ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Διονυσία Διαμαντοπούλου

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Διονυσία Διαμαντοπούλου Παρασκευή και μελέτη βιωσιμότητας σκευασμάτων προβιοτικών μικροοργανισμών και φυτικών εκχυλισμάτων Επιβλέπουσα: Αργυρώ Μπεκατώρου, Επίκουρος Καθηγήτρια Πάτρα, 2015 i

2 SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY SPECIALIZATION IN MEDICINAL CHEMISTRY MASTER THESIS Dionysia Diamantopoulou Development and study of synbiotic formulations based on probiotic species and plant extracts Supervisor: Argyro Bekatorou, Assistant Professor Patras, 2015 ii

3 Η παρούσα ΜΔΕ αφιερώνεται Στην οικογένεια μου Γιώργο, Άννα & Μιχαήλ iii

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα ΜΔΕ εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τομέα Χημικών Εφαρμογών, Χημικής Ανάλυσης και Χημείας Περιβάλλοντος του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Πλησιάζοντας στο τέλος της ακαδημαϊκής μου πορείας, νιώθω τη ανάγκη να ευχαριστήσω δημόσια τους ανθρώπους που με ενέπνευσαν να συνεχίσω με το μεταπτυχιακό και που με βοήθησαν στην υλοποίηση των στόχων μου. Αρχικά, ένα μεγάλο ευχαριστώ στους καθηγητές του μεταπτυχιακού προγράμματος της Ιατρικής Χημείας για την ποιότητα και το επίπεδο των γνώσεων που μου προσέφεραν. Από τα βάθη της καρδιάς μου ευχαριστώ την Επιβλέπουσα Επίκουρο Καθηγήτρια, φίλη, και υποστηρίκτρια κα. Αργυρώ Μπεκατώρου, για ΟΛΑ όσα έχει κάνει για μένα εδώ και πέντε χρόνια. Επίσης, ευχαριστώ ιδιαίτερα τους δύο βασικούς συνεργάτες μου στο εργαστήριο κα. Ευγενία Πατρινού και κ. Μιχάλη Καλλή, για την πολύτιμη βοήθειά τους σε εργαστηριακά και όχι μόνο θέματα. Χωρίς αυτούς δε θα είχα καταφέρει να ολοκληρώσω την εργασία μου. Θερμά ευχαριστώ στα παιδιά από το εργαστήριο Αγάπη Δήμα και Κωνσταντίνα Μπούρα για την υποστήριξη τους και την αγάπη τους. Επίσης, ευχαριστώ τον φίλο κ. Κωνσταντίνο Μίχο, Γεωπόνο, για την πολύτιμη βοήθειά του στην εύρεση βιβλιογραφίας. Δε μπορώ να παραλείψω τους φίλους μου: Κωνσταντίνα, Αναστασία, Βάσω, Στάθη, Αλέξη, Αντριάνα, Νίκο, Κωνσταντίνα, καθώς και όλα τα παιδιά από τη Δημοτική Φιλαρμονική Γαργαλιάνων που «γέμισαν» τον ελεύθερό μου χρόνο με τον καλύτερο τρόπο. Τέλος, το πιο μεγάλο ευχαριστώ το οφείλω στην οικογένειά μου. Ό,τι και να πω είναι λίγο, όσες φορές και να ευχαριστήσω θα σας αδικήσω και πάλι. Σας ευχαριστώ για την πίστη σας σε εμένα, για τη βοήθειά σας, για την κατανόησή σας, για όσα μου προσφέρετε όλα αυτά τα χρόνια, για όσα συνεχίζετε να μου προσφέρετε απλόχερα και για την ελευθερία λόγου και πράξεων που έχω. «Πάντα στον νου σου νάχεις την Ιθάκη. Το φθάσιμον εκεί είν ο προορισμός σου. Αλλά μη βιάζεις το ταξίδι διόλου. Καλλίτερα χρόνια πολλά να διαρκέσει και γέρος πια ν αράξεις στο νησί, πλούσιος με όσα κέρδισες στον δρόμο, μη προσδοκώντας πλούτη να σε δώσει η Ιθάκη» ( Κ.Π. Καβάφης ) iv

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αύξηση της επίγνωσης των καταναλωτών σε συνδυασμό με νέα επιστημονικά δεδομένα, έχουν οδηγήσει σε αυξημένη ζήτηση για θρεπτικότερα και ασφαλέστερα τρόφιμα, ελεύθερα παθογόνων μικροοργανισμών, τοξινών, χημικών επιμολυντών και χημικών προσθέτων. Για το σκοπό αυτό τόσο η επιστήμη όσο και η βιομηχανία έχουν στραφεί πρόσφατα στην ανάπτυξη των λεγόμενων «λειτουργικών» τροφίμων, συστατικών τροφίμων και συμπληρωμάτων διατροφής, προκειμένου να παρέχουν οφέλη υγείας πέρα των παραδοσιακών διατροφικών απαιτήσεων. Ένα μεγάλο μέρος της αγοράς των λειτουργικών τροφίμων αντιπροσωπεύουν τα «προβιοτικά» τρόφιμα, δηλαδή τρόφιμα που περιέχουν ζωντανά βακτήρια που μπορούν να βελτιώσουν την ανθρώπινη υγεία τροποποιώντας τη μικροχλωρίδα του εντέρου όταν καταναλώνονται σε κατάλληλες ποσότητες. Τα προβιοτικά που χρησιμοποιούνται περισσότερο στην τεχνολογία τροφίμων είναι γαλακτικά βακτήρια, κυρίως είδη Lactobacillus και Bifidobacterium, αλλά και ορισμένα είδη Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Saccharomyces, κλπ. Η στενή σχέση μεταξύ της μικροχλωρίδας του εντέρου και των συστατικών της διατροφής με την ανθρώπινη υγεία, έχουν στρέψει το ενδιαφέρον στη συνδυαστική χρήση προβιοτικών με «πριβιοτικά» (άπεπτα συστατικά, που αξιοποιούνται όμως από τα προβιοτικά στο έντερο) που είναι γνωστή ως «συνβιοτικά». Ο Saccharomyces boulardii, είναι ένας ζυμομύκητας που χρησιμοποιείται ευρέως ως φάρμακο για την πρόληψη και θεραπεία δυσλειτουργιών του εντέρου κυρίως μετά από αντιβιοτική θεραπεία. Επίσης φυτικά προϊόντα, όπως η πίσσα Πάφου Χίου (Pistacia lentiscus), χρησιμοποιούνται ευρέως για τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες (επουλωτικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, και αντιμικροβιακές) και ειδικότερα για τη θεραπεία προβλημάτων του πεπτικού συστήματος, όπως είναι η δυσπεψία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η χρήση πίσσας Πάφου (Pistacia terebinthus) και του προβιοτικού S. bοulardii για την παρασκευή (α) υγρών (κύτταρα σε υδατικά εκχυλίσματα πίσσας Πάφου), και (β) στερεών (πελλέτες πίσσας Πάφου με εγκλωβισμένα κύτταρα) σκευασμάτων για πιθανή φαρμακευτική χρήση. Αξιολογήθηκε η βιωσιμότητα του S. bοulardii στα σκευάσματα αυτά κατά την αποθήκευση καθώς και σε όξινες συνθήκες προσομοιώνοντας το γαστρικό υγρό. Η ρητίνη αναλύθηκε για αντιοξειδωτική ικανότητα, ολικά φαινολικά συστατικά, σάκχαρα, οργανικά οξέα, και πτητικά συστατικά με κλασσικές και ενόργανες μεθόδους (HPLC, GC, GC/MS). Λέξεις κλειδιά: Λειτουργικά τρόφιμα, προβιοτικά, P. terebinthus, S.boulardii v

6 ABSTRACT The increasing consumer awareness and scientific evidence has led to an increased demand for wholesome and safer food, free from pathogenic microorganisms, microbial toxins, chemical contaminants, and excessive additives. In this respect, both industry and the research community have recently focused on the development of functional foods or food supplements, which claim to provide health-promotion or disease prevention benefits beyond their basic nutritional value. A significant part of the functional food market is represented by probiotics, which are foods containing live bacteria that can positively affect human health by altering their intestinal microflora when consumed in adequate amounts. The most frequently used probiotics are lactic acid bacteria, mainly Lactobacillus and Bifidobacterium spp., as well as some Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Saccharomyces spp., etc. The close relationships between gut microbiota, nutrients, health and disease, have led to increasing interest in using probiotics and prebiotics, i.e. non-digestible substrates that can be utilized by probiotics in the gut stimulating their growth and viability. The combined use of probiotics and prebiotics is known as synbiotics. Saccharomyces boulardii is a yeast widely used as medicine to prevent and treat intestinal disorders. Plant components, such as mastic resins (Pistacia lentiscus L., P. terebinthus L., etc.), have also been used traditionally and commercially, for their medicinal properties (healing, antioxidant, antibacterial, anti-inflammatory) as well as for the treatment of the symptoms of dyspepsia. In this study, (a) liquid (cell suspension in aq resin extract) and (b) solid formulations (cells entrapped in resin pellets) of P. terebinthus resin (mastic of Paphos) with S. boulardii are proposed for possible medicinal uses. The viability of S. boulardii in these formulations was evaluated during storage as well as in acidic solutions simulating gastric acid. Finally, the formulations were analyzed for their antioxidant capacity and total phenolics contents, as well as for sugars, organic acids, and aroma-active volatile compounds by classic and instrumental techniques (HPLC, GC, GC/MS). Keywords: probiotics, novel foods, S. boulardii, P. terebinthus vi

7 vii

8 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Αργυρώ Μπεκατώρου (Επιβλέπουσα) Επίκουρη Καθηγήτρια Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Αλέξιος Βλάμης Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Μαρία Κανελλάκη Καθηγήτρια Χημείας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Three-member examining committee Argyro Bekatorou (Supervisor) Assistant Professor of Food Chemistry & Technology Alexios Vlamis Assistant Professor of Biochemistry & Molecular Biology Maria Kanellaki Professor of Food Chemistry & Biotechnology viii

9 Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή Λειτουργικά τρόφιμα- Τροφοφάρμακα (Nutraceuticals) Καινοφανή τρόφιμα (Novel Foods) Προβιοτικά Η ιστορία των προβιοτικών και η ανάπτυξή τους Η καταλληλότητα των προβιοτικών βακτηρίων Ο ρόλος των προβιοτικών βακτηρίων στην ανθρώπινη υγεία Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Γαλακτικά Βακτήρια (Lactic Acid Bacteria LAB) Γένος Lactobacillus Ζύμες Saccharomyces boulardii Φυσικά εκχυλίσματα Υδατική Εκχύλιση Εκχύλιση με διαλύτες Εκχύλιση μεθ υδρατμών Τερέβινθος Pistacia terebinthus Συστηματική Ταξινόμηση Χρήσεις Το δένδρο Οι καρποί Η ρητίνη Συγκομιδή ρητίνης γενικά Παρασκευή ρητίνης Πειραματικό μέρος Υλικά Σκεύη και όργανα Μικροοργανισμός Pistacia terebinthus ix

10 2.1.4 Θρεπτικό υλικό PDA Ringer pellets Προσομοιωση γαστρικου υγρού Αναλύσεις-μέθοδοι Εκχύλισμα πίσσας Πάφου Παρασκευή διαλύματος Ringer Παρασκευή stock διαλύματος μικροοργανισμού Παρασκευή στερεής καλλιέργειας για ανάπτυξη S. boulardii Υγρασία Ανάλυση πρωτεΐνης με τη μέθοδο Kjeldahl Ανάλυση σακχάρου με HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) Ταυτοποίηση πτητικών συστατικών GC/MS Απομόνωση πτητικών συστατικών με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid-Phase Micro-Extraction; SPME) Ανάλυση πτητικών συστατικών με GC/MS Προετοιμασία εκχυλισμάτων για τον ποσοτικό προσδιορισμό ολικών φαινολικών και αντιοξειδωτικών συστατικών της P. terebinthus Ποσοτικός προσδιορισμός ολικών φαινολικών συστατικών (Folin-Ciocalteau) Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας (DPPH ) Παρασκευή και μελέτη σκευασμάτων S. boulardii/p. terebinthus Βιωσιμοτητα S. boulardii σε διαφορες συνθηκες Βιωσιμότητα S. boulardii σε σκευάσματα μορφής χαπιών Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με πίσσα αιωρημένη υπό μορφή σκόνης Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με εκχύλισμα πίσσας Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία εκχυλίσματος πίσσας Πάφου Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία πίσσας Πάφου υπό μορφή σκόνης Αποτελέσματα και συζήτηση Χημική ανάλυση P. terebinthus Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με πίσσας Πάφου αιωρημένη υπό μορφή σκόνης Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με εκχύλισμα πίσσας Πάφου x

11 3.4 Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία εκχυλίσματος πίσσας Πάφου Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία πίσσας Πάφου υπό μορφή σκόνης Αποτελέσματα ανάλυσης πτητικών συστατικών με GC/MS Αποτελέσματα προσδιορισμού ολικών φαινολικών της P. terebinthus Αποτελέσματα ολικών αντιοξειδωτικών συστατικών P. terebinthus Συμπεράσματα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ελληνική Βιβλιογραφία Ηλεκτρονική Βιβλιογραφία xi

12 ΜΕΡΟΣ 1 - ΕΙΣΑΓΩΓΗ

13 1. Εισαγωγή 1.1 Λειτουργικά τρόφιμα- Τροφοφάρμακα (Nutraceuticals) Το δόγμα «Άσε την τροφή να γίνει το φάρμακό σου και το φάρμακό σου είναι η τροφή σου» που υιοθετήθηκε από τον Ιπποκράτη 2500 χρόνια πριν, έχει επανέλθει με νέες ιδέες και προοπτικές. Η δημιουργία και η συμβολή των λεγόμενων λειτουργικών τροφίμων έχει αποκτήσει νέα διάσταση και κεντρίζει το ενδιαφέρον του καταναλωτικού κοινού ολοένα και περισσότερο. Ο όρος «λειτουργικά τρόφιμα» εισήχθη για πρώτη φορά στη Ιαπωνία στα μέσα της δεκαετίας του 80 και αναφέρεται σε τρόφιμα στα οποία έχει δοθεί πρόσθετη λειτουργία (συχνά συνδεόμενη με την πρόληψη της υγείας/ασθένειας) με την προσθήκη νέων ή ήδη υπαρχόντων συστατικών. Ο εμπλουτισμός των τροφίμων γίνεται συνήθως με προσθήκη βιταμινών, ιχνοστοιχείων και άλλων εξειδικευμένων ουσιών με ειδική δράση όπως είναι οι στερόλες, ω3 λιπαρά οξέα και τα προβιοτικά. Ως λειτουργικά τρόφιμα χαρακτηρίζονται τα τρόφιμα ή τα συστατικά των τροφίμων, που παρέχουν οφέλη στην υγεία, πέρα από τα θρεπτικά συστατικά που ούτως ή άλλως περιέχουν και μπορεί να αποτελούν μέρος της καθημερινής διατροφής (German et al., 1999; Hasler, 1998). Τα λειτουργικά τρόφιμα έχουν χαρακτηριστεί ως «τρόφιμα με εμφάνιση παρόμοια με τα παραδοσιακά τρόφιμα τα οποία όταν καταναλώνονται ως τμήμα της φυσιολογικής δίαιτας επιδεικνύουν φυσιολογικά πλεονεκτήματα και /ή μειώνουν το κίνδυνο χρόνιων ασθενειών πέρα των βασικών θρεπτικών αναγκών» (Clydesdale, 1997). Ωστόσο, σε αντίθεση με τα παραδοσιακά τρόφιμα που μπορούν να φέρουν στην επισήμανσή τους μόνο ισχυρισμούς περί διατροφής, τα λειτουργικά τρόφιμα μπορούν να φέρουν ισχυρισμούς περί υγείας όταν συνοδεύονται από αποδείξεις (Kwakand Jukes, 2001). Σκοπός των λειτουργικών τροφίμων, λοιπόν, είναι σε πρώτο στάδιο να συμβάλλουν στη βελτίωση της κατάστασης της υγείας και της ευημερίας με μείωση για παράδειγμα της χοληστερόλης, προλαβάνοντας την οστεοπόρωση ή και ρυθμίζοντας της αρτηριακή πίεση. Επιπροσθέτως, παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόληψη ή στη 2

14 μείωση του κινδύνου εμφάνισης συγκεκριμένων ασθενειών όπως είναι ο καρκίνος, ο διαβήτης, η στεφανιαία νόσος και η υπέρταση. Τέλος, μπορούν σημαντικά να βελτιώσουν την πνευματική και σωματική ευεξία όταν φυσικά καταναλώνονται στο πλαίσιο ισορροπημένης διατροφής. Αν και τα λειτουργικά τρόφιμα είναι ένα σχετικά νέο δεδομένο για τη διατροφή µας, υπάρχει ήδη ένα πολύ αυστηρό νοµοθετικό πλαίσιο και ένας αυστηρός κανονισµός σε ισχύ από την 1η Ιουλίου του 2007, από την ΕΕ σχετικά µε την επισήμανση των τροφίµων και τον τρόπο διαφήµισης των θετικών ισχυρισµών αυτών των προϊόντων, το οποίο και έχει εναρµονισθεί µε το δίκαιο της κάθε χώρας µέλους, όπως και της χώρας µας. Επίσης, ο διεθνής οργανισµός Codex Alimentarius του FAO / WHO (Food and Agriculture Organization - Οργανισµός Τροφίµων και Γεωργίας / WorldHealth Organization-Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας) του ΟΗΕ, το Συμβούλιο της Ευρώπης και εθνικοί ρυθµιστικοί φορείς προβαίνουν σταδιακά στη θέσπιση πολύ συγκεκριμένων κανόνων, ώστε να διασφαλίσουν και να προστατέψουν τον καταναλωτή. Για να κυκλοφορήσει στην Ευρωπαϊκή αγορά ένα νέο λειτουργικό τρόφιμο πρέπει να κατατεθεί στην Ευρωπαική Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων (EFSA- European Food Safety Administration) πλήρης φάκελος με όλη την επιστημονική τεκμηρίωση για τις δηλούμενες για την υγεία ιδιότητες (health claims) οι οποίες ελέγχονται εργαστηριακά. Με βάση τους ισχύοντες κανόνες, συστατικά λειτουργικών τροφίμων μπορεί να είναι μόνο φυσικά προϊόντα, αποκλειόμενων έτσι των γενετικά τροποποιημένων (Παπαδοπούλου, 2007). Ως επί το πλείστον, τα λειτουργικά τρόφιμα περιλαμβάνουν: 1. Παραδοσιακά τρόφιμα που περιέχουν φυσικές βιοδραστικές ουσίες (πχ. διαιτητικές ίνες) ή τρόφιμα των οποίων κάποια από τα συστατικά έχουν εμπλουτισθεί (πχ. προβιοτικά, αντιοξειδωτικά, ιχνοστοιχεία). 2. Τρόφιμα από τα οποία έχει αφαιρεθεί ένα επιβλαβές συστατικό (μειωμένα κορεσμένα λιπαρά οξέα). 3. Τρόφιμα των οποίων η φύση έχει τροποποιηθεί με χημικές μεθόδους με σκοπό τη βελτίωση της υγείας (πχ. υδρολυμένος τύπος πρωτεϊνών για μείωση της πιθανότητας αλλεργιογόνου επίδρασης). 3

15 4. Τρόφιμα στα οποία η βιοδιαθεσιμότητα ενός ή περισσοτέρων συστατικών έχει αυξηθεί ώστε να παρέχουν μεγαλύτερη απορρόφηση κάποιου συστατικού (πχ. ιχνοστοιχεία). 5. Συνθετικά συστατικά τροφίμων που προστίθενται σε παραδοσιακά τρόφιμα (πχ. πριβιοτικά). Τα λειτουργικά τρόφιµα αποκτούν διαρκώς όλο και μεγαλύτερο μερίδιο στη διεθνή αγορά και είναι σίγουρο ότι το μερίδιο αυτό θα αυξηθεί ακόμα περισσότερο τα επόμενα έτη. Οι λόγοι της δημοφιλίας τους είναι πολλοί και σχετίζονται κυρίως µε την αύξηση και διαφοροποίηση των καταναλωτικών επιθυμιών, τις διαδοχικές διατροφικές κρίσεις και σκάνδαλα, την εύρεση καινοτόμων τρόπων παραγωγής και μεθόδων εµπλουτισμού όλων των λειτουργικών τροφίµων, την επιβάρυνση της υγείας λόγω του τρόπου ζωής, την αύξηση του κόστους της υγειονομικής περίθαλψης και τη σημασία της πρόληψης των ασθενειών, καθώς και τη νέα νομοθεσία που επιτρέπει την ευκολότερη είσοδό των λειτουργικών τροφίµων στην αγορά. Μερικά καινοτόμα λειτουργικά τρόφιμα που κυκλοφορούν στο εμπόριο είναι οι παιδικές τροφές, αρτοποιήματα και δημητριακά, προϊόντα ζαχαροπλαστικής, γαλακτοκομικά προϊόντα, έτοιμα γεύματα, σνακ, αναψυκτικά όπως ποτά για ενέργεια και σπορ, κρεατοσκευάσματα και αλοιφές. 1.2 Καινοφανή τρόφιμα (Novel Foods) Η ανάγκη της ιατρικής πρόληψης και η διατήρηση καλής φυσικής κατάστασης του ανθρώπινου οργανισμού, έχουν οδηγήσει τους καταναλωτές σε αναζήτηση τροφίμων που όχι μόνον είναι θρεπτικά αλλά παράλληλα παρέχουν πρόσθετα διαιτητικά οφέλη και κατά συνέπεια έχουν ευεργετική επίδραση στην υγεία. Μια νέα κατηγορία τροφίμων που μπορούν να επηρεάσουν ευεργετικά στην ανθρώπινη υγεία λόγω της υψηλής περιεκτικότητας τους σε βιοενεργά συστατικά, είναι τα «καινοφανή τρόφιμα» (novel foods). Τα καινοφανή τρόφιμα, είναι τρόφιμα που παράγονται μετά από επεξεργασία κατά την οποία μεταβάλλεται σημαντικά η σύσταση ή / και η θρεπτική τους αξία ή τρόφιμα που παράχθηκαν με εφαρμογή γενετικής μηχανικής (Guerinot, 4

16 2000; Yeet al., 2000). Παράδειγμα των καινοφανών τροφίμων αποτελούν τα λειτουργικά τρόφιμα (Pouteau, 2002). Στις νέες μεθόδους παραγωγής τροφίμων συμπεριλαμβάνονται καινοτόμες μέθοδοι (νέοι τύποι θερμικής επεξεργασίας, μη θερμικές μέθοδοι συντήρησης, νέες μέθοδοι ψύξης, λυοφιλίωση ή αφυδάτωση των τροφίμων, νέοι τύποι εξοπλισμού πχ. Βιοαντιδραστήρες και εφαρμογή νέων διεργασιών όπως η ενζυμική κατάλυση (Howlett et al., 2003)). Αυτές είναι νέες μέθοδοι, συμβάλουν σημαντικά στη βελτίωση της μικροβιακής ασφάλειας και στη συντήρηση της θρεπτικής αξίας και των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των τροφίμων, μειώνοντας στο ελάχιστο την ένταση των διεργασιών, τις ενεργειακές απαιτήσεις και τα απόβλητα. 1.3 Προβιοτικά Η λέξη προβιοτικό είναι σύνθετη και προέρχεται από το λατινικό «pro» που σημαίνει υπέρ και το βίος, δηλαδή ζωή. Τα προβιοτικά, λοιπόν, είναι μικροοργανισμοί «υπέρ ζωής». Κατά το Fuller, «τα προβιοτικά, είναι ζωντανά μικροβιακά συμπληρώματα που ευεργετικά επηρεάζουν και βελτιώνουν την εντερική μικροχλωρίδα». Κατά τον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας (FAO) των Ηνωμένων Εθνών και η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO) ως προβιοτικά ορίζονται «οι ζωντανοί μικροοργανισμοί (βακτήρια ή ζύμες), τα οποία κατά την κατάποση ή όταν εφαρμόζονται σε τοπικό επίπεδο σε επαρκή αριθμό παρέχουν ένα ή περισσότερα αποδεδειγμένα οφέλη για την υγεία του υποδοχέα ασθενή». Τα προβιοτικά έχουν τη δυνατότητα να διατηρούν την ισορροπία της εντερικής χλωρίδας και να επηρεάζουν το ανοσοποιητικό μας σύστημα. Ανταγωνίζονται τα παθογόνα βακτήρια και τα παρεμποδίζουν να εγκατασταθούν, καταλαμβάνοντας τους υποδοχείς των κυττάρων του εντέρου και καταναλώνοντας τα θρεπτικά συστατικά που τα παθογόνα θα χρησιμοποιούσαν. Αυτό επιτυγχάνεται με την ικανότητα τους να προσκολλώνται στα τοιχώματα του εντέρου αυξάνοντας τον αριθμό τους σε σχέση με τα παθογόνα βακτήρια, ρυθμίζοντας έτσι την εντερική μικροχλωρίδα άμεσα. 5

17 Τα προβιοτικά είναι ζώντες μικροοργανισμοί που χαρακτηρίζονται από την ωφέλιμη δράση που ασκούν στον οργανισμό, είναι μη παθογόνα και μη τοξικά ενώ αποικούν στο έντερο και συμβάλλουν στη διαδικασία του μεταβολισμού. Έχουν τη δυνατότητα να αποικήσουν και σε άλλους βλεννογόνους, όπως για παράδειγμα στον κολπικό βλεννογόνο όπου και προλαμβάνουν σημαντικά τις τοπικές λοιμώξεις. Έτσι αποτελούν μια ισχυρή άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος. Πίνακας 1. Βασικότερα είδη προβιοτικών μικροοργανισμών Lactobacillus Bifidobacterium Lactococcus Enterococcus Saccharomyces (L. acidophilus,l. plantarum,l. rhamnosus,l. paracasei, L. rhamnosus, L. johnsoni) (B. bifidum, B. infantis, B. longum) (L. lactis) (E. faecium, E. faecalis) (S. boulardii, S. cerevisiae) Το ανθρώπινο παχύ έντερο περιέχει περίπου 12 log βακτηριακών κυττάρων ανά γραμμάριο εντερικών υγρών και πάνω από 400 διαφορετικά μικροβιακά είδη (Rastall,2004). Ο μεγάλος βακτηριακός πληθυσμός του εντέρου οφείλεται στο ευνοϊκό για αυτόph, στον αργό χρόνο διέλευσής τους και την αφθονία θρεπτικών ουσιών (Gibson et al.,2000). Ορισμένοι από τους γηγενείς μικροοργανισμούς του παχέος εντέρου υγιών ατόμων περιορίζουν τη δραστηριότητα των παθογόνων στελεχών των γενών Escherichia, Clostridium, Salmonella και Campylobacter, που εντοπίζονται στο έντερο και μπορούν να προκαλέσουν εντερικές διογκώσεις και διάρροια (Rolfe, 2000; Ziemer and Gibson, 1998). Παράδειγμα αυτών αποτελούν, τα προβιοτικά γένη Bifidobacterium spp. και Lactobacillus spp. που έχουν μελετηθεί εκτενώς και έχουν χαρακτηριστεί ως πολύτιμοι κάτοικοι του εντέρου (Nielsen et al., 2003). Γενικά, ως προβιοτικά ορίζονται τα «ζωντανά μικροβιακά συμπληρώματα τροφών που έχουν ευεργετικές επιπτώσεις στον άνθρωπο όταν τα προσλαμβάνει για βελτίωση της 6

18 εντερικής μικροβιακής ισορροπίας» (Fuller, 1989). Η πρόσληψη των ζωντανών προβιοτικών οργανισμών μειώνει ή εξαλείφει ασθένειες όπως ο ερεθισμός του παχέος εντέρου, η δυσκοιλιότητα και η διάρροια των ταξιδιωτών, παρεμποδίζει την ανάπτυξη των παθογόνων βακτηρίων, συμβάλλει στη σύνθεση βιταμινών Β, μειώνει το επίπεδο της αμμωνίας στο αίμα, ελαττώνει τη χοληστερόλη και παρεμποδίζει το σχηματισμό όγκων (Roberfroid, 2000; Ziemer and Gibson, 1998). Εντούτοις, προκειμένου να επιδράσουν θετικά οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι ουσιαστικό να υπάρχουν τουλάχιστον 106 ζωντανά κύτταρα ανά γραμμάριο προϊόντος (Shah, 2002). Διάφοροι Δημόσιοι Οργανισμοί υπεύθυνοι για τα τρόφιμα ανά τον κόσμο έχουν εισαγάγει κανονισμούς που θέτουν κατώτερα όρια στον αριθμό των ζωντανών προβιοτικών βακτηρίων που πρέπει να υπάρχουν σε ένα προβιοτικό τρόφιμο κατά τη διάρκεια της πώλησής του (IDF, 1992; Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001). Συνήθως, οι προβιοτικές καλλιέργειες μπορούν να είναι αποτελεσματικότερες όταν λαμβάνονται μέσω κάποιου τροφίμου. Με τη λήψη του τροφίμου υπάρχει ταχεία άνοδος του ph του στομάχου και τα προβιοτικά βακτήρια μπορούν να φτάσουν ευκολότερα ασφαλή στο λεπτό έντερο όπου δρουν με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα (Gueimondeet al., 2004). Θεωρώντας ότι η περιοχή δράσης των προβιοτικών βακτηρίων είναι στο ανθρώπινο έντερο, είναι ουσιαστικό να διατηρηθεί η βιωσιμότητά τους σ αυτό (Gueimonde et al., 2004). Μια δημοφιλής προσέγγιση για να επιτευχθεί αυτό είναι η χρήση πριβιοτικών ουσιών (συμβιωτικά τρόφιμα). Το οικοσύστημα του παχέος εντέρου μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας πριβιοτικά όπως η ινουλίνη, και οι φρουκτοολιγοσακχαρίτες (FOS- fructooligosaccharides) για να παρέχει ένα υπόστρωμα επιβίωσης για τους επιθυμητούς μικροοργανισμούς (Roberfroid, 2001). Τα συνηθέστερα προβιοτικά βακτήρια ανήκουν στα οξυγαλακτικά βακτήρια, όπως πχ. ο L. acidophilus και τo Bifidobacteriums sp. (Tannock, 2002). Αυτά τα βακτήρια βρέθηκε ότι αποτρέπουν τη διάρροια στα παιδιά, καταστέλλουν τα παθογόνα βακτήρια του εντερικού σωλήνα, ανακουφίζουν τα συμπτώματα της δυσανεξίας της λακτόζης και ενισχύουν τον πληθυσμό των ευεργετικών βακτηρίων στο ανθρώπινο έντερο (Rafter,2004; Sanders, 2000, 2003). Τα πολυάριθμα οφέλη για την υγεία και η αυξανόμενη συνειδητοποίηση των 7

19 καταναλωτών για τα προβιοτικά έχουν κινήσει την προσοχή της βιομηχανίας τροφίμων (Saarela et al., 2002; Salminen and Gueimonde, 2004) ως προς τον τομέα αυτό. Οι επιχειρήσεις τροφίμων παράγουν όλο και περισσότερα τρόφιμα με ενσωματωμένα προβιοτικά βακτήρια. Προβιοτικά γαλακτοκομικά προϊόντα όπως τα προβιοτικά γιαούρτια που περιέχουν L. acidophilus, L. casei και Bifidobacterium ssp. Κατέχουν σημαντικό ποσοστό μεταξύ των διαθέσιμων στο εμπόριο προβιοτικών τροφίμων (Reid et al., 2003) Η ιστορία των προβιοτικών και η ανάπτυξή τους Η χρήση ζωντανών βακτηρίων για βελτίωση της υγείας δεν είναι μια νέα έννοια καθώς γίνεται αναφορά ακόμη και στις γραφές (Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001).Ομοίως, σύμφωνα με την Αγιουρβέδα (Ayurveda), μια από τις πρωτοποριακές ιατρικές επιστήμες που χρονολογείται από το 2500 π.χ, η κατανάλωση γιαουρτιού συστηνόταν για την βελτίωση της υγείας (Chopra and Doiphode, 2002). Γνωστοί επιστήμονες της αρχαιότητας όπως ο Ιπποκράτης χαρακτήριζαν το ζυμωμένο γάλα όχι ως τρόφιμο αλλά ως γιατρικό. Έχει τεκμηριωθεί επίσης ότι συνέστηναν σε ανθρώπους με στομαχικές και εντερικές διαταραχές τη πρόσληψη ξινογάλακτος (Oberman, 1985). Ο Elie Metchnikoff θεωρείται ο πρωτοπόρος στην ανάπτυξη των σύγχρονων προβιοτικών. Στις αρχές του εικοστού αιώνα, το 1908 με την διδακτορική του διατριβή The prolongation of life (Επιμήκυνση της ζωής), υποστήριξε ότι οι γαλακτοβάκιλλοι της γιαούρτης βελτιώνουν την υγεία και φέρνουν την μακροημέρευση (Metchnikoff,1908). Την ίδια περίοδο, ο Γάλλος παιδίατρος Tissier, ανακάλυψε τα Bifidobacteria και πρότεινε ότι μπορεί να δράσουν αποτελεσματικά στην πρόληψη των μολύνσεων σε νήπια που θηλάζουν (Tissier, 1906). Επιπλέον, προς το τέλος του 19ου αιώνα οι μικροβιολόγοι απέδειξαν ότι η μικροχλωρίδα του γαστρεντερικού σωλήνα υγιών ατόμων διέφερε σημαντικά από τη μικροχλωρίδα ασθενών. Η έρευνα συνεχίστηκε με απομόνωση και χαρακτηρισμό αυτών των μικροοργανισμών και στην συνέχεια αποδείχτηκε ότι η πρόσληψη αυτών των βακτηρίων μπορεί να παρέχει ένα ευρύ φάσμα θεραπευτικών ωφελειών στους ανθρώπους. Αυτή η ευεργετική μικροχλωρίδα χαρακτηρίστηκε ως προβιοτικά (Benkouider, 2004). Ο ρόλος των γαλακτοβακίλλων και των Bifidobacteria στην εντερική μικροχλωρίδα έγινε 8

20 εμφανέστερος τη δεκαετία του '40 (Fuller, 1989). Οι γαλακτοβάκιλλοι ήταν το πρώτο βακτηριακό γένος που παρουσίασε οφέλη για την υγεία (Gomes and Malcata,1999). Ο L. acidophilus που υπάρχει στο γιαούρτι θεωρήθηκε αρμόδιος για τη μακροζωία ανατολικών Ευρωπαίων που το κατανάλωναν παραδοσιακά ως βασικό τρόφιμο (Stantonet al., 2003). Στην περίοδο από το , ο L. acidophilus χρησιμοποιήθηκε σε ζυμωμένο γάλα για να θεραπεύσει τη διάρροια και τη δυσκοιλιότητα (Kopellof, 1926). Η χρήση των Bifidobacteria στη βιομηχανία ξεκίνησε στην Ιαπωνία όταν το 1971, η επιχείρηση βιομηχανίας γάλακτος Morinaga ανέπτυξε το πρώτο ζυμωμένο γαλακτοκομικό προϊόν που περιείχε το στέλεχος Β. longum. To 1978, η Yakult κυκλοφόρησε στην Ιαπωνία, ένα υγρό γιαούρτι με την επωνυμία «MilMil» που περιείχε τα στελέχη B. breve, B. bifidum και L. acidophilus (Hughes and Hoover, 1995; Ishibashiand Shimamura, 1993). Στη συνέχεια, τα προβιοτικά συμπεριλήφθησαν στην κατηγορία των λειτουργικών τροφίμων (Stanton et al., 2001) και πλέον είναι διαθέσιμα υπό μορφή σκόνης ή ταμπλέτας, αλλά συνηθέστερα ως γαλακτοκομικά προϊόντα (Sanders and Huis in t Veld,1999). Τα τελευταία χρόνια η αγορά των προβιοτικών γαλακτοκομικών προϊόντων έχει μεγαλώσει και επεκταθεί γρήγορα σε όλη την Ευρώπη, τη Βόρεια Αμερική, την Ιαπωνία, την Αυστραλία και άλλες αναπτυγμένες χώρες (Heasman and Mellentin, 2001; HilliamandYoung, 2000; Stantonetal., 2003) Η καταλληλότητα των προβιοτικών βακτηρίων Η πληθώρα των προβιοτικών στελεχών που έχουν αναγνωριστεί ως προς τη συνεισφορά τους στην καλύτερη υγεία των ανθρώπων ανήκουν στα γένη των γαλακτοβακίλλων και των Bifidobacteria (Prasad et al., 1998). Όμως, υπάρχουν και είδη όπως οι λακτόκοκκοι, εντερόκοκκοι, σακχαρομύκητες καθώς και προπιονικά βακτήρια που επίσης έχουν χαρακτηριστεί ως προβιοτικά είδη (Grant and Salminen, 1998; Salminen and vonwright, 1998; Sanders and Huisin tveld, 1999). Για να θεωρηθεί ένα στέλεχος προβιοτικού βακτηρίου ότι ασκεί θετική επίδραση στον άνθρωπο, πρέπει να εκπληρώνει ορισμένα κριτήρια, τα κυριότερα εκ των οποίων είναι: 1. Να αποτελεί γηγενή συστατικό του ανθρώπινου γαστρεντερικού συστήματος 9

21 (ανθρώπινης προέλευσης) 2. Να επιβιώνει στο άνω πεπτικό σύστημα 3. Να δρα ευεργετικά όταν βρίσκεται στο γαστρεντερικό σωλήνα 4. Να αντέχει στα οξέα και τα χολικά άλατα 5. Να είναι ασφαλές για ανθρώπινη κατανάλωση 6. Να παράγει αντιμικροβιακές ουσίες όπως βακτηριοσίνες 7. Να μπορεί να προσκολληθεί στον ανθρώπινο εντερικό σωλήνα και να αποικίσει (Sanders, 2003). Από τα παραπάνω, η ικανότητα προσκόλλησης των προβιοτικών στον εντερικό βλεννογόνο θεωρείται η σημαντικότερη καθώς έτσι τα προβιοτικά παραμένουν στο έντερο για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα και παρεμποδίζουν τη προσκόλληση παθογόνων μικροοργανισμών λειτουργώντας ανοσορυθμιστικά. Η ικανότητα προσκόλλησης των προβιοτικών ποικίλει, διότι επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως τα γαστρικά υγρά του στομάχου, τις συνθήκες ανάπτυξής τους, τον αριθμό των ανακαλλιεργειών και την χρησιμοποίηση κρυοπροστατευτικών στην περίπτωση που αυτά έχουν λυοφιλιωθεί (Elo et al., 1991; Tuomola et al., 2000; Ouwehand et al., 2001).Τέλος, τα προβιοτικά βακτήρια πρέπει να διαθέτουν τεχνολογικές ιδιότητες, όπως : 1. Να μπορούν να καλλιεργούνται σε μεγάλη κλίμακα, 2. Να έχουν μεγάλο χρόνο ζωής, 3. Να συμβάλλουν στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των προϊόντων όταν χρησιμοποιούνται για την παρασκευή προϊόντων ζύμωσης, 4. Να διατηρείται η βιωσιμότητά τους σε όλη τη διάρκεια ζωής του προϊόντος, 5. Να έχουν σταθερότητα στην κατάψυξη και ξήρανση. Γενικά, η βιωσιμότητα των προβιοτικών θεωρείται σημαντικό κριτήριο καθώς απότις μέχρι τώρα κλινικές μελέτες φαίνεται ότι τα ζωντανά κύτταρα είναι βασική προϋπόθεση για την ανάπτυξη ανοσορυθμιστικής δράσης (Temmerman et al., 2001; 10

22 Hamilton-Miller, 2001). Τέλος, τα προβιοτικά που προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση πρέπει να αποδεικνύεται ότι είναι χαμηλού κινδύνου όσο αφορά την πρόκληση ασθενειών καθώς και να μη συσχετίζονται με κάποια ασθένεια (FAO/WHO, 2001). Σε σύγκριση με τα άλλα προβιοτικά είδη, τα γαλακτικά βακτήρια είναι σχετικά ασφαλή και σπάνια έχουν συσχετιστεί με κάποια ασθένεια (Salminen et al., 1998) Ο ρόλος των προβιοτικών βακτηρίων στην ανθρώπινη υγεία Εικόνα 1: Ανθρώπινο πεπτικό σύστημα Το ανθρώπινο πεπτικό σύστημα αποτελείται από τον οισοφάγο, το στομάχι, το λεπτό έντερο και το παχύ έντερο. Μετά τη μάσηση της τροφής ακολουθεί η κατάποση της και γρήγορα η τροφή περνάει στο στομάχι μέσω του οισοφάγου. Εκεί αναμιγνύεται με το όξινο περιβάλλον του γαστρικού υγρού και πολτοποιείται από τις συσπάσεις και περισταλτικές κινήσεις του στομάχου. Ο χυμός στην συνέχεια κατευθύνεται προς το λεπτό έντερο όπου υφίσταται την επίδραση της χολής, του παγκρεατικού και εντερικού υγρού. Στο λεπτό έντερο γίνεται η απορρόφηση του μεγαλύτερου μέρους 11

23 των θρεπτικών συστατικών χάρη στις μκρολάχνες των επιθηλιακών κυττάρων. Στο παχύ έντερο εκκρίνεται βλέννα και όχι ένζυμα για αυτό και η χώνευση της τροφής έχει ολοκληρωθεί προτού εισέλθει στο παχύ έντερο. Ωστόσο, στο παχύ έντερο γίνεται ζύμωση του χυμού από την γηγενή μικροχλωρίδα και απορροφάται νερό από αυτό. Κατά την μικροβιακή ζύμωση παράγονται βιταμίνες του συμπλέγματος Β, ενώ τα κολοβακτηριοειδή παράγουν βιταμίνη Κ. Η κύρια αποστολή του παχέος εντέρου είναι η εναπόθεση του άπεπτου μέρους των τροφών μέχρι την αποβολή τους και η απορρόφηση νερού από αυτό (Ζερφυρίδης, 1998). Συνεπώς, η γαστρεντερική μικροχλωρίδα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της πεπτικής οδού και τον ανεφοδιασμό των θρεπτικών ουσιών, ενώ μπορεί να παρεμποδίσει την ανάπτυξη παθογόνων βακτηρίων, να αποτρέψει τη νοσηρότητα και να μειώσει την αντιβιοτική χρήση. Το γαστρεντερικό σύστημα περιλαμβάνει πολλούς μικροοργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων προαιρετικά και υποχρεωτικά αναερόβιων μικροοργανισμών, που ποικίλουν ως προς το είδος και τον αριθμό (Mitsuoka, 1996; Fooks et al. 1999; Tannock, 2002). Αυτό κάνει το γαστρεντερικό σωλήνα μια σύνθετη κοινοπραξία μικροοργανισμών που ανήκουν σε περισσότερα από 400 διαφορετικά βακτηριακά είδη (Cummings and Macfarlane, 1991). Τα αρχικά βακτηριακά κύτταρα φθάνουν από τη στοματική κοιλότητα μέσω του σάλιου στο στομάχι και μόνο οι μικροοργανισμοί που είναι ανθεκτικοί στις όξινες συνθήκες επιζούν. Λιγότερο από κύτταρα που ανήκουν στα γένη των στρεπτόκοκκων, σταφυλόκοκκων και γαλακτοβακίλλων εντοπίζονται στο στομάχι. Οι αριθμοί αυξάνονται σε 105 έως 107 κύτταρα στον ειλεό και αποτελούνται από αναερόβια Gram αρνητικά βακτήρια (Mitsuoka, 1996). Στο παχύ έντερο, οι βακτηριακοί αριθμοί είναι 1011 έως 1014, όπου τα υποχρεωτικά αναερόβια είδη υπερισχύουν με κυρίαρχο βακτηριακό είδος το Bacteroides fragilis. Άλλα βακτηριακά είδη ανήκουν στα γένη Bifidobacteria, κλωστρίδια, πεπτόκοκκοι, στρεπτόκοκκοι, Εubacteria, γαλακτοβάκιλλοι, πεπτοστρεπτόκοκκοι, Rumenococci, εντερόκοκκοι, κολοβακτήρια, μεθανογενή και ακετογενή βακτήρια (Fooks et al., 1999). Οι αλλαγές στη διατροφή, το στρες, η χρήση αντιβιοτικών καθώς και η υπερβολική υγιεινή μπορούν να αλλάξουν τη μικροβιολογία των εντέρων (Isolauri et al., 2002). Μελέτες έχουν δείξει ότι η διαταραχή της μικροβιακής ισορροπίας των εντέρων μπορεί να οδηγήσει σε σχετικές ασθένειες όπως η ιδιοπαθής φλεγμονώδης εντερική νόσος, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και ορισμένες αλλεργικές ασθένειες 12

24 (Salminen et al., 1996; Bjorksten et al., 1999; Kalliomaki et al., 2001; Malin et al., 1996). Γενικά, τα προβιοτικά βακτήρια συμβάλλουν στην διατήρηση της υγιούς ισορροπίας της μικροχλωρίδας του πεπτικού μας συστήματος καθώς προστατεύουν από εντερικά παθογόνα που προκαλούν γαστρεντερίτιδες και διάρροιες, καταπολεμούν τα ελικοβακτηρίδια του πυλωρού που ευθύνονται για το έλκος του στομάχου, ενισχύουν το ανοσοποιητικό μας σύστημα, βελτιώνουν τις ανοσολογικές λειτουργίες των εντέρων, ανακουφίζουν την ιδιοπαθή φλεγμονώδη εντερική νόσο, προστατεύουν από αλλεργίες ή έχουν ακόμα και αντικαρκινική δράση (Kalliomaki et al., 2001, 2003; Saarela et al., 2000; Greenwald et al., 2001). Επιπλέον, μπορούν να συμβάλουν στη μείωση της χοληστερόλης και στη πρόληψη της οστεοπόρωσης, να διευκολύνουν την αφομοίωση των βιταμινών, ανόργανων συστατικών και αμινοξέων από τον οργανισμό. Τέλος, με τη δράση των προβιοτικών το αίμα ελευθερώνεται από τις τοξίνες (van Putten et al., 2006). Επίσης, διάφορες μελέτες δείχνουν ότι τα συμπτώματα της δυσανεξίας της λακτόζης περιορίζονται με την κατανάλωση ζυμωμένων προβιοτικών γαλακτοκομικών προϊόντων (Salminen and Gueimonde, 2004; Vesa et al., 2000) λόγω της χαμηλότερης συγκέντρωσης λακτόζης στο τελικό προϊόν με συνέπεια την υψηλή δράση της λακτάσης και αύξηση της ποσότητας του ενζύμου που εισέρχεται στο λεπτό έντερο (Vesa et al., 2000; Fonden et al., 2000). Επιπλέον, τα προβιοτικά φαίνεται να προφυλάσσουν ή και να βελτιώνουν τη διάρροια επιδρώντας θετικά στο ανοσοποιητικό σύστημα ενώ προφυλάσσουν από μολύνσεις λόγω συναγωνισμού με τους παθογόνους μικροοργανισμούς για κατάληψη θέσης εντός της γαστρεντερικής οδού και στα επιθηλιακά κύτταρα. Τα προβιοτικά παρεμποδίζουν την ανάπτυξη παθογόνων βακτηρίων μέσω της παραγωγής ανασταλτικών ουσιών και κατ επέκταση δημιουργούν δυσμενές περιβάλλον μέσα στη γαστρεντερική οδό (Perdigon et al., 1995; Jack et al., 1995). Μελέτες παρουσιάζουν βελτίωση των συμπτωμάτων σε ασθενείς που πάσχουν από διάρροια των ταξιδιωτών μετά τη χορήγηση προβιοτικών (DuPont and Ericsson, 1993). Έχει αναφερθεί από ερευνητές ότι η χορήγηση προβιοτικών σε ασθενείς που λαμβάνουν αντιβιοτική θεραπεία μπορεί να μειώσει κατά 30% ως 50% τον κίνδυνο από διάρροιες (Surawicz et al. 1989), ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις απέτρεψε την εμφάνισή τους 13

25 όταν καταναλώθηκαν με μορφή γιαουρτιού ή ως λυοφιλιωμένο προϊόν (Colombel et al., 1987; 2000). Αυτά τα αποτελέσματα είναι κυρίως τεκμηριωμένα για νήπια ενώ τα στοιχεία για την περίπτωση των ενηλίκων δεν είναι επαρκώς τεκμηριωμένα (Salminen and Gueimonde, 2004). Σημαντική είναι και η δράση των προβιοτικών σε ασθενείς που πάσχουν από οξεία γαστρεντερίτιδα. Μελέτες έχουν δείξει ότι επιλεγμένα προβιοτικά βακτήρια, όπως L. rhamnosus GG, L. reuteri, L. casei shirota, B. lactis Bb12, L. delbrueckii ssp. bulgaricus και L. acidophilus μειώνουν σημαντικά το χρόνο διάρκειας της διάρροιας που προκαλείται από ρετροϊούς (Kaila et al., 1992). Ο μηχανισμός πίσω από αυτήν την ευνοϊκή έκβαση συνδέεται με την αύξηση του επιπέδου των αντισωμάτων κατά την ανάρρωση. Επομένως, προτείνεται η χρήση ορισμένων στελεχών προβιοτικών βακτηρίων για την προώθηση της συστηματικής και τοπικής ανοσίας απέναντι στο ρετροϊό, παρέχοντας έτσι προστασία από νέες μολύνσεις (DeRoos and Katan, 2000; Fonden et al., 2000). Όσον αφορά τα ιδιοπαθή φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου (Inflammatory Bowel Disease, IBD) και συγκεκριμένα την ασθένεια του Crohn (Crohn s disease, CD) και την ελκώδη κολίτιδα (Ulcerative Colitis, UC), που προσβάλλουν το παχύ (UC και CD) και το λεπτό έντερο (CD), έχει παρατηρηθεί ότι η χορήγηση /8 προβιοτικών, όπως π.χ. L. rhamnosus GG και L. salivarius UCC 118, αλλά και S. cerevisiae ssp. boulardii, μειώνει τη συχνότητα των υποτροπών και αυξάνει τη διάρκεια των περιόδων ύφεσης (Guslandi et al. 2000; Hamilton-Miller et al. 2001).Τα τελευταία χρόνια έχει διαπιστωθεί ότι οι διαφορές στην εντερική μικροβιακή σύνθεση συσχετίζονται με την εμφάνιση ορισμένων αλλεργικών ασθενειών (Bjorksten e al., 2001; Kalliomaki et al., 2001). Αυτό επομένως υποδεικνύει την πιθανή εφαρμογή των προβιοτικών βακτηρίων και σ αυτό το πεδίο. Χορήγηση L. rhamnosus GG. και Β. lactisbb12 προγεννητικά στη μητέρα και κατά τη διάρκεια των πρώτων μηνών σε νήπια μευψηλό κίνδυνο ατοπικών ασθενειών, μείωσε την επικράτηση του ατοπικού εκζέματος (Kalliomaki et al., 2003; Majama and Isolauri, 1997). Η έκθεση των άνοσων κυττάρων του εντερικού σωλήνα στους σωστούς τύπους μικροοργανισμών από την παιδική ηλικία μπορεί να αποβεί σημαντική για την πρόληψη της εκδήλωσης αλλεργίας σε μετέπειτα στάδια της ζωής. Εργαστηριακές μελέτες έχουν δείξει ότι τα προβιοτικά βακτήρια μειώνουν το ποσοστό της χοληστερόλης σε in vitro μελέτες (Gilliland et al., 1985; Gilliland and Walker, 1989) αν και τα αποτελέσματα είναι αντιφατικά. Μελέτη στην Ινδία σε ομάδα ατόμων που 14

26 κατανάλωνε βουβαλίσιο γάλα με προβιοτική καλλιέργεια L. acidophilus έδειξε μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης κατά 12-20% μετά από 1 μήνα (Khedkar et al., 1993), ενώ η κατανάλωση γάλακτος με προβιοτική καλλιέργεια E. Faecium προκάλεσε μεταβολή των επιπέδων της χοληστερόλης στο αίμα μετά από 6 εβδομάδες χορήγησης (Richelsen et al., 1996). Δίαιτες πλούσιες σε κρέας και σε λιπαρά και ταυτόχρονα φτωχές σε φυτικές ίνες ενοχοποιούνται για την αύξηση της δραστηριότητας ορισμένων ενζύμων όπως της β-γλυκουρονιδάσης, αζωρεδουκτάσης, ουρεάσης και νιτρορεδουκτάσης (Greenwald et al., 2001). Τα ένζυμα αυτά μετατρέπουν προκαρκινιγόνες ουσίες σε καρκινογόνες και συμβάλλουν στην αύξηση του κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του εντέρου. Έχει παρατηρηθεί ότι η κατανάλωση γαλακτοβακίλλων μειώνει τη δράση των ενζύμων αυτών αν και δεν έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τον πραγματικό κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου. Παρόλα αυτά, επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η κατανάλωση ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του εντέρου (Hirayama and Rafter, 2000). Διάφορες μελέτες έχουν εστιάσει στην επίδραση των προβιοτικών στην εντερική μικροοικολογία και τον καρκίνο (DeRoos and Katan, 2000) ενώ άλλες δείχνουν ότι συγκεκριμένα στελέχη προβιοτικών βακτηρίων μπορούν να δεσμεύσουν τις καρκινογόνες ουσίες (Haskard et al., 2001) και να απορρυθμίσουν τις εντερικές ενζυμικές δραστηριότητες, μειώνοντας τα καρκινογόνα μικροβιακά ένζυμα. Εντούτοις για να εξαχθεί ασφαλές συμπέρασμα απαιτούνται περαιτέρω κλινικές μελέτες σε διάφορες χώρες (Salminen and Gueimonde, 2004; Tomasik and Tomasik, 2003). Τέλος, επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η κατανάλωση ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων και ειδικότερα γιαουρτιού μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού (van t Veer et al., 1989). Ωστόσο πρέπει να τονισθεί ότι η χρήση των προβιοτικών πέρα από τις θετικές επιδράσεις στην υγεία ενέχει και ορισμένους κινδύνους. Καταρχάς, δεν θα πρέπει να καταναλώνονται υπερβολικά μεγάλες ποσότητες ημερησίως καθώς σ αυτήν την περίπτωση υπάρχει πιθανότητα πρόκλησης πονοκεφάλων, διάρροιας ή δυσκοιλιότητας. Επίσης έχει αναφερθεί, αν και είναι πολύ σπάνιες οι περιπτώσεις, ότι με τη χρήση προβιοτικών μπορεί να εμφανιστούν προβλήματα όπως βακτηρίωση και σηψαιμία (Τσακαλίδου, 1998). Αν και αυτοί οι κίνδυνοι είναι πολύ μικροί, γίνονται 15

27 περαιτέρω μελέτες για να εξαλειφθούν, αφού τα προβιοτικά αποτελούν αναμφισβήτητα ένα σημαντικό διατροφικό όπλο του ανθρώπινου οργανισμού. Προκειμένου να σχεδιασθούν τα προβιοτικά του μέλλοντος πρέπει να συγκεκριμενοποιηθούν τα κριτήρια επιλογής τους και να κατανοηθεί σε βάθος ο μηχανισμός δράσης τους. Αυτό θα διευκολύνει στην επιλογή προβιοτικών με πιο εξειδικευμένα χαρακτηριστικά και άρα με πιο εξειδικευμένες εφαρμογές, όπως π.χ. για συγκεκριμένες ηλικιακές ομάδες ή για συγκεκριμένες ομάδες ασθενών. Πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η ικανότητα προσκόλλησης των προβιοτικών είναι διαφορετική στο εντερικό επιθήλιο ανθρώπων διαφορετικής ηλικίας και επηρεάζεται από τη φυσιολογία του επιθηλίου ανάλογα με το αν ο άνθρωπος ασθενεί ή είναι υγιής (Ouwenhand et al., 2002). Τα τελευταία χρόνια γίνονται μελέτες σχετικά με την πιθανή ευεργετική δράση των μη ζωντανών προβιοτικών κυττάρων καθώς πλεονεκτούν των ζωντανών ως προς το μεγαλύτερο χρόνο ζωής και το μικρότερο κόστος συντήρησης, μεταφοράς και ασφάλειας. Μελέτες που έχουν γίνει με μη ζωντανά κύτταρα έχουν δείξει μείωση της διάρκειας διάρροιας που προκαλείται από ρετροϊούς (Kaila et al., 1995) και καταπράυνση σε περιπτώσεις δυσανεξίας στη λακτόζη (Vesa et al., 2000). Σημαντικές αλλαγές στον τομέα των προβιοτικών τροφίμων έχουν σημειωθεί τα τελευταία χρόνια (IDF, 1991; Fonden et al., 2000). Η απομόνωση νέων μικροοργανισμών με προβιοτικές ιδιότητες και ιδιαίτερα εκείνων που αποτελούν μέρος της φυσικής εντερικής χλωρίδας του ανθρώπου, οδήγησαν τις βιομηχανίες γάλακτος στην προσθήκη προβιοτικών μικροοργανισμών ή στην αντικατάσταση των ήδη χρησιμοποιούμενων μικροοργανισμών σε γνωστά παραδοσιακά ζυμωμένα προϊόντα Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Γαλακτικά Βακτήρια (Lactic Acid Bacteria LAB) Τα γαλακτικά βακτήρια είναι μια μεγάλη ομάδα βακτηρίων με παρόμοιες ιδιότητες και κύριο χαρακτηριστικό τους την παραγωγή γαλακτικού οξέος μέσω της ζύμωσης των υδατανθράκων. Αυτοί οι μικροοργανισμοί είναι ετερότροφοι και γενικά έχουν σύνθετες διατροφικές απαιτήσεις αφού έχουν έλλειψη από πολλές βιοσυνθετικές ικανότητες. Τα περισσότερα είδη των γαλακτικών βακτηρίων έχουν αυξημένες 16

28 απαιτήσεις σε αμινοξέα και βιταμίνες. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι οι πιο σημαντικοί προβιοτικοί μικροοργανισμοί που συνδέονται συνήθως με το ανθρώπινο γαστρεντερικό σύστημα. Στην κατηγορία των γαλακτικών βακτηρίων ανήκουν τα εξής γένη: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Weissella, Lactococcus και Vagococcus (Stiles and Holtzapfel, 1997). Ωστόσο κάποιοι υποστηρίζουν ότι στην κατηγορία αυτή των γαλακτικών βακτηρίων ανήκουν και κάποια γένη όπως Aerococcus, Erysipclothrix και Mycobacterium. Τα γαλακτικά βακτήρια χαρακτηρίζονται γενικά ως μεσόφιλα αλλά έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από 5 ο C ως 45 ο C. Το ph για την ανάπτυξη των περισσοτέρων γαλακτικών βακτηρίων κυμαίνεται μεταξύ 4,0 με 6,5, ενώ κάποια είδη μπορούν να αναπτυχθούν και σε χαμηλότερο ph όπως το 3,2 ή σε υψηλότερο ph όπως το 9,6. Η λιπολυτική και πρωτεολυτική τους ικανότητα θεωρείται αρκετά ασθενής. Συγκεκριμένα για την ανάπτυξή τους απαιτείται η παρουσία βιταμινών, αμινοξέων και βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης, και για το λόγο αυτό τα μέσα στα οποία καλλιεργούνται περιέχουν πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, διάφορα ιχνοστοιχεία και υδατάνθρακα που θα αποτελέσει την πηγή ενέργειας. Τα γαλακτικά βακτήρια σχηματίζουν μικρές σχετικά αποικίες ανεξάρτητα από την αφθονία των απαραίτητων συστατικών του μέσου ανάπτυξής τους, ενώ χαρακτηρίζονται από υψηλή ανεκτικότητα στα οξέα. Η ικανότητά τους αυτή να παράγουν μεγάλες ποσότητες γαλακτικού οξέος και να αντέχουν υπό αυτές τις συνθήκες αποτελεί ένα σημαντικότατο πλεονέκτημα των γαλακτικών βακτηρίων έναντι των άλλων βακτηρίων. Διακρίνονται δύο κατηγορίες γαλακτικών βακτηρίων, τα ομοζυμωτικά και τα ετεροζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια. Τα ομοζυμωτικά βακτήρια (Homofermentative) γλυκολύουν τις εξόζες και παράγουν γαλακτικό οξύ. Συγκεκριμένα, διασπούν την 1,6-διφωσφο-φρουκτόζη (FDP) σε δύο ισοτριόζες, την 3- φωσφογλυκεριναλδεϋδη (GAP) και την φωσφο-διυδροξυακετόνη, με την δράση της 1,6- δισφωσφορικής αλδολάσης. Από την 3-φωσφο- γλυκεριναλδεϋδη σχηματίζεται πυροσταφυλικό οξύ από το οποίο τελικά παράγεται το γαλακτικό οξύ που αποτελεί και το κύριο προϊόν αυτού του τρόπου ζύμωσης (Axelsson, 1998; Kandler, 1983; Stryer, 1997). Χαρακτηριστικά ομοζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια αποτελούν τα γένη των Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus και Pediococcus. Τα ετεροζυμωτικά βακτήρια οξειδώνουν τη γλυκόζη προς 6-φωσφο-γλυκονικό οξύ και ακολουθεί 17

29 αποκαρβοξυλίωση. Η πεντόζη στη συνέχεια διασπάται σε 3-φωσφο-γλυκεριναλδεϋδη και ακέτυλο- φωσφορικό οξύ με τη δράση μιας φωσφοκετολάσης. Το αποτέλεσμα αυτού του τρόπου ζύμωσης της εξόζης παράγει CO 2, αιθανόλη και γαλακτικό οξύ σε ίσα μέρη. Στα ετεροζυμωτικά βακτήρια ανήκουν τα στελέχη του γένους Leuconostoc και μερικά στελέχη του Lactobacillus spp. Τα ετεροζυμωτικά βακτήρια έχουν επίσης την ικανότητα να χρησιμοποιούν εξωτερικούς δέκτες ηλεκτρονίων για να αναγεννούν το NADH και να αποδίδουν επιπλέον ενέργεια ενώ έχουν στερούνται των ενζύμων ανδολάση και ισομεράση της εξόζης (Stryer, 1997), γι αυτό και μετατρέπουν την εξόζη σε πεντόζη (τη γλυκόζη σε ριβόζη). Η χρήση των γαλακτικών βακτηρίων για την παραγωγή ζυμωμένων προϊόντων, συμβάλλει στη συντήρηση των τροφίμων αυτών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα κυρίως λόγω της μείωσης του ph εξαιτίας της παραγωγής του γαλακτικού οξέος (Dugaset al., 1999). Επιπλέον συμβάλλουν στη βελτίωση της γεύσης, του αρώματος και της υφής των προϊόντων. Ορισμένα γαλακτικά βακτήρια παράγουν διάφορα παράγωγα πολυσακχαριτών τα οποία συμμετέχουν σε σημαντικό βαθμό στη διαμόρφωση της υφής των ζυμωμένων τροφίμων και κυρίως των γιαουρτιών. Τέλος, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βιομηχανική παραγωγή γαλακτικού οξέος. Τα γαλακτικά βακτήρια συνιστούν μια μεγάλη ομάδα βακτηρίων με κοινές ιδιότητες και χαρακτηρίζονται για την παραγωγή γαλακτικού οξέος από τη ζύμωση των υδατανθράκων. Είναι ετερότροφοι μικροοργανισμοί και η πλειοψηφία τους έχει αυξημένες απαιτήσεις σε αμινοξέα και βιταμίνες. Τα γαλακτικά βακτήρια αποτελούν τους σημαντικότερους προβιοτικούς μικροοργανισμούς που συνδέονται με το ανθρώπινο γαστρεντερικό σύστημα. Στην κατηγορία των γαλακτικών βακτηρίων ανήκουν τα εξής γένη: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Weissella, Lactococcus και Vagococcus (Stiles and Holtzapfel, 1997). Ωστόσο κάποιοι υποστηρίζουν ότι στην κατηγορία αυτή των γαλακτικών βακτηρίων ανήκουν και κάποια γένη όπως Aerococcus, Erysipclothrix και Mycobacterium. Τα γαλακτικά βακτήρια χαρακτηρίζονται γενικά ως μεσόφιλα αλλά έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από 5 ο C ως 45 ο C, ενώ σχηματίζουν μικρές σχετικά αποικίες. Το ph για την ανάπτυξη των περισσοτέρων γαλακτικών 18

30 βακτηρίων κυμαίνεται μεταξύ 4,0 με 6,5, ενώ κάποια είδη μπορούν να αναπτυχθούν και σε χαμηλότερο ph όπως το 3,2 ή σε υψηλότερο ph όπως το 9,6. Διαχωρίζονται σε δύο βασικές κατηγορίες, τα ομοζυμωτικά και τα ετεροζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια. Στην κατηγορία των ομοζυμωτικών γαλακτικών βακτηρίων συμπεριλαμβάνονται τα γένη των Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus και Pediococcus ενώ στην κατηγορία των ετεροζυμωτικών συμπεριλαμβάνονται τα στελέχη του γένους γένη των Leuconostoc και μερικά στελέχη του Lactobacillus spp. Η χρήση των γαλακτικών βακτηρίων για την παραγωγή ζυμωμένων προϊόντων, συμβάλλει στη συντήρηση των τροφίμων αυτών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα κυρίως λόγω της μείωσης του ph εξαιτίας της παραγωγής του γαλακτικού οξέος (Dugaset al., 1999). Διαδραματίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη βελτίωση της γεύσης, του αρώματος και της υφής των προϊόντων. Αντίθετα, στη βιομηχανία τροφίμων, τα γαλακτικά βακτήρια είναι πιθανότατα υπεύθυνα και για την αλλοίωση προϊόντων. Ετεροζυμωτικοί λακτοβάκιλλοι μπορεί να προκαλέσουν ανεπιθύμητη βλέννα σε ορισμένα τυριά εξαιτίας της δημιουργίας υδατανθράκων. Μπορεί να προκαλέσουν αλλοίωση των κατεψυγμένων τροφίμων και του μαγειρεμένου κρέατος, διατηρώντας την ατμόσφαιρα πλούσια σε διοξείδιο του άνθρακα. Μολαταύτα, αυτό μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών που προκαλούν αλλοίωση αλλά και παθογόνων μικροοργανισμών, προκαλώντας λασπώδη υφή, πράσινο χρώμα, αέριο, και όξινη γεύση. Πολλά λαχανικά που υπόκεινται σε ζύμωση περιέχουν λακτοβάκιλλους. Στα αρχικά στάδια επικρατούν Leuconostoc και/ή ετεροζυμωτικοί λακτοβάκιλλοι, αλλά το τελικό προϊόν συνήθως κυριαρχείται από πιο οξύ-ανθεκτικά, ομοζυμωτικά είδη (Narvhus et al., 2003) Τα είδη Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus και Enterococcus των γαλακτικών βακτηρίων και συγκεκριμένα τα στελέχη που φαίνονται στον πίνακα είναι προβιοτικά Γένος Lactobacillus Οι γαλακτοβάκιλλοι είναι γηγενή βακτήρια της βλεννογόνου μεμβράνης των ανθρώπων και ζώων, της στοματικής κοιλότητας, του εντέρου ή του κόλπου. Περίπου 70 είδη του γένους των γαλακτοβακίλλων έχουν χαρακτηριστεί (Tannock, 2002). Αυτοί 19

31 οι οργανισμοί είναι μικροαναερόβιοι ή αναερόβιοι, οξυάντοχοι ή οξύφιλοι. Γενικά, οι γαλακτοβάκιλλοι έχουν περίπλοκες διατροφικές απαιτήσεις διότι απαιτούν μικρή ποσότητα οξυγόνου, υδατάνθρακες επιδεκτικούς για ζύμωση, πρωτεΐνες και αμινοξέα, βιταμίνες της Β-ομάδας, παράγωγα των νουκλεϊκών οξέων, ακόρεστα ελεύθερα λιπαρά οξέα, και μέταλλα όπως μαγνήσιο Ζύμες Οι ζύμες είναι ευκαρυωτικοί, μονοκύτταροι μικροοργανισμοί, που είναι ευρέως διαδεδομένοι στο φυσικό περιβάλλον, ενώ στις μέρες μας χίλια περίπου είδη ζυμών είναι γνωστά. Οι ικανότητες των ζυμών να μεταβολίζουν τους υδατάνθρακες, έχουν γίνει αντικείμενο μελέτης και εκμετάλλευσης από τους ανθρώπους εδώ και χιλιάδες χρόνια, στην παραγωγή οίνου, μπύρας και άρτου. Η ζύμη που έχει ερευνηθεί και έχει χρησιμοποιηθεί περισσότερο από όλα τα είδη ζύμης είναι ο S. cerevisiae, γνωστή και ως ζύμη αρτοποιίας. Οι ζύμες, πέραν του γεγονότος, ότι έχουν αξιοποιηθεί ευρέως στην παραγωγή τροφίμων, ποτών και φαρμάκων, αποτελούν ισχυρό παράδειγμα ευκαρυωτικών κυττάρων, ικανών να ενισχύσουν τις γνώσεις στις βιολογικές και βιοϊατρικές επιστήμες. Η μελέτη του γονιδιώματος των ζυμών συμβάλλει στην κατανόηση πολλών ανθρώπινων ασθενειών και κληρονομικών διαταραχών. Σχηματίζουν χαρακτηριστικές λευκές κρεμ ωοειδείς αποικίες με ευχάριστη οσμή και το θρεπτικό καλλιέργειας είναι το Potato Dextrose Agar. Αναπτύσσονται σε θερμοκρασία 25 ο C 30 ο C. Από τις ζύμες ως προβιοτικοί μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται ο S. boulardii και ο S. cerevisiae Saccharomyces boulardii Ο S. boulardii είναι ένα τροπικό στέλεχος ζύμης το οποίο αρχικά απομονώθηκε από τα φυτά lychee και mangosteento 1923 από το Γάλλο επιστήμονα Henri Boulard. Σχετίζεται αλλά παράλληλα είναι αρκετά διαφορετικό στέλεχος από το S. cerevisiae καθώς διαφέρουν ταξινομικά και στις μεταβολικές/γενετικές τους ιδιότητες. Χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο ως προβιοτικό με σκοπό την εισαγωγή της δραστικής και ευεργετικής του καλλιέργειάς του στο παχύ και στο λεπτό έντερο ενώ 20

32 ταυτόγχρονα προστατεύει τον οργανισμό από παθογόνους μικροοργανισμούς. Πίνακας 2: Συστηματική ταξινόμηση του S. boulardii Βασίλειο Συνομοταξία Υποσυνομοταξία Ομοταξία Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Fungi Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Saccharomyces S. boulardii Υπάρχουν πολυάριθμες μελέτες που δείχνουν την αποτελεσματικότητα του S. boulardii στη θεραπεία και πρόληψη γαστρεντερικών διαταραχών. Σε περιπτώσεις όπως η οξεία διάρροια, το σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου, στη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου καθώς επίσης και στις εντερικές διαταραχές ασθενών που πάσχουν από AIDS προβιοτικά σκευάσματα του S. boulardii βοηθούν σημαντικά την ασθένεια και μειώνουν αποτελεσματικά τις κινήσεις του εντέρου. Ο S. boulardii σε πρώτο στάδιο παρουσιάζει δράση ενάντια τοξίνων εκκρίνοντας μια πρωτεάση kda 54 η οποία έχει τη δυνατότητα να αποκοδομεί τοξίνες Α και Β που εκκρίνονται από το Clostridium difficile με αναστολή της σύνδεσής τους. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των εντεροτοξικών και κυτταροτιξικών επιδράσεων από το Clostridium difficile. Παράλληλα, χαρακτηρίζεται από αποτελεσματική αντιμικροβιακή δράση. Δύο ιδιαίτερα γνωστά παθογόνα βακτήρια που είναι υπεύθυνα για την πρόκληση οξείας διάρροιας όπως είναι η Escherichia coli και η Salmonella typhimurium, φαίνεται να προσκολλώνται έντονα στη μαννόζη της επιφάνειας του S. boulardii μέσω υποδοχέων λεκτίνης. Από τη στιγμή που το παθογόνο βακτήριο θα προσκολληθεί στον S. 21

33 boulardii, αναστέλλεται η πρόσδεσή του στις μικρολαχνωτές παρυφές και στη συνέχεια αποβάλλεται από τον οργανισμό κατά τη διάρκεια της επόμενης κίνησης του εντέρου. Επίσης, συμβάλλει σημαντικά στη μείωση της υπερέκκρισης νερού και ηλεκτρολυτών (ιόντων χλωριδίου) που προκαλείται από την τοξίνη της χολέρας κατά τη διάρκεια μιας μόλυνσης. Η 120 kda πρωτεάση που παράγεται από τον S.boulardii. επιδρά στα εντεροκύτταρα που βρίσκονται στο μεγάλο και στο μικρό εντερικό σωλήνα και αναστέλλεται η διέγερση της αδενυλικής κυκλάσης, η οποία οδηγεί σε μείωση της παραγωγής της εντεροκυτταρικής κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης και της έκκρισης χλωριδίου. Πολύ σπουδαία είναι η αντιφλεγμονώδης δράση που παρουσιάζει ο S. boulardii ενάντια στη μόλυνση του εντέρου από E. coli η οποία προκαλεί έκκριση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης ιντερλευκίνης 8 (IL8) Εικόνα 2: Φωτογραφία απεικόνισης S. boulardii στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο 1.4 Φυσικά εκχυλίσματα Το εκχύλισμα, εξ ορισμού, είναι το προϊόν μιας διαδικασίας καθαρισμού, που είναι δυνατό να απομονωθεί από ένα δοθέν περίβλημα. Τα φυσικά εκχυλίσματα, έχουν διαδραματίσει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο από την αρχαιότητα. Ιερογλυφικά της Αιγύπτου δείχνουν με ποιους τρόπους παρασκεύαζαν εκχυλίσματα φυτών που χρησιμοποιούσαν για ποικίλες χρήσεις π.χ. καλλυντικά, τρόποι που συνεχίστηκαν για 22

34 πολλά χρόνια μέχρις ότου η συνθετική χημεία αναπτυχθεί ιδιαίτερα.. Υπάρχουν ποικίλοι τρόποι κατηγοριοποίησης των φυτικών εκχυλισμάτων. Μερικοί από τους πιο συνηθισμένους είναι οι ακόλουθοι : α) Τομέας εφαρμογής (αντι-φλεγμονώδη, αντιμικροβιακά, ενυδατικά εκχυλίσματα κ.τ.λ.) β) Όνομα βοτάνου ή οικογένειας βοτάνων γ) Μέθοδος εξαγωγής εκχυλίσματος (έγχυση, διήθηση, διαβροχή, χρήση διαλυτών, απόσταξη μεθ υδρατμών) Υδατική Εκχύλιση Η υδατική εκχύλιση συνήθως πραγματοποιείται με κρύο ή ζεστό νερό σε ξηρά ή μικρά κομμάτια του φυτού. Αυτή η μέθοδος προσφέρει πολικά, υδατοδιαλυτά μόρια από την πηγή. Η εκχύλιση με ζεστό νερό παρέχει το πλεονέκτημα της αποστείρωσης καθώς επίσης και το σημαντικό μειονέκτημα των θερμικά επιταχυνόμενων χημικών αντιδράσεων, το οποίο μπορεί να προκαλέσει κατανομή ή μεταβολή των ενεργών συστατικών Εκχύλιση με διαλύτες Η συγκεκριμένη εκχύλιση μπορεί να πραγματοποιηθεί με διάφορους διαλύτες όπως είναι η αιθανόλη, η ισοπροπανόλη, η ακετόνη ή και το εξάνιο. Γενικά, τέτοιοι διαλύτες εκχυλίζουν λιγότερο πολικά συστατικά από ότι εκχυλίζει το νερό ως διαλύτης. Το εξάνιο ειδικά, είναι ιδανικός διαλύτης για μη πολικές ενώσεις όπως είναι τα έλαια και προϊόντα απόσταξής τους. Η εκχύλιση των πολικών συστατικών με αλκοόλες ή μίγματα αλκοολών - νερού είναι συχνά πιο θεμιτή από ότι η εκχύλιση με σκέτο νερό. Μολαταύτα, σε πολλές περιπτώσεις είναι συχνό φαινόμενο το γεγονός ότι μέρος των ελαίων και των αποσταγμάτων τους εκχυλίζονται πράγμα που οδηγεί σε δυσκολίες στις ιδιότητες εφαρμογής των συγκεκριμένων εκχυλισμάτων. 23

35 1.4.3 Εκχύλιση μεθ υδρατμών Η εκχύλιση μεθ υδρατμών είναι μια μέθοδος που εύκολα διαχωρίζει τα πτητικά συστατικά από όλα τα υπόλοιπα. Χρησιμοποιείται από την αρχαιότητα με απώτερο σκοπό τη λήψη αιθέριων ελαίων από τα φυτά. Αυτή η διαδικασία ξεκίνησε τοποθετώντας το φυτό σε νερό που βράζει, όπου ο ατμός φεύγει ταχύτητα κατευθείαν εντός της φιάλης και συλλέγεται το συμπύκνωμα όλων των πτητικών. Η διαδικασία αυτή συνήθως διαρκεί αρκετές ώρες και απαιτεί θέρμανση έως 100 o C, θερμοκρασία ικανή να μεταβάλλει χημικές ιδιότητες του εκχυλίσματος. Τελικώς, διαπιστώνεται ότι η παραγωγή φυσικών εκχυλισμάτων για εμπορική χρήση, αποτελεί μία σχέση «έμπνευσης» ανάμεσα στη φύση και την επιστήμη. Είναι ιδιαίτερα σημαντική η γνώση της παρασκευής και σύνθεσης τους, εφόσον χρησιμοποιούνται ευρέως σε τρόφιμα, φάρμακα ή και καλλυντικά. Επόμενος στόχος είναι οι οργανοληπτικές ιδιότητες των εκχυλισμάτων να εξυπηρετούν περισσότερο την προσθήκη τους σε καλλυντικά και φάρμακα ώστε το παραγόμενο προϊόν να ικανοποιεί απόλυτα τον καταναλωτή. 1.5 Τερέβινθος Pistacia terebinthus H γνωστότερη, στο ευρύ κοινό, αρωματική φυσική ρητίνη, είναι αυτή που εξάγεται από το μαστιχόδεντρο ( Pistacia lentiscus var.chia ) και ονομάζεται Μαστίχα Χίου. Η χρήση της συγκεκριμένης μαστίχας είναι ευρεία εδώ και αρκετά χρόνια στα τρόφιμα, στα φάρμακα και γενικότερα στη βιομηχανία. Η συλλογή της μαστίχας γίνεται με τον παραδοσιακό τρόπο, δηλαδή εργάτες ισοπεδώνουν το χώρο γύρω από το δέντρο και σχίζουν τον κορμό του δέντρου σε συγκεκριμένα σημεία. Η μαστίχα αρχίζει να ρέει και σε 15 περίπου μέρες σταθεροποιείται και είναι έτοιμη προς συλλογή. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιείται από μέσα Αυγούστου μέχρι τα μέσα Σεπτεμβρίου. Κατόπιν το προϊόν κοσκινίζεται, πλένεται και καθαρίζεται επιμελώς, κομμάτι-κομμάτι, και κατόπιν προωθείται στο εμπόριο. Ωστόσο, στην παρούσα διπλωματική έρευνα προτιμήθηκε να χρησιμοποιηθεί ένα άλλο είδος αρωματικής ρητίνης, η Πίσσα Πάφου, που δεν έχει διερευνηθεί τόσο πολύ όσο η μαστίχα Χίου. 24

36 Η τερέβινθος ή τσικουδιά ή κοκκορεβυθιά ή τραμιθιά ή και τριμιθιά (Pistacia terebinthus) είναι ένα δένδρο πολύ γνώριμο στην περιοχή της Μεσογείου, για τους νόστιμους και πικάντικους καρπούς του. Ο Διοσκουρίδη την αναφέρει ως τέρμινθο και ο Θεόφραστος ως τέρμινθος η αγρία. Οι αρχαίοι χρησιμοποιούσαν τη ρητίνη της σαν αρωματική ύλη. Παρέχει πολύτιμη, πλούσια σε τερεβινθίνη ρητίνη, που διατίθενται στο εμπόριο με μορφή λευκών, υαλωδών, άμορφων κρυστάλλων ως τερεβινθίνη της Χίου ή της Κύπρου. Ο καρπό της, τα τσίουδα ή τα τρεμίθια της Κύπρου, χυμένος με αλάτι αποτελεί εύγεστο τράγημα και μετά από άλεση και έκθλιψη μας δίνει παχύρευστο λάδι με ευχάριστη μυρωδιά, το φαρμακευτικό τερεβίνθιον έλαιον του Διοσκουρίδη. Στη Χίο το λάδι αυτό ήταν απαραίτητο στη ζαχαροπλαστική αλλά και στη μαγειρική. Σε αρκετές από τις παραδοσιακές συνταγές το συναντάμε. Τα άγουρα τσίκουδα τα όπλα του Ιούδα των Γερμανών- τα οποία αναπτύσσονται σε αφθονία την άνοιξη μας δίνουν κίτρινη χρωστική. Συγγενεύει με τη φιστικιά (Pistacia vera) και το σχίνο (Pistacia lentiscus), από του οποίου τη Χιώτικη ποικιλία εξάγεται η πίσσα Πάφου. Εικόνα 3: Άνθος της Pistacia terebinthus Συστηματική Ταξινόμηση Η τσικουδιά ανήκει στο γένος των Πιστακίων, της οικογένειας των Ανακαρδιοειδών της τάξης των Σαπινδωδών. Άλλα είδη της οικογένειας είναι το Πιστάκιο του Άτλαντα στο Λίβανο και το Πιστάκιο της Κίνας, ένα δένδρο λιγότερο φουντωτό. Η καταγωγή 25

37 της είναι μεσογειακή και τη βρίσκουμε από την Ισπανία μέχρι το Λίβανο. Πίνακας 3: Συστηματική κατάταξη Pistacia terebinthus Βασίλειο: Συνομοταξία: Ομοταξία: Υφομοταξία: Τάξη: Οικογένεια: Γένος: Είδος: Φυτά (Plantae) Αγγειόσπερμα (Magnoliophyta) Δικοτυλήδονα (Magnoliopsida) Ροδίδες (Rosidae) Σαπινδώδη (Sapindales) Ανακαρδιοειδή (Anacardiaceae) Πιστακιά (Pistacia) P. terebinthus Χρήσεις Κύριος σκοπός της καλλιέργειάς της δεν είναι τα νόστιμα και μυρωδάτα τσίκουδα αλλά η κρεμεντίνα. Αυτή είναι ρητίνη όμοια με το ρετσίνι του πεύκου, από την οποία, μετά από ειδική επεξεργασία (βρασμός), παράγεται η τερεβινθίνη, το γνωστό νέφτι (Chian or Scio turpentine). Ακόμη χρησιμοποιείται σε βερνίκια και είναι βασικό συστατικό σε λαδομπογιές. Η διαφορά στην κρεμεντίνα είναι ότι περιέχει μεγάλες ποσότητες ταννίνης. Έτσι παράγεται ένα λάδι που χρησιμοποιείται για να σκουραίνει και να γυαλίζει δέρματα όπως και από το βελανίδι ή την πέτικα. Το μαστιχαδιενολικό οξύ που παράγεται από την κρεμεντίνα, χρησιμοποιείται ως αντιφλεγμονώδες, όπως απέδειξε ομάδα καθηγητών στο τμήμα φαρμακολογίας του Πανεπιστημίου της Βαλένθια στην Ισπανία με πειράματα σε ποντίκια το 2002, αλλά και για πολλές άλλες φαρμακευτικές χρήσεις, όπως τα αντηλιακά έλαια Το δένδρο Η τερέβινθος είναι δένδρο δίοικο που φτάνει μέχρι και τα 10 μέτρα. Φυτρώνει σε ξηρές, ανοιχτές, πετρώδεις θέσεις, συνήθως σε ασβεστολιθικές πλαγιές στην 26

38 ευμεσογειακή και στη θερμότερη περιοχή της παραμεσογειακής βλάστησης. Με κατάλληλο κλάδεμα μπορεί να παραμείνει σε χαμηλό ύψος προκειμένου να είναι ευκολότερη η συγκομιδή των καρπών της. Πρέπει να φτάσει στην ηλικία των 7 έως 10 ετών για να κάνει καρπό και ξεχωρίζει σε αρσενικό και θηλυκό. Ένα αρσενικό δένδρο φτάνει για να επικονιάσει από 8 έως 12 θηλυκά στην ίδια περιοχή. Καρπούς κάνουν μόνο τα θηλυκά που ανθίζουν μεταξύ Μάρτη και Απρίλη κάθε χρόνο Οι καρποί Οι μικροί φυστικοειδείς καρποί ξεκινούν να μεγαλώνουν αμέσως μετά σε σχηματισμό κοντούρας. Αλλάζουν πολλά χρώματα και στο τέλος του καλοκαιριού από κόκκινοι μετατρέπονται σε σκούρο μελανό, ενώ το επόμενο σκούρο πράσινο χρώμα δείχνει και την ωριμότητά τους. Τα φύλλα της τερεβίνθου είναι ατρακτοειδή, πράσινα, γυαλιστερά και σχηματίζουν συστάδες των 9 (4 και 4 αντικριστά και ένα στην άκρη) σε σχήμα ψαροκόκκαλου. Αν χαράξεις τον κορμό της τρέχει ρετσίνι με έντονη οσμή και κολλώδεις ιδιότητες, η κρεμεντίνα, η οποία έχει πολλαπλές χρήσεις. Οι καρποί της, τα τσίκουδα, υπάρχουν σε πολλές ποικιλίες για διαφορετικές χρήσεις. Τα πρώιμα αρχίζοντας περίπου από τα τέλη Ιουνίου, τα Ψιλάντικα, τα Χατζημηνάτα, τα Ρεβυθάτα που είναι χοντρά και σαρκώδη, τα Ψιλά για την παραγωγή λαδιού και τα σέρτικα. Όλα εκτός από τα σέρτικα μπορούν με κατάλληλη πίεση να ανοίξουν το κέλυφός τους σε δύο ίσα μέρη - γαβαθάκια και να ελευθερώσουν το νόστιμο και θρεπτικό περιεχόμενο τους.η τεχνική της συγκομιδής των τσίκουδων για παραγωγή λαδιού γίνεται στα τέλη του καλοκαιριού μόλις ωριμάσει ο καρπός, με το στρώσιμο υφασμάτων τσόλες - κάτω από το δένδρο όπου πέφτει ο καρπός, καθώς κάποιος ραβδίζει τα ψηλότερα σημεία του δένδρου σε ψιλή ανεμόσκαλα. Τα τσίκουδα στη συνέχεια τρίβονται για να πέσουν από τα τσαμπιά και τοποθετούνται σε σκάφες με νερό για να ξεχωρίσουν τα κούφια που επιπλέουν, από τα γεμάτα. Στεγνά πλέον μεταφέρονται στο ελαιοτριβείο για να μετατραπούν σε λάδι. Αφού κοπανιστούν, αλέθονται και μπαίνουν στο στειράκι, όπου με πίεση βγαίνει όλος ο χυμός τους που συγκεντρώνεται σε δεξαμενή. Το λάδι που επιπλέει, μαζεύεται με μια κομμένη κολοκύθα που χρησιμοποιείται σαν κουτάλα και τοποθετείται σε μπουκάλια ή νταμιτζάνες για οικιακή χρήση. Το λάδι που προκύπτει από τους καρπούς περιέχει ένα δυνατό συνδυασμό πρωτεϊνών και τανίνης 27

39 και είναι νόστιμο, παχύ και μυρωδάτο, κατάλληλο για την ζαχαροπλαστική αλλά και ως καρύκευμα φαγητών Η ρητίνη Ορισμένα κωνοφόρα δένδρα, όταν τραυματιστούν από διάφορες αιτίες (άνεμο, φωτιά, κεραυνό ή κ.ά.) εκκρίνουν ένα πυκνόρρευστο, κολλώδες, άχρωμο υγρό, τη ρητίνη, η οποία καλύπτει την πληγή και προστατεύει το δένδρο από προσβολές υγρασίας, σήψης και ξυροφθόρων εντόμων. Η ροή της ρητίνης γίνεται μέσω των ρητινοφόρων αγωγών, οι οποίοι συνδέονται μεταξύ τους δημιουργώντας ένα «δίκτυο συγκοινωνούντων αγγείων». Ρητινοφόρους αγωγούς διαθέτουν τα πεύκα, η ερυθρελάτη και τα ξενικά είδη ψευδοτσούγκα και λάρικα, όμως σημαντικές ποσότητες ρητίνης παράγουν κυρίως η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis) και δευτερευόντως η τραχεία πεύκη (Pinus brutia). Στην Ελλάδα σήμερα η παραγωγή ρητίνης προέρχεται εξ ολοκλήρου από τη χαλέπιο πεύκη, ενώ στο παρελθόν ρητινεύονταν και κάποια δάση τραχείας πεύκης Συγκομιδή ρητίνης γενικά Στη χώρα μας η ρητινοσυλλογή ρυθμίζεται από το Β.Δ 439/68 ΦΕΚ (150/Α/1968). Σήμερα χρησιμοποιείται αποκλειστικά η μέθοδος της αποφλοίωσης με διάνοιξη μετώπου και χημική επίδραση πάστας θειικού οξέος. Η μέθοδος αυτή αξιοποιώντας την ανατομία του ξύλου (αξονικοί και ακτινικοί ρητινοφόροι αγωγοί) προκαλεί τον ερεθισμό και το άνοιγμα των ακτινικών αγωγών. Χρησιμοποιούνται ειδικά εργαλεία για τη διαμόρφωση του μετώπου ρητίνευσης και την τοποθέτηση σε αυτό της πάστας θειικού οξέος. Η παραγόμενη ρητίνη οδηγείται από το μέτωπο με τη βοήθεια μεταλλικών οδηγών ροής σε μεταλλικά ή πλαστικά δοχεία τα οποία στερεώνονται κατάλληλα στη βάση του μετώπου. Οι εργασίες ρητίνευσης ξεκινούν το Μάρτιο κάθε έτους και ολοκληρώνονται το μήνα Νοέμβριο. Η ρητίνευση δεν έχει αρνητικές επιπτώσεις στην ποιότητα του ξύλου, που εξακολουθεί να είναι κατάλληλο για διάφορα προϊόντα (πριστή ξυλεία, χαρτοπολτός, μοριόπλακες κ.ά) μέχρι την απορητίνευσή του, οπότε το δένδρο υλοτομείται αμέσως αφού αφαιρεθούν όλα τα 28

40 μεταλλικά αντικείμενα που χρησιμοποιούνται κατά τη διαδικασία ρητίνευσης Παρασκευή ρητίνης Από τις πληγές, που κατ αυτόν τον τρόπο προκαλούνται στον κορμό του δένδρου, βγαίνει μια παχύρευστη και ρητινώδης ουσία, η τρεμιντίνα, που είναι παρόμοια με την πίσσα Πάφου και έχει σκούρο χρώμα. Η τρεμιντίνα συλλέγεται από και τοποθετείται σε ειδικά δοχεία. Στην αρχή είναι υποκίτρινη και παχύρευστη, αλλά όταν καθαριστεί και βραστεί μέσα σε ειδικό καζάνι σε σιγανή φωτιά, όπου ανακατεύεται συνέχεια, αποβάλλει μεγάλη ποσότητα αιθέριου ελαίου, ρευστοποιείται και αποκτά χρώμα γαλακτώδες. Στη συνέχεια σουρώνεται με κατάλληλο ύφασμα μέσα σε ξύλινη σκάφη που περιέχει μεγάλη ποσότητα νερού. Ακολούθως πλάθεται για αρκετή ώρα μέχρις ότου το χρώμα της από υποκίτρινο αρχίσει να γίνεται άσπρο. Το νερό ανανεώνεται διαρκώς ώστε να είναι πάντοτε κρύο. Με την κατεργασία που υφίσταται η τρεμιντίνα γίνεται συνεχώς πιο άσπρη και πιο ελαστική. Εικόνα 4: Ρητίνη P. terebinthus 29

41 ΜΕΡΟΣ 2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 30

42 2. Πειραματικό μέρος 2.1 Υλικά Σκεύη και όργανα Τα όργανα και σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση της πειραματικής διαδικασίας ήταν: 1. Αυτόκαυστο. 2. Δονητής vortex: IKA-VIBRO-FIX. 3. Ζυγός φαρμακευτικός: EXACTA, Alessandrini Strumentazione. 4. Ζυγός ακριβείας Cobo. 5. Ζυγός αναλυτικής ακριβείας: METTLER 200. Orma model BC. 6. Θερμοθάλαμοι θέρμανσης-ψύξης: 7. WBT BINDER, B , o C. 8. TERMAKS, o C. 9. Πεχάμετρο ηλεκτρονικό: EPI-BION SENTRON ph-system Συσκευή καθαρισμού νερού: LABCONCO WATER PRO PS (με φίλτρα απιονισμού, ενεργού άνθρακα και απομάκρυνσης οργανικού φορτίου). 11. Συσκευή απόσταξης με υδρατμούς απλή. 12. Υγρός χρωματογράφος υψηλής πίεσης: SHIMADZU LIQUID CHROMATOGRAPH LC-9A (Στήλη: Shim-pack SCR-101N, 142/B. Κινητή φάση: καλά απαερωμένο και φιλτραρισμένο νερό υψηλής καθαρότητας (σύστημα ισοκρατικό). Ανιχνευτής: Refractive Index Detector RID-6A. Φούρνος: Column oven SHIMADZU CTO-10A. Μικρή αντλία: DGU-2A). 13. Φίλτρα διήθησης: Schleicher & Schuell SPARTAN 13/B, Disposable Filter Holders (0,45 μm). 31

43 14. Συσκευή Kjeldahl: InKjel M. 15. Ψυχόμενη φυγόκεντρος: SIGMA 3K12, BIOBLOCK SCIENTIFIC. 16. Shaker πολλών θέσεων: SELECTA ROTABIT MOTOR ( U/min). 17. Θάλαμος Επώασης Raypa Incuterm Digit. 18. Συσκευή Stomacher: Bag Mixer interscience. 19. Χωνευτήρια. 20. Τριβλία Πετρί Gosselin. 21. Μικροβιολογικός κρίκος. 22. IR 23. Συσκευή εκχύλισης Soxhlet. 24. GC-MS [Shimadzu GC- 17A. Column Supelco CO Wax-10 (60 m, 0.32 mm i.d., 0.25 μm film thickness). Shimadzu MS QP5050 mass spectrometer.] 25. SPME fibre και holder Supelco, Bellefonte, PA, USA (2 cm fibre coated with 50/30 mm divinylbenzene/carboxen on poly(dimethylsiloxane) bonded to a flexible fused silica core). 26. Κωνικές φιάλες (όλων των μεγεθών). 27. Ογκομετρικές φιάλες (όλων των μεγεθών). 28. Uroboxes αποστειρωμένα. 29. Δοκιμαστικοί σωλήνες. 30. Πιπέττες. 31. Κυψελίδες ( Quartz και μιας χρήσεως) Μικροοργανισμός Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε το φαρμακευτικό προβιοτικό παρασκεύασμα UltraLevure της εταιρείας BIOCODEX. Το συγκεκριμένο παρασκεύασμα περιέχει λυοφιλιωμένα κύτταρα S. boulardii. Χρησιμοποιήθηκαν οι 32

44 κάψουλες των 50 mg και κάθε κάψουλα προσδίδει 10 9 μικροοργανισμού. κύτταρα προβιοτικού Εικόνα 5: Η συσκευασία του Ultra Levure, κάψουλα και το περιεχόμενό της Εικόνα 6: Ringers pellets Pistacia terebinthus Η ρητίνη που χρησιμοποιήθηκε προέρχεται από το δέντρο Pistacia terebinthus όπως έχει περιγραφεί αναλυτικότερα στο πρώτο μέρος. Προκειμένου να χρησιμοποιηθεί 33

45 σωστά, η στερεή συμπαγής πίσσα Πάφου τεμαχίστηκε και κονιοποιήθηκε όσο περισσότερο γινόταν. Εικόνα 7: Ρητίνη της P. terebinthus σε μικρά τεμαχίδια Θρεπτικό υλικό PDA. Η ονομασία PDA. προέρχεται από το Potato Dextrose Agar. Xρησιμοποιείται για την απομόνωση, καλλιέργεια και απαρίθμηση ζυμών και μυκήτων, σε γαλακτοκομικά προϊόντα ή άλλα τρόφιμα. Η περιεχόμενη συγκέντρωση γλυκόζης και το εκχύλισμα πατάτας, αποτελούν βασικά πλεονεκτήματα για την ανάπτυξη των παραπάνω ενώ είναι σημαντικό ότι η αυξημένη οξύτητα αναστέλλει την ανάπτυξη των βακτηρίων Ringer pellets Τα Ringers pellets είναι μίγμα διάφορων αλάτων υπό μορφή χαπιών, τα οποία διαλυόμενα στο νερό δημιουργούν ισοτονικό διάλυμα. Το διάλυμα Ringers περιέχει NaCl, KCl, CaCl 2 και NaHCO 3. 34

46 Εικόνα 8: Θρεπτικό υλικό Potato Dextrose Agar Προσομοιωση γαστρικου υγρού To διάλυμα που προσομοιάζει το γαστρικό υγρό (Simulated Gastric Fluid) είναι όξινο ρυθμιστικό διάλυμα που έχει την εξής σύσταση και ιδιότητα: NaCl (9 g/l), Na 2 HPO 4 2H 2 Ο (9 g/l), KH 2 PO 4 (1.5 g/l) και HCl 5N, με ph = ~2 και προσομοιάζει τις όξινες συνθήκες που επικρατούν στη στομαχική περιοχή. 2.2 Αναλύσεις-μέθοδοι Εκχύλισμα πίσσας Πάφου Σε κωνική φιάλη με 400 ml απιονισμένο νερό, προστέθηκαν 100 g κονιοποιημένης πίσσας Πάφου. Η φιάλη τοποθετήθηκε σε υδρόλουτρο σε σταθερή θερμοκρασία 70 ο C και αφέθηκε να θερμανθεί για έξι ώρες περίπου έως ότου προκύψει ένα υδατικό εκχύλισμα. 35

47 2.2.2 Παρασκευή διαλύματος Ringer Σε κωνική φιάλη προστέθηκαν 500 ml απιονισμένο νερό και μία ταμπλέτα Ringer. Η κωνική καλύφθηκε με αλουμινόχαρτο και τέθηκε προς αποστείρωση για 15 λεπτά.το διάλυμα αφέθηκε να κρυώσει πριν χρησιμοποιηθεί Παρασκευή stock διαλύματος μικροοργανισμού Σε κωνική των 500 ml προστέθηκαν 500 ml απιονισμένο νερό και μία κάψουλα Ringer. Το διάλυμα αποστειρώθηκε στο αυτόκαυαστο για 15 λεπτά. Η κωνική αφέθηκε να κρυώσει και στη συνέχεια προστέθηκε μία κάψουλα Ultra Levure. H όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε παρουσία φλόγας σε τέτοια απόσταση ώστε να αποστειρώνει τη γύρω περιοχή χωρίς να είναι επικίνδυνη για τη βιωσιμότητα του S. boulardii Παρασκευή στερεής καλλιέργειας για ανάπτυξη S. boulardii Σε κωνική φιάλη των 1000 ml προστέθηκαν 1000 mlαπιονισμένο νερό και 39 g PDA. Η κωνική θερμάνθηκε υπό ανάδευση έως ότου το στερεό θρεπτικό υλικό να διαλυθεί πλήρως στο νερό. Στη συνέχεια, η κωνική καλύφθηκε με διπλό αλουμινόχαρτο και τοποθετήθηκε στον αυτόκαυστο για 15 λεπτά προς αποστείρωση. Μετά το πέρας της αποστείρωσης, η κωνική αφέθηκε στον πάγκο προκειμένου να έλθει σε θερμοκρασία 35 ο C 40 ο C έτσι ώστε το θρεπτικό να παραμένει υγρό αλλά η θερμοκρασία της κωνικής να είναι ανεκτή από το δέρμα μας προκειμένου κατά το «στρώσιμο» των πετρί να αποφευχθεί η υγρασία. Σε καθαρό πάγκο και παρουσία φλόγας, προστέθηκαν προσεκτικά περίπου 20 ml PDA. σε κάθε πετρί, ποσότητα επαρκής ώστε να καλυφθεί καλά ο πάτος του εκάστοτε πετρί. Μετά την προσθήκη του θρεπτικού, το κάθε πετρί τοποθετήθηκε προσεκτικά και με ηρεμία σε καθαρό σημείο του πάγκου και αφέθηκε ώστε να στερεοποιηθεί. Τα πετρί αφέθηκαν εκτός ψυγείο για μερικές ώρες προκειμένου να μην αναπτυχθεί υγρασία. 36

48 2.2.5 Υγρασία Είναι μια διαδικασία, που πραγματοποιήθηκε σε δείγμα κονιοποιημένης πίσσας Πάφου. Μικρά τεμάχια αλουμινόχαρτου ζυγίστηκαν, προστέθηκε το δείγμα του κάθε υποστρώματος, θερμάνθηκαν στο φούρνο για 1 ημέρα στους ο C και στη συνέχεια ζυγίστηκαν τελικώς, για υπολογισμό του ποσοστού υγρασίας. Έστω x 1 = γραμμάρια άδειου αλουμινόχαρτου x 2 = γραμμάρια υγρού υποστρώματος-δείγματος x 3 = γραμμάρια μικτού ξηρού δείγματος και αλουμινόχαρτου Αρχικά υπολογίζουμε το κατά πόσο ξηράθηκε το δείγμα, δηλαδή: Ξηρό δείγμα = x 3 - x 1 Στα (x 2 -x 1 ) γραμμάρια υγρού δείγματος, προκύπτουν (x 3 -x 1 ) γραμμάρια. Συνεπώς, η εκατοστιαία ξήρανση είναι 100 (x 3 -x 1 )/ (x 2 -x 1 ). Επομένως η εκατοστιαία υγρασία θα είναι 100/ (x 3 -x 1 )/ (x 2 -x 1 ). Εδώ πρέπει να τονιστεί, ότι το ζύγισμα ων δειγμάτων πρέπει να γίνει αμέσως μετά την απομάκρυνσή τους από τη θέρμανση, ώστε να μη λάβουν αυτά υγρασία από το περιβάλλον Ανάλυση πρωτεΐνης με τη μέθοδο Kjeldahl Η μέθοδος Kjeldahl, που δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά το 1883, είναι παραδοσιακή αποδεκτή μέθοδος προσδιορισμού των πρωτεϊνών στα γαλακτοκομικά προϊόντα. Η μέθοδος αυτή, περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του ολικού αζώτου στα προϊόντα, δηλαδή δε μετράει απευθείας ποσότητα πρωτεΐνης. Η εκατοστιαία περιεκτικότητα πρωτεΐνης, υπολογίζεται από την περιεχόμενη ποσότητα αζώτου χρησιμοποιώντας τον παράγοντα 6,83 για τα γαλακτοκομικά προϊόντα και προϋποθέτει ότι όλη η ποσότητα αζώτου στο δείγμα είναι υπό τη μορφή πρωτεΐνης. Στην πειραματική διαδικασία της παρούσας διπλωματικής εργασίας, η μέθοδος Kjeldahl, εφαρμόστηκε σε κονιοποιημένη πίσσα Πάφου. 37

49 (α) Προετοιμασία δειγμάτων για προσδιορισμό πρωτεΐνης. Αρχικά, έγινε πολύ καλή πλύση των σωλήνων πέψης και στη συνέχεια τοποθέτησή τους σε ειδικό στήριγμα. Στη συνέχεια, σε κάθε σωλήνα, έγινε προσθήκη 3 γραμμαρίων θειικού καλίου και 0,3 γραμμαρίων θειικού χαλκού. Παράλληλα, σε αυτό το στάδιο έγινε η προσθήκη μετρήσιμης ποσότητας δείγματος. Ακολούθησε, προσθήκη 7 ml και 10 ml πυκνού θειικού οξέος, αντίστοιχα στην κάθε περίπτωση, στον απαγωγό. Το στήριγμα τοποθετήθηκε στη συσκευή Kjeldahl. (β) Λειτουργία συσκευής και μέθοδος Kjeldahl Η συσκευή πέψης, έχει 6 θέσεις για ισάριθμους σωλήνες πέψης. Οι σωλήνες, καλύπτονται με ένα ειδικό σκέπασμα που απάγει τα παραγόμενα αέρια από την αντίδραση της οξείδωσης και η συσκευή τίθεται σε λειτουργία. Η πέψη της οργανικής ύλης ξεκίνησε στη θερμοκρασία των 40 o C για δέκα λεπτά ενώ ανά δέκα λεπτά γινόταν αύξηση της θερμοκρασίας στους 60, 80 και 100 o C αντίστοιχα. Όταν η θερμοκρασία έφτασε τους 100 o C, τα δείγματα παρέμειναν στη συσκευή για 30 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της πέψης, το θειικό οξύ, οξειδώνει την οργανική ύλη προς διοξείδιο του άνθρακα, νερό και αμμωνία. Η αμμωνία, δεσμεύεται από το θειικό οξύ ως θειικό αμμώνιο και ανάγεται προς διοξείδιο του θείου. Το θειικό κάλιο, αυξάνει το σημείο βρασμού του διαλύματος, ώστε να πραγματοποιηθεί η οξείδωση σε μεγαλύτερη θερμοκρασία. Ο θειικός χαλκός, συμβάλλει στην κατάλυση της οξείδωσης και το μίγμα του κάθε σωλήνα ανακινείται καλά και τοποθετείται στην αντίστοιχη θέση του στη συσκευή πέψης. (γ) Απόσταξη της αμμωνίας με υδρατμούς. Σε αυτό το στάδιο, ο εκάστοτε σωλήνας πέψης τοποθετήθηκε διαδοχικά στη θέση στη συσκευή απόσταξης. Ως υποδοχέας του αποστάγματος, χρησιμοποιήθηκε κωνική φιάλη που περιείχε 20 ml ΗCl 0,1 Ν. Η συσκευή τέθηκε σε λειτουργία και προστέθηκε ποσότητα NaOH, στο σωλήνα πέψης, έτσι ώστε τελικός όγκος να είναι περίπου 60 ml. Με την προσθήκη της NaOH, η αμμωνία αποδεσμεύτηκε από το θειικό αμμώνιο. Η αμμωνία, ως πτητική, παρασύρθηκε από τους παραγόμενους υδρατμούς και τελικά 38

50 κατέληξε στον υποδοχέα που περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα HCl. Εδώ, πρέπει να σημειωθεί, ότι η ποσότητα του προτύπου HCl είναι περισσότερη από αυτή που απαιτείται για τη δέσμευση της παραγόμενης αμμωνίας. (δ) Τιτλοδότηση περίσσειας HCl Στο τελευταίο στάδιο της διαδικασίας, ογκομετρήθηκε η περίσσεια του προτύπου διαλύματος HCl με πρότυπο διάλυμα NaOH 0,1 Ν και με δείκτη ηλιανθίνη. Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα του NaOH που καταναλώνεται, τόσο περισσότερο είναι το ποσοστό περιεχόμενης πρωτεΐνης στο δείγμα μας. Στην περίπτωση ύπαρξης πρωτεινών θα έπρεπε με την προσθήκη 2 σταγόνων ηλιανθίνης στο απόσταγμα, το σιάλυμα να γίνει από κίτρινο, σοζ πορτοκαλί. Όμως η πίσσα Πάφου δεν περιέχει πρωτείνες Ανάλυση σακχάρου με HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) Ο προσδιορισμός του σακχάρου σε υδατικό εκχύλισμα πίσσας Πάφου έγινε με HPLC χρησιμοποιώντας χρωματογράφο SHIMADZU LC-9A. Οι αναλυτικές συνθήκες ήταν: (i) στήλη Shim-pack, SCR-101 N, (ii) κινητή φάση: τρεις φορές απεσταγμένο και διηθημένο νερό, (iii) ταχύτητα ροής: 0. 8 ml/min (iv) θερμοκρασία στήλης: 60 C, (v) ανιχνευτής: δείκτη διάθλασης. Τα δείγματα εισήχθησαν στη στήλη αφού αραιώθηκαν με τρεις φορές απεσταγμένο νερό σε συγκέντρωση 1% v/v και διηθήθηκαν με μικροφίλτρο 0,45 μm. Σαν εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε βουτανόλη-1 σε συγκέντρωση 1 % v/v Ταυτοποίηση πτητικών συστατικών GC/MS Απομόνωση πτητικών συστατικών με μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid- Phase Micro-Extraction; SPME) Η απομόνωση των πτητικών συστατικών στα δείγματα πραγματοποιήθηκε με την τεχνική headspace SPME. Κατά τη μέθοδο αυτή 6 g. δείγματος και 1 μl εσωτερικού προτύπου 4-μέθυλο-2-πεντανόλη συγκέντρωσης 4 mg/l εισάγονται σε φιαλίδιο 20 39

51 ml, το οποίο στο άνω άκρο του έφερε πώμα από καουτσούκ, μέσω του οποίου εισάγεται η βελόνα της σύριγγας SPME. Η σύριγγα φέρει ίνα μήκους 2 cm καλυμμένη με 50/30 mm διβυνιλοβενζόλιο και ανθρακούχο ρητίνη Carboxen σε πολυ-διμεθυλοσιλοξάνιο (DVD/Carboxen/PDMS Stable Flex Supelco, Bellefonte, PA, USA). Στη συνέχεια το φιαλίδιο θερμοστατείται στους 60 o C και η ίνα εκτίθεται στον υπερκείμενο χώρο για 45 min. Η εκρόφηση των πτητικών από την ίνα πραγματοποιήθηκε στον εγχυτή του αέριου χρωματογράφου σε θερμοκρασία 240 ο C για 3 min, σε λειτουργία splitless (καθολική εισαγωγή του δείγματος) Ανάλυση πτητικών συστατικών με GC/MS Τα πτητικά συστατικά που προσροφήθηκαν, αναλύθηκαν με Φασματογράφο Μάζας συνδεδεμένο με Αέριο Χρωματογράφο SHIMADZU GC-17A, MS QP5050 (Εικόνα 2.5). Χρησιμοποιήθηκε τριχοειδής στήλη Supelco CO Wax m, με εσωτερική διάμετρο 0,32 mm, πάχος film 0,25 μm και φέρον αέριο ήλιο με ταχύτητα ροής 2 ml/min. Η θερμοκρασία του φούρνου προγραμματίζονταν αρχικά στους 35 o C για 6 min και στη συνέχεια αυξανόταν στους 60 o C με ρυθμό 2 o C/min. Μετά από παραμονή 5 min στους 60 o C, η θερμοκρασία προγραμματιζόταν να αυξηθεί με ρυθμό 5 ο C/min στους 200 ο C και μετά να αυξηθεί στους 250 ο C με ρυθμό 25 ο C/min όπου και παρέμενε για 6 min. Η θερμοκρασία του εγχυτή ήταν 240 o C και το όργανο ρυθμίστηκε να λειτουργεί σε splitless (καθολική εισαγωγή του δείγματος) λειτουργία, όπως προαναφέρθηκε. Η θερμοκρασία του ανιχνευτή ήταν 240 o C. Ο τρόπος λειτουργίας του φασματογράφου μάζας ήταν πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (electron impact) με την ενέργεια στα 70 ev. 40

52 Εικόνα 9. Φασματογράφος Μάζας συνδεδεμένος με Αέριο Χρωματογράφο (GC-MS). Η ταυτοποίηση των πτητικών ενώσεων έγινε με χρήση δείκτη συγκράτησης (Retention Index; RI) και συγκεκριμένα με Kovats Index όπου σειρά αλκανίων (C 7 -C 32 ) διαλυμένα σε εξάνιο, προστέθηκε σε κάποια από τα δείγματα. Τα αλκάνια εκλούονται ανάλογα με το μέγεθος τους με αύξουσα σειρά με το εξάνιο να εκλούεται πρώτο μετά να ακολουθεί το επτάνιο και ούτω καθ εξής. Ο δείκτης συγκράτησης της κάθε ένωσης υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο που φαίνεται στην παρακάτω εξίσωση και συγκρίνεται με το ανάλογο RI της ένωσης από αναφορές σε επιστημονικά περιοδικά. Όπου RI: ο δείκτης συγκράτησης (Kovats Index) n: Ο αριθμός των ανθράκων του μικρότερου αλκανίου (αλκάνιο πριν από το άγνωστο) 41

53 N: Ο αριθμός των ανθράκων του μεγαλύτερου αλκανίου (αλκάνιο μετά το άγνωστο) tr: Ο χρόνος έκλουσης Τα δείγματα στα οποία έγινε προσθήκη της σειράς των αλκανίων επανελήφθησαν χωρίς την προσθήκη αυτής. Με αυτόν τον τρόπο οι ενώσεις που εκλούονται σε παρόμοιους χρόνους με αυτούς των αλκανίων ανιχνεύονται στην επόμενη ανάλυση. Για την ταυτοποίηση έγινε και χρήση πρότυπων συστατικών καθώς και χρήση των δεδομένων φασματοσκοπίας μάζας των βιβλιοθηκών NIST107, NIST21 και SZTERP Προετοιμασία εκχυλισμάτων για τον ποσοτικό προσδιορισμό ολικών φαινολικών και αντιοξειδωτικών συστατικών της P. terebinthus Για τις παρακάτω αναλύσεις παρασκευάσθηκαν τρία εκχυλίσματα διαφορετικής σύστασης προκειμένου να μελετηθούν τα αποτελέσματα συγκριτικά. Σε μικρές κωνικές φιάλες τοποθετήθηκαν 10 g P. terebinthus και 100 ml. διαλύτη (απιονισμένο νερό, μίγμα απιονισμένου νερού και μεθανόλης, μεθανόλη). Τα διαλύματα τοποθετήθηκαν σε θερμοθάλαμο των 30 ο C για 24 ώρες. Πίνακας: Σύσταση εκχυλισμάτων P. terebinthus Εκχύλισμα 1 10 ρητίνη 100 ml H 2 O Εκχύλισμα 2 10 g ρητίνη 50 ml H 2 O/50 ml CH 3 OH Εκχύλισμα 3 10 g ρητίνη 100 ml CH 3 OH Ποσοτικός προσδιορισμός ολικών φαινολικών συστατικών (Folin-Ciocalteau) Το σύνολο των φαινολικών ενώσεων ενός εκχυλίσματος προσδιορίζεται συνήθως με χρωματομετρικές μεθόδους. Αν και κανένα αντιδραστήριο δεν δίνει με τις επιμέρους φαινολικές ενώσεις προϊόντα που να εμφανίζουν το ίδιο μέγιστο μήκος απορρόφησης, η μέθοδος που στηρίζεται στο αντιδραστήριο FOLIN-CIOCALTEU είναι η πλέον αποδεκτή (Tsimidou et al.,1992). Η μέθοδος αυτή προσδιορίζει τις ολικές 42

54 φαινολικές ενώσεις ενός δείγματος και είναι η πλέον αποδεκτή. Βασίζεται στην οξείδωση των φαινολικών ενώσεων σε αλκαλικό περιβάλλον με μίγμα φωσφοροβολφραιμικού (H 3 PW 12 Ο 40 ) και φωσφορομολυβδαινικού οξέος (H 3 PMo 12 Ο 40 ). Κατά την αντίδραση οι φαινολικές ομάδες οξειδώνονται σε ομάδες με δομή κινόνης και τα οξέα φωσφοροβολφραιμικού και φωσφορομολυβδαινικού ανάγονται σε οξείδια βολφραιμίου (W 8 Ο 23 ) και μολυβδαινίου (ΜοΟ 23 ) μπλε χρώματος. Γενικά, οι φαινόλες που καθορίζονται από τον δείκτη FC εκφράζονται πολύ συχνά σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος (Σουφλερός, 1997). Εκτός από το αντιδραστήριο TroIox έχει βρεθεί ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί και το Γαλλικό Οξύ. Σύμφωνα με έρευνες που έχουν γίνει, τα αντιδραστήρια TroIox και Γαλλικό Οξύ, σαν πρότυπα αντιδραστήρια σ'αυτή τη μέθοδο, είναι παρόμοια θεωρώντας ότι το TroIox είναι μια μονοφαινόλη και το Γαλλικό Οξύ μια τριφαινόλη (Minussi et al., 2002). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών φαινολικών συστατικών πραγματοποιήθηκε με χρήση φασματοφωτομέτρου με την μέθοδο Folin-Ciocalteau. Για την μέθοδο αυτή χρησιμοποιήθηκαν το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau συγκέντρωσης 2Ν (Sigma Aldrich), μονοϋδρικό γαλλικό οξύ καθαρότητας 98% (Sigma Aldrich) και άνυδρο ανθρακικό νάτριο καθαρότητας 99,9% (Merck). Για το διάλυμα του ανθρακικού νατρίου διαλύθηκαν 200 g άνυδρου ανθρακικού νατρίου σε 800 ml νερού και το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι βρασμού. Όταν το διάλυμα επανήλθε σε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν κρύσταλλοι ανθρακικού νατρίου και με το πέρας 24 ωρών το διάλυμα φιλτραρίστηκε και αραιώθηκε στο 1 L. Για την προετοιμασία του διαλύματος του γαλλικού οξέος διαλύθηκαν 0,500 g γαλλικού οξέος σε 10 ml αιθανόλης σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και στην συνέχεια το διάλυμα αραιώθηκε έως την χαραγή με απεσταγμένο νερό. Η προετοιμασία της πρότυπης καμπύλης έγινε με την παρασκευή 6 διαλυμάτων τα οποία περιείχαν 0, 1, 2, 3, 5, και 10 ml από το διάλυμα που παρασκευάστηκε με τη χρήση του διαλύματος του γαλλικού οξέος όπως αναφέρεται στην προηγούμενη παράγραφο. Ακολούθησε αραίωση αυτών με απεσταγμένο νερό στα 100 ml. Τα διαλύματα που προέκυψαν είχαν συγκεντρώσεις ολικών φαινολικών συστατικών 0, 50, 100, 150, 250 και 500 mg γαλλικού οξέος/l. 43

55 Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των προτύπων προστέθηκαν σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες με βιδωτό πώμα 20 μl από το δείγμα ή το πρότυπο και στην συνέχεια 1,58 ml νερού και 100 μl αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteau. Τα δείγματα αναδεύτηκαν και αφέθηκαν για 8 λεπτά. Στην συνέχεια προστέθηκαν 300 μl από το διάλυμα του ανθρακικού νατρίου, αναδεύτηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 20 ο C για 2 ώρες. Στην συνέχεια μετρήθηκε η απορρόφηση στα 765 nm. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ολικών φαινολικών συστατικών των δειγμάτων εκφράστηκε σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος με την χρήση της πρότυπης καμπύλης που κατασκευάστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας (DPPH ) Πολλές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για να εκτιμήσουν και να συγκρίνουν την αντιοξειδωτική δράση στα τρόφιμα. Πρόσφατα, οι μέθοδοι ικανότητας απορρόφησης ριζών οξυγόνου (oxygen radical absorbance capacity assays) και χρωματομετρικές μέθοδοι απορρόφησης χρησιμοποιούνται για να εκτιμήσουν την αντιοξειδωτική δράση τροφίμων, εκχυλισμάτων και βιολογικών υγρών. Αυτές οι αναλυτικές μέθοδοι μετράνε την δέσμευση των ελευθέρων ριζών. Οι ποικίλες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την μέτρηση της αντιοξειδωτικής δράσης σε τρόφιμα μπορούν να δώσουν ποικίλα αποτελέσματα ανάλογα με την ελεύθερη ρίζα που θα χρησιμοποιηθεί σαν αντιδρών. Η μέθοδος στηρίζεται στην αντίδραση του αντιοξειδωτικού με μεθανολικό διάλυμα της σταθερής 1,1-διφαινυλ-2-πικριλυδραζυλικής ρίζας (η οποία απορροφά στα 517 nm) η οποία με την προσφορά υδρογόνου/ηλεκτρονίου ανάγεται σε υδραζίνη με αποτέλεσμα τον αποχρωματισμό του διαλύματος (Kumaran et al., 2005). 44

56 Ο προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο της εξουδετέρωσης της ρίζας DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Για τη μέθοδο DPPH χρησιμοποιήθηκαν το αντιδραστήριο 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (Sigma Aldrich) και ασκορβικό οξύ (Sigma Aldrich). Το διάλυμα DPPH προετοιμάστηκε με την προσθήκη 0,025 g DPPH σε ογκομετρική φιάλη του 1 L και αραίωση μέχρι την χαραγή με μεθανόλη. Το κάθε δείγμα εκχυλίσματος ρητίνης που μελετήθηκε αραιώθηκε με μεθανόλη σε τρείς διαφορετικές συγκεντρώσεις. Στα 100 μl του τελικού δείγματος περιέχονταν 10, 50 και 100 μl εκχυλίσματος. Η γραμμικότητα της μεθόδου μελετήθηκε με την χρήση 6 πρότυπων διαλυμάτων ασκορβικού οξέος διαφόρων συγκεντρώσεων. Η συγκεντρώσεις του ασκορβικού οξέος ήταν 20, 30, 50, 80, 130 και 180 g ασκορβικού οξέος/kg DPPH. Η πρότυπη καμπύλη έγινε με την μελέτη 5 διαφορετικών συγκεντρώσεων DPPH αραιωμένων σε μεθανόλη. Οι συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν ήταν 0,025, 0,021875, 0,01875, 0,0125 και 0,00625 g DPPH/L MeOH. Για την προετοιμασία και την μέτρηση των δειγμάτων και των προτύπων προσθέτονταν σε κυψελίδες 100 μl από το αραιωμένο δείγμα ή το πρότυπο και στην συνέχεια 3,9 ml μεθανολικού διαλύματος DPPH. Αμέσως γινόταν η μέτρηση της απορρόφησης στα 515 nm μέχρι η απορρόφηση να φτάσει σε πλατό. Από τις τελικές απορροφήσεις των δειγμάτων υπολογίστηκε με την βοήθεια της πρότυπης καμπύλης η συγκέντρωση του εναπομείναντος DPPH (g/l) στο δείγμα. 45

57 Ακολουθούσε ο υπολογισμός της επί της εκατό συγκέντρωσης DPPH που παρέμεινε στο δείγμα (%DPPH REM ). Με την γραφική παράσταση της %DPPH REM συναρτήσει της συγκέντρωσης του εκχυλίσματος υπολογίστηκε η EC 50, που είναι η συγκέντρωση του εκχυλίσματος που χρειάζεται για να δεσμεύσει την μισή συγκέντρωση του DPPH. 2.3 Παρασκευή και μελέτη σκευασμάτων S. boulardii/p. terebinthus Βιωσιμοτητα S. boulardii σε διαφορες συνθηκες Η παρούσα διπλωματική εργασία βασίστηκε στη μελέτη της βιωσιμότητας του S. boulardii σε δείγματα σκευασμάτων του με τη ρητίνη P. terebinthus. Ο S. boulardii ως προβιοτική ζύμη, αναπτύχθηκε σε θρεπτικό υλικό PDA (Potato Dextrose Agar), σε θερμοκρασία 30 ο C και για 72 ώρες, όπως περιγράφηκε παραπάνω Βιωσιμότητα S. boulardii σε σκευάσματα μορφής χαπιών Η βιωσιμότητα του μικροοργανισμού μελετήθηκε σε στερεά σκευάσματα τύπου «χαπιού». Για το σκοπό αυτό παρασκευάσθηκαν χάπια με τη βοήθεια της πρέσας του φασματογράφου IR. Η σύσταση του χαπιού ήταν 1 g κονιοποιημένης πίσσας και το περιεχόμενο 1 κάψουλας Ultra Levure. Αρχικά κονιοποιήθηκε η πίσσα πολύ καλά και στη συνέχεια αναδεύτηκε με το περιεχόμενο της κάψουλας με ιδιαίτερη προσοχή προκειμένου να μη δημιουργηθεί πρόβλημα τραυματισμού στα κύτταρα του S. boulardii. Τα χάπια αποθηκεύτηκαν εκτός ψυγείου, σε θερμοκρασία δωματίου. 46

58 Εικόνα 13: Χάπια P. terebinthus και S. boulardii Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με πίσσα αιωρημένη υπό μορφή σκόνης Πίνακας 4: Αναλογία Ringer, stock S. boulardii και ρητίνης P. terebinthus Δείγμα Σύσταση 1 18 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 2 18 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 0.3 g ρητίνη 3 18 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 0,6 g ρητίνη 4 18 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 1,0 g ρητίνη Σε αποστειρωμένα πλαστικά δοχεία (urobox) προστέθηκαν 2 ml από το stock κυττάρων του S. boulardii, 18 ml διάλυμα Ringer και κονιοποιημένη πίσσα σε διάφορες ποσότητες (0 g, 0.3 g, 0.6 g, και 1 g). Η βιωσιμότητα του προβιοτικού μελετήθηκε για διάστημα 90 ημερών ανά διαστήματα και παρατηρήθηκε μικρή αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων μέχρι το διάστημα των 30 ημερών και από εκεί και έπειτα σταδιακή σταθεροποίηση και μικρή μείωση όπως περιγράφεται αναλυτικότερα στο επόμενο κεφάλαιο. Παρακάτω φαίνεται το σχεδιάγραμμα που αφορά μέχρι τις 90 ημέρες μελέτης. Οι επόμενες δύο αναλύσεις που πραγματοποιηθήκαν δείχνουν σταθεροποίηση και ανεπαίσθητη μείωση της 47

59 βιωσιμότητας Βιωσιμότητα S. boulardii σε υδατικά σκευάσματα με εκχύλισμα πίσσας Σε κάθε urobox προστέθηκαν 2 ml από το stock κυττάρων, ποσότητα του εκχυλίσματος και αντίστοιχη ποσότητα Ringer έτσι ώστε ο τελικός όγκος του πειράματος να είναι τα 20 ml. Οι ποσότητες του εκχυλίσματος που μελετήθηκαν είναι 0 ml, 5 ml, 10 ml και 15 ml. Οπότε οι αντίστοιχες ποσότητες Ringer είναι 18 ml, 13 ml, 8 ml και 3 ml. Η βιωσιμότητα του προβιοτικού μελετήθηκε για διάστημα 90 ημερών και παρατηρήθηκε πολύ μικρή αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων μέχρι το διάστημα των 30 ημερών και από εκεί και έπειτα σταδιακή σταθεροποίηση. Παρακάτω φαίνεται το σχεδιάγραμμα που αφορά μέχρι τις 90 ημέρες μελέτης. Οι επόμενες δύο αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν δείχνουν σταθεροποίηση και ανεπαίσθητη μείωση της βιωσιμότητας. Πίνακας 5: Αναλογία Ringer, stock S. boulardii και P. terebinthus extract Δείγμα Σύσταση 1 18 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 2 13 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 5 ml εκχύλισμα ρητίνης 3 8 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 10 ml εκχύλισμα ρητίνης 4 3 ml Ringer 2 ml stock S. boulardii 15 ml εκχύλισμα ρητίνης 48

60 2.3.5 Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία εκχυλίσματος πίσσας Πάφου Πίνακας 6: Αναλογία stock S. boulardii, γαστρικού υγρού και εκχυλίσματος ρητίνης. Δείγμα 1 9 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 2 6,5 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 3 4 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 4 1,5 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 5 0 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού Σύσταση 1 ml stock S. boulardii 1 ml stock S. boulardii 2,5 ml εκχύλισμα ρητίνης 1 ml stock S. boulardii 5 ml εκχύλισμα ρητίνης 1 ml stock S. boulardii 7,5 ml εκχύλισμα ρητίνης 9 ml εκχύλισμα ρητίνης Βιωσιμότητα S. boulardii σε προσομοίωση γαστρικού υγρού παρουσία πίσσας Πάφου υπό μορφή σκόνης Πίνακας 7: Αναλογία stock S. boulardii, γαστρικού υγρού και ρητίνης. Δείγμα 1 9 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 2 9 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 3 9 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού 4 9 ml προσομοιωμένου γαστρικού υγρού Σύσταση 1 ml stock S. boulardii 1 ml stock S. boulardii 0,15 g ρητίνης 1 ml stock S. boulardii 0,3 g ρητίνης 1 ml stock S. boulardii 0,5 g ρητίνης 49

61 ΜΕΡΟΣ ΤΡΙΤΟ - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 50

62 3. Αποτελέσματα και συζήτηση 3.1 Χημική ανάλυση P. terebinthus Στην παρούσα διπλωματική εργασία, μελετήθηκε αρκετά η βιωσιμότητα του προβιοτικού στελέχους S. boulardii παρουσία πίσσας Πάφου (ρητίνης) P. terebinthus σε διάφορες συστάσεις και συνθήκες. Συνεπώς, η χημική ανάλυση και μελέτη της ίδιας της ρητίνης ήταν απαραίτητη για να μπορέσουμε να χαρακτηρίσουμε ορισμένες ιδιότητες της. Το εκχύλισμα που μελετήθηκε για την οξύτητά του προέκυψε από τη θέρμανση για 8 ώρες διαλύματος 100 g ρητίνης σε 400 ml απιονισμένο νερό. Η ανάλυση για σάκχαρα (HPLC), για οργανικά οξέα (JASCO) και για πρωτεΐνες, δεν είχε θετικά αποτελέσματα. Πίνακας 8: Χημική ανάλυση P. terebinthus Λιπαρές ύλες (Soxlet) 55% ph (εκχυλίσματος) 4,58 Υγρασία 58,9% Εικόνα 14: Ανάλυση λίπους της P. terebinthus 51