ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ. Διπλωματική Εργασία

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Διπλωματική Εργασία Κυτταροβιολογική προσέγγιση της αναιμίας στη Χρόνια Νεφρική Ανεπάρκεια Καραδήμας Δημήτριος AM: Επιβλέπουσα: Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Επίκουρη Καθηγήτρια ΑΘΗΝΑ 2016

2 Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε, στο πλαίσιο προπτυχιακών σπουδών, στον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής του τμήματος Βιολογίας, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια κα Αντωνέλου για την ευκαιρία που μου μου έδωσε να συμμετέχω στην εκπόνηση αυτής της εργασίας αλλά και για την εμπιστοσύνη της προς εμένα καθ όλη τη διάρκεια της χρονιάς. Ελπίζω να φάνηκα αντάξιος των προσδοκιών της και να βοήθησα όσο μπορούσα στην επιτυχία αυτής της ερευνητικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια και Διευθύντρια του τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κα Παπασιδέρη για την φιλοξενία στον Τομέα καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές της. Θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Υποψήφια Διδάκτορα Γεωργατζάκου Χαρά για την υπομονή που έδειξε προς εμένα στην διάρκεια της χρονιάς, για όλες τις γνώσεις που μου προσέφερε και για την τεράστια βοήθειά της στην εκπόνηση και συγγραφή αυτής της εργασίας. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τον μεταδιδακτόρικό ερευνητή Δρ Βασίλη Τζούνακα που μαζί με την κα Γεωργατζάκου Χαρά μας εκπαίδευσαν και μας μεταλαμπάδευσαν όσα γνώριζαν περί του θέματος αλλά και για την σωστή και εύρυθμη λειτουργία των πειραματικών διαδικασιών. Τέλος, πρέπει να επισημάνω την εξαιρετική συνεργασία μου με τη συμφοιτητριά μου Αναστασιάδη Αλκμήνη και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ζέκο Αθηνά με τις οποίες γίναμε πολύ καλοί φίλοι μέσα από τις όμορφες στιγμές που περάσαμε την φετινή χρονιά

3 Πίνακας Περιεχομένων Συντομογραφίες Εισαγωγή Γενικά στοιχεία για το αίμα Γενικά στοιχεία για το ερυθροκύτταρο (λειτουργία, δομή, παραγωγή) Αιματοκρίτης (Hct) Αιμοσφαιρίνη (Hb) Ερυθροκυτταρική μεμβράνη Λιπίδια ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Πρωτεΐνες ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Σύμπλοκα ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Μεταβολισμός ερυθροκυττάρων Αποπτωτικός θάνατος ερυθροκυττάρων Ερυθρόπτωση Νεφροί: ανατομία, δομή, λειτουργίες Ερυθροποιητίνη Νεφρική ανεπάρκεια Αναιμία Μεταβολές στο αιματολογικό πρότυπο στη ΧΝΑ Αιμοκάθαρση- Τεχνητός νεφρός Επίδραση της αιμοκάθαρσης στο αιματολογικό πρότυπο των ασθενών Θεραπεία αναιμίας της ΧΝΑ με χρήση ερυθροποιητίνης Αντίσταση στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Αίτια ανθεκτικότητας στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Αιματολογικό πρότυπο ασθενών που ανταποκρίνονται ή όχι στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Επίδραση της ερυθροποιητίνης στα ερυθροκύτταρα in vivo και in vitro Σκοπός της εργασίας Υλικά & Μέθοδοι Λευκαφαίρεση και αιμοπεταλιαφαίρεση σε κολώνες κυτταρίνης

4 3.2 Απομόνωση ερυθροκυτταρικών μεμβρανών Υπολογισμός ολικής πρωτεϊνικής συγκέντρωσης δείγματος Προετοιμασία πρωτεϊνικού δείγματος για ηλεκτροφόρηση Αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κατά Laemmli Τεχνική ανοσοαποτυπώματος κατά Western Ποσοτική εκτίμηση των πρωτεϊνών των πηκτωμάτων και των φιλμ Προετοιμασία για παρατήρηση της μορφολογίας ερυθροκυττάρων με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης - ΗΜΣ (Scanning Electron Microscope - SEM) Μέτρηση ενδοκυττάριων επιπέδων ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) και ιόντων Ca Μέτρηση επιπέδων αντιοξειδωτικής ικανότητας πλάσματος-frap (Ferric Reducing Ability of Plasma) Μέτρηση Οσμωτικής Ευθραυστότητας Ερυθροκυττάρων Αποτελέσματα Μέρος Α : Μεταβολές στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα των ασθενών (ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων), πριν τη διαδικασία της αιμοκάθαρσης Μέρος B : Μεταβολές στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα των ασθενών (ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων), μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης Μέρος Γ : Επίδραση της διαδικασίας αιμοκάθαρσης στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα ασθενών που δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με rhepo Μέρος Δ : Επίδραση της διαδικασίας αιμοκάθαρσης στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα ασθενών που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με rhepo Συζήτηση Περίληψη Βιβλιογραφικές Αναφορές

5 Συντομογραφίες Hb: Hemoglobin (αιμοσφαιρίνη) Hct: Hematocrit (αιματοκρίτης) MCV: Mean cell volume (μέσος όγκος ερυθροκυττάρων) MCH: Mean corpuscular hemoglobin (μέση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης ανά ερυθροκύτταρο) MCHC: Mean corpuscular hemoglobin concentration (μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης ερυθρών αιμοσφαιρίων) RDW: Red cell distribution width (εύρος κατανομής μεγέθους ερυθρών αιμοσφαιρίων) ATP: Τριφωσφορική αδενοσίνη PC: Φωσφατιδυλοχολίνη SM: Σφιγγομυελίνη PS: Φωσφατιδυλοσερίνη PA: Φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη CO 2 : διοξείδιο του άνθρακα HCO 3 : διττανθρακικά ιόντα Η + : ιόντα υδρογόνου Cl - : ιόντα χλωρίου Rh: Rhesus GPA: γλυκοφορίνες A GPB: γλυκοφορίνες B GPC: γλυκοφορίνες C GPD: γλυκοφορίνες D GPE: γλυκοφορίνες E DHA: L-αφυδροασκορβικό οξύ 2,3-DPG: 2,3-διφωσφογλυκερικό οξύ ΧΝΑ: Χρόνια Νεφρική Ανεπάρκεια GFR: ρυθμού σπειραματικής διήθησης ΑΙΚ: Αιμοκάθαρση SOD: υπεροξειδική δισμουτάση RFU: Relative Fluorescence Units - 5 -

6 1. Εισαγωγή 1.1 Γενικά στοιχεία για το αίμα Το αίμα του ανθρώπινου σώματος αποτελείται από έμμορφα στοιχεία, δηλαδή κυτταρικά συστατικά που αιωρούνται μέσα στο πλάσμα. Το πλάσμα αποτελείται από: Νερό (90%) Διαλυμένες ουσίες όπως πρωτεΐνες (κυρίως αλβουμίνη, σφαιρίνες, ινωδογόνο) που έχουν ως κύριο ρόλο τη μεταφορά ουσιών και τη διατήρηση της οσμωτικής ισορροπίας του πλάσματος, γλυκόζη, αμινοξέα, ηλεκτρολύτες, διάφορα ένζυμα, αντισώματα, ορμόνες, και μεταβολικά απόβλητα Διαλυμένα αέρια, κατα κύριο λόγο οξυγόνο, αλλά και διοξείδιο του άνθρακα και άζωτο Η αλβουμίνη που αποτελεί την πιο άφθονη πρωτεΐνη του πλάσματος βοηθά στη διατήρηση της ωσμωτικής ισορροπίας με τα κύτταρα του σώματος, αλλά και στην μεταφορά άλλων συστατικών (πχ λιπιδίων, ορμονών, βιταμινών). Στα έμμορφα συστατικά του αίματος ανήκουν τα: ερυθρά αιμοσφαίρια (ερυθροκύτταρα) που περιέχουν την αιμοσφαιρίνη, μόριο υπεύθυνο για τη μεταφορά οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα λευκά αιμοσφαίρια (λευκοκύτταρα) που αποτελούν τα κύτταρα άμυνας του οργανισμού επάγοντας ανοσολογικές απαντήσεις αιμοπετάλια που αποτελούν θραύσματα κυττάρων, προερχόμενα από τα μεγακαρυοκύτταρα και συμμετέχουν κυρίως στη διαδικασία πήξης του αίματος («Φυσιολογία Του Ανθρώπου», A.Vander, 1997). 1.2 Γενικά στοιχεία για το ερυθροκύτταρο (λειτουργία, δομή, παραγωγή) Η κυριότερη λειτουργία των ερυθροκυττάρων είναι η μεταφορά του οξυγόνου το οποίο προσλαμβάνεται από τους πνέυμονες με την εισπνοή και του διοξειδίου του άνθρακα που παράγεται από τα κύτταρα και αποβάλλεται μέσω της εκπνοής. Η ικανότητα ανταλλαγής αυτών των αερίων μεταξύ οργανισμού και περιβάλλοντος οφείλεται στην αιμοσφαιρίνη, την πολυπληθέστερη πρωτεΐνη στο εσωτερικό των ερυθροκυττάρων. Το οξυγόνο δεσμεύεται με μεγάλη συγγένεια στα άτομα του σιδήρου που εμπεριέχονται στα μόρια της αιμοσφαιρίνης ενώ το διοξείδιο του άνθρακα με πολύ μικρότερη. Στο γεγονός αυτό οφείλεται η ανταλλαγή των δύο αερίων στους πνεύμονες κατά την οποία το φλεβικό αίμα αποδεσμέυει το διοξείδιο και προσλαμβάνει οξυγόνο που το επιστρέφει στην κυκλοφορία. Τα ερυθροκύτταρα διαθέτουν σχήμα αμφίκοιλου δίσκου, είναι δηλαδή πιο παχιά στις άκρες τους απ ότι στο μέσον, έχουν διάμετρο περίπου 8μm και ύψος 2μm (Εικόνα 1). Το μοναδικό τους σχήμα σε συνδυασμό με το μέγεθός τους, προσδίδουν σε αυτά υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο. Σε - 6 -

7 αυτήν την ιδιότητά τους οφείλεται η μεγάλη ελαστικότητά τους και η ανθεκτικότητα στη μηχανική καταπόνηση, που τους επιτρέπουν να παραμορφώνουν το σχήμα τους στην κυκλοφορία και να το επαναφέρουν άμεσα. Βασικός παράγοντας όλων των παραπάνω χαρακτηριστικών αποτελεί η μοναδική στη φύση σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης. Εικόνα 1: Ερυθροκύτταρα από φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM) (Ανατύπωση από Mohandas & Gallagher, 2008) Η θέση παραγωγής των ερυθροκυττάρων είναι το εσωτερικό των οστών, γνωστό ως μυελός των οστών. Τα ερυθροκύτταρα προέρχονται από αρχέγονα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα, όπως και όλα τα άλλα κύτταρα του αίματος. Τα αρχέγονα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα, ύστερα από μία σειρά διαφοροποιήσεων μετατρέπονται σε προδρομικά ερυθροκύτταρα και αρχίζουν να παράγουν αιμοσφαιρίνη χάνοντας τον πυρήνα και τα οργανιδιά τους. Τα νεαρά ερυθροκύτταρα στον μυελό των οστών περιέχουν εντούτοις λίγα ριβοσώματα και γι αυτό παρουσιάζουν μια δικτυωτή μορφή όταν επεξεργάζονται με ειδικές χρωστικές και ονομάζονται δικτυοερυθροκύτταρα. Στην κυκλοφορία, βρίσκονται σε ποσοστά της τάξης του 0,5-2% και μετά την απομάκρυνση των τελευταίων οργανιδίων μετατρέπονται σε νεαρά ερυθροκύτταρα. Η μέση διάρκεια ζωής των φυσιολογικών ερυθροκυττάρων είναι περίπου 120 μέρες. Λόγω της απουσίας πυρήνα και οργανιδίων, δεν έχουν την ικανότητα να διατηρούν τη φυσιολογική τους δομή για μεγάλο χρονικό διάστημα γι αυτό και είναι αναγκαία η συνεχής αντικατάσταση των γηρασμένων ερυθροκυττάρων στον οργανισμό με νεαρά που προκύπτουν από την αδιάκοπη διαδικασία της ερυθροποίησης. Η καταστροφή των μη λειτουργικών ερυθροκυττάρων λαμβάνει χώρα στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα του σπλήνα και του ήπατος («Φυσιολογία Του Ανθρώπου», A.Vander, 1997) Αιματοκρίτης (Hct) Ο αριθμός των ερυθροκυττάρων στο ανθρώπινο αίμα υπολογίζεται περίπου σε 5,4 εκατομμύρια ανά μl σε έναν ενήλικο άνδρα και 4,8 εκατομμύρια ανά μl σε μια ενήλικη γυναίκα. Ο αιματοκρίτης είναι το ποσοστό του όγκου του αίματος που καταλαμβάνεται από τα ερυθροκύτταρα - 7 -

8 έπειτα από φυγοκέντρηση. Εκφράζεται σε ποσοστό όγκου, δηλαδή 25% αιματοκρίτης σημαίνει ότι στα 100ml ολικού αίματος, τα 25ml θα καταλαμβάνονται από τα ερυθροκύτταρα Αιμοσφαιρίνη (Hb) Η αιμοσφαιρίνη είναι μια σύνθετη σφαιρική πρωτεΐνη η οποία περιέχει πρωτεϊνικά και μη πρωτεϊνικά μόρια. Πιο συγκεκριμένα αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, δύο α (141 αμινοξέα) και δύο β (146 αμινοξέα), η κάθε μία από τις οποίες είναι σφαιρική ως προς το σχήμα (Εικόνα 2). Τα τέσσερα πολυπεπτίδια είναι διευθετημένα με τέτοιο τρόπο ώστε μεταξύ των ανόμοιων αλυσίδων να αναπτύσσεται ένας μεγάλος αριθμός αλληλεπιδράσεων σταθεροποίησης ενώ μεταξύ των όμοιων αλυσίδων πολύ μικρός. Οι επαφές μεταξύ ανόμοιων αλυσίδων περιορίζονται στις 17-19, σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου μεταξύ μερικών αμινοξέων εκ των 35 αμινοξέων του υβριδικού διμερούς. Μελέτες στην αλληλουχία των αμινοξέων σε απομονωμένες αιμοσφαιρίνες έχουν δείξει την ύπαρξη μεγάλης ποικιλότητας σε πολλες θέσεις. Πιο συγκεκριμένα, μόνο πέντε θέσεις είναι αμετάβλητες και δέκα είναι κατειλημμένες από το ένα εκ των δύο εναλλακτικών αμινοξέων. Προφανώς αυτά τα 15 αμινοξέα είναι πολύ σημαντικά για την διατήρηση της τρισδιάστατης δομής του μορίου. Εικόνα 2: Μοντέλο αναπαράστασης της αιμοσφαιρίνης στο χώρο (Ανατύπωση από Alan N. Schechter, 2008) Το μη πρωτεϊνικό τμήμα της αιμοσφαιρίνης συνίσταται από τέσσερις ομάδες αίμης η κάθε μία εκ των οποίων συνδέεται με κάθε μια από τις τέσσερις αλυσίδες της σφαιρίνης. Το άτομο του σιδήρου της αίμης συνδέεται σε κάθε πυρρολικό δακτύλιο και είναι το μόνο μέρος του μορίου που δεν χαρακτηρίζεται ως υδρόφοβο. Στα θηλαστικά η λειτουργία της αιμοσφαιρίνης συνίσταται στη μεταφορά του οξυγόνου μέσω του αίματος από τους πνέυμονες στους διάφορους ιστούς. Κατα συνέπεια θα πρέπει να βρίσκεται σε δύο μορφές, την οξυγονωμένη και την μη οξυγονωμένη ("Biochemistry", W.H. Freeman, 2001) - 8 -

9 1.2.3 Ερυθροκυτταρική μεμβράνη Ο Ολλανδός Jan Swammerdam το 1668 ήταν ο πρώτος που παρατήρησε και κατέγραψε τα χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων στο μικροσκόπιο και έδωσε το έναυσμα σε πολλούς άλλους επιστήμονες να ασχοληθύν με αυτά. Το 1675 ο Antonie van Leeuwenhoek δημοσίευσε άρθρο σε περιοδικό της εποχής κάνοντας παρατηρήσεις για τα ερυθροκύτταρα που μετά από 300 χρόνια σχεδόν επιβεβαιώθηκαν με πειραματικά αποτελέσματα. Έκτοτε, αλλά σε μεγαλύτερο βαθμό τις τρείς τελευταίες δεκαετίες η έρευνα πάνω στα χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων και ειδικότερα της μεμβράνης τους έχει αποκαλύψει πληθώρα δεδομένων τόσο για την σύσταση όσο και για την λειτουργία της (Mohandas & Gallagher, 2008). Η σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης αποτελεί το σημαντικότερο στοιχείο των ερυθροκυττάρων. Είναι εξαιρετικά ελαστική, αποκρίνεται ταχύτατα σε μεταβολές υγρών του περιβάλλοντος και διαθέτει την ακριβή αναλογία επιφάνειας προς όγκο ώστε να μην υπόκεινται σε λύση τα ερυθροκύτταρα καθώς περνούν μέσα από το σπλήνα, τα νεφρά, τα λεπτά τριχοειδή αγγεία κλπ. Παράλληλα, συντονίζει τη μεταφορά ουσιών από και πρός το εσωτερικό των ερυθροκυττάρων και ρυθμίζει την διάρκεια ζωής τους στην κυκλοφορία. Έχουν παρατηρηθεί παροδικές μεταβολές στην μεμβράνη κατά τη διάρκεια της κυκλοφοριας των ερυθοκυττάρων στον οργανισμό, χωρίς όμως να διαταράσσεται η δομική ακεραιότητα της (Mohandas & Gallagher, 2008). Όπως όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα, έτσι και τα ερυθροκύτταρα περιβάλλονται από μία διπλοστιβάδα λιπιδίων με τις υδρόφιλες κεφαλές των λιπιδίων να βρίσκονται προς το εξωτερικό ή το εσωτερικό του κυττάρου όπου υπάρχει επαφή με νερό και τις υδρόφοβες ουρές στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Το αξιοσημείωτο στην περίπτωση των ερυθροκυττάρων είναι η ύπαρξη ενός δικτύου σκελετικών πρωτεϊνών στο εσωτερικό του κυττάρου που είναι ενωμένες με τις κυτταροπλασματικές περιοχές των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών ή απευθείας με τα λιπίδια της μεμβράνης. Λιπίδια ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Η διπλοστοιβάδα των ερυθροκυττάρων αποτελείται από χοληστερόλη και φωσφολιπίδια σε ίδιες αναλογίες ως προς το βάρος τους. Η χοληστερόλη κατανέμεται και στις δύο στοιβάδες, κάτι το οποίο όμως δεν συμβαίνει και με τα φωσφολιπίδια. Υπάρχουν τέσσερα είδη φωσφολιπιδίων στην μεμβράνη. Στην εξωτερική μεμβράνη απαντάται η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και η σφιγγομυελίνη (SM), ενώ στην εσωτερική η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (PA). Τα λιπίδια εκτελούν κινήσεις στη διπλοστοιβάδα (πχ. flip-flop), επομένως κάποια από αυτά μπορεί να βρεθούν σε λανθασμένη θέση. Η επαναφορά τους στη σωστή μονοστοιβάδα πραγματοποιείται από ειδικές πρωτεΐνες. Οι φλιπάσες (flipase) μεταφέρουν τα φωσφολιπίδια από την εξωτερική προς την εσωτερική μονοστοιβάδα ενώ οι φλοπάσες (flopase) κάνουν το αντίθετο, μέσω ενός ενεργειοεξαρτώμενου (από τριφωσφορική αδενοσίνη) μηχανισμού. Επιπλέον, υπάρχουν και οι σκραμπλάσες (scramblase) που μεταφέρουν φωσφολιπίδια και προς τις δύο κατευθύνσεις μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου ενέργειας με βάση την κλίση συγκέντρωσης (Mohandas & Gallagher, 2008)

10 Εικόνα 3: Σχηματική αναπαράσταση του δικτύου πρωτεϊνών της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης (Ανατύπωση από Patrick G. Gallagher, 2013) Η κατανομή των φωσφολιπιδίων στις μονοστοιβάδες της μεμβράνης δεν είναι τυχαία. Υπάρχει λόγος που η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και τα φωσφοϊνοσιτίδια βρίσκονται στην εσωτερική μονοστοιβάδα. Η έκθεση της PS αυτόματα πυροδοτεί την φαγοκυττάρωση των ερυθροκυττάρων από τα μακροφάγα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επίσης σημαντικός είναι ο ρόλος της φωσφατιδυλοσερίνης στην διατήρηση του κυτταροσκελετού των ερυθροκυττάρων καθώς έχει βρεθεί ότι υπάρχει σύνδεση μεταξύ PS και σπεκτρίνης, γεγονός που σταθεροποιεί την μεμβράνη ακόμη περισσότερο. Τέλος, σε μικρά ποσοστά στην μεμβράνη συναντώνται και το φωσφατιδικό οξύ (PA) αλλά και η φωσφοϊνοσιτόλη και τα γλυκολιπίδια (Mohandas & Gallagher, 2008). Πρωτεΐνες ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Διαμεμβρανικές πρωτεΐνες Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί και προσδιοριστεί περισσότερες από 300 διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (Pasini et al, 2006) που εδράζονται στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων από τις οποίες μεγάλο ποσοστό αποτελούν αυτές που χαρακτηρίζουν τις διάφορες ομάδες αίματος. Κάθε μία από τις πρωτεΐνες αυτές εξυπηρετεί διαφορετική λειτουργία για το ερυθροκύτταρο όπως για παράδειγμα μεταφορά ουσιών από και προς το εσωτερικό του, διατήρηση δομικής ακεραιότητας της μεμβράνης, προσκόλληση και αλληλεπίδραση με άλλα κύτταρα και λήψη εξωκυττάριων σημάτων

11 Ζώνη-3 Η ζώνη-3 αναφέρεται και ως ανιοντοανταλλάκτης (ΑΕ1, SLC4A1) και είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στην επιφάνεια της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης. Η παρουσία της ζωνης-3 είναι απαραίτητη ώστε να μπορεί να επιτευχθεί η μεταφορά διοξειδίου του άνθρακα και οξυγόνου στους ιστούς και τους πνεύμονες (Bruce L., 2008). Πιο συγκεκριμένα, με τη δράση της καρβονικής ανυδράσης το διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) που παραλαμβάνεται από τα ερυθροκύτταρα μετατρέπεται σε διττανθρακικά ιόντα (HCO 3 ) και ιόντα υδρογόνου (Η + ). Η ζώνη-3 ανταλλάσσει τα ανθρακικά ιόντα με ιόντα χλωρίου (Cl - ) και τα Η + προσδένονται στην αιμοσφαιρίνη μειώνοντας την συγγένεια με το Ο 2 το οποίο και απελευθερώνεται. Παράλληλα, μέσω αυτής της διαδικασίας πραγματοποείται η μεταφορά του CO 2 με τη μορφή HCO 3 στο πλάσμα του αίματος (Bruce L., 2008). Δομικά, η πρωτεΐνη αποτελείται από τρεις περιοχές: την αμινοτελική περιοχή που συνδέεται με την αγκυρίνη, την καρβοξυτελική περιοχή που συνδέεται με την καρβονυκή ανυδράση II αλλά και την διαμεμβρανική περιοχή που διαπερνά την μεμβράνη φορές. Τόσο η αμινοτελική όσο και η καρβοξυτελική περιοχή βρίσκονται προς την πλευρά του κυτταροπλάσματος (Εικόνα 4) (Bruce L., 2006). Πειραματικά δεδομένα εχουν δείξει ότι η ζώνη-3 βρίσκεται στην επιφάνεια της μεμβράνης με τη μορφή διμερούς ή τετραμερούς. Υπό μορφή διμερούς, η ζώνη-3 συνδέεται με την πρωτεΐνη 4.1R, η οποία προσδένεται και σε άλλες πρωτεΐνες, δημιουργώντας ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο. Στην τετραμερή μορφή, η ζώνη-3 προσδένεται στην πρωτεΐνη 4.2 και την αγκυρίνη, μέσω των οποίων προσκολλάται στη β-σπεκτρίνη (Michaely & Bennett, 1995, Franko & Low,2012). Ταυτόχρονα βρίσκεται σε αλληλεπίδραση με τη γλυκοφορίνη Α (GPA) καθώς και με πρωτεΐνες του συμπλόκου Rhesus (Rh), όπως είναι τα αντιγόνα Rh, οι συνδεδεμένες με Rh γλυκοπρωτεΐνες (RhAG), οι πρωτεΐνες προσκόλλησης LW και CD47, με τις οποίες δημιουργεί το πολυπρωτεϊνικό μακροσύμπλοκο της ζώνης 3 (Εικόνα 3) (Bruce L., 2006). Επιπλέον, η πρωτεΐνη αυτή συνδέεται και με μια σειρά άλλων πρωτεϊνών στις οποίες περιλαμβάνονται τα γλυκολυτικά ένζυμα, η αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης, η αλδολάση και η φωσφοφρουκτοκινάση, η κινάση τυροσίνης p72syk, η δεοξυαιμοσφαιρίνη και τα αιμοχρώματα (οξειδωμένη μορφή αιμοσφαιρίνης). Η καρβοξυτελική περιοχή, όπως προαναφέρθηκε, συνδέεται με την καρβονική ανυδράση II που είναι απαραίτητη για την ενυδάτωση του διοξειδίου του άνθρακα και τη μεταφορά του από τους πνεύμονες στους ιστούς. Η σύνδεση της πρωτεΐνης με τη γλυκοφορίνη Α διευκολύνει την κίνηση της πρωτεΐνης στη μεμβράνη (Tanner M., 2002)

12 Εικόνα 4: Δευτεροταγής δομή της Ζώνης 3 (Ανατύπωση από Walsh & Stewart, 2010) Γλυκοφορίνες Οι γλυκοφορίνες είναι διαμεμβρανικές γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες των οποίων το αμινοτελικό άκρο βρίσκεται εξωκυτταρικά και συνδέονται με σιαλικά οξέα. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι χαρακτηριστικές της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης και κατατάσσονται σε γλυκοφορίνες A (GPA), γλυκοφορίνες B (GPB), γλυκοφορίνες C (GPC), γλυκοφορίνες D (GPD) και γλυκοφορίνες E (GPE), με μοριακό βάρος που ποικίλει από 17 έως 36 kda (Yiquin & Junfan, 2007). Ο κύριος ρόλος τους είναι η απόδοση αρνητικού φορτίου στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων για την αποτροπή της συσσωμάτωσής τους. Οι GPD και GPC φαίνεται να συνδέονται με τον ερυθροκυτταρικό σκελετό (Εικόνα 3) άρα και με την διατήρηση του σχήματος των ερυθροκυττάρων (Reid et al., 1987). Η GPA έχει ρόλο μοριακής συνοδού ρυθμίζοντας τη μεταφορά των μορίων της ζώνης-3 στη μεμβράνη (Bruce et al., 1994) ενώ έχει δειχθεί πως δεν συνδέεται με την ελεύθερη μορφή της ζώνης 3 στη μεμβράνη, αλλά αποτελεί τμήμα των συμπλόκων που αναφέρθηκαν χωρίς αυτή η σύνδεση να είναι μόνιμη (Giger et al.,2016). Στοματίνη (Ζώνη 7.2) Η στοματίνη είναι μεμβρανική πρωτεΐνη μεγέθους 32 kda με μια περιοχή πλούσια σε υδρόφοβα αμινοξέα τα οποία σχηματίζουν μια δομή που βυθίζεται στην μεμβράνη αλλά δεν τη διαπερνά. Συνολικά αποτελείται απο 288 αμινοξικά κατάλοιπα και λειτουργικά συμμετέχει στην δημιουργία των λιπιδικών σχεδίων στην επιφάνεια της μεμβράνης των ερυθροκυττάρων. Μπορεί να ελέγχει τη δράση διαφόρων μεμβρανικών πρωτεϊνών, όπως του μεταφορέα γλυκόζης καθώς και ιονικών καναλιών, ρυθμίζοντας αντιστρεπτά τη συμμετοχή τους στις λιπιδικές σχεδίες (Salzer et al.,2007)

13 Μεταφορέας γλυκόζης-1 (Glut-1) Ο μεταφορέας γλυκόζης ανήκει στην τάξη I της οικογένειας των μεταφορέων γλυκόζης. Διαπερνά την πλασματική μεμβράνη του ερυθροκυττάρου 12 φορές και τόσο το αμινοτελικό όσο και το καρβοξυτελικό άκρο του βρίσκεται στην κυτταροπλασματική πλευρά. Η περιοχή πρόσδεσης του υποστρώματος πιθανόν να βρίσκεται στην έβδομη διαμεμβρανική περιοχή ή μεταξύ των περιοχών 10 και 11 (Εικ.5). Ανάμεσα στις περιοχές 1 και 2 βρίσκεται ένα γλυκοζυλιωμένο αμινοξικό κατάλοιπο (Vrhovac I., 2014) (Εικόνα 5). Η κύρια λειτουργία του μεταφορέα αυτού είναι η μεταφορά γλυκόζης στο εσωτερικό των ερυθροκυττάρων. Παράλληλα όμως διαθέτει και ικανότητα μεταφοράς του L-αφυδροασκορβικού οξέος (DHA) και αυτό γιατί τα δύο μόρια μοιράζονται πολλά κοινά χαρακτηριστικά ως προς την στερεοδιάταξή τους. Το αξιοσημείωτο είναι ότι τα δύο αυτά μόρια δεν ανταγωνίζονται για την θέση προσδεσης στο μεταφορέα, αλλά ο ίδιος ο μεταφορέας αλλάζει στην δομή του ώστε να επιλέγει ποιό από αυτά θα μεταφέρεται σε κάθε στιγμή. Αυτό επιτυγχάνεται με την αλληλεπίδραση με την στοματίνη (Vrhovac I., 2014). Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση του μεταφορέα γλυκόζης των ερυθροκυττάρων (Ανατύπωση από Vrhovac, 2014) CD47 Η πρωτεΐνη CD47 είναι μια πρωτεΐνη της επιφάνειας των ερυθροκυττάρων και ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Αρχικά είχε ονομαστεί ως IAP (intergrin-associated protein) όμως το όνομα απορρίφθηκε λόγω της παρουσίας της και στα ερυθροκύτταρα στα οποία δεν συνδέεται με ιντεργκρίνες. Είναι μια έντονα γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη με πέντε διαμεμβρανικές περιοχές (Burger et al, 2016) (Εικονα 6). Η πρωτεΐνη αυτή έχει δειχθεί ότι λειτουργεί ως αναστολέας της ερυθροφαγοκυττάρωσης μέσω της συνδεσής της με την πρωτεϊνη SIRP-α της επιφάνειας των φαγοκυττάρων. Όμως, πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι δομικές αλλαγές στην πρωτεΐνη αυτή, λόγω στερεοδιαμορφωτικών αλλαγών σε γηρασμένα/οξειδωμένα ερυθροκύτταρα, μπορεί να επιφέρουν τα αντίθετα αποτελέσματα προωθώντας την ερυθροφαγοκυττάρωση μεσω αλληλεπίδρασης με την πρωτεϊνη SIRP-α, ύστερα από σύνδεση της πρωτεΐνη θρομβοσπονδίνης-1 (TSP-1) (Burger et al, 2012)

14 Εικόνα 6: Η πρωτεΐνη CD47 και η σύνδεση της με το RhAG (Ανατύπωση από L. Bordin, 2012) Υπεροξειρεδοξίνη-2 (Prx-2) Η υπεροξειρεδοξίνη-2 είναι ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο με κύρια λειτουργία την αποδόμηση των υπεροξειδίων όπου η καταλυτική της δράση οφείλεται στην παρουσία ισχυρά συντηρημένων καταλοίπων κυστεϊνης. Η πρωτεΐνη αυτή συναντάται στο κυτταρόπλασμα υπό τη μορφή ολιγομερών τα οποία προκύπτουν ύστερα από οξείδωση των μονομερών. Επιπλέον, η πρωτεΐνη αυτή συμμετέχει στην προστασία άλλων πρωτεϊνών από την αποικοδόμηση, δρώντας ως μοριακή συνοδός (chaperones) (Low et al, 2008). Kλαστερίνη (sclu) Η κλαστερίνη (ή αλλιώς απολιποπρωτεΐνη J) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από ένα ετεροδιμερές με συνολικό μοριακό βάρος 75-80kDa. Εντοπίζεται στην εξωκυττάρια και την ενδοκυττάρια πλευρά της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης αλλά και σε ελεύθερη μορφή στο κυτταρόπλασμα. Προκειμένου να σταθεροποιεί τη θέση της στην εξωκυτταρική πλευρά, προσδένεται στην ζώνη-3, την CD59 ή σε κάποιον μέχρι στιγμής άγνωστο υποδοχέα. Το ίδιο συμβαίνει και στην ενδοκυττάρια πλευρά της μεμβράνης όπου έχει παρατηρηθεί η προσδεσή της με την αιμοσφαιρίνη την ζώνη-3 και άλλες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού (Antonelou et al, 2011). Η πρωτεΐνη αυτή λειτουργεί ως μεταφορέας λιπιδίων στα ερυθροκύττρα ενώ συμμετέχει και σε διάφορες άλλες φυσιολογικές διεργασίες αυτών όπως η γήρανση. Σημαντική φαίνεται να είναι και η συνεισφορά της στην διατήρηση της ακεραιότητας της πρωτεϊνικής σύστασης των ερυθροκυττάρων. Επίσης έχουν γίνει αναφορές για την λειτουργία της πρωτεΐνης ως ενδο- και εξω-κυττραρική τσαπερόνη (Antonelou et al, 2011b), ως αναστολέας του συμπληρώματος και ως ρυθμιστής του κυτταρικού θανάτου (Antonelou et al, 2011). Στα γηρασμένα ερυθροκύτταρα η ποσότητα της κλαστερίνης μειώνεται σημαντικά κάτι που δείχνει την άμεση σχέση της πρωτεΐνης αυτής με τις διαδικασίες της γήρανσης. Μάλιστα, τα κυστίδια που αποκόπτονται από την μεμβράνη διαθέτουν μεγάλες ποσότητες κλαστερίνης, άρα η ίδια η πρωτεΐνη πιθανότατα να προωθεί την κυστιδιοποίηση (Antonelou et al, 2011)

15 Σκελετικές πρωτεΐνες Σπεκτρίνες Η πρωτεΐνη σπεκτρίνη αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη του υπομεμβρανικού σκελετού και απαντάται υπό τη μορφή νηματίων. Τα νημάτια αυτά αποτελούνται από το χαρακτηριστικό επαναλαμβανόμενο μοτίβο τριπλής έλικας με μήκος 106 αμινοξέα. Η α-σπεκτρίνη αποτελείται από 20 τέτοιες επαναλαμβανόμενες δομές ενώ η β-σπεκτρίνη από 16, με μοριακά βάρη 240 kda και 220 kda αντίστοιχα ( Βιολογία Κυττάρου, Μαργαρίτης Λ.Χ και συν., 2004,). Οι α- και β-σπεκτρίνες διαμορφώνουν ένα αντιπαράλληλο ετεροδιμερές μέσω ισχυρών πλευρικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στη 19η και 20η επαναλαμβανόμενη τριπλέτα του καρβοξυτελικού άκρου της α-σπεκτρίνης και την 1η και 2η τριπλέτα του αμινοτελικού άκρου της β-σπεκτρίνης. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ύπαρξη του υπομεμβρανικού δικτύου είναι η δημιουργία τετραμερών στο ένα άκρο μέσω πλευρικών αλληλεπιδράσεων. Η έλικα του αμινοτελικού άκρου της α- αλυσίδας του ενός διμερούς αλληλεπιδρά με τις δύο έλικες του καρβοξυτελικού άκρου της β αλυσίδας του άλλου διμερούς. Στο άλλο άκρο, τα διμερή σπεκτρίνης δημιουργούν ένα συνδετικό πλέγμα με την F-ακτίνη και την πρωτεΐνη 4.1R (Εικόνα7) (Mohandas & Gallagher, 2008). Αγκυρίνη (Πρωτεΐνη 2.1) Η αγκυρίνη είναι πρωτεΐνη του υπομεμβρανικού σκελετού, το μοριακό της βάρος έχει προσδιοριστεί στα 210kDa και αποτελείται από 1881 αμινοξέα (Wallin et al., 1984). Δομικά, διακρίνουμε τρείς περιοχές: i) την αμινοτελική περιοχή στην οποία γίνεται η πρόσδεση με την ζώνη-3 ii) την κεντρική περιοχή όπου προσδένεται η β-σπεκτρίνη και iii) μια περιοχή ευαίσθητη σε πρωτεάσες που ευθύνεται για την αλληλεπίδραση της αγκυρίνης με την σπεκτρίνη και την ζώνη-3. Η πρωτεΐνη αυτή μέσω της πρόσδεσης στη σπεκτρίνη και την ζώνη-3 συνδέει την λιπιδική διπλοστοιβάδα με τον ερυθροκυτταρικό σκελετό (Yiquin & Junfan, 2007). Αδουσίνη (Ζώνη 2.8 και 2.9) Η αδουσίνη ανήκει στις φωσφοπρωτεΐνες και αποτελείται απο δύο σχεδόν όμοιου μοριακού βάρους υπομονάδες (80 κ 81 kda). Κάθε μια από αυτές τις υπομονάδες αποτελείται από τρεις λειτουργικές περιοχές: την αμινοτελική κεφαλή 40 kda, την αυχενική περιοχή 8 kda και την καρβοξυτελική περιοχή, η οποία είναι ανθεκτική σε πρωτεάσες. Μπορεί να εμφανίζεται με την μορφή διμερών ή τετραμερών. Συνήθως η μικρότερη υπομονάδα συνδέεται με την καλμοντουλίνη ενώ ταυτόχρονα δημιουργεί ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο με την μεγάλη υπομονάδα (Franko & Low,2012). Ως προς την λειτουργία της, η αδουσίνη αποτελεί έναν εναλλακτικό τρόπο πρόσδεσης της σπεκτρίνης στην ακτίνη. Αυτή η πρόσδεση γίνεται μέσω καλμοντουλίνης (ασβεστιο-εξαρτώμενη διαδικασία) και όχι μέσω πρωτεϊης 4.1R. Επίσης έχει βρεθεί σύνδεση της αδουσίνης με την φωσφατιδυλοσερίνη αλλά και τα νημάτια ακτίνης στα οποία προσδίδει σταθερότητα (Franko & Low, 2012)

16 Εικόνα 7: Πρόσδεση των νηματίων σπεκτρίνης στη Ζώνη 3 με τη μεσολάβηση της Αγκυρίνης και της πρωτεϊνης 4.2 (Ανατύπωση από Mohandas & Gallagher, 2008) Ζώνη 4.1R Η πρωτεΐνη 4.1R αποτελεί μια από τις κυριότερες πρωτεΐνες για την διατήρηση του υπομεμβρανικου σκελετού των ερυθροκυττάρων. Συναντάται σε δύο ισομορφές, την 4.1a και την 4.1b με μοριακά βάρη 80 και 78 kda, αντίστοιχα (Yiquin & Junfan, 2007). Αλληλεπιδρά με λιπίδια της διπλοστοιβάδας (κυρίως PS και PIP 2 ) αλλά και πρωτεΐνες αυτής (ζώνη 3, GPC, p55) (Yiquin & Junfan, 2007). Λειτουργικά διακρίνεται σε δύο περιοχές: i) την περιοχή SAB στην οποία προσδένεται η σπεκτρίνη ii) την περιοχή που προσδένεται σε GPC και αρνητικά φορτισμένα λιπίδια της διπλοστοιβάδας (Yiquin & Junfan,2007). Παλλιδίνη (Πρωτεΐνη 4.2) Η πρωτεΐνη 4.2 βρίσκεται στην εξωτερική στοιβάδα της διπλοστοιβάδας και είναι παλμιτυλιωμένη και μυριστιλυωμένη κάτι που της επιτρέπει την απευθείας σύνδεση με την εσωτερική στοιβάδα. Η πρωτεΐνη αυτή θεωρείται ότι κατέχει εξέχοντα ρόλο στην διατήρηση της ακεραιότητας του μεμβρανικού σκελετού καθώς αλληλεπιδρά με την ζώνη-3, την αγκυρίνη και το σύμπλεγμα Rhesus. Επίσης συμβάλλει στην επιβίωση του κυττάρου καθώς αλληλεπιδρά και με την πρωτεΐνη CD47 (Satchwell et al., 2009)

17 Δεματίνη (ζώνη 4.9) Η πρωτεΐνη δεματίνη εντοπίζεται στο σύμπλοκο σπεκτρίνης-ακτίνης και σταθεροποιεί τα νημάτια της ακτίνης. Η σταθεροποίηση αυτή οφείλεται στην φωσφορυλίωση της δεματίνης από την camp-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση. Αποτελείται από τρείς υπομονάδες, δύο με όμοιο μοριακό βάρος (48kDa) και μια μεγαλύτερη (52kDa) ενώ η προσδεσή της στις υπόλοιπες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης (Lu et al.,2016). Ακτίνη-Τροπομυοσίνη-Τροπομοντουλίνη (Ζώνη 5) Η ακτίνη συγκροτείται από ινίδια F-ακτίνης που προκύπτουν από τον πολυμερισμό των μονομερών β-ακτίνης. Τα νημάτια F-ακτίνης αποτελούνται από μονομερή μήκους 30-40nm (Yiquin & Junfan, 2007) και έχουν ως ρόλο τη σταθεροποίηση των μορίων δεματίνης. Η τροπομυοσίνη αποτελεί συστατικό του υπομεμβρανικού σκελετού των ερυθροκυττάρων. Έχει σχήμα ράβδου και προσδένεται κατα μήκος των νηματίων ακτίνης μέσω των διμερών α-έλικας που δημιουργεί, μεσολαβώντας στην σταθεροποίηση των νηματίων ακτίνης στο εσωτερικό του ερυθροκυττάρου (Fowler & Bennett,1984). Η τροπομοντουλίνη συνδέεται στο ένα άκρο της ακτίνης και ελέγχει το μήκος των νηματίων της ακτίνης εμποδίζοντας τον πολυμερισμό ή την διάσπασή τους (Fowler V.M., 2013). Πρωτεΐνη p55 Πρόκειται για μια παλμιτυλιωμένη μεμβρανική πρωτεϊνη με μοριακό βάρος 55kDa (Ruff et al., 1991), η οποία δημιουργεί ένα τριμερές σύμπλοκο με τις πρωτεϊνες 4.1R και GPC (Marfatia et al., 1994). Αποτέλεσμα της δημιουργίας αυτού του συμπλόκου είναι η σταθεροποίηση του υπομεμβρανικού σκελετού και η επακόλουθη διατήρηση του σχήματος του ερυθροκυττάρου. Σύμπλοκα ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Όπως προαναφέρθηκε, μία απο τις σημαντικότερες προκλήσεις που καλείται να αντιμετωπίσει το ερυθροκύτταρο κατά την διάρκεια της ζωής του είναι η διατήρηση της ακεραιότητας την μεμβράνης του. Αυτή επιτυγχάνεται με την παρουσία δύο βασικών μακρομοριακών συμπλεγμάτων των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Το πρώτο έχει ώς βάση την αγκυρίνη και το άλλο την πρωτεϊνη 4.1R (Mohandas & Gallagher, 2008). Το σύμπλοκο της αγκυρίνης (ή σύμπλοκο της ζώνης-3) αποτελείται κυρίως από τετραμερή της ζώνης-3 που συνδέονται με την αγκυρίνη και την πρωτεΐνη 4.2, αγκυροβολώντας στον υπομεμβρανικό σκελετό της σπεκτρίνης. Στο σύμπλοκο αυτό συμμετέχει η γλυκοφορίνη Α και το σύμπλοκο Rhesus το οποίο αποτελείται από τις πρωτεΐνες Rh, RhAG, CD47, LW και τα διμερή και GPΒ. Το σύμπλοκο Rhesus και ζώνης-3 δημιουργούν μαζί ένα μακροσύμπλοκο. Ένα άλλο βασικό σύμπλοκο της μεμβράνης είναι το σύμπλοκο ζεύξης, στο οποίο βασικό ρόλο έχει η πρωτεΐνη 4.1R η οποία μέσω ακτίνης, τροπομοντουλίνης, τροπομυοσίνης, δεματίνης και αδουσίνης GPC, και p55 προσδένεται στο σκελετό της σπεκτρίνης

18 Η ύπαρξη αυτών των δύο συμπλόκων είναι που δίνει στο ερυθροκύτταρο τις ιδιότητες που έχουν αναφερθεί και αποτρέπουν την κυστιδιοποίηση της μεμβράνης του (Mohandas & Gallagher,2008). Ένα ακόμη σύμπλοκο μεμβράνης το οποίο συμβάλλει εξίσου στη σταθερότητα της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης είναι το σύμπλοκο μεταφορέα γλυκόζης 1-δεματίνης-αδουσίνης (Khan et al., 2008) Μεταβολισμός ερυθροκυττάρων Τα ερυθροκύτταρα, όπως προαναφέρθηκε, όταν ωριμάσουν και εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος στερούνται πυρήνα, άρα και γονιδιακής έκφρασης, καθώς και όλα τα υπόλοιπα τυπικά οργανίδια που υπάρχουν στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Επομένως για πολλές από τις μεταβολικές τους λειτουργίες εξαρτώνται άμεσα από τους μεταφορείς που βρίσκονται στη μεμβράνη τους. Πιο συγκεκριμένα, η απουσία μιτοχονδρίων συνεπάγεται πλήρη εξάρτηση από την γλυκόλυση για την παραγωγή των απαιτούμενων ποσοτήτων ATP. Η γλυκόζη εισέρχεται συνεχώς στα ερυθροκύτταρα μέσω του μεταφορέα γλυκόζης Glut-1, λόγω της υψηλής συγγένειας που έχει ο μεταφορέας με αυτήν. Επίσης η εξοκινάση (HK) που καταλύει το καθοριστικό βήμα της γλυκόλυσης, διαθέτει χαμηλό Km (σταθερά Michaelis), επομένως υψηλή ευαισθησία για την ενδοκυττάρια γλυκόζη. Με αυτόν τον τρόπο το μονοπάτι της γλυκόλυσης λειτουργεί συνεχώς και τροφοδοτεί το κύτταρο με ATP ακόμα και όταν η γλυκόζη στο πλάσμα είναι σε χαμηλά επίπεδα (Ayako Yachie-Kinosita et al, 2010). Ο σημαντικός ρόλος της διατήρησης των επιπέδων ΑΤΡ σε φυσιολογικά επίπεδα φαίνεται από τις λειτουργίες στις οποίες συμμετέχει το μόριο αυτό. Για παράδειγμα, οι αντλίες ιόντων χρησιμοποιούν το ATP ώστε να μεταβάλλουν την συγκέντρωση των ιόντων στο εσωτερικό των κυττάρων για τη διατήρηση του σχήματός τους στην κυκλοφορία. Επιπλέον, συμμετέχει ως υπόστρωμα με σημαντικές ενζυμικές αντιδράσεις φωσφορυλίωσης κατά την γλυκόλυση και λειτουργεί ως ρυθμιστής της γλυκολυτικής πορείας καθώς αναστέλλει την δράση της φωσφοφρουκτοκινάσης (Ayako Yachie-Kinosita et al., 2010). Το μεγαλύτερο μέρος της γλυκόζης που εισέρχεται στο κύτταρο μετατρέπεται σε γαλακτικό οξύ (περίπου το 87,5%). Το υπόλοιπο εισέρχεται στον κύκλο των φωσφορικών πεντοζών για την παραγωγή μορίων NADPH το οποίο συμμετέχει στην αντίδραση αναγωγής των μορίων οξειδωμένης γλουταθειόνης η οποία αποτελεί το βασικότερο μη ενζυμικό αντιοξειδωτικό συστατικό του κυττάρου (Ayako Yachie-Kinosita et al., 2010). Ένα ακόμη χαρακτηριστικό μεταβολικό μονοπάτι που συναντάται στα ερυθροκύτταρα είναι ο κύκλος Rapoport-Luebering. Κατά το μονοπάτι αυτό παράγονται μεγάλες συγκεντρώσεις του 2,3- διφωσφογλυκερινικού οξέος (2,3-diphosphoglycerate, 2,3-DPG) από το 1,3-διφωσφογλυκερινικό οξύ (1,3-diphοsphoglycerate, 1,3-DPG). Η αύξηση της συγκέντρωσης του 2,3-DPG καταλύει την αποδέσμευση του οξυγόνου από την αιμοσφαιρίνη στους ιστούς. Με αυτόν τον τρόπο η πρόσδεση και η αποδέσμευση των μορίων οξυγόνου, διοξειδίου του άνθρακα και άλλων στην αιμοσφαιρίνη ρυθμίζεται μέσω της γλυκολυτικής πορείας και συγκεκριμένα της επάρκειας μορίων ATP και 2,3-BPG (Ayako Yachie-Kinosita et al., 2010)

19 1.2.5 Αποπτωτικός θάνατος ερυθροκυττάρων Ερυθρόπτωση Η διαδικασία της ερυθρόπτωσης αποτελεί διαδικασία αντίστοιχη της απόπτωσης των εμπύρηνων κυττάρων και ενεργοποιείται σε καταστάσεις στρες (οξειδωτικού στρες, οσμωτικού στρες, έλλειψης ενεργειακών αποθεμάτων κτλ). Αυτό που την χαρακτηρίζει είναι η αύξηση των ιόντων ασβεστίου. Με αυτόν τον τρόπο πρακτικά προστατεύεται ο οργανισμός από πιθανά φαινόμενα αιμόλυσης καθώς η αιμοσφαιρίνη είναι τοξική για τον οργανισμό εαν κυκλοφορεί ελεύθερη σε μεγάλες ποσότητες (Lang & Lang, 2015). Κατά την ερυθρόπτωση ένα πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών λαμβάνει χώρα στο εσωτερικό του ερυθροκυττάρου. Μερικοί από τους σηματοδοτικούς παράγοντες που συμμετέχουν είναι οι κασπάσες, και μία πληθώρα από κινάσες όπως οι Janus-ενεργοποιούμενη κινάση 3, AMP-εξαρτώμενη κινάση, cgmp-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση, κινάση 1α της κασεΐνης, p38 κινάση, πρωτεϊνική κινάση C, και p21-ενεργοποιούμενη κινάση (Lang & Lang, 2015). Η ενεργοποίηση αυτών των μονοπατιών έχει ως αποτέλεσμα πολλές αλλαγές σε κυτταρικό κυρίως επίπεδο για το ερυθροκύτταρο. Οι κυριότερες από τις παρατηρηθείσες αυτές μεταβολές είναι: Αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα Ca 2+ Μείωση του όγκου του ερυθροκυττάρου (συρρίκνωση) λόγω απώλειας ιόντων KCl Κυστιδιοποίηση της μεμβράνης Εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης Αυξημένη ποσότητα κεραμιδίου Η αύξηση της ποσότητας του κυτοσολικού ασβεστίου οδηγεί στην ενεργοποίηση των ασβεστιοεξαρτώμενων καναλιών της μεμβράνης (Gardos) και κατα συνέπεια στην απώλεια ιόντων KCl και την συρρίκνωση του ερυθροκυττάρου. Ο υπομεμβρανικός σκελετός αποδιοργανώνεται και η μεμβράνη αρχίζει να κυστιδιοποιείται εξωτερικεύοντας παράλληλα την φωσφατιδυλοσερίνη λόγω ενεργοποίησης της ασβεστιο-εξαρτώμενης σκραμπλάσης (Abed et al., 2014). Γήρανση Τα ερυθροκύτταρα, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως, δεν έχουν απεριόριστη διάρκεια ζωής. Στις 120 περίπου ημέρες ζωής τους θεωρούνται γηρασμένα και γι αυτό απομακρύνονται από την κυκλοφορία. Κατα τη διάρκεια της κυκλοφορίας στον οργανισμό τα ερυθροκύτταρα έρχονται αντιμέτωπα με μια πληθώρα παραγόντων που μπορούν να οδηγήσουν σε μεταβολικές και φυσιολογικές αλλαγές. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως γήρανση και χαρακτηρίζεται κυρίως από κυστιδιοποίηση της μεμβράνης, μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα, αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων, τροποποίηση στην έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνικών δεικών (νεοαντιγόνα γήρανσης, σύμπλοκο σπεκτρίνης-αιμοσφαιρίνης, CD47) και σε ένα βαθμό, εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης. Τροποποιήσεις της αιμοσφαιρίνης και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις άλλων πρωτεϊνών (πχ. γλυκοζυλίωση και φωσφορυλίωση) αυξάνονται σε σημαντικό βαθμό καθώς λαμβάνει χώρα η διαδικασία της γήρανσης (Antonelou et al., 2010a). Παρότι αυτή η διαδικασία παρουσιάζει κάποια κοινά χαρακτηριστικά με τον αποπτωτικό θάνατο (κυστιδιοποίηση, αύξηση ιόντων ασβεστίου, οξειδωτικές βλάβες κα), υπάρχουν κάποιοι δείκτες οι οποίοι είναι χαρακτηριστικοί της γήρανσης, όπως

20 η συγκρότηση του συμπλόκου σπεκτρίνης-αιμοσφαιρίνης και η απαμιδίωση της πρωτεΐνης 4.1b σε 4.1a. 1.3 Νεφροί: ανατομία, δομή, λειτουργίες Οι νεφροί είναι ένα ζεύγος οργάνων με σχήμα φασολιού και ζυγίζουν περίπου 150 γραμμάρια σε ένα φυσιολογικό άντρα και 135 γραμμάρια σε μία φυσιολογική γυναίκα. Ανατομικά, εδράζονται στην οπισθοπεριτοναϊκή κοιλότητα και συγκεκριμένα ο αριστερός νεφρός εκτείνεται από τον Τ12 θωρακικό μέχρι τον L3 σπόνδυλο, ενώ ο δεξιός είναι ελαφρά μετατοπισμένος προς τα κάτω λόγω της παρουσίας του ήπατος. Έχουν μήκος cm, πλάτος 6 cm, πάχος περίπου 4 cm και καλύπτονται από μία ινώδη κάψα που αποτελείται από συνδετικό ιστό. Η κάψα αυτή βοηθάει στην διατήρηση του σχήματος και της λειτουργικότητας των νεφρών. Οι νεφροί εμφανίζουν τις εξής τρείς κύριες περιοχές: Φλοιός, η εξωτερική περιοχή που βρίσκεται ακριβώς κάτω από την νεφρική κάψα Μυελός, η κεντρική περιοχή που χωρίζεται σε έξω και έσω μυελώδη μοίρα Θηλή, η εσωτερικότερη περιοχή της έσω μυελώδους μοίρας που εκβάλλει στους νεφρικούς θύλακες Οι νεφρώνες είναι οι λειτουργικές μονάδες των νεφρών. Κάθε νεφρός περιέχει περίπου ένα εκατομμύριο νεφρώνες από τους οποίους άλλοι είναι επιφανειακοί φλοιώδεις νεφρώνες και άλλοι παραμυελικοί. Κάθε νεφρώνας αποτελείται από το νεφρικό σπείραμα και τα νεφρικά σωληνάρια. Το νεφρικό σπέιραμα είναι ένα τριχοειδικό δίκτυο που σχηματίζεται από το προσαγωγό αρτηριόλιο. Τα τριχοειδή του σπειράματος περιβάλλονται από την κάψα του Bowman. Τα νεφρικά σωληνάρια αποτελούνται από επιμέρους τμήματα με την εξής σειρά: εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο, εγγύς ευθύ σωληνάριο, αγκύλη Henle, άπω εσπειραμένο σωληνάριο και τα αθροιστικά σωληνάρια. Το κάθε ένα από τα παραπάνω τμήματα εμφανίζει λειτουργική αυτοτέλεια και τα επιθηλιακά κύτταρα που το καλύπτουν εμφανίζουν ευδιακριτες δομές στο μικροσκόπιο (Linda S. Costanzo, Physiology (4 th Ed.)). Οι νεφροί δέχονται περίπου το 25% της καρδιακής παροχής πράγμα απολύτως λογικό αν σκεφτεί κανείς τον κεντρικό τους ρόλο στη διατήρηση του όγκου και της σύστασης των σωματικών υγρών. Το αίμα υπερδιηθείται κατά μήκος των τριχοειδών του σπειράματος στην κάψα του Bowman κάτι που αποτελεί το πρώτο βήμα στη διαδικασία παραγωγής ούρων. Οι νεφροί αποβάλλουν με τα ούρα την περίσσεια κάθε συστατικού του αίματος, ώστε η περιεκτικότητά του να βρίσκεται σε φυσιολογικά επίπεδα, όλες τις ξένες προς τον οργανισμό ουσίες, όπως για παράδειγμα τα φάρμακα καθώς και την περίσσεια νερού. Τέλος ως ενδοκρινή όργανα συνθέτουν και εκκρίνουν τρείς ορμόνες, την ρενίνη, την ερυθροποιητίνη και την 1,25- διυδρόξυχοληκαλσιφερόλη ενώ ταυτόχρονα είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση της βιταμίνης D ώστε να γίνει δραστική για τον οργανισμό (GUITON A. Human Physiology and Mechanisms of disease (5 th Ed). W.B. Saunders Company: Philadelphia, 1992)

21 1.3.1 Ερυθροποιητίνη Η ερυθροποιητίνη είναι μια πρωτεΐνη μήκους 166 αμινοξέων με μοριακό βάρος 39 kda. Ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων και έχει ορμονική κυρίως δράση. Είναι έντονα γλυκοζυλιωμένη και περιέχει περίπου κατά 40% σιαλικά οξέα. Είναι αρκετά υδρόφοβο μόριο και περιέχει ακρετούς δισουλφιδικούς δεσμούς για την διατήρηση της δομής και της λειτουργίας της (Jelkmann W., 1992). Όπως προαναφέρθηκε, παράγεται στους νεφρούς ως απόκριση στην υποξία. Τα κύτταρα που ανταποκρίνονται στην υποξία φαίνεται πως αναγνωρίζουν τις αλλαγές στην περιεκτικότητα του διαλυμένου οξυγόνου και την ικανότητα πρόσδεσής του στην αιμοσφαιρίνη και πυροδοτούν την παραγωγή της ορμόνης, η οποία με τη σειρά της διεγείρει το μυελό των οστών προς παραγωγή περισσοτέρων ερυθροκυττάρων και αιμοσφαιρίνης για τη μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς. Αντιθέτως, όταν οι νεφροί ανιχνεύσουν περίσσεια οξυγόνου προς απελευθέρωση στους ιστούς, όπως σε πρωτοπαθή πολυκυτταραιμία, ελαττώνουν την έκκριση ερυθροποιητίνης. Υψηλά επίπεδα αιμοσφαιρίνης ή αιματοκρίτη αναστέλλουν την απελευθέρωση της ερυθροποιητίνης (Jelkmann W., 1992). Εικόνα 8: Μοριακός μηχανισμός δράσης της ερυθροποιητίνης (Ανατύπωση από Sankaran & Weiss)

22 Η κύρια δράση της ορμόνης συνίσταται στην προαγωγή της ωρίμανσης συγκεκριμένων πρόδρομων μορφών της ερυθράς σειράς στο μυελό των οστών όπως των BFU-E (Burst Forming Unit Erythroid) και CFU-E (Colony Forming Unit Erythroid), τα οποία μεταπίπτουν στην αμέσως επόμενη σειρά ωρίμανσης, την ερυθροβλάστη. Η απουσία της ορμόνης από το μικροπεριβάλλον του κυττάρου οδηγεί σε απόπτωση των συγκεκριμένων κυτταρικών σειρών και συνεπώς σε αναστολή της διαδικασίας ωρίμανσης της ερυθράς σειράς. Ανασταλτική επίδραση ασκεί η παρουσία οιστρογόνων ενώ αντίθετα τα ανδρογόνα και οι θυρεοειδικές ορμόνες ενεργοποιούν την δράση της ορμόνης (Jelkmann W., 1992) Νεφρική ανεπάρκεια Ως Χρόνια Νεφρική Ανεπάρκεια (ΧΝΑ) ορίζεται ως η απώλεια της φυσιολογικής λειτουργίας των νεφρών και υπολογίζεται από τη μέτρηση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR), ο οποίος ορίζεται ως ο όγκος του πλάσματος που φιλτράρεται από τα νεφρά στη μονάδα του χρόνου (1min). Με βάση τις διεθνείς οδηγίες οι ασθενείς που πάσχουν από νεφρική ανεπάρκεια κατηγοριουποιούνται στα εξής στάδια: Στάδιο 1: φυσιολογικός GFR 90 ml/min ανά 1.73 m 2 και αλβουμινουρία Στάδιο 2: GFR μεταξύ 60 και 89 ml/min ανά 1.73 m 2 Στάδιο 3: GFR μεταξύ 30 και 59 ml/min ανά 1.73 m 2 Στάδιο 4: GFR μεταξύ 15 και 29 ml/min ανά 1.73 m 2 Στάδιο 5: GFR of < 15 ml/min ανά 1.73 m 2 ή αλλίως νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου (End Stage Renal Disease) (Thomas et al., 2008) Τα αίτια της νεφρικής νόσου είναι ποικίλα. Τα κυριότερα συνοψίζονται στα εξής: 1. πρωτοπαθή νεφρικά νοσήματα σπειραματονεφροπάθειες (σπειραματονεφρίτιδα) διαμεσοσωληναριακές νεφροπάθειες (χρόνια πυελονεφρίτιδα) 2. αποφρακτικές νεφροπάθειες απόφραξη κατώτερου ουροποιητικού συστήματος (υπερτροφία προστάτη) απόφραξη ανώτερου ουροποιητικού συστήματος (νεφρολιθίαση, στενώματα ουρήθρας) 3. κληρονομικές ή συγγενείς νεφρικές παθήσεις πολυκυστική νόσος των νεφρών οικογενειακή νεφρίτιδα (σύνδρομο Alport) 4. συστηματικές παθήσεις ή τοξικά αίτια που προσβάλλουν τους νεφρούς Σακχαρώδης Διαβήτης Αθηροσκλήρυνση Αρτηριακή υπέρταση (κακοήθης) Νεφροπάθεια από αναλγητικά Αυτοάνοσα νοσήματα (Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος-ΣΕΛ) Ουρική αρθρίτιδα (Gabriel R.,1993)

23 Τα βασικότερα συμπτώματα της νόσου αυτής περιλαμβάνουν την αυξημένη ποσότητα αλβουμίνης στα ούρα, την αιματουρία, τη μειωμένη παραγωγή ούρων, τα οιδήματα στα άκρα, την υπέρταση, τη συχνοουρία και τη μειωμένη πνευματική εγρήγορση, ενώ το βασικότερο αιματολογικό σύμπτωμα είναι η αναιμία Αναιμία Αναιμία είναι η παθολογική κατάσταση κατά την οποία η τιμή της αιμοσφαιρίνης (Hb), του αιματοκρίτη (Hct) ή/και των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBCs) είναι κάτω των φυσιολογικών επιπέδων. Όσον αφορά τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας προτείνει ότι αναιμία χαρακτηρίζεται η κατάσταση κατά την οποία η αιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από 13 g/dl στους άντρες ή σε μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες και χαμηλότερες από 12 g/dl στις πρόεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Thomas et al., 2008). Η αναιμία εμφανίζεται σε όλα τα στάδια της ΧΝΑ σε διαφορετικά όμως ποσοστά και επίπεδα, αναλόγως το στάδιο. Περίπου το 25% των ασθενών του πρώτου σταδίου, το 50% των σταδίων 2,3 και 4 και το 75% των ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου πάσχουν από αναιμία (Zoccali et al, 2009). Παρ όλο που η αναιμία στη ΧΝΑ είναι αποτέλεσμα πολλαπλών μηχανισμών (έλλειψης σιδήρου, βιταμίνης B12, φυλλικού οξέος, γαστρεντερικής αιμορραγίας, υπερπαραθυροειδισμού, συστημικής φλεγμονή και μειωμένης επιβίωσης των ερυθροκυττάρων), η μειωμένη ικανότητα σύνθεσης της ερυθροποιητίνης είναι η κύρια αιτία που την προκαλεί Μεταβολές στο αιματολογικό πρότυπο στη ΧΝΑ Στους ασθενείς με ΧΝΑ ο συνολικός αριθμός ερυθροκυττάρων, η αιμοσφαιρίνη και ο αιματοκρίτης είναι μειωμένα λόγω της ανεπαρκούς σύνθεσης ερυθροποιητίνης ως αποτέλεσμα της μειωμένης λειτουργίας των νεφρών (Suresh et al., 2012). Παράλληλα τα ερυθοκύτταρα των ασθενών αυτών χαρακτηρίζονται από μειωμένη διάρκεια ζωής, η οποία είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αζώτου της ουρίας του αίματος (blood urea nitrogen, BUN) των ασθενών. Η μειωμένη διάρκεια ζωής των ερυθροκυττάρων έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με τα επίπεδα των ουραιμικών τοξινών που υπάρχουν σε περίσσεια στο αίμα των ασθενών (Ly et al., 2004). Το ουραιμικό πλάσμα, το οποίο χαρακτηρίζεται από συσσώρευση παραπροϊόντων του μεταβολισμού (ουραιμικές τοξίνες), προκαλεί εξωτερίκευση της PS στα ερυθροκύτταρα με αποτέλεσμα την πρόωρη απομάκρυνσή τους από την κυκλοφορία, χωρίς όμως να γίνεται άμεση αντικατάστασή τους λόγω μειωμένης παραγωγής ερυθροποιητίνης (Suresh et al., 2012). Η οσμωτική ευθραυστότητα των ερυθροκυττάρων στη ΧΝΑ παρατηρείται αυξημένη, δηλαδή τα κύτταρα λύονται ευκολότερα ακόμη σε ισοσμωτικό περιβάλλον σε σχέση με τα κύτταρα των υγειών προκαλώντας ευκολότερα αιμόλυση (Brzeszczynska et al., 2008). Τα αυξημένα επίπεδα αιμόλυσης, δηλαδή η αυξημένη ελεύθερη αιμοσφαιρίνη στο αίμα, προκαλούν περαιτέρω βλάβες. Η αιμοσφαιρίνη, όπως προαναφέρθηκε, όταν βρίσκεται ελεύθερη στο αίμα είναι τοξική για τον οργανισμό και φυσιολογικά απομακρύνεται από τα νεφρά. Στη ΧΝΑ όμως τα νεφρά δεν μπορούν να επιτελέσουν

24 σωστά αυτήν την λειτουργία και άρα η αιμοσφαιρίνη παραμένει στον οργανισμό για μεγάλα χρονικά διαστήματα σχηματίζοντας ακόμα πιο τοξικά παράγωγα και αλληλεπιδρώντας με τους γύρω ιστούς και τα ενδοθήλια. Η συνεχής αλληλεπίδραση αιμοσφαιρίνης, αίμης και σιδήρου οδηγεί σε έναν κύκλο οξειδωτικών αντιράσεων οδηγώντας σε κυτταρικές βλάβες που επιδεινώνουν την αιμόλυση (Suresh et al., 2012). Η μεμβρανική αστάθεια, η κυστιδιοποίηση της μεμβράνης, οι μορφολογικές τροποποιήσεις αλλά και η αναδιάρθρωση της πρωτεϊνικής σύστασης των ερυθροκυττάρων αποτελούν κάποιες από τις βασικές μεταβολές που χαρακτηρίζουν τα ερυθροκύτταρα στη ΧΝΑ (Antonelou et al., 2011 Georgatzakou et al., 2016). Πιο συγκεκριμένα, έχουν βρεθεί μεταβολές στη ζώνη-3 και τη σπεκτρίνη που λόγω οξειδωτικού στρες αποικοδομούνται σε θραύσματα, με αποτέλεσμα την αλλοίωση της δομής του υπομεμβρανικού σκελετού και κατα συνέπεια του σχήματος των ερυθροκυττάρων. Μείωση έχει παρατηρηθεί στα επίπεδα των πρωτεϊνών παλλιδίνη, ακτίνη, στοματίνη, CD47, ενώ αύξηση στην υδατοπορίνη-1, υπεροξειρεδοξίνη-2, HSP-70, καλπαΐνη και στις ουμπικουιτινιλιωμένες πρωτεΐνες (Antonelou et al., 2011). Επιπλέον, κάποιες χαρακτηριστικές μορφολογικές μεταβολές των ερυθροκυττάρων που έχουν βρεθεί στο αίμα των ασθενών με ΧΝΑ είναι τα εχινοκυτταρα, τα στοματοκυτταρα, τα κνιζοκύτταρα, τα δακρυοκύτταρα και τα σφαιροκύτταρα (Antonelou et al., 2011) Αιμοκάθαρση- Τεχνητός νεφρός Αιμοκάθαρση (ΑΙΚ) είναι η διαδικασία εκείνη κατά την οποία το αίμα φιλτράρεται μέσα από τις ημιδιαπερατές μεμβράνες για τη μεταφορά διαλυτών ουσιών (ουρία, κρεατινίνη κ.α.) από το αίμα του ασθενή προς το υγρό αιμοκάθαρσης και αντίθετα, ενώ πραγματοποιείται και απομάκρυνση της περίσσειας νερού από το αίμα του ασθενή. Η μεταφορά των ουσιών στη συμβατική αιμοκάθαρση βασίζεται στο φαινόμενο της διάχυσης, όπου οι ουραιμικές τοξίνες που βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση στο αίμα μεταφέρονται μέσω διάχυσης στο διάλυμα της αιμοκάθαρσης το οποίο ρέει αντίθετα προς τη κατεύθυνση του αίματος. Από τις φυσιολογικές λειτουργίες των νεφρών η θεραπεία με αιμοκάθαρση υποκαθιστά μερικώς μόνο (~10%) την απέκκριση των ηλεκτρολυτών, του νερού και των άχρηστων προϊόντων του μεταβολισμού. Οι ορμονικές και μεταβολικές διαταραχές δεν είναι δυνατόν να διορθωθούν με αυτή τη μέθοδο, καθώς ο τεχνητός νεφρός υποκαθιστά τη νεφρική λειτουργία, αλλά δεν μπορεί να υποκαταστήσει την ορμονική λειτουργία των νεφρών. Αυτό πρέπει να γίνει με απευθείας χορήγηση των ορμονών στους ασθενείς. Η κάθαρση του αίματος επιτυγχάνεται με την κυκλοφορία του αίματος στον τεχνητό νεφρό ο οποίος αποτελείται από τρία κύρια μέρη: α) το μηχάνημα της αιμοκάθαρσης, β) το φίλτρο αιμοκάθαρσης και γ) το σύστημα παρασκευής και τροφοδοσίας του υγρού αιμοκάθαρσης. Το μηχάνημα της αιμοκάθαρσης διευκολύνει και ελέγχει την κυκλοφορία του αίματος και του υγρού αιμοκάθαρσης από και προς το φίλτρο. Η τεχνική αυτή απαιτεί παρακέντηση του ασθενή με δυο βελόνες, μια στη φλέβα και μια στην αρτηρία

25 Εικόνα 9: Διαγραμματική απεικόνηση διαδικασίας αιμοκάθαρσης (πηγή: Βιβλίο Βιολογίας Γενικής Παιδείας Α Λυκείου, κεφάλαιο 6) Επίδραση της αιμοκάθαρσης στο αιματολογικό πρότυπο των ασθενών Μελέτες που έχουν γίνει σε αίμα ασθενών πριν και μετά από την αιμοκάθαρση καταλήγουν σε πληθώρα αιματολογικών μεταβολών που προκύπτουν από αυτή τη διαδικασία. Πιο συγκεκριμένα, έχουν παρατηρηθεί αυξημένα επίπεδα των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) τόσο πριν όσο και μετά τη διαδικασία της ΑΙΚ (Antonelou et al., 2011). Αυτό υποδηλώνει πως η διαδικασία δεν επιφέρει επιπλέον οξειδωτικό στρες στα κύτταρα, απλώς αδυνατεί να αναστρέψει το υψηλό οξειδωτικό φορτίο στο αίμα των ασθενών. Όσον αφορά την ενεργοποίηση των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων του αίματος, έχει αποδειχθεί ότι αυτή επάγεται μετά την αιμοκάθαρση αφού οι επιφανειακοί δείκτες CD14 και CD11b των μονοκυττάρων παρουσιάζονται αυξημένοι (Pereira et al., 2010). Η μεμβρανική αστάθεια είναι ένα ακόμα στοιχείο που χαρακτηρίζει τα ερυθροκύτταρα των ασθενών που υποβάλλονται σε ΑΙΚ. Αυτή οφείλεται στις μεταβολές σε πρωτεϊνικό κυρίως επίπεδο και συγκεκριμένα στις πρωτεΐνες του υπομεμβρανικού σκελετού όπου παρατηρείται μείωση της σπεκτρίνης και αύξηση της ζώνης-3 (Costa et al., 2008b). Ταυτόχρονα έχει παρατηρηθεί μείωση των επιπέδων της υδατοπορίνης-1, των ουμπικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών, αύξηση της υπεροξειρεδοξίνης- 2 και αύξηση της κυστιδιοποίησης της μεμβράνης. Το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των ερυθροκυτταρικών πρωτεϊνών παρουσιάζει πρωτεΐνες με μεγαλύτερο μοριακό βάρος και περισσότερα θραύσματα πρωτεϊνών λόγω αυξημένης πρωτεόλυσης. Παράλληλα, η μεμβράνη υφίσταται πάρα

26 πολλές τροποποιήσεις ως αποτέλεσμα της αιμοκάθαρσης. Πιο συγκεκριμένα, η υδατοπορίνη-1, οι ουμπικουιτινιλιωμένες πρωτεΐνες, το σύμπλοκο σπεκτρίνης-αιμοσφαιρίνης αλλά και ο μεμβρανικός δείκτης CD47, που αποτελεί αναστολέα της ερυθροφαγοκυττάρωσης, παρουσιάζονται μειωμένα. Από την άλλη εμφανίζεται αυξημένη πρόσδεση κυτοσολικών πρωτεϊνών στη μεμβράνη, αυξημένη πρωτεόλυση και καρβονυλίωση και αύξηση στα επίπεδα υπεροξειρεδοξίνης-2, ως δείκτες κυτταρικής γήρανσης και αμυντικής ανταπόκρισης των κυττάρων στο οξειδωτικό περιβάλλον (Antonelou et al, 2011). Επιπρόσθετα, έχει αποδειχθεί ότι η αιμοκάθαρση προκαλεί αυξημένη εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης στην μεμβράνη των ερυθροκυττάρων, που αποτελεί δείκτη ταχείας απομάκρυνσης των ερυθροκυττάρων από την κυκλοφορία, συμβάλλοντας έτσι περαιτέρω στην αναιμία (Abed et al., 2014). Όσον αφορά στο αντιοξειδωτικό δυναμικό, έχουν γίνει αναφορές για αύξηση της ενεργότητας της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) αλλά και αύξηση των επιπέδων λιπιδικής υπεροξείδωσης της μεμβράνης η οποία προκαλεί αλλαγές στη γενικότερη δομή των ερυθροκυττάρων (Brzeszczynska et al, 2008). Παρόλα αυτά, η ευεργετική μερικώς δράση της ΑΙΚ παρουσιάζεται από τη μείωση των εχινοκυττάρων στο αίμα των ασθενών μετά την αιμοκάθαρση που φαίνεται να σχετίζεται με τα επίπεδα των ROS και του Ca 2+ που μειώνονται με την διαδικασία (Antonelou et al, 2011). Τα επίπεδα της σπεκτρίνης, της υδατοπορίνης-1, των ουμπικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών, της καλπαΐνης και του συμπλόκου σπεκτρίνης-αιμοσφαιρίνης εμφανίζουν τάσεις αποκατάστασης προς τα φυσιολογικά επίπεδα μετά το τέλος της συνεδρίας αιμοκάθαρσης, ενώ η οσμωτική ευθραυστότητα φαίνεται επίσης να βελτιώνεται (Antonelou et al., 2011) Θεραπεία αναιμίας της ΧΝΑ με χρήση ερυθροποιητίνης Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η αναιμία είναι ένα από τα πιο κοινά συμπτώματα του αιματολογικού συστήματος που εμφανίζουν οι ασθενείς με ΧΝΑ. Κυρίως οφείλεται στη μειωμένη ικανότητα των νεφρών να παράγουν την ορμόνη ερυθροποιητίνη. Πλέον με την παραγωγή ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (rhepo) η θεραπεία της αναιμίας είναι αρκετά εύκολη, αποφεύγοντας τη μετάγγιση μονάδων αποθηκευμένων ερυθροκυττάρων και των επιπλοκών που περιλαμβάνουν αυτές (Pinevich & Petersen, 1992). Δοσολογία της ερυθροποιητίνης Η δοσολογία της ερυθροποιητίνης έχει καθοριστεί με αυστηρά όρια για τους ασθενείς με ΧΝΑ τελικού σταδίου και δεν διαφέρει για περιπτώσεις πρίν ή μετά την αιμοκάθαρση. Η δόση στα αρχικά στάδια περιορίζεται στα units ανα kg σωματικού βάρους ανά ένεση, χορηγούμενη ενδοφλεβικά ή υποδόροια 3 φορές την εβδομάδα. Η δοσολογία θα πρέπει να είναι ελεγχόμενη και να συμβαδίζει με την τιμή του αιματοκρίτη. Συγκεκριμένα όταν ο αιματοκρίτης βρίσκεται μεταξύ 0,30 και 0,33 ή αυξάνεται κατα 0,04 σε διάστημα 2 εβδομάδων τότε η δόση θα πρέπει να μειωθεί. Το ίδιο θα πρέπει να συμβεί εάν ο αιματοκρίτης φτάσει στο 0,36 (Pinevich & Petersen, 1992). Μια μέση δόση ερυθροποιητίνης είναι περίπου στα 75 units ανα kg σωματικού βάρους για τρεις φορές την εβδομάδα αλλά μπορεί να ποικίλει από 12,5-525 units ανα kg σωματικου βάρους

27 Επίσης ανάλογα με τον τρόπο χορήγησης διαμορφώνεται και η δόση και συνήθως στην υποδόροια είναι μικρότερη απ ότι στην ενδοφλέβια (Pinevich & Petersen, 1992) Αντίσταση στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Η θεραπεία με ερυθροποιητίνη δεν αποτελεί πανάκεια καθώς ένα ποσοστό των ασθενών δεν ανταποκρίνονται επαρκώς σε αυτήν. Ως αντίσταση στην ερυθροποιητίνη ορίζεται η αποτυχία επίτευξης των επιθυμητών επιπέδων αιμοσφαιρίνης/αιματοκρίτη παρά την χορήγηση υψηλότερων από το συνηθισμένο δόσεων ερυθροποιητίνης, ή η συνεχής ανάγκη παροχής υψηλών δόσεων του φαρμάκου ώστε να διατηρηθούν τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης σε φυσιολογικές τιμές (Afsar et al., 2013) Αίτια ανθεκτικότητας στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Όπως αναγράφεται και παραπάνω, δεν ανταποκρίνονται όλοι οι ασθενείς με ΧΝΑ στην θεραπεία με ερυθροποιητίνη, καθώς ένα ποσοστό περίπου 5-10% των ασθενών ανταποκρίνονται μόνο σε πολύ υψηλές δόσεις ερυθροποιητίνης. Οι κύριοι λόγοι για τους οποίους συμβαίνει αυτό είναι η επαγωγή φλεγμονής, το οξειδωτικό στρες και η έλλειψη σιδήρου, ενώ η απώλεια αίματος, ο υπερπαραθυροειδισμός και η έλλειψη σε βιταμίνη B12 και φυλικό οξύ χαρακτηρίζονται ως δευτερεύοντες λόγοι. Η φλεγμονή χαρακτηρίζει τη ΧΝΑ από τα πρώτα κιόλας σταδία της. Η έκρηξη της παραγωγής κυτταροκινών, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α), η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), η ιντερλευκίνη-6 (IL-6), και η ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) είναι ο λόγος για την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης (CRP, φιμπρινογόνο), την μείωση των επιπέδων αλβουμίνης (Costa et al., 2009), τρανσφερίνης αλλά και του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Bamgbola et al., 2011). Πράγματι στους μη ανταποκρινόμενους στη θεραπεία ασθενείς, οι πρωτεϊνες οξείας φάσης βρίσκονται σε μεγαλύτερα επίπεδα ενισχύοντας την θεωρία για ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ φλεγμονής και μη ανταπόκρισης (Costa et al., 2009). Εξ αιτίας της ύπαρξης των φλεγμονώδων αυτών παραγόντων, τα λευκά αιμοσφαίρια προσελκύονται στις εστίες φλεγμονής προκειμένου να συμβάλλουν στην άμυνα του οργανισμού και παράγουν μεγάλες ποσότητες ελεύθερων οξειδωτικών ριζών και πρωτεολυτικών ενζύμων. Τα ερυθροκύτταρα των ασθενών, ιδίως των μη ανταποκρινόμενων, είναι αρκετά ευαίσθητα τόσο στο οξειδωτικό στρές όσο και στην πρωτεόλυση δημιουργώντας έτσι μεγαλύτερα προβλήματα στην φυσιολογική τους λειτουργία. Τελικά ο χρόνος ζωής τους μειώνεται και εντείνεται ακόμα περισσότερο το φαινόμενο της αναιμίας στους ασθενείς Αιματολογικό πρότυπο ασθενών που ανταποκρίνονται ή όχι στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη Στο αιματολογικό πρότυπο των μη ανταποκρινόμενων ασθενεών, έχουν παρατηρηθεί πολύ χαμηλότερες τιμές αιματοκρίτη και αιμοσφαιρίνης, MCH, MCHC και RWD σε σχέση με τους ανταποκρινόμενους στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη, ενώ τα ερυθροκυτταρά τους εμφανίζονται

28 υποχρωμικά λόγω μικρότερης ποσότητας αιμοσφαιρίνης. Η ανθεκτικότητα στην ερυθροποιητίνη δε σχετίζεται με μεταβολές στον MCV και τους δείκτες σιδήρου (Gallucci et al.,1999). Όσον αφορά στη σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, έχουν βρεθεί μειωμένα επίπεδα πρωτεολυτικών θραυσμάτων των μονομερών της ζώνης-3 (Costa et al., 2008a) καθώς επίσης και της σπεκτρίνης υποδηλώνοντας μεταβολές στον υπομεμβρανικό σκελετό (Costa et al., 2008b). Μεγαλύτερες μειώσεις στην σπεκτρίνη παρατηρούνται μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης στους ασθενείς αυτούς (Costa et al., 2008b), ενώ κατά την επώαση ερυθροκυττάρων (που λαμβάνονται μετά την ΑΙΚ) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ελαστάσης, δεν παρατηρούνται σημαντικές μεταβολές στο πρότυπο των πρωτεΐνών της μεμβράνης (Pereira et al., 2011). Από την άλλη πλευρά, η ποσότητα της μαλονδυαλδεΰδης, ο αριθμός των δικτυοερυθροκυττάρων, και η ελεύθερη αιμοσφαιρίνη του πλάσματος παρουσιάζουν μεγαλύτερες τιμές στους ανταποκρινόμενους ασθενείς (Gallucci et al.,1999). Η ερυθροποίηση η οποία εμφανίζεται αυξημένη στου ασθενείς που λαμβάνουν ερυθροποιητίνη οδηγεί στην παραγωγή νεαρότερων ερυθροκυττάρων στο αίμα τα οποία όμως λόγω οξειδωτικού περιβάλλοντος έχουν υποστεί βλάβες, οι οποίες έχουν προσδιοριστεί κυρίως μέσω της ζώνης-3 (Costa et al., 2008b). Η παραγωγή οξειδωτικών ριζών και η υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης των ερυθροκυττάρων φαίνεται να μειώνεται με την χορήγηση της rhepo στους ασθενείς που ανταποκρίνονται στην θεραπεία (Boran M et al., 1998) αυξάνεται όμως η εισροή ιόντων Ca 2+ στα ερυθροκύτταρα γεγονός που εξηγεί την ανικανότητα της ερυθροποιητίνης να καταστέλλει καθολικά την ερυθρόπτωση στα ώριμα ερυθροκύτταρα (Vota et al., 2013). Πέραν όμως από τις διαφορές μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη ασθενών οι δύο ομάδες παρουσιάζουν και αρκετές ομοιότητες. Συγκεκριμένα η συνεδρία της αιμοκάθαρσης πυροδοτεί την αύξηση των φλεγμονωδών παραγόντων στο αίμα (πχ. CRP) όλων των ασθενών, όπως και την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και των μονοκυττάρων (Pereira et al 2010). Επιπλέον, πειράματα που έχουν γίνει χρησιμοποιώντας ελαστάση, η οποία παράγεται από τα ουδετερόφιλα σε καταστάσεις φλεγμονής, δείχνουν αυξημένη ευαισθησία των ερυθροκυττάρων σε αυτήν πριν από την διαδικασία της αιμοκάθαρσης, καθώς επηρεάζονται αρνητικά τα επίπεδα αγκυρίνης και σπεκτρίνης στην ερυθροκυτταρική μεμβράνη (Pereira et al, 2011) Επίδραση της ερυθροποιητίνης στα ερυθροκύτταρα in vivo και in vitro Έχει αποδειχθεί ότι η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη που χρησιμοποιείται για την θεραπεία της αναιμίας στη ΧΝΑ, εκτός από την επίδραση που έχει στους ερυθροβλάστες έχει και την ικανότητα να προσδένεται πάνω στα ώριμα ερυθροκύτταρα και συγκεκριμένα σε μερικούς υποδοχείς που έχει βρεθεί ότι υπάρχουν στην επιφάνεια της μεμβράνης τους. Αυτή η αλληλεπίδραση αυξάνει την βιωσιμότητα των ερυθροκυττάρων και καταστέλλει ως ένα βαθμό την ερυθρόπτωση Ακόμα μειωνει την εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης στη μεμβράνη (Myssina et al., 2003). Πειράματα που έχουν γίνει σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια που υπερεκφράζουν την ορμόνη δίνουν μια ακόμα πιο ξεκάθαρη εικόνα για τις ιδιότητες της. Τα ερυθροκύτταρα των ζώων αυτών είναι πιο επιρρεπή στην απόπτωση όμως παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντίσταση στην επαγώμενη οσμωτική τους λύση πιθανόν λόγω αυξημένης εισροής ιόντων Ca 2+ και αυξημένης ενεργότητας καναλιών Κ +. Ο μέσος όγκος ερυθροκυττάρων εμφανίζει μεγαλύτερες τιμές ενώ ο δείκτης RWD είναι

29 περίπου τρείς φορές μεγαλύτερος σε σχέση με τους αντίστοιχους των μη διαγονιδιακών ζώων. Μετρώντας το μέγεθος των ερυθροκυττάρων με κυτταρομετρία ροής φάνηκε πως τα ερυθροκύτταρα των ποντικών αυτών ήταν σημαντικά μικρότερα σε σχέση με αυτό των ερυθροκυττάρων των ποντικών αγρίου τύπου γεγονός που όταν από το διάλυμα επώασης αφαιρέθηκε η ερυθροποιητίνη, το ποσοστό των ανώριμων ερυθροκυττάρων ήταν σαφώς μεγαλύτερο όπως ήταν αναμενόμενο (Foller et al, 2007). Επιπλέον, η ερυθροποιητίνη είναι προστατευτική και ως προς εξωτερικούς οξειδωτικούς παράγοντες (Choudhury TD et al., 1999) καθώς αποτρέπει την παραγωγή οξειδωτικών ριζών και την υπεροξείδωση των λιπιδίων (Boran M et al, 1998) που προκαλούν αναδιοργάνωση του πρωτεϊνικού σκελετού των κυττάρων. Τέλος, μετά από πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί σε δείγμα αίματος ποντικών που δεν είχαν πρόσβαση σε τροφη παρουσιάστηκε ανάκτηση της ενεργότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), καταλάση (CAT), γλουταθειόνη (GSH) και αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PD) καθώς και των ΑΤΡασών μαγνησίου (Mg 2+ ), καλίου (Κ + ), ασβεστίου (Ca 2+ ) και νατρίου (Na + ), ύστερα από χορήγηση ερυθροποιητίνης (Chakraborty et al., 1988)

30 2. Σκοπός της εργασίας Η συγκεκριμένη εργασία έχει ως σκοπό την μελέτη των επιδράσεων της θεραπείας με ερυθροποιητίνη και της διαδικασίας της αιμοκάθαρσης σε ασθενείς που πάσχουν από Χρόνια Νεφρική Ανεπάρκεια τελικού σταδίου και υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε λήψη ολικού αίματος από: 1) ασθενείς που λαμβάνουν πολύ υψηλά επίπεδα δόσεων ερυθροποιητίνης (Ν=8, μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς), 2) ασθενείς που λαμβάνουν φυσιολογικά επίπεδα δόσεων ερυθροποιητίνης (Ν=10,ανταποκρινόμενοι), τόσο πριν όσο και μετά από την διαδικασία της αιμοκάθαρσης, καθώς και από υγιείς δότες (Ν=15) για τη μελέτη του αιματολογικού και βιοχημικού προτύπου, χαρακτηριστικών του πλάσματος, ερυθροκυτταρικών παραμέτρων και της πρωτεϊνικής σύστασης της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης

31 3. Υλικά & Μέθοδοι 3.1 Λευκαφαίρεση και αιμοπεταλιαφαίρεση σε κολώνες κυτταρίνης Αρχή μεθόδου Με την ανάμειξη δύο διαφορετικών κυτταρινών δημιουργείται στήλη με πόρους ποικίλων διαστάσεων μέσα από τους οποίους διέρχεται το ολικό αίμα υπό την επίδραση της δύναμης της βαρύτητας. Ο διαχωρισμός των ερυθροκυττάρων από τα λευκά αιμοσφαίρια στηρίζεται στο γεγονός ότι τα λευκά αιμοσφαίρια λόγω μεγάλου μεγέθους δεν μπορούν να διαπεράσουν τους πόρους που δημιουργούνται, άρα κατακρατούνται στις κολώνες. Αντίστοιχα τα αιμοπετάλια λόγω μικρού μεγέθους χρειάζονται αρκετή ώρα να περάσουν από τους πόρους ή παγιδεύονται στους πολύ μικρούς πόρους. Έτσι τα ερυθροκύτταρα διαπερνούν γρήγορα το τεχνητο αυτό φιλτρο και συλλέγονται στο κάτω μέρος της κολώνας (Beutler E. et al, 1976). Υλικά-Αντιδραστήρια: Κυτταρίνη-α Falcon, 50ml Διάλυμα PBS (310mosm), (5mM PO4/150mM NaCl, ph 8.0) Πιπέτες Pasteur Κυτταρίνη Sigmacell type 50 Σύριγγες, 10ml Ψυχόμενη επιτραπέζια φυγόκεντρος Heraus, κεφαλή #3344 Πειραματική διαδικασία: 1) Αραίωση των πακεταρισμένων ερυθροκυττάρων με διάλυμα PBS 310 mosm. 2) Ακολουθεί ανάμειξη των κυτταρινών, το μείγμα μεταφέρεται σε κολώνες και εμποτίζεται με διάλυμα PBS. 3) Προσθήκη του δείγματος στη στήλη. 4) Σταδιακά συλλέγεται το δείγμα που περνάει από τη στήλη. 5) Ακολουθούν πλυσίματα με διάλυμα PBS σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (4 C), για την απομάκρυνση των κυτταρινών. 3.2 Απομόνωση ερυθροκυτταρικών μεμβρανών Αρχή μεθόδου Σε απομονωμένα ερυθροκύτταρα προστίθεται το διάλυμα λύσης (υπότονο 20mosm). Με αυτόν τον τρόπο προκαλείται οσμωτική λύση των ερυθροκυττάρων δηλαδή δημιουργία ρηγμάτων στην ερυθροκυτταρική μεμβράνη και απελευθέρωση του κυτοσολίου. Έτσι μετά από τις διαδοχικές πλύσεις και φυγοκεντρήσεις οι μεμβράνες παραμένουν ως ίζημα στον πυθμένα των σωλήνων (Dodge J. et al, 1963)

32 Υλικά-Αντιδραστήρια Διάλυμα λύσης (υπότονο 20mosm) (Na2HPO4 2H2O 5mM /NaH2PO4 H2O 5mM /0,3mM PMSF, ph 8.0, 4 C) Διάλυμα φωσφορικών 50mM (50P8) (Na2HPO4 2H2O 50mM, NaH2PO4H2O 50mM, ph 8.0) Αναστολέας πρωτεασεών PMSF (Phenyl mathyl sulfonyl fluoride) 200mM, SERVA Αντιδραστήριο N-ethyl-maleimide Πιπέτες pasteur Πειραματική διαδικασία: 1) Μετά από το τελευταία πλύσιμο για την απομάκρυνση των κυτταρινών, προστίθεται το διάλυμα λύσης. 2) Ακολουθεί φυγοκέντρηση (13.000rpm, 20 λεπτά, 4 ο C) και αναρρόφηση υπερκειμένου και δευτερογενούς ιζήματος στο οποίο περιέχονται τυχόν άσπαστα ερυθροκύτταρα και πρωτεάσες. 3) Η διαδικασία επαναλαμβάνεται όσες φορές χρειαστεί μέχρι να αποχρωματιστεί το ίζημα των μεμβρανών (ghosts). * Για τη μελέτη της πρωτεΐνης υπεροξειρεδοξίνη-2 πραγματοποιείται προεπώαση των δειγμάτων με το αντιδραστήριο Ν-ethylmeleimide το οποίο προσδένεται στις SH ομάδες της πρωεΐνης, εμποδίζοντας τη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών. 3.3 Υπολογισμός ολικής πρωτεϊνικής συγκέντρωσης δείγματος Αρχή μεθόδου Η μέτρηση της ολικής πρωτεϊνικής συγκέντρωσης σε ένα δείγμα στηρίζεται στην απορρόφηση του διαλύματος που προκύπτει με την ανάμειξη του δείγματος και του αντιδραστηρίου Bradford. Το αντιδραστήριο αυτό περιέχει την χρωστική Coomasie brilliant blue η οποία έχει την ικανότητα να δίνει τα ελεύθερα ηλεκτρόνιά της στα ιονιζόμενα μέρη της πρωτεϊνης αλλάζοντας έτσι την στερεοδιαμόρφωση του πρωτεϊνικού μορίου. Στη συνέχεια δεσμέυεται στις υδρόφοβες θετικά φορτισμένες περιοχές της πρωτεϊνης μέσω δυνάμεων Van der Waals. Η δέσμευση αυτή, προκαλεί την αλλαγή του χρώματος της χρωστικής από καφεκόκκινο σε μπλέ, με μέγιστο απορρόφησης στα 595 nm (Brandford M.N., 1976). Μετρώντας τις απορροφήσεις σε διαλύματα πρωτεϊνών γνωστής συγκέντρωσης μπορούμε να κατασκευάσουμε μια πρότυπη καμπύλη απορρόφησης-συγκέντρωσης έτσι ώστε κάθε φορά να αντιστοιχούμε την απορρόφηση του κάθε δείγματος με την συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνων. Υλικά-Αντιδραστήρια Διάλυμα χρωστικής Bradford, BIO-RAD Eppendorf 1,5ml Κυβέτες φασματοφωτομέτρου, SIGMA Υπότονο διάλυμα 5P8 (Na2HPO4 2H2O 5mM, NaH2PO4 H2O 5mM, ph 8.0) Φασματοφωτόμετρο ZEISS

33 Πειραματική διαδικασία: 1) Μετά από την απομόνωση των μεμβρανών ακολουθεί αραίωση ποσότητας του δείγματος με υπότονο διάλυμα 5P8 για τη μέτρηση της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης. 2) Σε ποσότητα αραιωμένου δείγματος μεμβρανών 10μl προστίθεται 790μl υπότονο διάλυμα 5P8 και 200μl διάλυμα Bradford. Στο τυφλό προστίθεται 200μl διαλύματος Bradford σε 800μl υπότονου διαλύματος. Ακολουθεί καλή ανάμειξη με vortex και τα δείγματα αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 25 λεπτά, για να ολοκληρωθεί και να σταθεροποιηθεί ο χρωματισμός του δείγματος. 3) Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 595nm. 4) Υπολογίζεται η συγκέντρωση κάθε δείγματος σε mg/ml από την πρότυπη καμπύλη. 3.4 Προετοιμασία πρωτεϊνικού δείγματος για ηλεκτροφόρηση Υλικά-Αντιδραστήρια β-μερκαπτοαιθανόλη Γλυκερόλη EDTA (Ethyleno-diamino-tetraacetic acid disodium salt) Μπλε της βρωμοφαινόλης Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Πειραματική διαδικασία Η ποσότητα της κάθε ουσίας εξαρτάται από τον τελικό όγκο του διαλύματος χρώσης που χρειαζόμαστε, με την αναλογία του όγκου διαλυμάτων SDS-10mM EDTA, γλυκερόλης, β-μερκαπτοαιθανόλης και μπλε της βρωμοφαινόλης να είναι πάντα 10:10:5:1, αντίστοιχα. Για τελικό όγκο βαμμένου δείγματος 100λ, προστίθενται 26 λ του διαλύματος χρώσης σε 74 λ απομονωμένων μεμβρανών. Το βαμμένο δείγμα, στη συνέχεια, τοποθετείται σε νερό που βράζει για 3 λεπτά και στη συνέχεια γίνεται αποθήκευση στους -80 C. 3.5 Αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κατά Laemmli Αρχή μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση αποδιαταγμένων πρωτεϊνων κατά Laemmli στηρίζεται στο διαφορετικό ηλεκτροφορητικό πρότυπο που παρουσιάζουν οι πρωτεϊνες διαφορετικού μοριακού βάρους. Συγκεκριμένα οι πρωτεϊνες μικρού μοριακού βάρους, με την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος μπορούν να διαπερνούν τους πόρους του πηκτώματος ακρυλαμίδης πολύ πιο εύκολα και γρήγορα σε σχέση με τις πρωτεϊνες μεγάλου μοριακού βάρους. Ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους επιτυγχάνεται εύκολα συγκρίνοντας τη θέση των μαρτύρων δηλαδή πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους με την επιθυητή πρωτεϊνη (Laemmli, 1970). Απαραίτητη προϋπόθεση είναι να έχουν αποδιαταχθεί οι πρωτεϊνες μας με την δράση της β-μερκαπτοαιθανόλης (διάσπαση δισουλφιδικών δεσμών) και να

34 έχουν αποκτήσει αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο με την δράση του SDS έτσι ώστε ο διαχωρισμός να οφείλεται μόνο στο μοριακό βάρος και όχι στην στερεοδιάταξη ή το φορτίο. Υλικά-Αντιδραστήρια Ακρυλαμίδη APS (Ammonium Persulfate) Δις-ακρυλαμίδη Glycine Hydrochloric acid (HCl) Ηλεκτρονικό πεχάμετρο Μείγμα μαρτύρων Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Συσκευή ηλεκτροφόρησης TEMED (N,N,N,N - Tetramethylethylenediamine) Tris (MW=121,14) Απεσταγμένο νερό Πειραματική διαδικασία Η διαδικασία ξεκινά με την παρασκευή των πηκτωμάτων διαχωρισμού και πακεταρίσματος. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή των πηκτωμάτων είναι: διάλυμα ακρυλαμίδηςδις ακρυλαμίδης 30:0.8 w/v, 0.4% SDS σε 1.5 Μ Tris/HCl ph 8.8, 0.4% SDS σε 0.5 M Tris/HCl ph 6.8, 10% APS και TEMED. Η συγκέντρωση της ακρυλαμίδης στο πήκτωμα είναι αυτή που καθορίζει και τη διακριτική του ικανότητα, καθώς μεγάλη συγκέντρωση ακρυλαμίδης έχει ως αποτέλεσμα την καλύτερη ανάλυση πρωτεϊνών χαμηλού μοριακού βάρους ενώ χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμίδης βοηθά στην ανάλυση πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους. Στο πήκτωμα διαχωρισμού (resolving gel), εκτός από τη συγκέντρωση της ακρυλαμίδης η οποία αλλάζει κάθε φορά ανάλογα με το πήκτωμα που παρασκευάζεται, τα υπόλοιπα διαλύματα βρίσκονται σε σταθερή συγκέντρωση. Πιο συγκεκριμένα περιέχεται 10-15% διάλυμα ακρυλαμίδης-δις ακρυλαμίδης 30:0.8 w/v, 0.375M Tris/HCl ph 8.8, 0.1% SDS, 0.025% APS, 0.083% TEMED. Μετά από καλή ανάμειξη των παραπάνω συστατικών ποσότητα διαλύματος μεταφέρεται γυάλινα τζαμάκια όπου αφήνεται να πήξει για τη δημιουργία του πηκτώματος. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός του πηκτώματος διαχωρισμού, ακολουθεί η παρασκευή του πηκτώματος πακεταρίσματος, το οποίο εξασφαλίζει ότι όλες οι πρωτεΐνες θα ξεκινήσουν από το ίδιο σημείο για το διαχωρισμό τους. Το πήκτωμα πακεταρίσματος (stacking gel), έχει σταθερή σύσταση ανεξάρτητα από το πήκτωμα διαχωρισμού και περιέχει: 3.05% διάλυμα ακρυλαμίδης-δις ακρυλαμίδης 30:0.8 w/v, 0.127Μ Tris/HCl ph 6.8, 0.1% SDS, 0.05% APS, 0.17% TEMED. Ύστερα από καλή αλλά ήπια ανάδευση προστίθεται το πήκτωμα πακεταρίσματος πάνω από το πήκτωμα διαχωρισμού και ακολούθως εισάγεται το χτένι που θα δημιουργήσει τις θέσεις των πηγαδιών φόρτωσης των δειγμάτων. Αφού γίνει ο πολυμερισμός των δύο πηκτωμάτων, εισάγονται τα δείγματα στις ειδικές θέσεις υποδοχής, ενώ στην πρώτη υποδοχή εισάγονται δείγματα πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους

35 (μάρτυρες). Στη συνέχεια, προστίθεται στη συσκευή το διάλυμα ηλεκτροφόρησης (Running buffer) που βοηθά στην επίδραση του ρεύματος πάνω στις πρωτεΐνες, μέσω των ηλεκτροδίων της συσκευής. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης κλείνει και τα δύο ηλεκτρόδια συνδέονται με ειδική συσκευή εφαρμογής τάσης. Έτσι, επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών υπό σταθερό ρεύμα I=20 ma, για κάθε πήκτωμα πακεταρίσματος και υπό σταθερό ρεύμα I=35 ma, για κάθε πήκτωμα διαχωρισμού. Η ηλεκτροφόρηση σταματάει όταν η χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης φτάσει σε απόσταση μισό εκατοστό από τη βάση του πηκτώματος διαχωρισμού και είναι εμφανείς όλες οι ζώνες των μαρτύρων μοριακών βαρών. Το διάλυμα ροής της ηλεκτροφόρησης (Running buffer) περιέχει 17.7 mm Tris (M.W.=121.4), 192 mm γλυκίνη (M.W.=75.07) και 0.1% SDS (M.W.=288.38), ph 8.3. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στη ρύθμιση του ph, η οποία δεν πρέπει να γίνεται με υδροχλωρικό οξύ διότι τα ιόντα χλωρίου μειώνουν την αναλυτική ικανότητα της μεθόδου. 3.6 Τεχνική ανοσοαποτυπώματος κατά Western Αρχή μεθόδου Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που έχουν διαχωριστεί με αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση κατα Laemli μεταφέρονται μέσω μιας ειδικής συσκευής, που εφαρμόζει σταθερή ηλεκτρική τάση, σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάζονται με πρωτογενή αντισώματα που συνδέονται ειδικά με τις επιθυμητές προς εντοπισμό πρωτεϊνες. Στη συνέχεια γίνεται επώαση με δευτερογενή αντισώματα που αναγνωρίζουν τα πρωτογενή και είναι συζευγμένα με το ένζυμο υπεροξειδάση. Το αποτέλεσμα της σύνδεσης οπτικοποιείται με την τεχνική χημειοφωταύγειας που περιλαμβάνει την εμφάνιση των ζωνών σε φωτοευαίσθητα φιλμ αυτοραδιογραφίας μετά την επώαση με το υπόστρωμα της υπεροξειδάσης, τη λουμινόλη. Η ένωση αυτή οξειδώνεται από την υπεροξειδάση και όταν επιστρέφει στην κατάσταση ηρεμίας εκπέμπει φώς που μαυρίζει τοπικά τα φωτογραφικά φίλμ. Υλικά-Αντιδραστήρια β-μερκαπτοαιθανόλη Διηθητικό χαρτί Whatmann 3MM ECL Western Blotting Detection Reagents Εμφανιστής D-19 HRP-conjugated anti-mouse IgG HRP-conjugated anti-rabbit IgG HRP-conjugated anti-goat IgG Κασέτα εμφάνισης Λαβίδες Νιτροκυτταρίνη 0.45 μm Στερεωτής (fixer) ακτινογραφικού φιλμ Τransblot SDI Semidry Transfer Gel

36 Αντισώματα: Anti-band-3, anti-calpain, anti-cd47, anti-hb, anti-igg s, anti-prx2, anti -Ubiquitin, anti -sclu, anti spectrin Πειραματική διαδικασία Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης τα πηκτώματα στα οποία έχει γίνει ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών μεταφέρονται στην ειδική συσκευή της Transblot-SDI Semidry Transfer Gel. Πιο συγκεκριμένα, τοποθετούνται 6 φύλλα χαρτιών Whatmann, διαστάσεων 6 x 9.3 mm, το ένα πάνω στο άλλο, τα οποία έχουν εμποτιστεί προηγουμένως σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer buffer). Μετά από την τοποθέτηση κάθε χαρτιού είναι αναγκαία η απομάκρυνση φυσαλίδων που μπορεί να έχουν εγκλωβιστεί ενδιάμεσα, καθώς τα κενά αέρος που ίσως υπάρχουν θα εμποδίσουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια τοποθετείται η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, διαστάσεων 5.5 x 8.8 mm, η οποία προηγουμένως έχει εμποτιστεί σε απεσταγμένο νερό, και αφαιρούνται όπως και προηγουμένως τυχόν φυσαλίδες. Ακολουθεί η τοποθέτηση του πηκτώματος πάνω στην νιτροκυτταρίνη με το σωστό προσανατολισμό και τέλος τοποθετούνται άλλα 6 φύλλα χαρτιών Whatmann εμποτισμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Σε κάθε στάδιο είναι απαραίτητη η αφαίρεση των φυσαλίδων. Η συσκευή κλείνει, ενώνεται με συσκευή εφαρμογής τάσης μέσω ηλεκτροδίων και ακολουθεί η μεταφορά πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη για περίπου 50 λεπτά σε σταθερή τάση 20 V. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς (Transfer buffer) είναι: Tris (M.W.=121.1) 50mM Glycine (M.W.=75.07) 40mM SDS (M.W.=288.38) 0.04% Methanol 20%, ph 8.3 Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών στο φύλλο νιτροκυτταρίνης ακολουθεί ανίχνευση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει με, ειδικά για την πρωτεΐνη, αντισώματα. Αρχικά,γίνεται κάλυψη των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης του αντισώματος με επώαση της μεμβράνης σε άπαχο γάλα (blocking). Ακολουθεί επώαση των μεμβρανών με το πρωτογενές αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος (αραιωμένο στο διάλυμα blocking). Αφού τελειώσει η επώαση και αφού ξεπλυθεί καλά η μεμβράνη με διάλυμα PBS-T (Tween 0,1% σε PBS), ακολουθεί η επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα (αραιωμένο στο διάλυμα blocking), το οποίο είναι συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση (HRP-Horseradish Peroxidase). Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος PBS είναι: NaCl (M.W.=58.44) 1.37M KCl (M.W.=74.55) 27mM Na2HPO4 2H2O (M.W.=177.9) 80.6mM KH2PO4 (M.W.=136.1) 19.4mM Στη συνέχεια γίνεται ανίχνευση του σήματος με το σύστημα ECL που βασίζεται στη χημειοφωταύγεια. Συγκεκριμένα, η νιτροκυτταρίνη επωάζεται με το υπόστρωμα του ενζύμου HRP, τη λουμινόλη, η οποία οξειδώνεται και διεγείρεται. Επιστρέφοντας στην κατάσταση ηρεμίας παράγει φως το οποίο προσβάλλει φωτοευαίσθητα φιλμ αυτοραδιογραφίας. Η ανίχνευση του σήματος γίνεται σε σκοτεινό θάλαμο, λόγω της φωτοευαισθησίας των φιλμ. Πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ECL και ακολουθεί τοποθέτησή της σε ειδική κασέτα μαζί με το κομμάτι του φιλμ. Στη συνέχεια γίνεται εμφάνιση των ζωνών με το διάλυμα D19. Το φιλμ ξεπλένεται σε νερό και ακολουθεί στερέωση με το

37 διάλυμα Fixer. Μετά το τέλος της ανοσοεντόπισης, είναι δυνατή η επαναχρησιμοποίηση της μεμβράνης ιτροκυτταρίνης, ύστερα από κατάλληλη επεξεργασία, για τον εντοπισμό και άλλων πρωτεϊνών που πιθανόν υπάρχουν στο ίδιο δείγμα. Για την πραγματοποίηση ενός νέου κύκλου ανοσοεντόπισης, είναι αναγκαία η αποκόλληση (stripping) των προηγούμενων ιχνηθετών που τοποθετήθηκαν στη μεμβράνη κατά τον πρώτο κύκλο. Αυτό επιτυγχάνεται με επώαση της μεμβράνης στους 60 C, για 45 λεπτά σε διάλυμα απορρυπαντικού (Stripping buffer) που περιέχει β-μερκαπτοαιθανόλη, σε κατάλληλη ποσότητα ώστε η τελική συγκέντρωσή της να είναι 0.7%. Ακολουθούν ξεπλύματα της μεμβράνης και στέγνωμα, ώστε να είναι έτοιμη για τον επόμενο κύκλο ανοσοεντόπισης. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος Stripping buffer είναι: Tris-HCl 62.5mM, ph 7.6,2% SDS 3.7 Ποσοτική εκτίμηση των πρωτεϊνών των πηκτωμάτων και των φιλμ Τα πηκτώματα καθώς και τα φιλμ σαρώνονται και πυκνομετρούνται με τη βοήθεια του προγράμματος επεξεργασίας εικόνων Gel Analyser ver 1.0. Ο τρόπος με τον οποίο γίνεται εκτίμηση της ποσότητας της κάθε ζώνης περιλαμβάνει τον ορισμό του υποβάθρου και του περιγράμματος της κάθε ζώνης. Συγκεκριμένα, ο χρήστης ορίζει την περιοχή του υποβάθρου της ζώνης και στη συνέχεια το περίγραμμα της ζώνης. Μετά την αφαίρεση του υποβάθρου υπολογίζεται το άθροισμα της φωτεινότητας όλων των εικονοστοιχείων (pixels) που περιέχονται στη ζώνη και οι τιμές που προκύπτουν επεξεργάζονται με τη βοήθεια του προγράμματος Excel. Για κάθε δείγμα, υπολογίζεται η τιμή της κάθε πρωτεϊνικής ζώνης, το άθροισμα των τιμών όλων των πρωτεϊνών καθώς και η τιμή του λόγου της κάθε πρωτεΐνης προς το άθροισμα αυτό ή προς μια πρωτεΐνη αναφοράς η οποία εμφανίζει σταθερές τιμές ανάμεσα στα δείγματα. 3.8 Προετοιμασία για παρατήρηση της μορφολογίας ερυθροκυττάρων με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης - ΗΜΣ (Scanning Electron Microscope - SEM) Αρχή μεθόδου Η γλουταρική αλδεΰδη σταθεροποιεί τις πρωτεΐνες ενώ το τετροξείδιο του οσμίου συγκρατεί τα λιπίδια (ανορθώνει τους διπλούς δεσμούς των ανθρακικών αλυσίδων και συνδέεται με εστερικούς δεσμούς σε αυτά) στα κύτταρα. Με την χρήση αυτών των δύο ουσιών πραγματοποιείται η μονιμοποίηση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης η οποία καλύπτεται εν συνεχεία με σφαιρίδια χρυσού-παλλαδίου. Η πρόσπτωση της δέσμης των ηλεκτρονίων του Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης στα σφαιρίδια προκαλεί την ανάκλαση πρωτογενών ηλεκτρονίων και την εκπομπή δευτερογενών ηλεκτρονίων (λόγω ιονισμού ατόμων του δείγματος). Το σήμα από τα δευτερογενή ηλεκτόνια λαμβάνεται και ενισχύεται σε φθορίζουσα οθόνη ώστε να πάρουμε εικόνα για την επιφανειακή μορφολογία των ερυθροκυττάρων. Υλικά-Αντιδραστήρια Αιθανόλη Γλουταρική αλδεΰδη Επιτραπέζια φυγόκεντρος Εppendorf,

38 Εppendorfs 1,5ml Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, PHILIPS SEM515 Κακοδυλικό νάτριο Καλυπτρίδες OsO 4 PBS 310mosm Σουκρόζη Συσκευή κάλυψης Χρυσού-Παλλαδίου, Tousimis Samsputter-2a Ταινία διπλής όψης Πειραματική διαδικασία 1) Σε 20μl από το ίζημα με τα πακεταρισμένα ερυθροκύτταρα προστίθεται διάλυμα 2% γλουταραλδεΰδης σε 0.1 mm κακοδυλικό νάτριο ph 7.4. Επώαση για 1h. 2) Ακολουθεί πλύση με διάλυμα 4% σουκρόζης σε 0,1Μ κακοδυλικό νάτριο στους 4 C, για 15 λεπτά. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλες 2 φορές. 3) Προσθήκη διαλύματος 1% OsO4 σε 0.1 mm κακοδυλικό νάτριο ph 7.4 και επώαση για μια ώρα στους 4 C 4) Ακολουθεί ξέπλυμα με διάλυμα 4% σουκρόζης σε 0.1 mm κακοδυλικό νάτριο ph 7.4. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται ακόμη μια φορά. 5) Αφυδάτωση με αιθανόλη σε διαδοχικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις %. * Από το βήμα που προστίθεται 100% αιθανόλη τα δείγματα αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου 6) Αραίωση των πακεταρισμένων ερυθροκυττάρων με διάλυμα 100% αιθανόλης και επίστρωση του δείγματος σε καλυπτρίδα. 7) Στέγνωμα στον αέρα - στερέωση της καλυπτρίδας σε stub του ΗΜΣ με ταινία διπλής όψης - κάλυψη με Χρυσό-Παλλάδιο και παρατήρηση στο Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης. 3.9 Μέτρηση ενδοκυττάριων επιπέδων ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) και ιόντων Ca 2+ Αρχή μεθόδου Η μέτρηση των ενδοκυττάριων επιπέδων ελευθέρων ριζών οξυγόνου πραγματοποιείται με τη χρήση του αντιδραστηρίου CMH 2DCFDA ένα λιπόφιλο μόριο που έχει την ικανότητα να διαπερνά τις μεμβράνες των ερυθροκυττάρων, το οποίο οξειδώνεται από τα ROS, από-ακετυλιώνεται από κυτταρικές εστεράσες και φθορίζει. Η ένταση του φθορισμού μετράται με φθορισμόμετρο. Αντίστοιχα, για την μέτρηση των επιπέδων ασβεστίου χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο Fluo-4 διαπερνά εύκολα την λιπιδική διπλοστοιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης και υδρολύεται από τις ενδοκυτταρικές εστεράσες στο κυτοσόλιο. Το ιόν που παράγεται δεσμεύει χηλικά τα ιόντα ασβεστίου. Το χηλικό σύμπλοκο του Fluo-4 με τα ιόντα Ca 2+ εκπέμπει φθορισμό που μετράται με το φθορισμόμετρο

39 Υλικά-Αντιδραστήρια CMH 2 DCFDA Fluo-4 AM Γλυκόζη PBS 310mosm 145mM NaCl 7.5mM KCl 1.8mM CaCl 2 10mM glucose 10mM Hepes/NaOH, ph mM pyruvate DMSO (dimethyl sulfoxide) PBS 310 mosm Φθορισμόμετρο VersaFluor, Bio-Rad ddh2o Πειραματική διαδικασία 1. Απομόνωση ερυθροκυττάρων από ολικό αίμα και αραίωσή τους σε ισότονο διάλυμα. 2. Προσθήκη αντιδραστηρίου DCFDA ή Fluo4-AM σε κάθε δείγμα και επώαση, υπό ανάδευση, σε σκοτάδι για 30 ή 45 λεπτά, αντίστοιχα. 3. Ακολουθεί πλύση των κυττάρων με ισότονο διάλυμα και επώασή τους στο σκοτάδι για 12 λεπτά. 4. Λύση με ddh2o 5. Μέτρηση στο φθορισμόμετρο 3.10 Μέτρηση επιπέδων αντιοξειδωτικής ικανότητας πλάσματος-frap (Ferric Reducing Ability of Plasma) Αρχή μεθόδου Για τη μέτρηση των επιπέδων συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας πλάσματος πραγματοποιήθηκε μέτρηση της ικανότητας αναγωγής του συμπλόκου Fe 3+ - ΤΡΤΖ σε Fe 2+ -TPTZ από τα αντιοξειδωτικά του πλάσματος. Σε χαμηλό pη, το σύμπλοκο τρισθενούς σιδήρου-τριπυριδυλοτριαζίνη (Fe 3+ - TriPyridyltriaZine) ανάγεται σε σύμπλοκο δισθενούς σιδήρου-tptz (Fe 2+ -TPTZ) (το οποίο έχει ένα έντονο μπλε χρώμα) και η αλλαγή στην απορρόφηση μετράται σε μήκος κύματος 593nm (Benzie I.F, 1996). Για τη μέτρηση του ποσοστού συμμετοχής του ουρικού οξέος στην αναγωγική ικανότητα του πλάσματος, χρησιμοποιείται το ένζυμο ουρικάση. Υλικά-Αντιδραστήρια Διάλυμα οξικού οξέος 300 mm ph 3.6 Διάλυμα TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) (M.W.=312.34) 10 mm HCl (40mM) Διάλυμα FeCl3 6H2O (M.W.=270.30) 20 mm

40 Ουρικάση Το αντιδραστήριο FRAP είναι έτοιμο μετά από ανάμειξη των παραπάνω διαλυμάτων (οξικού οξέος-tptz-fecl3) σε αναλογία 10:1:1 αντίστοιχα. Πειραματική διαδικασία 1) Αραίωση πλάσματος με αντιδραστήριο FRAP (30x) 2) Επώαση για 4min στους 37 C 3) Φωτομέτρηση 3.11 Μέτρηση Οσμωτικής Ευθραυστότητας Ερυθροκυττάρων Αρχή μεθόδου Το διάλυμα χλωριούχου νατρίου (NaCl) συγκέντρωσης 0,9% είναι ισότονο για τα ερυθροκύτταρα. Όσο η συγκέντρωση του NaCl μειώνεται τόσο περισσότερα ερυθροκύτταρα υφίστανται λύση αφού το διάλυμα γίνεται υπότονο. Ο δείκτης οσμωτικής ευθραυστότητας MCF (Median Corpuscular Fragility) δηλαδή η συγκέντρωση του NaCl που προκαλεί λύση στο 50% των κυττάρων, δείχνει την ευαισθησία των ερυθροκυττάρων στην αιμόλυση λόγω οσμωτικού στρες (Parpart AK, 1947). Πειραματική διαδικασία 1. Προετοιμασία Eppendorf με δ/ματαnacl ( %) ml από κάθε δ/μα 3. Προσθήκη 10λ φυσιολογικού αίματος 4. Ήπιο Vortex 5. Επώαση 15min σε RT 6. Φυγοκέντρηση 5min σε 1500rpm 7. Φωτομέτρηση υπερκείμενου στα 540nm Για τα δείγματα παρασκευάζονται δ/ματα NaCl των παρακάτω συγκεντρώσεων: 0% - 0,1% - 0,2% - 0,25% - 0,3% - 0,35% - 0,4% - 0,45% - 0,5% - 0,55% - 0,06% - 0,7% - 0,8% - 0,9%. Από την καμπύλη που δημιουργείται με βάση την απορρόφηση και τη συγκέντρωση NaCl, υπολογίζεται η συγκέντρωση του NaCl που προκελεί λύση στο 50% των κυττάρων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για δείγμα ολικού αίματος που έχει επωαστεί για 24 ώρες σε κλίβανο με σταθερή θερμοκρασία 37 ο C (μεταβολικό στρες)

41 4. Αποτελέσματα Μέρος Α : Μεταβολές στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα των ασθενών (ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων), πριν τη διαδικασία της αιμοκάθαρσης Οι δύο ομάδες των ασθενών που μελετήθηκαν, δημιουργήθηκαν με βάσει τις δόσεις ερυθροποιητίνης που λαμβάνουν οι ασθενείς, δηλαδή την εμφάνιση ανθεκτικότητας ή όχι στη θεραπεία με rhepo. Οι μη ανταποκρινόμενοι (ΜΑ) ασθενείς υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση για διάστημα 31 (±40) μήνών και λάμβαναν (±5651) IU/week ερυθροποιητίνης ενώ οι ανταποκρινόμενοι (Α) υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση για διάστημα 40 (±39) μηνών και λάμβαναν 9350 (±4204) IU/week ερυθροποιητίνης κατά μέσο όρο. Η μελέτη του αιματολογικού προτύπου των μη ανταποκρινόμενων και ανταποκρινόμενων ασθενών πριν από την ΑΙΚ έδειξε μειωμένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης (Hb), αιματοκρίτη (Hct), αριθμού ερυθροκυττάρων (RBC) και ενδοκυττάριας συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης (MCHC) ταυτόχρονα με αύξηση του δείκτη εύρους μεγέθους των ερυθροκυττάρων (RDW) σε σχέση με τα υγιή άτομα (Πίνακας 1, Διάγραμμα1). Οι μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς επιπροσθέτως παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα ενδοκυττάριας αιμοσφαιρίνης (MCH). Όλοι οι ασθενείς χαρακτηρίζονται, όπως είναι αναμενόμενο από συσσώρευση ουραιμικών τοξινών, όπως ουρία, κρεατινίνη και ουρικό οξύ (Πίνακας 2, Διάγραμμα2). RBC (10 6 /μl) Hb (gr/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (gr) RDW (%) ΜΑ 3,9 ± 0,7* 10,4 ± 0,9* 33,5 ± 2,2* 89,1± 16,1 27,8 ± 5,9* 31,1 ± 1,3* 16,8 ± 1,4 * Α 3,6 ± 0,4* 10,9 ± 0,7* 33,9± 1,9* 95,4± 9,1 30,2 ± 3,2 31,2 ± 0,6* 16,6 ± 1,3 * Υγιείς 4,7 ± 0,6 14,9 ± 1,3 43,8 ± 4,5 93,0± 6,0 31,6 ± 2,1 34,0 ± 1,2 12,9 ± 0,8 Πίνακας 1: Αιματολογικές παράμετροι ασθενών πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης (Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς, ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς). Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± την τυπική απόκλιση. (*) p<0.05 έναντι υγιών. Ουρία (mg/dl) Κρεατινίνη (mg/dl) Ουρικό οξύ (mg/dl) ΜΑ 153 ± 27 * 7,7 ± 1,2* 7,5 ± 1,0 * Α 125 ± 25 * 6,7 ± 2,0* 5,9 ± 1,2 * Υγιείς 35 ± 12 4,2 ± 1,2 0,7 ± 0,1 Πίνακας 2: Βιοχημικές παράμετροι ασθενών πρίν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης και υγιών ατόμων. ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± την τυπική απόκλιση. (*) p<0.05 έναντι υγιών, ( ) p<0.05, MA έναντι A

42 ΜΑ ROS (RFU) Ca 2+ (RFU) Μη Αναστρέψιμα (%) Δισκοκύτταρα (%) Αναστρέψιμα (%) 448 ± ± ,9 ± 4,1 * 31,7 ± 11,8 * 59,9 ± 11,6 Α 443 ± 155* 2122 ± 782 5,3 ± 2,9 * 26,8 ± 7,5 * 67,2 ± 7,3 * Υγιείς 306 ± ± 448 2,7 ± 0,9 44,1 ± 6,6 52,8 ± 6,3 Πίνακας 3: Ερυθροκυτταρικές παράμετροι ασθενών πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης και υγιών ατόμων. ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± την τυπική απόκλιση. (*) p<0.05 έναντι υγιών. 160 Αιματολογικό πρότυπο (πριν την αιμοκάθαρση) ΜΑ Α 20 0 RBC Hb Hct MCV MCH MCHC RDW Διάγραμμα 1: Αιματολογικές παράμετροι ασθενών πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 έναντι υγιών. Όσον αφορά στις ερυθροκυτταρικές παραμέτρους, και οι δύο ομάδες των ασθενών παρουσιάζουν μειωμένη οσμωτική ευθραυστότητα και μειωμένα επίπεδα φυσιολογικών δισκοκυττάρων ταυτόχρονα με αύξηση των μη αναστρέψιμων μορφολογικά τροποποιημένων ερυθροκυττάρων (Πίνακας 3, Διάγραμμα 3, Εικόνα 10-12). Ως μη αναστρέψιμης παραμόρφωσης χαρακτηρίζονται τα σφαιρο-εχινοκύτταρα, τα εχινοκύτταρα, τα δακρυοκύτταρα, τα ελλειπτοκύτταρα, τα οβαλοκύτταρα και τα σχιστοκύτταρα τα οποία αποτελούν θραύσματα των ερυθροκυττάρων. Οι

43 ανταποκρινόμενοι ασθενείς επιπλέον, παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα αναστρέψιμων ερυθροκυτταρικών μορφών αλλά και ενδοκυττάριων ριζών οξυγόνου σε σχέση με τα υγιή άτομα (Πίνακας 3, Διάγραμμα 3, Εικόνα 10 & 12). Ως προς την πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, γενικότερα στους ασθενείς προκύπτει αύξηση των διμερών της ζώνης-3 και των IgGs και μείωση των ουμπικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών. Οι μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, επιπλέον, παρουσιάζουν μείωση στη μεμβρανοσυνδεόμενη Hb και την κλαστερίνη και αύξηση στην υπεροξειρεδοξίνη (Prx-2), ενώ οι ανταποκρινόμενοι ασθενείς αντίθετα εμφανίζουν μείωση της CD47 και αύξηση της ζώνης-3 (Διάγραμμα 4, Εικόνα 13). Η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος (TAC) και η αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος οφειλόμενη στα επίπεδα του ουρικού οξέος (UA) ή σε άλλα αντιοξειδωτικά συστατικά (AC-UA) εμφανίζονται αυξημένες και στις δύο ομάδες των ασθενών (Διάγραμμα 2) Βιοχημικό πρότυπο και χαρακτηριστικά πλάσματος (πριν την αιμοκάθαρση) ΜΑ Α Ουρία Κρεατινίνη Oυρικό Ελεύθερη Hb πλάσματος TAC AC-UA UA Διάγραμμα 2: Βιοχημικές παράμετροι ασθενών, πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης, και υγιών ατόμων. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 έναντι υγιών : p<0.05, MA έναντι A

44 Ερυθροκυτταρικές παράμετροι (πρίν την αιμοκάθαρση) ΜΑ Α 0 Διάγραμμα 3: Ερυθροκυτταρικές παράμετροι ασθενών πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. στους 37 ο C. : p<0.05 έναντι υγιών. MCF : οσμωτική ευθραυστότητα, μετά από επώαση των κυττάρων Η σύγκριση μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη ασθενών πριν από την διαδικασία της αιμοκάθαρσης αποκαλύπτει πως οι ανταποκρινόμενοι ασθενείς παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικά μειωμένα επίπεδα ουρίας και ουρικού οξέος (Πίνακας 2, Διάγραμμα 2). Οι δύο ομάδες των ασθενών διαφέρουν και στην πρωτεΐνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, καθώς οι μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα Prx-2, αλλά μειωμένα επίπεδα ζώνης-3, IgGs και κλαστερίνης σε σχέση με τους ανταποκρινόμενους (Διάγραμμα 4, Εικόνα 13)

45 Εικόνα 10: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων μη ανταποκρινόμενου ασθενή με ΧΝΑ, πριν από την αιμοκάθαρση. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm. Κόκκινα βέλη: ερυθροκύτταρα μη αναστρέψιμης παραμόρφωσης. Εικόνα 11: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων ανταποκρινόμενου ασθενή με ΧΝΑ, πριν από την αιμοκάθαρση. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm. Κόκκινα βέλη: ερυθροκύτταρα μη αναστρέψιμης παραμόρφωσης. Εικόνα 12: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων υγιούς δότη. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm

46 Πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης (πρίν την αιμοκάθαρση) MA A Διάγραμμα 4: Πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης των ασθενών πριν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 έναντι υγιών : p<0.05, MA έναντι Α. Ub: Ουμπικουιτινυλιωμένες πρωτεΐνες

47 Υγιείς ΜΑ προ ΑΙΚ Α προ ΑΙΚ Ζώνη-3 CD47 Μεμβρανοσυ νδεόμενη Hb IgG s Prx-2 Ub sclu 4.1 R Εικόνα 13: Ενδεικτικές εικόνες Aνοσοαποτυπώματος κατά Western για τους ασθενείς πρίν την διαδικασία της αιμοκάθαρσης και τους υγιείς

48 Μέρος B : Μεταβολές στα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα των ασθενών (ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων), μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης RBC (10 6 /μl) Hb (gr/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (gr) RDW (%) ΜΑ 4,2 ± 1,2 11,3 ± 1,4* 34,0 ± 4,6* 85,0 ± 16,5 28,2 ± 5,9 33,1 ± 1,3 14,5 ± 0,7* Α 4,0 ± 0,9* 11,8 ± 1,0* 33,2 ± 3,8* 84,4 ± 8,5* 29,6 ± 4,4 33,6 ± 3,7 15,8 ± 2,1* Υγιείς 4,7 ± 1,2 14,8 ± 1,3 43,8 ± 4,5 92,9 ± 6,0 31,6 ± 2,1 34,0 ± 1,2 12,8 ± 0,8 Πίνακας 4: Αιματολογικές παράμετροι ασθενών, μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης, και υγιών ατόμων (Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς, ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς). Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± την τυπική απόκλιση. (*) p<0.05 έναντι υγιών. ROS (RFU) Ca 2+ (RFU) Μη Αναστρέψιμα (%) Δισκοκύτταρα (%) Αναστρέψιμα (%) ΜΑ 385 ± ± 717 7,9 ±4,9* 29,0 ± 9,5* 62,2 ± 9,6* Α 429 ± 84* 2291 ± 485 4,7 ± 1,8* 27,5 ± 7,1* 67,0 ± 6,7* Υγιείς 306 ± ± 448 2,7 ± 0,9 44,1 ± 6,6 52,8 ± 6,3 Πίνακας 5: Ερυθροκυτταρικές παράμετροι ασθενών, μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης, και υγιών ατόμων. Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς, ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς). Αναγράφεται ο μέσος όρος ± την τυπική απόκλιση. (*) p<0.05 έναντι υγιών. Μετά από την αιμοκάθαρση, οι τιμές Hb και Hct παραμένουν μειωμένες στις δύο ομάδες των ασθενών σε σχέση με τα υγιή άτομα, ενώ οι ανταποκρινόμενοι ασθενείς παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα και στον αριθμό και στον μέσο όγκο (MCV) των ερυθροκυττάρων. O δείκτης RDW παραμένει αυξημένος και στις δύο ομάδες των ασθενών μετά την ΑΙΚ (Πίνακας 4, Διάγραμμα 5). Αντίστοιχα όλοι οι ασθενείς χαρακτηρίζονται από παθολογικά χαμηλά επίπεδα συνολικής και εξαρτώμενης από ουρικό αντιοξειδωτικής ικανότητας πλάσματος (Διάγραμμα 6)

49 160 Αιματολογικό πρότυπο (μετά την αιμοκάθαρση) MA A RBC Hb Hct MCV MCH MCHC RDW Διάγραμμα 5: Αιματολογικές παράμετροι ασθενών, μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 vs υγιείς. 160 Χαρακτηριστικά πλάσματος (μετά την αιμοκάθαρση) MA A 20 0 Ελεύθερη Hb Allen TAC AC-UA UA Διάγραμμα 6: Χαρακτηριστικά του πλάσματος των ασθενών, μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 έναντι υγιών

50 Και στις δύο ομάδες των ασθενών παρατηρούνται παθολογικά αυξημένα επίπεδα ερυθροκυττάρων μη αναστρέψιμων και αναστρέψιμων μορφολογικών τροποποιήσεων, με αντίστοιχη μείωση των φυσιολογικών δισκοκυττάρων (Εικόνες 14-16). Οι μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς διατηρούν την ανθεκτικότητα στο οσμωτικό στρες, ενώ οι ανταποκρινόμενοι παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα ενδογενών ROS σε σχέση με τους υγιείς (Πίνακας 5, Διάγραμμα 7). Όσον αφορά στην πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, αυξημένα επίπεδα IgGs χαρακτηρίζουν όλους τους ασθενείς, αλλά οι μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα κλαστερίνης, ενώ οι ανταποκρινόμενοι μειωμένα επίπεδα CD47, Prx-2 και ουμπικουιτινυλιωμένων πρωτεϊνών ταυτόχρονα με αυξημένα επίπεδα μεμβρανοσυνδεόμενης Hb σε σχέση με τα υγιή άτομα (Διάγραμμα 8, Εικόνα 17). Συγκρίνοντας τις δύο ομάδες των ασθενών, δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές στο αιματολογικό πρότυπο και τα χαρακτηριστικά του πλάσματος ή των ερυθροκυττάρων, αλλά όσον αφορά στην πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, οι ανταποκρινόμενοι ασθενείς χαρακτηρίζονται από αυξημένα επίπεδα μεμβρανοσυνδεόμενης αιμοσφαιρίνης και κλαστερίνης, αλλά μειωμένα επίπεδα CD47, διμερών ζώνης-3 και Prx-2 σε σχέση με τους μη ανταποκρινόμενους ασθενείς (Διάγραμμα 8, Εικόνα 17). 600 Ερυθροκυτταρικές παράμετροι (μετά την αιμοκάθαρση) MA A Διάγραμμα 7: Ερυθροκυτταρικές παράμετροι ασθενών μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. στους 37 ο C. : p<0.05 έναντι υγιών. MCF : οσμωτική ευθραυστότητα, μετά από επώαση των κυττάρων

51 Εικόνα 14: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων μη ανταποκρινόμενου ασθενή με ΧΝΑ, μετά από την αιμοκάθαρση. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm. Κόκκινα βέλη: ερυθροκύτταρα μη αναστρέψιμης παραμόρφωσης. Εικόνα 15: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων ανταποκρινόμενου ασθενή με ΧΝΑ, μετά από την αιμοκάθαρση. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm. Κόκκινα βέλη: ερυθροκύτταρα μη αναστρέψιμης παραμόρφωσης. Εικόνα 16: Ενδεικτική ηλεκτρονιογραφία ερυθροκυττάρων υγιούς δότη. Ράβδος μεγέθυνσης: 10μm

52 Πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης (μετά την αιμοκάθαρση) MA A Διάγραμμα 2: Πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης των ασθενών, μετά την διαδικασία της αιμοκάθαρσης. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. : p<0.05 έναντι υγιών : p<0.05, MA έναντι Α Διμερή ζώνης 3 0 MA Διάγραμμα 9: Διμερή ζώνης-3 της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης των ασθενών, μετά την αιμοκάθαρση Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση, ύστερα από κανονικοποίηση στις τιμές των υγιών ατόμων (100%, πορτοκαλί γραμμή). ΜΑ: μη ανταποκρινόμενοι ασθενείς, Α: ανταποκρινόμενοι ασθενείς. A