ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ ΛΑΓΙΟΣ

2 Περιεχόμενα Πρόλογος Εισαγωγή Γενικά Λιγνοκυτταρίνη Ένζυμα Μικροοργανισμοί που παράγουν κυτταρινάσες.11 2 Θεωρητικό μέρος Γενικά Μέθοδοι και τεχνικές ακινητοποίησης ενζύμων Χημικές μέθοδοι ακινητοποίησης Φυσικές μέθοδοι ακινητοποίησης 26 3 Υλικά και μέθοδοι Celluclast 1.5 L FG Novozym Αντιδραστήρες διαλείποντος έργου Υπόστρωμα Μέτρηση παραγωγής γλυκόζης Διασύνδεση Celluclast και Novozym 188 με καρβοδιϊμίδιο (EDAC) 3.7 Διασύνδεση Celluclast και Novozym 188 με γλουταραλδεϋδη (O=CH-(CH 2 ) 3 -CH=O) Ενζυμική υδρόλυση του χαρτιού Μέτρηση ενζυμικών μονάδων Προσδιορισμός πρωτεϊνης 36 4 Αποτελέσματα Παραγωγή γλυκόζης από διάφορα είδη χαρτιού με τη χρήση ελεύθερων (μη διασυνδεδεμένων) ενζύμων Celluclast και Novozym..37

3 4.1.1 Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4 (χωρίς προεπεξεργασία) στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4 (με προεπεξεργασία) στους 55 0 C και στους 45 0 C Παραγωγή γλυκόζης από ανακυκλωμένο χαρτί στους 55 0 C και στους 45 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτοπετσέτα στους 55 0 C και στους 45 0 C Παραγωγή γλυκόζης από διάφορα είδη χαρτιού με τη χρήση διασυνδεδεμένων ενζύμων Celluclast (με EDAC) και Novozym (με γλουταραλδεϋδη) Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4 στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4, προεπεξεργασμένο με NaOH, στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4, προεπεξεργασμένο με H 3 PO 4, στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτοπετσέτα στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτόκουτο στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από ανακυκλωμένο χαρτί στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί κουζίνας στους 55 0 C Παραγωγή γλυκόζης από μίγμα χαρτιού κουζίνας και χαρτοπετσέτας στους 55 0 C Συζήτηση Βιβλιογραφία 62

4 Πρόλογος Στο κείμενο αυτό περιγράφονται τα πεπραγμένα της μεταπτυχιακής εργασίας μου, που έλαβε χώρα στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, με επιβλέποντα τον Καθηγητή Δ. Βύνιο. Το περιεχόμενο της εργασίας αφορά τη διερεύνηση για τη σταθεροποίηση και τη βελτιστοποίηση της καταλυτικής δράσης των κυτταρινασών κατά τη βιοτεχνολογική επεξεργασία αποβλήτων. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Βύνιο για την ανάθεση της εργασίας, την υποστήριξη και τη συνεχή συνεργασία του. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Σ. Τζιάλα, Γ. Φίλο και Γ. Καρύγιαννη για τη συνεργασία και τη βοήθειά τους. Τέλος ευχαριστώ και τον Ι. Στέφα για τη βοήθειά του σε τεχνικά ζητήματα Η/Υ. Γεράσιμος Λάγιος

5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΓΕΝΙΚΑ Ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα της σύγχρονης κοινωνίας είναι το ενεργειακό. Η αλόγιστη άντληση, αλλά και χρήση των αποθεμάτων ορυκτών καυσίμων (κυρίως του πετρελαίου), έχει ως συνέπεια τόσο την καταστροφή του οικοσυστήματος (τρύπα όζοντος, υποχώρηση του εδάφους σε σχέση με τη στάθμη της θάλασσας κατά ένα μέτρο, αύξηση της θερμοκρασίας της Γης, κ.α.) όσο και την εξάντληση των αποθεμάτων αυτών. Τώρα πια, η ανθρώπινη κοινωνία είναι υποχρεωμένη να βρει εναλλακτικές πηγές ενέργειας, οι οποίες θα είναι φιλικές προς το οικοσύστημα, αλλά και ανεξάντλητες, καθώς επίσης και να επιβραδύνει το ρυθμό εξάντλησης των ήδη υπαρχουσών. Βέβαια, επειδή το κέρδος παραμένει πάντα αυτοσκοπός για το καπιταλιστικό σύστημα, το κόστος παραγωγής της ενέργειας πρέπει να είναι μικρό, και τα οφέλη τεράστια. Τίθεται, λοιπόν, το ερώτημα ποια θα είναι αυτή η ανεξάντλητη, αλλά και πάμφθηνη πηγή ενέργειας. Η απάντηση βρίσκεται στον όρο βιομάζα. Στον όρο βιομάζα μπορεί να δοθεί ένα πλήθος ερμηνειών. Σε ότι αφορά, όμως, τη βιοτεχνολογία, εννοεί κάθε οργανική ύλη που αναπτύσσεται μέσω της φωτοσυνθετικής μετατροπής της ηλιακής ενέργειας. Ο ήλιος, είτε άμεσα, είτε έμμεσα, αποτελεί την κύρια πηγή ενέργειας στη Γη. Η δύναμή του μετατρέπεται σε χρήσιμη οργανική μορφή βιομάζα- μέσω των φυτών, των αλγών και φωτοσυνθετικών βακτηρίων. Η βιομάζα που παράγεται μέσω της φωτοσύνθεσης, κάθε χρόνο, σε στεριά και ωκεανούς, περιέχει, περίπου, ενέργεια της τάξης των 3*10 21 Joules, ποσό που αντιστοιχεί σε 10 φορές της ετήσιας παγκόσμιας κατανάλωσης. Έτσι, προκύπτει ο όρος βιοκαύσιμα. Βιοκαύσιμο υλικό είναι αυτό που παράγει ενέργεια και προέρχεται από οργανικές ουσίες. 1.2 ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗ Η λιγνοκυτταρίνη είναι, περίπου, η μισή από τη συνολική ποσότητα ύλης που παράγεται από τη φωτοσύνθεση. Αποτελείται από τρία είδη πολυμερών: την κυτταρίνη, την ημικυτταρίνη και τη λιγνίνη. Το ποσοστό του κάθε πολυμερούς ποικίλει ανάλογα με το είδος και την ηλικία του φυτού. Κατά μέσο όρο, η 5

6 λιγνοκυτταρίνη αποτελείται από 45% κυτταρίνη, 30% ημικυτταρίνες και 25% λιγνίνη. Η λιγνίνη είναι ένα τρισδιάστατο, σφαιρικό, ακανόνιστο, αδιάλυτο, υψηλού μοριακού βάρους (>10000) πολυμερές, αποτελούμενο από υπομονάδες φαινυλοπροπανίου, χωρίς αλυσίδες κανονικά επαναλαμβανόμενων μονάδων, ή κάποιους δεσμούς που μπορούν να υδρολύονται εύκολα, είτε χημικά, είτε ενζυμικά. Στα φυτά η λιγνίνη συνδέεται με ημικυτταρίνη και καλύμματα αποτελούμενα από ίνες κυτταρίνης. Η λιγνίνη είναι υπεύθυνη για την ακαμψία των φυτών και την ανθεκτικότητά τους σε μηχανικές πιέσεις και μικροβιακές επιθέσεις. Εικόνα 1.1: Λιγνίνη 6

7 Οι ημικυτταρίνες είναι μικρές αλυσίδες ετερογενών πολυμερών, οι οποίες περιέχουν εξόζες ( σάκχαρα με έξι άτομα άνθρακα όπως γλυκόζη, μαννόζη και γαλακτόζη) και πεντόζες ( σάκχαρα με πέντε άτομα άνθρακα όπως ξυλόζη και αραβινόζη). Οι τρεις κύριοι τύποι των ημικυτταρινών είναι α) ξυλάνες, οι οποίες έχουν σκελετό από πολύ-β-1,4-ξυλάνη με πλευρικές συνδέσεις σε αραβινόζη, β) γλυκουρονικό οξύ και αραβινογλυκουρονικό οξύ και γ) μαννάνες, οι οποίες αποτελούνται από γλυκομαννάνες, γαλακτομαννάνες και αραβινογαλακτάνες. Η κυτταρίνη είναι το απλούστερο από τα συστατικά που βρίσκονται σε λιγνοκυτταρινικά υλικά. Είναι η πιο διαδεδομένη οργανική ένωση στη φύση. Αποτελείται από μακριές αλυσίδες μορίων D-γλυκόζης συνδεδεμένων με β-1,4 γλυκοζιτικούς δεσμούς. Η δημιουργία δεσμών β-1,4 επιτρέπει το σχηματισμό μακριών αλυσίδων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ινωδών δομών στη γραμμική αλυσίδα της κυτταρίνης, οι οποίες παρουσιάζουν μεγάλη αντοχή και ελάχιστη διαλυτότητα. Επομένως, είναι κατάλληλες ως υλικό κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών. Οι αλυσίδες αυτές έχουν περιοχές κρυσταλλικής δομής, αλλά και άμορφες περιοχές. Επιπλέον, η κυτταρίνη είναι μια μορφή αποθηκευμένης γλυκόζης. Έτσι, είναι ένα συστατικό των λιγνοκυτταρινών, το οποίο έχει τη μεγαλύτερη δυνατότητα μετατροπής σε μια μεγάλη ποικιλία ενώσεων, όπως αλκοόλη. Μεγάλα ποσοστά κυτταρίνης συναντάμε στα διάφορα είδη χαρτιού. Το χαρτί παρασκευάζεται από ξύλο, κατεργασμένο με CaSO 4 εν θερμώ, ή από άχυρο, κατεργασμένο με NaOH εν θερμώ και υπό πίεση. Με αυτή τη διεργασία απομακρύνεται η λιγνίνη. Στη συνέχεια, η κυτταρίνη, αφού λευκανθεί, μετατρέπεται σε χαρτί (διηθητικό). Οι συνηθισμένοι τύποι χαρτιού προκύπτουν από το διηθητικό με κατεργασία με BaSO 4, κολοφώνιο, καολίνη (Al 2 O 3.2SiO 2.2H 2 O), υλικά που προσδίδουν στο χαρτί διάφορες ιδιότητες (λεία επιφάνεια, στιλπνότητα, κ.α.). Τα ποσοστά της κυτταρίνης διαφέρουν ανάλογα με τον τύπο χαρτιού, αλλά παραμένει η κύρια οργανική ένωση. Έχει βρεθεί πως το 80% των αποβλήτων ενός σπιτιού σχετίζεται με την κατανάλωση χαρτιού. Κάποια είδη χαρτιού μπορούν να ανακυκλωθούν, αλλά κάποια άλλα όχι. Τα απόβλητα αυτά, λοιπόν, θάβονται σε κατάλληλα διαμορφωμένες περιοχές, με αποτέλεσμα τεράστιες ποσότητες κυτταρίνης, και κατ επέκταση γλυκόζης, να χάνονται. Τίθεται, λοιπόν, άλλο ένα ερώτημα πως μπορεί να 7

8 γίνει δυνατή η αξιοποίηση αυτής της οργανικής ύλης. Αρκεί να διασπαστεί η κυτταρίνη σε γλυκόζη. 1.3 ΕΝΖΥΜΑ Οι Spano et al έδειξαν ότι η παραγωγή γλυκόζης είναι το πιο ακριβό βήμα κατά την παραγωγή αιθανόλης από βιομάζα. Συγκεκριμένα, υπολογίστηκε πως το κόστος παραγωγής γλυκόζης αντιστοιχεί στο 40% του συνολικού κόστους της διεργασίας. Συνεπώς, κρίνεται απαραίτητη η μείωση του κόστους της παραγωγής της γλυκόζης για την βιομηχανική εκμετάλλευση της μεθόδου. Πρωταρχικό ρόλο στη διάσπαση της κυτταρίνης παίζουν οι κυτταρινάσες. Ένα σύστημα κυτταρινάσης αποτελείται από: -Ενδο-β-γλυκανάση, η οποία υδρολύει β-1,4-δεσμούς μεταξύ γειτονικών μορίων γλυκόζης μέσα στις άμορφες περιοχές του πολυμερούς της κυτταρίνης (ασθενώς πακεταρισμένες) σπάζοντας την αλυσίδα στη μέση. -Εξω-β-γλυκανάση, η οποία υδρολύει τις κομμένες αλυσίδες κυτταρίνης από τα μη αναγωγικά άκρα τους και παράγουν γλυκόζη, κελλοβιόζη και κελλοτριόζη. -Κελλοβιοϋδρολάσες, οι οποίες βρίσκονται συχνά σε κυτταρινολυτικούς μύκητες και είναι ένας τύπος εξωγλυκανασών οι οποίες απομακρύνουν τμήματα 10 ή περισσοτέρων μονάδων γλυκόζης από τα μη αναγωγικά άκρα του μορίου της κυτταρίνης. -β γλυκοσιδάση ή κελλοβιάση, η οποία μετατρέπει κελλοβιόζη και κελλοτριόζη σε γλυκόζη. 8

9 Εικόνα 1.2: Μηχανισμός υδρόλυσης κυτταρίνης 9

10 Εικόνα 1.3: Μηχανισμός υδρόλυσης κυτταρίνης Τουλάχιστον δύο στάδια αποικοδόμησης της κυτταρίνης από μικροοργανισμούς ξεκινούν με το προκαταρκτικό προϋδρολυτικό πρώτο βήμα που περιέχει ένα ένζυμο (C1), που διογκώνει και/ή ενυδατώνει αλυσίδες άνυδρης γλυκόζης. Το δεύτερο βήμα χρησιμοποιεί υδρολυτικά ένζυμα (Cx) και β-γλυκοσιδάση (κελλοβιάση). 10

11 1.4 Μικροοργανισμοί που παράγουν κυτταρινάσες Αν και ο αριθμός των μικροοργανισμών που αποικοδομούν την κυτταρίνη είναι μεγάλος, ελάχιστοι από αυτούς παράγουν τέτοιες ποσότητες ενζύμων που να υδρολύουν την κυτταρίνη in vitro. Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται οι κυριότεροι μικροοργανισμοί που παράγουν κυτταρινάσες. Πίνακας 1.1 Κύριοι μικροοργανισμοί παραγωγής κυτταρινασών Το Trichoderma reesie έχει ένα εκτεταμένα μελετημένο ενζυμικό σύμπλεγμα κυτταρινάσης. Αυτό το σύμπλεγμα μετατρέπει κρυσταλλικές, άμορφες και χημικά 11

12 παραγόμενες κυτταρίνες ποσοτικά σε γλυκόζη. Τα ζωτικά χαρακτηριστικά αυτού του συμπλέγματος κυτταρινάσης είναι: 1) το σύστημα είναι πολυενζυμικό, 2) τρία συστατικά ένζυμα είναι διακριτά το λιγότερο, τόσο φυσικά όσο και χημικά, και 3) και τα τρία συστατικά παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην υδρόλυση της κυτταρίνης σε γλυκόζη. Η ανάλυση για την δράση της κυτταρινάσης χρησιμοποιεί μια μέθοδο που καθορίζει την επίδραση της κυτταρινάσης σε μικροκρυσταλλική κυτταρίνη. Η απελευθερώμενη γλυκόζη προσδιορίζεται από ένα σύστημα εξοκινάσης/ αφυδρογονάσης της γλυκόζης-6ρ στα 340nm. Η διάσπαση της κυτταρίνης από κυτταρινολυτικούς οργανισμούς, είναι συχνά αργή και ατελής. Έτσι έχουν εφαρμοσθεί στρατηγικές γενετικής μηχανικής για τη δημιουργία οργανισμών, οι οποίοι έχουν μεγαλύτερη δραστικότητα κυτταρινασών. 12

13 2 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 ΓΕΝΙΚΑ Ακινητοποίηση ή καθήλωση ενζύμου είναι ο περιορισμός του σε τεχνητή στερεά φάση, η οποία διακρίνεται από την κύρια υγρή φάση. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ετερογενές σύστημα. Η στερεά φάση, που φέρει το ένζυμο, είναι καταλυτικά ενεργός και ονομάζεται βιοκαταλυτική στερεά φάση, για να διακρίνεται από κάθε άλλη στερεά φάση χωρίς καταλυτικές ιδιότητες. Η ακινητοποίηση γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να επιτρέπεται η αμφίδρομη μεταφορά ( π.χ. υποστρώματος, προϊόντος, οξυγόνου) μεταξύ βιοκαταλυτικής στερεάς φάσης και κύριας υγρής φάσης. Τυπικά στο σύστημα διακρίνεται και η στατική υγρή φάση που εντοπίζεται στο εσωτερικό της βιοκαταλυτικής στερεάς φάσης, της οποίας αποτελεί και μέρος. Η ακινητοποίηση ενζύμου έχει τα εξής πλεονεκτήματα: Α) την αύξηση της σταθερότητας του ενζύμου, Β) τον εύκολο και άμεσο έλεγχο της αντίδρασης (με απλή προσθήκη ή αφαίρεση του ενζύμου), Γ) την εύκολη και άμεση παραλαβή του προϊόντος (εφόσον ένζυμο και προϊόν βρίσκονται σε διαφορετικές φάσεις), Δ) την οικονομία (μετά το τέλος της αντίδρασης το ίδιο ένζυμο μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί), και Ε) τη συνεχή λειτουργία της βιοκαταλυτικής αντίδρασης. 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ Οι μέθοδοι ακινητοποίησης διακρίνονται σε φυσικές και χημικές, οι οποίες περιλαμβάνουν διάφορες τεχνικές (Σχήμα 2.1) Στις χημικές μεθόδους ακινητοποίησης δημιουργείται χημικός ομοιοπολικός δεσμός είτε μεταξύ στερεάς φάσης (φορέα) και ενζύμου (α), ή μεταξύ των ίδιων των μορίων του ενζύμου, τα οποία στην περίπτωση αυτή σχηματίζουν τη βιοκαταλυτική στερεά φάση. Στις φυσικές μεθόδους το ένζυμο είτε προσροφάται στο φορέα (γ), είτε περιορίζεται εντός 13

14 τεχνητού μικροπεριβάλλοντος, π.χ. πλέγμα πολυμερούς (δ), μικροκαψύλλιο (ε) ή λιπόσωμα (στ). 14

15 2.2.1 Χημικές μέθοδοι ακινητοποίησης Οι χημικές τεχνικές ακινητοποίησης αποτελούν τη συνηθέστερη επιλογή, λόγω της ύπαρξης πληθώρα οργανικών αντιδράσεων που μπορούν να οδηγήσουν σε επιτυχή αποτελέσματα. Πλεονέκτημα των χημικών μεθόδων αποτελεί το γεγονός ότι ο ομοιοπολικός δεσμός, γενικά, ακινητοποιεί το ένζυμο κατά τρόπο σταθερό. Αντιθέτως, μειονέκτημα αποτελεί η υψηλή δραστικότητα και αποτελεσματικότητα πολλών χημικών αντιδραστηρίων, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε ανεπιθύμητες αντιδράσεις με τις πλευρικές ομάδες αμινοξέων απαραίτητων για την ενζυμική δραστικότητα. Προκειμένου να διασφαλιστεί η καταλυτική ικανότητα του ακινητοποιημένου ενζύμου πρέπει να ικανοποιείται μια από τις παρακάτω συνθήκες: Α) Παρουσία είτε ενζυμικού υποστρώματος είτε συναγωνιστικού αναστολέα. Και στις δυο περιπτώσεις, κατά την ακινητοποίηση, η ενεργός περιοχή του ενζύμου φέρει υπόστρωμα ή αναστολέα δεσμευμένο (Σχήμα 2.2α). Συνεπώς, η περιοχή αυτή, άρα και η ενζυμική δραστικότητα, προστατεύονται από τα αντιδραστήρια ακινητοποίησης (-R-). Β) Προσωρινός σχηματισμός αντιστρέψιμου συμπλόκου ενζύμου-αναστολέα μέσω ομοιοπολικού δεσμού, ώστε να προστατευθεί η ενεργός περιοχή (Σχήμα 2.2β). Γ) Εφόσον είναι εφικτή, χρησιμοποίηση πρόδρομης αδρανούς μορφής του ως προς ακινητοποίηση ενζύμου (π.χ. ζυμογόνα πρωτεασών). 15

16 Ομάδες του βιοκαταλύτη που κυρίως χρησιμοποιούνται κατά την ακινητοποίηση είναι η ε-αμινομάδα της Lys και η α-αμινομάδα του Ν-τελικού άκρου του ενζυμικού μορίου. Η σουλφυδρυλομάδα της Cys είναι δραστικότερη από την αμινομάδα (π.χ. της Lys) και ακόμη δραστικότερη από την υδροξυλομάδα (π.χ. της Tyr, Ser, Thr), ωστόσο ο αντίστοιχα σχηματιζόμενος θειεστέρας είναι λιγότερο σταθερός από την 16

17 υποκατεστημένη αμίνη ή από τον εστέρα. Εάν ληφθεί υπόψη και η συχνότητα παρουσίας των αμινοξέων στο ενζυμικό μόριο, η προτίμηση αμινοξέων ως θέσεων ακινητοποίησης μειώνεται, με την εξής σειρά: Lys (-NH 2 ), Cys (-SH), Tyr (φαινολικό υδροξύλιο), His (ιμιδαζολομάδα), Asp (-COOH), Glu (-COOH), Arg(γουανιδινομάδα ), Trp (ινδολομάδα), Ser (-CH 2 OH), Thr (-CH 2 OH) και Met (θειεστέρας,-s-ch 3 ). Η χημική σύσταση στερεών υλικών που χρησιμοποιούνται ως φορείς ακινητοποιημένων ενζύμων παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία. Στα περισσότερα υλικά υπάρχουν ελεύθερες ομάδες (π.χ. υδροξυλομάδες, αμινομάδες ή καρβοξυλομάδες), από τις οποίες είναι δυνατό να ακινητοποιηθεί ο βιοκαταλύτης. Στη συνέχεια περιγράφονται οι κυριότερες αντιδράσεις ακινητοποίησης ενζύμων: Διαζώτωση Μέσω της τεχνικής αυτής επιτυγχάνεται ο σχηματισμός αζωδεσμών (-Ν=Ν-) προερχόμενων από αντίδραση ενζύμου και δραστικών ηλεκτρονιόφιλων αρυλοδιαζωνιακών ομάδων (ArN + 2 ) του φορέα. Ο φορέας πρέπει να έχει αρυλαμινομάδες, οι οποίες παρουσία νιτρώδους νατρίου και υδροχλωρικού οξέος μετατρέπονται στις αντίστοιχες δραστικές αρυλοδιαζωνιακές ομάδες. Οι τελευταίες, στη συνέχεια, αντιδρούν με πλευρικές φαινολικές ομάδες του ενζύμου (π.χ. της Tyr), σχηματίζοντας φαινολ-αζωπαράγωγα ακινητοποιημένου ενζύμου (Σχήμα 2.3α). Επίσης, ελεύθερες ενζυμικές αμινομάδες (π.χ. της Lys και του Ν-τελικού άκρου) αντιδρούν με τις αρυλοδιαζωνιακές ομάδες του ενεργοποιημένου φορέα, παράγοντας δι-αζωπαράγωγα ακινητοποιημένου ενζύμου, στα οποία μια ενζυμική αμινομάδα δεσμεύεται σε διαζωνικές ομάδες του φορέα (Σχήμα 2.3β). 17

18 18

19 Σχηματισμός αμιδικού δεσμού α) Φορέας με ελεύθερες αρωματικές ή αλειφατικές αμινομάδες ενεργοποιείται παρουσία θειοφωσγενίου σε αλκαλικό περιβάλλον προς το αντίστοιχο δραστικό ισοθειοκυανο-παράγωγο (Σχήμα 2.4α). Στη συνέχεια, πρωτοταγείς αμινομάδες του ενζύμου(π.χ. της Lys) αντιδρούν με τον ενεργοποιημένο φορέα σχηματίζοντας θειοαμιδικούς δεσμούς. Ειδικά για φορέα που φέρει αρωματικές αμινομάδες, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί φωσγένιο (Σχήμα 2.4β). Τότε λαμβάνεται το αντίστοιχο δραστικό ισοκυανο-παράγωγο, το οποίο, με πρωτοταγείς αμινομάδες του ενζύμου σχηματίζει αμιδικούς δεσμούς. Άλλες ενζυμικές πλευρικές ομάδες (π.χ. σουλφυδρυλομάδες, ιμιδαζολομάδες, φαινολομάδες και καρβοξύλια), επίσης αντιδρούν με δραστικά ισο(θειο)κυανο-παράγωγα του φορέα. Αλλά, οι λαμβανόμενες αντίστοιχες ενώσεις είναι ασταθείς σε ασθενώς αλκαλικό ph και αποικοδομούνται παρουσία νουκλεόφιλων ομάδων. β) Φορέας με καρβοξυλομάδες ενεργοποιείται υπό βρασμό με θειονυλο-χλωρίδιο, οπότε σχηματίζεται ο αντίστοιχος ακυλοχλωρο-υποκατεστημένος φορέας. Οι ομάδες του τελευταίου αντιδρούν σε μειωμένη θερμοκρασία με ενζυμικές αμινομάδες, σχηματίζοντας αμιδικούς δεσμούς (Σχήμα 2.5). 19

20 γ) Πολύ συνηθισμένη αντίδραση καρβοξυλίου και αμινομάδας είναι αυτή που χρησιμοποιεί καρβοδιιμίδια. Τα καρβοξύλια του φορέα, σε όξινο ph, ενεργοποιούνται παρουσία καρβοδιιμιδίου προς τις αντίστοιχες δραστικές ο-ακυλισοουρίες (εστέρες ισοουρίας), οι οποίες στη συνέχεια αντιδρούν με πρωτοταγείς ομάδες του ενζύμου, κυρίως αμινομάδες και λιγότερο υδροξυλομάδες ή σουλφυδρυλομάδες (Σχήμα 2.6). δ) Φορέας με ελεύθερες υδροξυλομάδες ενεργοποιείται προς κυκλικό καρβοϊμίδιο. Σε ψυχρό αλκαλικό περιβάλλον, δυο υδροξύλια ενεργοποιούνται προς κυκλικό καρβοϊμιδο-παράγωγο, παρουσία κυανοβρωμιδίου. Τελικά, οι δραστικές κυκλικές καρβοϊμιδομάδες του φορέα αντιδρούν με αμινομάδες του ενζύμου, με αποτέλεσμα την ακινητοποίηση του ενζύμου μέσω δεσμών ισοουρίας. ε) Κατάλληλη ενεργοποίηση υδροξυλομάδων οποιουδήποτε φορέα είναι δυνατό να οδηγήσει σε δραστικά καρβονυλο-παράγωγα. Ως αντιδραστήριο ενεργοποιήσεως χρησιμοποιείται ο αιθυλεστέρας του χλωρομυρμηκικού οξέος σε άνυδρο οργανικό περιβάλλον (π.χ. διμεθυλσουλφοξείδιο παρουσία διοξανίου και τριαιθυλαμίνης). Τα σχηματιζόμενα δραστικά κυκλικά καρβονυλο-παράγωγα αντιδρούν με πρωτοταγείς αμινομάδες του ενζύμου για να δώσουν ακινητοποιημένο βιοκαταλύτη (Σχήμα 2.7). 20

21 Αντιδράσεις αρυλιώσεως και αλκυλιώσεως Περιγράφονται γενικές αντιδράσεις ομάδων του ενζυμικού μορίου (π.χ. αμινομάδων, σουλφυδρυλομάδων) με δραστικές ομάδες ενεργοποιημένου φορέα (π.χ. αλογόνα, εποξείδια). Μια αντίδραση στην οποία μετέχει αλογόνο ως δραστική ομάδα του φορέα αποτελεί η απευθείας ακινητοποίηση ενζύμου σε δραστικό συνθετικό ακρυλο-φθοριούχο πολυμερές. Τέτοιο υλικό είναι αυτό που παράγεται από τον συμπολυμερισμό μεθακρυλικού οξέος και 5-φθορο-2,4-δινιτρο-ανιλινο-μεθακρυλικού οξέος. Μέρος της δομής του δραστικού πολυμερούς, καθώς και η αντίστοιχη νουκλεόφιλη αντίδραση ακινητοποιήσεως του ενζύμου παριστάνονται στο Σχήμα

22 Ακόμη ένα παράδειγμα αποτελεί η αντίδραση του πολύ-δραστικού κυανουρικού οξέος (με τη μορφή διχλωροτριαζινο φορέα) είτε με αμινομάδες του ενζύμου (ΝΗ 2 - Ε), ή με άλλον υποκαταστάτη R, ο οποίος φέρει υδοξυλομάδες (OH-R). (Σχήμα 2.9) Στη δεύτερη περίπτωση, υπάρχει η ευκαιρία επιλογής κατάλληλου υποκαταστάτη R, ώστε να τροποποιηθούν οι ιδιότητες του φορέα (π.χ. με την εισαγωγή κατάλληλων ιοντικών ή υδρόφοβων ομάδων). Κατά την αντίδραση υποκατάστασης του τελευταίου χλωρίου προστίθεται το ένζυμο, οπότε η ακινητοποίηση χρειάζεται ώρες ή ακόμα και μέρες για να ολοκληρωθεί. 22

23 Σχηματισμός βάσης Schiff Στην περίπτωση αυτή πραγματοποιούνται αντιδράσεις μεταξύ αλδεϋδομάδων, που ήδη υπάρχουν ή δημιουργούνται στο φορέα, και αμινομάδων του ενζύμου, με αποτέλεσμα το σχηματισμό δεσμών αλδιμίνης, γνωστών και ως δεσμών βάσης Schiff. Καταλληλότεροι φορείς θεωρούνται αυτοί που φέρουν αλδεϋδομάδες, όπως είναι ορισμένα ειδικά συνθετικά πολυμερή (π.χ. ακεταλδεϋδο-πολυακρυλαμίδιο) και φυσικοί πολυσακχαρίτες με γειτονικές υδροξυλομάδες (τύπου cis-διόλης), οι οποίες έχουν οξειδωθεί παρουσία υπεριωδικού νατρίου (NaIO 4 ) προς τις αντίστοιχες αλδεϋδομάδες. Εντούτοις, η μέθοδος αυτή παρουσιάζει κάποια μειονεκτήματα αναφορικά με τη διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας. Καταρχήν, σε ορισμένους φορείς πολυσακχαριτικής φύσεως, οι σχηματιζόμενες αλδεϋδομάδες είναι γειτονικές, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ακατάλληλης στερεοδιάταξης όταν και οι δυο αντιδρούν με το ένζυμο. Ο σχηματισμός αυτής της στερεοδιάταξης οδηγεί το ένζυμο, τελικά, σε αδρανοποίηση. Επιπλέον, οι σχηματιζόμενοι δεσμοί αλδιμίνης είναι ασταθείς, ιδίως σε όξινο ph, οπότε απαιτείται αναγωγή τους παρουσία βοροϋδριδίου του νατρίου (NaBH 4 ). Ανταλλαγή θειολο-δισουλφιδικών δεσμών Στο σχήμα 2.10(α) παρουσιάζεται μια αντίδραση που οδηγεί σε αντιστρέψιμη ακινητοποίηση του ενζύμου μέσω σχηματισμού δισουλφιδικού δεσμού. Ο δεσμός αυτός σχηματίζεται μεταξύ ενζύμου και φορέα. Οι θειολομάδες κατάλληλου φορέα ενεργοποιούνται με 2,2 -διπυριδινο-δισουλφίδιο, και ο σχηματιζόμενος δραστικός φορέας ανταλλάσσει πυριδινο-σουλφιδομάδες με θειολομάδες του ενζύμου, οδηγώντας το τελευταίο σε ακινητοποίηση. Στο σχήμα 2.10(β), ο δισουλφιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ συμπλόκου ενζύμου-βραχίονα και φορέα. Ουσιαστικά γίνεται εισαγωγή μορίου βραχίονα, μεταξύ ακινητοποιημένου ενζύμου και φορέα. Το χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο είναι η Ν-ακετυλ-ομοκυστεϊνο-θειολακτόνη, το οποίο, αφενός προσφέρει την απαραίτητη θειολομάδα, αφετέρου, παίζει το ρόλο του βραχίονα. Αρχικά, η θειολακτόνη αντιδρά με αμινομάδες του ενζύμου, με αποτέλεσμα το άνοιγμα του δακτυλίου και το σχηματισμό ομοιοπολικού συμπλόκου ενζύμου-βραχίονα μέσω αμιδικού δεσμού. Στη συνέχεια, στην αντίδραση προστίθεται ο φορέας που φέρει θειολομάδες, οπότε και σχηματίζονται δισουλφιδικοί δεσμοί. Λόγω της παρουσίας δισουλφιδικών δεσμών στο ακινητοποιημένο σύμπλοκο, η αναγέννηση του βιοκαταλυτικού φορέα με νέα ποσότητα δραστικού ενζύμου γίνεται παρουσία αναγωγικών αντιδραστηρίων. 23

24 Ακινητοποίηση σε ανόργανα υλικά Δεδομένου ότι η λειτουργικότητα των ανόργανων υλικών για χημική ακινητοποίηση ενζύμων είναι περιορισμένη, οι αντίστοιχοι φορείς πρέπει πρώτα να υποστούν επεξεργασία με κατάλληλα κατά περίπτωση τριμεθοξυ-οργανοπυριτικά. Η χρήση τέτοιων αντιδραστηρίων σκοπό έχει την επικάλυψη της ανόργανης επιφάνειας του φορέα με στιβάδες οργανικής σύστασης, που φέρουν οργανικές λειτουργικές ομάδες (αλειφατικές ή αρωματικές αμινομάδες, αλογόνα, αλδεϋδομάδες κ.α.). Στη συνέχεια, το ένζυμο ακινητοποιείται μέσω των λειτουργικών αυτών ομάδων. Η διαδικασία επικαλύψεως χρησιμοποιεί ως συνηθέστερο αντιδραστήριο το πυριτικό παράγωγο 3- αμινοπροπυλο-τριμεθοξυ-πυρίτιο. Σύμφωνα με το σχήμα 2.11α, υδροξυλομάδες του φορέα, πολύ-οξειδίου του πυριτίου, υποκαθίστανται από τριμεθοξυ-ομάδες του αντιδραστηρίου, με αποτέλεσμα την παρουσία λειτουργικής νέας επιφάνειας επί της ανόργανης, στην προκειμένη περίπτωση με ελεύθερες αμινομάδες. Προφανώς, χρησιμοποίηση διαφορετικών παραγώγων του πυριτίου οδηγεί σε αντίστοιχες οργανικές επιφάνειες με διαφορετικές ελεύθερες λειτουργικές ομάδες. Κύριο μειονέκτημα του εν λόγω ανόργανου φορέα είναι η περιορισμένη σταθερότητά του, ακόμα και σε ήπιες αλκαλικές συνθήκες. Επεξεργασία του φορέα με άλατα ζιρκονίου υπό κενό έχει ως αποτέλεσμα την εναπόθεση επικαλύμματος οξειδίου του ζιρκονίου, οπότε και βελτιώνεται η ανθεκτικότητα σε αλκαλικό περιβάλλον. Βελτιωμένη μορφή ανόργανου φορέα είναι και το προϊόν το οποίον παρασκευάζεται κατόπιν επεξεργασίας με τετραχλωρο-τιτάνιο (Σχήμα 2.11β). Στην προκειμένη περίπτωση, η νέα επιφάνεια προσφέρει, αφενός δραστικές χλωρομάδες για περαιτέρω 24

25 αντιδράσεις τροποποιήσεως (π.χ. με διαμινοαλκάνια), αφετέρου αυξημένη χημική σταθερότητα, λόγω της ύπαρξης στιβάδας τιτανίου. 25

26 2.2.2 Φυσικές μέθοδοι ακινητοποίησης Προσρόφηση Η ακινητοποίηση βιοκαταλύτη μέσω προσροφήσεως σε κατάλληλο φορέα αποτελεί την παλαιότερη τεχνική (Σχήμα 2.1γ). Ανάλογα με τον χρησιμοποιούμενο φορέα, οι δυνάμεις που οδηγούν το ένζυμο σε προσρόφηση είναι είτε ηλεκτροστατικές, είτε υδρόφοβες. Η πρώτη και ευρύτερη βιομηχανική εφαρμογή ακινητοποιημένων ενζύμων αφορούσε την παραγωγή L-αμινοξέων παρουσία ακυλάσης L-αμινοξέων, προσροφημένης σε ανιοντοανταλλάκτη δεξτράνης (DEAE-Sephadex). Κύριο μειονέκτημα της τεχνικής προσροφήσεως μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων είναι η ευκολία με την οποία το ένζυμο διαφεύγει του φορέα. Αυτό συμβαίνει σε περιπτώσεις μεταβολής του ph, της ιοντικής ισχύς της υγρής φάσης ή παρουσία υποστρώματος, κυρίως όταν αυτό έχει το ίδιο συνολικό φορτίο με το ακινητοποιημένο ένζυμο. Το παραπάνω μειονέκτημα, από διαφορετική οπτική γωνία μπορεί να θεωρηθεί ως πλεονέκτημα της τεχνικής, γιατί η αναγέννηση του βιοκαταλυτικού φορέα (απομάκρυνση αδρανούς βιοκαταλύτη και φόρτιση με νέα ποσότητα δραστικού ενζύμου) καθίσταται πολύ εύκολη και οικονομική. Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ βιοκαταλύτη και φορέα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ακινητοποίηση του βιοκαταλύτη με προσρόφηση. Στην προκειμένη περίπτωση, το ένζυμο τροποποιείται με την εισαγωγή κατάλληλων υδρόφοβων μορίων (ουρών), μέσω σταθερών ομοιοπολικών δεσμών. Στην συνέχεια, επιλέγεται φορέας με ανάλογα υδρόφοβα χαρακτηριστικά, οπότε, όταν το τροποποιημένο ένζυμο και ο υδρόφοβος φορέας βρεθούν σε υδάτινο περιβάλλον αλληλεπιδρούν με υδρόφοβες δυνάμεις και το ένζυμο προσροφείται. Η παρουσία επιφανειοδραστικών ουσιών έχει συνήθως ως αποτέλεσμα την αντιστροφή του φαινόμενου και την επαναδιαλυτοποίηση του ενζύμου. Εγκλωβισμός Με τον όρο αυτό εννοούμε τον περιορισμό του ενζύμου στο εσωτερικό της δομής πολυμερούς υλικού (πλέγματος) που αποτελεί το φορέα (Σχήμα 2.1δ). Προφανώς, προϋπόθεση της επιτυχίας εγκλωβισμού του βιοκαταλύτη είναι να έχει μέγεθος μεγαλύτερο από αυτό των πόρων του φορέα. Κάτι τέτοιο δεν είναι πάντα εφικτό, αφού κατά τη σύνθεση του πλέγματος είναι σχετικά δύσκολο να ελεγχθεί και να καθοριστεί το μέγεθος των πόρων. Γενικά, με την τεχνική αυτή υπάρχει μεγάλη 26

27 δυνατότητα διαφυγής ενζύμου από το πλέγμα, πρόβλημα το οποίο συχνά αντιμετωπίζεται με χημική σταθεροποίηση του βιοκαταλυτικού φορέα από διδραστικά αντιδραστήρια. Από την άλλη πλευρά, οι πόροι του φορέα θα πρέπει να έχουν τέτοιο μέγεθος, ώστε να αμβλύνουν πιθανά φαινόμενα περιορισμού της μεταφοράς ουσιών λόγω του μοριακού τους μεγέθους. Γενικά, ο εγκλωβισμός θεωρείται ως η καταλληλότερη τεχνική για την ακινητοποίηση κυττάρων και μεγαλομοριακών συστημάτων. Δυο τύποι πολυμερών υλικών που βρίσκουν ευρεία εφαρμογή είναι το πολυακρυλαμίδιο και τα διάφορα φυσικά πολυμερή, πολυσακχαριδικής κυρίως σύστασης, με δυνατότητα σχηματισμού πηκτωμάτων. Ο βιοκαταλύτης αναμιγνύεται με αρχικά μονομερή, τα οποία τελικώς πολυμερίζονται, εγκλωβίζοντας τον βιοκαταλύτη. Το πολυακρυλαμίδιο (Σχήμα 2.12) σχηματίζεται από μονομερή συστατικά ακρυλαμιδίου και Ν,Ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου. Το τελευταίο χρησιμοποιείται ως αντιδραστήριο διαμοριακής σύνδεσης. Η αντίδραση αρχίζει παρουσία K 2 S 2 O 5 και μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου, ενώ ως καταλύτης χρησιμοποιείται Ν,Ν,Ν,Ν -τετραμεθυλ-αιθυλενο-διαμίνη (TEMED). Κύριο πρόβλημα είναι η τοξικότητα των μονομερών και, ως εκ τούτου, η τεχνική αποφεύγεται σε ευαίσθητα βιολογικά συστήματα (π.χ. κύτταρα). Αντίθετα, τα φυσικά πολυμερή δεν παρουσιάζουν προβλήματα τοξικότητας, η δομή τους είναι όμως λιγότερο σταθερή σε σχέση με το πολυακρυλαμίδιο. Άγαρ, κ-καρραγενάνη και αλγινικό ασβέστιο πηκτωματοποιούνται εγκλωβίζοντας βιοκαταλύτες ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος. Άγαρ και κ-καρραγενάνη σχηματίζουν πηκτώματα με μεγάλους πόρους και διαλυτοποιούνται με αύξηση της θερμοκρασίας. Συνεπώς θεωρούνται ως υλικά μετρίως κατάλληλα για εγκλωβισμό. Διαλυτοποίηση του πολυμερούς παρατηρείται από τους 40 0 C και άνω, άρα προϋπόθεση εφαρμογής της τεχνικής είναι η σταθερότητα του βιοκαταλύτη, τουλάχιστον στην συγκεκριμένη θερμοκρασία, ώστε το πολυμερές να είναι διαλυτοποιημένο κατά την έναρξη του εγκλωβισμού. Στη συνέχεια προστίθεται βιοκαταλύτης, και το θερμό διάλυμα (ή αιώρημα, αν πρόκειται για κύτταρα) πολυμερούς και βιοκαταλύτη πηκτωματοποιεί είτε σε μη υδατοσυμβατό υγρό, π.χ. λάδι ή βουτανόλη (περίπτωση ζελατίνης και άγαρ), είτε σε διάλυμα χλωριούχου καλίου (περίπτωση κ-καρραγενάνης). Το αλγινικό οξύ προέρχεται από κυανοφύκη και έχει ως δομικές μονάδες β-d-μαννοπυρανοζυλοουρονικό οξύ και α-l-γλυκοπυρανοζυλο-ουρονικό οξύ. Αρχικά διαλυτοποιείται ο πολυσακχαρίτης, προστίθεται βιοκαταλύτης, ενώ το υδάτινο διάλυμα εισάγεται 27

28 στάγδην σε διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου, οπότε και πηκτωματοποιείται αμέσως. Ο φορέας αλγινικού ασβεστίου έχει σχετικά σταθερή δομή, όμως η παρουσία φωσφορικών και κιτρικών ανιόντων θα πρέπει να αποφεύγεται, αφού τα ανιόντα αυτά έχουν την ιδιότητα να σχηματίζουν σύμπλοκα με τα κατιόντα ασβεστίου, οδηγώντας τελικά το πήκτωμα σε διαλυτοποίηση. Εγκαψυλλίωση Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, το ένζυμο βρίσκεται ελεύθερο και διαλυμένο σε εξαιρετικά μικρό όγκο υγρού, το οποίο περιορίζεται στο εσωτερικό ημιπερατής μεμβράνης που λαμβάνει τη μορφή μικροσφαιριδίου ή μικροκαψυλλίου (Σχήμα 1.1ε). Συνεπώς, ο βιοκαταλυτικός φορέας αποτελείται από πληθυσμό ημιπερατών καψυλλίων, τα οποία στο εσωτερικό τους φέρουν ενζυμικό διάλυμα. Προϋπόθεση επιτυχίας της τεχνικής είναι η σταθερότητα του ενζύμου υπό μορφή διαλύματος. Τα καψύλλια έχουν διάμετρο μm, ανάλογα δε με το μέγεθος των πόρων τους επιτρέπουν τη διέλευση μορίων μικρότερου μεγέθους (π.χ. υποστρώματος, προϊόντος, 28

29 αλάτων κ.α.) όχι όμως και ενζύμου. Τέτοια συστήματα ακινητοποιημένων ενζύμων χαρακτηρίζονται από: (α) μεγάλη ειδική επιφάνεια, (β) υψηλή ταχύτητα μεταφοράς μάζας, (γ) υψηλό βαθμό συγκράτησης ενζύμου και (δ) δυνατότητα ταυτόχρονης ακινητοποίησης περισσότερων από ένα ένζυμα. Κύρια μειονεκτήματα της τεχνικής είναι η μειωμένη μηχανική σταθερότητα των καψυλλίων και η μεγάλη απώλεια ενζυμικής δραστικότητας λόγω επαφής του βιοκαταλύτη με οργανικούς διαλύτες, χημικά μονομερή και λοιπά αντιδραστήρια κατά την εγκαψυλλίωση. Για τον λόγο αυτό είναι σκόπιμο να προστεθεί κατάλληλη σταθεροποιητική ουσία στο αρχικό ενζυμικό διάλυμα πριν από την έναρξη της διεργασίας (π.χ. αλβουμίνη, πολυαιθυλενο-γλυκόλη, πολυβινυλο-αλκοόλη, δεξτράνη, ή θειϊκή ηπαρίνη). Η εγκαψυλλίωση ενζύμου επιτυγχάνεται με διάφορες τεχνικές. Μια απλή τεχνική είναι του διαχωρισμού φάσεων, σύμφωνα με την οποία υδατικό διάλυμα ενζύμου αναδεύεται έντονα με μη υδατοσυμβατό οργανικό διαλύτη που περιέχει διαλυμένο πολυμερές. Το σχηματιζόμενο αιώρημα (γαλάκτωμα) αποτελείται από μικροσταγόνες που περιέχουν διαλυμένο ένζυμο. Ακολούθως, το γαλάκτωμα εισάγεται υπό έντονη ανάδευση σε διαφορετικό, κατάλληλο, μη υδατοσυμβατό οργανικό διαλύτη, όπου το πολυμερές είναι αδιάλυτο. Αποτέλεσμα είναι το τελευταίο να συγκεντρωθεί γύρω από τις μικροσταγόνες του ενζυμικού διαλύματος, σχηματίζοντας μικροκαψύλλια ημιπερατής μεμβράνης. Περίπτωση εγκαψυλλιώσεως είναι και αυτή που προβλέπει το ένζυμο ελεύθερο στο εσωτερικό ηιπερατών μεμβρανών, π.χ. κοίλων ινών. Προφανώς, η μεμβράνη οφείλει να έχει οπές τέτοιου μεγέθους, ώστε να είναι διαπερατή από μικρομοριακές ουσίες, όχι όμως και από τον βιοκαταλύτη. 29

30 3. Υλικά και μέθοδοι 3.1 Celluclast 1.5 L FG Το Celluclast 1.5 L FG είναι ένα προϊόν που χορηγήθηκε από την εταιρεία Novozymes. Πρόκειται για υγρό παρασκεύασμα κυτταρινάσης (50 mg/ml) με χρώμα καφέ-κίτρινο (το χρώμα μπορεί να ποικίλει από παρτίδα σε παρτίδα και δεν αποτελεί ένδειξη ενζυμικής δραστικότητας), που παράγεται από ζύμωση σε υδατικό περιβάλλον επιλεγμένου είδους μύκητα που ανήκει στο είδος Trichoderma reesei. Το ένζυμο καταλύει τη διάσπαση της κυτταρίνης σε γλυκόζη, κελλοβιόζη και σε άλλα ολιγομερή γλυκόζης. Η ποσότητα των προϊόντων που παράγονται εξαρτάται από τις συνθήκες της αντίδρασης. Το Celluclast μειώνει το ιξώδες των διαλυτών κυτταρινικών υποστρωμάτων. Η δραστικότητά του είναι: Celluclast 1.5 L = 700 EGU/g, EGU= Μονάδες ενδογλυκανάσης. Τα ενεργά συστατικά του Celluclast 1.5 L είναι διαλυτά στο νερό. Το θόλωμα που μπορεί να εμφανίζεται στα ενζυμικά παρασκευάσματα δεν επιδρά στην ογομετρική δραστικότητα ή στη διαχείριση των χαρακτηριστικών του προϊόντος. Το Celluclast 1.5 L μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιαδήποτε διεργασία διάσπασης της κυτταρίνης σε σάκχαρα, τα οποία στη συνέχεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διεργασίες ζύμωσης, ή τη μείωση του ιξώδους, ή την αύξηση του βαθμού εκχύλισης των προϊόντων φυσικής προέλευσης. Η διατήρηση και συντήρησή του προτείνεται σε κλειστούς, σκοτεινούς και ξηρούς χώρους, (θερμοκρασίες 0 ο C 25 0 C). Αν φυλαχτεί σωστά μπορεί να χρησιμοποιηθεί, χωρίς προβλήματα, για περίοδο μέχρι 18 μηνών. Ειδάλλως, χάνεται μέρος της δραστικότητάς του και απαιτούνται μεγαλύτερες ποσότητες κατά τη χρήση του. 30

31 3.2 Novozym 188 Το Novozym 188 είναι ένα προϊόν που χορηγήθηκε από την εταιρεία Novozymes. Πρόκειται για ένα ενζυμικό παρασκεύασμα κελλοβιάσης (50 mg/ml) που παράγεται από ζύμωση, σε υδατικό περιβάλλον, μύκητα που ανήκει στο είδος Aspergillus niger. Επειδή η κελλοβιόζη (παράγεται από τη διάσπαση της κυτταρίνης με τη βοήθεια του Celluclast 1.5 L) δεν είναι σάκχαρο το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διεργασίες ζύμωσης, χρησιμοποιείται το Novozym 188 (κελλοβιάση), το οποίο υδρολύει την κελλοβιόζη σε γλυκόζη. Η μέγιστη απόδοση επιτυγχάνεται με το συνδυασμό Novozym 188 με Celluclast ή Cellubrix L. Το Novozym 188 είναι καφέ, υγρό παρασκεύασμα. Η δραστικότητά του είναι: Novozym 188 = 250 CbU/g. Η διατήρηση και συντήρησή του προτείνεται σε κλειστούς, σκοτεινούς και ξηρούς χώρους, (θερμοκρασία = 5 ο C). Αν φυλαχτεί σωστά μπορεί να χρησιμοποιηθεί, χωρίς προβλήματα, για περίοδο μέχρι 12 μηνών. Ειδάλλως, χάνεται μέρος της δραστικότητάς του και απαιτούνται μεγαλύτερες ποσότητες κατά τη χρήση του. 3.3 Αντιδραστήρες Διαλείποντος Έργου Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε συστοιχία πέντε θερμοστατούμενων αντιδραστήρων διαλείποντος έργου πλήρους αναμείξεως. Ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου (batch reactor) χρησιμοποιείται συχνά στη βιομηχανία. Αρχικά γίνεται εισαγωγή των αντιδρώντων και στη συνέχεια, αφού ολοκληρωθεί η αντίδραση, το μείγμα μεταφέρεται και υποβάλλεται σε περαιτέρω επεξεργασία. Οι αντιδραστήρες διαλείποντος έργου χρησιμοποιούνται για την παραγωγή μικρών (σχετικά) ποσοτήτων προϊόντων. Επίσης, χρησιμοποιούνται για την δοκιμή νέων διεργασιών που βρίσκονται σε πειραματικό στάδιο. Τα μειονεκτήματα αυτού του αντιδραστήρα είναι το υψηλό κόστος λειτουργίας και η μικρή κλίμακα παραγωγής. 31

32 Σχήμα Αντιδραστήρας διαλείποντος έργου 3.4 Υπόστρωμα Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε χαρτοπετσέτα, χαρτί Α 4, ανακυκλωμένο χαρτί, χαρτί κουζίνας και χαρτόκουτο. Για τις ζυγίσεις του χαρτιού χρησιμοποιήθηκε ζυγός ακριβείας TYP /L της Precisa Instruments AG. 3.5 Μέτρηση παραγωγής γλυκόζης Για δοκιμές σε βιομηχανικά υποστρώματα συνιστάται η ακόλουθη δοσολογία (% w/w βασισμένη στην αναλογία κυτταρίνης): Celluclast 1.5 L: 1% Novozym 188: 0.2% Cellubrix L: 1% Η δοσολογία εξαρτάται από συνθήκες όπως το ph, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση υποστρώματος. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της γλυκόζης μπορεί να γίνει είτε με χημικές μεθόδους (πχ. δινιτροσαλυκιλικό αντιδραστήριο), ή με ενζυμικές. Οι ενζυμικές υπερτερούν λόγω μεγάλης εξειδίκευσης και ταχύτητας. Στην προκειμένη περίπτωση προτιμήθηκε ο ενζυμικός προσδιορισμός με συνδυασμένη δράση της οξειδάσης της γλυκόζης με μια υπεροξειδάση. Η οξειδάση καταλύει την οξείδωση της D-γλυκόζης από το οξυγόνο σε D-γλυκονικό οξύ, με ταυτόχρονη παραγωγή H 2 O 2. Στη συνέχεια το H 2 O 2 ανάγεται παρουσία της υπεροξειδάσης. Μετριέται η οπτική απορρόφηση της έγχρωμης παραγόμενης ουσίας στα 500nm και γίνεται σύγκριση με την απορρόφηση ενός πρότυπου διαλύματος, υπολογίζοντας τη συγκέντρωση της παραγόμενης D-γλυκόζης. 32

33 Για τον ενζυμικό προσδιορισμό της γλυκόζης χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο Glucose oxidase/peroxidase της εταιρείας Biosystems reagents and instruments (κωδικός 11504) με σύσταση: phosphate 70 mmol/l, phenol 5 mmol/l, glucose oxidase>10 U/mL, peroxidase>1u/ml, 4-aminoantipyrine 0.4mmol/L, ph=7.5 και ένα πρότυπο διάλυμα γλυκόζης 1 mg/ml. Για τη φωτομέτρηση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε φωτόμετρο της Pharmacia LKB-Novaspec II. 3.6 Διασύνδεση Celluclast και Novozym 188 με καρβοδιιμίδιο (EDAC) - Παρασκευή διαλύματος καρβοδιιμιδίου (EDAC M r =191.7) 63.9*10-2 % w/v, C=0.33M. Διάλυση 32 mg καρβοδιιμιδιου σε 5 ml HCl ph=4.5 (διάλυμα EDAC) - Διασύνδεση Celluclast με EDAC C 1 (αναλογία mol Celluclast/ mol EDAC 1/0) = 500 μl Celluclast + 0 μl EDAC μl HCl ph=4.5 C 2 (1/1): 500 μl Celluclast + 15 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 C 3 (1/2): 500 μl Celluclast + 30 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 C 4 (1/5): 500 μl Celluclast + 75 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 C 5 (1/10): 500 μl Celluclast μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 C 6 (1/25): 500 μl Celluclast μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 C 7 (1/50): 500 μl Celluclast μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 - Διασύνδεση Novozym με EDAC Ν 1 (αναλογία mol Novozym / mol EDAC 1/0): 500 μl Novozym + 0 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 Ν 2 (1/1): 500 μl Novozym + 15 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 N 3 (1/2): 500 μl Novozym + 30 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 N 4 (1/5): 500 μl Novozym + 75 μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 N 5 (1/10): 500 μl Novozym μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 N 6 (1/25): 500 μl Novozym μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 N 7 (1/50): 500 μl Novozym μl δ/μα EDAC μl HCl ph=4.5 33

34 3.7 Διασύνδεση Celluclast και Novozym 188 με γλουταραλδεϋδη ( O=CH-(CH 2 ) 3 -CH=O) - Παρασκευή διαλύματος γλουταραλδεϋδης (Δ 2 ) 0.05 % w/v, C=0.005M Αραίωση 100λ διαλύματος γλουταραλδεϋδης 50 % w/v σε mL H 2 O. - Παρασκευή διαλύματος γλυκίνης 0.15 %w/v. Διάλυμα 0.15g γλυκίνης σε 100mL H 2 O. - Διασύνδεση Celluclast με γλουταραλδεϋδη C 1 (αναλογία mol Celluclast/ mol Δ 2 1/0) = 500 μl Celluclast + 0 μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- C 2 (1/1): 500 μl Celluclast μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- C 3 (1/5): 500 μl Celluclast μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- C 4 (1/10): 500 μl Celluclast μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- C 5 (1/15): 500 μl Celluclast μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- C 6 (1/20): 500 μl Celluclast μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 - Διασύνδεση Novozym με γλουταραλδεϋδη Ν 1 (αναλογία mol Novozym / mol Δ 2 1/0): 500 μl Novozym + 0 μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- Ν 2 (1/1): 500 μl Novozym μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- N 3 (1/5): 500 μl Novozym μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- N 4 (1/10): 500 μl Novozym μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- N 5 (1/15): 500 μl Novozym μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 3- N 6 (1/20): 500 μl Novozym μl Δ μl ρ δ/μα PO 4 Μετά από 2 ώρες προστίθεται διάλυμα γλυκίνης, για να σταματήσει η δράση της γλουταραλδεϋδης (αντίστοιχη ποσότητα σε κάθε διάλυμα). n γλυκίνης > n/2 GH 34

35 3.8 Ενζυμική υδρόλυση του χαρτιού Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αντιδραστήρα υπό ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά 20 ml αραιού διαλύματος (α.δ.) HCl ph=4.5, 400 mg υποστρώματος και 20 μl ενζύμων (σε διάφορες αναλογίες) σε διάφορες θερμοκρασίες. Αρχικά το υπόστρωμα (χαρτί) τεμαχίζονταν σε μικρά κομμάτια και ζυγίζονταν η απαιτούμενη ποσότητα. Στη συνέχεια τοποθετούνταν σε καθένα από τους πέντε αντιδραστήρες μαζί με ένζυμα και buffer. Κατά τη διάρκεια της επώασης λαμβάνονταν (σε eppendorf), σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, 100λ δείγματος. Τα δείγματα τοποθετούνταν σε νερό (100 0 C) για 10 min. Επειτα αφήνονταν να ψυχθούν σε θερμοκρασία δωματίου και γινόταν φυγοκέντρηση στις rpm για 5 min. Μετά τη φυγοκέντρηση γινόταν αφαίρεση του υπερκείμενου και αραίωσή του με νερό σε πενταπλάσια ποσότητα. Στη συνέχεια, αφού λαμβάνονταν 20λ από το αραιωμένο υγρό και γινόταν πρόσθεση 2mL διαλύματος οξειδάσης της γλυκόζης/υπεροξειδάσης, ακολουθούσε ο προσδιορισμός της γλυκόζης. 3.9 Μέτρηση ενζυμικών μονάδων - Διάλυση π-νιτροφαινυλο-β-d-γλυκοπυρανοζίτη σε 2mL ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών 0.5M ph=5 (Δ 1 ). - Διάλυση 1μL Novozym 188 (ή 1μL Celluclast) σε 5 ml α.δ. HCl ph=4.5. (Αναλογία: 1μL E/5 ml α.δ. HCl). Λήψη 400 μl δ/τος και αραίωση με μέχρι 2mL με α.δ. HCl (Δ 2 ). - Τοποθέτηση των Δ 1 και Δ 2 σε υδατόλουτρο στους 37 0 C για 3 min. - Δημιουργία τυφλού δ/τος με ανάμιξη 200μL από το Δ 1, 200μL H 2 O και 1600μL NaOH 0.1N. - Ανάμιξη των Δ 1 και Δ 2 και επώαση στους 37 0 C. - Λήψη δείγματος 400μL σε 3 min και εισαγωγή του σε 1600μL NaOH 0.1N. - Φωτομέτρηση στα 405nm, αφού έχουμε μηδενίσει με το τυφλό. 35

36 Για τον υπολογισμό των ενζυμικών μονάδων χρησιμοποιήθηκε πρότυπη καμπύλη παρανιτροφαινόλης Προσδιορισμός πρωτεϊνης Η ποσοτική ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε με τη μέθοδο Bradford. - Σε 3 σωλήνες τοποθετήθηκαν: Σωλήνας Α: 3 ml αντιδραστήριο Bradford, 100μL δείγματος, Σωλήνας Β: 3 ml αντιδραστήριο Bradford, 100 μl BSA (50 μg/ml), Σωλήνας Γ: 3 ml αντιδραστήριο Bradford, 100 μl ρυθμιστικού δ/τος. - Επώαση για 5 min. - Φωτομέτρηση στα 595, χρησιμοποιώντας το σωλήνα Γ ως τυφλό. - Υπολογισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνης: (OD A *5 μg/100 μl)/od A. 36

37 4 Αποτελέσματα 4.1 Παραγωγή γλυκόζης από διάφορα είδη χαρτιού, με τη χρήση ελεύθερων (μη διασυνδεδεμένων) ενζύμων Celluclast και Novozym Κατά τη διάρκεια των συγκεκριμένων πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα εξής είδη χαρτιού: Α 4, χαρτοπετσέτα και ανακυκλωμένο χαρτί Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4 (χωρίς προεπεξεργασία) στους 55 0 C Στα πρώτα πειράματα επιχειρήθηκε η μέτρηση της μέγιστης παραγωγής γλυκόζης από χαρτί Α 4, παρουσία μεγάλης περίσσειας κυτταρινασών. Σε ένα αντιδραστήρα (στους 55 ο C) τοποθετήθηκαν: 400 mg χαρτί Α 4 (χωρίς επεξεργασία), 20 ml αραιού διαλύματος (α.δ.) HCl ph= 4.5, 5 mm K 2 EDTA, 1 ml Celluclast (50 mg) και 0.5 ml Novozym (25 mg). Στη συνέχεια μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση σε 24h, 48h και 6*24h και έπειτα υπολογίστηκε η ποσότητα της παραγόμενης γλυκόζης στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 4.1. Πίνακας 4.1 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από χαρτί Α 4 24h 48h 6*24h mg 58,5 12,6 19,0 Παρατηρείται μια αυξομείωση στην ποσότητα της παραγόμενης γλυκόζης, η οποία θεωρήθηκε ότι οφειλόταν σε λάθος κατά τη διάρκεια εκτέλεσης της πειραματικής διαδικασίας. Ανεξάρτητα από αυτό, αλλά και για να επιβεβαιωθεί το κατά πόσο ήταν λανθασμένα ή όχι τα πρώτα αποτελέσματα, το στερεό υπόλειμμα από το παραπάνω πείραμα ελήφθη με φυγοκέντρηση και χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για τα ένζυμα (με τις παραπάνω ποσότητες). Στη 37

38 συνέχεια, το νέο υπόλειμμα ελήφθη ξανά με φυγοκέντρηση και έγινε επανάληψη της ίδιας πειραματικής διαδικασίας (ίδιες ποσότητες). Τα αποτελέσματα φαίνονται στους παρακάτω πίνακες 4.2 και 4.3. Η μέτρηση της ποσότητας της παραγόμενης γλυκόζης (mg), έγινε τόσο κατ ευθείαν στα δείγματα, όσο και έπειτα από αραίωση (1/5) για βέλτιστη ακρίβεια των αποτελεσμάτων. Πίνακας 4.2 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από το πρώτο υπόλειμμα 24h 48h mg 10,9 13,2 Πίνακας 4.3 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από το δεύτερο υπόλειμμα 24h 48h mg 11,1 10,5 Δεδομένου ότι η παραχθείσα ποσότητα γλυκόζης συνολικά υπήρξε πάρα πολύ μικρή, αφού το αρχικό χαρτί ήταν 400mg, θεωρήθηκε ότι πιθανόν κάποια πρόσθετα σ αυτό να παρεμποδίζουν είτε τη δράση των κυτταρινασών είτε τη διαδικασία του προσδιορισμού της γλυκόζης. Πλην όμως, όπως φαίνεται στον πίνακα 4.1, μετρήθηκε σημαντική ποσότητα απελευθερωθείσας γλυκόζης στις πρώτες 24h, η οποία στη συνέχεια μειωνόταν. Με αυτό το δεδομένο, θεωρήθηκε σκόπιμη η επανάληψη του πειράματος (το πρώτο στάδιο, δεν υπήρξε παραλαβή και επεξεργασία στερεών υπολειμμάτων) άλλη μία φορά, με τις ίδιες ποσότητες, στις ίδιες συνθήκες, αλλά τώρα οι μετρήσεις έγιναν σε 0h, 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 2,5h, 3h και 3,5h. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα

39 Πίνακας 4.4 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από χαρτί Α 4 σε αρχικούς χρόνους επεξεργασίας χρόνος mg 0h 12,3 0,5h 41,9 1h 46,8 1,5h 53,3 2h 45,5 2,5h 68,6 3h 75,9 3,5h 61,9 Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι σε γενικές γραμμές υπάρχει βαθμιδωτή αύξηση της παραγόμενης γλυκόζης τουλάχιστον τις 3 πρώτες ώρες, πράγμα που δείχνει ότι απελευθερώνεται στο αρχικό στάδιο γλυκόζη, η οποία μετράται κανονικά. Ως εκ τούτου, το πείραμα επαναλήφθηκε για τρίτη φορά με τις ίδιες ποσότητες, στις ίδιες συνθήκες, αλλά τώρα οι μετρήσεις έγιναν σε 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h και 11h, ώστε να διευκρινιστεί το αποτέλεσμα του πίνακα 4.1. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 4.5. Πίνακας 4.5 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από χαρτί Α 4 σε αρχικούς χρόνους επεξεργασίας χρόνος mg 2h 83,9 3h 74,4 4h 99,0 5h 76,9 6h 79,4 7h 87,5 8h 84,0 9h 81,4 10h 69,7 11h 51,7 39

40 Όπως φαίνεται στον πίνακα 4.5, η γλυκόζη απελευθερώνεται ταχύτατα από το χαρτί με τη δράση των κυτταρινασών εντός των δυο πρώτων ωρών και η ποσότητά της παραμένει σχετικά σταθερή τις επόμενες 6-7 ώρες. Στη συνέχεια εμφανίζεται μείωση της συγκέντρωσής της στο διάλυμα, ενδεικτικό ότι πράγματι κάποιο συστατικό του χαρτιού παρεμποδόζει, είτε τη διαλυτοποίησή της, είτε τον προσδιορισμό της. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι απαιτείται κάποια προεπεξεργασία του χαρτιού, ούτως ώστε να απομακρυνθεί το συστατικό αυτό. Αυτό δεν ήταν προτιμητέο, δεδομένου ότι οποιαδήποτε πρόσθετη επεξεργασία ανεβάζει το κόστος της διεργασίας αν πρόκειται να περάσει σε βιομηχανική κλίμακα, όμως θεωρήθηκε απαραίτητο να μελετηθεί, ώστε να μπορεί να γίνει η οποιαδήποτε σύγκριση μεταξύ των διαφόρων ειδών χαρτιού στη διαλυτοποίησή τους από τις κυτταρινάσες Παραγωγή γλυκόζης από χαρτί Α 4 (με προεπεξεργασία) στους 55 ο C και στους 45 ο C Επειδή φάνηκε πως η παραγωγή γλυκόζης βελτιστοποιείται εφόσον το δείγμα χαρτιού έχει υποστεί αρχικά προεπεξεργασία, από εδώ και πέρα όλα τα δείγματα χαρτιού θα υπόκεινται σε προεπεξεργασία. Αφού δοκιμάστηκε η δράση αρκετών ενώσεων, καταλήξαμε πως η καταλληλότερη επεξεργασία γίνεται χρησιμοποιώντας διάλυμα 0,1Μ H 3 PO 4. Το δείγμα χαρτιού τοποθετείται σε ένα δοχείο με 0,1Μ H 3 PO 4 και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 24h. Στη συνέχεια στο δείγμα γίνονται 3 πλύσεις με Η 2 Ο και μετά τοποθετείται στον αντιδραστήρα Α. Αρχικά διερευνήθηκε η μέγιστη παραγωγή γλυκόζης με ποσότητες ενζύμων 1 ml Celluclast και 0,5 ml Novozym. Σε ένα αντιδραστήρα (στους 55 ο C) τοποθετήθηκαν 400mg χαρτί Α 4 προεπεξεργασμένο με 0,1Μ H 3 PO 4, σε θερμοκρασία δωματίου για 24h (μετά την προεπεξεργασία έγιναν 3 πλύσεις με Η 2 Ο), 20 ml α.δ. HCl ph= 4.5, 5 mm K 2 EDTA, 1 ml Celluclast και 0,5 ml Novozym. 40

41 Πίνακας 4.6 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από επεξεργασμένο χαρτί Α 4 χρόνος mg 24h 194,1 72h 134,6 120h 159,6 Έγινε επανάληψη του πειράματος για να μετρηθεί η παραγόμενη γλυκόζη σε στενότερα χρονικά διαστήματα και να διερευνηθεί μήπως το πρόβλημα της μη σωστής μέτρησης της γλυκόζης παραμένει και μετά την επεξεργασία. Πίνακας 4.7 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από επεξεργασμένο χαρτί Α 4 χρόνος mg 7h 154,5 16h 156,0 20h 153,0 26h 208,2 42h 181,6 64h 194,0 136h 186,3 160h 271,0 184h 218,6 209h 291,6 Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η μέγιστη διαλυτοποιήσιμη ποσότητα γλυκόζης από το χαρτί Α 4 φτάνει μέχρι τα 291mg. Εντούτοις, επειδή το συγκεκριμένο τμήμα της μελέτης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση περίσσειας κυτταρινασών, που είναι ασύμφορη για βιομηχανική εφαρμογή, στη συνέχεια μελετήθηκε η παραγωγή γλυκόζης από προεπεξεργασμένο χαρτί με τη συμβατική συγκέντρωση των ενζύμων και σε δυο διαφορετικές θερμοκρασίες. 41

42 Σε ένα αντιδραστήρα (στους 55 ο C) τοποθετήθηκαν 400mg χαρτί Α 4 προεπεξεργασμένο με 0,1Μ H 3 PO 4, σε θερμοκρασία δωματίου για 24h, και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν στον αντιδραστήρα μαζί με 20mL α.δ. HCl, ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Στη συνέχεια μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση σε 24h, 48h, 72h, 96h και 120h. Έπειτα υπολογίστηκε η ποσότητα της παραγόμενης γλυκόζης στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 4.8. Πίνακας 4.8 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης (55 ο C) από επεξεργασμένο χαρτί Α 4 χρόνος mg απόδοση (%) 24h 50, h 68, h 71, h 86, h 86,2 29 Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η παραγωγή γλυκόζης γίνεται μέχρι την πάροδο 96h, όπου και δείχνει να σταθεροποιείται. Στη συνέχεια ερευνήθηκε και η περίπτωση παραγωγής γλυκόζης στους 45 ο C. Σε ένα αντιδραστήρα (στους 45 ο C) τοποθετήθηκαν 400mg χαρτί Α 4 προεπεξεργασμένο με 0,1Μ H 3 PO 4, 20mL α.δ. HCl ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 4.9. Πίνακας 4.9 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης (45 ο C) από επεξεργασμένο χαρτί Α 4 χρόνος mg απόδοση (%) 24h 79, h 149, h 189,5 65 Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η παραγωγή γλυκόζης γίνεται ευκολότερα στους 45 ο C και η απόδοσή της ανέρχεται σε επίπεδα άνω του 65%, σε σχέση με την ποσότητα που απελευθερώνεται με τη χρήση μεγάλης περίσσειας ενζύμων. 42

43 160 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από επεξεργασμένο χαρτί Α 4 παραγόμενη γλυκόζη (mg ) C 45C χρόνος (h) Παραγωγή γλυκόζης από ανακυκλωμένο χαρτί στους 55 ο C και στους 45 ο C Στη συνέχεια δοκιμάστηκε η παραγωγή γλυκόζης από ανακυκλωμένο χαρτί, σε δυο διαφορετικές θερμοκρασίες. Αρχικά, σε ένα αντιδραστήρα (στους 55 ο C) τοποθετήθηκαν 400 mg ανακυκλωμένο χαρτί, προεπεξεργασμένο με 0,1Μ H 3 PO 4 σε θερμοκρασία δωματίου για 24h, 20mL α.δ. HCl ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα Πίνακας 4.10 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης (55 ο C) από ανακυκλωμένο χαρτί χρόνος mg 24h 26 48h 25,5 72h 33,8 96h 51,3 43

44 Έπειτα, σε δεύτερο αντιδραστήρα (στους 45 ο C) τοποθετήθηκαν 400 mg ανακυκλωμένο χαρτί, προεπεξεργασμένο με 0,1Μ H 3 PO 4 σε θερμοκρασία δωματίου για 24h, 20mL α.δ. HCl ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα Πίνακας 4.11 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης (45 ο C) από ανακυκλωμένο χαρτί χρόνος mg 24h 16,2 48h 30,4 120h 33,5 Όπως φαίνεται από τους πίνακες 4.10 και 4.11, η ποσότητα της γλυκόζης που παράγεται από ανακυκλωμένο χαρτί δεν είναι ικανοποιητική. Γι αυτό δε δόθηκε συνέχεια στα πειράματα με ανακυκλωμένο χαρτί. Παρόλα αυτά θεωρείται σκόπιμο να αναφερθεί ότι η διαλυτοποίηση του ανακυκλωμένου χαρτιού γίνεται καλύτερα στους 55 0 C. παραγόμενη γλυκόζη (mg ) Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης από ανακυκλωμένο χαρτί χρόνος (h) 55C 45C 44

45 4.1.4 Παραγωγή γλυκόζης από χαρτοπετσέτα στους 55 ο C και στους 45 ο C Τέλος, δοκιμάστηκε η παραγωγή γλυκόζης σε χαρτοπετσέτα στις δυο θερμοκρασίες όπως και στα προηγούμενα πειράματα. Η χαρτοπετσέτα είχε δοκιμαστεί σε παλαιότερα πειράματα για την παραγωγή γλυκόζης έπειτα από επεξεργασία με κυτταρινάσες (Γ. Φίλος, Διδακτορική Διατριβή), αλλά είχε χρησιμοποιηθεί ως έχει, χωρίς να υποστεί καμία επεξεργασία. Ως εκ τούτου, θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί, στην παρούσα εργασία, προεπεξεργασμένη, για συγκριτικούς λόγους. Σε έναν αντιδραστήρα (55 ο C) τοποθετήθηκαν 400 mg χαρτοπετσέτα προεπεξεργασμένη με H 3 PO 4 0.1M σε θερμοκρασία δωματίου για 24h, 20mL HCl ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Οι μετρήσεις έγιναν σε 24h, 48h, 72h, 96h και 120h. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα Πίνακες 4.12 Ποσότητα παραγόμενης γλυκόζης (55 ο C) από χαρτοπετσέτα χρόνος mg απόδοση (%) 24h 95, h 106, h 126, h 157, h 157,9 54 Και εδώ, όπως και στην περίπτωση του χαρτιού Α 4, παρατηρείται η μέγιστη παραγωγή γλυκόζης μετά την πάροδο 96h, όπου και σταθεροποιείται. Αντίστοιχα και εδώ, ερευνήθηκε και η περίπτωση παραγωγής γλυκόζης στους 45 ο C. Σε ένα αντιδραστήρα (στους 45 ο C) τοποθετήθηκαν 400mg χαρτοπετσέτα προεπεξεργασμένη με 0,1Μ H 3 PO 4, 20mL α.δ. HCl ph=4.5, 5 mm K 2 EDTA, 16λ Celluclast και 4λ Novozym. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα