ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ FKLF1 ΣΤΟΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΚΑΙ ΑΛΛΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ===================================================== Πανεπ. Έτος Αριθμ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ FKLF1 ΣΤΟΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΚΑΙ ΑΛΛΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Γεώργιου Γαβριηλίδη Αιματολόγου ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΚΩΤΣΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΦΡΟΔΙΤΗ ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΚΩΤΣΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΦΡΟΔΙΤΗ ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙΔΟΥ- ΑΝΔΡΕΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΜΑΡΙΑ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ «Η έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5342/32, άρθρο και νόμος 1268/82, άρθρο 50 8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

4

5

6

7 Στους γονείς μου Θωμά και Ελένη Σε όσους αγωνίζονται σε ξένους τόπους

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μεταγραφικοί παράγοντες Ορισμός- Λειτουργία Ταξινόμηση Krüpel-Like Factors.. 19 α) Sp1. 20 β) KLF1/EKLF γ) Άλλοι ΚLFs δ) Συγγενείς προς τον FKLF1 KLFs. 24 ε) FKLF1/FKLF Η μεταγραφική ρύθμιση της αιμοποίησης Γενικά Μεταγραφικός έλεγχος αιμοποιητικών γονιδίων Επίλογος Μοριακές τεχνικές PCR RT-PCR Υβριδισμός κατά Southern (Southern blot) Δοκιμασία προφύλαξης από RNάση Κατασκευή μεταλλαγμένων ποντικών Ιικοί φορείς- Γονιδιακή Θεραπεία Καλλιέργεια και επιμόλυνση κυττάρων Ανοσοφαινότυπος... 65

10 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ρετροϊικός Φορέας του FKLF Κυτταρικές Σειρές Ρετροϊικοί Φορείς Επιμόλυνση της MEL κυτταρικής σειράς Επιμολύνσεις κυττάρων μυελού ποντικών Ανοσοφθορισμός FKLF1 Knockout Ποντικοί Κατασκευή του φορέα στόχευσης Απομόνωση FKLF1 +/- στελεχιαίων κυττάρων Η Γένεση των FKLF -/- ποντικών Ανάλυση της έκφρασης FKLF Έκφραση δυνητικών γονιδίων στόχων του FKLF Αιματολογική ανάλυση και μελέτη μυελού οστών FKLF1 -/- ποντικών Ακτινοβόληση Διαγονιδιακοί Ποντικοί που Υπερεκφράζουν τον FKLF Κατασκευή Πλασμιδίων Ανάλυση DNA και RNA Αιματολογικές αναλύσεις Ανοσοφθορισμός και χρώσεις Καλλιέργειες Αιμοποιητικών Προγονικών Κυττάρων Έκφραση FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς Συλλογή δειγμάτων Έλεγχος της έκφρασης FKLF Στατιστική ανάλυση

11 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ρετροϊικός φορέας του FKLF Η επιμόλυνση με τον FKLF1 επάγει την έκφραση χαμηλά εκφραζόμενων αλλά όχι τελείως σιωπηλών διαγονιδίων γ αλύσου σε κυτταρικές σειρές (MEL) Η επιμόλυνση με τον ρετροιϊκό φορέα FKLF1 προάγει την έκφραση ελάχιστα ενεργοποιημένου διαγονιδίου γ-αλύσου σε ερυθροβλάστες ποντικού Η επιμόλυνση επάγει την έκφραση ενός ελάχιστα εκφραζόμενου διαγονιδίου γ-αλύσου σε μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού οστών ποντικού Η επιμόλυνση με FKLF1 έχει μέτρια πλειοτροπικά αποτελέσματα στην αιμοποίηση των ενήλικων ποντικών FKLF1 knockout ποντικοί Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε διάφορους ιστούς ποντικών και της απουσίας της σε knockout (KLF -/- ) ποντικούς Οι ομόζυγοι μεταλλαγμένοι FKLF1 -/- ποντικοί αναπτύσσονταν κανονικά και ήταν γόνιμοι Αιματολογική ανάλυση των FKLF1 -/- ποντικών Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων των αλύσεων της αιμοσφαιρίνης στους FKLF1 -/- ποντικούς Διαγονιδιακοί ποντικοί που υπερεκφράζουν τον FKLF Οι χιμαιρικοί FKLF1 υπερεκφράζοντες ποντικοί είναι αναιμικοί Η υπερέκφραση FKLF1 προκαλεί διακοπή στην τελική εμβρυική ερυθροποίηση, με αποτέλεσμα πρόωρο τερματισμό της κύησης Η έκφραση των εμβρυϊκών β-αναλόγων αλύσεων της αιμοσφαιρίνης δεν επηρεάζεται από την υπερέκφραση FKLF

12 3.4. Έκφραση FKLF1 σε άλλους ιστούς Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε ιστούς ποντικών Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σχεδόν 10 χρόνια μετά από την αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος (κι εκείνου πολλών άλλων οργανισμών) το κύριο ενδιαφέρον της μοριακής βιολογίας βρίσκεται στην αποκρυπτογράφηση του ρόλου των προϊόντων του (των πρωτεϊνών) και στην κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους η ρύθμιση της σύνθεσης, η τελική επεξεργασία και οι αλληλεπιδράσεις τους καθορίζουν τον κυτταρικό φαινότυπο. Αυτό είναι ένα τεράστιο έργο, λόγω της μεγάλης του πολυπλοκότητας, στου οποίου βρισκόμαστε ακόμη την αρχή. Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι μια μεγάλη ομάδα πρωτεϊνών με κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιωματικής έκφρασης. Παρόλο που πολλοί από αυτούς είναι πλέον γνωστοί, η δράση τους στις περισσότερες περιπτώσεις παραμένει ανεξιχνίαστη. Αυτό συμβαίνει διότι έχουν την ικανότητα να συνδέονται σε πολυάριθμες περιοχές του DNA αλλά, με κάποιους μηχανισμούς, επιλέγουν κάποιες από αυτές, τις οποίες είτε ενεργοποιούν είτε καταστέλλουν ανάλογα πολλές φορές με τα εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια σήματα που δέχονται ή με το συνολικό μεταγραφικό περιβάλλον και τη φάση ανάπτυξης του κυττάρου. Είναι συνεπώς η μελέτη τους συχνά πολύ επίπονη και χρονοβόρα. Όταν στις αρχές του 2002 μου ανατέθηκε η μελέτη ενός τέτοιου παράγοντα, στο εργαστήριο του καθηγητή Γεώργιου Σταματογιαννόπουλου, στο πανεπιστήμιο Ουάσινγκτον, στο Σηάτλ, ελάχιστα γνώριζα σχετικά με τους παράγοντες αυτούς και τις δυσκολίες που θα έβρισκα μπροστά μου. Ο λόγος που θέλαμε να μελετήσουμε τον FKLF1, ο οποίος είχε στα τέλη της προηγούμενης δεκαετίας ανακαλυφθεί στο εργαστήριο του κ. Σταματογιαννόπουλου, ήταν ο πιθανός ρόλος του, που είχε διαφανεί στις πρώτες μελέτες, στην έκφραση της εμβρυϊκής αλύσου της αιμοσφαιρίνης. Η αρχική μάλιστα σκέψη πίσω από την ανακάλυψή του ήταν η ριζοσπαστική ιδέα να χρησιμοποιηθούν γονίδια μεταγραφικών παραγόντων για να επιτευχθεί αυτό που φαινόταν δύσκολο με τα υπόλοιπα γονίδια που είχαν χρησιμοποιηθεί, η γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. Η κατανόηση εξάλλου του μεταγραφικού περιβάλλοντος της στροφής από την εμβρυϊκή στην 13

14 αιμοσφαιρίνη του ενηλίκου ήταν εξαιρετικά ενδιαφέρουσα για ένα εργαστήριο το οποίο έχει πρωτοπορήσει πολλάκις στην κατανόηση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Η παρούσα μελέτη αποτελείται από δύο μέρη: α) το γενικό μέρος όπου παρατίθενται πληροφορίες i) για τους μεταγραφικούς παράγοντες, τη δομή, τον τρόπο δράσης και τον ρόλο τους γενικά και ειδικότερα στην αιμοποίηση και ii) για τις μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν και β) το ειδικό μέρος που περιλαμβάνει τα υλικά και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν, τα αποτελέσματα, τη συζήτηση και τα συμπεράσματα, την περίληψη και τις βιβλιογραφικές αναφορές. Το μέρος της μελέτης με τους ιικούς φορείς και τους μεταλλαγμένους ποντικούς διενεργήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Ουάσινγκτον, στο Σηάτλ των ΗΠΑ. Η μελέτη της έκφρασης στους ανθρώπινους ιστούς έγινε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Τομέα Βιολογικών Επιστημών και Προληπτικής Ιατρικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης. Είμαι σήμερα πολύ ευγνώμων που μου δόθηκε η ευκαιρία να βάλω κι εγώ ένα λιθαράκι στην έρευνα των μοριακών μηχανισμών της γενετικής έκφρασης. Αυτό το οφείλω καταρχήν στο διευθυντή του τομέα ιατρικής γενετικής του Πανεπιστημίου Ουάσιγκτον καθηγητή κ. Γεώργιο Σταματογιαννόπουλο και στον καθηγητή αιματολογίας κ. Ιωάννη Χριστάκη, διευθυντή μου στην αιματολογική κλινική του «Θεαγένειου» Αντικαρκινικού Νοσοκομείου της Θεσσαλονίκης ο οποίος με εκπαίδευσε στην αιματολογία, με ενθάρρυνε και με κατηύθυνε προς την συγκεκριμένη έρευνα. Ευχαριστώ ολόψυχα την καθηγήτρια Βιοχημείας κ α Νόρμα Βαβάτση- Χριστάκη που μου ανέθεσε τη διδακτορική διατριβή, με στήριξε και με καθοδήγησε ερευνητικά και συνέβαλε καθοριστικά στην ολοκλήρωση της συγγραφής της. Την ομότιμη καθηγήτρια κ α Αφροδίτη Δημητριάδου ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε να με συμπεριλάβει στους υποψήφιους διδάκτορες του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας και για την πολύτιμη συμβολή της στη διατριβή. Ευχαριστώ θερμά τον ομότιμο καθηγητή κ. Αλέξανδρο Κώτση ο οποίος, ως μέλος της τριμελούς επιτροπής, συνέβαλε σημαντικά στην εξέλιξη και ολοκλήρωση του έργου. 14

15 Επίσης, ευχαριστώ τους συνεργάτες μου κ. Γρηγόριο Τσόλκα, άμισθο επιστημονικό συνεργάτη του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, για την πολύτιμη βοήθειά του στο πειραματικό μέρος που έγινε στο Εργαστήριο και την κ α Σμαράγδα Ευφραιμίδου, βιολόγο του Αιματολογικού Τμήματος του Νοσ. «Παπαγεωργίου» για τη διευκόλυνση στην επεξεργασία των δειγμάτων των μαρτύρων. Τους συνεργάτες μου στην Αμερική κ α Mari Aker, PhD και κ. David Emery, PhD, αναπληρωτή καθηγητή ιατρικής γενετικής, Chao-Zhong Song, PhD, αναπληρωτή καθηγητή ιατρικής γενετικής και Dr. Qiliang Li, αναπληρωτή καθηγητή ιατρικής γενετικής ευχαριστώ για την εξαιρετικά πολύτιμη βοήθεια, καθοδήγηση και φιλική συμπαράσταση. Επιπλέον οφείλω να ευχαριστήσω την Dr. Μαρία Κούρτη, παιδίατρο, για τα δείγματα από τους ασθενείς με λευχαιμία και τον κ. Γεώργιο Τζημαγιώργη, επίκουρο καθηγητή Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. για τα δείγματα από ασθενείς με καρκίνο πνεύμονα και για τη βοήθεια στην τελική επεξεργασία του κειμένου. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τους γονείς μου, που με υπομονή και θυσίες μου έδωσαν τα εφόδια και με στήριξαν σε όλα τα βήματα της επιστημονικής μου πορείας. 15

16 16

17 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Μεταγραφικοί Παράγοντες Ορισμός- Λειτουργία Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι πρωτεΐνες οι οποίες συνδέονται μέσω ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων του μορίου τους σε συγκεκριμένες περιοχές του DNA, τα στοιχεία απόκρισης (response elements) των γονιδιακών προαγωγέων (promoters) ή ενισχυτών (enhancers). Με τη σύνδεσή τους αυτή ελέγχουν τη μεταγραφή γενετικών πληροφοριών από το γενετικό υλικό στο αγγελιοφόρο RNA (mrna). Αυτό το πετυχαίνουν προσελκύοντας (μεταγραφικοί ενεργοποιητές) ή απωθώντας (μεταγραφικοί καταστολείς) την RNA πολυμεράση στη συγκεκριμένη περιοχή. Στη διαδικασία αυτή συνήθως συμμετέχουν και άλλοι παράγοντες, όπως οι συν-ενεργοποιητές (co-activators) ή συν-καταστολείς (co-repressors) που σχηματίζουν με τους μεταγραφικούς παράγοντες σύμπλεγμα γονιδιακής ενεργοποίησης ή καταστολής αντίστοιχα. Η δράση τους αυτή καθιστά τους μεταγραφικούς παράγοντες βασικούς ρυθμιστές πολυάριθμων κυτταρικών λειτουργιών (1). Μερικές από τις πιο σημαντικές λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν οι μεταγραφικοί παράγοντες στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι: i) Η βασική μεταγραφική δραστηριότητα που ρυθμίζεται από τους «γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες» (GTFs) όπως οι TFIIA, TFIIB, TFIID. ii) Η ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Η ενεργοποίηση ή αδρανοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων επιτρέπει μεταβολές στη μορφολογία, την αναπτυξιακή πορεία και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι Hox και ο παράγοντας που κωδικοποιείται από την περιοχή καθορισμού του φύλου του χρωμοσώματος Υ, ο SRY. iii) Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, κυρίως από μεταγραφικούς παράγοντες που κωδικοποιούνται από ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως ο Myc.

18 iv) Η απάντηση σε εξωτερικά ερεθίσματα, είτε περιβαλλοντικά (παράγοντας θερμικού σοκ, HSF) είτε διακυτταρικά (όπως οι μεταγραφικοί παράγοντες των υποδοχέων των ορμονών) Ταξινόμηση Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί περίπου 2600 πιθανούς μεταγραφικούς παράγοντες, κάνοντάς τους τη μεγαλύτερη οικογένεια πρωτεϊνών (περίπου 10% του συνόλου). Κάθε παράγοντας μπορεί να συνδέεται σε πολλαπλές περιοχές του DNA και να ενεργοποιεί ή καταστέλλει πολλές από αυτές. Επιπλέον, πολλά γονίδια για να ενεργοποιηθούν απαιτούν περισσότερους από έναν μεταγραφικούς παράγοντες αλλά και άλλα βοηθητικά στοιχεία που σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα ενεργοποίησης. Υπάρχουν πολλές ταξινομήσεις των μεταγραφικών παραγόντων αλλά η πιο επικρατής είναι εκείνη που έχει ως βάση τις ομοιότητες των περιοχών του μεταγραφικού παράγοντα που συνδέονται στο DNA, οι οποίες αποκαλούνται «βασικά μοτίβα». Βάσει αυτών των βασικών μοτίβων οι μεταγραφικοί παράγοντες χωρίζονται σε 5 υπερκατηγορίες. Κάθε υπερκατηγορία περιλαμβάνει περισσότερες υποομάδες με διαφοροποιήσεις του βασικού μοτίβου (2): I. Βασικής έλικας-βρόγχου-έλικας (basic helix-loop-helix, leucine zipper) όπως οι: c-myc, NF-1, RF-X, AP-1(-like):c-Fos/c-Jun, CREB, C/EBP-like, bzip / PAR, MyoD, Tal/Twist/Atonal/Hen κ.α. II. Δακτυλίου ψευδαργύρου (zinc finger) όπως οι: παράγοντες-υποδοχείς στεροειδών και θυροειδικών ορμονών (Steroid hormone receptors, Thyroid hormone receptor-like factors), παράγοντες- GATA, TFIIIA, Sp1, Krüppel κ.α. III. Έλικας-στροφής-έλικας (helix-turn-helix) όπως οι: Ubx, Oct, παράγοντες θερμικού σοκ (HSF), Myb, Ets, παράγοντες ρυθμιστές της ιντερφερόνης (Interferon regulatory factors) κ.α. IV. βήτα-πλατφόρμας (beta-scaffold) όπως οι: Rel, NF-kappaB, NF-AT (NFATC1, NFATC2, NFATC3), STAT, p53, Mef2, SRF, TBP, SOX, SRY, TCF-1, SSRP1, MATA, παράγοντες περιοχής ψυχρού σοκ (csd), Runt V. Λοιποί όπως οι: HMGI(Y), E1A, AP2/EREBP, ARF, RAV 18

19 1.1.3 Krüpel-Like Factors Η οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων Sp1/Krüpel-Like Factor (KLF) ανήκει στην υπερκατηγορία παραγόντων με βασικό μοτίβο περιοχής σύνδεσης στο DNA τύπου «Δακτυλίου Ψευδαργύρου». Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν μέχρι σήμερα εξακριβωθεί έξι μέλη στην ομάδα Sp και δεκαεπτά στην ομάδα KLF (2). Οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας αυτής χαρακτηρίζονται από την παρουσία τριών παρόμοιων δακτυλίων ψευδαργύρου τύπου Κυστεΐνης- Ιστιδίνης (Cys 2 /His 2 ) κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο του πρωτεϊνικού τους μορίου. Οι δακτύλιοι αυτοί συνδέουν τους παράγοντες KLF σε περιοχές του DNA που περιέχουν στοιχεία απόκρισης τα οποία φέρουν την νουκλεοτιδική αλληλουχία GC/CACCC. Ο ψευδάργυρος των δακτυλίων, στερούμενος οξειδο-αναγωγικής δράσης, είναι ιδιαίτερα κατάλληλος ώστε να σταθεροποιεί πρωτεϊνικά συμπλέγματα ενώ η τετραεδρική δομή του δίνει στους δακτυλίους μορφή που διευκολύνει την επαφή του πολυπεπτιδίου με το DNA. Σχηματική αναπαράσταση του δακτυλίου ψευδαργύρου. Ο ψευδάργυρος (πράσινο) συνδέεται με δύο μόρια ιστιδίνης και δύο μόρια κυστεΐνης Η σύνδεση ενός KLF (μπλε) στο DNA (πορτοκαλί) Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν δράση ενεργοποιητή, καταστολέα ή και τα δύο (2-9). Ο ίδιος παράγοντας μπορεί να έχει διαφορετική δράση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων αλλά και μέσα στο ίδιο κύτταρο, στα διαφορετικά στοιχεία απόκρισης και γονίδια στα οποία συνδέεται. Συνδεόμενοι με τα στοιχεία απόκρισης GC/CACCC διαφόρων γονιδιακών ενισχυτών οι KLF ρυθμίζουν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αύξηση και η διαφοροποίηση και είναι ουσιαστικοί για την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. 19

20 Η μελέτη του μοριακού μηχανισμού με τον οποίο δρουν έχει δείξει ότι διάφορα μέλη της οικογένειας αυτής σχηματίζουν συμπλέγματα ενεργοποίησης ή καταστολής με πολυάριθμους γονιδιακούς συν-ενεργοποιητές, όπως οι CBP/p300, PCAF, SWI/SNF ή συν-καταστολείς, όπως οι CtBP και msin3α (7, 10-40). Ωστόσο, γνωρίζουμε ελάχιστα γύρω από τα γονίδια στόχους και την in vivo δράση των περισσότερων από αυτούς. Στην μελέτη τους δεν βοηθάει καθόλου και το γεγονός ότι έχουν όλοι παρόμοιες ειδικότητες και ιδιότητες σύνδεσης με τα στοιχεία απόκρισης GC/CACCC, τουλάχιστον in vitro και πολλοί εκφράζονται σε όλους τους τύπους κυττάρων και σε όλα τα στάδια της ανάπτυξής τους. Οι περισσότερο κατανοητοί ως προς τη λειτουργία τους μέχρι τώρα είναι: α) Ο Sp1, το «ιδρυτικό» μέλος της οικογένειας. Ανιχνεύτηκε στις αρχές της δεκαετίας του 1980 (41-49) και ήταν ένας από τους πρώτους μεταγραφικούς παράγοντες που απομονώθηκαν, κλωνοποιήθηκαν και μελετήθηκαν σε κύτταρα θηλαστικών (9, 44, 47-93). Εκφράζεται καθολικά και συνδέεται σε στοιχεία απόκρισης πολλών βασικών (housekeeping) γονιδίων. Αυτό μας κάνει να πιστεύουμε ότι είναι ένας «γενικός» μεταγραφικός παράγοντας που συμβάλλει στη βασική μεταγραφική δραστηριότητα όλων των τύπων κυττάρων και συμμετέχει στην κυτταρική ανάπτυξη. Η απάλειψή του σε ποντικούς (knockout) οδηγεί σε μεγάλες μορφολογικές διαταραχές πολύ νωρίς, κατά την εμβρυϊκή εξέλιξη (94). Ωστόσο, Sp1 -/- εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα αυξάνονται φυσιολογικά και συμμετέχουν στην εμβρυϊκή ζωή των ποντικών μέχρι την 11 η εμβρυϊκή ημέρα, γεγονός που δείχνει ότι ο Sp1 δεν είναι αναντικατάστατος για την κυτταρική ανάπτυξη. Πιθανώς να έχει έναν ειδικό ρόλο στην επιβίωση των μη πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, ειδικά κατά την πορεία της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Η δράση του, όπως και των περισσότερων παραγόντων της οικογένειας, ρυθμίζεται με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η γλυκοσυλίωση και η φωσφορυλίωση, υποκινούμενες από εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια ερεθίσματα, όπως διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, αντιμεταβολίτες, σήματα διαφοροποίησης, ογκογονίδια και άλλα. Οι Sp3 και Sp4 φαίνονται επίσης να συμμετέχουν στην κυτταρική ανάπτυξη, όπως ο Sp1, αν και οι αντίστοιχοι ομόζυγοι knockout ποντικοί επιβιώνουν μέχρι τη γέννηση ενώ πολύ λίγα γνωρίζουμε για τον Sp2 (2, ). β) O KLF1 ή EKLF (Erythroid Krüpel-Like Factor). Είναι ο πρώτος και αρχετυπικός παράγοντας της κατηγορίας των Krüpel-Like Factors στα κύτταρα των 20

21 θηλαστικών ( ). Είναι ένας ειδικός μεταγραφικός παράγοντας, καθότι εκφράζεται σχεδόν κατά αποκλειστικότητα στα κύτταρα της ερυθράς σειράς, τόσο στον άνθρωπο όσο και στους ποντικούς (25, 29, 31, 32, 35, 39, 40, 110, 111, ). Στα κύτταρα αυτά ο EKLF συνδέεται με το στοιχείο απόκρισης CACCC του προαγωγέα της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης και είναι απαραίτητος για την αλλαγή (switching) από την εμβρυϊκή άλυσο γ της αιμοσφαιρίνης στην αλυσίδα β κατά τους πρώτους μήνες της εξωμήτριας ζωής (31, 33, 36, 37, 96, , ). Ποντίκια klf1 -/- (knockout) πεθαίνουν την 14.5 η εμβρυϊκή ημέρα από β-θαλασσαιμία (126, 127). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι ο EKLF επίσης ελέγχει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ερυθροκυτταρική διαφοροποίηση, τη σταθερότητα της κυτταρικής μεμβράνης και την ομοιόσταση της αιμοσφαιρίνης (21, 25, 109, 122, 128, 129). Επίσης ενεργοποιεί τον προαγωγέα του KLF3 στα ερυθροκύτταρα (130). Η ανάλυση του EKLF έδωσε πολλά στοιχεία για τη δομή, το μηχανισμό δράσης και τον ρόλο των KLF. Το πρωτεϊνικό του μόριο περιέχει 362 αμινοξέα και η στερεοτακτική του δομή περιλαμβάνει τρεις δακτυλίους ψευδαργύρου τύπου C2H2 πολύ κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο (40, 118). Ακριβώς δίπλα στην αμινοτελική πλευρά των δακτυλίων βρίσκεται μια περιοχή πλούσια σε βασικά αμινοξέα που πιστεύεται πως είναι σημαντική για τον τροπισμό του παράγοντα προς τον πυρήνα του κυττάρου. Το αμινοτελικό του άκρο είναι πλούσιο σε προλίνη, σερίνη, θρεονίνη και όξινα αμινοξέα που είναι σημαντικά για την μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή. Η δραστική περιοχή του EKLF περιλαμβάνει τόσο ενεργοποιητικά όσο και ανασταλτικά στοιχεία, τα πρώτα μεταξύ των αμινοξέων 20 έως 124 και τα δεύτερα στο τμήμα 196 έως 291. Η ενεργοποιητική περιοχή επίσης συμμετέχει στη αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες και η λειτουργία του παράγοντα επηρεάζεται πιθανώς από τη φωσφορυλίωση και τη στερεοτακτική της διάταξη (32, 36, 39, 123, 131). Σημαντικό στοιχείο στην κατανόηση του μηχανισμού της μεταγραφικής δράσης του EKLF αποτέλεσε η παρατήρηση ότι στα klf1 -/- ποντίκια η χρωματίνη της περιοχής του προαγωγέα της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης παραμένει σε κλειστή, στη μεταγραφική επεξεργασία, διαμόρφωση (ετεροχρωματίνη). Το άνοιγμα της χρωματίνης από τον EKLF φαίνεται πως γίνεται μέσω της προσέλκυσης ενός πρωτεϊνικού συμπλέγματος, του E-RC1 (EKLF co-activator-complex), το οποίο μοιάζει με το σύμπλεγμα SWI/SNF που ξετυλίγει τη χρωματίνη και ενεργοποιεί 21

22 διάφορα γονίδια του ζυμομύκητα (34). Το σύμπλεγμα ενεργοποίησης του EKLF περιλαμβάνει επίσης συν-ενεργοποιητές με δράση ιστονικής ακετυλ-τρανσφεράσης (HATs) (21, 25, 27, 29, 31-37, 39, 40, 96, 110, 111, , , 127, 131). Η ακετυλίωση της χρωματίνης οδηγεί σε ενεργοποίηση ενώ η μεθυλίωση σε αδρανοποίηση της γονιδιακής έκφρασης. Οι HATs που αλληλεπιδρούν με τον EKLF είναι οι ευρέως γνωστοί CBP, p300 και P/CAF. Οι δύο πρώτοι ακετυλιώνουν και τον ίδιο τον EKLF στην ανασταλτική του περιοχή (19, 22, 24, 29, ). Ο EKLF συνδέεται ισχυρά στο στοιχείο απόκρισης CACCC του προαγωγέα του γονιδίου της αλύσου β και πολύ ασθενέστερα στο παρόμοιο στοιχείο του γονιδίου της γ αλύσου. Πιθανολογείται πως υπεύθυνη γι αυτό είναι η παρουσία άλλων στοιχείων κοντά στα γονίδια αυτά που υποβοηθούν ή αναστέλλουν τη σύνδεση του EKLF. H διαφορά αυτή, σε συνδυασμό με την ψηλότερη έκφραση του παράγοντα στον ερυθροποιητικό ιστό των ενηλίκων σε σχέση με τα έμβρυα, οδήγησε στην υπόθεση ότι ο EKLF συνδέεται με την στροφή από τη γ στη β άλυσο (37, 39, 123, ) και έδωσε το έναυσμα για την αναζήτηση και άλλων παραγόντων με ανάλογη δράση. Συνοψίζοντας τα ανωτέρω στοιχεία, ο EKLF είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται ειδικά στον ενήλικο ερυθροποιητικό ιστό, υφίσταται μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, υποκινούμενες κατά πάσα πιθανότητα από εξωτερικά ερεθίσματα και ενεργοποιεί τον προαγωγέα της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης μέσω και τροποποιήσεων της δομής της χρωματίνης, συνεπικουρούμενος από μια σύνθετη ομάδα από συν-ενεργοποιητές. γ) Άλλοι KLF. Με σημείο εκκίνησης την νουκλεοτιδική αλληλουχία των δακτυλίων ψευδαργύρου του EKLF έχουν ανιχνευθεί συνολικά 16 μεταγραφικοί παράγοντες, με σημαντικές ομολογίες στην περιοχή σύνδεσής τους στο γενετικό υλικό των κυττάρων των θηλαστικών. Ανάλογοι παράγοντες έχουν διαπιστωθεί και σε άλλες κατηγορίες οργανισμών, όπως η κότα, η δροσόφιλα και το ψάρι- ζέβρα (zebrafish) και οι αναλογίες αυτές βοήθησαν στη, μερική έστω, εξιχνίαση των ρόλων αρκετών από αυτούς σε συνδυασμό με πειράματα ολικής ή μερικής εξάλειψης των παραγόντων αυτών από το γενετικό υλικό ποντικών. Ο KLF2 ή LKLF (Lung Krüpel-Like Factor) συμβάλλει στη διαμόρφωση των αιμοφόρων αγγείων και των πνευμόνων αλλά και στον προγραμματισμό, τη μετανάστευση και την επιβίωση των Τ λεμφοκυττάρων (17, 19, 30, 146). Τα klf2 22

23 αρνητικά ποντίκια πεθαίνουν μεταξύ 12.5 και 14.5 ης εμβρυϊκής ημέρας από ελαττωματική ρύθμιση της καρδιακής εξώθησης και καρδιακή ανεπάρκεια, ενώ οι πνεύμονές τους αρχικά αναπτύσσονται φυσιολογικά (30). Ο KLF2, επίσης, αναστέλλει την ωρίμανση των λιποκυττάρων καταστέλλοντας την έκφραση του σημαντικού τους μεταγραφικού παράγοντα Ppary (30). Ο KLF3 ή BKLF (Basic Krüpel-Like Factor) πιθανώς συνεργάζεται με τον EKLF στην καταστολή της γ αλύσου της αιμοσφαιρίνης αλλά εκφράζεται, εκτός από τον αιμοποιητικό και σε άλλους ιστούς, όπως ο ηπατικός, πνευμονικός, μυϊκός και εγκεφαλικός (16, 38, 130, 139, ). Ο KLF4 ή GKLF (Gut-enriched Krüpel-Like Factor) εκφράζεται εντονότερα στον επιθηλιακό ιστό του γαστρεντερικού σωλήνα και σχετίζεται με την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω καταστολής του προαγωγέα της κυκλίνης D1, αλλά και με την τελική διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων και την ακεραιότητα της δομής του δέρματος των ποντικών. Επίσης ο KLF4 ανήκει στην ομάδα 4 «πολυδύναμων» γονιδίων που είναι ικανά να μετατρέπουν ινοβλάστες σε πολυδύναμα εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα (ES cells) (14, 23, 26, 101, ). Ο KLF5 ή IKLF (Intestinal-enriched Krüpel-Like Factor) είναι πιθανώς συμπληρωματικός με τον KLF4 στο εντερικό επιθήλιο και, όπως ο KLF3, συμβάλλει στην διαφοροποίηση του λιπώδη ιστού μέσω ρύθμισης της έκφρασης του μεταγραφικού τους παράγοντα Ppary. Τα klf5 αρνητικά ποντίκια πεθαίνουν πριν από την 8.5 η εμβρυϊκή ημέρα από διαταραχές στην αγγειογένεση και στην αντίδραση των αιμοφόρων αγγείων σε τραύμα (20, 23, 159, 161). Ο KLF6 ή CPBP (Core promoter binding protein) ή GBF (GC-rich sites binding factor) ή Zf9 εκφράζεται σε πλείστους ιστούς, όπως των νεφρών, νευρικού συστήματος, καρδιάς, πνευμόνων και εντέρου ως απάντηση σε φυσιολογικά ερεθίσματα. Τα ποντίκια από τα οποία έχει απαλειφθεί πεθαίνουν την 12.5 η εμβρυϊκή ημέρα από διαταραχές στην ερυθροποίηση και την αγγείωση του λεκιθικού ασκού. Εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα αρνητικά για τον KLF6 είναι λιγότερο ικανά να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται σε καλλιέργειες. Πιθανώς επίσης εμπλέκεται στην ίνωση του ήπατος αλλά και στην ινωδόλυση, προκαλώντας την ενεργοποίηση των γονιδίων του κολλαγόνου και του ενισχυτή του πλασμινογόνου της ουροκινάσης (upa) αντίστοιχα (11, 18, 26, ). 23

24 Ο KLF7 ή UKLF (Ubiquitous Krüpel-Like Factor) μοιάζει με τον KLF6 και εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ιστούς σε χαμηλά επίπεδα αλλά εμφανίζει υψηλή έκφραση στο νευρικό ιστό, στην ανάπτυξη του οποίου έχει σημαντικό ρόλο. Ποντίκια χωρίς τον klf7 πεθαίνουν τη 2 η ημέρα μετά τη γέννησή τους από εκτεταμένες νευρολογικές διαταραχές που προέρχονται από μη σωστή ανάπτυξη των νευραξόνων και αυξημένη απόπτωση των αισθητικών νευρώνων. Κυρίως προσβάλλονται οι οσφρητικές κι οπτικές οδοί, ο εγκεφαλικός φλοιός και ο ιππόκαμπος (153, ). Ο KLF8 ή BKLF3 (Basic Krüpel-Like Factor 3) ή ZNF741 είναι συγγενής με τους KLF3 και 12, ασκώντας κατασταλτική μεταγραφική δράση (150, 153, 154, 168, 169). Ο KLF9 ή BTEB (Basic transcription element- binding protein) συνδέεται σε στοιχεία απόκρισης τύπου GC, άλλοτε ενεργοποιώντας τα και άλλοτε καταστέλλοντας τα. Όπως και ο KLF6 φαίνεται να παίζει ρόλο στην ηπατική ίνωση και την αλκοολική κίρρωση αλλά επίσης έχει συσχετισθεί με τις ορμονικές αλλαγές του ενδομήτριου κατά την εγκυμοσύνη και με την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Τα ποντίκια χωρίς αυτόν έχουν ήπιες νευρολογικές διαταραχές και φυσιολογική καμπύλη επιβίωσης αλλά τα θηλυκά εμφανίζουν υπογονιμότητα, λόγω ελάττωσης της ανταπόκρισης του ενδομήτριου στην προγεστερόνη, του υποδοχέα της οποίας ο KLF9 αποτελεί συμπαράγοντα (63, 73, 75, 153, ). Ο KLF12 ή AP2rep καταστέλλει τη μεταγραφή ενός σημαντικού άλλου μεταγραφικού παράγοντα των θηλαστικών, του AP-2a (13, 153, 154, 180). Ο KLF15/ KKLF περιορίζει την υπερτροφία του μυοκαρδίου ως απάντηση σε υπερφόρτωση σε ενδαγγειακό όγκο υγρών, ελέγχοντας τη δράση των προυπερτροφικών παραγόντων GATA-4 και MEF2 (myocyte enhancer factor-2). Επίσης, όπως οι KLF3 και KLF5, ελέγχει τη διαφοροποίηση του λιπώδη ιστού μέσω επίδρασης στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Ppary. Τα klf15 αρνητικά ποντίκια αναπτύσσουν εύκολα προκλητή καρδιακή ανεπάρκεια κι έχουν διαταραχή στην ανάπτυξη του λιπώδη ιστού (13, 181). Πολύ λίγα είναι έως σήμερα γνωστά για τους KLF14/ Sp6 (85, 153, ), τον KLF16 (153, 184) και KLF17 (185). δ) Συγγενείς προς τον FKLF1 KLFs. 24

25 Ο KLF10- TIEG1 (TGF-β1 induced early gene 1) είναι ο πρώτος μιας υποομάδας KLFs με σημαντική ομολογία αμινοξέων που περιλαμβάνει τον παράγοντα της μελέτης μας FKLF1/TIEG2/FKLF1 και τον πρόσφατα περιγραφέντα TIEG3. Περιγράφηκε το 1995 ως το προϊόν ενός γονιδίου που επαγόταν από τον TGF-β1 σε κυτταρικούς πληθυσμούς οστεοβλαστών (189). Τα klf10 αρνητικά ποντίκια έχουν διαταραχές στην ανάπτυξη των οστών, με αυξημένο αριθμό δυσλειτουργικών οστεοβλαστών και διαταραχή στη ωρίμανση των οστεοκλαστών (186). Τα οστά των ζώων αυτών είναι εύθραυστα, με ελαττωμένα οστεοκύτταρα, οστική μάζα, πυκνότητα και μέγεθος με συνέπεια σκελετικές ανωμαλίες. Σε μεγάλη ηλικία τα ποντίκια αυτά εμφανίζουν επίσης καρδιακή υπερτροφία. Ο KLF10 αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 480 αμινοξέων που, πέρα από τους δακτυλίους ψευδαργύρου του καρβοξυτελικού άκρου, οι οποίοι τη συνδέουν σε στοιχεία απόκρισης τύπου GC στο DNA, περιέχει επίσης τρεις, ανεξάρτητες μεταξύ τους, περιοχές μεταγραφικής καταστολής (R1, R2, R3) κοντά στο αμινοτελικό άκρο (187). Εκτός από τον TGF-β1 η σύνθεση του KLF10 επάγεται και από άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως ο BMP2 (μορφοποιητικός παράγοντας των οστών-2) (188) και ο EGF (επιδερμικός αυξητικός παράγοντας) (189) στους οστεοβλάστες, ο θρεπτικός ορός, ο φορβολικός εστέρας και ο EGF σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη -όπου περιγράφηκε ως EGRa (early growth response a) (190, 191)- αλλά και από ορμόνες. Συγκεκριμένα η έκφρασή του αυξάνεται απότομα, μετά από επίδραση 17β-οιστραδιόλης, σε θετικά για τον υποδοχέα οιστρογόνων (ER) ανθρώπινα εμβρυϊκά οστεοβλαστικά κύτταρα. Αντίθετα, ανδρογόνα όπως η 5 α - διυδροτεστοστερόνη (DHT) αναστέλλουν την έκφραση του TIEG1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου προστάτη (191). Ο KLF10 βρέθηκε πως έχει κατασταλτική μεταγραφική δράση και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό επιθηλιακών, μεσεγχυματικών, νευρικών και οστεοβλαστικών κυττάρων, ενώ η έκφρασή του είναι ελαττωμένη σε καρκινικά κύτταρα μαστού και προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει αντι-πολλαπλασιαστική δράση (191). Ο επαγωγέας του KLF10, ο TGF-β1, είναι ένας ισχυρός αναστολέας του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (10, 84, 184, 186, ). Η δράση του αυτή ασκείται εν μέρει μέσω επαγωγής της απόπτωσης, διαδικασία στην οποία φαίνεται να εμπλέκεται ο KLF10, τουλάχιστον σε κυτταρικές σειρές παγκρέατος (192), ήπατος (202) κι 25

26 επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (192, 197, 199) όπου αυτό έχει μελετηθεί. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός πως η απόπτωση στην ηπατική κυτταρική σειρά Hep 3B δεν προκαλείται μέσω της επαγωγής των γνωστών προ-αποπτωτικών γονιδίων Bax ή Bcl-X L αλλά μέσω της παραγωγής δραστικών ριζών οξυγόνου και απώλεια του ηλεκτρικού δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Ο μηχανισμός αυτός απόπτωσης θυμίζει τη δράση του p53, ο οποίος προκαλεί επαγωγή οξειδοαναγωγικών γονιδίων τα οποία παράγουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που βλάπτουν τα μιτοχόνδρια και προκαλούν απόπτωση. Κάτι ανάλογο γίνεται πιθανώς και με τον KLF10 (203). O KLF13 ή FKLF2 (Fetal Krüpel-Like Factor-2) περιγράφηκε αρχικά ως ειδικός μεταγραφικός παράγοντας του ερυθροποιητικού ιστού, ικανός να ενεργοποιεί ισχυρά τον προαγωγέα της γ και λιγότερο εκείνους της ε και β αλύσου της αιμοσφαιρίνης (205). Ωστόσο σε περαιτέρω μελέτες ανιχνεύτηκε και σε άλλους ιστούς, ενώ οι ποντικοί στους οποίους εξαλείφθηκε, οι οποίοι μελετήθηκαν από τον γράφοντα, δεν παρουσιάζουν διαταραχές στην ερυθροποίηση κατά την εμβρυϊκή ή την ενήλικη ζωή (ανέκδοτες παρατηρήσεις). Επίσης ενεργοποιεί μια χυμοκίνη, τον RANTES που εμπλέκεται στην διέγερση των Τ λεμφοκυττάρων και καταστέλλει σε αυτά τον αντι-αποπτωτικό παράγοντα Bcl-xL προκαλώντας ελαττωμένη απόπτωσή τους και διόγκωση του θύμου και του σπλήνα (206). Στον βάτραχο Xenopus ο KLF13 είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη της καρδιάς, αλληλεπιδρώντας με τον μεταγραφικό παράγοντα GATA-4 στη ρύθμιση καρδιακών γονιδίων στόχων (3). ε) Ο FKLF1 ή KLF11 ή TIEG2/TIEG3 περιγράφηκε αρχικά σχεδόν ταυτόχρονα από τους Cook T, Urrutia R και συνεργάτες ως TIEG2 (TGF-β inducible early gene) (60) σε ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα και σε κύτταρα ωοθηκών από κινέζικα χάμστερ και από τους Asano H, Stamatoyannopoulos G και συνεργάτες ως FKLF (Fetal KLF) -ο οποίος μετονομάστηκε FKLF1 μετά την ανακάλυψη του FKLF2- σε εμβρυϊκά ερυθροποιητικά κύτταρα (28). Εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς σε διαφορετικό βαθμό, με ψηλότερα επίπεδα έκφρασης στον παγκρεατικό, μυϊκό και εμβρυϊκό ερυθροποιητικό ιστό. Είναι κατά 91% ανάλογος με τον KLF10 στην περιοχή των δακτυλίων ψευδαργύρου (περιοχή σύνδεσης στο DNA) και κατά 44% στην αμινοτελική περιοχή (ρυθμιστική της δράσης). Επάγεται, όπως και ο KLF10, από τον TGF-β1 κι έχει ανασταλτική 26

27 μεταγραφική δράση και προ-αποπτωτικές και αντι-πολλαπλασιαστικές ιδιότητες (28, 60, 187). Η ανασταλτική μεταγραφική του δράση ασκείται χάρη σε μια παρόμοια με τον KLF10 δομή τριών μεταγραφικών ανασταλτικών περιοχών (R1, R2, R3) στην αμινοτελική του περιοχή (187). Ίσως η πιο σημαντική κατασταλτική της μεταγραφής περιοχή του είναι μία διαμόρφωση α-έλικας στην ανασταλτική περιοχή R1, η οποία αλληλεπιδρά με το σύμπλεγμα ιστονικής απο-ακετυλίωσης msin3a και ονομάζεται SID (msin3a interacting domain). Η προ-αποπτωτική (υπέρ της απόπτωσης) ενέργειά του γίνεται με τρεις μηχανισμούς: i) μέσω ενεργοποίησης της κασπάσης-3 (207). ii) με μεταγραφική καταστολή της σύνθεσης της πρωτεΐνης Smad7 που έχει αρνητική παλίνδρομη δράση στην οδό μεταφοράς σήματος του TGF-β. Με αυτό τον τρόπο επιτείνεται η προ-αποπτωτική και αντι-πολλαπλασιαστική δράση του TGF-β (173, 197, 208, 209). iii) Τέλος ο FKLF1 προκαλεί μεταγραφική μείωση των επιπέδων της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-X(L) (207). Για την TGF-β σχετιζόμενη αντι-πολλαπλασιαστική δράση κεντρικό ρόλο φαίνεται να παίζει η συμμετοχή του FKLF1 στην καταστολή του πρωτοογκογονιδίου c-myc. Σε καρκινικά παγκρεατικά κύτταρα με μεταλλάξεις του ογκογονιδίου Ras η από τον FKLF1 καταστολή του c-myc αντισταθμίζεται από μια υπέρ-ενεργοποιημένη κινάση, την ERK (extracellular signal-regulated kinase), η οποία αφενός αναστέλλει τη σύνδεση του FKLF1 με τον συν-ενισχυτή msin3a μέσω φωσφορυλίωσης και αφετέρου εμποδίζει τη σύνδεση του συμπλέγματος αυτού με την περιοχή του ενισχυτή του c-myc που καταστέλλεται από τον TGF-β (TGF-β inhibitory element- TIE) (75, 173, 204). Με αυτόν αλλά και άλλους μηχανισμούς τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα χάνουν τον έλεγχο του c-myc. Πέρα από την εμπλοκή του FKLF1 στην αποπτωτική και αντιπολλαπλασιαστική οδό του TGF-β1, ελάχιστα είναι ακόμη και σήμερα γνωστά σχετικά με άλλες, ειδικές λειτουργίες του στα περισσότερα ανθρώπινα όργανα ή των ομολόγων του παραγόντων σε άλλους οργανισμούς, όπως οι ποντικοί. Όπως συμβαίνει με άλλους παράγοντες της ομάδας είναι πιθανή η εμπλοκή του στη γένεση ή εξέλιξη διαφόρων εντοπισμένων ή συστηματικών παθήσεων. Ενδιαφέρον 27

28 προκάλεσε το γεγονός ότι η υπερέκφρασή του σε κύτταρα παγκρέατος οδηγεί σε καταστολή του πολλαπλασιασμού τους, όπως επίσης και σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της προϊνσουλίνης (60, 208), γεγονός που οδήγησε στη μελέτη πιθανής εμπλοκής τριών γονιδιακών πολυμορφισμών του (Q62R, A347S και T220M), που οδηγούν σε ελάττωση ή κατάργηση της σύνθεσής του, στην παθογένεση του σακχαρώδη διαβήτη. Ωστόσο σε μια μεγάλη πληθυσμιακή μελέτη μια τέτοια συσχέτιση δεν βρέθηκε, παρόλο που πιθανολογείται πως ο πρώτος τουλάχιστον πολυμορφισμός (Q62R) αυξάνει ελαφρά τον κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου (210). Πιθανολογείται επίσης εμπλοκή διαταραχών του στη δημιουργία οστικής νόσου, όπως οστεοπενία και οστεοπόρωση και στην πρόκληση υπερτροφικής καρδιομυοπάθειας (191). Ο FKLF1 έχει επίσης την ικανότητα να επάγει την έκφραση της ε, γ και λιγότερο της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης, κινητοποιώντας τους προαγωγείς τους σε πειράματα σε κυτταρικές σειρές, in vitro (28). Οι φυσιολογικές συνέπειες αυτής της δράσης του δεν έχουν ακόμη εξακριβωθεί. Είναι πιθανή επίσης κάποια ογκοκατασταλτική του δράση, χάρη στην αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτική του δράση σε επιθηλιακά κύτταρα, με πιθανό ρόλο στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη (177, 191). Αρχικά μελετήσαμε τον FKLF1 χάρη στην ικανότητά του επαγωγής των εμβρυϊκών αλύσεων της αιμοσφαιρίνης, με την ελπίδα να τον χρησιμοποιήσουμε στη γονιδιακή θεραπεία της β-μεσογειακής και δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Η επαγωγή συγκεκριμένα της γ αλύσου μεταφράζεται σε επαγωγή της σύνθεσης και αύξηση της ποσοστιαίας αναλογίας της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF). Η HbF μπορεί να λειτουργήσει στη θέση της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων HbA και να δεσμεύσει την περίσσεια α αλύσεων που οδηγούν στην καταστροφή των άωρων ερυθροκυττάρων στη β-μεσογειακή αναιμία ( ). Επίσης τα αυξημένα επίπεδά της εμποδίζουν την καθίζηση της παθολογικής αιμοσφαιρίνης S (HbS) που προκαλεί τη δρεπάνωση στη δρεπανοκυτταρική νόσο (213, 214). Συνεπώς η επαγωγή της σύνθεσης της γ αλύσου και κατ επέκταση της HbF στα πρώιμα ερυθροκύτταρα θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την κλινική εικόνα των παθήσεων αυτών. Η επαγωγή της HbF από ρετροϊικούς φορείς θα μπορούσε να επιτευχθεί με δύο τρόπους: α) με την κλασική προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας, δηλαδή την εισαγωγή στο DNA ενός ιικού φορέα που εκφράζει τη γ άλυσο υπό την επίδραση 28

29 ενός ισχυρού ενισχυτή και προαγωγέα. Η μέθοδος αυτή ωστόσο έχει αποτύχει έως σήμερα να αποδώσει σταθερά υψηλά επίπεδα έκφρασης γ αλύσου, ενώ απαιτεί την εισαγωγή στο γενετικό υλικό πολυάριθμων αντιγράφων του φορέα, γεγονός που ενέχει κινδύνους μεταλλαξιγένεσης (215). β) Η εισαγωγή ενός ιικού φορέα που εκφράζει έναν ισχυρό επαγωγικό της γ αλύσου μεταγραφικό παράγοντα, θα μπορούσε να αποτελέσει εναλλακτική λύση. Για να διαπιστώσουμε εάν η αύξηση των επιπέδων του FKLF1 θα μπορούσε να πετύχει υπερέκφραση HbF σε αιμοποιητικά κύτταρα, δημιουργήσαμε αρχικά έναν ρετροϊικό φορέα έκφρασης του FKLF1 και τον δοκιμάσαμε σε κύτταρα ερυθρολευχαιμίας ποντικού MEL και σε αποικίες ερυθροβλαστών ποντικού που φέρει ανθρώπινο γονίδιο γ αλύσου, in vitro. Κατόπιν δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα του φορέα αυτού in vivo σε μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού οστών ενηλίκων ποντικών που έφεραν το ανθρώπινο γ γονίδιο. Μετά προχωρήσαμε σε απάλειψη του ομόλογου γονιδίου του FKLF1 - του Tieg2 - και σε υπερέκφραση του FKLF1 σε διαγονιδιακούς ποντικούς και διερευνήσαμε, πέρα από τις επιδράσεις στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης, τυχόν συνέπειες της διαταραχής του στη συνολική ερυθροποίηση αλλά και σε άλλα όργανα και συστήματα. Τέλος εξετάσαμε και τα επίπεδα έκφρασης του σε ανθρώπινους φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ιστούς, διερευνώντας πιθανή εμπλοκή του στη γένεση ή την εξέλιξη κακοήθων νεοπλασιών. 29

30 1.2 Η μεταγραφική ρύθμιση της αιμοποίησης Γενικά Ο όρος αιμοποίηση αναφέρεται στο σχηματισμό και την ανάπτυξη των ώριμων κυττάρων του αίματος που περιλαμβάνει πολλαπλασιασμό, εξελικτική δέσμευση (commitment) και διαφοροποίηση από προγονικά κύτταρα. Με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η αντικατάσταση των γερασμένων ή κατεστραμμένων κυττάρων του αίματος και η ομοιοστασία του αίματος υπό κανονικές συνθήκες αλλά και η προσαρμογή σε καταστάσεις στρες που είναι απαραίτητη για την άμυνα του οργανισμού απέναντι σε παθογόνους παράγοντες. Δεδομένου του ζωτικού ρόλου του αίματος στη λειτουργία του σώματος, γίνεται κατανοητό πως η ρύθμιση της αιμοποίησης δε μπορεί παρά να είναι περίπλοκη, ανταποκρινόμενη σε ποικίλα εσωτερικά και εξωτερικά ερεθίσματα. Ο αιμοποιητικός ιστός αποτελείται από ένα σύνθετο σύστημα οργάνων, με κέντρο το μυελό των οστών, από τον οποίο προέρχονται και στα οποία διαφοροποιούνται και ωριμάζουν τα αρχέγονα (στελεχιαία) κύτταρα προς οκτώ κυτταρικές σειρές: ερυθρά, μεγακαρυοκυτταρική, μυελική (ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, βασεόφιλα, εωσινόφιλα), λεμφική (Β, Τ) και μονοκυτταρική. Κατά καιρούς αρκετά μοντέλα έχουν προτείνει την ρύθμιση της αιμοποίησης εξωγενώς -μέσω αιμοποιητικών αυξητικών παραγόντων, άλλων κυττοκινών και αλληλεπιδράσεων με τα στρωματικά κύτταρα ή άλλα στοιχεία του αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντος- ή ενδογενώς -στοχαστικά μοντέλα- ή με συνδυασμό των δύο (1). Μέσα στο αιμοποιητικό μικροπεριβάλλον τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα διαχωρίζονται σε «φωλιές» (niches) όπου αλληλεπιδρούν με άλλα κύτταρα και παράγοντες τις εξωκυττάριας ουσίας, αλληλεπίδραση που καθορίζει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους όπως και των απογόνων τους, των πρόδρομων εξελικτικά δεσμευμένων κυττάρων (216). Δεν είναι ωστόσο ακόμη ξεκάθαρο το κατά πόσο συμβάλλουν οι εξωκυττάριοι αυτοί παράγοντες και σε πιο βαθμό είναι γενετικά καθορισμένο το προς ποια κατεύθυνση θα διαφοροποιηθούν τα αρχέγονα κύτταρα, ερώτημα που πρόσφατα αναθερμάνθηκε με τις παρατηρήσεις της ικανότητας ακόμη και δεσμευμένων κυττάρων για από- και ανά-διαφοροποίηση (trans-differentiation) προς, ακόμη και 30

31 μακρινούς συγγενικά, τύπους κυττάρων κάτω από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας (217). Συνολικά τα αιμοποιητικά κύτταρα αντιδρούν στα εξωκυτταρικά, διακυτταρικά και ενδοκυτταρικά τους ερεθίσματα με ενεργοποίηση οδών σημάτων (signaling pathways), συχνά εν είδη καταρράκτη (signaling cascades) που συνήθως καταλήγουν σε μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή κάποιων γονιδίων τα οποία καθορίζουν την εξέλιξη του κυττάρου σε συμφωνία με τα γύρω κύτταρα και τις ανάγκες του οργανισμού. Η απορρύθμιση αυτών των οδών, αλληλεπιδράσεων και γονιδιακών ανταποκρίσεων ενοχοποιείται για ένα μεγάλο ποσοστό παθήσεων του αιμοποιητικού ιστού, όπως -για παράδειγμα- οι λευχαιμίες και τα λεμφώματα (218). Είναι λοιπόν σαφές ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες, ως ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, παίζουν κεντρικό ρόλο στην αιμοποίηση. Είτε εξωγενώς είτε ενδογενώς ρυθμιζόμενο το μεταγραφικό περιβάλλον του κυττάρου είναι εκείνο που θα καθορίσει, ρυθμίζοντας τους συνδυασμούς γονιδίων που θα εκφραστούν, την εξελικτική πορεία των αρχέγονων και των πιο ώριμων κυττάρων προς την κατεύθυνση του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της αδράνειας ή απόπτωσης. Η κατανόηση λοιπόν του ελέγχου της αιμοποίησης αλλά και των μοριακών διεργασιών όλων των κυττάρων του ανθρώπινου οργανισμού και του ίδιου του τρόπου με τον οποίο η γονιδιακή ρύθμιση και έκφραση καθορίζει το φαινότυπο των κυττάρων απαιτεί την εξακρίβωση του ρόλου των βασικών αυτών παιχτών που δρουν σε κάθε κύτταρο και σε κάθε στάδιο της ανάπτυξής του. Το καθήκον αυτό, δεδομένου τόσο του μεγάλου αριθμού και των δομικών παραλλαγών των πρωτεϊνών αυτών όσο και της πολυπλοκότητας των αλληλεπιδράσεων, συνεργασιών, ανταγωνισμών, υποκαταστάσεων και των συχνά μεταβαλλόμενων συνδέσεων κι επιδράσεων των μεταγραφικών παραγόντων πάνω στο γονιδίωμα, είναι εξαιρετικά δύσκολο με τις μέχρι τώρα μεθόδους κι αποτελεί ίσως μια από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της σύγχρονης μοριακής βιολογίας. Μέσα από, συχνά επίπονες, μελέτες κάποιες από τις δράσεις των μεταγραφικών παραγόντων έχουν αρχίσει να ξεκαθαρίζουν, ειδικά στον αιμοποιητικό ιστό που είναι ένας από τους καλύτερα μελετημένους, και να μας επιτρέπουν μια πρώτη εκτίμηση της εξαιρετικά σύνθετης εικόνας. 31

32 1.2.2 Μεταγραφικός έλεγχος αιμοποιητικών γονιδίων Α) Συμπληρωματικότητα. Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες φαίνονται να δρουν συμπληρωματικά (redundancy). Για παράδειγμα, οι GATA-1 και GATA-2 που παίζουν κεντρικό, θετικό, ρόλο στη ρύθμιση της ερυθροκυτταρικής και μεγακαρυοκυτταρικής διαφοροποίησης (219). Σε ποντικούς με απαλειφή του GATA-1 (knockout) τα επίπεδα του GATA-2 είναι αυξημένα (220, 221). Φαίνεται λοιπόν να αντισταθμίζεται, εν μέρει, η έλλειψη του πρώτου από τον δεύτερο παράγοντα, γεγονός που φαίνεται να οδηγεί σε περαιτέρω διαφοροποίηση των ανωτέρω σειρών από ότι αν αυτό δε συνέβαινε, όπως φάνηκε και σε άλλες περιπτώσεις knockout ποντικών. Επίσης, ο μεταγραφικός παράγοντας Egr-1 ο οποίος είναι προϊόν ενός γονιδίου πρώιμης απάντησης σε σήματα διαφοροποίησης και ανήκει στην οικογένεια των παραγόντων δακτυλίου ψευδαργύρου - όπως και ο παράγοντας της μελέτης μας -, παρότι είναι σημαντικός για την τελική διαφοροποίηση της μονοκυτταρικής/ μακροφαγοκυτταρικής σειράς, αναπληρώνεται από άλλους παράγοντες της ίδιας οικογένειας και η έλλειψή του δεν προκαλεί διαταραχή της ωρίμανσης (222). Έχει επίσης προταθεί παρόμοια συμπληρωματικότητα ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας HOX (58, ). Μη εξαρτώμενα από ένα ή λίγους μόνο μεταγραφικούς παράγοντες αλλά χρησιμοποιώντας ένα εξαιρετικά περίπλοκο δίκτυο για τις πιο ζωτικές λειτουργίες τους, τα αιμοποιητικά κύτταρα διασφαλίζουν τις λειτουργίες αυτές από ελάσσονες (ή και κάποιες μείζονες) γενετικές βλάβες, γεγονός στο οποίο οφείλεται η εκπληκτική αξιοπιστία του πιο παραγωγικά δραστήριου ιστού του σώματος. 32

33 Mεταγραφικός έλεγχος της αιμοποίησης Μεταγραφικός παράγοντας Ρόλος στην αιμοποίηση PU.1: ουσιαστικός για την ανάπτυξη της μυελικής (ουδετερόφιλα και μακροφάγα) και λεμφικής (Β, Τ) σειράς. Μέτρια καθυστέρηση της διαφοροποίησης ουδετεροφίλων σε PU.1-/- ποντικούς. Η ελάττωσή του είναι ουσιαστική για τη διαφοροποίηση της ερυθράς σειράς Ets-1 απαραίτητος για την ανάπτυξη της ΝΚ σειράς και για την σωστή έκφραση γονιδίων των Β και Τ λεμφικών σειρών Fli-1 έκφρασή του οδηγεί σε α) επαγωγή πολλαπλασιασμού, β) αναστολή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, γ) αναστολή τελικής διαφοροποίησης προερυθροβλαστών. Σχετίζεται επίσης με την επαγωγή μεγακαρυοκυτταρικού φαινότυπου και διατήρηση φυσιολογικού αριθμού Τ λεμφοκυττάρων. C/EBPα βασικός ρυθμιστής της διαφοροποίησης των ουδετεροφίλων. C/EBPβ σημαντικός ρόλος στην ανάπτυξη μακροφάγων και Β- λεμφοκυττάρων. Αυξάνεται κατά την ωρίμανση των ουδετεροφίλων. C/EBPγ εμπλέκεται στη Β λεμφοκυτταρική ανάπτυξη και στην αιμοποίηση από το εμβρυϊκό ήπαρ C/EBPδ επάγεται κατά την μυελοποίηση. Όπως ο C/EBPβ στα μακροφάγα λειτουργεί ως ρυθμιστής της έκφρασης γονιδίων κυτταροκινών σε φλεγμονώδεις απαντήσεις. C/EBPε ρυθμιστής της τελικής διαφοροποίησης εωσινοφίλων, ουδετεροφίλων και μακροφάγων. AML1/PEBP2β απαραίτητος για τη φυσιολογική ανάπτυξη όλων των αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών. PLZF η καταστολή του ίσως είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των πρώιμων προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών. MZF-1 σημαντικός ρόλος στη επαγωγή της παραγωγής κοκκιοκυττάρων WT-1 μέγιστη έκφραση σε CD34 + /CD33 - /Lin - πρώιμα μυελικά προγονικά κύτταρα. Η καταστολή του είναι απαραίτητη για την αρχική ωρίμανση της μυελικής σειράς. MFOG-1 κεντρικός ρόλος στην εξέλιξη της ερυθράς και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς. HOXA10 η έκφρασή του σχετίζεται με πολλαπλασιασμό των πρώιμων προδρομικών κυττάρων της ερυθράς και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς. Η καταστολή του είναι σημαντική για τη διαφοροποίηση της μυελικής και Β λεμφικής σειράς. HOXA5 ή έκφρασή του ρυθμίζει θετικά τη διαφοροποίηση των ουδετεροφίλων και μονοκυττάρων ενώ η καταστολή του επάγει την ερυθροποίηση. 33

34 HOXΑ9 σημαντικός στην ανάπτυξη μυελικών, ερυθροειδών και Β λεμφικών προγονικών κυττάρων. HOXΒ3 καταστολή του είναι απαραίτητη για τη λεμφική ανάπτυξη. Υπερέκφρασή του επάγει την ανάπτυξη μακροφάγων και ουδετεροφίλων. HOXΒ4 ρόλος «κλειδί» στον πολλαπλασιασμό πρώιμων αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. HOXΒ8 ρόλος στη θετική ρύθμιση της ανάπτυξης των μακροφάγων και στην αρνητική των ουδετεροφίλων. Άλλοι HOX (HOXΒ2, 6-9, HOXC6, 8), ρυθμιστικοί ρόλοι στην ερυθροποίηση. EGR-1 διαφοροποίηση μακροφάγων, καταστολή ανάπτυξης ουδετεροφίλων. c-myb επιβίωση και πολλαπλασιασμός πρώιμων προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών. Η καταστολή του απαραίτητη για την τελική διαφοροποίηση. c-myc ψηλά επίπεδα έκφρασης σε πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα μυελικής σειράς. Καταστολή του εκεί προκαλεί τελική διαφοροποίηση. Έκφρασή του την αναστέλλει. AP-1 (Jun/Fos) πιθανός ρόλος στη ρύθμιση των αποπτωτικών οδών και την ανάπτυξη διαφόρων αιμοποιητικών σειρών. GATA οι GATA-1 και GATA-1 έχουν κεντρικούς ρόλους στη θετική ρύθμιση της ερυθρο- και μεγακαρυο-κυτταρικής ανάπτυξης και στην αρνητική της μυελικής. Ο GATA-3 βρίσκεται αποκλειστικά σε Τ και ΝΚ κύτταρα όπου απαιτείται για τη διαφοροποίηση και δέσμευσή τους. STAT1 κεντρικός ρόλος στη διαφοροποίηση των μονοκυττάρωνμακροφάγων, μέσω της επαγωγής των γονιδίων ICAM-1 και FcγR1 STAT3 ουσιαστικός για τη gpl 30-σχετιζόμενη επαγωγή του πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης, και σημάτων επιβίωσης σε απάντηση σε IL-6. STAT4 καταστέλλεται κατά τη διαφοροποίηση της ερυθράς και μυελικής σειράς. SCL απαραίτητος για την ανάπτυξη στελεχιακών κυττάρων. IRF-1 απαραίτητος για τη δέσμευση και επιλογή των CD8 θυμοκυττάρων. MafB σπουδαίος ρόλος στην επαγωγή των μονοκύτταρων φαγοκυττάρων και καταστολή ερυθροειδών γονιδίων στη μυελική σειρά. Ε2Α το πρώτο εμφανιζόμενο γονίδιο που σχετίζεται με τη δέσμευση των Β λεμφοκυττάρων. BSAP/Pax5 εκφράζεται και διατηρεί τη δέσμευση της Β σειράς. EBF λειτουργία στην ανάπτυξη των Β προγονικών κυττάρων Ikaros κεντρικός ρόλος στην απόφαση λεμφικής διαφοροποίησης. Διαταραχή του επηρεάζει σοβαρά τη Β, Τ και ΝΚ σειρά αλλά όχι την ερυθρά, μεγακαρυοκυτταρική και μυελική. 34

35 Β) Συνεργασία και ανταγωνισμός. Υπάρχουν πολλές περιπτώσεις όπου δύο ή περισσότεροι μεταγραφικοί παράγοντες δρουν σε συνεργασία στη ρύθμιση της αιμοποίησης, για παράδειγμα στην αύξηση της έκφρασης κάποιων γονιδίων. Ο PU.1 συνεργάζεται με τους NF-IL6β (C/EBPδ), c-myb και C/EBPα, c-jun και c-fos και με τον Ets-1, όντας βασικός για την ανάπτυξη της μυελικής (ουδετερόφιλα και μακροφάγα) και λεμφικής σειράς (Β, Τ) (57, 88, 136, ). Παρομοίως, διάφοροι μεταγραφικοί παράγοντες συνδέονται σε κοντινούς προαγωγείς και συνεργάζονται με τον AML1 τροποποιώντας τη δράση του στα γονίδια στόχους, μεταξύ άλλων οι Ets-1, c-myb, PU.1, BSAP/PAX5, LEF-1, C/EBPα και ο AP-1 (230, 231). Ο AML1/CBFβ είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη όλων των αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών και ανήκει στην οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων του «παράγοντα που συνδέεται στον πυρήνα» (core binding factor- CBF) (232, 233). Είναι ένα ετεροδιμερές, αποτελούμενος από δύο διαφορετικά τμήματα, γεγονός που δείχνει πως ο διμερισμός μαζί με τη συνεργασία με άλλους παράγοντες ενισχύει τη δραστικότητα ενός μεταγραφικού παράγοντα κι επακολούθως τη γονιδιακή έκφραση. Το β τμήμα του ετεροδιμερούς (CBFβ) δεν συνδέεται με το DNA απευθείας αλλά ενισχύει τη σύνδεση του άλλου τμήματος (του AML1, CBFα2). Οι Gu και συνεργάτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη CBFα2 διαθέτει ικανότητα αυτο-αναστολής της σύνδεσής της στο DNA μέσω τριών ενδομοριακών, ανασταλτικών πεπτιδικών αλληλουχιών η επίδραση των οποίων αναστέλλεται από τον ετεροδιμερισμό με το CBFβ, με αποτέλεσμα αύξηση της ικανότητας σύνδεσης στο DNA κατά 40 περίπου φορές. (234) Εκτός από αυτού του τύπου τη συνεργασία μεταξύ υπομονάδων των μεταγραφικών παραγόντων υπάρχει και το φαινόμενο της ακύρωσης της αυτόαναστολής ενός παράγοντα μέσω πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης δύο μεταγραφικών παραγόντων, όπως στην περίπτωση του CBFα2 και του Ets-1 που είναι μέλος μιας μεγάλης και καλά διατηρημένης ανάμεσα στα είδη (γεγονός που υποδηλώνει σημαντικό κυτταρικό ρόλο) οικογένειας μεταγραφικών παραγόντων. Η σύνδεση του CBFβ κι η επακόλουθη σύνδεση του CBFα2 στο DNA έχει σαν αποτέλεσμα αλλαγές στη στερεοτακτική δομή που επιτρέπουν τη σύνδεση του Ets-1 που, με τη σειρά του, σταθεροποιεί το σύμπλεγμα. Ωστόσο, άλλοι ερευνητές προτείνουν πως η απευθείας πρωτεϊνική αλληλεπίδραση των CBFα2 και του Ets-1 επάγει στερεοτακτικές 35

36 αλλαγές στις αυτό-ανασταλτικές περιοχές των δύο πρωτεϊνών οδηγώντας σε αμφίδρομη ενεργοποίηση της ικανότητας σύνδεσης του DNA κι ενεργοποίηση της διεγερτικής τους περιοχής (235). Όποιος και να είναι ο μηχανισμός, η συνέργεια αυτή αποτελεί ένα καλό μοντέλο για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς συνεργασίας μεταξύ μεταγραφικών παραγόντων στον αιμοποιητικό και άλλους ιστούς. Υπάρχουν βέβαια και πολλά παραδείγματα ανταγωνισμού, με αρνητικές αλληλεπιδράσεις συνδυασμών μεταγραφικών παραγόντων στον έλεγχο της αιμοποίησης. Αυτό φαίνεται να έχει μεγάλη σημασία στη διαφοροποίηση και δέσμευση των προγονικών κυττάρων σε μία αιματολογική κυτταρική σειρά, καθότι η έκφραση ειδικών μεταγραφικών παραγόντων φαίνεται να δρα εμποδίζοντας τη δράση άλλων, μη ειδικών ή διαφορετικής ειδικότητας (για άλλη κυτταρική σειρά) μέσω μηχανισμού ανταγωνισμού. Ένα καλό παράδειγμα αυτού του μηχανισμού είναι η ανταγωνιστική σχέση μεταξύ PU.1 και GATA-1 που μας επιτρέπει μια σπάνια ματιά στους μηχανισμούς αυτής της αλληλορύθμισης. Ο PU.1, όπως είδαμε παραπάνω, είναι βασικός στη θετική ρύθμιση της ανάπτυξης της μυελικής και λεμφικής σειράς, αλλά η αναστολή του είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση της ερυθράς σειράς (136, 226, 236). Αντίθετα ο GATA-1 κατέχει κεντρικό ρόλο στη θετική ρύθμιση της ερυθροκυτταρικής και μεγακαρυοκυτταρικής εξέλιξης και στην αρνητική εκείνης της μυελικής (219). Έχει καταδειχθεί πως η υπερέκφραση του PU.1 και του GATA-1 εμποδίζει τη διαφοροποίηση των σειρών, όπου είναι κανονικά κατασταλμένοι, δείχνοντας πως απαιτείται τόσο θετική όσο και αρνητική ρύθμιση των παραγόντων αυτών για τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων (237). Αυτή η παρεμπόδιση διαφοροποίησης συνοδεύεται συνήθως με αυξημένο πολλαπλασιασμό πρώιμων προγονικών κυττάρων. Είναι από παλιά γνωστό πως οι PU.1 και GATA-1 αλληλεπιδρούν αλληλοεξουδετερωνόμενοι (238). Πιο πρόσφατα όμως φάνηκε το εξής ενδιαφέρον: ότι ο μηχανισμός με τον οποίον ο PU.1 αναστέλλει τον GATA-1 διαφέρει από εκείνον με τον οποίον συμβαίνει το αντίστροφο, δηλαδή από τον τρόπο που ο GATA-1 αναστέλλει την δράση του PU.1. Ο GATA-1 εμποδίζει την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του PU.1 αναστέλλοντας την σύνδεση του συνενισχυτή του PU.1, c-jun (237). Αντίθετα η αμινοτελική περιοχή του PU.1 συνδέεται 36

37 στην περιοχή προσκόλλησης του GATA-1 στο DNA (δακτύλιος άνθρακα, C-finger), εμποδίζοντας απευθείας τη σύνδεση και δράση του (226). Η ανταγωνιστική αυτή σχέση μεταξύ PU.1 και GATA-1 μας δείχνει ένα μηχανισμό βάσει του οποίου πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις μεταγραφικών παραγόντων μπορούν να επάγουν τη διαφοροποίηση προς μία κυτταρική σειρά αλλάζοντας τους γονιδιακούς συνδυασμούς που εκφράζονται στα δεσμευμένα προγονικά κύτταρα. Άλλα παραδείγματα παρόμοιων αλληλοκατασταλτικών αλληλεπιδράσεων είναι η αναστολή του PU.1 από τον παράγοντα BSAP κατά την εξέλιξη της Β-λεμφικής σειράς και αναστολή διαφοροποίησης των μακροφάγων από τον WT1 (136, 231). Κάποιοι μεταγραφικοί παράγοντες φαίνονται να έχουν ρόλο και στην απόφαση πολλαπλασιασμού έναντι διαφοροποίησης ενός εξελισσόμενου αιμοποιητικού κυττάρου. Σχετικά με το σχηματισμό των ουδετερόφιλων, η έκφραση του PU.1 επιταχύνει την τελική διαφοροποίηση μιας κυτταρικής σειράς πρόδρομων μυελικών κυττάρων, της 32Dcl3, όπως φαίνεται μορφολογικά και από την έκφραση κυτταρικών δεικτών διαφοροποίησης (229). Πιο γρήγορη διαφοροποίηση ουδετερόφιλων παρατηρείται επίσης στην παραπάνω κυτταρική σειρά μετά από εισαγωγή ενός αναστολέα του c-myb, γεγονός συμβατό με το ρόλο του c-myb ως θετικού ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού πρώιμων αιμοποιητικών κυττάρων και ως αναστολέα της τελικής διαφοροποίησης. Οι Bellon και συνεργάτες βρήκαν πως ο PU.1 καταστέλλει την έκφραση του c-myb κατά την τελική διαφοροποίηση των ουδετερόφιλων, συνδεόμενος κοντά στην αρχή του γονιδίου του, κι έτσι επάγει την μυελική ωρίμανση (239). Είναι λοιπόν φανερός ο κεντρικός ρόλος της ρύθμισης της δράσης των μεταγραφικών παραγόντων στον αιμοποιητικό πολλαπλασιασμό, τη δέσμευση και τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών. Η διαταραχή του ελέγχου αυτού έχει σοβαρές συνέπειες στην αιματολογική εξέλιξη. Για παράδειγμα, κύτταρα της μυελικής κυτταρικής σειράς M1 φυσιολογικά διαφοροποιούνται προς μακροφάγα, υπό την επίδραση ιντερλευκίνης 6 (IL-6) (240, 241). Εάν όμως επαχθεί εξωγενώς έκφραση του GATA-1, η διαφοροποίηση αυτή παρεμποδίζεται και τα κύτταρα εμφανίζουν απόπτωση. Επιπλέον, η υπερέκφραση του GATA-1 αλλάζει το φαινότυπο των κυττάρων M1 από μυελικά σε ερυθροειδή και μεγακαρυοκυτταροειδή. Σε μια άλλη μελέτη, ο GATA-1 αναπρογραμμάτισε 37

38 μυελομονοκυτταρικές κυτταρικές σειρές πτηνών σε εωσινόφιλα, θρομβοβλάστες κι ερυθροβλάστες (242). Οι συνέπειες της αλλαγής του μεταγραφικού περιβάλλοντος στην εξέλιξη των αιμοποιητικών κυττάρων φαίνονται και στην περίπτωση του μεταγραφικού παράγοντα C/EBPε, ο οποίος, υπό φυσιολογικές συνθήκες, εκφράζεται μόνο στα κύτταρα της μυελικής σειράς και σχετίζεται με τελική διαφοροποίηση ουδετερόφιλων και μακροφάγων (243). Η προκλητή, έκτοπη έκφρασή του σε μια λεμφική κυτταρική σειρά προκάλεσε την έκφραση μιας σειράς γονιδίων μακροφάγων, μεταξύ των οποίων και ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα διέγερσης των αποικιών μακροφάγων MCSF (macrophage-colony stimulating factor receptor) και άλλων κυτταροκινών (244). Είναι συνεπώς φανερό πως η μεταγραφική ρύθμιση της τελικής διαφοροποίησης στον αιμοποιητικό ιστό προϋποθέτει την επαγωγή κάποιων γονιδίων και την αναστολή κάποιων άλλων από συγκεκριμένους συνδυασμούς μεταγραφικών παραγόντων. Άλλοι μηχανισμοί ρύθμισης της δράσης των μεταγραφικών παραγόντων, εκτός από αυτούς που αναφέρθηκαν (συμπληρωματικότητα, συνεργασία, ανταγωνισμός), είναι: Γ) Ο καθορισμός της οδού διαφοροποίησης βάσει των επιπέδων συγκέντρωσης των μεταγραφικών παραγόντων. Και πάλι είναι χαρακτηριστική η περίπτωση του μεταγραφικού παράγοντα PU.1 (μυελική και λεμφική διαφοροποίηση), μέλους της οικογένειας ets. Οι DeKoter και συνεργάτες προσδιόρισαν ότι η επιλογή ανάμεσα στην έκφραση γονιδίων μακροφάγων ή Β-λεμφικής σειράς καθορίζεται από τις διαφορετικές συγκεντρώσεις του PU.1 (245, 246). Προγονικά κύτταρα με κοινό μυελικό- λεμφικό δυναμικό διαφοροποίησης που εκτέθηκαν σε χαμηλές συγκεντρώσεις PU.1 διαφοροποιήθηκαν προς B-λεμφοκύτταρα. Αντίθετα, υψηλές συγκεντρώσεις PU.1 προήγαγαν τη διαφοροποίηση προς μακροφάγα κι εμπόδισαν την εξέλιξη των προγονικών κυττάρων προς B λεμφοκύτταρα. Παρομοίως, ο GATA-1 σε χαμηλά επίπεδα επάγει την έκφραση γονιδίων εωσινοφίλων, κάτι που δε συμβαίνει σε ψηλότερα επίπεδά του. Για παράδειγμα, χαμηλές συγκεντρώσεις GATA-1 ενεργοποιούν τον προαγωγέα του EOS47, ενός γονιδίου που εκφράζει έναν πρώιμο και ειδικό δείκτη της εωσινοφιλικής 38

39 διαφοροποίησης στον αιμοποιητικό ιστό της κότας. Ψηλά επίπεδα του GATA-1, αντίθετα, καταστέλλουν τον προαγωγέα του EOS47 (247). Δ) Ανταγωνισμός μεταξύ ισομορφών ενός μεταγραφικού παράγοντα που προέρχονται από εναλλακτική συναρμολόγηση (alternatively spliced). Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, το γονίδιο AML1 εκφράζει το τμήμα α του ετεροδιμερούς μεταγραφικού παράγοντα AML1/PEBP2β που είναι απαραίτητος για τη φυσιολογική ανάπτυξη όλων των αιμοποιητικών σειρών. Το τμήμα α είναι εκείνο που συνδέεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA σε γονίδια στόχους, ενώ το β ενισχύει τη σύνδεση αυτή του α, επηρεάζοντας την τρισδιάστατη δομή του. Το πλήρους μήκους α τμήμα περιέχει μία καλά διατηρημένη ανάμεσα στα είδη (από τις μύγες μέχρι τον άνθρωπο) - και συνεπώς σημαντική - περιοχή που λέγεται Runt και, κάτω από αυτήν, την περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου (C-terminal region) (248). Η περιοχή Runt ευθύνεται για τη σύνδεση του AML1 στο DNA. Η περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου απαιτείται για την μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. Έχουν διαπιστωθεί αρκετές παραλλαγές του α τμήματος του γονιδίου AML1. Οι Zhang και συνεργάτες ανακάλυψαν ένα νέο αντίγραφο του AML1, τον AML1ΔN, από το οποίο λείπει ένα μέρος της αμινοτελικής περιοχής, η οποία περιλαμβάνει μέρος της περιοχής Runt (248). Ο AML1ΔN δεν μπορεί να συνδεθεί στο DNA ή να ετεροδιμεριστεί με το τμήμα β. Ενδιαφέρον είναι πως το αντίγραφο AML1ΔN εκφράζεται σε διάφορες μυελικές και λεμφικές κυτταρικές σειρές. Περαιτέρω έλεγχος έδειξε ότι ο AML1ΔN παρεμποδίζει την δράση (μεταγραφική ενεργοποίηση) του πλήρους AML1. Η έκφραση του AML1ΔN παρεμπόδισε τη διαφοροποίηση προς ουδετερόφιλα της κυτταρικής σειράς 32Dcl3, μετά από διέγερση από G-CSF, με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό πρώιμων μυελικών μορφών. Πιθανολογείται λοιπόν πως ο AML1ΔN ανταγωνίζεται τον πλήρους μήκους AML1 στη σύνδεση με πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν συνήθως με την καρβοξυτελική του περιοχή. Δύο άλλες «ισομορφές» του AML1 που έχουν επίσης διερευνηθεί είναι: α) ο AML1α που έχει την περιοχή σύνδεσης του DNA αλλά όχι εκείνη για τη μεταγραφική διέγερση (248, 249) και β) ο PEBP2αB2 που έχει ισχυρότερη ικανότητα σύνδεσης στο DNA και μικρότερη μεταγραφική δυνατότητα από τον, πλήρους μήκους, AML1 (250). 39

40 Συνολικά, είναι λοιπόν πιθανό η παραγωγή εναλλακτικών ισομορφών (alternative splicing) να αποτελεί μηχανισμό καλύτερης ρύθμισης της δράσης του AML1 και άλλων μεταγραφικών παραγόντων πάνω στα γονίδια στόχους. Ε) Η μετα-μεταγραφική ρύθμιση δράσης. Ο NF-Y είναι ένας κοινός, ετερομερής μεταγραφικός παράγοντας που παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της έκφρασης γονιδίων στα διαφοροποιούμενα μονοκύτταρα. Σχηματίζεται από τη σύνδεση των τμημάτων NF-YA, NF-YB και NF- YC, όλα από τα οποία είναι απαραίτητα για τη σύνδεση στο DNA. Η απουσία δράσης του NF-Y στα κυκλοφορούντα (ώριμα) μονοκύτταρα έχει αποδοθεί στην έλλειψη του τμήματος A. Ωστόσο το mrna του NF-YA είναι παρόν σε όλα τα στάδια της ωρίμανσης των μονοκυττάρων. Οι Marziali και συν. βρήκαν ότι η έκφραση γονιδίων υπό την καθοδήγηση του NF-Y στα ώριμα μακροφάγα εξαρτάται από την προοδευτική αύξηση των επιπέδων του NF-YA, η οποία ρυθμίζεται με μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Συνεπώς η παραγωγή NF-YA είναι ο περιοριστικός παράγοντας στην ενεργοποίηση του NF-Y, επιτρέποντας την διαφορετική δράση από τον NF-Y στα διάφορα στάδια ωρίμανσης των μονοκυττάρων προς μακροφάγα (251). Ο μεταγραφικός παράγοντας AML1/CBFβ καταδεικνύει μια άλλη στρατηγική ρύθμισης της δράσης των μεταγραφικών παραγόντων μέσω ελέγχου των ετεροδιμερών των υποτμημάτων τους. Παρότι το τμήμα AML1 (CBFα2, ή PEBP2α) βρίσκεται πάντα στον πυρήνα, το τμήμα β (CBFβ ή PEBP2β), όταν δεν είναι συνδεμένο με το α, βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα (252). Έτσι η σύνδεση αυτών των δύο αποτελεί περιοριστικό παράγοντα στη δράση του AML1/CBFβ. Η σταθερότητα του mrna αποτελεί έναν επιπρόσθετο μηχανισμό μεταμεταγραφικής ρύθμισης. Κύτταρα MEL που έχουν μεταμορφωθεί από τον ιό SFFV (Friend spleen focus-forming virus) αποτελούν ένα μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης και διαφοροποίησης των ερυθροειδών κυττάρων (253). Όταν εκτεθούν σε διάφορους επαγωγικούς παράγοντες τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν μια ελάττωση στην έκφραση PU.1 κατά 3 5 φορές (254). Αυτό γίνεται μέσω μετα-μεταγραφικού μηχανισμού που ελαττώνει το χρόνο ημίσειας ζωής του PU.1-mRNA. Επιπλέον, ο μηχανισμός αυτός ήταν ειδικός, καθότι η ευστάθεια των mrna των ερυθροκυτταρικών μεταγραφικών παραγόντων GATA-1 και NF-E2 δεν επηρεάστηκε με τον ίδιο τρόπο. Συνολικά, οι Hensold και συν. (254) πρότειναν ότι 40

41 αυτός ο μηχανισμός μπορεί να αποτελεί ένα νέο τρόπο με τον οποίο να ρυθμίζονται τα επίπεδα και η δράση επιμέρους μεταγραφικών παραγόντων, με αποτέλεσμα τη διαφορετική έκφραση γονιδίων στα εξελισσόμενα κύτταρα. ΣΤ) Ενεργοποίηση προσχηματισμένων, ανενεργών μεταγραφικών παραγόντων. Ο «πυρηνικός παράγοντας» NF-κB είναι ένας δραστικός μεταγραφικός παράγοντας που ανευρίσκεται σε μεγάλη ποικιλία κυττάρων, παίζοντας κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση διαφόρων γονιδίων τα οποία σχετίζονται με ανοσολογικές, φλεγμονώδεις και αποπτωτικές διεργασίες (255). Η οικογένεια Rel/NF-κB αντιπροσωπεύει μια ομάδα δομικά παρόμοιων και εξελικτικά διατηρημένων πρωτεϊνών ( ). Σε απουσία κατάλληλων ερεθισμάτων τα διμερή του NF-κB παραμένουν στο κυτταρόπλασμα, όπου είναι σε ανενεργή μορφή λόγω σύνδεσης με μέλη της οικογένειας αναστολέων IκB. Η παραμονή αυτή στο κυτταρόπλασμα αποτελεί τον μείζονα ρυθμιστικό μηχανισμό αδρανοποίησης του NF-κB, περιορίζοντας την πρόσβασή του σε γονιδιακές αλληλουχίες στόχους και, συνεπώς, είναι κεντρικής σημασίας για τον έλεγχο της φυσιολογικής ανάπτυξης των κυττάρων (259). Η διέγερση από αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, μια ποικιλία κυτταροκινών, βακτηριακά λιπίδια, ιούς, παράγοντες βλάβης του DNA και φυσικό ή οξειδωτικό στρες οδηγούν σε φωσφορυλίωση και πρωτεολυτική αποδόμηση του I-κB από τα πρωτεασώματα (26S) ή απομάκρυνσή του με άλλους μηχανισμούς. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του αδρανούς NF-κB μέσω αποκάλυψης των σημάτων μεταφοράς προς τον πυρήνα του μορίου του και της μετακίνησής του εκεί, όπου διεγείρει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Η μετακίνηση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα εξαρτάται από τον μεταβολικό κύκλο Ran GTP/GDP και από μεταφορικές πρωτεΐνες (ιμπορτίνες, εξπορτίνες) οι οποίες διαμεσολαβούν στη μεταφορά μέσω συμπλεγμάτων των πόρων της πυρηνικής μεμβράνης. Μετά από την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του NF-κB, ένας μηχανισμός αρνητικής ανάδρομης δράσης επανασυνδέει τον NF-κB με πυρηνικούς IκB και τον επιστρέφει, αδρανή, στο κυτταρόπλασμα. Κεντρική σε αυτό το μηχανισμό ανάδρασης είναι η ενεργοποίηση του γονιδίου του ίδιου του IκB από τον ενεργό NF-κB. 41

42 Με αυτόν και άλλους μηχανισμούς οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας Rel/NF-κB παρέχουν στα κύτταρα ένα μηχανισμό ταχείας απάντησης σε αιμοποιητικούς ρυθμιστές αλλά και ταχείας παραγωγής διαφόρων αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών. Έτσι δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους την εξέλιξη διαφόρων αιμοποιητικών κυττάρων και στη συνολική ανοσολογική ρύθμιση σε σπονδυλωτούς και ασπόνδυλους οργανισμούς (257, 260). Οι πυρηνικοί παράγοντες ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων (NFAT) είναι μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιολογία των Τ κυττάρων (261). Όταν τα T κύτταρα βρίσκονται σε ηρεμία οι παράγοντες αυτοί διατηρούνται στο κυτταρόπλασμα σε έντονα φωσφορυλιωμένη μορφή. Κατά την ενεργοποίηση των T κυττάρων οι συγκεντρώσεις ασβεστίου αυξάνουν με αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση των NFAT από μια ευαίσθητη στο ασβέστιο φωσφατάση, την καλσινευρίνη (262, 263). Η αποφωσφορυλίωση αποκαλύπτει δύο αλληλουχίες μεταφοράς στον πυρήνα στο μόριο των NFAT, διευκολύνοντας την ταχεία μεταφορά τους εκεί. Οι NFAT, κατόπιν, σχηματίζουν ζεύγη με τον παράγοντα AP-1 (αλλιώς Jun/Fos) και συνδέονται σε αλληλουχίες απόκρισης, επάγοντας την γονιδιακή έκφραση (264). Έτσι οι NFAT παρέχουν στα αιμοποιητικά κύτταρα ένα μηχανισμό ταχείας απάντησης σε αυξημένες συγκεντρώσεις ασβεστίου μέσω της διευκολυνόμενης από την καλσινευρίνη ενεργοποίησης και μεταφοράς στον πυρήνα. Ζ) Μετα-μεταφραστική τροποποίηση μεταγραφικών παραγόντων (φωσφορυλίωση και ακετυλίωση). Έχουμε ήδη περιγράψει πως η φωσφορυλίωση του IκB μέσω της IκB κινάσης και η αποφωσφορυλίωση των NFAT μέσω της καλσινευρίνης παίζουν κεντρικό ρόλο στη μεταφορά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB και NFAT. Επιπρόσθετα, η φωσφορυλίωση/ αποφωσφορυλίωση παίζει σημαντικό ρόλο και σε άλλες κοινές ρυθμίσεις δράσης τέτοιων παραγόντων, επηρεάζοντας τη λειτουργία τους: (i) μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεταγραφικών παραγόντων, συμπαραγόντων και του βασικού συμπλέγματος μεταγραφής, (ii) τροποποιώντας τη σύνδεση των μεταγραφικών παραγόντων στο DNA, 42

43 (iii) αλλάζοντας την πρωτεϊνική τους σταθερότητα κι εκείνη των συμπαραγόντων τους και (iv) τροποποιώντας τη δομή της χρωματίνης (265, 266). Υπάρχουν πολυάριθμα παραδείγματα αυτών των ρυθμιστικών μηχανισμών. Οι μηχανισμοί αυτοί πολλές φορές δρουν σε συνεργασία, όπως όταν υπάρχει φωσφορυλίωση σε πολλαπλές περιοχές της πρωτεΐνης. Επιπλέον τόσο φωσφορυλίωση όσο και αποφωσφορυλίωση μπορούν να είναι το αποτέλεσμα ενός και μόνο ερεθίσματος. Για παράδειγμα, ο παράγοντας TPA μπορεί να προκαλέσει φωσφορυλίωση των περιοχών ενεργοποίησης των μεταγραφικών παραγόντων c-jun και ταυτόχρονα αποφωσφορυλίωση των ανασταλτικών περιοχών, καταλήγοντας σε αύξηση της διεγερτικής δράσης (265). Συνολικά, η σχετική σπουδαιότητα της φωσφορυλίωσης ως τροποποιητή της δράσης των μεταγραφικών παραγόντων τονίζεται από πολυάριθμες μελέτες, που έχουν ξεκαθαρίσει τις μηχανιστικές και δομικές παραμέτρους αυτού του είδους της ρύθμισης (265, ). Η ακετυλίωση αντιπροσωπεύει έναν άλλον μηχανισμό μετα-μεταφραστικής τροποποίησης των μεταγραφικών παραγόντων, ο οποίος μπορεί να τροποποιήσει τη σύνδεση πρωτεΐνης DNA και τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης πρωτεΐνης. Έχει επίσης ανακύψει ως ένας μηχανισμός μέσω του οποίου το πυκνά διαμορφωμένο, σταθερής δομής πυρηνικό DNA (ετεροχρωματίνη) μπορεί να ανοίξει και να γίνει προσβάσιμο στη γονιδιακή μεταγραφή αλλά και αντιγραφή, επιδιόρθωση και ανασυνδυασμό (ευχρωματίνη) (276). Οι μεταγραφικοί παράγοντες μπορούν να μεσολαβήσουν σε αυτή τη διαδικασία μέσω της επιστράτευσης ιστονικών ακετυλασών και από-ακετυλασών που μεταβάλλουν τις σχέσεις μεταξύ νουκλεοσωμικών στοιχείων κι έτσι τη δομή της χρωματίνης. Επιπρόσθετα, οι μεταγραφικοί παράγοντες μπορούν οι ίδιοι να αποτελέσουν στόχο ακετυλασών και από-ακετυλασών (277). Για παράδειγμα, ο GATA-1, ο σημαντικός ρυθμιστής και μεγακαρυοκυτταρικής ανάπτυξης, μπορεί να ακετυλιωθεί τόσο in vivo όσο και in vitro (132). Επιπλέον, η ακετυλίωση χαρακτηριστικών τμημάτων λυσίνης στον GATA-1 είναι σημαντική για την ενεργοποιητική του ικανότητα. Παρόμοια ευρήματα έχουν περιγραφεί για τον p53 και τον EKLF (29, 278). 43

44 Οι μηχανισμοί ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων που έχουν περιγραφεί δείχνουν την έμφαση που έχει δείξει η φυσική επιλογή στον σωστό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης και την τεράστια πολυπλοκότητα των πρωτεϊνικών συσχετίσεων που συνθέτουν το μεταγραφικό περιβάλλον κάθε κυττάρου, σε κάθε στάδιο εξέλιξης και κάτω από κάθε είδους εξωτερικά ερεθίσματα. Πρέπει, ωστόσο, να προστεθεί ότι συνεχώς αναδεικνύονται και νέοι μηχανισμοί και η σπουδαιότητα των αλληλεπιδράσεων συνεχώς αναβαθμίζεται. Ανάμεσα στους πιο πρόσφατα περιγραφέντες μηχανισμούς ελέγχου των μεταγραφικών παραγόντων είναι: (i) Η μεταφραστική ρύθμιση των γονιδίων των μεταγραφικών παραγόντων (π.χ. HOX) (279). (ii) Το «παράθυρο ευκαιρίας» για τη μεταγραφική ενεργοποίηση (π.χ. c-myc) (280). (iii) Τοπογραφικοί παράγοντες -η θέση των μεταγραφικών παραγόντων σε υποκυτταρικό επίπεδο- (π.χ. E2F, p53) (259). (iv) Αποδόμηση μεταγραφικών παραγόντων μέσω ουμπικοποιητίνης (π.χ. p53, AP-1) (266, 277) Επίλογος Η σύνδεση κυττοκινών στους κατάλληλους υποδοχείς έχει σαν αποτέλεσμα την ειδική ενεργοποίηση οδών μεταγωγής σημάτων. Τα εξελισσόμενα αιμοποιητικά κύτταρα πρέπει να συνδυάσουν ερεθίσματα από σταθερούς υποδοχείς με εκείνα από υποδοχείς που ενεργοποιούνται από εισερχόμενα ενδοκυττάρια κι εξωκυττάρια μηνύματα. Η έκφραση αιμοποιητικών γονιδίων είναι συνισταμένη των επιδράσεων των πολυάριθμων μεταγόμενων σημάτων στη ρύθμιση του μεταγραφικού μηχανισμού. Σε πολλές περιπτώσεις, οι αιμοποιητικές απαντήσεις είναι αποτέλεσμα ενεργοποίησης της σύνθεσης μιας ομάδας μεταγραφικών παραγόντων από τους συνδυασμούς αυτών των σημάτων. Οι διεγειρόμενοι παράγοντες, με τη σειρά τους, δρουν σε συνεργασία ή ανταγωνισμό για να τροποποιήσουν τη δράση συγκεκριμένων προαγωγέων. Σε άλλες περιπτώσεις η γονιδιακή έκφραση μπορεί να εξαρτάται από τροποποιήσεις των μεταγραφικών παραγόντων από τα μεταγόμενα σήματα- καταρράκτες σημάτων (όπως στους NFAT). 44

45 Συνολικά, οι μεταγραφικοί παράγοντες ρυθμίζουν ένα ευρύτερο σύνολο αιμοποιητικών φαινομένων - πέρα από τις κυτταροκίνες και τους υποδοχείς τους. Αυτό ενισχύεται από τις μελέτες των Anderson και συν. που επανεισήγαγαν γονίδια του PU.1 και των υποδοχέων του αυξητικών παραγόντων G-CSF και M-CSF σε μια προγονική μυελική κυτταρική σειρά με έλλειψη του PU.1, την «503». Αυτά τα κύτταρα στερούνται τον PU.1 και τους υποδοχείς των G-CSF και M-CSF αλλά μπορούν να αναπτύσσονται παρουσία ιντερλευκίνης 3 (IL-3) (281). Η αποκατάσταση του υποδοχέα του G-CSF, όπως ήταν αναμενόμενο, προήγαγε τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση αυτών των κυττάρων μετά από προσθήκη G-CSF. Ωστόσο τα κύτταρα αυτά δεν εμφάνισαν άλλη αλλαγή στις πρωτεΐνες επιφανείας - πέρα από τον υποδοχέα G-CSF - στη γονιδιακή έκφραση ή τη λειτουργική τους ικανότητα, που να υποδεικνύουν τελική τους διαφοροποίηση προς ώριμα ουδετερόφιλα. Παρομοίως, η αποκατάσταση του υποδοχέα του M-CSF είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη ανταπόκριση στον M-CSF αλλά αυτή περιοριζόταν στην επιβίωση και ανάπτυξη και όχι στην εξέλιξη της διαφοροποίησης προς μονοπύρηνα φαγοκύτταρα. Αντίθετα η αποκατάσταση του PU.1 οδήγησε τόσο στην έκφραση λειτουργικών υποδοχέων των G-CSF και M-CSF όσο και διαφόρων μορίων που δείχνουν κυτταρική διαφοροποίηση. Τα κύτταρα όπου αποκαταστάθηκε ο PU.1 όταν εκτέθηκαν σε G-CSF διαφοροποιήθηκαν προς ώριμα ουδετερόφιλα, όπως φάνηκε από την έκφραση ποικίλων λειτουργιών και γονιδίων - όπως η έκφραση της NADPH οξειδάσης gp91-phox, της ουδετεροφιλικής κολλαγινάσης και ζελατινάσης και γονιδίων των δευτερευόντων κοκκίων και υπεροξειδίου, μετά από διέγερση -. Παρομοίως η έκθεσή τους σε M-CSF, οδήγησε σε τυπικά χαρακτηριστικά τελικά διαφοροποιημένων μακροφάγων, όπως φάνηκε από την κυτταρική τους μορφολογία, έκφραση του F4/80, της σιαλοαντχεσίνης, του Mac-1/CD11b και του υποδοχέα της μανόζης και IL-18, σε αντίθεση με τη μητρική κυτταρική σειρά (χωρίς τον PU.1). Συνολικά, αυτή η μελέτη έδειξε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας PU.1 είναι βασικός για τη μυελική ανάπτυξη, δρώντας και πέρα από την απλή ενεργοποίηση της σύνθεσης των υποδοχέων των κυτταροκινών ( ). Από μελέτες των αιμοποιητικών συστημάτων των θηλαστικών και άλλων οργανισμών είναι φανερό ότι, η απομόνωση κεκαθαρμένων κυττοκινών και των υποδοχέων τους είναι πολύ σημαντική για την κατανόηση των γεγονότων που 45

46 εμπλέκονται στην ανάπτυξη και λειτουργία των αιμοποιητικών κυττάρων. Επιπλέον, ο χαρακτηρισμός των ποικίλων οδών μεταγωγής σήματος και, με αυξανόμενη έμφαση, των επηρεαζόμενων μεταγραφικών παραγόντων, είναι απαραίτητη για την κατανόηση του τρόπου με τον οποίο συνδέονται το εξωτερικό περιβάλλον και ο εσωτερικός προγραμματισμός των προγονικών κυττάρων με τους διαφορετικούς συνδυασμούς εκφραζόμενων γονιδίων που καθορίζουν την κυτταρική εξέλιξη. Και πάλι, δεδομένης της αναφαινόμενης πολυπλοκότητας των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, η πρόκληση για το μέλλον θα είναι τεράστια. Η μελέτη μας φιλοδοξεί να βάλει ένα ακόμα λιθαράκι στο τεράστιο οικοδόμημα αυτό της μοριακής βιολογίας, που είναι ακόμη στα θεμέλια, αναλύοντας τις επιδράσεις ενός μεταγραφικού παράγοντα μιας σημαντικής οικογένειας στον αιμοποιητικό και άλλους ιστούς. 46

47 1.3 Μοριακές τεχνικές Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Ορισμός: Η Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR polymerase chain reaction) είναι πλέον μία βασική τεχνική βιοχημείας και μοριακής βιολογίας για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό αλληλουχίας DNA μέσω της ενζυμικής αναπαραγωγής του, χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών (όπως η E. Coli ή οι ζύμες) (285). Η PCR είναι μία in vitro μέθοδος η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί χωρίς περιορισμούς στη μορφή του χρησιμοποιούμενου DNA και μπορεί να διαφοροποιηθεί εκτενώς για την πραγματοποίηση πολλών μεθόδων γενετικής επέμβασης. Με τη χρήση της συγκεκριμένα DNA τμήματα μπορούν να κλωνοποιηθούν σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα και μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και δισεκατομμύρια φορές. Τεχνική: Τα ολιγονουκλεοτίδια που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητές (primers) δεσμεύονται σε θέσεις συμπληρωματικές από την αλληλουχία που πρόκειται να αντιγραφεί και καθορίζουν τα άκρα του DNA τμήματος που θα πολλαπλασιαστεί. Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια: α. Αποδιάταξη του DNA (denaturation) β. Υβριδισμός των εκκινητών στο DNA- εκμαγείο (annealing) γ. Επιμήκυνση των μεταξύ των εκκινητών τμημάτων (extension) Ένας πλήρης τέτοιος κύκλος περιλαμβάνει επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες και γίνεται, στις μέρες μας, αυτόματα από ειδικά μηχανήματα (thermal cyclers). Σε μια τυπική αντίδραση, το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται, με θέρμανση στους 95 C. Στη συνέχεια οι εκκινητές, που βρίσκονται σε περίσσεια, προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA- εκμαγείου, με ψύξη του δείγματος στους C. Ακολουθεί επώαση στους 72 C για την επιμήκυνση των εκκινητών από μία θερμοάντοχη πολυμεράση, παρουσία των τεσσάρων τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων. Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσύστατοι κλώνοι με τη σειρά τους χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για την in vitro σύνθεση του DNA. Μετά από μερικούς κύκλους το επικρατές προϊόν είναι ένα DNA τμήμα, το μέγεθος του οποίου 47

48 αντιστοιχεί στην μεταξύ των δύο αρχικών εκκινητών απόσταση. Στη πράξη 20 με 30 κύκλοι της αντίδρασης είναι αρκετοί για την αποτελεσματική ενίσχυση του DNA τμήματος. Σε κάθε κύκλο, που διαρκεί περίπου πέντε λεπτά, η ποσότητα του DNA διπλασιάζεται. Η όλη διαδικασία κλωνοποίησης ενός DNA τμήματος σε ένα in vitro σύστημα (χωρίς κύτταρα) διαρκεί μερικές ώρες, σε σχέση με τις μερικές μέρες που απαιτούνται για τις in vivo διαδικασίες κλωνοποίησης. Χρήσεις: Η PCR είναι εξαιρετικά επιλεκτική και ευαίσθητη μέθοδος, έχει δυνατότητα ανίχνευσης και ενός μόνο DNA μορίου σε ένα μείγμα. Η PCR τεχνολογία αντικαθιστά τον υβριδισμό κατά Southern για τη διάγνωση γενετικών ασθενειών και για την ανίχνευση λοιμωδών νόσων (ιώσεων, μικροβιακών λοιμώξεων κτλ.). Επιπλέον, στην ιατροδικαστική από ένα απλό ίχνος αίματος ή άλλων ιστών (ακόμα και από ένα μόνο κύτταρο) μπορεί να αναγνωριστεί η ταυτότητα ενός ατόμου (γενετικό αποτύπωμα genetic fingerprint ) (286) Αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης- πολυμεράσης (reverse transcriptase- polymerase chain reaction RT-PCR) Η RT-PCR είναι μια μοριακή τεχνική αντίστοιχη της PCR που έχει σα σκοπό τον πολλαπλασιασμό ενός καθορισμένου τμήματος ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA). Το τμήμα αυτό του RNA μεταγράφεται αρχικά αντίστροφα στο συμπληρωματικό του τμήμα DNA, το οποίο κατόπιν πολλαπλασιάζεται με PCR. Τεχνική: Στο πρώτο βήμα της RT-PCR, που αποκαλείται «αντίδραση πρώτης αλύσου», σχηματίζεται συμπληρωματικό DNA από αγγελιοφόρο RNA (mrna) με τη χρήση dntps και μιας RNA-εξαρτώμενης DNA πολυμεράσης (αντίστροφης μεταγραφάσης), με τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής. Η RT-PCR επωφελείται ενός χαρακτηριστικού των ώριμων ευκαρυωτικών mrnas, την ύπαρξη μιας, κοινής αλληλουχίας, περιοχής γνωστής ως η 3' πολυαδενυλιωμένη ουρά [poly(a) tail] όπου υβριδίζονται oligo-dt εκκινητές. Οι εκκινητές αυτοί προσκολλώνται στο 3' άκρο κάθε μορίου mrna στο διάλυμα με αποτέλεσμα την 5'->3' σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cdna) από την αντίστροφη μεταγραφάση. Εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκκινητές συμπληρωματικοί του mrna στόχου ή τυχαία εξαμερή. 48

49 Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης της αντίστροφης μεταγραφής και την παραγωγή cdna από το αρχικό mrna γίνεται απλή PCR, που αποκαλείται «αντίδραση της δεύτερης αλύσου». Εδώ χρησιμοποιούνται εκκινητές συμπληρωματικοί της αλληλουχίας των εξονίων του υπό διερεύνηση γονιδίου. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν εκκινητές για τον πολλαπλασιασμό πολλαπλών γονιδίων που εκφράζονται στον υπό μελέτη ιστό. Ποσοτική PCR αληθούς χρόνου (Quantitative real-time PCR) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συγκρίνουμε επίπεδα έκφρασης πολλαπλών γονιδίων. Τα βήματα της «αντίδρασης της δεύτερης αλύσου» είναι: α. Αναμιγνύονται το cdna, μια θερμοάντοχη DNA πολυμεράση και οι δύο DNA εκκινητές. β. Η αντίδραση θερμαίνεται πάνω από τους 37 C για να γίνει η προσκόλληση των εκκινητών στο cdna. γ. Με περαιτέρω θέρμανση η θερμοάντοχη DNA πολυμεράση συνθέτει διπλή αλυσίδα DNA από το cdna στόχο των εκκινητών. δ. Με θέρμανση στους 95 C χωρίζεται η διπλή άλυσος DNA. ε. Η αντίδραση ψύχεται δίνοντας τη δυνατότητα στους εκκινητές να συνδεθούν και πάλι και ο κύκλος αρχίζει ξανά. Μετά από περίπου 30 κύκλους, εκατομμύρια αντίτυπα της αλυσίδας στόχου έχουν παραχθεί και το αρχικό RNA αποσυντίθεται, με τη βοήθεια RNάσης H, αφήνοντας καθαρό cdna. Χρήσεις: Με τον λογαριθμικό πολλαπλασιασμό που πετυχαίνει η RT-PCR, μπορούν να ανιχνευθούν ακόμη και πολύ λίγα αντίγραφα mrna μορίων κι έτσι η τεχνική χρησιμοποιείται ευρέως στη διάγνωση γενετικών νόσων και, όπως στην παρούσα μελέτη, στην ανίχνευση και μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης σε έναν συγκεκριμένο ιστό. 49

50 1.3.3 Υβριδισμός σε μεμβράνη κατά Southern (Southern blot) Είναι ακόμη μια μέθοδος ρουτίνας της μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μιας γνωστής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε ένα δείγμα DNA προς διερεύνηση. Το όνομά της το πήρε από τον εφευρέτη της, βρετανό βιολόγο, Edwin Southern. Οι άλλες παρόμοιες τεχνικές που αναπτύχθηκαν αργότερα για την ανάλυση RNA ή πρωτεϊνών (western blot, northern blot, southwestern blot) ονομάστηκαν κατ αναλογία (και, προφανώς, κατ ευφημισμό!) του ονόματος του Southern. Η «Southern blot», συνεπώς, ξεκινά με κεφαλαίο γράμμα σε αντίθεση με τις υπόλοιπες. Μέθοδος: 1. Χρησιμοποιούνται περιοριστικά ένζυμα για να κοπεί το υψηλού μοριακού βάρους DNA σε μικρότερα τμήματα. 2. Το «κομμένο» DNA κατόπιν ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για να διαχωριστούν τα τμήματά του. 3. Η πηκτή επεξεργάζεται σε όξινο διάλυμα (π.χ. HCl) που διασπά περαιτέρω τα τμήματα DNA σε μικρότερα κομμάτια, υδρολύοντας τα μόρια πουρίνης (depurination), για πιο εύκολη μεταφορά από την πηκτή στη μεμβράνη. 4. Εάν η μεταφορά πρόκειται να γίνει σε αλκαλικό ph, η πηκτή κατόπιν τοποθετείται σε αλκαλικό διάλυμα (π.χ. NaOH) όπου διαχωρίζεται η διπλή έλικα των ηλεκτροφορημένων τμημάτων DNA (denaturation). Η επεξεργασία αυτή επιτρέπει την ευκολότερη προσκόλληση του αρνητικά φορτισμένου DNA στη θετικά φορτισμένη μεμβράνη, επιτρέπει την προσκόλληση του ανιχνευτή (όπως περιγράφεται παρακάτω) στις μονές αλύσους και καταστρέφει τυχόν υπολειμματικά RNA, που μπορεί να υπάρχουν μέσα στο DNA. 5. Ένα φύλο μεμβράνης από νιτρο-κυτταρίνη ή νάιλον τοποθετείται πάνω ή κάτω από την πηκτή, σε πλήρη επαφή (χωρίς «φυσαλίδες» αέρα). Κατόπιν, πάνω (ή κάτω) από τη μεμβράνη, εφάπτονται φύλλα διηθητικού χαρτιού και ασκείται ομοιόμορφη πίεση (συνήθως με κάποιο βάρος) για την εξασφάλιση καλής επαφής της μεμβράνης με την πηκτή. Το σύνολο τοποθετείται σε λεκάνη με ηλεκτρολυτικό διάλυμα (buffer), το οποίο διαπερνά την πηκτή και τη μεμβράνη, απορροφούμενο από το διηθητικό 50

51 χαρτί και μεταφέρει το DNA από την πηκτή στη μεμβράνη, όπου αυτό συνδέεται ηλεκτροστατικά. 6. Η μεμβράνη κατόπιν «ψήνεται» στους 60 με 100 C - στην περίπτωση της νιτρο-κυτταρίνης - ή εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία - στην περίπτωση μεμβράνης από νάιλον - για μονιμοποίηση της σύνδεσης του DNA με τη μεμβράνη. Η όλη διαδικασία αυτή της μεταφοράς του DNA από την πηκτή στη μεμβράνη ονομάζεται, λακωνικά, blot. 7. Τέλος το DNA της μεμβράνης εξετάζεται για την ύπαρξη ή όχι μιας γνωστής αλληλουχίας μέσω υβριδισμού με έναν ανιχνευτή - κομμάτι συμπληρωματικής DNA ή RNA αλληλουχίας - σεσημασμένο με κάποιο ραδιοϊσότοπο (συνήθως 32 P) ή με κάποια φθορίζουσα ή χρωμογενή χρωστική. Προς αποφυγή μη ειδικής προσκόλλησης του ανιχνευτή, η μεμβράνη επεξεργάζεται προηγουμένως με DNA από σπέρμα σολομού, απιονισμένη φορμαμίδη και απορρυπαντικά (π.χ. SDS). Κατόπιν η περίσσεια ανιχνευτή ξεπλένεται από τη μεμβράνη και τυχόν σημεία σύνδεσής του στο DNA ανιχνεύονται με αυτο-ραδιογραφία (επίθεση της μεμβράνης σε ακτινοευαίσθητη επιφάνεια και φωτογράφηση της) - στην περίπτωση ραδιοϊσοτόπου ή φθορίζοντος ανιχνευτή - ή με ανάπτυξη του χρώματος - σε περίπτωση χρήσης χρωμογενούς χρωστικής -. Ο υβριδισμός κατά Southern επιτρέπει την σαφή ανίχνευση της παρουσίας ή μη μιας γνωστής αλληλουχίας DNA (π.χ. ενός γονιδίου) σε κάποιο γενετικό υλικό, μη επηρεαζόμενος από παράγοντες που καθιστούν δύσχρηστες άλλες μεθόδους, όπως μικροί γενετικοί πολυμορφισμοί (ο ανιχνευτής έχει μεγάλη αλληλουχία σύνδεσης, σε αντίθεση με τους εκκινητές της PCR), μεγάλο μέγεθος της υπό μελέτη αλληλουχίας, κακή ποιότητα υλικού (πολυκατετμημένο DNA) κ.α. και συνεπώς χρησιμοποιείται εκεί όπου απαιτείται μεγάλη βεβαιότητα (π.χ. στη δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών), συχνά συμπληρωματικά με τις άλλες μεθόδους. Επίσης, επιτρέπει την εκτίμηση του αριθμού των αντιγράφων ενός γονιδίου (π.χ. ενός εισηγμένου διαγονιδίου) μέσω σύγκρισης με γενετικό υλικό που περιέχει ένα μόνο αντίγραφο του γονιδίου προς διερεύνηση. Απαραίτητη προϋπόθεση, όμως, είναι η διαθεσιμότητα επαρκούς ποσότητας γενετικού υλικού (συνήθως >5mg). 51

52 1.3.4 Δοκιμασία προφύλαξης από RNάση (RNase protection assay, nuclease protection assay- RPA, NPA) Είναι μια τεχνική που έχει ως σκοπό την ανίχνευση μεμονωμένων μορίων RNA γνωστής αλληλουχίας από ένα σύνθετο μείγμα, που έχει εξαχθεί από κύτταρα προς ανάλυση. Μπορεί να ανιχνεύσει ένα ή περισσότερα μόρια RNA ακόμα και με χαμηλή συνολική συγκέντρωση στο μείγμα. Μέθοδος: 1. Το RNA που έχει εξαχθεί αρχικά αναμιγνύεται με, συμπληρωματικούς της υπό εξέταση αλληλουχίας, ανιχνευτές RNA ή DNA και οι συμπληρωματικές αλυσίδες υβριδίζονται, σχηματίζοντας διπλής έλικας RNA (ή υβρίδιο DNA-RNA). Οι ανιχνευτές παρασκευάζονται με εισαγωγή (cloning) του γονιδιακού τμήματος που μας ενδιαφέρει σε γονιδιακό φορέα, με κατάλληλους προαγωγείς (SP6, T7 ή T3) και μεταγραφή in vitro, με τη χρήση DNA εξαρτώμενων RNA πολυμερασών από βακτηριοφάγους. Σημαίνονται ραδιοϊσοτοπικά με τη χρήση (συνήθως) dutp- 32 P. 2. Το μίγμα εκτίθεται σε ριβονουκλεάσες, οι οποίες διασπούν μόνο τις μονές αλύσους RNA και όχι τις διπλές. Έτσι τα μη υβριδισμένα μόρια διασπώνται σε μικρά ολιγονουκλεοτίδια ή νουκλεοτίδια. 3. Τα υβριδισμένα μόρια που ψάχνουμε, αν υπάρχουν, απεικονίζονται με παρόμοιο τρόπο που περιγράφηκε πιο πάνω για τον υβριδισμό κατά Southern, με αυτο-ραδιογραφία. Χρήσεις: Στη μελέτη μας η τεχνική χρησιμοποιήθηκε για την εξακρίβωση και την ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης (ή μη) γονιδίων όπως ο FKLF1, αντικαθιστώντας ή συμπληρώνοντας την RT-PCR. Άλλη χρήση είναι η χαρτογράφηση ιντρονίων και των 5' και 3' άκρων μεταγραφόμενων γονιδιακών περιοχών. Η τεχνική υβριδισμού σε «θυρίδες» (Slot-Blot) αποτελεί μια απλούστευση της RPA, όπου το RNA φορτώνεται στη μεμβράνη μέσω μιας συσκευής με πηγαδάκια- θυρίδες (slot-blot manifold), χωρίς να προηγηθεί ηλεκτροφόρηση σε πηκτή κι ακολουθεί υβριδισμός με κατάλληλο ανιχνευτή, όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Εξυπηρετεί για λόγους ταχύτητας αλλά χρειάζεται προσοχή, επειδή συχνά δίνει ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 52

53 Ο υβριδισμός σε μεμβράνη κατά northern (northern blotting) δίνει παρόμοιες πληροφορίες με την RPA αλλά είναι πιο χρονοβόρος και λιγότερο ποσοτικός. Ωστόσο, δίνει πληροφορίες και ως προς το μέγεθος του RNA στόχου, οι οποίες στη δοκιμασία προστασίας από RNάση χάνονται κατά την επεξεργασία με τη νουκλεάση. 53

54 1.3.5 Διαγονιδιακοί ποντικοί (transgenic)- ποντικοί με απενεργοποίηση γονιδίων (knockout) Οι διαγονιδιακοί (transgenic) ποντικοί είναι ποντικοί στους οποίους το γενετικό υλικό έχει τροποποιηθεί με μεθόδους μοριακής γενετικής, ώστε να έχουν κάποια κληρονομήσιμα χαρακτηριστικά που επιθυμούμε. Μπορούν να εκφράζουν ένα ή περισσότερα ξένα γονίδια, κάποια αλλοιωμένα (ως προς τη δομή) φυσιολογικά γονίδια ή να έχουν απαλλαγεί τελείως από κάποια τμήματα του γενετικού τους υλικού. Οι knockout ποντικοί είναι γενετικά τροποποιημένοι με τέτοιο τρόπο ώστε, ένα ή περισσότερα γονίδιά τους, να έχουν καταστεί ανενεργά. Η απενεργοποίηση αυτή ενός γονιδίου, του οποίου η νουκλεοτιδική αλληλουχία είναι γνωστή αλλά όχι και η λειτουργία, παρέχει σημαντικές πληροφορίες για το ρόλο του προϊόντος του γονιδίου στο συγκεκριμένο αλλά και σε συγγενείς οργανισμούς, ακόμη, κατ επέκταση, και στον άνθρωπο. Αυτό γίνεται παρατηρώντας το γενετικά τροποποιημένο ποντίκι για οποιεσδήποτε τυχόν αλλαγές σε σύγκριση με φυσιολογικά αδέρφια του. Η τεχνική εφαρμόζεται σε πολλούς οργανισμούς αλλά ο ποντικός είναι ο πιο κοντινός προς τον άνθρωπο, όπου μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα και χωρίς υπερβολικό κόστος. Για παράδειγμα, η απενεργοποίηση γονιδίων στους αρουραίους είναι πολύ πιο δύσκολη κι έγινε εφικτή μόλις το Οι πρώτοι knockout ποντικοί δημιουργήθηκαν από τους Mario R.Capecchi, Martin Evans και Oliver Smithies το , στους οποίους δόθηκε το βραβείο Nobel Ιατρικής το Χρήσεις: Οι άνθρωποι έχουν πολλά ομόλογα γονίδια με τους ποντικούς. Κατά συνέπεια η παρατήρηση των χαρακτηριστικών των διαγονιδιακών ποντικών μας δίνει πιθανώς χρήσιμες πληροφορίες για τις λειτουργίες αλλά και τη συμβολή των γονιδίων αυτών ή μεταλλάξεών τους σε διάφορες παθήσεις του ανθρώπου. Παραδείγματα έρευνας όπου υπήρξαν χρήσιμοι οι διαγονιδιακοί ποντικοί είναι στη μελέτη του καρκίνου, της παχυσαρκίας, των καρδιοπαθειών, του σακχαρώδη διαβήτη, των αρθροπαθειών, της κατάχρησης ουσιών, των αγχωδών διαταραχών, των γηρατειών και της νόσου Parkinson, όπως επίσης και στη μελέτη φαρμάκων και νέων θεραπειών, όπως η γονιδιακή θεραπεία. Η ονοματολογία των μεταλλαγμένων αυτών γενιών ποντικών συνήθως περιλαμβάνει το όνομα του γονιδίου που έχει τροποποιηθεί για παράδειγμα το p53 -/- ποντίκι, από το γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, του οποίου η αδρανοποίηση από 54

55 μεταλλάξεις στους ανθρώπους προκαλεί το σύνδρομο Li-Fraumeni, με δραματική αύξηση της συχνότητας κακοηθειών σε νεαρή ηλικία. Άλλα μοντέλα ποντικών ονομάζονται με βάση φυσικά τους χαρακτηριστικά, όπως το ποντίκι «Μαθουσάλας» (λόγω της συγκριτικά μεγάλης διάρκειας ζωής του). Τεχνική παραγωγής knockout ποντικών: υπάρχουν διάφορες παραλλαγές στη διαδικασία παραγωγής των διαγονιδιακών ποντικών. Μια τυπική διαδικασία είναι η εξής: Α) Παραγωγή χιμαιρικής βλαστοκύστης: 1. Το γονίδιο που πρόκειται να απαλειφθεί απομονώνεται από μια γονιδιωματική «βιβλιοθήκη» ποντικού. Κατόπιν, η νουκλεοτιδική του αλληλουχία τροποποιείται με τέτοιο τρόπο ώστε να γίνει ανενεργό. Συνήθως στην αλληλουχία προστίθεται κι ένα σηματοδοτικό γονίδιο, φυσιολογικά ανύπαρκτο στους ποντικούς, που προσφέρει αντίσταση σε κάποιον τοξικό παράγοντα ή προσφέρει κάποιο ιδιαίτερο χαρακτηριστικό, π.χ. χρώμα ή φθορισμό. Οι πιθανότητες πετυχημένου ομόλογου ανασυνδυασμού είναι εξαιρετικά μικρές και συνεπώς η πλειονότητα των επηρεασμένων κυττάρων, στα οποία έχει συμβεί ομόλογος ανασυνδυασμός, θα έχει αλλαγμένο το γονίδιο μόνο στο ένα από τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα, συνεπώς θα είναι «ετερόζυγα» για το αλλοιωμένο γονίδιο. 2. Απομονώνονται εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα ποντικών διαφορετικού χρώματος από εκείνους στους οποίους πρόκειται να γίνει η εμφύτευση, (π.χ. άσπρους) και καλλιεργούνται in vitro. 3. Εισάγεται η τροποποιημένη γονιδιακή αλληλουχία στα στελεχιαία κύτταρα του σταδίου 2 με ηλεκτροπορισμό (δημιουργία πόρων στην κυτταρική μεμβράνη με στιγμιαία ηλεκτρική εκκένωση βλ. παρακάτω), μικροένεση ή με ρετροϊικό φορέα. Μερικά στελεχιαία κύτταρα θα ενσωματώσουν τη νέα αλληλουχία στο γενετικό τους υλικό στη θέση του αρχικού γονιδίου χάρη σε μια διαδικασία που λέγεται ομόλογος ανασυνδυασμός (homologous recombination). Αυτό συμβαίνει επειδή η αλληλουχία του αρχικού και του τροποποιημένου γονιδίου είναι πολύ παραπλήσιες. Χάρη στο σηματοδοτικό γονίδιο που έχει εισαχθεί μπορούν να επιλεγούν τα κύτταρα όπου έχει γίνει η αντικατάσταση και τα υπόλοιπα να εξαλειφθούν. 4. Τα τροποποιημένα στελεχιαία κύτταρα εισάγονται σε βλαστοκύστες άλλων ποντικών, διαφορετικού χρώματος (π.χ. γκρίζων) και εμφυτεύονται σε μήτρες θηλυκών ποντικών. Οι βλαστοκύστες αυτές περιέχουν δύο ειδών στελεχιαία 55

56 κύτταρα, τα φυσιολογικά (γκρίζων ποντικών) και τα τροποποιημένα, όπου το γονίδιο στόχος έχει αδρανοποιηθεί (άσπρων ποντικών). Τα νεογέννητα ποντίκια συνεπώς θα είναι χιμαιρικά, με μέρος του σώματος (και του τριχώματος) φυσιολογικό (γκρίζο) και μέρος μεταλλαγμένο (άσπρο). 5. Τα νεογέννητα ποντίκια είναι χρήσιμα μόνο εάν ο χιμαιρισμός έχει επηρεάσει και τα γενετικά τους κύτταρα (ωάρια και σπερματοζωάρια). Διασταυρώνονται με ποντίκια του είδους στο οποίο έχει γίνει η τροποποίηση (άσπρα) και οι απόγονοι που είναι μόνο αυτού του είδους (άσπροι), θα είναι ημιζυγώτες για το ενδιαφέρον γονίδιο (θα έχουν μόνο ένα αλλήλιο, στο άλλο χρωμόσωμα θα είναι το ανενεργό). Με περαιτέρω διασταυρώσεις θα προκύψουν ομοζυγωτικοί ποντικοί για το τροποποιημένο (ανενεργό) γονίδιο. Περιορισμοί: Η χρησιμότητα της τεχνικής περιορίζεται σε κάποιες περιπτώσεις από το γεγονός ότι η αδρανοποίηση κάποιων γονιδίων είναι θανατηφόρα για τα μεταλλαγμένα έμβρυα, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου σε ενήλικα ποντίκια. Αυτό συμβαίνει περίπου στο 15% των knockouts και συχνά παρακάμπτεται με γονίδια τα οποία αδρανοποιούνται υπό συγκεκριμένες συνθήκες (conditional mutations), π.χ. μετά τη χορήγηση κάποιου φαρμάκου. Μερικές επίσης φορές η απενεργοποίηση κάποιου γονιδίου δεν έχει ορατά αποτελέσματα ή τα μεταλλαγμένα ποντίκια έχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά από ανθρώπους στους οποίους τα αντίστοιχα γονίδια έχουν αδρανοποιηθεί από συγγενείς μεταλλάξεις. Για παράδειγμα, οι όγκοι στα p53 -/- ποντίκια αναπτύσσονται σε διαφορετικούς ιστούς από ότι στους ανθρώπους με μεταλλάξεις του p53. Υπάρχει συχνά κάποια διαφοροποίηση στο φαινότυπο που προκύπτει, ανάλογα με το στέλεχος ποντικών από το οποίο προέρχονται τα τροποποιημένα στελεχιαία κύτταρα. Συνήθως χρησιμοποιείται το στέλεχος άσπρων ποντικών 129, το οποίο ωστόσο δεν είναι κατάλληλο για πολλά πειράματα (π.χ. συμπεριφοράς) και γι αυτό πρέπει να διασταυρωθούν οι μεταλλαγμένοι απόγονοι με άλλα στελέχη. Τέλος, μερικά γονίδια δεν απενεργοποιούνται εύκολα λόγω επαναληπτικών αλληλουχιών, DNA μεθυλίωσης ή παρουσίας ετεροχρωματίνης, που δυσκολεύουν τον ομόλογο ανασυνδυασμό. Η τεχνική της παραγωγής διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν ξένα γονίδια είναι παρόμοια με αυτή που περιγράψαμε, με τη διαφορά ότι εκεί δεν αντικαθίσταται κάποιο φυσιολογικό γονίδιο από κάποιο ανενεργό αλλά εισάγεται το 56

57 ξένο γονίδιο (ένα ή περισσότερα αντίτυπα), είτε σε κάποια ανενεργή περιοχή του γενετικού υλικού με ομόλογο ανασυνδυασμό (όπως περιγράφηκε) είτε με τη χρήση ρετροϊικού φορέα. Οι πρώτοι διαγονιδιακοί ποντικοί (F0: founders 0) που παράγονται με αυτό τον τρόπο, έχουν αντίγραφα του νέου γονιδίου μόνο σε κάποιο ποσοστό των κυττάρων τους και λέγονται χιμαιρικοί. Κάποιοι από αυτούς θα έχουν ενσωματώσει το ξένο γονίδιο στους γαμέτες τους και η διασταύρωσή τους θα δώσει απογόνους που θα το φέρουν σε όλα τα κύτταρά τους (F1: founders 1). Επειδή το ξένο γονίδιο βρίσκεται συνήθως μόνο στο ένα από τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα (ενός ή περισσοτέρων ζευγών χρωμοσωμάτων), χωρίς ομόλογό του στο άλλο, οι ποντικοί αυτοί λέγονται ημιζυγώτες (hemizygotes). Η περαιτέρω διασταύρωσή τους θα δώσει ποντικούς φυσιολογικούς, ημίζυγους ή ομόζυγους για το νέο γονίδιο (F2). FKLF1 FKLF1 FKLF1 Μικροένεση σε αυγό ποντικού heterozygous homozygous Σχηματική αναπαράσταση της παραγωγής διαγονιδιακών-knockout ποντικών 57

58 1.3.6 Ιικοί Φορείς Γονιδιακή Θεραπεία Οι ιικοί φορείς (viral vectors) είναι ένα εργαλείο για την εισαγωγή γενετικού υλικού στον πυρήνα κυττάρων. Αυτό μπορεί να γίνει σε ζωντανούς οργανισμούς (in vivo) ή σε καλλιέργειες κυττάρων (in vitro). Οι ιοί έχουν αναπτύξει εξειδικευμένους μοριακούς μηχανισμούς για να εισάγουν το γενετικό τους υλικό στα κύτταρα που μολύνουν. Η εισαγωγή αυτή λέγεται μεταγωγή (transduction) και χρησιμοποιείται για την εισαγωγή γονιδίων σε κύτταρα από τους μοριακούς βιολόγους από τη δεκαετία του 70, οπότε ο Paul Berg χρησιμοποίησε έναν τροποποιημένο ιό SV40 με γενετικό υλικό από τον βακτηριοφάγο λ για να διαμολύνει κύτταρα νεφρού πιθήκων, σε κυτταρικές καλλιέργειες. Οι ιικοί φορείς έχουν μεγάλες διαφορές, ανάλογα με τις εφαρμογές για τις οποίες προορίζονται αλλά έχουν και μερικές κοινές βασικές ιδιότητες και προϋποθέσεις για τη χρήση τους: α) Ασφάλεια: οι ιικοί φορείς συχνά προέρχονται από κάποιους παθογόνους ιούς, οι οποίοι τροποποιούνται κατάλληλα ώστε να ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος από τη χρήση τους. Αυτό συνήθως προϋποθέτει την αφαίρεση ενός τμήματος του γενετικού τους υλικού, το οποίο ευθύνεται για τον πολλαπλασιασμό τους μέσα στα κύτταρα. Έτσι είναι ικανοί να εισέρχονται στα κύτταρα και να ενσωματώνουν τα γονίδια που μας ενδιαφέρουν, αλλά δεν μπορούν να πολλαπλασιαστούν και να λύσουν τα κύτταρα ξενιστές από μόνοι τους, οπότε, όταν αυτό είναι επιθυμητό (π.χ. κατά την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων του φορέα), χρησιμοποιούνται βοηθητικοί φορείς που εισάγουν τα γονίδια πολλαπλασιασμού στα μολυσμένα κύτταρα. β) Χαμηλή τοξικότητα: ο φορέας πρέπει να επηρεάζει ελάχιστα τη φυσιολογία των κυττάρων που επιμολύνει. γ) Σταθερότητα: η ικανότητα πολλών ιών να αναδιατάσσουν το γονιδίωμά τους προκαλεί πολλά, προφανή, προβλήματα τόσο στη λειτουργικότητα όσο και στην ασφάλειά τους ως ιικοί φορείς και συνεπώς γίνεται κάθε δυνατή προσπάθεια για τον περιορισμό της ικανότητάς τους αυτής. δ) Ειδικότητα για τύπους κυττάρων: οι περισσότεροι ιικοί φορείς κατασκευάζονται έτσι ώστε να μπορούν να μολύνουν όσο το δυνατό περισσότερους διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Ωστόσο, κάποτε προτιμάται το αντίθετο και με κατάλληλη τροποποίηση του ιικού υποδοχέα μπορεί ο φορέας να στοχευθεί σε έναν συγκεκριμένο κυτταρικό υποδοχέα. 58

59 Οι ιικοί φορείς αρχικά αναπτύχθηκαν ως εναλλακτική μέθοδος της εισαγωγής «γυμνού» DNA σε κύτταρα, η οποία παραδοσιακά γίνεται με καθίζηση με φωσφορικό ασβέστιο ή ηλεκτροπορισμό (βλ. παρακάτω). Υπερέχει εκείνων στο ότι σχεδόν 100% των κυττάρων μολύνονται και δεν επηρεάζεται η βιωσιμότητά τους, ενώ πολλοί ιοί ενσωματώνουν το γενετικό υλικό που μεταφέρουν στο κυτταρικό γονιδίωμα πετυχαίνοντας συνεχή έκφραση. Ωστόσο, οι παραδοσιακές τεχνικές ακόμα χρησιμοποιούνται σε πολλές εφαρμογές λόγω της πολυπλοκότητας κατασκευής των ιικών φορέων. Με τους ιικούς φορείς επιτυγχάνεται η έκφραση γονιδίων και η σύνθεση πρωτεϊνών που μπορεί, με τη χρήση ρετροϊών, να κληρονομείται και στις επόμενες γενεές κυττάρων, τα οποία μπορούν κατόπιν να μελετηθούν in vitro ή in vivo (μετά από μεταμόσχευσή τους). Πιο πρόσφατα χρησιμοποιούνται και γονίδια που εκφράζουν βραχέα ρυθμιστικά RNAs (sirnas), με σκοπό τον αποκλεισμό της παραγωγής μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης πολύ γρηγορότερα από ότι με τους μεταλλαγμένους οργανισμούς αλλά με λιγότερο αξιόπιστα αποτελέσματα. Τύποι ιικών φορέων α) Ρετρο-ιικοί (retroviruses): βασίζονται συνήθως στον ιό Moloney της λευχαιμίας των ποντικών και ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του λήπτη με σταθερό τρόπο μέσω της χρήσης μιας αντίστροφης μεταγραφάσης. Έχουν χρησιμοποιηθεί σε αρκετές κλινικές μελέτες όπως η SCID-X1, της βαριάς συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας. Ωστόσο μολύνουν το γονιδίωμα μόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων με αποτέλεσμα τη δυσκολία στη χρήση τους για επιμόλυνση στελεχιαίων ή άλλων, αργά διαιρούμενων κυττάρων, όπως οι νευρώνες. Έχουν εμπλακεί στην πρόκληση λευχαιμιών και άλλων νεοπλασιών λόγω της τυχαίας εισαγωγής κάποιων από τα πολυάριθμα αντίγραφα του φορέα κοντά σε ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία ενεργοποιούν ή αδρανοποιούν αντίστοιχα (287). β) Λέντι-ιικοί (Lentiviruses): βασίζονται στον ιό του AIDS του ανθρώπου ή των πιθήκων (HIV, SIV) και είναι μία υποκατηγορία ρετροϊών που έχουν αναπτύξει την ικανότητα να εισέρχονται στο γονιδίωμα και μη διαιρούμενων κυττάρων (όπως τα Τ λεμφοκύτταρα). Χάρη σε αυτή την ικανότητά τους και παρά την δυνητική επικινδυνότητά τους έχουν γίνει προσφιλείς σε εφαρμογές όπως η γονιδιακή θεραπεία στελεχιαίων κυττάρων. 59

60 Όπως και οι ρετρο-ιοί, μεταγράφουν αντίστροφα το γενετικό τους υλικό (RNA) σε DNA με μια αντίστροφη μεταγραφάση και αυτό κατόπιν εισέρχεται στο γονιδίωμα, σε μια τυχαία θέση, χάρη σε μία ιντεγκράση. Ο ιός, που τώρα καλείται προ-ιός, παραμένει στο DNA του κυττάρου-ξενιστή και μεταφέρεται στους απογόνους του όταν αυτό διαιρείται. Όπως και στους ρετρο-ιούς, η τυχαία θέση της ενσωμάτωσης αυτής μπορεί να προκαλέσει διαταραχή στην έκφραση γειτονικών γονιδίων και ογκογένεση ωστόσο αυτό παρατηρείται αρκετά πιο σπάνια, πιθανώς λόγω των λιγότερων εισερχόμενων αντιγράφων που απαιτούνται για επαρκή έκφραση. γ) Αδενοϊοί (Adenoviruses) Σε αντίθεση με τους ρετρο-ιούς και λεντι-ιούς, το DNA των αδενοϊών δεν ενσωματώνεται στο DNA του κυττάρου ξενιστή και συνεπώς δεν πολλαπλασιάζεται και δεν μεταδίδεται στους απογόνους του. Αυτό περιορίζει τη χρήση τους κυρίως στη βασική έρευνα και στη δημιουργία DNA εμβολίων. Η ανοσοποίηση πολλών ανθρώπων από προηγούμενη επαφή τους με αδενοϊούς, που προκαλούν κοινές λοιμώξεις του αναπνευστικού, πεπτικού και άλλων βλεννογόνων, μπορεί να προκαλέσει δυνητικά επικίνδυνες αλλεργικές αντιδράσεις. Άλλοι χρησιμοποιούμενοι φορείς είναι οι αδενο-εξαρτώμενοι (adenoassociated) ιοί, οι ιοί foamy και κάποια μικρομόρια που βασίζονται κυρίως σε φωσφολιπίδια. Γονιδιακή Θεραπεία είναι η χρησιμοποίηση ιικών φορέων για τη θεραπεία ασθενειών, γενετικών ή μη, μέσω της εισαγωγής και έκφρασης θεραπευτικών γονιδίων. Τα γονίδια αυτά μπορεί να υποκαθιστούν κάποια ελαττωματικά γονίδια, όπως στη βαριά συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ή στη μεσογειακή και δρεπανοκυτταρική αναιμία, ή να παράγουν κάποια πρωτεΐνη που είναι χρήσιμη στην καταπολέμηση μιας χρόνιας λοίμωξης (π.χ. AIDS, ηπατίτιδα) ή στη διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος (εν είδη εμβολίων). Αρκετές τέτοιες απόπειρες έχουν στεφθεί με επιτυχία στο εργαστήριο, σε πειραματόζωα ή σε κυτταρικές καλλιέργειες. Ωστόσο στην κλινική πράξη παρουσιάζονται προβλήματα που οφείλονται στη σταδιακή απενεργοποίηση των μεταφερόμενων γονιδίων, στην ανοσολογική απάντηση στους ιικούς φορείς, σε ογκογένεση από ενεργοποίηση από τους ρετροϊικούς φορείς ογκογονιδίων και άλλα. Στο μέλλον τα προβλήματα αυτά 60

61 μπορούν να αντιμετωπισθούν με τη βέλτιστη σχεδίαση των ιικών φορέων και να ανοίξει ένα νέο κεφάλαιο στην ιατρική θεραπευτική. 61

62 1.3.7 Καλλιέργεια και επιμόλυνση κυττάρων Καλλιέργεια είναι η τεχνική με την οποία προκαρυωτικά, ευκαρυωτικά ή φυτικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Αποτελεί εργαστηριακή τεχνική ρουτίνας από τη δεκαετία του 1950, έχοντας εφευρεθεί σαν ιδέα τον 19ο αιώνα, όταν ο Sydney Ringer ανέπτυξε αλατούχα διαλύματα ηλεκτρολυτών για τη διατήρηση της λειτουργίας παρασκευασμάτων καρδιάς, τα οποία ο Wilhelm Roux το 1885 χρησιμοποίησε για τη διατήρηση εμβρυϊκού ιστού από κότες. Η ραγδαία εξέλιξη επήλθε μετά το 1940, με την μαζική παραγωγή εμβολίων κατά του ιού της πολιομυελίτιδας (Salk) σε κυτταρικές καλλιέργειες. Αρχές κυτταρικών καλλιεργειών: α) Απομόνωση κυττάρων: υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για την απομόνωση κυττάρων από ιστούς για καλλιέργεια. Τα κύτταρα του περιφερικού αίματος (λευκά αιμοσφαίρια) και του μυελού των οστών μπορούν εύκολα να καλλιεργηθούν. Άλλοι ιστοί πρέπει πρώτα να πεφθούν με τρυψίνη, κολλαγενάση ή προνάση ή απλά τμήματά τους να τοποθετηθούν σε θρεπτικό υλικό, ώστε κάποια κύτταρα να διαφύγουν στο καλλιεργητικό υλικό και να πολλαπλασιαστούν. Τα κύτταρα που προέρχονται κατευθείαν από κάποιον ιστό λέγονται πρωταρχικά (primary) κι έχουν συνήθως περιορισμένη διάρκεια ζωής και ανακαλλιεργειών (με την εξαίρεση κάποιων κακοηθών κυττάρων). Αντίθετα, τα κύτταρα που προέρχονται από κυτταρικές σειρές οι οποίες προήλθαν είτε από φυσικές είτε από τεχνητές μεταλλάξεις (συχνά με πρόκληση υπερέκφρασης του γονιδίου της τελομεράσης) επιζούν και πολλαπλασιάζονται απεριόριστα. Υπάρχει μεγάλος αριθμός κυτταρικών σειρών οι οποίες είναι αντιπροσωπευτικές σχεδόν όλων των ιστών πολυάριθμων ζωντανών οργανισμών. Συνθήκες καλλιέργειας: τυπικά τα κύτταρα καλλιεργούνται σε κατάλληλη θερμοκρασία και περιεκτικότητα διοξειδίου του άνθρακα (συνήθως 37 C, 5% CO2), σε κατάλληλη συσκευή επώασης (κλίβανο) και σε κατάλληλο καλλιεργητικό υλικό (με ποικίλο, κατάλληλο για κάθε τύπο κυττάρων ph και συγκεντρώσεις γλυκόζης, άλλων θρεπτικών προϊόντων και αυξητικών παραγόντων). Οι συνθήκες προσαρμόζονται ειδικά για κάθε τύπο κυττάρων αλλά και για κάθε πείραμα και οι 62

63 διαφοροποιήσεις τους μπορούν να επηρεάσουν το φαινότυπο των καλλιεργούμενων κυττάρων. Μερικά κύτταρα, όπως τα λευκά αιμοσφαίρια, αναπτύσσονται χωρίς να προσκολλώνται σε κάποια επιφάνεια και, συνεπώς, καλλιεργούνται σε εναιωρήματα, ενώ άλλα απαιτούν επιφάνεια προσκόλλησης. β) Χειρισμός κυτταρικών καλλιεργειών Καθώς τα κύτταρα τα οποία καλλιεργούνται πολλαπλασιάζονται, καταλαμβάνουν όλο το διαθέσιμο χώρο και αυτό έχει ως αποτέλεσμα: - εξάντληση των θρεπτικών υλικών - συγκέντρωση αποπτωτικών/ νεκρών κυττάρων - σήματα αναστολής της ανάπτυξης από γειτονικά κύτταρα - σήματα ανεπιθύμητης διαφοροποίησης Αυτά αποφεύγονται με τακτικές αραιώσεις των κυττάρων (passaging) και ανανεώσεις του θρεπτικού τους υλικού υπό στείρες συνθήκες για την αποφυγή μολύνσεων με μικρόβια. Τα προσκολλημένα κύτταρα πρέπει πρώτα να αποκολλούνται, με έκθεσή τους σε διάλυμα τρυψίνης-edta. γ) Διαμόλυνση με ξένο DNA (transfection and transduction) Η εισαγωγή ξένων γονιδίων σε καλλιεργούμενα κύτταρα αποσκοπεί στην έκφραση από αυτά κάποιας ενδιαφέρουσας πρωτεΐνης και στη μελέτη των μοριακών παραγόντων που την επηρεάζουν. Πιο πρόσφατα έγινε δυνατή και η απενεργοποίηση γονιδίων, με διαμόλυνση με αλληλουχίες έκφρασης RNAi (βραχέα τροποποιητικά της έκφρασης τμήματα RNA). Η εισαγωγή αυτή γίνεται κυρίως με: - Ηλεκτροπορισμό, όπου τα κύτταρα αραιώνονται με συγκεκριμένη συγκέντρωση σε ηλεκτρολυτικό διάλυμα που περιέχει το επιθυμητό γενετικό υλικό με τη μορφή πλασμιδίου, τοποθετούνται σε κυβέτες και εφαρμόζεται, στιγμιαία, υψηλή τάση, από ειδική συσκευή (electroporator), με αποτέλεσμα τη διάνοιξη πόρων στην κυτταρική τους μεμβράνη και την εισαγωγή των πλασμιδίων σε κάποια από αυτά, τα οποία κατόπιν επιλέγονται με βάση κάποιο αποκτηθέν χαρακτηριστικό τους. - Καθίζηση σε διάλυμα φωσφορικού ασβεστίου. - Διαμόλυνση με ιικούς φορείς, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω. δ) Παραγωγή ιικών φορέων σε καλλιέργειες 63

64 Τροποποιημένοι ιοί που έχουν εισέλθει σε κυτταρικές σειρές με τους ανωτέρω τρόπους, μπορούν να παραχθούν σε μεγάλες ποσότητες από το υπερκείμενο διάλυμα τέτοιων καλλιεργειών υπό κατάλληλες συνθήκες. Τα βίρια (ιικά σωμάτια) που παράγονται θα είναι πακεταρισμένα σε τμήματα της κυτταρικής μεμβράνης των κυττάρων ξενιστών, γεγονός που καθορίζει τον τροπισμό τους και την μελλοντική ικανότητά τους να εισέρχονται σε άλλα κύτταρα. Υπάρχουν π.χ. φορείς που προσβάλλουν μόνο κύτταρα ποντικών (οικοτροπικοί- ecotropic) και άλλοι που προσβάλλουν και κύτταρα πρωτευόντων (αμφοτροπικοί- amphotropic). Οι κυτταρικές σειρές, οι οποίες χρησιμοποιούνται γι αυτή τη διαδικασία, ονομάζονται παραγωγικές σειρές και διακρίνονται επίσης σε οικοτροπικές και αμφοτροπικές. Μερικές κοινές κυτταρικές σειρές είναι: Ανθρώπινες * Κ562 (ερυθρολευχαιμία) * MCF-7 (καρκίνος μαστού) * MDA-MB-438 (καρκίνος μαστού) * U87 (γλοιοβλάστωμα) * A172 (γλοίωμα) * HeLa (καρκίνος τραχήλου μήτρας της Henrietta Lacks) * HL60 (προμυελοκυτταρική λευχαιμία) * A549 (καρκίνος πνεύμονα) * HEK 293 (νεφρός) * Jurkat (T λεμφοβλαστική λευχαιμία) * Lncap (καρκίνος προστάτη) Κυτταρικές σειρές ποντικού * 3T3 (εμβρυονικοί ινοβλάστες) * MEL (ερυθρολευχαιμία) * MC3T3 (εμβρυονικά κρανιακά) * C3H-10T1/2 (εμβρυονικά μεσεγχυματικά) 64

65 1.3.8 Ανοσοφαινότυπος Ο ανοσοφαινότυπος είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της έκφρασης κυτταρικών πρωτεϊνών και για τη διάκριση και τον διαχωρισμό κυττάρων, ανάλογα με τις πρωτεΐνες τις οποίες εκφράζουν. Χρησιμοποιείται τόσο στη βασική έρευνα όσο και για διαγνωστικούς σκοπούς, και σαν υλικό μπορεί να χρησιμοποιηθούν εναιωρήματα κυττάρων ή ιστολογικά παρασκευάσματα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η διάκριση των λευχαιμιών με βάση τα επιφανειακά αντιγόνα CD (clusters of differentiation). Στην κυτταρομετρία ροής κύτταρα σε εναιώρημα σημαίνονται με φωσφορίζοντα αντισώματα κατά των, υπό έλεγχο, πρωτεϊνών (συνήθως της κυτταρικής μεμβράνης τους) και κατόπιν διέρχονται από ένα κυτταρόμετρο ροής (flow cytometer) ή έναν πιο εξειδικευμένο διαχωριστή κυττάρων (FACS: Fluorescence- activated cell sorting), που χρησιμοποιούν ακτίνες λέιζερ για να αναλύσουν ή/και να διαχωρίσουν τα διερχόμενα κύτταρα, ανάλογα με τη σήμανσή τους. Κατόπιν, γίνεται ανάλυση του αριθμού, της ποσοστιαίας αναλογίας και της έντασης φθορισμού των σεσημασμένων κυττάρων με ειδικό λογισμικό. Η ένταση φθορισμού αντικατοπτρίζει τον αριθμό των συνδεμένων, φθοριζόντων αντισωμάτων ανά κύτταρο και συνεπώς, κατά προσέγγιση, το ποσό της υπό εξέτασης πρωτεΐνης. Χάρη στην ύπαρξη τριών κύριων φθοροχρωστικών - αλλά και πολλών άλλων παραλλαγών τους - και τη χρήση κυτταρομέτρων, με περισσότερα από ένα λέιζερ (Blue Argon Laser- μήκος κύματος 488nm και Red Diode Laser- μήκος κύματος 635nm), έχουμε τη δυνατότητα να αναλύουμε ταυτόχρονα την έκφραση περισσότερων από μια πρωτεϊνών και να βγάζουμε χρήσιμα συμπεράσματα από τους συνδυασμούς τους. Οι ευρύτερα σήμερα χρησιμοποιούμενες φθοροχρωστικές είναι: Πράσινη (συνήθως ονομάζεται FL1): fluoroscein isothiocyanate (FITC), Alexa Fluor 488, green flurescent protein (GFP), carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester CFDA-SE, DyLight 488 Πορτοκαλί (FL2): phycoerythrin (PE) Κόκκινη (FL3): peridinin chlorophyll protein (PerCP), phycoerythrin PE- Alexa Fluor 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR), PE-Cy5.5, PI Υπέρυθρη (FL4): phycoerythrin PE-Alexa Fluor 750, PE-Cy7 65

66 Μπλε: allophycocyanin (APC), APC-Cy7 Έτσι αναλύονται εκατομμύρια κύτταρα σε λίγα λεπτά της ώρας. 66

67 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Ρετροϊικός Φορέας του FKLF Κυτταρικές Σειρές Όλες οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37 ο C και 7.5% CO 2 σε Dulbeco s Modified Eagle s media (DMEM) με 10% βόειο εμβρυϊκό ζωμό (FBS), από τον οποίον απενεργοποιήθηκε το συμπλήρωμα μέσω θέρμανσης στους 60 ο C επί 30'. Η ερυθρολευχαιμική κυτταρική σειρά ποντικού MEL585 που χρησιμοποιήθηκε (288) περιείχε είτε ένα τεχνητό χρωμόσωμα YAC (yeast artificial chromosome) ανθρώπινης β αλύσου μεγέθους 144kb (289) είτε μια κασέτα έκφρασης της ανθρώπινης A γ-αλύσου με έναν προαγωγέα της περιοχής -159, συνδεμένο με έναν σύνθετο μlcr ενισχυτή, ενσωματωμένη στο γενετικό υλικό των κυττάρων (290). Τα κύτταρα MEL κινητοποιήθηκαν για διαφοροποίηση μέσω καλλιέργειας σε 3mM N,N 1 -εξαμεθυλική δι-ακεταμίδη (Aldrich) και 10 μm αιμίνη (Sigma) για 4 ημέρες (288) Ρετροϊικοί Φορείς Ο ρετροϊικός φορέας του FKLF1 δημιουργήθηκε απομονώνοντας ένα γονιδιακό τμήμα 1.5 kb με τη χρήση των περιοριστικών ενζύμων EcoRI και NotI, από το πλασμίδιο psg5dd/fklf-1 (28) το οποίο περιείχε το cdna του FKLF1 και εισάγοντας αυτό το τμήμα στην περιοχή μεταξύ των περιοριστικών ενζύμων EcoRI- NotI του ρετροϊικού φορέα pmx-ires-gfp (291) (σχήμα 1), ο οποίος εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP: green fluorescent protein). Ο φορέας που δημιουργήθηκε, ήταν ένας φορέας διπλής έκφρασης (bicistronic) FKLF1 και πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (σχήμα 1). Ως στοιχείο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ένας GFP φορέας αναφοράς (292). 67

68 Δημιουργήθηκαν παραγωγικές σειρές των ρετροϊών με διαμόλυνση της οικοτροπικής κυτταρικής σειράς GP+E86 και απομόνωσης κλώνων θετικών για GFP μέσω ανοσοφθορισμού (FACS). Οι τίτλοι του φορέα προσδιορίστηκαν μέσω διαδοχικής αραίωσης των υπερκείμενων καλλιεργειών των φορέων, προσθήκης τους σε καθορισμένες συγκεντρώσεις NIH3T3 κυττάρων και ανάλυσης της έκφρασης GFP σε αυτά, μετά την επακόλουθη επιμόλυνσή τους. Οι παραγωγικοί κλώνοι ελέγχθηκαν για απουσία ιικών σωματίων ικανών για αυτο-πολλαπλασιασμό με τυποποιημένες μεθόδους. Επίσης έγινε Southern blot των παραγωγικών και επιμολυσμένων κυττάρων για εξακρίβωση της παρουσίας του ιικού DNA (294). πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη FKLF1 Σχήμα 1. Σχεδιασμός φορέα FKLF1. Το cdna του FKLF1 επικολλήθηκε μπροστά από το cdna της GFP σε έναν προκατασκευασμένο γαμμα-ρετροϊικό φορέα pmx-ires-egfp. Έτσι δημιουργείται ένας φορέας διπλής έκφρασης (bi-cistronic) FKLF1/GFP. LTR: ιϊκός επαγωγέας (long terminal repeat), IRES: περιοχή προσέλκυσης ριβοσώματος (internal ribosome entry site), GFP: πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (green fluorescent protein), sd, sa: περιοχές μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας (splice donor and acceptor sites), pa: σινιάλο πολυαδενυλίωσης (poly-adenylation signal), βέλος: έναρξη μεταγραφής Επιμόλυνση της MEL κυτταρικής σειράς Τα κύτταρα MEL επιμολύνθηκαν με καλλιέργεια 24 ωρών σε φιλτραρισμένο υπερκείμενο διαλύματος που περιείχε τον ιό και 8 mg/ml πολυβρήνης (hexadimethrine bromide- polybrene). Κατόπιν τα κύτταρα, αφού πλύθηκαν, καλλιεργήθηκαν για μερικές ημέρες και τα GFP(+) απομονώθηκαν με FACS Vantage 68

69 (Beckton Dickinson, San Jose, CA). Επιμέρους κλώνοι, κατόπιν, διαχωρίστηκαν με περιοριστική αραίωση Επιμολύνσεις κυττάρων μυελού ποντικών Χρησιμοποιήθηκε η σειρά διαγονιδιακών ποντικών 1279 (293). Η σειρά αυτή περιέχει 3 αντίγραφα ενός διαγονιδίου που περιέχει ένα τμήμα 2.5 kb του ενισχυτή μlcr, συνδεμένο με ένα εκφραζόμενο τμήμα της ανθρώπινης A γ-αλύσου, περιλαμβανομένου ενός προαγωγέα 1348 bp. Συλλέχθηκαν κύτταρα μυελού οστών από ποντικούς στους οποίους είχε χορηγηθεί 5-FU ενδοπεριτοναϊκά και επιμολύνθηκαν ως εξής: Α) Έγινε κινητοποίηση 2 ημερών στις ακόλουθες συνθήκες καλλιέργειας: 1x10 6 κύτταρα/ml σε Iscove modified Dulbeco medium (IMDM, Gibco/BRL) με 10% προσδιορισμένο FBS (Invitrogen, Purchase, NY) και L-γλουταμίνη, πυρουβικό νάτριο, μη απαραίτητα αμινοξέα, αντιβιοτικά, 5% συμπλήρωμα ιντερλευκίνης-3(il- 3, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), 100 ng/ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη-6 (IL-6, Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ) και 50 ng/ml ανασυνδυασμένο παράγοντα στελεχιαίων κυττάρων ποντικού (SCF, PeproTech., Rocky Hill, NJ) στους 37 C, 5% CO 2 επί 48 ώρες. Β) Κατόπιν τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε τρυβλία με ακτινοβολημένα (15 Gy) παραγωγικά κύτταρα του ρετροϊού σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, σε συγκέντρωση 5-10x10 6 κύτταρα μυελού ανά τρυβλίο 10-cm, με 10 ml του ανωτέρω καλλιεργητικού υλικού και επιπλέον προσθήκη πολυβρήνης (polybrene) 8 µg/ml. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας ως ανωτέρω συλλέχθηκαν τα μη προσκολλημένα στα τρυβλία κύτταρα, προσεκτικά, πάνω σε πάγο και πλύθηκαν με κρύο αλατούχο ισοοσμωτικό διάλυμα Hanks (HBSS, Gibco BRL). Γ) Από τα ανωτέρω επιμολυσμένα κύτταρα μυελού οστών έγιναν καλλιέργειες προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων, σε συγκέντρωση 4,000 κυττάρων/ml σε μεθυλοκυτταρίνη που περιέχει αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες ποντικού και ερυθροποιητίνη (Epo, StemGenix, Amherst, NY). Δ) Τα υπόλοιπα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μεταμοσχεύτηκαν σε ακτινοβολημένους με 1025 cgy συγγενείς ποντικούς σε δόση 5-10 x10 5 κύτταρα ανά ποντικό. Το αίμα των μεταμοσχευμένων ποντικών αναλύθηκε σε αιματολογικό 69

70 αναλυτή Cell-DYN 3500 (Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA) μετά από την αποκατάσταση της αιμοποίησης Ανοσοφθορισμός 1x10 6 κινητοποιημένα MEL κύτταρα, κύτταρα ερυθροποιητικών αποικιών ή 3μl περιφερικού αίματος ποντικών μεταμοσχευμένων με επιμολυσμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 30 min σε HBSS με 4% φορμαλδεΰδη και με διαδοχικές πλύσεις σε κρύα ακετόνη και συνδέθηκαν με mab για HbF, συνδεμένο με φυκοερυθρίνη (BD Bioscience, San Jose, CA). Μετά από μια τελική πλύση τα κύτταρα αναλύθηκαν με ανοσοφθορισμό δύο χρωμάτων (PE-κόκκινο, GFP-πράσινο) σε FACS SCAN (BD Bioscience) με λογισμικό CellQuest. 70

71 2.2 FKLF1 Knockout Ποντικοί Κατασκευή του φορέα στόχευσης για την απενεργοποίηση του FKLF1 Απομονώθηκε γονιδιωματικός κλώνος που περιέχει το πλήρες γονίδιο FKLF1 ποντικού από μια «βιβλιοθήκη» γονιδιωματικού υλικού του ποντικού 129SV (Stratagene). Έγινε ανάλυση αλληλουχίας που έδειξε ότι ο FKLF1 κωδικοποιείται από 4 εξόνια με 3 ιντρόνια (28). Σκοπός μας ήταν να δημιουργήσουμε έναν φορέα στόχευσης που θα αντικαθιστούσε την περιοχή που κωδικοποιεί τους δακτυλίους ψευδάργυρου (zinc finger) με το γονίδιο ανθεκτικότητας στη Νεομυκίνη (Neo r ). Τα 4.2 kb NotI (από τον φάγο φορέα) KpnI (ιντρόνιο 3) 5' ομόλογο τμήμα και το 4.7 kb HindIII (από το ιντρόνιο 3 μέχρι πέρα από το εξόνιο 4) 3' ομόλογο τμήμα εισήχθησαν στο φορέα pbluescript II SK στις περιοχές NotI - KpnI και HindIII αντίστοιχα. Ένα τμήμα EcoRV αφαιρέθηκε από το 3'HindIII τμήμα και μια PGKNeo r περιοχή έκφρασης (blunted EcoRI-SalI τμήμα) εισήχθη στην διαιρεμένη περιοχή p3'h3. Κατόπιν το πλασμίδιο κόπηκε με τα περιοριστικά ένζυμα HindIII (blunted) και PmlI και ενώθηκαν τα άκρα του, δημιουργώντας το pneo-3'. Το τμήμα NotI- XmnI του p5'nk εισήχθη στις περιοχές NotI/EcoRI (blunted) του pneo-3' σχηματίζοντας τον p5'-neo-3'. Ο 5'-Neo-3' κόπηκε με τα NotI (blunted) και XhoI (blunted) και εισήχθη σε φορέα που περιέχει το γονίδιο της διφθεριτικής τοξίνης Α (DTA) στην περιοχή SmaI, δημιουργώντας τον φορέα γονιδιακής στόχευσης p5'- Neo-3'-DTA (Εικόνα 1Α). Ο αρχικός φορέας όπου εισήχθη το cdna του FKLF1 71

72 Ομόλογος ανασυνδυασμός του FKLF1 έχει ως αποτέλεσμα τη διαγραφή της C- τελικής περιοχής της πρωτεΐνης που περιέχει ολόκληρη την περιοχή των δακτυλίων ψευδαργύρου, οι οποίοι χρησιμεύουν για τη σύνδεση του μεταγραφικού παράγοντα με το DNA (Εικόνα 1Β). Ο γόνος της διφθεριτικής τοξίνης Α βρίσκεται έξω από την περιοχή του ομόλογου ανασυνδυασμού, καταστρέφοντας έτσι όταν εκφράζεται κύτταρα στα οποία έχουν συμβεί μη ομόλογοι ανασυνδυασμοί Απομόνωση FKLF1 +/- κυτταρικών κλώνων στελεχιαίων κυττάρων Εμβρυϊκά στελεχιαία (ES) κύτταρα ποντικού R1 (χρώματος agouti, δηλαδή καφε-κίτρινο) καλλιεργήθηκαν σε 10 τρυβλία 6cm με τροφοδοτική στοιβάδα κυττάρων και επιμολύνθηκαν με 15μg του φορέα γονιδιακής στόχευσης του FKLF1 (κομμένου με το ένζυμο NotI) μέσω ηλεκτροπορισμού, με τη βοήθεια ενός BioRad Gene Pulser II στα 250V, 500μF. Μια ημέρα μετά από τον ηλεκτροπορισμό επιλέχθηκαν κύτταρα μέσω καλλιέργειας σε 200μg/ml G418 (νεομυκίνη) για 10 ημέρες. Με τον τρόπο αυτό επιλέγονται τα κύτταρα που φέρουν το εισαγμένο γονιδιακό τμήμα, που τα κάνει - μεταξύ άλλων - ανθεκτικά στη νεομυκίνη. Συλλέχθηκαν αποικίες σε καλλιεργητικό υλικό χωρίς G418 και χωρίστηκαν σε δύο δίδυμα τρυβλία, ένα με τροφοδοτική στοιβάδα από γ-ακτινοβολημένους πρωτογενείς εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού, με σκοπό την κατάψυξη και αποθήκευση και το δεύτερο χωρίς τροφοδοτική στοιβάδα για ανάλυση. Οι G418 ανθεκτικοί κλώνοι εξετάσθηκαν καταρχήν για ομόλογο ανασυνδυασμό με PCR, χρησιμοποιώντας δύο ζεύγη εκκινητών για τις περιοχές των σημείων ενσωμάτωσης 5' και 3', οι οποίοι μεγένθυναν διαφορετικού μεγέθους τμήματα για τα σημεία όπου υπήρχε ομόλογος ανασυνδυασμός (Εικόνα 1Γ). Οι θετικοί κλώνοι αναλύθηκαν περαιτέρω με ανάλυση κατά Southern χρησιμοποιώντας ένα δείκτη (ανιχνευτή) έξω από την περιοχή του ανασυνδυασμού (Εικόνα 1Δ). Συνολικά ανιχνεύθηκαν τρεις σωστά ανασυνδυασμένοι κλώνοι ανάμεσα σε περισσότερους από 100 που μελετήθηκαν Η Γένεση των FKLF -/- ποντικών Ανασυνδυασμένοι κλώνοι εμβρυϊκών κυττάρων ενέθηκαν σε βλαστοκύστες ποντικών C57BL/6 (μαύρους) και μεταφέρθηκαν σε έμβρυα ημέρας 2.5 (E2.5), με 72

73 αποτέλεσμα τη δημιουργία μεγάλου αριθμού χιμαιρικών ποντικών, σύμφωνα με το χρώμα τριχώματος. Οι χιμαιρικοί (μαύροι- agouti) άρρενες ποντικοί διασταυρώθηκαν με C57BL/6 (μαύρους) θηλυκούς για να εξακριβωθεί η γενετική μεταβίβαση του απενεργοποιημένου FKLF1 αλληλίου. Οι ποντικοί FKLF1 +/- (agouti) κατόπιν διασταυρώθηκαν μεταξύ τους για τη δημιουργία ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών (FKLF1 -/- ) (Εικόνα 1E). 73

74 ΕΙΚΟΝΑ 1 Α 7kb Φυσιολογικό αλλήλιο KpnI KpnI KpnI E1 E2 E3 E4 ανιχνευτής Φορέας Στόχευσης p5'-neo-3'-dta E1 E2 PGK dta 11kb Μεταλλαγμένο αλλήλιο KpnI KpnI Primer 1F Ε= Εξόνιο, PGK= γονίδιο αντοχής στη νεομυκίνη, dta= γονίδιο διφθεριτικής τοξίνης Β E1 E2 Primer 2F PGK Primer 1R Primer 2R f1 f2 f3 Deleted 74

75 ΕΙΚΟΝΑ 1 (συνέχεια) Γ Clone kb 7.1 kb Δ Primers 1F/1R +/+ +/- +/- +/- Mutant(11kb) WT(7kb) Ε -/- -/- +/+ -/- -/- +/+ +/- +/- +/- +/- 11kb 7kb Εικόνα 1. Στοχευμένη διαταραχή της λειτουργίας του ομόλογου γονιδίου του FKLF1 στους ποντικούς (Tieg2, Tieg3). Α. Σχηματική απεικόνιση της περιοχής του γονιδίου FKLF1, του φορέα στόχευσης και του αλληλίου στόχου. Β. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που απαλείφονται από το γονίδιο του FKLF1. Γ. Ανάλυση PCR των εμβρυϊκών στελεχιαίων (ES) κυττάρων όπου έχει τροποποιηθεί ο FKLF1. Το ζεύγος εκκινητών 1F και 1R ανιχνεύει μία ζώνη 5.3 kb για το τροποποιημένο αλλήλιο και καμία ζώνη για το κανονικό. Το ζεύγος 2F και 2R ανιχνεύει μία ζώνη 3.7 kb για το τροποποιημένο αλλήλιο και μία ζώνη 7.1kb για το κανονικό. Δ. Ανάλυση με Southern blot των τροποποιημένων ES κυττάρων. DNA που απομονώθηκε από τα κύτταρα ES διασπάστηκε με το πεπτικό ένζυμο KpnI. Το κανονικό αλλήλιο δίνει μία ζώνη 7kb. Το στοχευμένο αλλήλιο παράγει ζώνη 11 kb. Ε. Ανάλυση με Southern blot ποντικών απογόνων της διασταύρωσης ετερόζυγων ποντικών FKLF1 +/-. DNA που απομονώθηκε από άκρα ουρών διασπάστηκε με KpnI. Το κανονικό αλλήλιο δείνει μία ζώνη 7 kb. Το στοχευμένο αλλήλιο παράγει ζώνη 11 kb. 75

76 Ο γονότυπος 72 απογόνων των διασταυρώσεων ετερόζυγων ποντικών FKLF1 +/- έδωσε την αναλογία FKLF1 +/+ :FKLF1 +/- :FKLF1 -/- = 17:38:17, που είναι σύμφωνη με την κατά Μέντελ μετάδοση 1:2:1. Όλοι οι ποντικοί στεγάστηκαν στην μονάδα SPF (ελεύθερη από ειδικούς παθογόνους μικροοργανισμούς) του Πανεπιστημίου Ουάσιγκτον του Seattle, τρέφονταν με τη συνήθη δίαιτα και χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις απαιτήσεις της αμερικανικής επιτροπής για την προστασία των πειραματόζωων (IAAAC) Ανάλυση της έκφρασης FKLF1 Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος RT-PCR για την εξέταση της έκφρασης FKLF1 σε ιστούς ποντικού και για τη μελέτη της απουσίας έκφρασης στους FKLF1 -/- ποντικούς σε ολικό RNA που απομονώθηκε από διάφορους ιστούς FKLF1 +/+ και FKLF1 -/- ποντικών, όπως εγκέφαλο, καρδιά, νεφρό, ήπαρ, πνεύμονα, μυ, σπλήνα, όρχεις και θύμο, με τη χρήση του αντιδραστηρίου TRIZOL (Invitrogen) (βλ. και σελ.83). Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές (primers) ειδικοί για FKLF1: 5'- TCTGACTCTGGGGATGTCAC-3' και 5'-CGGCAATCTGGAGTCTGGA-3' στους 95 ο C για 3 min και ακολούθως 30 κύκλοι στους 95 ο C για 40 s, 58 ο C για 40 s, 72 ο C για 60s Μελέτη της έκφρασης δυνητικών γονιδίων στόχων του FKLF1 Απομονώθηκε ολικό RNA από εμβρυϊκούς λεκιθικούς ασκούς εμβρύων ημέρας 10 και εμβρυϊκό ήπαρ εμβρυϊκής ημέρας 16. Αναλύθηκε η έκφραση των γονιδίων των αλύσεων ε y και β H1 της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης ποντικού στους λεκιθικούς ασκούς, του γονιδίου της αλύσου β major στο εμβρυϊκό ήπαρ και του γονιδίου που κωδικοποιεί την ανθρώπινη γ άλυσο στο περιφερικό αίμα (των ποντικών που διασταυρώθηκαν με διαγονιδιακούς ποντικούς που την εκφράζουν) με αποτύπωση σημείου (spot blotting) και τη μέθοδο προστασίας από RNάση στο εργαστήριο του Dr. Q.Li. Για την τεχνική αποτύπωσης σημείου (spot blot) χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Schleicher & Schuell (Keene, NH) Minifold I1, ως εξής: 1 έως 5 x 10 6 κύτταρα συλλέγονται και φυγοκεντρούνται. Το ίζημα πλένεται δις με PBS, αναδιαλύεται σε κρύο ισο-οσμωτικό διάλυμα Tris-EDTA (TE) (10 mmol/l Tris, 0.1mmol/L EDTA) και προστίθενται 20 U αναστολέα RNάσης (Rnasin, Promega, Madison, WI). 76

77 Κατόπιν τα κύτταρα λύονται με 5% διάλυμα NP-40, φυγοκεντρούνται και μεταφέρονται σε σωληνάρια με διάλυμα SSC (0.15 mol/l NaCl, mol/l Trisodium Citrate) και φορμαλδεΰδη (6X SSC και 8% formaldehyde τελικό). Μετά από παραμονή στους 65 C επί 15' για αποδιάταξη τα δείγματα χρησιμοποιούνται απευθείας ή αποθηκεύονται στους -70 C. Μετά από ανασύσταση σε τελικό όγκο 300 μl με 15x SSC και τοποθετούνται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, υγρή με 15x SSC, υπό κενό αέρος. Μετά από το στέγνωμα η μεμβράνη «ψήνεται» υπό κενό αέρος στους 80 C για 2 ώρες. Κατόπιν η μεμβράνη υγραίνεται επί 3 ώρες σε υδατόλουτρο στους 65 C και υβριδίζεται με 50ng από κατάλληλους RNA ανιχνευτές σεσημασμένους με 32 P-UTP. Για τη γ άλυσο ως ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε το τμήμα μεγέθους 0.6-kb μεταξύ των περιοχών των περιοριστικών ενζύμων EcoRII και HindIII της περιοχής του 3' άκρου του γονιδίου της Gγ αλύσου. Ο υβριδισμός διήρκεσε τουλάχιστον 16 ώρες και ακολούθησε εντατική έκπλυση με 2x SSC με 0.1% SDS στους 65 C επί έξι φορές και με 0.1 x SSC με 0.1% SDS σε 50% φορμαμίδη στους 65 C δύο φορές. Η ένταση του υβριδισμού μετρήθηκε μετά από έκθεση της μεμβράνης σε φιλμ Kodak X-OMAT AR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) στους -7O ο C, και υπολογίστηκε η αναλογία των mrna των α, β, και γ αλύσεων με λογισμικό Kodak. Για την δοκιμασία προστασίας από RNάση (που έγινε στο εργαστήριο του Dr Q. Li) συλλέχθηκαν 100μl περιφερικού αίματος και απομονώθηκε ολικό RNA (όπως παραπάνω). Για κάθε προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκαν 200 ng ολικού RNA. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι: ανθρώπινης γ αλύσου-pt7 A γ, β αλύσουpsp6 H b 350 και α αλύσου ποντικού-psp64 m α (293) Αιματολογική ανάλυση και μελέτη μυελού οστών FKLF1 -/- ποντικών Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα μέσω οπισθοβολβικής παρακεντήσεως. Υπολογίσθηκε ο αριθμός των ερυθροκυττάρων (RBCs), λευκών αιμοσφαιρίων (WBCs), αιμοπεταλίων, η αιμοσφαιρίνη (Hb), ο διάμεσος όγκος ερυθρών (MCV), η διάμεση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης ανά ερυθρό (MCH) και η κατανομή μεγέθους των ερυθροκυττάρων με γενικές μετρήσεις αίματος με τη χρήση ενός Cell- DYN 3500 αιματολογικού αναλυτή (Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA). Τα δικτυοερυθροκύτταρα μετρήθηκαν σε επίχρισμα περιφερικού αίματος μετά από χρώση με Brilliant Cresyl Blue. Το περιφερικό αίμα και τα δικτυοερυθροκύτταρα 77

78 μελετήθηκαν σε ένα οπτικό μικροσκόπιο Zeiss, με 10x, 40x και 100x αντικειμενικούς φακούς. Συλλέχθηκε μυελός οστών από FKLF1 +/+, FKLF1 +/- και FKLF -/- ποντικούς μετά από θανάτωσή τους κι έγιναν επιχρίσματα με κυτταροφυγοκέντρηση στις 7000rpm για 10'. 0.5x10E4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό με μεθυλοκυτταρίνη που περιείχε rhepo 3 μονάδες/ml, rmil-3 10ng/ml, rhil-6 10ng/ml και 50ng/ml rmscf (MethoCult, StemCell Technologies, Vancouver, BC) Ακτινοβόληση FKLF1 +/+ και FKLF1 -/- ποντικοί ακτινοβολήθηκαν με 3 εβδομαδιαίες δόσεις 2.5Gy (7.5Gy total) ολοσωματικής ακτινοβολίας γ σε έναν 137 Cs ακτινοβολητή ζώων διπλής πηγής (Gammacell 40, Nordion, Inc., Ottawa, Canada) και παρακολουθήθηκαν για 12 μήνες. 78

79 2.3 Διαγονιδιακοί Ποντικοί που Υπερεκφράζουν FKLF Κατασκευή Πλασμιδίων Ο ενισχυτής μ'lcrβ απομονώθηκε από τμήμα του πλασμιδιακού φορέα pbr322-β p -Nfe2-μ'LCR (του Dr Q. Li), ανάμεσα στις περιοχές κοπής των περιοριστικών ενζύμων EcoRV-EcoRI και εισήχθη στον φορέα pbluescript SK (Stratagene) (βλ. σελ. 71) στο τμήμα SmaI-EcoRI, δημιουργώντας τον φορέα pbsμ'lcrβ. Το cdna του FKLF απομονώθηκε από τμήμα EcoRI-SnaBI του φορέα psport/fklf (του H. Asano) και εισήχθη στον παραπάνω φορέα (pbs-μ'lcrβ), στο τμήμα EcoRI-EcoRV, δημιουργώντας τον φορέα pbs-μ'lcrβ-fklf). Το τμήμα DNA που περιέχει το γονίδιο της β αλύσου μεγέθους 3.1 kb απομονώθηκε με τη χρήση των περιοριστικών ενζύμων PmlI-SalI από τον φορέα pβ/puc18 (του Dr Q Li) και εισήχθη στην περιοχή PstI (blunted)/sali του φορέα pgem-5zf(+) (Promega) δημιουργώντας τον φορέα pgem-3'β. Ο φορέας pgem- 3'β κόπηκε με τα ένζυμα BamHI (blunted) και NotI και το τμήμα του γονιδίου της β αλύσου εισήχθη στον φορέα pbs-μ'lcrβ-fklf στην περιοχή SalI (blunted)-noti δημιουργώντας τον φορέα pbs-μ'lcrβ-fklf-3'β. Το τμήμα μ'lcr-β-fklf-3'β αφαιρέθηκε από τον τελικό φορέα με τα ένζυμα KpnI και SacII. Απομονώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, εξαγωγή με φαινόλη και καθίζηση με αιθανόλη και ανασυστάθηκε σε χαμηλής συγκέντρωσης TE (5mM Tris, 0.1 mm EDTA ph 8.0). Οι αρχικοί πλασμιδιακοί φορείς όπου εισήχθη ο FKLF1 για τη δημιουργία του διαγονιδίου 79

80 2.3.2 Ανάλυση DNA και RNA Το τμήμα μ'lcr-β-fklf-3'β, που περιγράφηκε παραπάνω, ενέθηκε σε βλαστοκύστες ποντικού και οι διαγονιδιακοί απόγονοι ανιχνεύθηκαν με slot blot υβριδισμό. Οι αριθμοί αντιγράφων του διαγονιδίου των νεαρών ποντικών προσδιορίστηκαν με υβριδισμό κατά Southern, με ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA ως στοιχείο συγκρίσεως και έναν ανιχνευτή από α-άλυσο ποντικού ως μάρτυρα ελέγχου φόρτωσης στην πηκτή ηλεκτροφόρησης. Απομονώθηκε ολικό RNA από τους ιστούς που περιείχαν πρώιμα ερυθροκύτταρα (αίμα και λεκιθικός ασκός ημέρας 10 και 12). Η έκφραση mrna των αλύσεων α, ζ, ε y and β h1 των εμβρύων υπολογίστηκε με δοκιμασία προστασίας RNάσης. Για να ελαχιστοποιηθεί το πειραματικό σφάλμα, δείγματα από τον κάθε ποντικό αναλύθηκαν ανεξάρτητα κι έγιναν πολλαπλές μετρήσεις, τόσο με τη δοκιμασία προστασίας RNάσης όσο και με υβριδισμό κατά Southern. Η έκφραση του FKLF1 διαγονιδίου τεκμηριώθηκε με δοκιμασία προστασίας από RNάση. 9 χιμαιρικοί ποντικοί (founders) και 10 αγρίου τύπου ποντικοί ελέγχου διασταυρώθηκαν με ποντικούς C57BL/6 και οι εγκυμοσύνες τερματίστηκαν στις ημέρες 9-13 μετά τη γονιμοποίηση για την εξαγωγή εμβρύων προς ανάλυση και φωτογράφηση της εμβρυϊκής ανάπτυξης Αιματολογικές αναλύσεις Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα μέσω οπισθοβολβικής παρακέντησης των ποντικών. Υπολογίσθηκε ο αριθμός των ερυθροκυττάρων (RBCs), λευκών αιμοσφαιρίων (WBCs), αιμοπεταλίων, η αιμοσφαιρίνη (Hb), ο διάμεσος όγκος ερυθρών (MCV), η διάμεση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης ανά ερυθρό (MCH) και η κατανομή μεγέθους των ερυθροκυττάρων, ο τύπος των λευκών αιμοσφαιρίων (ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, εωσινόφιλα, βασεόφιλα) με γενικές μετρήσεις αίματος με τη χρήση ενός Cell-DYN 3500 αιματολογικού αναλυτή (Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA). Τα δικτυοερυθροκύτταρα μετρήθηκαν σε επίχρισμα περιφερικού αίματος μετά από χρώση με Brilliant Cresyl Blue Ανοσοφθορισμός και χρώσεις Έγιναν τομές από έμβρυα ηλικίας 10.5 ημερών (Ε10.5d) μέσα σε PBS+ BSA 0.5% (σε πάγο) και αφαιρέθηκε ο λεκιθικός ασκός και το ήπαρ. Δημιουργήθηκαν 80

81 εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων με επανειλημμένες αναρροφήσεις με πιπέτα, πλύθηκαν με PBS+BSA και συνδέθηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα TER119-PE (ερυθρά σειρά) και CD45-FITC (μυελική σειρά) (BD Pharmingen, San Diego, CA), αφού κρατήθηκε ένα μέρος για αρνητικό στοιχείο ελέγχου και για καλλιέργειες σε μεθυλοκυτταρίνη. Αναλύθηκαν σε έναν αναλυτή ανοσοφθορισμού FACS (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Τα επιχρίσματα περιφερικού αίματος βάφτηκαν με το HEMA 3 Stain Set (Biochemical Sciences Inc., Swedesboro, NJ). Στις καλλιέργειες προγονικών κυττάρων οι αποικίες BFU-Es and CFU-Es ημέρας 12 συλλέχθηκαν και συνδέθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα για την HbF, συνδεμένο με φυκοερυθρίνη (PE) (BD Bioscience, San Jose, CA). Έγινε ανοσοφθορισμός διπλού χρώματος για GFP (πράσινος φθορισμός) και PE (κόκκινος φθορισμός), όπως περιγράφηκε ανωτέρω Καλλιέργειες Αιμοποιητικών Προγονικών Κυττάρων Το καλλιεργητικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε τόσο στις καλλιέργειες προγονικών κυττάρων σε μεθυλοκυτταρίνη όσο και σε εκείνες σε θρόμβο πλάσματος (plasma clot) βασίζεται στο Iscove s Modification of Dulbeco s Medium (IMDM) και περιέχει επιπλέον 15% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) (HyClone, Logan, UT), 0.5% βόειο ορό πλάσματος (PDS) (Antech Technologies, Tyler, TX), 1% βόεια πρωτεΐνη ορού (Intergen, Purchase, NY), 0.5% Protein-Free Hybridoma Medium II (Invitrogen, Gaithersburg, MD), 10-4 M 2-μερκαπτοεθανόλη, 2 μονάδες/ml ερυθροποιητίνη (Epo) (Epoetin, Amgen, Thousand Oaks, CA), 50 ng/ml παράγοντα στελεχιαίων κυττάρων ποντικού (mscf) και 5 ng/ml αγγειακό ενδοθηλιακόκυτταρικό αυξητικό παράγοντα ποντικού (VEGF) (και τα δύο από την Peprotech, Rocky Hill, NJ) και 0.5% διάλυμα θρομβοποιητίνης ποντικού (Tpo, δωρεά του K.Kaushansky, Univ. of San Diego, CA). Για το καλλιεργητικό μέσο μεθυλοκυτταρίνης στο παραπάνω διάλυμα προστίθεται 1.1% 4000cp μεθυλοκυτταρίνη (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ) ενώ για τον θρόμβο πλάσματος προστίθενται 0.4mM χλωριούχο ασβέστιο, βόειος θρομβίνη (Sigma, St.Louis, MO) και 10% βόειο πλάσμα με κιτρικό οξύ (bovine citrated plasma) (Antech). 81

82 Κύτταρα μυελού των οστών ποντικών ανασυστάθηκαν σε συγκέντρωση 1-2x10 4 cells/ml σε μεθυλoκυτταρίνη με SCF, IL3, IL6 και EPO (MethoCult GF M3434, Stem Cell Technologies, Inc.). Συλλέχθηκαν BFU-Es και CFU-Es ημέρας 12 και αναλύθηκαν για έκφραση γ αλύσου με ανοσοφθορισμό, όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Το υγρό καλλιεργητικό υλικό κυτταρικού πολλαπλασιασμού, που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη του πολλαπλασιασμού των διαγονιδιακών, εμβρυϊκών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, σε σύγκριση με φυσιολογικά, βασιζόταν στο Iscove s Modification of Dulbeco s Medium και περιείχε 30% FBS, 1% BSA, 50 ng/ml Flt-3 Ligand (FL, δωρεά του S.Lyman, Amgen/Immunex, Seattle, WA), ιντερλευκίνη-3 (IL-3) ποντικού και ερυθροποιητίνη (Epo), θρομβοποιητίνη (Tpo) και παράγοντα στελεχιαίων κυττάρων (SCF). 82

83 2.4 Έκφραση FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς Συλλογή δειγμάτων Ζητήθηκε η γραπτή συγκατάθεση των δοτών μετά από σχετική ενημέρωσή τους. Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα από 6 φαινομενικά υγιείς αιμοδότες που χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες και μυελός οστών από 26 παιδιά με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, πριν από τη θεραπεία. Επίσης συλλέχθηκαν ιστολογικά δείγματα από 10 ασθενείς με καρκίνο πνεύμονα, ένα από καρκινικό κι ένα από παρακείμενο υγιή ιστό. Τα αιματολογικά δείγματα συντηρήθηκαν σε φιαλίδια με αντιπηκτικό EDTA στους 4 ο C μέχρι την επεξεργασία τους, η οποία έγινε εντός 24 ωρών από τη λήψη Έλεγχος της έκφρασης FKLF1 Η μοριακή μελέτη για την έκφραση του γονιδίου του FKLF1 πραγματοποιήθηκε στο Eργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Α.Π.Θ υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κ ας Ν.Βαβάτση-Χριστάκη. Το πειραματικό μέρος περιελάμβανε τα παρακάτω στάδια: Mοριακή μελέτη αίματος, μυελού οστών και πνευμονικού ιστού 1. Λήψη: α) καρκινικού και παραπλήσιου μη παθολογικού ιστού από τον πνεύμονα 10 ασθενών και αποθήκευση σε RNA Later στους -70 ο C β) μυελού οστών από την πρόσθια άνω λαγόνιο άκανθα 26 παιδιών με λευχαιμία, απομόνωση μονοπυρήνων κυττάρων μυελού οστών με επιστοίβαση του αραιωμένου σε PBS δείγματος σε ίση ποσότητα διαλύματος Ficoll Histopaque 1077, φυγοκέντρηση και απομόνωση της ενδιάμεσης στοιβάδας, πλύση και αραίωση με PBS και γ) περιφερικού αίματος με φλεβοκέντηση και απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων ως ανωτέρω. 2. Κονιορτοποίηση του στερεού ιστού (πνεύμονα) 3. Απομόνωση RNA από τα κύτταρα του κονιορτοποιημένου ιστού ή από τα μονοπύρηνα κύτταρα 4. Σύνθεση cdna με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) 83

84 5. Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων FKLF1 και rrna, που χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας, με τη μέθοδο της PCR και ειδικούς για κάθε γονίδιο εκκινητές (αφετηρίες) 6. Έλεγχος των αποτελεσμάτων της PCR με ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης συγκέντρωσης 1.5% (w/v) που περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο για το διαχωρισμό και καθορισμό του μεγέθους των προϊόντων 7. Μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας σε συσκευή EDAS Estman Kodak για φωτογράφηση των PCR προϊόντων Απομόνωση ολικού RNA 1. Η εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά την κονιορτοποιήση του πνευμονικού ιστού ή την απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων των διαφόρων δειγμάτων. Για την εκχύλιση του RNA χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: 1. Solution D, προκειμένου να πραγματοποιηθεί λύση των κυττάρων και να διαχωριστούν τα κυτταρικά στοιχεία από τα πυρηνικό οξύ, διατηρώντας ακέραιο το RNA 2. Οξικό νάτριο 2Μ (ph 4.5) 3. Όξινη φαινόλη: Καθίζηση του RNA από την υγρή φάση 4. Xλωροφόρμιο: Για το διαχωρισμό του διαλύματος σε τρεις φάσεις. Μία άνω υγρή που περιέχει αποκλειστικά το RNA, μία ενδιάμεση που περιέχει το DNA και μία κάτω ανόργανη φαινόλης χλωροφορμίου. 5. Αιθανόλη: Εκχύλιση του RNA στο διάλυμα 6. DEPC (DiEthylPyroCarbonate) H 2 O: Διάλυση ιζήματος Αναλυτικά το πρωτόκολλο απομόνωσης RNA περιελάμβανε τα ακόλουθα στάδια: Λύση των κυττάρων του ιστού 1. Τοποθέτηση 300 μl δείγματος σε αποστειρωμένο σωληνάριο eppendorf του 1.5 ml όπου βρίσκεται ο κονιορτοποιημένος ιστός 2. Προσθήκη 300 μl Solution D και ανακίνηση με Vortex. 3. Προσθήκη 30 μl οξικού Νατρίου 4. Προσθήκη 300 μl όξινης φαινόλης 5. Προσθήκη 60 μl χλωροφορμίου 84

85 6. Vortex για Επώαση στον πάγο για Φυγοκέντρηση στις rpm για 20 σε θερμοκρασία 4 ο C Εκχύλιση RNA 9. Μεταφορά υδατικής φάσης σε αποστειρωμένο eppendorf 1.5 ml 10. Προσθήκη 300 μl όξινης φαινόλης 11. Προσθήκη 60 μl χλωροφορμίου 12. Vortex για Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 σε θερμοκρασία 4 ο C 14. Επανάληψη του σταδίου εκχύλισης Απομάκρυνση φαινόλης 15. Μεταφορά υπερκείμενης στοιβάδας σε αποστειρωμένο eppendorf 1.5 ml 16. Προσθήκη χλωροφορμίου σε ίσο όγκο με την υδατική φάση ( ml) 17. Vortex για Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 σε θερμοκρασία δωματίου Κατακρήμνιση RNA. 19. Μεταφορά υπερκείμενης στοιβάδας σε αποστειρωμένο eppendorf 1.5 ml 20. Προσθήκη 500 μl αιθανόλης 100% 21. Vortex για Επώαση στους -20 ο C για 24 ώρες 23. Φυγοκέντρηση στις rpm για 20 σε θερμοκρασία 4 ο C 24. Απομάκρυνση αιθανόλης με απόχυση 25. Προσθήκη 500 μl αιθανόλης 70% 26. Ανάδευση των δειγμάτων 27. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 σε θερμοκρασία 4 ο C 28. Απομάκρυνση αιθανόλης με απόχυση και στέγνωμα του eppendorf σε θερμοκρασία δωματίου 29. Προσθήκη 50 μl DEPC H 2 O 30. Διατήρηση στους -20 ο C Ποσοτικός προσδιορισμός του RNA Ο ποσοτικός προσδιορισμός του RNA πραγματοποιήθηκε με τη μέτρηση της απορρόφησης της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) από το RNA δείγμα σε μήκη 85

86 κύματος 260nm (OD 260 ) και 280nm (OD 280 ). Σε μήκος κύματος 260 nm ελέγχουμε την περιεκτικότητα σε DNA/ RNA, ενώ σε μήκος κύματος 280 nm την πρόσμιξη σε πρωτεΐνες. Το πρωτόκολλο προσδιορισμού της καθαρότητας περιελάμβανε τα ακόλουθα στάδια: 1. Μεταφορά των δειγμάτων RNA σε θερμοκρασία δωματίου 2. Ταχεία ανακίνηση για 3-4 δευτερόλεπτα 3. Προσθήκη 998μl DEPC Η 2 O σε αποστειρωμένα eppendorf 4. Προσθήκη 2μl δείγματος εκχυλισμένου RNA 5. Μηδενισμός φωτόμετρου στα 260nm και στα 280nm με τυφλό 1μl DEPC Η 2 Ο 6. Φωτομέτρηση του διαλύματος RNA στα 260nm και στα 280nm 7. Υπολογισμός του ποσού του RNA πολλαπλασιάζοντας την OD 260 με το πηλίκο 40/(ποσότητα RNA που φωτομετρήθηκε). Το αποτέλεσμα αντιστοιχεί σε μg/mlσυγκέντρωση RNA 8. Υπολογισμός λόγου OD 260 /OD 280 για την καθαρότητα του δείγματος. Το δείγμα θεωρείται καθαρό από προσμίξεις προτείνων για λόγους μεγαλύτερους από 1.8 Σύνθεση cdna από το mrna των δειγμάτων PCR για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων FKLF1 και rrna Για τη σύνθεση cdna από το εξαγχθέν RNA χρησιμοποιήθηκαν τυχαία εξαμερή και η αντίστροφη μεταγραφάση SuperscriptIII σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας. Το πρωτόκολλο της RT-PCR περιελάμβανε τα ακόλουθα στάδια 1. Απόψυξη των δειγμάτων RNA και μεταφορά τους σε πάγο 2. Λήψη ποσότητας 4μg RNA από κάθε δείγμα και τοποθέτηση τους σε ξεχωριστά αποστειρωμένα eppendorf. 3. Προσθήκη 200ng τυχαίου εκκινιτή 4. Προσθήκη 10mM dntp mix 5. Προσθήκη DEPC Η 2 Ο μέχρι τελικού όγκου 12μl 6. Ανάδευση περιεχομένου και στιγμιαία φυγοκέντρηση 7. Επώαση στους 65 ο C για 5' 86

87 8. Προσθήκη μίγματος αντίδρασης αποτελούμενο από τα παρακάτω αντιδραστήρια: 4μl cdna Synthesis Buffer, 1μl 0.1M DTT, 1μl RNAse out, 1μl Superscript III και 1 μl DEPC H 2 O. 9. Προσθήκη 8μl μίγματος αντίδρασης σε δείγμα 10. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10' 11. Επώαση στους 42 ο C για 1 ώρα 12. Επώαση στους 70 ο C για Συντήρηση του δείγματος στους 20 ο C Ακολούθησε PCR για τα γονίδια FKLF1 και rrna με εκκινητές ειδικούς για FKLF1: 5'-TCTGACTCTGGGGATGTCAC-3' και 5'-CGGCAATCTGGAGTCTGGA-3' με αποδιάταξη στους 95 ο C για 3' και ακολούθως 30 κύκλοι στους 95 ο C για 40 s (αποδιάταξη), 58 ο C για 40 s (υβριδισμός εκκινιτών), 72 ο C για 60s (επιμήκυνση). Ως στοιχείο ελέγχου και ποσοτικού προσδιορισμού των προϊόντων της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε το ριβοσωμικό 28S rrna με εκκινητές: 5'-ACGGTAACGCAGGTGTCCT-3' και 5'-CCTCTCGTACTGAGCAGGA-3' στους 95 ο C για 3' και ακολούθως 30 κύκλοι στους 95 ο C για 40 s, 56 ο C για 40 s, 72 ο C για 60 s, όπως περιγράφεται και στους πίνακες που ακολουθούν. Πρωτόκολλο αντίδρασης PCR για το γονίδιο FKLF1 Θερμοκρασία ( ο C) Χρόνος Κύκλοι Αποδιάταξη Αποδιάταξη Υβριδισμός εκκινιτών Επιμήκυνση Επιμήκυνση Πρωτόκολλο αντίδρασης PCR για το γονίδιο rrna Θερμοκρασία ( ο C) Χρόνος Κύκλοι Αποδιάταξη Αποδιάταξη Υβριδισμός εκκινιτών Επιμήκυνση Επιμήκυνση

88 Έλεγχος των προϊόντων PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Για τη δημιουργία πηκτής αγαρόζης 1.5% (w/v) χρησιμοποιείται το παρακάτω πρωτόκολλο: 1. Προσθήκη 1gr στερεάς αγαρόζης (Sigma) σε γυάλινη φιάλη Erlenmeyer 2. Προσθήκη 100ml ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης 1ΧΤΒΕ 3. Τοποθέτηση της φιάλης σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι την διάλυση της αγαρόζης και πλήρους διαυγασης 4. Ψύξη του μίγματος στους 60 ο C 5. Προσθήκη 0.3μl Βρωμιούχου αιθιδίου (1mg/ml) 6. Ανακίνηση 7. Απόχηση θερμής αγαρόζης στο εκμαγείο της συσκευής ηλεκτροφόρησης και τοποθέτηση ειδικής χτένας για να δημιουργηθούν ολοκληρωμένα πηγάδια 8. Μετά τη δημιουργία πηκτής πάχους 5mm απομακρύνεται η χτένα και η πηκτή τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και καλύπτεται πλήρως με το ρυθμιστικό διάλυμα. 9. Τοποθέτηση 12μl δείγματος PCR [8μl δείγμα και 3μl διαλύματος φόρτωσης σε κάθε ένα από τα πηγάδια, ταυτόχρονα με τα δείγματα φορτώνεται και δείκτης με γνωστά μοριακά μεγέθη 100bp 10. Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων για περίπου σε 80 Volts 11. Μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας για ανάγνωση και φωτογράφηση των αποτελεσμάτων. 2.4 Στατιστική ανάλυση Η σύγκριση των μέσων όρων των αποτελεσμάτων έγινε με t-test ανεξαρτήτων ή συσχετισμένων δειγμάτων (independent ή paired samples t-test), με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS 13 for Windows, SPSS Inc. 88

89 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Ρετροϊικός φορέας FKLF1 Δημιουργήσαμε έναν ρετροϊικό φορέα ικανό να εκφράζει το μεταγραφικό παράγοντα FKLF1 μεταφέροντας ένα πλήρους μήκους ανθρώπινο cdna του στον ιικό φορέα pmx-ires-gfp, ο οποίος επίσης έχει τη δυνατότητα να εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), έχοντας ως στόχο τη μελέτη των αποτελεσμάτων της υπερέκφρασής του. Στο φορέα που προέκυψε το cdna του FKLF1 βρέθηκε κάτω από το μεταγραφικό έλεγχο του ρετροϊικού ενισχυτή LTR και συνδέθηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, σχηματίζοντας μια νουκλεοτιδική κασέτα διπλής έκφρασης - FKLF1 και GFP - (bi-cistronic) (σχήμα 1, βλ. «Υλικά και Μέθοδοι»). Αυτός ο σχεδιασμός επιτρέπει την έκφραση του FKLF1 σε πολλούς ιστούς, μετά από επιμόλυνσή τους με τον ρετροϊικό φορέα και τον εύκολο εντοπισμό των κυττάρων που εκφράζουν τον FKLF1 με φθορισμό, χάρη στην ταυτόχρονη παρουσία GFP (302). Κατόπιν δημιουργήθηκε μια οικοτροπική (ecotropic: ικανή να μολύνει μόνο κύτταρα ποντικού) παραγωγική σειρά του ιικού φορέα, εισάγοντας το φορέα στην κυτταρική σειρά GP+E86. Η μελέτη της πυκνότητας συγκέντρωσης του φορέα που προέκυψε έγινε μέσω επιμόλυνσης κυττάρων NIH3T3 κι έδειξε πως η παραγωγική σειρά που είχε δημιουργηθεί ήταν ικανή να παράγει, σταθερά, φορείς με τίτλους (συγκεντρώσεις) κοντά στα 10 6 μολυσματικά ιικά σωμάτια ανά ml. Ανάλυση του γενετικού υλικού των επιμολυσμένων κυττάρων κατά Southern έδειξε ότι ο φορέας αυτός είναι γενετικά σταθερός. Επιπλέον δεν παρατηρήθηκαν διαταραχές στην ανάπτυξη των κυττάρων της παραγωγικής σειράς ή των κυττάρων NIH3T3. Η εύκολη σχετικά παραγωγή του ρετροϊικού φορέα εισαγωγής του FKLF1 σε κύτταρα ποντικού αποδεικνύει ότι το γενετικό υλικό του μεταγραφικού παράγοντα της μελέτης μας δεν περιέχει στοιχεία που να αποσταθεροποιούν ιικούς φορείς στους οποίους εισάγεται και ότι οι φορείς αυτοί είναι ικανοί να πολλαπλασιάζονται σε

90 ειδικές παραγωγικές σειρές, σε επαρκή πυκνότητα ώστε να μολύνουν κύτταρα στόχους, μεταφέροντας ακέραια αντίγραφα του παράγοντα. Συνεπώς, θα ήταν, πιθανώς, δυνατή η παραγωγή παρόμοιων φορέων για κλινική εφαρμογή γονιδιακής θεραπείας Η επιμόλυνση με τον FKLF1 επάγει την έκφραση χαμηλά εκφραζόμενων αλλά όχι τελείως σιωπηλών διαγονιδίων γ-αλύσου σε κυτταρικές σειρές (MEL). Έγινε επιμόλυνση κυτταρικής σειράς ερυθρολευχαιμίας ενήλικου ποντικού (MEL) με σκοπό τη μελέτη των επιπτώσεων της επιμόλυνσης αυτής σε ένα μοντέλο ενήλικης ερυθροποίησης. Τα κύτταρα MEL περιείχαν είτε ένα πλήρες YAC (yeast artificial chromosome), που περιείχε τη γονιδιωματική περιοχή της ανθρώπινης β αλύσου της αιμοσφαιρίνης, είτε μια ανασυνδυασμένη κασέτα έκφρασης A γ-αλύσου της αιμοσφαιρίνης. Στα κύτταρα με το πλήρες YAC β αλύσου τα γονίδια της γ αλύσου είναι πλήρως σιωπηλά, τόσο σε ενήλικες μεταλλαγμένους ποντικούς όσο και σε κύτταρα MEL. Αντίθετα, η ανασυνδυασμένη κασέτα έκφρασης της A γ-αλύσου, η οποία περιλαμβάνει έναν συντομευμένο (-159 bp) προαγωγέα και το στοιχείο ελέγχου μlcr, εκφράζει γ άλυσο σχεδόν σε όλα τα κύτταρα (πανκυτταρικά) σε χαμηλά επίπεδα. Με αυτά τα δύο μοντέλα κυττάρων MEL μπορέσαμε να εκτιμήσουμε την πιθανή επίδραση του FKLF1 τόσο στην πλειονότητα των ωριμαζόντων ερυθροκυττάρων του ενηλίκου, όπου τα γ γονίδια είναι σιωπηλά, όσο και σ εκείνη τη μειονότητα τους που εκφράζουν μια μικρή ποσότητα γ αλύσου, η οποία συμμετέχει στο σχηματισμό των χαμηλών επιπέδων εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων. Στην πρώτη σειρά των μελετών, κύτταρα MEL που περιείχαν το πλήρες τεχνητό χρωμόσωμα YAC ανθρώπινης β αλύσου επιμολύνθηκαν με τον ρετροϊικό φορέα του FKLF1+GFP ή με φορέα ελέγχου GFP. Κύτταρα GFP(+) (επιμολυσμένα με το φορέα) απομονώθηκαν με φθορισμό (FACS scan). Απομονώθηκαν με διαδοχικές αραιώσεις συνολικά 7 ανεξάρτητοι θετικοί κλώνοι, χωρίς περαιτέρω επιλογή. Οι κλώνοι αυτοί αναλύθηκαν για την συνέκφραση GFP (ως δείκτη έκφρασης FKLF1) και γ-αλύσου με ανοσοφθορισμό δύο χρωμάτων. 90

91 Η GFP εκφραζόταν σε 98.6 ±1.1% των κυττάρων με ένταση 782±455 μονάδες μέσου φθορισμού (mean fluorescence units- mfu). Όπως φαίνεται στo Σχήμα 2A, η επιμόλυνση με FKLF1 είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή, δοσοεξαρτώμενη αύξηση του τμήματος των κυττάρων που εξέφραζαν γ-άλυσο, από 0.2% σε 2.1% (R 2 =0.77, P=0.001). Ωστόσο το επίπεδο αυτό δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό από εκείνο της μητρικής κυτταρικής σειράς, που εκφράζει γ σε 0.9% των κυττάρων, ή από κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα GFP (0.4%). Όπως φαίνεται διαγραμματικά στο σχήμα 2B, η επιμόλυνση με FKLF1 δεν επηρέασε την έκφραση γ-αλύσου των γ-θετικών κυττάρων. Σε αυτή την περίπτωση το μέσο επίπεδο έκφρασης γ-αλύσου των λίγων γ-θετικών κυττάρων ήταν 39.3 ±8.1 mfu για τους επιμολυσμένους με FKLF1 κλώνους έναντι 37.5 mfu για τη μητρική κυτταρική σειρά και 27.9 mfu για τα κύτταρα ελέγχου, επιμολυσμένα με το φορέα GFP. Δεν διαπιστώθηκε διαταραχή στο ρυθμό ανάπτυξης των επιμολυσμένων κυττάρων. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα με τα κύτταρα που περιείχαν το -πλήρους μήκους- YAC β-αλύσου, στα κύτταρα MEL που περιείχαν την ελάχιστα εκφραζόμενη κασέτα A γ αλύσου παρατηρήθηκε ενίσχυση της έκφρασης γ αλύσου μετά από την επιμόλυνση με τον φορέα FKLF1. Σε αυτή την περίπτωση συνολικά 12 ανεξάρτητοι επιμολυσμένοι κλώνοι απομονώθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Εδώ η GFP εκφραζόταν σε ποσοστό 74.4 ±33.5% των κυττάρων σε επίπεδο 203±195 mfu. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3A, η επιμόλυνση με FKLF1 αύξησε ελαφρώς το ήδη υψηλό - ποσοστό των κυττάρων που εκφράζαν γ άλυσο σε 80.0 ±17.0% στους 12 κλώνους (R 2 =0.21, P=0.014) έναντι 83% της μητρικής σειράς. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο σχήμα 3B, η έκφραση γ αλύσου στα γ-θετικά κύτταρα αυξήθηκε κατά σημαντικό και δοσοεξαρτώμενο βαθμό, μεταξύ 40.3 ±14.4 mfu στα κύτταρα που εκφράζαν GFP <250 mfu σε 87.5 ±24.0 mfu για κύτταρα με έκφραση GFP > 250 mfu (R2=0.41, P=0.025). Το επίπεδο έκφρασης γ αλύσου στους πληθυσμούς ψηλού GFP ήταν σημαντικά υψηλότερο από το επίπεδο έκφρασης 45.6 mfu της μητρικής κυτταρικής σειράς (P<0.001). Κι εδώ δεν διαπιστώθηκε διαταραχή στο ρυθμό ανάπτυξης των επιμολυσμένων κυττάρων (302). 91

92 Σχήμα 2. Αποτελέσματα της επιμόλυνσης με FKLF1/GFP κυττάρων MEL που περιέχουν ακέραιο γονίδιο β-περιοχής (YAC). Σε αυτά το γονίδιο της γ αλύσου είναι φυσιολογικά σιωπηλό. 7 επιμολυσμένοι κλώνοι αναλύθηκαν για την ένταση του φθορισμού GFP και κόκκινου (phycoerythrin) φθορίζοντος αντισώματος κατά της γ αλύσου. A) Σύγκριση της έντασης (mfu= mean fluorescent units) έκφρασης GFP και του ποσοστού κυττάρων που εκφράζουν γ άλυσο. B) Σύγκριση των εντάσεων GFP και κόκκινου φθορίζοντος αντισώματος για τη γ-άλυσο. Σχήμα 3. Αποτελέσματα της επιμόλυνσης FKLF1 MEL κυττάρων που περιέχουν μία ελάχιστα εκφράζουσα «κασέτα» γ αλύσου. 12 επιμολυσμένοι κλώνοι που εκφράζανε GFP απομονώθηκαν με FACS και αναλύθηκαν για έκφραση GFP και γ αλύσου όπως στο σχήμα 2. A) Σύγκριση της έντασης (mfu= mean fluorescent units) έκφρασης GFP και του ποσοστού κυττάρων που εκφράζουν γ άλυσο. B) Σύγκριση των εντάσεων GFP και PE για τη γ-άλυσο. 92

93 3.1.2 Η επιμόλυνση με τον ρετροϊικό φορέα FKLF1 προάγει την έκφραση ενός ελάχιστα ενεργοποιημένου διαγονιδίου γ-αλύσου σε ερυθροβλάστες ποντικού. Σε μια πρώτη προσπάθεια να αξιολογήσουμε την, κλινικά χρήσιμη, ικανότητα του FKLF1 για επαγωγή της γ-αλύσου της αιμοσφαιρίνης, πέρα από τις κυτταρικές σειρές, στο κυτταρικό μεταγραφικό περιβάλλον προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων, επιμολύναμε κύτταρα μυελού οστών ποντικών. Οι ποντικοί που χρησιμοποιήσαμε ήταν διαγονιδιακοί και περιείχαν ένα διαγονίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη γ-αλύσο. Στην περίπτωση αυτή το διαγονίδιο περιείχε μια ανασυνδυασμένη A γ -περιοχή με έναν εκτεταμένο (-1348 bp) προαγωγέα (promoter) υπό τον έλεγχο ενός σύνθετου ενισχυτικού στοιχείου μlcr. Επιλέξαμε αυτό το συγκεκριμένο διαγονίδιο επειδή περιέχει όλα τα βασικά cis-ενεργά στοιχεία που συμμετέχουν στη ρύθμιση της γ- αλύσου, συμπεριλαμβανομένου ενός πιθανού καταστολέα (silencer), ο οποίος είναι ειδικός για την εμβρυϊκή φάση ανάπτυξης και εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα, σε έναν κυτταρικό υποπληθυσμό (ετεροκυτταρική έκφραση), με τρόπο παραπλήσιο με εκείνον που συχνά παρατηρείται σε ασθενείς με σοβαρές αιμοσφαιρινοπάθειες, σε ασθενείς υπό θεραπεία με υδροξυουρία και άλλους επαγωγείς της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης καθώς και σε ασθενείς με συγγενή αύξηση της HbF. Μετά από λήψη του μυελού των οστών, επιμόλυνσή του με το φορέα FKLF1+GFP ή το φορέα ελέγχου GFP, καλλιέργεια σε ημιστερεό καλλιεργητικό υλικό (μεθυλοκυτταρίνη) με κατάλληλους αυξητικούς παράγοντες για ανάπτυξη της ερυθράς σειράς, έγινε λήψη των ερυθροβλαστικών αποικιών, στις οποίες αναλύσαμε την έκφραση GFP και της γ-αλύσου με ανοσοφθορισμό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Προσδιορίσαμε την επίδραση της επιμόλυνσης με το φορέα FKLF1 στη συχνότητα έκφρασης του διαγονιδίου γ-αλύσου συγκρίνοντας τη συχνότητα HbF(+) κυττάρων στους υποπληθυσμούς GFP-αρνητικών (μη επιμολυσμένων) και GFPθετικών (επιμολυσμένων) κυττάρων σε αθροίσεις των ερυθροειδών αποικιών. Ομαλοποιήσαμε το πηλίκο αυτό με το αντίστοιχο πηλίκο του φορέα που είχε μόνο GFP. Με παραπλήσιο τρόπο προσδιορίσαμε το αποτέλεσμα της επιμόλυνσης με FKLF1 στο ποσό της έκφρασης γ-αλύσου. Ως δείκτη του ποσού της γ-αλύσου 93

94 χρησιμοποιήσαμε την ένταση του ανοσοφθορισμού στα GFP-θετικά (επιμολυσμένα) και GFP-αρνητικά (μη επιμολυσμένα) κύτταρα στις αθροίσεις των ερυθροειδών αποικιών ομαλοποιημένο και πάλι με βάση το φορέα που είχε μόνο GFP. Συγκρίναμε επίπεδα έκφρασης επιμολυσμένων και μη κυττάρων μεμονωμένων αποικιών παρακάμπτοντας τον παράγοντα της ποικιλίας έκφρασης μεταξύ αποικιών αυτού του, ετεροκυτταρικά εκφραζόμενου, διαγονιδίου. Η επιμόλυνση με FKLF1 είχε σαν αποτέλεσμα 80% αύξηση του ποσοστού κυττάρων που εξέφραζαν τη γ-άλυσο και 65% αύξηση στο ποσό έκφρασης, σε σύγκριση με δείγματα επιμολυσμένα με τον φορέα που είχε μόνο GFP (σχήμα 4). Επιπλέον η έκφραση FKLF1 δεν είχε εμφανείς επιπτώσεις στο μέγεθος και τη μορφολογία των ερυθροειδών αποικιών, συγκρινόμενη και πάλι με το φορέα GFP (302). Τα αποτέλεσμα αυτά δείχνουν πως η υπερέκφραση FKLF1 έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση τόσο του ποσοστού γ-θετικών κυττάρων όσο και των επιπέδων έκφρασης, χωρίς εμφανείς ανεπιθύμητες ενέργειες στην ανάπτυξη των αποικιών. FKLF1 FKLF1 Σχήμα 4. Αποτελέσματα της επιμόλυνσης FKLF1 σε προδρομικά ερυθροποιητικά κύτταρα διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα γ αλύσου, μετά από καλλιέργεια. 20 αποικίες BFU-E συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν όπως στο σχ.2. A) Διαφορά στη συχνότητα γ θετικών κυττάρων μεταξύ FKLF1+/GFP+ και FKLF1-/GFP+ κυττάρων. B) Διαφορά στην ένταση γ- συνδεόμενου φθορίζοντος αντισώματος μεταξύ FKLF1+/GFP+ και FKLF1-/GFP+ κυττάρων. * P<

95 3.1.3 Η επιμόλυνση επάγει την έκφραση ενός ελάχιστα εκφραζόμενου διαγονιδίου γ-αλύσου σε μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού οστών ποντικού. Για να μελετήσουμε την δυνατότητα κλινικής χρήσης ρετροϊικών φορέων FKLF1 για την επαγωγή της γ-αλύσου και συνεπώς της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε ασθενείς με β-μεσογειακή και δρεπανοκυτταρική αναιμία, ελέγξαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις του φορέα FKLF1 in vivo, συλλέγοντας μυελό οστών από τους διαγονιδιακούς ποντικούς που εκφράζουν την ανθρώπινη γ-άλυσο, τους οποίους έχουμε περιγράψει και επιμολύνοντας τα κύτταρα με τον φορέα FKLF1(+GFP) ή με τον φορέα ελέγχου GFP. Κατόπιν μεταμοσχεύσαμε 2 συγγενικούς δέκτες του καθενός. Ένα μήνα μετά τη μεταμόσχευση συλλέχθηκε περιφερικό αίμα από τους λήπτες των επιμολυσμένων κυττάρων και αναλυθήκανε για GFP και γ-άλυσο με ανοσοφθορισμό δύο χρωμάτων. Η έκφραση στους λήπτες των μοσχευμάτων καθώς και ενός φυσιολογικού C57BL/6 ποντικού ελέγχου περιγράφονται στα σχήματα 5 και 6. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, η συχνότητα της επιμόλυνσης ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες, 34-35% για την ομάδα του φορέα GFP και 41-42% για την ομάδα του φορέα FKLF1. Το συνολικό ποσό της έκφρασης GFP ήταν επίσης συγκρίσιμο, μεταξύ mfu για τον φορέα GFP και mfu για τον φορέα FKLF1. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6A, η επιμόλυνση με FKLF1 προκάλεσε αύξηση 9-11% στο ποσοστό των ερυθρών που εκφράζουν γ-άλυσο σε σχέση με τον φορέα ελέγχου GFP. Επίσης, όπως φαίνεται στο σχήμα 6B, προκάλεσε μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση 12-20% στο ποσό της έκφρασης γ-αλύσου σε σχέση με τον φορέα GFP. Αυτό δείχνει για πρώτη φορά, πως ένας ιικός φορέας μεταγραφικού παράγοντα θα μπορούσε να επάγει την έκφραση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης in vivo και συνεπώς να χρησιμεύσει κλινικά στη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. Απαιτείται όμως βελτίωση του αποτελέσματος, με κατάλληλη τροποποίηση του φορέα και βελτιστοποίηση των επιπέδων έκφρασης (302). 95

96 FKLF1 γt FKLF1 γt Σχήμα 5. Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση ερυθρών αιμοσφαιρίων ποντικών μεταμοσχευμένων με μυελό οστών επιμολυσμένο με ιικό φορέα FKLF1/GFP. Δύο επιμολυσμένοι διαγονιδιακοί ποντικοί που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα γ αλύσου (FKLF1 γtg #1 and #2) συγκρίνονται με δύο συγγενείς τους που επιμολύνθηκαν μόνο με GFP (GFP γtg #1 and #2), ένα μη μεταμοσχευμένο διαγονιδιακό συγγενή (μlcr-γ Tg), κι ένα μη συγγενή, φυσιολογικό ποντικό C57BL/6 (B6). Στον 1 μήνα μετά τη μεταμόσχευση τα ερυθρά τους αναλύθηκαν για GFP και κόκκινο φθορίζον αντίσωμα για τη γ άλυσο, όπως στο σχήμα 2. 96

97 FKLF1 FKLF1 Σχήμα 6. Αποτελέσματα της επιμόλυνσης με FKLF1 διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα γ αλύσου. A) Περίληψη των αποτελεσμάτων του σχήματος 5, συχνότητα έκφρασης γ αλύσου. B) Περίληψη των αποτελεσμάτων του σχήματος 5, ένταση έκφρασης γ αλύσου (ένταση ανοσοφθορισμού κόκκινου φθορίζοντος αντισώματος για τη γ άλυσο). * P<0.001 **P< Η επιμόλυνση με FKLF1 έχει μέτρια πλειοτροπικά αποτελέσματα στην αιμοποίηση των ενήλικων ποντικών. Το γεγονός ότι οι ποντικοί που είχαν μεταμοσχευτεί με μυελό οστών επιμολυσμένο με FΚLF1 είχαν υψηλή συχνότητα ερυθρών αιμοσφαιρίων που εξέφραζαν GFP και συνεπώς FKLF1, δείχνει ότι η έκφραση FKLF1 δεν εμποδίζει την εγκατάσταση (engraftment) των στελεχιαίων κυττάρων στο μυελό των οστών. Ωστόσο περαιτέρω μελέτη έδειξε κάποια ήπια αποτελέσματα της επιμόλυνσης σε διάφορες αιματολογικές παραμέτρους, όπως 15% μείωση στην ολική αιμοσφαιρίνη, 97

98 12% μείωση του αιματοκρίτη, 17% μείωση στον αριθμό των ερυθροκυττάρων, 42% μείωση του αριθμού των αιμοπεταλίων και 179% αύξηση των λευκών αιμοσφαιρίων (με διπλασιασμό των λεμφοκυττάρων και αύξηση κατά 160% των βασεοφίλων), όπως περιγράφεται στον πίνακα 1. Αυτές οι αλλαγές καταδεικνύουν πιθανές επιδράσεις της FKLF1 έκφρασης στη διαφοροποίηση και/ή τον πολλαπλασιασμό της ερυθράς σειράς και παρόμοιες επιδράσεις της πιθανής έκτοπης έκφρασης του φορέα FKLF1 και στις άλλες αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές in vivo, (καθότι για την επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων του φορέα δε χρησιμοποιήθηκε προαγωγέας ειδικός για την ερυθρά σειρά, αλλά ο γενικός ενισχυτής των ρετροϊών LTR). Το γεγονός αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις in vitro αλλά συμφωνεί με περαιτέρω παρατηρήσεις in vivo (βλ. παρακάτω) και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης (302). Mouse Hb Hct RBC Plt WBC Lym Baso (g/dl) (percent) (x10 /μl) (x10 /μl) (x10 /μl) (x10 /μl) (x10 /μl) C57BL/ Transgenic GFP (a) GFP (b) FKLF1 (a) FLF11 (b) avg cont's avg FKLF P Πίνακας 1 Αιματολογικό προφίλ ποντικών μεταμοσχευμένων με μυελό οστών επιμολυσμένο με το φορέα FKLF1. Διαγονιδιακοί ποντικοί που εκφράζουν ανθρώπινη γ άλυσο επιμολύνθηκαν με φορέα FKLF1 ή φορέα ελέγχου με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και αναλύθηκαν για αιμοσφαιρίνη (Hb), αιματοκρίτη (Hct), αριθμό ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC), αιμοπεταλίων (Plt), λευκών αιμοσφαιρίων (WBC), λεμφοκυττάρων (Lym) και βασεόφιλων (Baso). Οι μη μεταμοσχευμένοι ποντικοί ελέγχου ήταν διαγονιδιακοί και φυσιολογικοί ποντικοί C57BL/6. 98

99 3.2 FKLF1 knockout ποντικοί Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε διάφορους ιστούς ποντικών και της απουσίας της σε knockout (FKLF1 -/- ) ποντικούς. Η ανάλυση RNA με RT-PCR έδειξε ότι ο FKLF1 εκφράζεται σε όλους τους μελετηθέντες ιστούς στους αγρίου τύπου ποντικούς (FKLF1 +/+ ) (Εικ.2). Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές καθολικής έκφρασης του FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς (60). Όπως αναμενόταν, το mrna του FKLF1 απουσιάζει σε όλους τους ιστούς των FKLF1 -/- ποντικών (Εικόνα 2)(102). Η έκφραση του FKLF2 (ή KLF13), ενός άλλου καθολικά εκφραζόμενου μέλους της οικογένειας KLF βρέθηκε φυσιολογική στους ιστούς των FKLF1 -/- ποντικών, δείχνοντας την στοχευμένη απενεργοποίηση του FKLF1 γονίδιου στους ποντικούς αυτούς. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο FKLF1 εκφράζεται καθολικά και απουσιάζει τελείως στους knockout ποντικούς. Marker brain heart kidney liver lung muscle spleen testes thymus FKLF1 FKLF1 +/+ FKLF1 FKLF1 -/- KLF13 FKLF1 -/- Εικόνα 2. Μελέτη με RT-PCR της έκφρασης FKLF1 σε διάφορους ιστούς φυσιολογικών και των knockout ποντικών. Οι εκκινητές για την ανίχνευση του mrna του FKLF1 συνδέονται στην περιοχή του εξόνιου 4 του FKLF1 και συνεπώς δεν ανιχνεύουν το τροποποιημένο γονίδιο, όπου η περιοχή αυτή έχει απαλειφεί. Αντίθετα ο KLF13 ανιχνεύεται φυσιολογικά. 99

100 3.2.2 Οι ομόζυγοι μεταλλαγμένοι FKLF1 -/- ποντικοί αναπτύσσονταν κανονικά και ήταν γόνιμοι. Διερευνήσαμε την πιθανή επίδραση του FKLF1 στη συνολική ανάπτυξη των ποντικών, καθότι υπάρχουν αναφορές πως αυτός επηρεάζει αρνητικά την κυτταρική ανάπτυξη in vitro. Ζυγίσαμε τους FKLF1 +/+ και FKLF1 -/- ποντικούς σε δύο χρονικά σημεία της ανάπτυξής τους. Το μέσο βάρος στις 4 εβδομάδες για τους αρσενικούς FKLF1 -/- ήταν 17 ± 3.6g (n = 4) vs ± 1.8 στους ποντικούς ελέγχου (n = 8) και στις 6 εβδομάδες 22.3 ± 1.3 (n = 5) vs ± 2.25 (n = 6) ενώ οι θηλυκοί ήταν ± 6 (n = 4) και 20.3 ± 0.5 (n = 3) vs ± 0.9 (n = 4) και 19.3 ± 1.15g (n = 3) (Σχήμα 7). Οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως ο FKLF1 δεν είναι απαραίτητος για τη φυσιολογική σωματική ανάπτυξη των ποντικών. Υπάρχουν αναφορές ότι ο FKLF1 έχει αντι-ογκογόνο δράση (60, 177, 191). Κάποιοι ποντικοί μας παρακολουθήθηκαν μέχρι το τέλος της ζωής τους (3 FKLF1 +/+, 3 FKLF1 +/- και 4 FKLF1 -/- ) αλλά δεν παρατηρήθηκε αυξημένη εμφάνιση νεοπλασματικών όγκων στους FKLF1 -/- ποντικούς ή ελάττωση της συνολικής επιβίωσης (Σχήμα 8)(102). 100

101 25 Βάρος +/+ +/- -/- g εβδομάδες 6 εβδομάδες Σχήμα 7. Σωματικό βάρος FKLF1 knockout ποντικών. (Αρσενικοί FKLF1 +/+ n=6, FKLF1 +/- n=7, FKLF1 -/- n=5, θηλυκοί FKLF1 +/+ n=3, FKLF1 +/- n=8, FKLF1 -/- n=3). Επιβίωση +/+ +/- -/- Μ η ν ε ς Σχήμα 8. Μακρόχρονη παρακολούθηση FKLF1 knockout ποντικών. 10 αδερφοί ποντικοί (3 FKLF1 +/+, 3 FKLF1 +/- και 4 FKLF1 -/- ) παρακολουθήθηκαν μέχρι το τέλος της ζωής τους. Επιπρόσθετα 8 ποντικοί (2 FKLF1 +/+, 2 FKLF1 +/- and 4 FKLF1 -/- ) εκτέθηκαν σε κατατετμημένη, μη θανατηφόρα ολοσωματική ακτινοβολία γ (7.5Gy) και παρακολουθήθηκαν επί 12 μήνες. Παρόμοιες δόσεις ακτινοβολίας γ προκαλούν ογκογένεση ή μυελική απλασία σε ευάλωτα στελέχη knockout ποντικών (295). Ωστόσο όλοι οι FKLF1 -/- ποντικοί επέζησαν κατά την περίοδο της παρατήρησης χωρίς εμφάνιση νεοπλασιών, αναιμίας, αιμορραγικής διάθεσης ή ευαισθησίας σε λοιμώξεις, όπως και οι φυσιολογικοί και ετερόζυγοι αδελφοί τους (102). Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι ο FKLF1 δεν είναι απαραίτητος για την προστασία του γενετικού υλικού και των κυττάρων από την ακτινοβολία ή για την καταστολή εμφάνισης νεοπλασίας κάτω από ογκογόνα ερεθίσματα. 101

102 3.2.3 Αιματολογική ανάλυση των FKLF1 -/- ποντικών. Κατόπιν εξετάσαμε εάν η απαλειφή του FKLF1 έχει κάποια επίπτωση στην αιμοποίηση. Συλλέχθηκε αίμα με οπισθοβολβική παρακέντηση και συγκρίθηκε ο αριθμός των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBCs), λευκών αιμοσφαιρίων (WBCs), αιμοπεταλίων (PLTs), τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης (Hb), ο μέσος όγκος των ερυθρών (MCV) και η μέση ποσότητα αιμοσφαιρίνης ανά ερυθροκύτταρο (MCH). Η μέση αιμοσφαιρίνη των FKLF1 -/- και FKLF1 +/+ ποντικών είναι 16.6 ± 0.7g/dl και 16.4 ± 0.7 g/dl αντίστοιχα (Σχήμα 9A), ο αριθμός των ερυθροκυττάρων 10 ± 0.5 M/μl και 10 ± 0.7 (Σχήμα 9B), ο αριθμός των λευκών 4.97 ± 1.6 K/μ/l και 4.87 ± 2.07 (Σχήμα 9Γ) και των αιμοπεταλίων ± M/μl και 1.11 ± 0.15 (Σχήμα 9Δ). Ο μέσος MCV είναι 52.7 ± 1.7 έναντι 52.2 ± 2.2 και η MCH 16.5 ± 0.6 έναντι ± 0.6. Συνεπώς δεν υπάρχει διαφορά μεταξύ των FKLF1 -/- ποντικών από τους αγρίου τύπου αδερφούς τους στις παραπάνω βασικές αιματολογικές παραμέτρους. Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, παρατηρήθηκε παρόμοιος αριθμός αποικιών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων σε καλλιέργειες μυελού των οστών σε ημιστερεά καλλιεργητικά υλικά (μεθυλοκυτταρίνη) (Σχήμα 10): FKLF1 -/- : 111.5± 12 CFU-GM, 8.5± 07 CFU-E και 2.5± 0.7 CFU-Meg, FKLF1 +/+ : 115± 5.6 CFU-GM, 10.5± 2.6 CFU-E, 1.5± 0.7 CFU-Meg ανά 10 4 κύτταρα. Επιπλέον δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στη μορφολογία του περιφερικού αίματος και του μυελού οστών σε επιχρίσματα. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως ο FKLF1 είτε δεν είναι απαραίτητος ή η λειτουργία του υποκαθίσταται από κάποιον άλλον παράγοντα, όταν απουσιάζει, στον αιμοποιητικό ιστό των ποντικών (102). 102

103 Α g/ 16 d L Β Μ / Μ L Αιμοσφαιρίνη RBCs /+ +/- -/- Κ / L Γ WBCs K / L Δ PLTs Σύνολο θηλυκοί αρσενικοί Σχήμα 9. Αιματολογική ανάλυση FKLF1 knockout, ετερόζυγων και φυσιολογικών απογόνων της διασταύρωσης FKLF1+/- ποντικών, αρσενικοί, θηλυκοί και σύνολο. (Αρσενικοί FKLF1 +/+ n=7, FKLF1 +/- n=6, FKLF1 -/- n=6, Θηλυκοί FKLF1 +/+ n=4, FKLF1 +/- n=5, FKLF1 -/- n=5). 103

104 Μυελός Οστών +/+ +/- -/- Progenitor numbers / 10 4 cells GM E Meg Σχήμα 10. Υπολογισμός προγονικών ερυθροποιητικών κυττάρων μυελού οστών μετά από καλλιέργεια σε ημιστερεά καλλιεργητικά υλικά. Παρόμοιοι αριθμοί ερυθροειδών (Ε: BFU-E, CFU- E), μυελικών- μονοκυτταρικών (GM: CFU-GM) και μεγακαρυοκυτταρικών (MEG: CFU-Meg) προγονικών κυττάρων Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων των αλύσεων της αιμοσφαιρίνης στους FKLF1 -/- ποντικούς. Ο FKLF1 επιδρά στη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων μέσω σύνδεσης του στις περιοχές CACCC ή GC των προαγωγέων τους, σε μοντέλα προσωρινής έκφρασης (28, 60). Οι in vivo γονιδιακοί στόχοι του FKLF1 είναι άγνωστοι. Ο FKLF1 διεγείρει την ενδογενή έκφραση ανθρώπινων ε και γ αλύσεων της αιμοσφαιρίνης όταν υπερεκφράζεται στην κυτταρική σειρά ανθρώπινης ερυθρολευχαιμίας K562 (28). Αναλύσαμε την επίδραση της απαλειφής του FKLF1 γονίδιου στην έκφραση των αλύσεων αιμοσφαιρίνης του ποντικού με spot blotting και τη μέθοδο προστασίας από RΝάση (εργαστήριο Dr. Q. Li). Οι αναλύσεις αυτές δεν έδειξαν μεταβολή στην έκφραση όλων των γονιδίων των αλύσεων της αιμοσφαιρίνης ανάμεσα στους FKLF1 +/+ και FKLF1 -/- ποντικούς (μη καταχωρημένα δεδομένα). Είναι πιθανό ο FKLF1 να έχει κάποιο ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων αυτών, αλλά άλλα μέλη της ίδιας οικογένειας ή άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες να τον υποκαθιστούν όταν απουσιάζει (102). Μελετήσαμε περαιτέρω τη σχέση του FKLF1 με την έκφραση της ανθρώπινης γ αλύσου της αιμοσφαιρίνης, που έχει περισσότερο ενδιαφέρον και από κλινική πλευρά, διασταυρώνοντας τους FKLF1 -/- ποντικούς με ποντικούς που εκφράζουν το 104

105 ανθρώπινο γ γονίδιο (293). Οι FKLF1 αρνητικοί-γ θετικοί ποντικοί που προέκυψαν από τη διασταύρωση (FKLF1 -/-,γ ) εξέφραζαν γ στον ίδιο βαθμό με τους FKLF1 θετικούς-γ θετικούς (FKLF1 +/+,γ ), δείχνοντας ότι ο FKLF1 δεν είναι αναγκαίος για τη ρύθμιση της έκφρασης του ανθρώπινου γ διαγονιδίου στους ποντικούς και, κατ επέκταση, είναι απίθανο να έχει σημαντικό φυσιολογικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης της γ αλύσου στον άνθρωπο και στη στροφή από την εμβρυϊκή στην αιμοσφαιρίνη του ενηλίκου (σχήμα 11)(102). γ/α άλυσοι 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0 FKLF1 -/-,γ FKLF1 +/+,γ Σχήμα 11. Οι FKLF1-αρνητικοί, γ-θετικοί ποντικοί που προέκυψαν από τη διασταύρωση (FKLF1 -/-,γ ) εξέφραζαν γ στον ίδιο βαθμό με τους FKLF1-θετικούς, γ-θετικούς (FKLF1 +/+,γ ) 105

106 3.3 Ποντικοί που υπερεκφράζουν τον FKLF Οι χιμαιρικοί, FKLF1 υπερεκφράζοντες ποντικοί είναι ηπίως αναιμικοί. Για την περαιτέρω ανάλυση της λειτουργίας του γονιδίου FKLF1 in vivo δημιουργήσαμε διαγονιδιακούς ποντικούς που υπερεκφράζουν τον παράγοντα. Χρησιμοποιήσαμε το πλήρες ανθρώπινο cdna του FKLF1 (1.7kb), το οποίο τοποθετήθηκε σε μια νουκλεοτιδική κασέτα έκφρασης, υπό την καθοδήγηση ενός προαγωγέα 0.87 kb της β-αλύσου της αιμοσφαιρίνης, ελεγχόμενων από έναν 3.1 kb μικροlcr ενισχυτή (LCR: locus control region - η βασική περιοχή ελέγχου κι ενεργοποίησης της περιοχής της β και των ανάλογων αλύσεων της αιμοσφαιρίνης στο ανθρώπινο γονιδίωμα). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι παρόμοιες κασέτες έκφρασης εκφράζουν διαγονίδια σε προγονικά και ώριμα κύτταρα της ερυθράς σειράς (290, 296, 297). Οι 9 χιμαιρικοί διαγονιδιακοί ποντικοί που δημιουργήθηκαν αρχικά με αυτόν τον τρόπο αναλύθηκαν με RT-PCR και Slot Blots για έκφραση ανθρώπινου FKLF1. Η αιματολογική ανάλυση κατέδειξε ήπια αλλά σημαντική αναιμία (Hb:15.5± 2.4g/dl vs. 18.6± 2.0 στους ποντικούς ελέγχου, p<0.01) και δικτυοερυθροκυττάρωση (Ret % of RBCs: 4.3± 1.2 vs. 2.3± 0.6, διορθωμένο 3.5, p=0.01) (σχήμα 12A, B, Γ) και ήπια λευκοπενία (Σχήμα 12Δ) και θρομβοπενία (Σχήμα 12Ε), πιθανώς λόγω έκτοπης έκφρασης του διαγονιδίου στις σειρές αυτές. Τα επιχρίσματα περιφερικού αίματος ήταν, κατά τα άλλα, φυσιολογικά. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα διαμολυσμένα προγονικά ερυθροποιητικά κύτταρα είναι ικανά να επιβιώνουν κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και να αποκαθιστούν την ενήλικη αιμοποίηση με τρόπο συγκρίσιμο με τα φυσιολογικά. Ωστόσο παρουσιάζουν ένα έλλειμμα στην παραγωγή ώριμων ερυθροκυττάρων, το οποίο αποκαθίσταται μερικώς μέσω υπερπαραγωγής από τα μη διαμολυσμένα προγονικά κύτταρα, όπως φαίνεται από την αύξηση των ΔΕΚ. Η απουσία μορφολογικών αλλοιώσεων στο αίμα και στο μυελό οστών υποδεικνύει ότι η βλάβη δεν οφείλεται σε μείζονες διαταραχές της αιμοσφαιρίνης ή της κυτταρικής μεμβράνης. 106

107 Α Hemoglobin Αιμοσφαιρίνη Β g/dl RBCs Total Female Male p<0.01 Controls FKLF1 OE chimeras M/uL Γ Total Female Male p<0.01 Reticulocytes % Δ WBCs K/uL Ε Δικτυοερυθροκύτταρα WBC Differential p<0.01 Total Female Male p=0.07 K/uL Lymphocytes p=0.15 Neutrophils p=0.03 ΣΤ Platelets Αιμοπετάλια K/uL Total Female Male p=0.18 Σχήμα 12. Αιματολογική ανάλυση διαγονιδιακών FKLF1 υπερ-εκφραζόντων χιμαιρικών ποντικών (F0). (A,B,Γ) Μερικώς αντιρροπούμενη αναιμία (Δ,Ε): Λεμφοπενία, ουδετεροπενία. (ΣΤ): Ήπια ελάττωση των αιμοπεταλίων. n=9 χιμαιρικοί ποντικοί (5 αρσενικοί, 4 θηλυκοί) και 10 ποντικοί ελέγχου (5 αρσενικοί, 5 θηλυκοί). RBCs: ερυθρά αιμοσφαίρια, WBCs: λευκά αιμοσφαίρια 107

108 Α Β Εικόνα 3. Οπτική σύγκριση διαγονιδιακών (αριστερά) και φυσιολογικών (δεξιά) εμβρύων. (A) Εμβρυϊκή ημέρα 10.5 και (B) Απόγονοι (F1) των FKLF1 χιμαιρικών υπερεκφραζόντων ποντικών. Πλήρης έλλειψη ώριμων ερυθρών αιμοσφαιρίων, υποστροφή και εμβρυϊκός θάνατος στο μέσο της κύησης. 108

109 3.3.2 Η υπερέκφραση FKLF1 προκαλεί διακοπή στην τελική εμβρυϊκή ερυθροποίηση, με αποτέλεσμα πρόωρο τερματισμό της κύησης. Και οι 9 FKLF1 θετικοί χιμαιρικοί αρχέγονοι ποντικοί διασταυρώθηκαν με C57BL/6 (Taconic Farms) φυσιολογικούς ποντικούς και οι απόγονοι αναλύθηκαν όπως έχει περιγραφεί για έκφραση του FKLF1 διαγονιδίου. Ήταν όλοι αρνητικοί (n=52). Κατόπιν τερματίσαμε πρόωρα τις παραπάνω κυήσεις, σε καθορισμένα χρονικά σημεία και βρήκαμε ότι τα ομόζυγα έμβρυα πέθαιναν τις εμβρυϊκές ημέρες 10.5 και 12 (μετά από τη σύλληψή τους). Τα έμβρυα ήταν μικρότερα από τα φυσιολογικά και εντελώς αναιμικά (Εικόνα 3), παρότι ίχνη από πρόδρομα ερυθροποιητικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν στο εμβρυϊκό ήπαρ τους με ανοσοφθορισμό (5.7 vs. 72% των αιμοποιητικών κυττάρων) (Σχήμα 13). Οι λεκιθικοί τους ασκοί ήταν επίσης ωχροί, γεγονός που υποστηρίζει την υπόθεση ότι το πρόβλημα είναι εντοπισμένο στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και όχι σε κάποιο άλλο εμβρυϊκό όργανο ή ιστό (κάτι εξάλλου απίθανο λόγω του ερυθροκυτταρικού ενισχυτή της κασέτας έκφρασης). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως η υπερέκφραση FKLF1 έχει σοβαρές επιπτώσεις στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του αιμοποιητικού ιστού των ποντικών. 109

110 FKLF1 OE Fetal Livers % of hematopoietic cells FLN FLA 10 0 TER CD Σχήμα 13. Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση εμβρυϊκού ήπατος ημέρας E10.5 από φυσιολογικά και διαγονιδιακά έμβρυα μετά από χρώση με αντι-ter119-pe (ερυθράς σειράς) και αντι-cd45-fitc (λευκής σειράς) μονοκλωνικά αντισώματα. Χαμηλή συγκέντρωση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στα προσβεβλημένα έμβρυα. FLN: φυσιολογικά, FLA: προσβεβλημένα 110

111 Καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων από εμβρυϊκούς λεκιθικούς ασκούς ημερών 9.5 και 10.5 μετά τη γονιμοποίηση έδειξαν εμπλουτισμό σε BFU-Es και CFU-Es έναντι πιο ώριμων κυττάρων στα προσβεβλημένα έμβρυα. Την ημέρα 10.5 ο αριθμός των προγονικών κυττάρων έναντι των πιο ώριμων μορφών ανά κύτταρα ήταν: BFU-Es: 265± 167 vs ± 43, CFU-Es: 111±30 vs. 80±84, CFU-GMs: 111± 26 vs. 78± 46 και CFU-GEMMs: 33±23 vs. 10±10 (Σχήμα 14Α, Β, Γ, Δ), ενώ η συνολική κυτταροβρίθεια ήταν σημαντικά ελαττωμένη (96250± vs ± (Σχήμα 14ΣΤ) αιμοποιητικά κύτταρα στα προσβεβλημένα vs. φυσιολογικά έμβρυα. Η ηπατική ερυθροποίηση ήταν ακόμη περισσότερο προσβεβλημένη (ημέρα 11.5), με 67819± vs ± ερυθροποιητικά κύτταρα, 38±44 vs. 59±35 BFU-Es (ανά κύτταρα) (Σχήμα 14Ε). Αυτό μπορεί να οφείλεται όμως και στη βλάβη του ήπατος από την αναιμία που ήδη βρισκόταν σε εξέλιξη στα προσβεβλημένα έμβρυα. 111

112 Α Day 9.5 YS CFCs/ cells CFU-E BFU-E CFU- GEMM CFU- MK CFU- GM Normal Affected TOTAL Β Day 10.5 AGM CFCs/ cells Γ Day 10.5 YS CFU-E BFU-E CFU- GEMM CFU-MK CFU-GM TOTAL CFCs/ cells CFU-E BFU-E CFU- GEMM CFU- MK CFU- GM TOTAL Δ Day 11 YS CFCs/ cells CFU-E BFU-E GEMM MK GM TOT Ε Day 11.5 Fetal Livers CFC/ cells CFU-E BFU-E CFU- GEMM CFU- MK CFU- GM TOTAL Σχήμα 14 (βλ. επόμενη σελίδα) 112

113 ΣΤ Cellularity cells Ζ Normal YS Normal FL Affected YS Affected FL dpc In vitro expansion of E10.5 YS CFCs cells days Normal in medium A Normal in medium B Affected in medium A Affected in medium B Σχήμα 14. Μετρήσεις προγονικών κυττάρων. (A,Γ,Δ): Καλλιέργειες σε μεθυλοκυτταρίνη και θρόμβους πλάσματος από λεκιθικούς ασκούς διαγονιδιακών (F1) FKLF1 και εμβρύων ελέγχου ημέρας 9.5, 10.5, 11 δείχνουν αυξημένους αριθμούς πολυδύναμων και ειδικευμένων (lineage committed) προγονικών κυττάρων, (B) παραπλήσιους αριθμούς προγονικών ερυθροειδών κυττάρων σε AGMs ημέρας 10.5 (Ε) εξάλειψη προγονικών κυττάρων στο εμβρυϊκό ήπαρ. (ΣΤ): Κυτταροβρίθεια περίπου 50% της φυσιολογικής στους λεκιθικούς ασκούς και πολύ ελαττωμένη στο εμβρυϊκό ήπαρ των διαγονιδιακών εμβρύων. (Ζ): Καλλιέργεια in vitro σε υγρό καλλιεργητικό υλικό με ερυθροποιητίνη (EPO) (υλικό B) ή Flt3 ligand (FL) (υλικό A) και θρομβοποιητίνη (TPO), VEGF, SCF και IL3. Σημαντική επιβράδυνση της ανάπτυξης τόσο των ερυθροειδών όσο και των μυελοειδών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. YS: λεκιθικός ασκός (Yolk Sac), FL: εμβρυϊκό ήπαρ (Fetal Liver) Μαζί τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πως η υπερέκφραση FKLF1 σταματάει την διαφοροποίηση της ερυθράς σειράς στο στάδιο του προερυθροβλάστη. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ενεργοποίηση από τον FKLF1 προαγωγέων γονιδίων βασικών για τη μετάβαση από το προγονικό στο προδρομικό στάδιο της ερυθροποίησης. Μέχρι σήμερα προσπάθειες για την ταυτοποίηση των αντίστοιχων προαγωγέων, πέραν των περιγραφέντων των αλύσεων της 113

114 αιμοσφαιρίνης, έχουν αποτύχει (ανέκδοτη επικοινωνία με τον ερευνητή P. Gallacher). Τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα από τους προσβεβλημένους εμβρυϊκούς ασκούς και ήπαρ παρήγαγαν μορφολογικά φυσιολογικές αποικίες σε καλλιεργητικό υλικό μεθυλοκυτταρίνης και θρόμβων πλάσματος (plasma clot), μη διαφορετικές σε μέγεθος (σημείο ενδεικτικό για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό) ή σε χρώμα (ενδεικτικό της παραγωγής αιμοσφαιρίνης) από τα φυσιολογικά (Εικόνα 4Α, Β. Γ). Το εύρημα αυτό ήταν σταθερό σε διαφορετικά προσβεβλημένα έμβρυα. 114

115 Α Φυσιολογικός YS ημ.10.5 Β Παθολογικός YS ημ.10.5 Γ Παθολογικός YS ημ.10.5 Εικόνα 4. Καλλιέργειες σε θρόμβους πλάσματος από διαγονιδιακά FKLF1 (παθολογικά) και φυσιολογικά έμβρυα. Τα προγονικά ερυθροειδή κύτταρα αναπτύσσονται φυσιολογικά in vitro. 115

116 Έγινε ακολούθως μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού CFCs από λεκιθικούς ασκούς ημέρας 10.5 σε υγρά καλλιεργητικά υλικά με δύο διαφορετικές συνθέσεις: υλικό A: FL, TPO, VEGF, SCF, IL3, υλικό B: EPO, TPO VEGF, SCF, IL3 (Σχήμα 14Ζ). Τα φυσιολογικά CFCs διπλασιάστηκαν σε αριθμό στο υλικό A (30000 σε κυτ/ml) ενώ τα προσβεβλημένα παρέμειναν ανεπηρέαστα (30000 σε κυτ/ml) 8 μέρες αργότερα. Το καλλιεργητικό υλικό που περιείχε EPO (B) αντίθετα προκάλεσε τον πολλαπλασιασμό τόσο των φυσιολογικών (30000 σε κυτ/ml, 6 φορές) όσο και των προσβεβλημένων CFCs (30000 σε , 4 φορές). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα που υπερεκφράζουν FKLF1 χρειάζονται την παρoυσία EPO για τον πολλαπλασιασμό τους σε μεγαλύτερο βαθμό από τα φυσιολογικά. 116

117 3.3.3 Η έκφραση των εμβρυϊκών β-αναλόγων αλύσεων της αιμοσφαιρίνης δεν επηρεάζεται από την υπερέκφραση FKLF1. Ένας από τους στόχους μας ήταν να ελέγξουμε την επίδραση του FKLF1 στην έκφραση εμβρυϊκών αλύσεων της αιμοσφαιρίνης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο FKLF1 ενεργοποιεί έντονα τους προαγωγείς των εμβρυϊκών β-αναλόγων αλύσεων της αιμοσφαιρίνης σε πειραματικά μοντέλα παροδικής του έκφρασης (28). Αναλύθηκε η γονιδιακή έκφραση των εμβρυϊκών αλύσεων ποντικού ε y και β H1 σε έμβρυα ημέρας 10 με δοκιμασία προστασίας από RΝάση και η αναλογία τους με την έκφραση των α-αναλόγων αλύσεων (α και ζ) ήταν 0.313± στα προσβεβλημένα και ± στα φυσιολογικά έμβρυα (Σχήμα 15). Παρά τις προσδοκίες δεν υπήρξε διέγερση της έκφρασης στα FKLF1 υπερεκφράζοντα έμβρυα. β/α globin expression ratio Control FKLF-1 OE embryos rate εy+βh1/α+ζ Σχήμα 15. Δοκιμασία RNάσης των εμβρυϊκών α και β αναλόγων αλύσων αιμοσφαιρίνης. Η αναλογία β/α αλύσων (ε y +β H1 /α+ζ) δεν επηρεάζεται σημαντικά στα FKLF1 διαγονιδιακά έμβρυα. n=10 διαγονιδιακά και 8 φυσιολογικά (αδέρφια) έμβρυα. 117

118 ιστούς 3.4 Διερεύνηση της έκφρασης του FKLF1 σε άλλους Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε διάφορους ιστούς ποντικών Μελετήσαμε την έκφραση του μεταγραφικού μας παράγοντα σε διάφορα όργανα και ιστούς ποντικών με σκοπό να διαπιστώσουμε εάν αυτός εκφράζεται καθολικά ή επιλεκτικά σε κάποια από αυτά. Συγκεκριμένα, τον αναζητήσαμε σε εγκεφαλικό, καρδιακό και άλλο μυϊκό ιστό και σε δείγματα από νεφρό, ήπαρ, πνεύμονα, σπλήνα, όρχη και θύμο αδένα. Η ανάλυση RNA με RT-PCR έδειξε ότι ο FKLF1 εκφράζεται σε όλους τους μελετηθέντες ιστούς στους αγρίου τύπου (μη διαγονιδιακούς) ποντικούς (Εικόνα 5). Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές καθολικής έκφρασης του FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς (60) και συνηγορεί υπέρ μιας βασικής, μη ειδικής μεταγραφικής του λειτουργίας σε κυτταρικό επίπεδο. Marker brain heart kidney liver lung muscle spleen testes thymus FKLF1-362bp Εικόνα 5. Μελέτη με RT-PCR της έκφρασης FKLF1 σε διάφορους ιστούς φυσιολογικών ποντικών. 118

119 3.4.2 Προσδιορισμός της έκφρασης FKLF1 σε ανθρώπινους ιστούς Στο τελευταίο μέρος της μελέτης μας μελετήσαμε την έκφραση του FKLF1 mrna σε φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ιστούς ανθρώπου. Αρχικά αναλύσαμε με ημιποσοτική RT-PCR ολικό mrna που απομονώθηκε από το αίμα 6 υγιών εθελοντών. Ως εσωτερικό μάρτυρα, στοιχείο ελέγχου της ποιότητας των δειγμάτων και σύγκρισης της έντασης της γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήσαμε ένα τμήμα του γονιδίου του ριβοσωμικού RNA (rrna) μεγέθους συγκρίσιμου με εκείνο του προϊόντος του FKLF1. Διαπιστώσαμε πως ο FKLF1 εκφραζόταν σταθερά και με παραπλήσια ένταση στο περιφερικό αίμα σε όλους τους υγιείς αιμοδότες (Εικόνα 6Α). Κατόπιν αναλύσαμε μυελό των οστών 26 παιδιών με Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (Ο.Λ.Λ., ALL) για την έκφραση του FKLF1. Το mrna του FKLF1 ήταν ελαττωμένο ή απουσίαζε τελείως σε 10 από τα 14 rrna θετικά δείγματα (ποσοστό 71.4%), με σημαντική ελάττωση σε 2 (14%) και πλήρη απουσία σε 8 (57%) (Εικ. 6Β). Τα υπόλοιπα 12 από τα 26 δείγματα ήταν αρνητικά τόσο για τον FKLF1 όσο και για τον εσωτερικό μάρτυρα (rrna) και δεν αξιολογήθηκαν. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι ο FKLF1 πιθανώς ελαττώνεται σημαντικά ή απαλείφεται σε κάποιες περιπτώσεις Ο.Λ.Λ.. Δεδομένης της προαποπτωτικής και αντιογκογόνου δράσης του είναι πιθανό η απουσία του αυτή να αποτελεί σημαντικό παράγοντα της παθογένεσης ή της πρόγνωσης της νόσου στις περιπτώσεις αυτές. Τέλος μελετήσαμε, με τον ίδιο τρόπο, την έκφραση του FKLF1 σε ιστολογικά δείγματα πνευμόνων από 10 ασθενείς με, ιστολογικά τεκμηριωμένο, καρκίνο των πνευμόνων. Για κάθε ασθενή υπήρχε ένα δείγμα από καρκινικό (n=10) κι ένα από παραπλήσιο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (n=10). Σύνολο 20 δείγματα. Και πάλι διαπιστώσαμε παρόμοια έκφραση FKLF1 σε όλα τα δείγματα, αν και, όπως αναμενόταν από τη βιβλιογραφία (60), σαφώς ελαττωμένη σε σχέση με εκείνη του αίματος. Παρατηρήθηκε εμφανώς παρόμοια αναλογία FKLF1/rRNA ανάμεσα στα φυσιολογικά και καρκινικά παρασκευάσματα (Εικόνα 6Γ). 119

120 Α 385bp rrna FKLF1 KLF11 362bp Β rrna + FKLF1 Γ rrna + + φ κ φ κ φ κ φ κ φ κ FKLF1 Εικόνα 6. RT-PCR για ανίχνευση του FKLF1 σε ανθρώπινο περιφερικό αίμα, μυελό οστών και πνευμονικό ιστό. Α. Σταθερή έκφραση FKLF1 σε περιφερικό αίμα 6 υγιών εθελοντών. Ως στοιχείο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε η έκφραση του γονίδιου του ριβοσωμικού RNA (rrna). B. Διαταραχή της έκφρασης FKLF1 σε μυελό οστών παιδιών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία. Γ. Ομοιόμορφη έκφραση σε φυσιολογικό παράπλευρο- (φ) και καρκινικό (κ) ιστό πνεύμονα από ασθενείς με καρκίνο πνεύμονα. 120