ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 3. Προσδιορισμός Γλουταθειόνης με Τριχοειδή Ηλεκτροφόρηση. Υπεύθυνη άσκησης: Καθηγήτρια Α.

Transcript

1 ΒΙΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 3 Υπεύθυνη άσκησης: Καθηγήτρια Α. Ζώτου Προσδιορισμός Γλουταθειόνης με Τριχοειδή Ηλεκτροφόρηση Η Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση (Capillary Electrophoresis, CE) είναι μια διαχωριστική τεχνική, στην οποία ο διαχωρισμός βασίζεται στην κίνηση φορτισμένων ενώσεων, μέσα σε τριχοειδή σωλήνα, από τηγμένο οξείδιο του πυριτίου, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Τα άκρα του τριχοειδούς είναι εμβαπτισμένα μαζί με δυο ηλεκτρόδια, σε δοχεία που φέρουν ηλεκτρολύτη. Η διάταξη περιλαμβάνει επίσης σύστημα εισαγωγής δείγματος - που παρέχει τη δυνατότητα υδροδυναμικής ή ηλεκτροκινητικής εισαγωγής- και αυτόματο δειγματολήπτη. Η κινητήρια δύναμη του διαχωρισμού είναι η ηλεκτροοσμωτική ροή (EOF), η οποία ωθεί τα ιόντα, ανεξαρτήτως φορτίου, προς το καθοδικό άκρο. Χαρακτηριστικό της Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης αποτελεί η ανίχνευση on-capillary. Δηλαδή, όταν η ανίχνευση είναι οπτική, ο ίδιος ο τριχοειδής αποτελεί το οπτικό παράθυρο και διέρχεται μέσα από τον ανιχνευτή, χωρίς να χρειάζονται εξωτερικές σωληνώσεις, που συνεισφέρουν στη διεύρυνση των ανιχνευόμενων ζωνών των συστατικών ενός δείγματος. Η φασματομετρία μαζών αποτελεί περίπτωση ανίχνευσης μετά τον τριχοειδή. Χαρακτηριστικά μεγέθη της Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης αποτελούν η ηλεκτροφορητική ευκινησία ( ) και η ηλεκτροοσμωτική ροή ( ). 1

2 Γενικά περί Γλουταθειόνης H Γλουταθειόνη (GSH) είναι μια πρωτεΐνη μικρού μοριακού βάρους και ανήκει στις θειόλες (R-SH). Η GSH, ως τριπεπτίδιο, συντίθεται από τρία αμινοξέα: το γλουταμινικό οξύ, την κυστεΐνη και τη γλυκίνη. Βιοσύνθεση γλουταθειόνης Η GSH είναι το κυριότερο αντιοξειδωτικό του οργανισμού και βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα, αλλά και σε μικρότερες συγκεντρώσεις στο αίμα. Μέσα στα κύτταρα μπορεί να βρίσκεται ελεύθερη ή δεσμευμένη σε πρωτεΐνες. Ο ρόλος της στα κύτταρα είναι πολλαπλός: Μεταφορά αμινοξέων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης μέσα στο κύτταρο, ενσωμάτωση σε κάποιες δομές του λευκοτριενίου, αναγωγή του ασκορβικού οξέος, κ.ά. Η βιολογική δράση της GSH οφείλεται στην παρουσία της θειολικής ομάδας, που ως πυρηνόφιλη, είναι δότης πρωτονίων. Σύμφωνα μ αυτήν την ιδιότητα, η ανηγμένη μορφή (GSH) εξουδετερώνει τις ελεύθερες ρίζες (O ) προς σχηματισμό νέων ελεύθερων ριζών (GS ) και ακολούθως σχηματισμό του δισουλφιδίου της GSΗ, G-S-S-G. Η θειολική οξειδοαναγωγική ισορροπία βασίζεται στο λόγο ανηγμένων 2

3 προς οξειδωμένων μορίων γλουταθειόνης (GSH/GSSG). Σε φυσιολογικά κύτταρα, ο λόγος αυτός υπερβαίνει το 100, ενώ σε καταστάσεις στρες (οξειδωτικό στρες) κυμαίνεται από 1 έως 10. Το οξειδωτικό στρες έχει συνδεθεί με πολλές ασθένειες όπως το Alzheimer, Parkinson, AIDS, καρκινογένεση, κίρρωση ήπατος, με τελευταίο εύρημα τον αυτισμό. Η GSH και πιο συγκεκριμένα ο λόγος GSH/GSSG, αποτελεί βιοδείκτη για ένα πλήθος ασθενειών, καταδεικνύοντας έτσι τη σημαντικότητα του προσδιορισμού της. Πειραματική διαδικασία Οι περισσότερες θειόλες, φυσικές και συνθετικές, στερούνται χρωμοφόρας ή φθορίζουσας ομάδας. Για το λόγο αυτό, ο προσδιορισμός τους σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις σε πολύπλοκα υποστρώματα (όπως τα βιολογικά δείγματα) μπορεί να είναι προβληματικός. Τυπική προσέγγιση για την άρση του προβλήματος, είναι η παραγωγοποίηση αυτών των ενώσεων με κατάλληλα αντιδραστήρια. Μια νέα κατηγορία αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης των θειολών είναι οι εστέρες του προπιολικού οξέος. Ο μεθυλεστέρας του προπιολικού οξέος (methyl propiolate, MP) είναι ο πιο υδατοδιαλυτός και παρουσιάζει όλα τα πλεονεκτήματα της σειράς, όπως δημιουργία σταθερών παραγώγων, εκλεκτικότητα και ταχεία κινητική σε ήπιες συνθήκες. Μεθυλεστέρας του προπιολικού οξέος Το προϊόν της αντίδρασης της GSH με τον MP παρουσιάζει συζυγία στο μόριο (εναλλαγή διπλούαπλού-διπλού δεσμού) και απορροφά στα 285nm. Διαδικασία παραγωγοποίησης Προσθήκη, κατά σειρά, των ακόλουθων αντιδραστηρίων, σε πλαστικά φιαλίδια Eppendorf : 800 μl πρότυπο διάλυμα GSH ή δείγμα 100 μl MP (20 mmol/l) 100μL ρυθμιστικό διάλυμα βορικών αλάτων (200 mmol/l, ph=9,5) Ακολουθεί χειροκίνητη ανάδευση του μίγματος και ποσότητα 200 μl μεταφέρεται αμέσως σε υποδοχέα του αυτόματου δειγματολήπτη της Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης. Ο διαχωρισμός και η ανίχνευση του παραγώγου λαμβάνει χώρα 15 λεπτά μετά την ανάμιξη των αντιδραστηρίων, χρόνος που ούτως ή άλλως απαιτείται για την ενδιάμεση πλύση του τριχοειδούς μεταξύ των δειγμάτων. Αντιδραστήρια Γλουταθειόνη (GSH): παρασκευάζεται αποθεματικό διάλυμα συγκέντρωσης 5 mmol/l, σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, με ζύγιση 0,0153 g του αντιδραστηρίου και αραίωση με υδατικό διάλυμα EDTA (συγκέντρωσης 5mmol/L). Ρυθμιστικό διάλυμα βορικών αλάτων: βορικό οξύ συγκέντρωσης 200 mmol/l για την παραγωγοποίηση και 75 mmol/l για τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό (BGE). Ρύθμιση του ph σε τιμή 9,5 με NaOH 2 mol/l και στις δύο περιπτώσεις. Μεθυλεστέρας του προπιολικού οξέος (MP): παρασκευάζεται διάλυμα συγκέντρωσης 22 mmol/l, με προσθήκη 20 μl του πυκνού αντιδραστηρίου, σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml και αραίωση με νερό Milli Q. Διάλυμα ακετόνης 0,1% v/v, ως δείκτης ηλεκτροοσμωτικής ροής. ΝαΟΗ 1mol/L και 0,1mol/L 3

4 Ηλεκτροφορητικές συνθήκες ανάλυσης Τριχοειδής σωλήνας: L total =60cm (L eff =51,5cm) x 75 μm i.d. Φέρων ηλεκτρολύτης (BGE): Ρυθμιστικό διάλυμα βορικών αλάτων (75 mmol/l, ph=9,5). Διηθείται από φίλτρα 0,2μm και απαερώνεται πριν την εισαγωγή του στο όργανο. Ανίχνευση DAD: λ=285nm Εισαγωγή δείγματος: Υδροδυναμική, με εφαρμογή πίεσης 34,5 mbar για 5 sec. Εφαρμοζόμενη τάση: +20kV Πρωτόκολλο αρχικής προετοιμασίας και καθημερινής εξισορρόπησης του τριχοειδούς Διαδικασία Χρόνος (min) NaOH 1M NaOH 0, 1M Απιονισμένο H 2 O* BGE Αρχική προετοιμασία καινούριου τριχοειδούς Καθημερινή πλύση στην αρχή των μετρήσεων Πλύση μεταξύ των μετρήσεων Καθημερινή πλύση μετά το πέρας των μετρήσεων *Διηθημένο από 0,2μm Οι πλύσεις κατά σειρά με: ΝαΟΗ είναι απαραίτητες για την αποπρωτονίωση των σιλανολικών ομάδων (SiOH SiO - ) και ανάπτυξη της EOF, με νερό για την απομάκρυνση περίσσειας αλκάλεως και με BGE για την εξασφάλιση επιθυμητών τιμών ιοντικής ισχύος και ph. Σε τακτά χρονικά διαστήματα (συνήθως μετά από κάθε 4-5 μετρήσεις) είναι απαραίτητη η αναπλήρωση του ρυθμιστικού διαλύματος, στους υποδοχείς του αυτόματου δειγματολήπτη επειδή, λόγω ηλεκτρόλυσης του ρυθμιστικού διαλύματος, μπορεί να αλλάξει το ph και επομένως και η EOF. Σε υδατικά διαλύματα, η ηλεκτρόλυση του νερού παράγει διαλυτά πρωτόνια στην άνοδο και υδροξυλιόντα στην κάθοδο. Υπολογισμός ηλεκτροφορητικής ευκινησίας (μ ep ) (2) (1) Εισάγοντας στην πρώτη εξίσωση τις διαστάσεις του τριχοειδούς (L=60cm, l=51,5cm), το χρόνο μετανάστευσης t m της GSH και της ΕΟF σε sec και το δυναμικό του εφαρμοζόμενου πεδίου (20000 Volt), υπολογίζονται οι τιμές της φαινόμενης ευκινησίας (μ app ) της GSH, καθώς και η ευκινησία της EOF (χρησιμοποιώντας διάλυμα 0,1% v/v ακετόνης). Από τη δεύτερη εξίσωση υπολογίζεται η τιμή της ηλεκτροφορητικής ευκινησίας (μ ep ) της GSH, η οποία, ως ανιόν θα έχει αρνητικό πρόσημο. Ένωση GSH (t m = min) EOF(t m = min) Φαινόμενη ευκινησία μ app ( 10 4 cm 2 /s V) Ηλεκτροφορητική ευκινησία μ ep ( 10 4 cm 2 /s V) 4

5 Καμπύλη αναφοράς Παρασκευάζονται διαλύματα GSH με αραίωση του αποθεματικού διαλύματος των 5mM. Οι τελικές συγκεντρώσεις που προκύπτουν στο μίγμα παραγωγοποίησης είναι 25, 50, 75, 100, 150 και 200 μm. Ανάλυση δειγμάτων Ο προσδιορισμός της GSH σε βιολογικά υγρά, είναι πολύ σημαντικός ως δείκτης οξειδωτικού στρες και γι' αυτό το λόγο, μελετάται και ως πιθανός βιοδείκτης για τον αυτισμό, καθώς και για άλλες ασθένειες, όπως Πάρκινσον, Alzheimer, καρκίνο. Τα δείγματα ούρων αυτιστικών ατόμων έχουν βρεθεί να περιέχουν ελαττωμένες ποσότητες γλουταθειόνης, σε σχέση με τα ούρα υγιών ατόμων. H αξία του προσδιορισμού της GSH σε βιολογικά υγρά (όπως ούρα) καθίσταται ακόμη σημαντικότερη, όταν πραγματοποιείται με μια τεχνική απλή, οικολογική και χαμηλού κόστους, όπως η Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση. Με χρήση της μεθόδου που περιγράφτηκε παραπάνω, η GSH μπορεί να προσδιοριστεί σε σύντομο χρόνο, με απλό και οικονομικό τρόπο σε δείγματα ούρων. 5