία ανήκαν, με στόχο τον έλεγχο των δεικτών του οξειδωτικού στρες στον ηπατικό, καρδιακό, νεφρικό, μυϊκό και πνευμονικό ιστό καίς το αίμα. Με την ανάλυση των αποτελεσμάτων, εντοπίστηκε η συμπεριφορά των δεικτών σε σχέση με το χρόνο, αλλά και αυτή μεταξύ των ομάδων (ομάδα ελέγχου και ομάδα πολυφαινολών) στους ιστούς. Οι δείκτες του οξειδωτικού στρες που ελέγχθηκαν ήταν: η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η δραστικότητα της καταλάσης (CAT), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα

83 (TAC- Total antioxidant capacity), οι ουσίες που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS- Thiobarbituric acid reactive substances) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. Πραγματοποιήθηκαν τρείς (3) δειγματοληψίες ιστών στα χρονικά διαστήματα: δύο (2), δώδεκα (12) και σαράντα οκτώ (48) ημερών μετά από την γέννηση των χοιριδίων καθώς και πέντε (5) αιμοληψίες. Πρέπει να αναφερθεί ότι μέχρι και τη δέκατη τρίτη (13) ημέρα από τη γέννηση, τα χοιρίδια τρέφονταν μόνο με μητρικό γάλα. Από εκείνη τη μέρα και μέχρι την τριακοστή (30) μέρα, η τροφή τους εκτός από γάλα περιείχε και το σιτηρέσιο απογαλακτισμού. Τέλος, ο πλήρης απογαλακτισμός πραγματοποιήθηκε μετά την τριακοστή τρίτη (33) ημέρα από τη γέννηση τους. Συγκεκριμένα διαπιστώθηκε ότι σε ηλικία 47 ημερών, η πολυφαινολική ομάδα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου όσον αφορά στην TAC παρουσιάζει αύξηση τιμών στατιστικά σημαντική στον καρδιακό ιστό κατά 5,6%, στον τετρακέφαλο κατά 8,13%, και στον πνευμονικό ιστό την μεγαλύτερη αύξηση κατά 11%. Επίσης, τα αποτελέσματα στην μέτρηση της καταλάσης έδειξαν αύξηση στην δραστηριότητα του ενζύμου από 10,96% στον τετρακέφαλο ιστό μέχρι και 43,39% στον νεφρικό ιστό. Παρατηρήθηκε στην πολυφαινολική ομάδα μείωση της οξείδωσης των λιπιδίων (TBARS) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε όλους τους ιστούς από 6,4% στον πνευμονικό ιστό έως και 58,8% στον τετρακέφαλο. Η οξείδωση των πρωτεϊνών μειώθηκε στην πολυφαινολική ομάδα από 13,02% στον τετρακέφαλο μέχρι 41,86% στον πνευμονικό ιστό. Τέλος, η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) παρουσιάζεται αυξημένη στην πολυφαινολική ομάδα με τιμές από 9,25% στον καρδιακό ιστό έως και 28,26% στον πνευμονικό ιστό. Ανάλογα ευνοϊκοί βρέθηκαν και οι ίδιοι δείκτες που μετρήθηκαν στο αίμα για τα ζώα της πολυφαινολικής ομάδας Από όλα τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας που αφορούσε στη διατροφή χοίρων στην περίοδο του απογαλακτισμού και στον έλεγχο των δεικτών οξειδωτικού στρες στους ιστούς αυτών, είναι θετικά και ενθαρρυντικά. Όπως αποδεικνύεται τα αντιοξειδωτκά της ελιάς που προέρχεται που προστέθηκαν μέσω του ενσιρωμένου καλαμποκιού στο σιτηρέσιο του απογαλακτισμού, ενίσχυσε σημαντικά την αντιοξειδωτική άμυνα των νεαρών χοιριδίων. Επίσης, πρέπει να αναφερθεί ότι αυτή η παρατήρηση έχει σημαντική σημασία για την ευζωία των χοιριδίων ότι καθώς τα νεαρά χοιρίδια αναπτύσσονται σε συνθήκες

84 κλειστού ενσταυλισμού, που όσο και καλές να είναι δεν παύει να είναι περισσότερο στρεσογόνες σε σχέση με αυτές του ελεύθερου ενσταυλισμού. Συνεπώς, τα νεαρά χοιρίδια που καταναλώνουν το πολυφαινολικό σιτηρέσιο και παρουσιάζουν καλύτερη αντιοξειδωτική άμυνα αναπτύσσονται και ομαλότερα σε σχέση με τα άλλα. Στην συνέχεια για να εξαχθούν πιο ασφαλή συμπεράσματα, αποφασίστηκε να πραγματοποιηθεί περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο αριθμό χοίρων, όπως επίσης και η παρακολούθηση μίας μελλοντικής χοιρομητέρας που να λαμβάνει πολυφαινολικό σιτηρέσιο από νεαρή ηλικία, με σκοπό την απόκτηση δεδομένων που να αφορούν την επόμενη γενιά. Τα συμπεράσματα αυτής της περαιτέρω μελέτης παρουσιάζονται παρακάτω Τα αποτελέσματα της ολοκληρωμένης τελικής μελέτης όσον αφορά τους βιοδραστικούς δείκτες σε αίμα και ιστούς των χοίρων. Μετά την επιτυχή έκβαση του πιλοτικού πειράματος και στα πλαίσια ενός πλέον εμπεριστατωμένου πειράματος εκτράφηκαν είκοσι (20) χοίρίδια τα οποία διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες των δέκα (10). Σε αυτές τις δύο ομάδες χορηγήθηκε διαφορετικό σιτηρέσιο. Στην πρώτη ομάδα η οποία αποτελούσε την ομάδα ελέγχου χορηγήθηκε κανονικό σιτηρέσιο για χοίρους, ενώ το σιτηρέσιο της δεύτερης ομάδας περιείχε επιπλέον επεξεργασμένα Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) τα οποία περιέχουν πολυφαινόλες. Στα αρχικά στάδια του πειράματος παρασκευάστηκε ενσίρωμα το οποίο περιείχε τα ΥΑΕ (Κατακράτημα των μεμβρανών μικροδιήθησης τύπου Γ) και στη συνέχεια προστέθηκε στο σιτηρέσιο των χοίρων που ανήκαν στην πολυφαινολική ομάδα. Τα χοιρίδια εκτράφηκαν για 50 ημέρες και κατά τη διάρκεια έγιναν 4 ιστοληψίες - αιμοληψίες (2, 20, 35 και 50 ημέρες μετά την γέννηση). Κατά τις ιστοληψίες λαμβάνονταν δείγματα από εννέα ιστούς πακρεατικός, στομαχικός, ηπατικός, σπλήνας, καρδιακός, εγκεφαλικός, μυικός, νεφρικός, πνευμονικός συν ένα δείγμα αίματος Οι δείκτες του οξειδωτικού στρες που ελέγχθηκαν ήταν: η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η δραστικότητα της καταλάσης (CAT), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC- Totalantioxidantcapacity), οι ουσίες που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS- Thiobarbituricacidreactivesubstances) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια.

85 Στο χοιροστάσιο του ΤΕΙ / Θεσσαλίας πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω εργασίες: Εκτροφή χοιριδίων (Εφαρμογή σιτηρεσίου και συνθηκών ομαλής διαβίωσης ανάπτυξης). Στις 2 Απριλίου 2014 γεννήθηκαν είκοσι (20) χοίροι από δύο (2) χοιρομητέρες (10 από την κάθε χοιρομητέρα). Το γενετικό υπόβαθρο των χοιρομητέρων προήλθε από τη διασταύρωση Landrace (μητέρα) Χ LargeWhite Duroc Pietrain (πατέρας). Εικόνα 21. Οι Χώροι Εγκατάστασης στις Οποίες Εκτράφηκαν οι Χοίροι που Συμμετείχαν στην Παρούσα Μελέτη. Τόσο οι συνθήκες διαβίωσης τους όσο ο τρόπος θανάτωσης τους για τη λήψη αίματος και ιστών έγιναν σύμφωνα με τις Οδηγίες 2010/63/ΕΕ του Ε. Κ. και του Συμβουλίου της 22/10/2010 περί προστασίας των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς. Παρακολούθηση ανάπτυξης χοίρων (Ημερήσια αύξηση ζωϊκού βάρους, ημερήσια κατανάλωση τροφής). Είκοσι (20) ημέρες από την γέννησή τους, ξεκίνησε ο απογαλακτισμός τους και τα δέκαέξι (16) εναπομείναντα χοιρίδια, χωρίστηκαν σε δύο (2) ομάδες, εκ

86 των οποίων οκτώ (8) αποτέλεσαν την ομάδα Α (ελέγχου) και τα άλλα οκτώ (8) την ομάδα Β, όπου στο σιτηρέσιό της υπήρχαν πολυφαινολικά πρόσθετα. Κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας του απογαλακτισμού, τα χοιρίδια απομακρύνονταν καθημερινά, από τις χοιρο-μητέρες τους σε διαφορετικά κελιά για χρονικό διάστημα οκτώ (8) ωρών, ενώ κατά τη δεύτερη βδομάδα του απογαλακτισμού η καθημερινή απομάκρυνση από τις χοιρο-μητέρες αυξήθηκε σε δέκα (10) ώρες. Η απομάκρυνση των χοιρο-μητέρων έγινε 35 μέρες μετά την γέννηση τους. Συγχρόνως, όλες αυτές τις μέρες γινόταν συνεχής παρακολούθηση της ημερήσιας κατανάλωσης στα σιτηρέσια απογαλακτισμού, όπως φαίνεται στο Γράφημα 39. Γράφημα 39. Ημερήσια Κατανάλωση Σιτηρεσίου από την Εικοστή Μέρα της Γέννησης Μέχρι την Πεντηκοστή. Όπως βλέπουμε χαρακτηριστικά στο Γράφημα 39., μετά την απομάκρυνση των χοιρο-μητέρων, η κατανάλωση και των δύο σιτηρεσίων υπερδιπλασιάστηκε. Εκτός από την ημερήσια μέτρηση της κατανάλωσης σιτηρεσίου, γινόταν και μετρήσεις στα βάρη των χοίρων. Στο Γράφημα 40 που ακολουθεί φαίνεται η αύξηση στα βάρη των χοίρων με το πέρας των ημερών και μέχρι το τέλος του πειράματος.

87 ΠΙΝΑΚΑΣ 12. Μέσος Όρος Μέτρησης Βάρους των Χοιριδίων. Ημέρες μετά την γέννηση Μέσος Όρος Contol Polyph. 2 1, ,131 5,131 5, ,859 5,720 5, ,600 6,450 6, ,537 8,434 8, ,395 12,540 14,250 Γράφημα 40. Αύξηση στα Βάρη Των Χοίρων σε σχέση με το χρόνο. Από το παραπάνω διάγραμμα παρατηρείται ότι κατά μέσο όρο το βάρος των γουρουνιών που ανήκαν στην πολυφαινολική ομάδα παρουσιάζεται κατά 1,7 χιλιόγραμμα αυξημένο από αυτό της ομάδας ελέγχου, στις 50 ημέρες μετά την γέννησή τους, παρότι κατανάλωσαν κατά μέσο όρο 380 γραμμάρια σιτηρεσίου λιγότερο από αυτό της ομάδας ελέγχου. Εκτέλεση τεσσάρων (4) ιστοληψιών (σε 2, 20, 35 και 50 ημέρες μετά την γέννησή τους) 9 διαφορετικών ιστών και αντίστοιχων στο Μικροσφαγείο που υπάρχει στο αγρόκτημα του ΤΕΙ/Θεσσαλίας.

88 Η πρώτη ιστοληψία εκτελέστηκε σε δύο (2) χοιρίδια ηλικίας δύο (2) ημερών και βάρους 0,950 και 1,560 kg. Χρησιμοποιήθηκε το αναισθητικό φάρμακο Xylopan (VetoquinolS.A., France) για να διασφαλιστεί ότι προκαλείται ο ελάχιστος δυνατός αναπόφευκτος πόνος, ταλαιπωρία ή αγωνία (Οδηγίες 2010/63/ΕΕ) και η θανάτωση έγινε στην εγκατάσταση του εκτροφέα από αρμόδιο, εκπαιδευμένο πρόσωπο. Η δεύτερη ιστοληψία έγινε είκοσι (20) μέρες μετά την γέννηση σε δύο (2) χοιρίδια ημερών και βάρους 4,900 και 4,550kg. H Τρίτη ιστοληψία πραγματοποιήθηκε τριάντα πέντε (35) μέρες από τη γέννηση τους σε τέσσερα (4) χοιρίδια, 2 από το πολυφαινολικό group και 2 από το group των control. Η τέταρτη ιστοληψία έγινε πενήντα (50) μέρες από τη γέννηση τους σε δώδεκα (12) χοιρίδια, 6 από το πολυφαινολικό group και 6 από το group των control. Αντίστοιχα στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας: Ταχεία και ασφαλή μεταφορά των δειγμάτων των αιμοληψιών και των ιστών, καθώς και η τοποθέτησή τους σε ψυγείο στους -80 ο C. Επεξεργασία του αίματος (Λήψη πλάσματος αιμολύματος) και ομογενοποίηση ιστών. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες. Η επεξεργασία αίματος και ιστών πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο που περιγράφθηκε παραπάνω στην μελέτη με τα κοτόπουλα.

89 Περιγραφή Σιτηρεσίων ομάδας πολυφαινολών και Contol. Παρασκευή Πολυφαινολικού Σιτηρεσίου ΠΙΝΑΚΑΣ 13. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας (Β) με Πολυφαινολικά Πρόσθετα. POLYPHENOL. GROUP. ΤΡΟΦΕΣ % ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ (Ενσιρωμένο με κατακράτημα επεξεργασμένων ΥΑΕ, που προήλθε από μικροδιήθηση με κεραμικά φίλτρα, πολυφαινολοποιημένο με 4% στερεά + Καλαμπόκι με 56% στερεά). 46,5 Σύνολο 60% Στερεά. ΣΟΓΙΑΛΕΥΡΟ 21,0 ΟΡΟΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ 20,0 ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ (PROVET) 10,0 ΙΣΟΡΡΟΠΙΣΤΗΣ (Piglets Corn 2,5%) 2,5 ΣΥΝΟΛΟ 100,0 Εικόνα 22 Ανάλυση Επεξεργασμένων ΥΑΕ (Συμπύκνωση με Αντλία Κενού, με Ένα Πέρασμα), με την HPLC μέθοδο.