ΛΕΥΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙA ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΣΗ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ. Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς. Καθηγητής Βιοχηµείας.

Transcript

1 ΛΕΥΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙA ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΣΗ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς Καθηγητής Βιοχηµείας Τµήµα Βιολογίας Αθήνα 1/2010 Περιεχόµενα 1. Ένζυµα και βιοτεχνολογία 2. Γενικές ιδιότητες ενζύµων 3. Τα ένζυµα είναι πρωτείνες που παράγονται από ζώντα κύτταρα 4. Η χρήση ενζύµων στη βιοµηχανία και στην καθηµερινή ζωή 5. Πλεονεκτήµατα χρήσης αποµονωµένων ενζύµων 6. Ποιά ένζυµα χρησιµοποιούνται σε βιοµηχανικό επίπεδο; 7. Κοινωνική αποδοχή και εµπορική αξία ενζύµων 8. Πλεονεκτήµατα της χρήσης βιοµηχανικών ενζύµων 9. Μοριακή γενετική και πρωτεϊνική µηχανική ενζύµων 10. Tροποποίηση βελτίωση ενζύµων 10.1 Γενική επισκόπηση της δηµιουργίας νέων µορφών ενζύµων µε συγκεκριµένες ιδιότητες µε τη πειραµατική διαδικασία µετάθεσης γονιδίων (gene shuffling) 10.2 Κατευθυνόµενη εξέλιξη 11. Τεχνολογία µαζικής παραγωγής ενζύµων 12. Xρήση των µικροοργανισµών σαν πηγή για την αποµόνωση και παραγωγή ενζύµων 13. Βιοµηχανικές ζυµώσεις και ενζυµική παραγωγή 14. Ακινητοποιηµένα ένζυµα σε ουδέτερα υποστρώµατα και η χρήση τους στην βιοκατάλυση 15. Μέθοδοι ακινητοποίησης ένζυµων σε ουδέτερα υποστρώµατα 16. Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα των ακινητοποιηµένων ενζύµων 17. Παραδείγµατα χρήσης ακινητοποιηµένων ενζύµων 18. Bιοαντιδραστήρες και ενζυµική τεχνολογία 19. Σύντοµη περιγραφή της δράσης διαφόρων ενζύµων που έχουν βιοµηχανική εφαρµογή 19.1 Εφαρµογές των ενζύµων στη βιοµηχανία τροφίµων Επεξεργασία αµύλου Αρτοποιία Ζυθοποιία Φρουτοχυµοί Οινοποιία Βιοµηχανία λιπών και ελαίων Γαλακτοκοµία Συνθετικά γλυκαντικά 19.2 Εφαρµογές των ενζύµων στη βιοµηχανία προϊόντων µεγάλης κλίµακας Βιολογικά απορρυπαντικά πλυντηρίων Υφαντουργία Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 1

2 Χαρτοποιία Ζωοτροφές Παραγωγή αλκοόλης Βιοµηχανία δερµάτων Βιοµηχανία καλλυντικών 19.3 Εφαρµογές των ενζύµων στη χηµική βιοµηχανία Παραγωγή ακρυλαµιδίου Παραγωγή νικοτιναµιδίου Παραγωγή χρωστικών Παραγωγή οπτικώς καθαρών αµινοξέων Παραγωγή φυτοφαρµάκων 19.4 Εφαρµογές των ενζύµων στη φαρµακευτική βιοµηχανία Παραγωγή αντιβιοτικών Παραγωγή αντιϊικών φαρµάκων Παραγωγή αντι-υπερχοληστερολαιµικών φαρµάκων 19.5 Εφαρµογές των ενζύµων στην ιατρική Θεραπευτική αντικατάσταση ενζύµων Τα ένζυµα ως θεραπευτικά εργαλεία 20. Τεχνητά ένζυµα 21. Kαταλυτικά αντισώµατα 22. Χρήση µη φυσικών υποστρωµάτων 23. Παραγωγή ενζύµων πρός πώληση 24. Γενικά περί βιοαισθητήρων 25. Ενζυµικοί αναλυτές και ενζυµικά ηλεκτρόδια 26. Tα γενικά χαρακτηριστικά ενός βιοαισθητήρα 27. Βασικά τεχνικά χαρακτηριστικά ενός βιοαισθητήρα 28. Ακινητοποιηµένα ένζυµα. Αρχή λειτουργία των βιοαισθητήρων 29. Θερµιδοµετρικοί βιοαισθητήρες 30. Αµπεροµετρικοί ενζυµικοί βιοαισθητήρες 31. Ποτενσιοµετρικοί ενζυµικοί βιοαισθητήρες 32. Οπτικοί ενζυµικοί βιοαισθητήρες 33. Πιεζοηλεκτρικοί βιοαισθητήρες 34. Ανοσο-βιοαισθητήρες 35. Το µέλλον της ενζυµικής τεχνολογίας 36. Συµπεράσµατα Οι παγκόσµιες ανάγκες απαιτούν καινοτοµία Τα ένζυµα µπορούν να κάνουν την διαφορά Τα ένζυµα βρίσκονται σε όλους τους ζώντες οργανισµούς Τα ένζυµα διατηρούν τα δάση ζωντανά Τα ένζυµα αντιγράφουν την φύση για να βοηθήσουν την βιοµηχανία 37. H Βιοτεχνολογία και η επίδραση της στις οικονοµικές και βιοµηχανικές παραµέτρους 38. Βιβλιογραφία Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 2

3 1. Ένζυµα και βιοτεχνολογία Τα ένζυµα είναι κυρίως πρωτεϊνικά µόρια που παράγονται στα κύτταρα και δρουν σαν καταλύτες µε σκοπό να επιταχύνουν της βιοχηµικές αντιδράσεις που είναι απαραίτητες για την κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασµό αλλά και πληθώρα βιολογικών λειτουργιών. Είναι ευνόητο οτι δεν θα υπήρχε ζωή χωρίς τα ένζυµα. Η ραγδαία ανάπτυξη των βιοεπιστηµών και πιo συγκεκριµένα η Βιοχηµεία συνεπικουρούµενη από τη δοµική βιολογία και άλλες ειδικότητες βοήθησαν σηµαντικά στην πληρέστερη κατανόητη της δοµής και της λειτουργίας ενός µεγάλου αριθµού ενζύµων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντας. Παρά το γεγονός οτι τα ένζυµα παράγονται απο κύτταρα, είναι πλέον εφικτό να αποµονωθούν απο αυτά και να λειτουργήσουν in vitro από το δοκιµαστικό σωλήνα στο εργαστήριο µέχρι τον βιοαντιδραστήρα στη βιοµηχανική παραγωγή. Η µοναδική αυτή ιδιότητα των ενζύµων να λειτουργούν και να επιταχύνουν διάφορες χηµικές αντιδράσεις, έξω από το περιβάλλον του κυττάρου, είχε καταλυτική επίδραση στην εντυπωσιακή ανάπτυξη ενος νέου βιοµηχανικού κλάδου που λέγεται ενζυµική τεχνολογία ή βιοκατάλυση που είναι η καρδιά του κλάδου της Λευκής Βιοτεχνολογίας. Η ενζυµική τεχνολογία λοιπόν είναι ο ακρογωνιαίος λίθος της νέας τεχνολογίας που βασίζεται στις διεργασίες της ζωής και λέγεται Bιοτεχνολογία. Ο Πίνακας 1 δίνει ενδεικτικά στοιχεία της παγκόσµιας παραγωγής διαφόρων ενζύµων βιοµηχανικού ενδιαφέροντος. Είναι βέβαιο ότι ο αριθµός και η ποσότητα των βιοµηχανικά παραγόµενων ενζύµων αυξάνεται εκθετικά. Ένζυµο Τόνοι καθαρού ενζύµου Πρωτεάση απο Bacillus 550 Αµυλογλυκοσιδάση 350 Αµυλάση από Bacillus 350 Ισοµεράση της γλυκόζης 60 Μικροβιακή πυτία 25 Μυκητιακή αµυλάση 20 Πηκτινάση 20 Μυκητιακή πρωτεάση 15 Πίνακας 1 Ετήσια παγκόσµια παραγωγή ενδεικτικών ενζύµων ιδιαίτερου βιοµηχανικού ενδιαφέροντος. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 3

4 2. Γενικές ιδιότητες ενζύµων Η ενεργότητα ενος ενζύµου οφείλεται στην καταλυτική του φύση. Ένα ένζυµο δρα σε µια χηµική αντίδραση µειώνοντας την ενέργεια ενεργοποίησης της αντίδρασης, χωρίς να συµµετέχει σε αυτή, αυξάνοντας δραµατικά την ταχυτητά της. Τα ένζυµα εµφανίζουν πολύ µεγάλη εξειδίκευση και δρουν σε ένα συγκεκριµένο συστατικό που ονοµάζεται υπόστρωµα (substrate). Ελάχιστα ποσά ενζύµου είναι ικανά να καταλύσουν µεγάλα ποσά υποστρώµατος. Η καταλυτική δράση ενος ενζύµου δεν οφείλεται µόνο στην πρωτοταγή µοριακή του δοµή αλλά και και στη σωστή του διαµόρφωση στο χώρο ή δίπλωµα (folding). Η σωστή στερεοδοµή ενός ενζύµου είναι αυτή που εξασφαλίζει την καταλυτική του εξειδίκευση και λειτουργία. Μεταβολές της στερεοδοµής των ενζύµων µε διάφορους παράγοντες όπως π.χ. ακραίες αλλαγές του ph ή της θερµοκρασίας ή αποδιατακτικοί παράγοντες, µπορούν να µειώσουν σηµαντικά ή και να καταστρέψουν την ενεργότητά τους. Ένας µεγάλος αριθµός ενζύµων χρειάζεται την ύπαρξη παραγόντων που ονοµάζονται συνένζυµα και είναι συµπαράγοντες (cofactors) οι οποίοι µπορεί να είναι µέταλλα, νουκλεοτίδια ή άλλα µικρά µόρια. Η εξειδίκευση των ενζύµων µπορεί να είναι τόσο µεγάλη ώστε να µπορούν να διακρίνουν υποστρώµατα που είναι δοµικά πολύ όµοια όπως π.χ. τα οπτικώς ισοµερή (D-, L-). Τα ένζυµα συνήθως δρούν σε ήπιες συνθήκες οξύτητας, αλατότητας και θερµοκρασίας, αλλά υπάρχουν και ένζυµα που µπορούν να δράσουν και σε ακραίες συνθήκες οξύτητας (ph 2-4, 10-12), θερµοκρασία 0-15 και C) αλλά και αλατότητας (µέχρι 4Μ NaCl). Η ενζυµική ενεργότητα ποικίλει σηµαντικά και ανάλογα µε την πηγή των ενζύµων. Για παράδειγµα, η ενζυµική ενεργότητα του ενζύµου αµυλάση ποικίλει ανάλογα µε το είδος των φύτρων απο όπου αποµονώνεται. Η καταλυτική ενεργότητα των ενζύµων διαφέρει από αυτή των κοινών καταλυτών στα παρακάτω σηµεία: Τα ένζυµα είναι πολύ αποτελεσµατικά µε αριθµό ανακύκλωσης (turnover number) συνήθως πολύ µεγαλύτερο από αυτόν των ανόργανων καταλυτών. Ιδιαίτερα όταν έχουµε ενζυµικές αντιδράσεις που λαµβάνουν χώρα σε περιοχές θερµοκρασιών µεταξύ 25 και 37 0 C. Ο αριθµός ανακύκλωσης είναι ο αριθµός µορίων υποστρώµατος που αλληλεπιδρούν µε το ενεργό κέντρο, ανά ενεργό κέντρο στη µονάδα του χρόνου (sec). Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 4

5 Οι ενζυµικές αντιδράσεις συνήθως λαµβάνουν χώρα σε περιοχές ph κοντά στο ουδέτερο. Σε αντίθεση οι ανόργανοι καταλύτες δρούν θεωρητικά και πρακτικά σε όλο σxεδόν το φάσµα ph. Οι ενζυµικές αντιδράσεις είναι πολύ ειδικές ως προς τη φύση της χηµικής αντίδρασης που καταλύουν και το υπόστρωµα που καταναλώνουν. Για παράδειγµα, υπάρχουν δύο αφυδρογονάσες της λακτόζης που καταλύουν τη µετατροπή είτε της D- είτε της L- ισοµορφής της λακτόζης σε πυροσταφυλικό. Το επίπεδο των ενζύµων υπόκεινται σε κυτταρικό έλεγχο, όπως π.χ. γονιδιακή ρύθµιση. Διάφοροι κυτταρικοί µηχανισµοί µπορούν να επηρεάσουν το ρυθµό παραγωγής ενός ενζύµου και τη τελική ενδοκυτταρική του τοπολογία και συγκεντρωσή. Χρησιµοποιώντας τεχνικές γενετικής µηχανικής είναι δυνατόν να παραχθούν µεταλλαγµένα βακτήρια, τα οποία είναι ικανά να συνθέσουν ένζυµα σε µεγάλες ποσότητες από απλά υποστρώµατα. Η παρουσία ενός συγκεκριµένου υποστρώµατος µπορεί να επάγει είτε την έκφραση του γονιδίου για την υπερπαραγωγή ενός δεδοµένου ενζύµου ή την µετατροπή ενός ενζύµου από την ανενεργό στην ενεργό του µορφή. Οι βοχηµικές και βιολογικές ιδιότητες των ενζύµων αποτελούν αντικείµενο της Βιοχηµείας και δεν θα αναπτυχθούν στο παρόν εγχειρίδιο. Για λόγους υπενθύµισης και µόνο, ο Πίνακας 2 αναφέρει τους κυριώτερους τύπους ενζύµων. Αριθµός κύριου τύπου Τύπος Αντίδραση που καταλύει 1 Οξειδοαναγωγάσες Οξειδοαναγωγή 2 Μεταφοράσες Μεταφορά οµάδων 3 Υδρολάσες Υδρόλυση 4 Λυάσες Αποµάκρυνση οµάδας αφήνοντας διπλό δεσµό, προσθήκη οµάδας σε διπλό δεσµό 5 Ισοµεράσες Ισοµερισµός 6 Λιγάσες (συνθετάσες) Σύνδεση δύο µορίων µε κατανάλωση ενέργειας µέσω ATP ή αντίστοιχου µόριου ενέργειας Πίνακας 2 Οι κυριώτεροι τύποι ενζύµων Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 5

6 3. Τα ένζυµα είναι πρωτείνες που παράγονται από ζώντα κύτταρα Όπως αναφέρθηκε, τα ένζυµα παράγονται από ευκαρυωτικά ή προκαρυωτικά κύτταρα. Προς το παρόν τα περισσότερα ένζυµα βιοµηχανικού ενδιαφέροντος παράγονται από µικροοργανισµούς κυρίως βακτήρια και µύκητες. Τελευταία, τα ζωϊκά κύτταρα χρησιµοποιούνται επίσης σε µεσαία κλίµακα παραγωγής πρωτεϊνών. Μερικοί από τους πλέον χαρακτηριστικούς µικροοργανισµούς βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος αναφέρονται στον Πίνακα 3. Μικροοργανισµός Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus coagulans Streptomyces olivaceus Microbacterium arborescens Actinoplanes missouriensis Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis Aspergillus niger Aspergillus niger Mucor miehei Mucor pusillus Endothica parasitica Aspergillus niger Bacillus subtilis Ένζυµο α-αµυλάση α-αµυλάση Ξυλοζο(γλυκοζο)-ισοµεράση Ξυλοζο(γλυκοζο)-ισοµεράση Ξυλοζο(γλυκοζο)-ισοµεράση Ξυλοζο(γλυκοζο)-ισοµεράση Αλκαλική πρωτεάση (εξωκυττ.) Αλκαλική πρωτεάση (εξωκυττ.) Ουδέτερη πρωτεάση (εξωκυττ.) Ουδέτερη πρωτεάση (εξωκυττ.) Γλυκοαµυλάση (εξωκυττ.) Όξινη πρωτεάση (εξωκυττ.) Όξινη πρωτεάση (εξωκυττ.) Όξινη πρωτεάση (εξωκυττ.) Όξινη πρωτεάση (εξωκυττ.) Πηκτινάση, β-γλουκανάση, κυτταρινάσες (εξωκυττ.) Πηκτινάση, β-γλουκανάση, κυτταρινάσες (εξωκυττ.) Πίνακας 3 Βακτήρια και µύκητες και τα ένζυµα που παράγουν ένζυµα βιοµηχανικού ενδιαφέροντος 4. Η χρήση ενζύµων στη βιοµηχανία και στην καθηµερινή ζωή Πάνω από 4 δεκάδες αιώνες διαδικασίες όπως ζυµώσεις για την παραγωγή µπύρας, κρασιού, τυριών και ψωµιού βασίζονται στην αθέλητη και καθαρά εµπειρική χρήση των ενζύµων. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 6

7 Στα δύο επικά ποιήµατα του Οµήρου, Οδύσσεια και Ιλιάδα που χρονολογούνται γύρω στο 700 Π.X. αναφέρεται η χρήση ενός κάτι που εµείς τώρα το γνωρίζουµε σαν ένζυµο το οποίο συµµετέχει στην παραγωγή τυριών. Πολλές λοιπόν παραδοσιακές τεχνολογίες βασίζονται σε ενζυµικές αντιδράσεις και ενζυµικές διεργασίες πολύ πριν διαλευκανθεί επιστηµονικά η έννοια του ενζύµου. Στον δυτικό κόσµο, η βιοµηχανία έδωσε ιδιαίτερη προσοχή στα ένζυµα που παράγονται από ζύµη και βύνη λόγω της αυξηµένης χρήσης τους στην αρτοποιία και ζυθοποιία. Τα βασικά και αρχικά βήµατα της Βιοχηµείας είχαν εστιαστεί στις µυκητιακές ζυµώσεις και την επεξεργασία του αµύλου για τη µετατροπή του σε ζάχαρη. Στον ανατολικό κόσµο οι αντίστοιχες βιοµηχανίες ήταν αυστηρά εστιασµένες στην αύξηση της παραγωγής τροφών και οι περισσότερες ζυµώσεις για την παραγωγή τροφών χρησιµοποιούσαν νηµατώδεις µύκητες σαν πηγή ενζύµων. Το 1896 άρχισε στη Δύση η πραγµατική µοντέρνα µικροβιακή ενζυµική τεχνολογία µε την πρώτη εµπορευµατοποίηση του ενζύµου τακαδιαστάση, το οποίο ήταν ένα µίγµα υδρολυτικών ενζύµων που παρασκευάζοταν από καλλιέργεια Aspergillus oruzae σε καλαµποκάλευρο και είχε ευρή φάσµα εφαρµογών. Η µέθοδος παραγωγής της τακαδιαστάσης δεν διέφερε πολύ από τον τρόπο που παρασκεύαζαν το ένζυµο αυτό εδώ και δεκάδες αιώνες στην Ασία. Είναι ένα σαφές παράδειγµα µεταφοράς τεχνολογίας από την Ανατολή στη Δύση. Στην Ευρώπη το δέρµα ήταν πάντα ένα σηµαντικό εµπορεύσιµο βιολογικό παράγωγο. Αρχικά οι διεργασίες επεξεργασίας του απαιτούσαν την χρήση κοπράνων από σκύλους και χοίρους. Με την αλλαγή του αιώνα ένας διάσηµος Γερµανός χηµικός, ο Otto Roehm διαπίστωσε ότι τα ενεργά συστατικά των κοπράνων των σκύλων ήταν πρωτεάσες δηλαδή ένζυµα που αποικοδοµούν πρωτείνες. Κατάφερε να δείξει ότι εκχυλίσµατα από εντόσθια ζώων που παράγουν παρόµοια ένζυµα µπορούσαν κάλλιστα να αντικαταστήσουν τη χρήση των κοπράνων απο σκύλους. Μετά τη θεαµατική αυτή αλλαγή στη βιοµηχανία δερµάτων άρχισε η ευρεία χρήση ενζυµικών εκχυλισµάτων από χοιρινό και βοδινό πάγκρεας και έτσι η κατεργασία δερµάτων έλαβε πιο κοινωνικά αποδεκτό χαρακτήρα. Μέχρι τα µέσα της δεκαετίας του 50, επήλθε ραγδαία ανάπτυξη στην ενζυµική τεχνολογία και ιδιαίτερα στην τεχνολογία παραγωγής µικροβιακών ενζύµων. Οι λόγοι ήταν πολλοί και ποικίλοι, αλλά σχετίζονται κυρίως µε τα ακόλουθα γεγονότα. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 7

8 Η σηµαντική ανάπτυξη των υγρών καλλιεργειών µικροοργανισµών που κυρίως συνδέθηκε µε τον δεύτερο παγκόσµιο πόλεµο. Η ανάγκη µεγάλων ποσοτήτων πενικιλλίνης σε µικρό χρονικό διάστηµα ώθησε τη χρήση καλλιεγειών µεγάλου όγκου για την παραγωγή µικροοργανισµών και στη συνέχεια ενζύµων. Η βασική γνώση της φύσης και των ιδιοτήτων των ενζύµων γρήγορα εξελίχθηκε και εµπλουτίστηκε µε αποτέλεσµα την έγκαιρη συνειδητοποίηση της ευρείας χρησιµότητας των ενζύµων ως βιοµηχανικών καταλυτών. Τα περισσότερα ένζυµα βιοµηχανικής σηµασίας µπορούσαν να παραχθούν από λίγους µικροοργανισµούς. Η περαιτέρω χρήση των ενζύµων σαν προσθετικά-βελτιωτικά στόχευε κυρίως στη βελτίωση των ήδη υπαρχουσών παραδοσιακών διεργασιών παρά στην ανάπτυξη νέων προοπτικών εφαρµογής. Ακόµη και σήµερα το µεγαλυτερο ποσοστό ενζύµων που παράγονται έχει σχέση µε την υδρόλυση των γλυκοζιδικών δεσµών των υδατανθράκων, όπως άµυλο και πηκτίνη (γλυκοζιδάσες) καθώς και των πεπτιδικών δεσµών των πρωτεινών (πρωτεάσες). 5. Πλεονεκτήµατα χρήσης αποµονωµένων ενζύµων Η χρήση αποµονωµένων ενζύµων παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τις κλασσικές χηµικές διαδικασίες. Στις διεργασίες ζύµωσης όµως η χρήση µικροβιακών κυττάρων ως καταλυτών µπορεί να έχει µια σειρά περιορισµών όπως: Ένα µεγάλο ποσό του υποστρώµατος µπορεί να µετατραπεί σε βιοµάζα Μπορεί να λάβουν χώρα ανεπιθύµητες παράλληλες αντιδράσεις Οι συνθήκες ανάπτυξης του οργανισµού µπορεί να µην συµπίπτουν µε τις συνθήκες παραγωγής του προϊόντος Ο διαχωρισµός και καθαρισµός του προιόντος στόχου από το µίγµα της ζύµωσης µπορεί να είναι ιδιαίτερα δύσκολος. Οι περισσότεροι περιορισµοί που αναφέρθηκαν παραπάνω, αν όχι όλοι, µπορούν να ξεπεραστούν µε τη χρήση ενζύµων ακινητοποιηµένων σε ουδέτερα υλικά. Στο µέλλον προβλέπεται η αντικατάσταση πολλών παραδοσιακών ζυµώσεων µε πολύπλοκα πολυενζυµικά συστήµατα τα οποία θα βρίσκονται ακινητοποιηµένα σε βιοαντιδραστήρες και θα µπορούν να µετασχηµατίζουν ενζυµικά το υπόστρωµά τους και να παράγουν προϊόν, ποιοτικά και οικονοµικά βελτιωµένο, µε µεγαλύτερη απόδοση και βελτιωµένη οµοιογένεια. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 8

9 Στις ηµέρες µας, όχι µόνο ενισχύονται οι ήδη υπάρχουσες εφαρµογές των ενζύµων, αλλά και διευρύνονται οι δυνατότητες χρήσης περισσοτέρων ενζύµων υψηλής καθαρότητας για τις βιοµηχανικές διαδικασίες για την κλινική ιατρική και την εργαστηριακή διαγνωστική. Ο αριθµός των εµπορικά διαθέσιµων ενζύµων υψηλής καθαρότητας, παρόλο που είναι ήδη ιδιαίτερα σηµαντικός αυξάνεται συνεχώς. Η χρήση ενζύµων υψηλής καθαρότητας σχετίζεται σηµαντικά µε το κόστος, το οποίο µπορεί να ανέρχεται σε εκατοντάδες δολλάρια ανά γραµµάριο. Σε αντίθεση, τα ενζυµικά παρασκευάσµατα χαµηλής καθαρότητας που µπορεί να έχουν λιγότερο από 1% κατά βάρος ενεργό υλικό, µπορεί να κοστίζουν µερικά µόνο δολλάρια το κιλό. Σε πολλές διεργασίες όπως η διαύγαση του κρασιού και των χυµών φρούτων, η ψυχρή διόρθωση της αιθανόλης της µπύρας και η βελτίωση του άρτου, η χρήση ενζύµων µη υψηλής καθαρότητας επηρεάζει ελάχιστα το κόστος παραγωγής. 6. Ποιά ένζυµα χρησιµοποιούνται σε βιοµηχανικό επίπεδο; Τα περισσότερα από τα ένζυµα που χρησιµοποιούνται σε βιοµηχανικό επίπεδο είναι κατά κανόνα εξωκυτταρικά. Τα ένζυµα αυτά εκκρίνονται απο τους µικροοργανισµούς που τα παράγουν και δρούν στο υπόστρωµα σε εξωκυτταρικό περιβάλλον. Είναι ένζυµα που δρουν µε τρόπο ανάλογο µε αυτόν των ενζύµων πέψης του ανθρώπου και των ζώων. Έτσι λοιπόν όταν οι µικροοργανισµοί παράγουν ένζυµα για τη διάσπαση µεγάλων ποσοτήτων εξωκυτταρικών µορίων µε ένα ανάλογο τρόπο, τα ένζυµα αυτά συνήθως εκκρίνονται στο υλικό ζύµωσης. Με τον τρόπο αυτό το υλικό ζύµωσης µε την καλλιέργεια ορισµένων οργανισµών, π.χ. βακτηρίων ή ζυµών, γίνεται σηµαντική πηγή υδρολασών, όπως αµυλάσες και σε µικρότερα ποσά κυτταρινάσες, λιπάσες κλπ. Τα βιοµηχανικά ένζυµα είναι κυρίως υδρολάσες και έχουν τη δυνατότητα: Να δρουν χωρίς πολύπλοκους συµπαράγοντες. Είναι ευδιάλυτα. Να διαχωρίζονται εύκολα από τα κύτταρα που τα παράγουν διότι είναι εξωκυτταρικά. Να έχουν σηµαντικά υψηλή ειδική ενεργότητα. Παρόλαυτα αυτά µερικά ενδοκυτταρικά ένζυµα παράγονται σήµερα σε βιοµηχανική κλίµακα όπως: Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 9

10 Η οξειδάσης γλυκόζης που χρησιµοποιείται στη διατήρηση των τροφών. Η ασπαραγινάση που χρησιµοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου. Η ακυλάση της πενικιλλίνης που χρησιµοποιείται για τη µετατροπή του αντιβιοτικού πενικιλλίνη. Επειδή ο αριθµός των εξωκυτταρικών ενζύµων είναι περιορισµένος και έχει σε µεγάλο βαθµό µελετηθεί, αναµένεται σηµαντική ανάπτυξη στο πεδίο των ενδοκυτταρικών ενζύµων διότι όχι µόνο έχουν παραβλευθεί αλλά και υπερέχουν αριθµητικά. 7. Κοινωνική αποδοχή και εµπορική αξία ενζύµων Οι πωλήσεις των βιοµηχανικών ενζύµων ήταν σχετικά χαµηλές µέχρι το 1965 οπότε άρχισε η χρησιµοποίηση ενζύµων σε ευρεία κλίµακα στα απορρυπαντικά. Από το 1966 µέχρι το 1969 εµφανίστηκε µια µαζική αύξηση της χρήσης των ενζύµων σε απορρυπαντικά η οποία όµως µειώθηκε δραµατικά το 1969 και Η δραµατική αυτή πτώση οφειλόταν στην εµφάνιση αλλεργικών συµπτωµάτων στους εργαζόµενους που παρασκεύαζαν τα ένζυµα αυτά σε βιοµηχανικό επίπεδο. Ακολούθησε τέτοια υστερική αντίδραση στα µέσα µαζικής ενηµέρωσης ώστε σχεδόν όλα τα ένζυµα αποσύρθηκαν από τα απορρυπαντικά. Παρόλα αυτά, µετά τη θέσπιση αυστηρών προδιαγραφών και τη λήψη καταλλήλων προφυλάξεων στις βιοµηχανικές µονάδες παραγωγής ενζύµων καθώς και µε τη χρήση της τεχνολογίας εγκλωβισµού των ενζύµων πριν φτάσουν στον καταναλωτή, µειώθηκαν σηµαντικά µέχρι σχεδόν εξαλείφθηκαν τέτοιοι κίνδυνοι. Προσεκτικές περιβαλλοντολογικές µελέτες έδειξαν ότι δεν υπάρχουν περιβαλλοντολογικοί κίνδυνοι, ούτε άλλοι κίνδυνοι, για την οικιακή χρήση. Μετά από αυτή την κρίση, η χρήση των ενζύµων στα απορρυπαντικά αυξήθηκε κατακόρυφα, έφτασε στα προηγούµενα επίπεδα και έκτοτε συνεχώς αυξάνεται. Στη Δυτική Ευρώπη η χρήση ζεστού νερού ( C) στο πλύσιµο των ρούχων θεωρείται απόλυτα αναγκαία. Στις ΗΠΑ και στον Καναδά η παραδεκτή και ευρέως χρησιµοποιούµενη θερµοκρασία ήταν 55 0 C. Αντίθετα στην Ιαπωνία, τα ρούχα πλένονται µε κρύο νερό και για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Εκδηλώνεται λοιπόν το σηµαντικά αυξανόµενο ενδιαφέρον για ένζυµα δραστικά σε χαµηλές θερµοκρασίες νερού, δηλαδή θερµοκρασία περιβάλλοντος, µειώνοντας έτσι την κατανάλωση ενέργειας για το καθηµερινό πλύσιµο των ρούχων. Ενώ οι πρωτεάσες είχαν την πρωτεύουσα θέση στη χρησιµοποίηση τους στα απορρυπαντικά, τα τελευταία χρόνια έχει εκδηλωθεί αυξανόµενο ενδιαφέρον για Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 10

11 τις αµυλάσες και τις λιπάσες ώστε να χρησιµοποιηθούν σε απορρυπαντικά για την ενζυµική αποµάκρυνση λιπών, πρωτεϊνών και αµύλου από τα ρούχα. Πολύ πρόσφατα οι κυτταρινάσες εισήλθαν επίσης στην αγορά των απορρυπαντικών διότι διαφοροποιούνται από τα άλλα ένζυµα. Σε αντίθεση µε τις πρωτεάσες και τις λιπάσες που αποικοδοµούν και αποµακρύνουν διάφορες χρωστικές κλπ οι κυτταρινάσες δρούν πάνω στην ίνα του υφάσµατος. Στα καινούργια υφάσµατα οι ίνες είναι λείες και το ύφασµα εµφανίζει µια απαλότητα. Με τη χρήση και µε τα διαδοχικά πλυσίµατα οι ίνες αυτές σπάνε, προσδίδοντας έτσι στο ύφασµα µια λιγώτερο απαλή αφή και δηµιουργούν χνούδι. Οι κυτταρινάσες λοιπόν µπορούν να δράσουν στο σηµείο αυτό και να αποικοδοµήσουν τα µέρη των ινών που εξέχουν και µειώνουν την απαλότητα. Ως αποτέλεσµα της δράσης των κυτταρινασών κατά την πλύση των υφασµάτων επιτυγχάνεται εκτός από τον καθαρισµό τους, και βελτίωση της απαλότητάς τους. Στη βιοµηχανία του αµύλου, οι α-αµυλάσες και οι αµυλογλυκοσιδάσες έχουν πλήρως αντικαταστήσει τα οξέα στην παραγωγή δεξτρόζης. Την τελευταία δεκαετία οι τιµές των ενζύµων έχουν πέσει σε πραγµατικούς αριθµούς. Για παράδειγµα τα ένζυµα που χρησιµοποιούνται σήµερα σε µεγάλες ποσότητες στη βιοµηχανία τροφίµων είναι φτηνώτερα κατά 20-35% σε σύγκριση µε τις τιµές στα µέσα της δεκαετίας του 70. Χάρις στην ανάπτυξη διαφόρων µεθόδων καθαρισµού επιτυγχάνεται η παραγωγή ενζύµων µε υψηλότερη καθαρότητα, ειδικότητα και ενεργότητα και έτσι είναι απαραίτητη η χρήση τους µόνο σε µικρές ποσότητες. Συνεπώς η βιοµηχανική παραγωγή έχει εστιαστεί στο πεδίο αυτό µε ιδιαίτερη έµφαση. Οι τρέχουσες πωλήσεις βιοµηχανικών ενζύµων στις ΗΠΑ βρίσκονται γύρω στα 2-3 δισεκατοµµύρια δολλάρια/έτος, σύµφωνα µε τα στατιστικά δεδοµένα του Υπουργείου εµπορίου των ΗΠΑ. Με οικονοµοτεχνικούς όρους το 80% των πωλήσεων των βιοµηχανικών ενζύµων συγκεντρώνεται σε τρείς κύριες αγορές: Στη βιοµηχανία επεξεργασίας αµύλου (11%) Απορρυπαντικών (37%) Επεξεργασία υφασµάτων (13%) Υπόλοιπες (19%) Ακόµη µαζικότερη εφαρµογή των ενζύµων στη βιοµηχανία σαν καταλύτες θα επιτευχθεί εάν οι τιµές των ενζύµων συνεχίσουν την πτωτική τους τάση. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 11

12 Η τεχνολογία ανασυνδιασµού του DNA, οι σηµαντικά βελτιωµένες µέθοδοι ζυµώσεων και η παραγωγή βιοµάζας µε σκοπό την παραγωγή ενζύµων σε συνδιασµό µε την υψηλή τεχνολογία που εφαρµόζεται σήµερα στην παρασκευή και στον καθαρισµό των ενζύµων είχαν σαν αποτέλεσµα τη µείωση των εµπορικών τους τιµών. Ετσι η βιοµηχανική παραγωγή που βασίζεται στην ενζυµική τεχνολογία να βρίσκεται σε πλεονεκτική θέση έναντι της συµβατικής χηµικής βιοµηχανίας. Παρά το γεγονός ότι πολλά ειδικά ένζυµα χρησιµοποιούνται µε αυξανόµενους ρυθµούς στην κλινική διαγνωστική, το ποσό των ενζύµων που απαιτούνται για την κάλυψη των αναγκών της αγοράς αυτής είναι πολύ µικρό. Η σηµαντική ανάπτυξη µικροαναλυτών και η χρήση αυτοµάτων διαδικασιών µε την εφαρµογή ακινητοποιηµένων ενζύµων προσδίδει στα ένζυµα αυτά ρόλο ανάλογο µε αυτό των µικροολοκληρωµένων κυκλωµάτων των υπολογιστών. Έτσι λοιπόν ενώ τα ένζυµα θα είναι αναγκαίο να παραχθούν η αγορά θα χρειάζεται µόνο µικρές ποσότητες. Οι ποσότητες όµως αυτές θα µπορούν να έχουν αρκετά καλή προστιθέµενη αξία. Το πεδίο λοιπόν είναι ελέυθερο για πολλές µικρές βιοτεχνολογικές εταιρείες άκρως εξειδικευµένες µε προϊόντα υψηλής προστιθέµενης αξίας. 8. Πλεονεκτήµατα της χρήσης βιοµηχανικών ενζύµων Η χρήση ενζύµων σε βιοµηχανικό επίπεδο παρουσιάζει βασικά πλεονεκτήµατα όπως: Υψηλή ποιότητα προιόντων Χαµηλά ποσά παραπροϊόντων Απλούστερη διαδικασία καθαρισµού του τελικού προιόντος Μη τοξικότητα του ένζύµου Βιοανακύκλωση των ενζύµων µε σηµαντικά περιβαλλοντολογικά πλεονεκτήµατα Εύκολη και φτηνή παραγωγή ενζύµων σε µεγάλες ποσότητες απο µικροοργανισµούς Σηµαντική µείωση µέχρι εξάλειψη της ανάγκης για χηµική επεξεργασία που απαιτεί ειδικά ανθεκτικά υλικά, άρα οικολογική και φιλική προς το περιβάλλον τεχνολογία. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 12

13 Η ενζυµική τεχνολογία θέτει ορισµένες προϋποθέσεις πριν εδραιωθεί η χρήση ενός νέου ενζύµου. Πριν λοιπόν ένα νέο ένζυµο περάσει στη φάση της παραγωγής πρέπει να προηγηθούν τα ακόλουθα στάδια: Παραγωγή ενζύµου Αποµόνωση ενζύµου Καθαρισµός ενζύµου Αποµόνωση καθαρού ενζύµου σε διαλυτή µορφή Ακινητοποίηση ενζύµου σε ουδέτερα υποστρώµατα Δυνατότητα χρήσης τους σε ποικιλία βιοαντιδραστήρων Είναι αναµφίβολο ότι η ενζυµική τεχνολογία θα δώσει εφικτές λύσεις σε πολλά από τα πλέον φλέγοντα προβλήµατα της µοντέρνας κοινωνίας, όπως στην παραγωγή ή βελτίωση τροφίµων, τη µείωση της κατανάλωσης ενέργειας και τη διατήρηση και βελτίωση του περιβάλλοντος. Η νέα αυτή τεχνολογία ξεκίνησε απο τη Βιοχηµεία και κατά την πορεία της υποστηρίχθηκε σηµαντικά απο τη µικροβιολογία, χηµεία, µοριακή βιολογία, χηµική µηχανική, βιοπληροφορική και πρωτεϊνική µηχανική. Έτσι εξελίχθηκε και αναπτύχθηκε ώστε να φτάσει στα σηµερινά υψηλά επίπεδα και να γίνει ένας σηµαντικός κλάδος της βασικής επιστήµης που συνδέθηκε άµεσα και ταχύτατα µε τη βιοµηχανική παραγωγή. Βρισκόµαστε ήδη στην πορεία σηµαντικής προσέγγισης µεταξύ δύο κλάδων, της ενζυµικής τεχνολογίας και της γενετικής µηχανικής όπως φαίνεται στο επόµενο κεφάλαιο. Συντονισµένες έρευνες απο τις δύο αυτές επιστηµονικές περιοxές έχουν ήδη επιφέρει τα πρώτα θεαµατικά αποτελέσµατα στη χρησιµοποίηση των γονιδίων και των προιόντων τους σε επίπεδα παραγωγής. 9. Μοριακή γενετική και πρωτεϊνική µηχανική ενζύµων Σήµερα, η τεχνολογία του ανασυνδιασµένου DNA µας επιτρέπει να µεταφέρουµε γονίδια ενζύµων που θα µπορούσαν να φανούν χρήσιµα από έναν οργανισµό σε άλλο. Έτσι λοιπόν όταν εντοπίσουµε ένα ένζυµο που παρουσιάζει βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον µπορούµε να αποµονώσουµε το γονίδιο του να το κλωνοποιήσουµε στον κατάλληλο γονιδιακό φορέα και να τον εισαγάγουµε στον κατάλληλο µικροοργανισµό ώστε να εκφραστεί και να παραχθεί το ένζυµο που µας ενδιαφέρει. Ο µικροοργανισµός αυτός πρέπει να είναι κατάλληλος για βιοτεχνολογική παραγωγή δηλαδή να παρουσιάζει τη βέλτιστη συµπεριφορά και Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 13

14 την µεγαλύτερη δυνατή απόδοση στους ζυµωτήρες παραγωγής. Με τον τρόπο αυτό έχουµε τη δυνατότητα να παράγουµε ένζυµα βιοµηχανικού ενδιαφέροντος υψηλής ποιότητας και καθαρότητας. Ανάπτυξη του οργανισµού που παράγει το ένζυµο που µας ενδιαφέρει. Καθαρισµός του ενζύµου Αποµόνωση του mrna Προσδιορισµός µερικής αµινοξικής ακολουθίας της πρωτείνης. mrna σε DNA Σχεδιασµός συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων σαν ανιχνευτές Κλωνοποίηση του DNA σε βακτήριο E. coli (βιβλιοθήκη cdna) Ταυτοποίηση cdna κλώνων µε υβριδισµό µε τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια Μετασχηµατισµός οργανισµών δεκτών που χρησιµοποιούνται από τη βιοµηχανία Βιοµηχανική παραγωγή του ενζύµου Εικόνα 1 Στρατηγική που χρησιµοποιείται για την αποµόνωση κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων. Ένα πρόσφατο παράδειγµα αυτής της τεχνολογικής προσέγγισης είναι ένα ένζυµο που χρησιµοποιείται στα απορρυπαντικά σαν καθαριστικό και ονοµάζεται λιπολάση. Το ένζυµο αυτό παράγεται από τη Δανέζικη πολυεθνική Βιοτεχνολογική εταιρεία Novo Nordisk A/S και χρησιµοποιείται για την αποµάκρυνση λιπαρών χρωστικών από τα υφάσµατα. Το ένζυµο λοιπόν αυτό ταυτοποιήθηκε και αποµονώθηκε από τον µύκητα Humicola languinosa σε ποσότητες που δεν ενέπνεαν εµπορικό ενδιαφέρον. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 14

15 Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτείνη αυτή αποµονώθηκε από τον οργανισµό αυτό και µεταφέρθηκε µέσω του κατάλληλου πλασµιδίου στο µύκητα Aspergillus oruzea όπου και επιτεύχθηκε η έκφραση του γονιδίου και η παραγωγή της πρωτείνης σε εµπορικά επίπεδα. Το ένζυµο αυτό, άν και ανασυνδιασµένο, έχει διατηρήσει πλήρως τις ιδιότητές του και αποδείχτηκε ιδιαίτερα αποτελεσµατικό σε πολλές συνθήκες πλύσης ρούχων. Το ένζυµο λιπολάση είναι επίσης πολύ σταθερό σε µεγάλο φάσµα θερµοκρασιών και ph, συνθήκες που έχουν άµεση σχέση µε το πλύσιµο. Περαιτέρω το ένζυµο λιπολάση είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στην πρωτεολυτική δράση πρωτεασών που συνήθως χρησιµοποιούνται στα απορρυπαντικά πλύσεως και συνεπώς ακόµη πιο κατάλληλο. 10. Tροποποίηση βελτίωση ενζύµων Η τροποποίηση των ενζύµων µε σκοπό να µεταβληθούν ή να βελτιωθούν οι καταλυτικές τους ιδιότητες βρίσκεται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος σε πολλά εργαστήρια τα τελευταία χρόνια. Στο παρελθόν το κύριο και ίσως µοναδικό εργαλείο για να επιτευχθεί ο σκοπός αυτός ήταν η τυχαία µεταλλαξιγέννεση. Τα τελευταία χρόνια η νέα τεχνολογία έφερε σηµαντικές αλλαγές στο πεδίο αυτό. Υπάρχουν λοιπόν σοβαροί αντικειµενικοί λόγοι για την παρασκευή τροποποιηµένων ενζύµων χρησιµοποιώντας την τεχνολογία του ανασυνδιασµένου DNA. Οι στόχοι του σχεδιασµού και παρασκευής µετασχηµατισµένων ενζύµων είναι οι παρακάτω: Αύξηση της ενεργότητας των ενζύµων Βελτίωση της σταθερότητας Δυνατότητα δράσης των ενζύµων σε διαφορετικά περιβάλλοντα Αλλαγή του βελτίστου ph και θερµοκρασίας Αλλαγή της εξειδίκευσης του ενζύµου έτσι ώστε να µπορεί να καταλύσει διαφορετικέ αντιδράσεις Αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης Επιφανειακή τροποποίηση των ενζύµων για τη µείωση της ανοσοδιέγερσης χορηγούµενα σε ασθενείς Ενκαψυλλίωση σε λιποσώµατα µε επιφανειακές οµάδες που στοχεύουν υποδοχείς συγκεκριµένου οργάνου Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 15

16 Μεγάλη ενεργότητα και χαµηλό ρυθµός ανακύκλωσης ή υδρόλυσης από ενδογενείς πρωτεάσες. Η πρωτεϊνική µηχανική ή «µοριακή χειρουργική» χρησιµοποιείται για να τροποποιεί τη δράση των ενζυµικών µορίων. Η πρωτεϊνική µηχανική περιλαµβάνει κατ αρχήν την πειραµατική παραγωγή του µοντέλλου του ενζύµου που µας ενδιαφέρει και τη γραφική του παρουσίαση στο χώρο των τριών διαστάσεων. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µόνα εάν διαθέτουµε σηµαντικές ποσότητες πολύ καθαρού ενζύµου, το έχουµε κρυσταλλώσει και έχουµε προσδιορίσει τη δοµή του από κρυσταλλογραφικά δεδοµένα µε ακτίνες Χ, ή σε διάλυµα µε τη χρήση πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR). Στρατηγικά σχεδιασµένες µεταβολές στη δοµή του ενζύµου και βέβαια οι αντίστοιχες αλλαγές στην αλληλουχία του γονιδίου που το εκφράζει µπορούν να έχουν πολλές φορές, αλλά όχι πάντα, τα επιθυµητά αποτελέσµατα στις ιδιότητες του ενζύµου που σχετίζονται µε τη σταθερότητά του, το βέλτιστο ph, την ειδική του ενεργότητα, την εξειδίκευσή του κλπ. Για να επιτύχει κάποιος τις επιθυµητές αλλαγές στο χώρο των ενζύµων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος µπορεί να ακολουθήσει τους παρακάτω δρόµους. 1. Ό ένας δρόµος είναι η αποµόνωση του γονιδίου που κωδικοποιεί το ένζυµο που µας ενδιαφέρει, ο προσδιορισµός της δοµής του µε τη χρήση δοµικών µεθόδων και ο σχεδιασµός µεταλλαγών που πιθανώς θα οδηγήσουν στο επιθυµητό ή αναµενόµενο αποτέλεσµα. Αυτό βέβαια θα είναι δυνατόν να διερευνηθεί µε την προϋπόθεση ότι το ένζυµο και οι διαφορετικές µορφές του είναι δυνατόν να εκφραστούν σε µικροοργανισµούς ή ακόµη και σε ευκαρυωτικούς οργανισµούς και να παραχθούν σε σηµαντικές ποσότητες για βιοχηµική, βιοφυσική και ενζυµική ανάλυση. 2. Ό άλλος δρόµος είναι η χηµική τροποποίηση του ενζύµου. Δεν είναι τίποτε άλλο παρά η χρήση διαφόρων χηµικών αντιδράσεων που εισάγουν χηµικές µεταβολές στο ένζυµο το οποίο είναι ήδη αποµονωµένο σε σχετικά υψηλή καθαρότητα και µπορεί να υποστεί διάφορες χηµικές κατεργασίες µε το επιθυµητό για το σκοπό που θέλουµε αποτέλεσµα. 3. Γονιδιακή µετάθεση όπως αναλύεται στο κεφάλαιο Κατευθυνόµενη εξέλιξη όπως αναλύεται στο κεφάλαιο Ένα πρόσφατο παράδειγµα πρωτεϊνικής µηχανικής είναι η φωσφολιπάση Α2. Το ένζυµο τροποποιήθηκε δοµικά έτσι ώστε να είναι πιο ανθεκτικό σε υψηλές Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 16

17 συγκεντρώσεις οξέων. Τώρα χρησιµοποιείται σε µεγάλη έκταση σαν γαλακτοµατοποιητής ή χυλοποιητής τροφών. Πρόσφατα η γνώση των ενζυµικών µηχανισµών σε συνδιασµό µε την κατανόηση της δοµής των ενζύµων στο µοριακό και ακόµη στο ατοµικό επίπεδο, έχει ανοίξει καινούργιες προοπτικές στο επιστηµονικό πεδίο που λέγεται πρωτεινική µηχανική. Είναι προφανές ότι η γενετική µηχανική και η πρωτεινική µηχανική θα δώσουν σηµαντική ώθηση σε πολλές περιοχές του πεδίου της βιοµηχανικής ενζυµικής τεχνολογίας. Η γενετική µηχανική θα εξασφαλίσει µεγαλύτερη οικονοµία στην παραγωγή των ενζύµων µε τη χρησιµοποίηση σπανίων και εξωτικών οργανισµών καθώς και ταχύτερη ανάπτυξη των προγραµµάτων παραγωγής. Τέλος οι πρώτες ενδείξεις από πληθώρα πειραµάτων όσον αφορά τη δυνητική επιβάρυνση του περιβάλλοντος απο ανασυνδιασµένα ένζυµα είναι ήδη πολύ ενθαρρυντικές αφού είναι αρνητικές όσον αφορά την τοξικότητα των ανασυνδιασµένων ενζύµων Γενική επισκόπηση της δηµιουργίας νέων µορφών ενζύµων µε συγκεκριµένες ιδιότητες µε τη πειραµατική διαδικασία µετάθεσης γονιδίων (gene shuffling) Στο κεφάλαιο αυτό θα γίνει συνοπτική ανάπτυξη των διαδικασιών που εφαρµόζονται για την δηµιουργία ενζυµικών ενεργοτήτων µε ζητούµενες ιδιότητες για µια συγκεκριµένη ενζυµική εφαρµογή. Οι νέες αυτές ιδιότητες σχετίζονται κυρίως µε τις ενζυµικές παραµέτρους και την προσαρµογή τους στο σχήµα µιας παραγωγικής διαδικασίας Συνοπτικά: 1. Τα στοχοθετηµένα γονίδια για ένα συγκεκριµένο γνώρισµα λαµβάνονται από διάφορους οργανισµούς που πιθανόν να ζουν σε περιβάλλοντα που είναι κοντά στις ζητούµενεσ συνθήκες, όπως π.χ. θερµοκρασία, ph, αλατότητα κλπ. Αυτά τα γονίδια, A, B, C µπορούν να έχουν την ίδια λειτουργία, αλλά οι ακολουθίες DNA τους έχουν µερικές διαφορές που πιθανόν να συνάδουν µε την διαφορετικότητά τους στις συνθήκες που λειτουργούν. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 17

18 2. Στο δοκιµαστικό σωλήνα τα τρία αυτά γονίδια τεµαχίζονται είτε ενζυµικά είτε µηχανικά. 3. Τα γονίδια (ή τµήµατα αυτών) θερµαίνονται, αναγκάζοντας τις συµπληρωµατικές αλυσίδες των γονιδίων (ή τµηµάτων αυτών) να χωρίσουν. 4. Μειώνοντας τη θερµοκρασία τα τµήµατα των γονιδίων ανασυνδιάζονται και δηµιουργούν νέα γονίδια µε τους νέους συνδυασµούς των αρχικών ακολουθιών γονιδίων. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι να υπάρχει επαρκής οµολογία στην ακολουθία των γονιδίων για να έχει και νόηµα ο ανασυνδιασµός. 5. Τα επανασυνδυασµένα γονίδια (ή τµηµάτων αυτών) γεµίζουν ενζυµικά (π.χ. µέσω pcr) για να δηµιουργήσουν τα ολόκληρα γονίδια (ή τµήµατα αυτών). Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 18

19 6. Οι νέες µορφές των γονιδίων εκφράζονται και παράγουν διαφορετικές µορφές των πρωτεϊνών. Kάθε γονίδιο παράγει µια πρωτεΐνη που ποικίλλει σε σχέση µε τη φυσική δοµή (άγριο τύπο) σε ένα λεπτό σηµείο (σηµειώστε τους κύκλους). Αυτές οι λεπτές παραλλαγές δοµής, πιθανόν να βελτιώσουν τη λειτουργία των αλλαγµένων πρωτεϊνών. 7. Κάθε πρωτεϊνική µορφή αναλύεται για την επιθυµητή λειτουργία που την καθορίζει ο ερευνητής και βέβαια οι ανάγκες τις βιοτεχνολογικής διαδικασίας. Αν και πολλές από τις νέες πρωτεΐνες δεν θα αποδειχθούν συµφέρουσες, συχνά αρκετές επιλέγονται για περαιτέρω µελέτη. Τα γονίδια που κωδικοποιούν αυτές τις πρωτεΐνες «µεταθέτονται» πάλι, και η διαδικασία επαναλαµβάνετε αρκετές φορές µέχρι να επιτευχθεί το επιθυµητό αποτέλεσµα. Η διαδικασία αυτή έχει ένα µεγάλο πλεονέκτηµα εάν η ανάλυση της επιθυµητής ενζυµικής ενεργότητας είναι εύκολη και µπορεί να γίνει µαζικά. Ο αριθµός των διαφόρων µορφών των πρωτεϊνών είναι της τάξης πολλών εκατοντάδων, οπότε πολύπλοκες και χρονοβόρες ενζυµικές δοκιµασίες ανάλυσης δεν ευνοούν τη χρήση της προσέγγισης αυτής. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 19

20 10. 2 Κατευθυνόµενη εξέλιξη Τα σηµερινά ένζυµα είναι το προϊόν της βιολογικής εξέλιξης που έχει διαρκέσει (και διαρκεί) πολλά δισεκατοµµύρια ετών. Εντούτοις, δεδοµένου ότι τα ένζυµα προσαρµόζονται τέλεια στο φυσιολογικό ρόλο τους, η δραστηριότητα και η σταθερότητά τους είναι συχνά µακρυά από αυτά που η ενζυµική τεχνολογία χρειάζεται. Αυτό αφορά την σταθερότητα των ενζύµων στους οργανικούς διαλύτες, το ph, την αλατότητα των αντιδράσεων που παράγουν τις βιοµηχανικά σηµαντικές ενώσεις, την θερµοκρασία κ.λ.π. Η ίδια η φύση εµφανίζεται να παρέχει µια λύση για αυτό το πρόβληµα. H φυσική επιλογή παράγει έναν µεγάλο αριθµό παραλλαγών µέσω µεταλλάξεων και επιλέγει στη συνέχεια το καταλληλότερο µεταλλαγένο στέλεχος για µια συγκεκριµένη λειτουργία. Αυτή τη διαδικασία µπορούµε να τη µιµιθούµε στο δοκιµατικό σωλήνα µε τη χρησιµοποίηση των σύγχρονων µοριακών µεθόδων της βιολογίας µεταλλαγής και ανασυνδυασµού Αυτός ο συνδιασµός των µεθόδων έχει ονοµασθεί κατευθυνόµενη εξέλιξη και παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάπτυξη βιοκαταλυτών µε νέες ιδιότητες χωρίς απαραίτητη προϋπόθεση της γνώσης της ενζυµικής δοµής ή του καταλυτικού µηχανισµού. Η διαδικασία αυτή έχει ένα µεγάλο πλεονέκτηµα εάν η ανάλυση της επιθυµητής ενζυµικής ενεργότητας είναι εύκολη και µπορεί να γίνει µαζικά. Ο αριθµός των διαφόρων µορφών των πρωτεϊνών είναι της τάξης πολλών χιλιάδων, οπότε πολύπλοκες και χρονοβόρες ενζυµικές διαδικασίες δεν ευνοούν τη χρήση της προσέγγισης αυτής. Η παρακάτω εικόνα 2 παρουσιάζει διαγραµµατικά τα στάδια ενός κύκλου κατευθυνόµενης εξέλιξης. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 20

21 Εικόνα 2 Διαγραµµατική παρουσίαση των βασικών σταδίων ενός κύκλου κατευθυνόµενης εξέλιξης. Η διαδικασία αυτή έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα επιτυχής σε δεκάδες ένζυµα βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. 11. Τεχνολογία µαζικής παραγωγής ενζύµων Μολονότι ένας µεγάλος αριθµός ενζύµων που χρησιµοποιούνται στην ενζυµική τεχνολογία προέρχεται από φυτικές ή ζωικές πηγές, είναι εύλογο ότι η µελλοντική ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας θα βασισθεί σχεδόν αποκλειστικά στα ένζυµα µικροβιακής προέλευσης. Ήδη κατά τη διαδικασία παραγωγής βύνης στη ζυθοποιεία, όπου η αµυλάση αποκτάται µε χαµηλό κόστος από φύτρα καλαµποκιού, θα επιτευχθεί σταδιακή αντικατάσταση της αµυλάσης αυτής µε αµυλάσες που προέρχονται από µικροοργανισµούς. Στο παρακάτω κεφάλαιο θα γίνει ανάπτυξη της τεχνολογίας που χρησιµοποιεί µικροοργανισµούς για την παραγωγή ενζύµων. Οι µικροοργανισµοί λοιπόν είναι ιδανικά κυτταρικά εργοστάσια για παραγωγή ενζύµων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 21

22 12. Xρήση των µικροοργανισµών σαν πηγή για την αποµόνωση και παραγωγή ενζύµων Η χρήση των µικροοργανισµών σαν πηγή για την παραγωγή ενζύµων έχει αναπτυχθεί για πολλούς και σοβαρούς λόγους, µερικοί απο τους οποίους αναφέρονται παρακάτω. 1. Συνήθως η ειδική ενεργότητα των ενζύµων µικροβιακής προέλευσης είναι πολύ υψηλή ανά µονάδα υγρού βάρους του προιόντος. 2. Η χρήση µικροοργανισµών που αναπτύσσονται στο εργαστήριο δεν επηρεάζεται απο εποχιακές διακυµάνσεις, πολιτικές αποφάσεις ή άλλους παράγοντες που µπορούν να επιφέρουν διακυµάνσεις στην απόκτηση της πρώτης ύλης για την παραγωγή του ενζύµου. 3. Με τα ένζυµα µικροβιακής προέλευσης έχουµε τη δυνατότητα να επιλέξουµε ένζυµα από διαφόρους οργανισµούς. Έτσι έχουµε στη διαθεσή µας ένα µεγάλο φάσµα χαρακτηριστικών όπως άριστο ph ανθεκτικότητα σε υψηλή θερµοκρασία ή υψηλή αλατότητα κλπ που µπορούν να αξιοποιηθούν ανάλογα µε την επιδιωκόµενη εφαρµογή. 4. Η βιοµηχανική γενετική έχει σηµαντικά αυξήσει τις πιθανότητες βελτίωσης και τελειοποίησης της παραγωγής των ενζύµων καθώς και τις ιδιότητες αυτών µέσω της επιλογής του κατάλληλου µικροβιακού στελέχους για την εισαγωγή µεταλλαγών, την επαγωγή και την ανάπτυξη σε επιλεγµένα θρεπτικά υλικά. Νέα ένζυµα προερχόµενα από ασυνήθιστες πηγές και οργανισµούς µορούν τώρα να παραχθούν µε κλωνοποίηση των σχετικών γονιδίων και µεταφορά τους σε οργανισµούς-µοντέλλα που µπορούν εύκολα να αναπτυχθούν σε εργαστηριακές και βιοµηχανικές συνθήκες όπως ο Aspergillus oryzae, Bacillus sp κλπ. Η συστηµατοποίηση της επιλογής του κατάλληλου µικροοργανισµού µέσα από το άπειρο πλήθος των µικροοργανισµών που υπάρχουν στη φύση είναι πολύ σύνθετη εργασία και περιλαµβάνει πολλές παραµέτρους. Οι παράµετροι αυτοί είναι: το κόστος της καλλιέργειας η έκκριση των ενζύµων που µας ενδιαφέρουν από το κύτταρο στο θρεπτικό υλικό η παραµονή των συντιθέµενων ενζύµων στο κύτταρο Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 22

23 η παράλληλη παραγωγή επικίνδυνων ενζύµων ή ενζύµων που πιθανόν να παρεµποδίζουν το ένζυµο που µας ενδιαφέρει. Τα ένζυµα ανάλογα µε την προέλευσή τους, διαφέρουν σηµαντικά ως προς τη θερµοσταθερότητά τους, τη σταθερότητά τους σε διάφορες ακραίες τιµές ph και σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων ή άλλων στοιχείων. Οι πρωτεάσες που παράγονται από το Bacillus subtilis για παράδειγµα είναι σχετικά θερµοσταθερά ένζυµα και παραµένουν ενεργά σε αλκαλικό ph οπότε είναι τα πλέον κατάλληλα για να χρησιµοποιηθούν σα πρόσθετα στη σκόνη πλυσίµατος. Αντίθετα, οι αµυλάσες από µύκητες είναι θερµοευαίσθητες και συνεπώς είναι κατάλληλες για την αρτοβιοµηχανία. Όταν ο βιοµηχανικός γενετιστής επιλέγει έναν µικροοργανισµό για την παραγωγή ενός ενζύµου πρέπει να λάβει υπόψην πολλές παραµέτρους και να προσπαθήσει να βελτιώσει τις ιδιότητες του νέου ενζύµου έτσι ώστε να είναι κατάλληλο για ευρεία χρήση. Μερικές από τις παραµέτρους αυτές αναφέρονται παρακάτω: Αύξηση κατά το δυνατόν της παραγωγής του ενζύµου Ανεξαρτοποίηση της παραγωγής του από επαγωγείς Βελτίωση της σταθερότητάς του. Μείωση και εξάλειψη ανεπιθύµητων οσµών, χρωµάτων και επικίνδυνων ιδιοτήτων και παραπροιόντων ή µεταβολιτών. Δεν βρισκόµαστε ακόµη στο στάδιο χρησιµοποίησης έξυπνων γενετικών τεχνικών σε ευρεία κλίµακα. Οι περισσότερες βιοµηχανίες προσπαθούν να επιτύχουν τα επιθυµητά αποτελέσµατα µε το συνδιασµό µεταλλαξιγέννεσης και µιας γρήγορης και αποτελεσµατικής µεθόδου επιλογής (screening). Ένα κοινό χαρακτηριστικό των περισσοτέρων µικροοργανισµών βιοµηχανικού ενδιαφέροντος είναι ότι η γενετική τους δεν έχει ακόµη µελετηθεί σε βάθος. Αυτό είναι αναµενόµενο διότι τα οικονοµικά στοιχεία πιέζουν τη βιοµηχανία να χρησιµοποιήσει τον οργανισµό αυτό κατά τον καλύτερο δυνατό τρόπο παρά να τον αναλύσει προς απόκτηση βασικής γνώσης. Παρόλαυτα η τεχνική της µεταφοράς γονιδίων που πλέον χρησιµοποιείται σε πολλά εργαστήρια σε συνδιασµό µε την πρωτεινική µηχανική θα επηρεάσει αναµφίβολα την κλασσική γενετική και ήδη ανοίγει καινούργιους ορίζοντες στην ενζυµική τεχνολογία. 13. Βιοµηχανικές ζυµώσεις και ενζυµική παραγωγή Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 23

24 Οι πρώτες ύλες που χρησιµοποιούνται στις βιοµηχανικές ζυµώσεις συνήθως περιορίζονται σε φτηνές ύλες που είναι εύκολο να αποκτηθούν σε µεγάλες ποσότητες και σε χαµηλό κόστoς και οι οποίες είναι θρεπτικά ασφαλείς. Μερικές από τις πλέον κοινές πρώτες ύλες συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα 4. Πηγή άνθρακα Πηγή αζώτου Καλαµποκάλευρο, σιτάλευρο, υδρολυµένο καλαµποκάλευρο, κριθάρι, αραβικό κόµµι, λακτόζη, πολτοποιηµένα τεύτλα, παραπροϊόντα αραβοσίτου. Σογιάλευρο, ιχθυάλευρα, υδρολυµένες ζύµες, εκχυλίσµατα ζυµών, καζεϊνη, αµµωνία, αµµωνιακά άλατα, παραπροϊόντα επεξεργασίας αραβοσίτου. Ιχνοστοιχεία και βιταµίνες Παραπροϊόντα επεξεργασίας αραβοσίτου, Fe, Ca, Na, ανθρακικά, θειϊκά και κιτρικά άλατα. Πίνακας 4 Η βιοµηχανική παραγωγή ενζύµων από µικροοργανισµούς βασίζεται κυρίως σε δύο τύπους καλλιεργειών: Σε υγρές καλλιέργειες (ζυµωτήρες) Σε καλλιέργειες σε σταθερό υπόστρωµα Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούνται και η αντίστοιχη τεχνολογία δεν αποτελούν αντικείµενο του εγχειριδίου αυτού και δεν θα αναπτυχθούν διεξοδικά. Συνεπως θα αναφέρουµε συνοπτικά τα κριτήρια και τις προϋποθέσεις χρήσης των δύο αυτών µεθόδων. Η καλλιέργεια σε σταθερό υπόστρωµα για την παραγωγή µηκυτιακών ενζύµων έχει πολύ µακρά ιστορία και εφαρµόζεται ιδιαίτερα στην Ιαπωνία και σε άλλες χώρες της Άπω Ανατολής. Στην πράξη, η µέθοδος αυτή χρησιµοποιεί σαν υπόστρωµα υγρό καλαµποκάλευρο ή ρυζάλευρο εµπλουτισµένο µε ιχνοστοιχεία και άλατα. Η καλλιέργεια γίνεται σε παραλληλόγραµµα ή κυκλικά πλαίσια τα οποία και διατηρούνται σε σταθερή θερµοκρασία και υγρασία. Σηµαντικά για τη βιοµηχανία ένζυµα που παράγονται µε τη µέθοδο αυτή είναι πολλά µυκητιακά ένζυµα όπως πρωτεάσες, αµυλάσες, πηκτινάσες και κυτταρινάσες. Επειδή τα µικροβιακά παραγόµενα ένζυµα είναι κυρίως προιόντα που έχουν εµπορικά υψηλό όγκο και µέτριο κόστος, η παραγωγή τους µε υγρές καλλιέργειες γίνεται σε ζυµωτήρες των οποίων ο σχεδιασµός βασίζεται στους ζυµωτήρες που χρησιµοποιούνται στην παραγωγή µικροβιακών αντιβιοτικών. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 24

25 Η επιλογή του θρεπτικού υλικού είναι µια πολύ χρήσιµη παράµετρος διότι αποτελεί τη µοναδική πηγή ενέργειας, άνθρακα και αζώτου του καλλιεργούµενου µικροοργανισµού σε ένα κλειστό σύστηµα. Από την άλλη πλευρά το κόστος του αρχικού υλικού θα επηρεάσει σηµαντικά και το κόστος του τελικού προιόντος. Ένας συνηθισµένος βιοµηχανικός ζυµωτήρας για την παραγωγή µικροβιακών ενζύµων είναι κατασκευασµένος από ανοξείδωτο ατσάλι και έχει χωρητικότητα µεταξύ 10 και 50 κυβικών µέτρων. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα ένζυµα παράγονται σε µαζικές ποσότητες σε χρόνο που διαρκεί από 30 έως 150 ώρες. Εϊναι βέβαια αυτονόητη η ανάγκη για αυστηρά στείρες συνθήκες γεγονός που ανεβάζει το κόστος παραγωγής. Μετά την ολοκλήρωση της ζύµωσης το(α) µικροβιακά παραγόµενα ένζυµα θα βρίσκονται είτε ενδοκυτταρικά είτε στο θρεπτικό υλικό (υγρό ή στερεό) εφόσον έχουν εκκριθεί από τα κύτταρα. Τα εµπορικά διαθέσιµα ενζυµικά παρασκευάσµατα βρίσκονται είτε σε στερεά είτε σε υγρή µορφή και διακρίνονται σε χαµηλής και υψηλής καθαρότητας ένζυµα. Το τελικό κόστος αγοράς ενός ενζύµου εξαρτάται επίσης από την περαιτέρω διαδικασία που απαιτείται µέχρι την απόκτηση της τελικής σφραγισµένης συσκευασίας του προιόντος. Τα ένζυµα που πρόκειται να χρησιµοποιηθούν στη βιοµηχανία τροφίµων ή για ιατρικούς σκοπούς πρέπει να ικανοποιούν πολύ αυστηρές προδιαγραφές όσον αφορά την τοξικότητά τους. Προς το παρόν µόνο ένας µικρός αριθµός µικροοργανισµών χρησιµοποιείται για την παραγωγή ενζύµων για τέτοιου είδους χρήσεις. Είναι αξιοσηµείωτο ότι σύµφωνα µε την ισχύουσα νοµοθεσία την τελική ευθύνη για την ασφάλεια των ενζυµικών παρασκευασµάτων τη φέρει το εργοστάσιο παραγωγής. Στην πράξη ένα ένζυµο για να είναι ασφαλές πρέπει να είναι κατά το δυνατόν ελεύθερο από παρενέργειες όπως π.χ. αλλεργικές αντιδράσεις και να είναι απηλλαγµένο από τοξικά παραπροϊόντα και µικροοργανισµούς. Κ. Βοργιάς (2010) Ενζυµική Βιοτεχνολογία Σελίδα 25