Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ARG, ASP, GLU, HIS, LYS ΣΤΟΝ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΞΑΝΘΙΝΗΣ YGFO

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ- ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ R, P, U, H, Y ΣΤΟΝ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΞΑΝΘΙΝΗΣ YFO ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΚΑΡΕΝΑ ΕΥΣΤΑΘΙΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2007

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ- ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ R, P, U, H, Y ΣΤΟΝ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΞΑΝΘΙΝΗΣ YFO ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΚΑΡΕΝΑ ΕΥΣΤΑΘΙΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΦΡΙΛΙΓΓΟΣ ΕΥΣΤΑΘΙΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Βιολογικής Χηµείας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2007

4 Φτασµένες οι προλήψεις σε µια καθαρότητα µαθηµατική θα µας βοηθήσουν να κατανοήσουµε την βαθύτερη δοµή του κόσµου. Οδυσσέας Ελύτης Μαρία Νεφέλη, 1978

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία µεταπτυχιακής ειδίκευσης εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χηµείας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων στα πλαίσια του ιατµηµατικού Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών στην «Βιοτεχνολογία». Θα ήθελα να ευχαριστήσω αρχικά όλα τα µέλη ΕΠ της συντονιστικής επιτροπής και κυρίως τον Αναπληρωτή καθηγητή κ. Ιωάννη Λαζαρίδη, που µου έδωσαν την ευκαιρία της συµµετοχής µου στο ΠΜΣ αλλά και όλους τους διδάσκοντες του προγράµµατος για την πολύτιµη βοήθειά τους όσον αφορά την ενηµέρωσή µου πάνω σε θέµατα του επιστηµονικού τους πεδίου, όταν εγώ το ζητούσα. Στα πλαίσια της προσπάθειας της θεωρητικής µου κατάρτισης τον πρώτο χρόνο των σπουδών µου ουσιαστική ήταν η βοήθεια των υπεύθυνων καθηγητών µου, του Καθηγητή κ. Σπύρου Γεωργάτου και της Αναπληρώτριας καθηγήτριας κ. Μαρίας Φράγκου. Ιδιαίτερα όµως θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ευστάθιο Φριλίγγο που µε δέχτηκε στο εργαστήριό του και µε καθοδήγησε στην πρακτική και θεωρητική κατάρτισή µου στο αντικείµενο της µελέτης του µε αµείωτο ενδιαφέρον από την αρχή της παρουσίας µου εκεί µέχρι την ολοκλήρωση της εργασίας µου. Η υποµονή και η αδιάκοπη βοήθειά του ήταν καθοριστική για την εισαγωγή µου σε µία νέα για µένα επιστήµη, ενώ οι συνεχείς υποδείξεις του ήταν αυτές που µε οδήγησαν ερευνητικά προς την σωστή κατεύθυνση. Πολύ σηµαντική και πολύτιµη ήταν και η συνεργασία µου µε τα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου που υλοποιήθηκε σε πολύ φιλικό και οικείο περιβάλλον. Ειδικότερα, ευχαριστώ τους υποψήφιους διδάκτορες Γεώργιο Μερµελέκα και Κωνσταντίνο Παπακώστα για την καθοδήγησή τους κατά την διάρκεια υλοποίησης πειραµατικών τεχνικών, την δρ. Καρατζά Παναγιώτα για τις εποικοδοµητικές συνοµιλίες µας, καθώς και την Βούρβου Ελένη για την αυθόρµητη βοήθειά της κατά την εκπόνηση της πτυχιακής της διατριβής. Ξεχωριστά θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Αικατερίνη Γεωργοπούλου, η οποία µε την συνεχή βοήθειά της και τις πολύτιµες συµβουλές της συνέβαλε αποτελεσµατικά στην προσαρµογή µου στο εργαστήριο και στην ολοκλήρωση της δουλειάς µου. Θα ήθελα να εκφράσω την απέραντη ευγνωµοσύνη µου στους γονείς µου γιατί είναι αυτοί που µου έµαθαν από νωρίς να αναζητώ την γνώση και µε πείσµα και υποµονή να µην εγκαταλείπω την προσπάθεια προς την κατάκτησή της έχοντας ως αρωγό την ουσιαστική στήριξη και αγάπη τους, που γι αυτούς είναι αυτονόητη. Τέλος, ένα µεγάλο ευχαριστώ στην αδερφή µου για την στήριξή της όλα αυτά τα χρόνια των σπουδών µου και σε όλους όσους µε το ενδιαφέρον και την αγάπη τους υποστηρίζουν τις επιλογές µου µε τρόπο µοναδικό και αναντικατάστατο ώστε να τους θεωρώ πολύτιµους στην ζωή µου.

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα εργασία έχει ως αντικείµενο µελέτης τον διαµεµβρανικό µεταφορέα YgfO, έναν ειδικό και υψηλής συγγένειας συµµεταφορέα ξανθίνης:η +, που κωδικοποιείται από το γονίδιο ygfo και εκφράζεται στην εσωτερική µεµβράνη των κυττάρων της Escherichia coli. Στο εργαστήριο χρησιµοποιούµε τον YgfO ως αντιπροσωπευτικό µοριακό σύστηµα για τη µελέτη των σχέσεων δοµής-λειτουργίας των µεταφορέων της οικογένειας NT/NC2 (Nucleobase scorbate Transporters / Nucleobase-Cation ymporters-2). Συγκεκριµένα, έγινε συστηµατική ανάλυση των δυνητικά ιοντιζόµενων καταλοίπων αµινοξέων (His, rg, ys, sp, lu) που εντοπίζονται σε διαµεµβρανικά τµήµατα του YgfO, µε τη χρήση της τεχνικής µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής στόχευσης. Χρησιµοποιώντας µια πλήρως λειτουργική εναλλακτική µορφή του YgfO, µε τις 5 εγγενείς κυστεΐνες (Cys) αλλαγµένες σε σερίνες (er) (Cys-less YgfO), προχωρήσαµε σε αντικατάσταση κάθε ενός από τα κατάλοιπα αυτά σε Cys. Ο έλεγχος ενεργότητας και έκφρασης 16 διαπερασών µοναδικής κυστεΐνης (single-cys) έδειξε ότι τρία µεταλλάγµατα (H31C, E272C και D304C) έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης στην µεµβράνη µε ελάχιστη έως µηδενική ενεργότητα. Περαιτέρω µεταλλαξιγένεση των 3 αυτών θέσεων σε φυσικού τύπου υπόστρωµα αποκάλυψε ότι δύο κατάλοιπα (lu272 και sp304) είναι αναντικατάστατα για τον µηχανισµό ενεργού µεταφοράς ξανθίνης, καθώς οι αντικαταστάσεις E272D, E272Q, E272C, D304E, D304N και D304C οδηγούν σε φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη αλλά µηδενική ενεργότητα. Τα κατάλοιπα αυτά εντοπίζονται σε εξαιρετικά συντηρηµένες θέσεις της αλληλουχίας του µορίου (Ε272, απόλυτα συντηρηµένη και D304, συντηρηµένη ως D, E, ή Ν, σε όλους τους γνωστούς µεταφορείς NT/NC2), ανοδικά µιας σηµαντικής περιοχής του µεταφορέα ( , ΝΑΤ motif) που έχει προταθεί ότι συµµετέχει στο µονοπάτι µεταφοράς υποστρώµατος και στον καθορισµό της εξειδίκευσης αναγνώρισης πουρινών, τόσο στον µεταφορέα ξανθίνης YgfO όσο και στον µεταφορέα ουρικού/ξανθίνης Uap του ασκοµύκητα spergillus nidulans. Σηµαντικός εµφανίζεται να είναι και ο ρόλος της His31, ενός απόλυτα συντηρηµένου καταλοίπου των µεταφορέων NT/NC2 στο µέσον της διαµεµβρανικής έλικας. Συγκεκριµένα, επίπεδα ενεργότητας που είναι ευθέως ανάλογα µε τα επίπεδα έκφρασης στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη ευρέθησαν για τα µεταλλάγµατα H31Q (120% σε σχέση µε την φυσικού τύπου διαπεράση), H31N (100%), H31C και H31 (60-70%), H31K και H31R ( %), ενώ µε προσθήκη του υδρόφιλου H-αντιδραστηρίου (MTEΑ + ) που εισάγει θετικό ιοντικό φορτίο η διαπεράση H31C απενεργοποιείται πλήρως. Επίσης, η θέση His31 είναι µερικώς προσβάσιµη στο υδρόφιλο πολικό Hαντιδραστήριο MTE -. Τα αποτελέσµατα υποδεικνύουν µία ειδική (ενδοµοριακή ή διαµoριακή) υδρόφιλη αλληλεπίδραση του καταλοίπου His31, που συνδέεται µε την βέλτιστη έκφραση ή σταθερότητα δοµής του µορίου YgfO στη µεµβράνη. Τέλος, θέσεις µε κατάλοιπα που παρουσιάζουν χαµηλή ή πολύ υψηλή ενεργότητα συνδυάστηκαν ανά δύο και αντικαταστάθηκαν ταυτόχρονα µε κυστεΐνη (paired-cys mutants). Ο λειτουργικός έλεγχος των διπλών µεταλλαγµάτων παρουσία και απουσία ιόντων καδµίου (Cd 2+ ) δίνει µια πρώτη ένδειξη ότι οι θέσεις lu429 (έλικα 12) και His257 (έλικα 6) είναι πιθανόν να γειτνιάζουν στην τριτοταγή δοµή του µορίου ώστε να δηµιουργούν θέση δέσµευσης Cd 2+.

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Κεφάλαιο 1ο : Εισαγωγή ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς Η οικογένεια µεταφορέων NT/NC Μεταφορείς πουρινών στο εντεροβακτήριο Escherichia coli Ο µεταφορέας YgfO ιαµεµβρανικά φορτισµένα κατάλοιπα Σκοπός της εργασίας ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο :Υλικά και µέθοδοι Όργανα Χηµικά Αναλώσιµα ιαλύµατα Βακτηριακά στελέχη και πλασµίδια Τεχνικές ανασυνδυασµένου DN Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) δυο σταδίων (overlap/extension) Κατασκευή ανασυνδυασµένου DN (περιοριστική πέψη-ανασύνδεση) ηµιουργία επιδεκτικών κυττάρων Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DN Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport ssay) Επίδραση αλκυλιωτικών H-αντιδραστηρίων Επίδραση χλωριούχου καδµίου (CdCl 2 ) οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς σε διάφορα ph Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών Αναλύσεις πρωτεϊνών Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης µε την µέθοδο BC Ηλεκτροφόρηση σε πήγµα D-ακρυλαµιδίου (D-PE) Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) οκιµασία σήµανσης κυστεϊνών in vivo 44

8 2.11 n silico ανάλυση 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3ο :Αποτελέσµατα Πιθανά φορτισµένα διαµεµβρανικά κατάλοιπα του µεταφορέα YgfO Μεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής στόχευσης Τα επίπεδα έκφρασης στην µεµβράνη Ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης Μεταλλαξιγένεση επιλεγµένων καταλοίπων στο φυσικού τύπου υπόστρωµα Επίδραση αλκυλιωτικών H-αντιδραστηρίων Επίδραση του ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών Επίδραση ιοντικών H-αντιδραστηρίων (MTE -, MTEΑ + ) οκιµασίες αλκυλίωσης της διαπεράσης H31C in vivo Εκτενής µεταλλαξιγένεση των καταλοίπων H31, K164, R385, D232, E272, D Τα κατάλοιπα His31, ys164, rg Τα κατάλοιπα sp232, lu272, sp Ενεργότητα σε σχέση µε το ph Μεταλλαξιγένεση ζευγών κυστεϊνών (paired-cysteine mutagenesis) ιαπεράσες διπλών κυστεϊνών: Συνδυασµός θέσεων Ι ιαπεράσες διπλών κυστεϊνών: Συνδυασµός θέσεων ΙΙ Επίδραση ιόντων Cd 2+ στην ενεργότητα των διαπερασών µε δύο κυστεΐνες. 77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4ο: Συζήτηση.. 79 Βιβλιογραφία. 85 Παραρτήµατα. 97 Παράρτηµα Ι Παράρτηµα ΙΙ.108

9 Συνττµήσεει ιςς TP (adenosine triphosphate) = τριφωσφορική αδενοσίνη vidin- HRP = σύζευγµα αβιδίνης - υπεροξειδάσης C-less (Cys-less): διαπεράση χωρίς κατάλοιπα κυστεϊνών BD (biotin acceptor domain) = περιοχή δέσµευσης βιοτίνης B (Bovine erum lbumin) = Αλβουµίνη ορού βοός DDM (n-doedcyl-β, D-maltoside)= n-δωδεκυλο-β,d-µαλτοπυρανοσίδιο DMO (dimethyl sulfoxide) = διµεθυλο - σουλφοξείδιο DTT (dithiothreitol) = διθειοθρεϊτόλη EDT = ethylene dinitrolotetra-acetic acid E.coli = εντεροβακτήριο Escherichia coli His 10 tag (10-Histidine tag) = ουρά 10 ιστιδινών HRP protein (horseradish peroxidase protein ) = πρωτεϊνη Α συνδεδεµένη µε υπεροξειδάση ραπανιού PT (isopropyl-β-d-thiogalactoside) = ισοπροπυλ-β-d-θειογαλακτοσίδιο acy- epitope = επίτοπος acy αλληλουχία του καρβοξυτελικού δωδεκαπεπτιδίου της διαπεράσης λακτόζης acy lacz p/o (promoter/operator) = υποκινητής/χειριστής του οπερονίου της λακτόζης B = θρεπτικό υλικό uria Bertani ή uria Broth MTE - (odium (2-ulfonatoethyl)methanethiosulfonate) = µεθανο-θειοσουλφονικό αιθυλσουλφονικό (άλας νατρίου) MTEΑ + (2-minoethyl)methanethilsulfonate)= µεθανο-θειο-σουλφονική αιθυλαµίνη NT (Nucleobase scorbate Transporter) = οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού NC2 (Nucleobase-Cation ymporter-2) = οικογένεια-2 συµµεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων κατιόντων ΝΕΜ (N-ethylmaleimide) = Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο OM (Oregon reen Maleimide) = πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon PCR (polymerase chain reaction) = αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης ph= ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της συγκέντρωσης των ιόντων υδροξωνίου [Η 3 Ο + ] ενός διαλύµατος PM (phenazinemethosulphate) = µεθοσουλφονικό φαιναζίνιο PVDF (polyvinylidene difluoride) = διφθοριούχο πολύ-βινυλιδένιο D-PE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) = ηλεκτροφόρηση επί πήγµατος πολυακρυλαµιδίου-δωδεκυλoθειϊκού νατρίου TC system (Transport Commision system) = διεθνές σύστηµα φυλογενετικής- λειτουργικής ταξινόµησης και ονοµατολογίας των πρωτεΐνών µεταφοράς TM (transmembrane segment) = διαµεµβρανικό τµήµα wt (wild-type) = φυσικού τύπου

10

11 ΚΕΦΑΛΑΙΙΟ 1 ο ο :Ειισαγωγή - 1 -

12 - 2 -

13 1.1 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς Τα εξωτερικά και εσωτερικά «σύνορα» των κυττάρων σχηµατίζονται από τις βιολογικές µεµβράνες, οι οποίες συµπεριφέρονται σαν διαχωριστικές επιφάνειες επιτρέποντας διαµερισµατοποίηση χωρίς όµως να είναι αδρανή συστήµατα. Συγκεκριµένα, οι κυτταρικές µεµβράνες αποτελούν ελεγχόµενους φραγµούς διαπερατότητας που ρυθµίζουν την κίνηση των βιοµορίων από και προς το εσωτερικό του κυττάρου ή των οργανιδίων που οριοθετούνται στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ο ζωτικής σηµασίας αυτός ρόλος των µεµβρανών θα ήταν αδύνατος χωρίς την παρουσία οργανωµένων πρωτεϊνικών συστηµάτων στην µεµβράνη, που συγκροτούν οι µεµβρανικές πρωτεΐνες. Οι µεµβρανικές πρωτεΐνες διακρίνονται σε ενσωµατωµένες (integral ή intrinsic) και σε περιφερικές ή εξωµεµβρανικές (peripheral ή extrinsic). Ενδοµεµβρανικές (ενσωµατωµένες) και περιφερικές µεµβρανικές πρωτεΐνες είναι δυνατόν να λειτουργούν συνεργειακά µέσα στο κύτταρο, όπως για παράδειγµα στα συστήµατα των µεµβρανικών υποδοχέων (integral) πρωτεϊνικών κινασών (peripheral), που εξυπηρετούν έναν από τους γνωστούς µηχανισµούς µοριακής σηµατοδότησης. Συνοπτικά, οι λειτουργίες που καταλύονται από ενσωµατωµένες µεµβρανικές πρωτεΐνες περιλαµβάνουν µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος (signal transduction) και ενέργειας (energy transduction), όπως είναι: (α) υποδοχείς σηµάτων σε µηχανισµούς µοριακής σηµατοδότησης, (β) έλεγχος της επικοινωνίας και των αλληλεπιδράσεων του κυττάρου µε το περιβάλλον του ή µε άλλα κύτταρα, (γ) οξειδοαναγωγικά ένζυµα στην αναπνευστική αλυσίδα, (δ) πρόσληψη µικροµορίων που χρησιµοποιούνται ως µεταβολικά ενδιάµεσα, ρύθµιση των ενδοκυτταρικών συγκεντρώσεων ιόντων ή απέκκριση κυτταροτοξικών ουσιών. Στην περίπτωση (δ), πρόκειται κυρίως για τις πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς, πολυτοπικές διαµεµβρανικές πρωτεΐνες µε 4 έως 14, συνήθως, διαµεµβρανικά τµήµατα (κατά κανόνα, α-έλικες) (transmembrane segments, TMs, ή transmembrane helices, TMHs), µεταξύ των οποίων σχηµατίζεται ένα στερεοδιαταξικά ευέλικτο κέντρο δέσµευσης υποστρώµατος. Ως προς τον δοµικό τους τύπο, οι πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς ανήκουν στην κατηγορία των πολυτοπικών διαµεµβρανικών (transmembrane) πρωτεΐνών, επειδή διατρέχουν (span) περισσότερες από µία φορές την κυτταρική µεµβράνη (lberts et al., 2000, odish et al., 2004, Berg et al., 2005, Valdés et al., 2006). Γενικότερα (Εικόνα 1.1), οι πρωτεΐνες µεταφοράς (transporters) σύµφωνα µε το διεθνές σύστηµα φυλογενετικής λειτουργικής ταξινόµησης και ονοµατολογίας (Transport Commission, TC system, 1999) (htpp:// ταξινοµούνται σε διαύλους (channels- TC1) και σε µεταφορείς (carriers). Οι δίαυλοι επιτελούν πάντα διευκολυνόµενη διάχυση, δηλαδή δεν συσσωρεύουν αλλά απλώς εξισορροπούν τις συγκεντρώσεις ιόντων ή µικροµορίων εκατέρωθεν της µεµβράνης (equilibrative transport). Οι µεταφορείς επιτελούν κυρίως αντιδράσεις ενεργού µεταφοράς, που επιτρέπουν «ασύµµετρη» συσσώρευση ιόντων ή µικροµορίων, προς τη µία πλευρά της µεµβράνης, ακόµη και ενάντια της διαβάθµισης συγκεντρώσεών τους (concentrative transport), και έχουν µεγαλύτερη ευελιξία διαµορφώσεων (aier et al., 2000). Οι αντιδράσεις ενεργού µεταφοράς αντλούν την απαραίτητη ενέργεια για την µεταφορά ενός υποστρώµατος από τη µία πλευρά της µεµβράνης στην άλλη είτε από µία «πρωτογενή» πηγή, όπως είναι η υδρόλυση του TP, είτε, έµµεσα, από µια «δευτερογενή» πηγή ενέργειας (ηλεκτροχηµική διαβάθµιση ιόντων). Έτσι, µιλάµε για πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς πρωτογενούς και δευτερογενούς τύπου, αντίστοιχα - 3 -

14 (Primary-TC3 and econdary-tc2 active transporters). Οι µεταφορείς ενεργού µεταφοράς δευτερογενούς τύπου µπορούν να λειτουργήσουν ως µονοµεταφορείς (uniporters), που καταλύουν την αντίδραση µεταφοράς ενός µόνο είδους µορίου διαµέσου της µεµβράνης, ανεξάρτητα από την κίνηση άλλων ειδών µορίων, ως συµµεταφορείς (symporters), που καταλύουν την αντίδραση µεταφοράς δύο ειδών µορίων διαµέσου της µεµβράνης, προς την ίδια κατεύθυνση, και ως αντιµεταφορείς (antiporters), που καταλύουν την αντίδραση µεταφοράς δύο ειδών µορίων διαµέσου της µεµβράνης, προς διαµετρικά αντίθετες κατευθύνσεις. Πρωτεϊνικά Συστήµατα Μεταφοράς (transporters) Μεταφορείς (carriers) ίαυλοι (channels)-tc1 Μεταφορείς οµάδας (group translocators) -TC4 Ενεργοί µεταφορείς πρωτογενούς τύπου (primary active transporters)-tc3 Ενεργοί µεταφορείς δευτερογενούς τύπου (secondary active transporters) - TC2 Μονοµεταφορείς (uniporters)-tc2 Αντιµεταφορείς (antiporters) Συµµεταφορείς (symporters) Εικόνα 1.1 : Σχηµατική απεικόνιση της ταξινόµησης των πρωτεϊνών µεταφοράς. Χρησιµοποιείται το διεθνές σύστηµα φυλογενετικής λειτουργικής ταξινόµησης και ονοµατολογίας (Transport Commission, TC system, 1999)(htpp:// Με έντονους χαρακτήρες σηµειώνεται η κατηγορία στην οποία ανήκει ο υπό µελέτη µεταφορέας YgfO. Όπως προκύπτει από την εξελισσόµενη καταγραφή και ανάλυση της πλήρους αλληλουχίας πολλών γονιδιωµάτων, οι µεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς µικροµορίων ιόντων αποτελούν σηµαντικό ποσοστό του ολικού αριθµού των γνωστών γονιδιακών προϊόντων (5-15%, ανάλογα µε το γονιδίωµα) και έχουν ουσιαστικό ρόλο, τόσο για τις προσαρµογές των παθογόνων ή µη µικροοργανισµών σε διαφορετικά ενδιαιτήµατα (microbial adaptations), όσο και για την ανθρώπινη φυσιολογία και οµοιοστασία ή την εκδήλωση ασθενειών (human physiology and disease) (Kaback et al., 2001; Karatza and Frillingos, 2005). Ωστόσο, δεν υπάρχουν πολλά δεδοµένα στο επίπεδο της αναλυτικής δοµής και µηχανισµού λειτουργίας των πρωτεϊνών αυτών. Αυτό οφείλεται κυρίως σε σηµαντικά τεχνικά προβλήµατα προερχόµενα από τον έντονα υδρόφοβο χαρακτήρα (hydrophobicity) και την λειτουργική σηµασία της ευελιξίας της στερεοδιάταξης (conformational flexibility) των διαµεµβρανικών - 4 -

15 πρωτεϊνών. Συγκεκριµένα, η δέσµευση του ειδικού υποστρώµατος στο αντίστοιχο κέντρο δέσµευσης σε συνδυασµό µε ενεργοποίηση του µεταφορέα από πρωτογενή ή δευτερογενή πηγή ενέργειας οδηγεί σε αντιστρεπτή αλλαγή της στερεοδιάταξης του µορίου (conformation change), η οποία επιτρέπει τελικά την διαµεµβρανική µεταφορά προς µία κατεύθυνση, π.χ. προς το εσωτερικό ή το εξωτερικό του κυττάρου (vectorial transport). Ως συνέπεια, η αποµόνωση των πρωτεϊνών αυτών από το µεµβρανικό περιβάλλον και η ανάκτησή τους σε µορφή λειτουργική και συγχρόνως κατάλληλη για αναλυτικές βιοφυσικές µελέτες εµφανίζει µεγάλες, αν όχι ανυπέρβλητες, τεχνικές δυσχέρειες. Τεχνικές µοριακής βιολογικής ανάλυσης σε συνδυασµό µε βιοχηµικές και βιοφυσικές µελέτες των µεµβρανικών πρωτεϊνών µεταφοράς µπορούν να οδηγήσουν σταδιακά στον χαρακτηρισµό των σχέσεων της δοµής και της λειτουργίας τους. Σε ένα πρώτο στάδιο προσέγγισης, είναι δυνατή η ανάλυση της τοπολογίας, του κέντρου δέσµευσης και των διαµορφώσεων ενός µεταφορέα σε χαµηλή δοµική ευκρίνεια (low resolution) µε τις τεχνικές της in vitro µεταλλαξιγένεσης και της µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής στόχευσης. Παραδείγµατα διαµεµβρανικών µεταφορέων που δοµικά και λειτουργικά είναι χαρακτηρισµένοι µέσω αυτών των τεχνικών αποτελούν ο µεταφορέας λακτόζης acy της E. coli (Frillingos et al., 1998, Kaback et al., 2001, Kaback et al., 2007), ο µεταφορέας γλουταµικού ltt του Bacillus stearothermophilus (lotboom et al., 2001) και ο µεταφορέας σεροτονίνης ERT (ato et al., 2004; Zhang and Rudnick, 2005). Σε δεύτερο στάδιο, ακολουθεί η επιβεβαίωση από κρυσταλλογραφικά δεδοµένα ανάλυσης της δοµής σε υψηλή ευκρίνεια (high resolution) µε χαρακτηριστικά παραδείγµατα τον µεταφορέα λακτόζης acy της E.coli (bramson et al., 2003a, Mizra et al., 2006, uan et al., 2007) και τα βακτηριακά οµόλογα των µεταφορέων νευροδιαβιβαστών ltt (Yernool et al., 2004) και ERT (Yamashita et al., 2005). Σε τρίτο επίπεδο ανάλυσης, ο συνδυασµός των κρυσταλλογραφικών δεδοµένων µε νεότερα πειράµατα κατευθυνόµενης στόχευσης (site-directed techniques) ή και επαναξιολόγηση των ήδη διαθέσιµων δεδοµένων µεταλλαξιγένεσης οδηγεί σε ασφαλέστερα συµπεράσµατα για τον µηχανισµό λειτουργίας µιας πρωτεΐνης ενεργού µεταφοράς, σε αναλυτικό µοριακό επίπεδο (bramson et al., 2003b; uan and Kaback, 2006; Kaback et al., 2007) (Kanner, 2006; Raunser et al., 2006; Ryan and Mindell, 2007) (Rudnick, 2006; Forrest et al., 2007; Zomot et al., 2007)

16 1.2 Η οικογένεια µεταφορέων NT/NC2 H µεγαλύτερη και ευρύτερα διαδεδοµένη κατά την εξέλιξη οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων είναι γνωστή ως οικογένεια Μεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Ασκορβικού (Nucleobase scorbate Transporters, NT) (de Koning and Diallinas, 2000), ή οικογένεια Συµµεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Κατιόντων #2 (Nucleobase-Cation ymporter 2, NC2) (TC 2..40, Πρόκειται για την οικογένεια µε τον υψηλότερο βαθµό συντήρησης από τις έξι γονιδιακές οικογένειες µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων που είναι γνωστές στη βιβλιογραφία (Kraupp and Marz, 1995, de Koning and Jarvis, 1999, de Koning and Diallinas, 2000, Willins et al, 2002, Wallace et al., 2002, Cecchetto et al., 2004). Περιλαµβάνει µεταφορείς πουρινών, πυριµιδινών και -ασκορβικού και αριθµεί περισσότερα από 500 µέλη σε όλα σχεδόν τα είδη οργανισµών, σε αρχαία, ram-θετικά και ram-αρνητικά βακτήρια, φυτά, µύκητες και θηλαστικά (µε εξαιρέσεις ορισµένα παρασιτικά πρωτόζωα, ενδοπαρασιτικά βακτήρια, και ζυµοµύκητες) (de Koning and Diallinas, 2000). Τα λειτουργικώς χαρακτηρισµένα µέλη της οικογένειας NT/NC2 είναι µόνο 15 και περιλαµβάνουν ειδικούς µεταφορείς ουρακίλης, ξανθίνης ή ουρικού οξέος (οξειδωµένων πουρινών) σε γονιδιώµατα βακτηρίων, µυκήτων και φυτών, ή µεταφορείς βιταµίνης C, στα θηλαστικά (Tsukaguchi et al., 1999, de Koning and Diallinas, 2000, iang et al., 2001, oudela et al., 2005). Τα µέλη της οικογένειας αυτής παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι (α) ευθύνονται για την πρόσληψη νουκλεοτιδικών βάσεων που χρησιµοποιούνται ως αναγκαία θρεπτικά υποστρώµατα στον µεταβολισµό των κυττάρων, και (β) αναγνωρίζουν ως πιθανά υποστρώµατα δοµικά ανάλογα νουκλεοτιδικών βάσεων που χρησιµοποιούνται ως αντιµικροβιακά, αντιϊκά ή αντικαρκινικά φάρµακα (όπως 5-φθοροκυτοσίνη, 5-φθοροουρακίλη, αλλοπουρινόλη, οξυπουρινόλη) (Kraupp and Marz, 1995, de Koning and Jarvis, 1999, de Koning and Diallinas, 2000, Willins et al, 2002, Wallace et al., 2002). Παρά την προφανή σπουδαιότητα του ρόλου τους (λειτουργούν µέσα στα κύτταρα ως µοριακές είσοδοι αναγνώρισης και πρόσληψης πουρινών ή δοµικώς συγγενών φαρµάκων), τα µέλη της οικογένειας NT/NC2 δεν έχουν µελετηθεί συστηµατικά στο µοριακό επίπεδο και δεν έχουν µελετηθεί σε υψηλή αναλυτική ευκρίνεια δοµές ή µοντέλα του µηχανισµού λειτουργίας τους. Περισσότερες από 500 αλληλουχίες µελών είναι γνωστές, αλλά µόνο 15 µέλη έχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά µέχρι σήµερα (Εικόνα 1.2). Πρόσφατα, χαρακτηρίσθηκε από την ερευνητική µας οµάδα ένας νέος µεταφορέας NT/NC2, του εντεροβακτηρίου E.coli, που ονοµάζεται YgfO και λειτουργεί ως ειδικός συµµεταφορέας ξανθίνης:η +. Σήµερα, χρησιµοποιούµε τον YgfO ως πρότυπο µοριακό σύστηµα για µελέτη των σχέσεων δοµής-λειτουργίας των µεταφορέων NT/NC2 (Karatza and Frillingos, 2005; Karatza et al., 2006)

17 Εικόνα 1.2 : Χαρακτηρισµένα µέλη της οικογένειας ΝΑΤ/NC2. Αριστερά σηµειώνεται το όνοµα του µεταφορέα µαζί µε το είδος οργανισµού στο γονιδίωµα του οποίου ανήκει και δεξιά το κύριο υπόστρωµα που µεταφέρει. Με ερυθρό περίγραµµα σηµειώνεται ο µεταφορέας ξανθίνης YgfO που είναι αντικείµενο της παρούσας µελέτης

18 1.3 Μεταφορείς πουρινών στο εντεροβακτήριο E.coli Το «απλό» πειραµατικό µοντέλο του εντεροβακτηρίου E. coli Κ-12 έχει αξιοποιηθεί συστηµατικά για την ανάλυση των βασικών αρχών εξελικτικά συντηρηµένων µηχανισµών και πρωτεϊνικών δοµών, ενώ αποτελεί πεδίο αναφοράς για κάθε κυτταρικό βιολόγο (Zalkin and Nygaard, 1996) και για κάθε ολοκληρωµένη µοριακή έρευνα στη σύγχρονη, µετα-γονιδιωµατική εποχή (von Heijne, 1999). Στην περίπτωση των µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων, η E. coli διαθέτει γνωστά και επαρκώς χαρακτηρισµένα συστήµατα για την πρόσληψη αδενίνης (Burton, 1983; Roy-Burman and Visser, 1975) και ουρακίλης (ndersen et al., 1995), ενώ συστήµατα πρόσληψης οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνης) ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίσθηκαν µόνον πρόσφατα, από το εργαστήριό µας (Karatza and Frillingos, 2005). Το εντεροβακτήριο E. coli δεν µπορεί να αξιοποιήσει ξανθίνη, ουρικό ή υποξανθίνη αλλά ούτε και άλλες φυσικές πουρίνες, ως µοναδική πηγή αζώτου, πλην της αδενίνης. Παρ όλα αυτά, µπορεί να χρησιµοποιήσει µε επικουρικό τρόπο πουρίνες όπως η ξανθίνη, η υποξανθίνη και η γουανίνη: αυτές µπορούν να προσληφθούν και να επιβοηθήσουν την αερόβια αύξηση των κυττάρων όταν χρησιµοποιούνται ως βασικές πηγές αζώτου άλλα µόρια (αµµώνιο, ασπαρτικό) (Xi et al., 2000; Karatza and Frillingos, 2005). Αυτές και άλλες παλαιότερες παρατηρήσεις υποδεικνύουν µεταξύ άλλων την παρουσία λειτουργικών γονιδίων µεταφοράς ξανθίνης ή υποξανθίνης στο γονιδίωµα της E. coli. n silico αναλύσεις ( έδειξαν ότι στο γονιδίωµα της E. coli εντοπίζονται 10 πιθανά µέλη της οικογένειας NT/NC2, που θα µπορούσαν να λειτουργούν φυσιολογικά ως µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων (ξανθίνης, ουρικού, ή ουρακίλης) (Εικόνα 1.3) (Karatza and Frillingos, 2005). Από αυτά µόνο ο µεταφορέας ουρακίλης Ura είχε χαρακτηριστεί λειτουργικά προ του 2004 (ndersen et al., 1995), ενώ από τα υπόλοιπα 9 πιθανά µέλη, µόνο 4 έχουν στην αλληλουχία τους το µοτίβο υπογραφή, µία χαρακτηριστική αλληλουχία, υψηλής συντήρησης µεταξύ των µεταφορέων NT, που εµπλέκεται στην αναγνώριση υποστρώµατος και στην εξειδίκευση του κέντρου δέσµευσης (Diallinas et al., 1998; Koukaki et al., 2005; Karatza et al., 2006) (YgfO, YicE, YgfU, Ycd). Μάλιστα, οι YgfO και YicE εµφανίζουν µεγαλύτερη εξελικτική συγγένεια µε τους µεταφορείς Uap και UapC του spergillus nidulans: κατά µέσο όρο, οι αλληλουχίες των 2 βακτηριακών οµολόγων ταυτίζονται στο 30% µε αυτές των 2 µυκητιακών, ενώ η ταυτότητα ανεβαίνει στο 70% στην 10πεπτιδική περιοχή του µοτίβου ( 324 [Q/E/P]-N-X-X-X-X-X-T-[R/K/] 333 ). Τα γονίδια των YgfO και YicE κλωνοποιήθηκαν από το γονιδίωµα της E. coli, υπερεκφράσθηκαν εξωχρωµοσωµικά σε λειτουργική µορφή (Karatza and Frillingos, 2005) και ο λειτουργικός χαρακτηρισµός τους έδειξε ότι και οι δυο λειτουργούν ως ειδικοί και υψηλής συγγένειας (high affinity) µεταφορείς ξανθίνης και, µάλιστα, συµµεταφορείς ξανθίνης:h + (Karatza and Frillingos, 2005), χωρίς να µπορούν να µεταφέρουν ουρικό οξύ, υποξανθίνη, ουρακίλη ή οποιαδήποτε άλλη φυσική νουκλεοτιδική αζωτούχο βάση (αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυµίνη) ή φαρµακευτικό της ανάλογο (όπως οξυπουρινόλη, ή αλλοπουρινόλη). Επίσης, αναγνωρίζουν ως ειδικούς προσδέτες (ligands), που ανταγωνίζονται την πρόσληψη ξανθίνης σε πειράµατα ελέγχου ενεργού µεταφοράς, πολλά ανάλογα της ξανθίνης (1-µεθυλοξανθίνη, 3-µεθυλοξανθίνη, 2-θειοξανθίνη, 6-θειοξανθίνη, 9-µεθυλοξανθίνη), αλλά όχι ανάλογα που φέρουν τροποποιήσεις στις θέσεις 7 ή 8 (ιµιδαζόλιο) του πουρινικού δακτυλίου (όπως 7-µεθυλοξανθίνη, 8-µεθυλοξανθίνη, 8-αζαξανθίνη,

19 δεαζαξανθίνη, 8-θειουρικό, ουρικό) (Karatza and Frillingos, 2005; oudela et al., 2005) (βλ. και παρακάτω, Εικόνα 1.5). Εικόνα 1.3: [Q/E/P]-N-X--X-X-X-X-T-[R/K/]: Η αλληλουχία- υπογραφή της οικογένειας NT/NC2 στα 15 χαρακτηρισµένα µέλη (NT motif). Στην αριστερή πλευρά αναγράφεται ο µεταφορέας και το είδος οργανισµού στο οποίο ανήκει, ενώ στην δεξιά πλευρά φαίνεται το κύριο µεταφερόµενο υπόστρωµα. Στο µέσον δίνεται η αλληλουχία των αµινοξέων που αντιστοιχεί στην περιοχή «µοτίβο». Με κάθετες µπλε στήλες επισηµαίνονται αµινοξέα που είναι πλήρως συντηρηµένα σε όσους µεταφορείς έχει γίνει πλήρης λειτουργικός χαρακτηρισµός ενώ στο οριζόντιο πλαίσιο επισηµαίνεται ο µεταφορέας YgfO. Βιβλιογραφικές αναφορές δίνονται στο κείµενο

20 1.4 Ο µεταφορέας YgfO Το γονιδίωµα του εντεροβακτηρίου E.coli Κ-12 περιλαµβάνει τα YgfO και YicE, δύο εξελικτικά συντηρηµένα µέλη της οικογένειας µεταφορέων NT/NC2, µε µεγάλη οµολογία καταλοίπων µεταξύ τους (45% ταυτότητα καταλοίπων) και υψηλή συγγένεια οµολογίας µε τον Uap του spergillus nidulans, του πιο εκτενώς µελετηµένου µέλους της οικογένειας NT από έναν ευκαρυωτικό οργανισµό (Pantazopoulou and Diallinas, 2007). Τα γονίδια ygfo και yice υποκλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους φορείς έκφρασης και υπερεκφράσθηκαν εξωχρωµοσωµικά στην E.coli σε συνθήκες αµελητέας ενδογενούς ενεργότητας (Karatza and Frillingos, 2005) και, µετά τον αναλυτικό λειτουργικό χαρακτηρισµό τους (κεφάλαιο 1.3) (Karatza and Frillingos, 2005; oudela et al., 2005), χρησιµοποιούνται συστηµατικά σήµερα σε περαιτέρω πειράµατα µεταλλαξιγένεσης και ανάλυσης των σχέσεων δοµής-λειτουργίας τους. Ο µεταφορέας YgfO αποτελεί αντικείµενο µελέτης αυτής της εργασίας. Είναι µια πρωτεΐνη 466 καταλοίπων αµινοξέων µε πιθανή δοµή 12 διαµεµβρανικών τµηµάτων και το καρβοξυτελικό της άκρο προς το κυτταρόπλασµα (ranseth et al., 2005; Karatza et al., 2006) (Εικόνα 1.4).. Όπως και όλα τα µέλη της οικογένειας NT, περιέχει, αµέσως πριν το ένατο διαµεµβρανικό τµήµα (TM9), στην κυτταροπλασµατική θηλειά (loop) 8-9, την αλληλουχία υπογραφή [Q/E/P]-N-X-X-X-X-X-T-[R/K/] (NT motif) (Diallinas et al., 1998, Meintanis et al., 2000). Η αλληλουχία υπογραφή (βλ. Εικόνα 1.3) προέκυψε κυρίως από αναλύσεις χιµαιρικών µεταφορέων πουρινών µε τµήµατα της πρωτεΐνης Uap και της παράλογης αυτής πρωτεΐνης UapC του. nidulans (Diallinas et al., 1998) και πρόκειται για µια ιδιαίτερα συντηρηµένη περιοχή, συντηρηµένη σε µεγάλο βαθµό σε όλα µέλη της οικογένειας από τα βακτήρια µέχρι τον άνθρωπο (de Koning and Diallinas, 2000) (Εικόνα 1.3), που έχει δειχθεί ότι περιέχει κατάλοιπα µε κρίσιµο ρόλο στην αναγνώριση υποστρώµατος και στην εξειδίκευση, τόσο στον µεταφορέα Uap του. nidulans (Koukaki et al., 2005; millis et al., 2001) όσο και στον YgfO της E. coli (Karatza et al., 2006). Ο αναλυτικός λειτουργικός χαρακτηρισµός του YgfO (Karatza and Frillingos, 2005) έδειξε ότι είναι ειδικός και υψηλής συγγένειας συµµεταφορέας H + :ξανθίνης (K m περί τα 5 µm). Σε έντονη αντίθεση µε τους µεταφορείς Uap (oudela et al., 2005; Koukaki et al., 2005) και UapC (Vlanti et al., 2006) του ασκοµύκητα. nidulans, fuap του παθογόνου ασκοµύκητα. fumigatus (Γκουντέλλα Σοφία, διδακτορική διατριβή-2006) (Pantazopoulou and Diallinas, 2007) και Xut1 του ζυµοµύκητα Candida albicans (oudela et al., 2005), ο YgfO δεν µεταφέρει ουρικό οξύ (σε συγκεντρώσεις 0.1 mm) ή οξυπουρινόλη και δεν αναγνωρίζει ως προσδέτες ανάλογα ξανθίνης που φέρουν υποκαταστάτες στη θέση 8 του ιµιδαζολικού τµήµατος της πουρίνης (8- µεθυλοξανθίνη, 8-αζαξανθίνη, 8-θειουρικό) (oudela et al., 2005). Ακόµη, δείχθηκε ότι οι απαραίτητες για τη δέσµευση υποστρώµατος αλληλεπιδράσεις του YgfO γίνονται κυρίως µε τις οµάδες Ν3-Η και =Ο2 του πυριµιδινικού δακτυλίου ενώ η αλληλεπίδραση µε τον ιµιδαζολικό δακτύλιο της πουρίνης γίνεται κυρίως µέσω του Ν9 (Karatza and Frillingos, 2005, oudela et al., 2005) (Εικόνα 1.5)

21 Εικόνα 1.4: Mοντέλο τοπολογικής οργάνωσης του µεταφορέα YgfO Το παρουσιαζόµενο µοντέλο προκύπτει από in silico ανάλυση µε το πρόγραµµα TMHMM ( (ranseth et al., 2005) και προκαταρτικά δεδοµένα του εργαστηρίου από πειράµατα κυστεϊνικής στόχευσης και ανάλυσης της προσβασιµότητας κυστεϊνών σε υδρόφιλα αντιδραστήρια (scanningcysteine accessibility method, CM) (Μερµελέκας Γ., Γεωργοπούλου Α., Καρατζά Π., και Φριλίγγος Ε., αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Παρουσιάζεται επίσης η πιθανή θέση των καταλοίπων που αποτελούν την ευρύτερη περιοχή του NT motif (Karatza et al., 2006). Εικόνα 1.5: Ρόλος των θέσεων 1-9 του πουρινικού δακτυλίου της ξανθίνης για την αναγνώριση υποστρώµατος από βακτηριακά (YgfO/YicE) ή από µυκητιακά (Uap/Xut1) µέλη της οικογένειας µεταφορέων NT/NC2. Με γαλάζιους κύκλους σηµειώνονται οι θέσεις που όταν τροποποιηθούν επηρεάζουν σηµαντικά την αναγνώριση υποστρώµατος ενώ µε µαύρους κύκλους φαίνονται οι θέσεις, τροποποίηση των οποίων δεν επιτρέπει την αναγνώριση υποστρώµατος

22 Για την περαιτέρω µελέτη των σχέσεων δοµής-λειτουργίας, της τοπολογίας, των αλληλεπιδράσεων στη θέση δέσµευσης υποστρώµατος, της δυναµικής της δοµής και άλλων στοιχείων του µηχανισµού λειτουργίας των µεταφορέων της οικογένειας NT/NC2 έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριo ένα πρότυπο µοριακό σύστηµα, µε βάση τον µεταφορέα YgfO. Κατασκευάστηκε ένας µεταφορέας χωρίς εγγενή κατάλοιπα κυστεϊνών, µε αλλαγµένες τις πέντε εγγενείς του κυστεΐνες σε σερίνη (YgfO-Cys-less), o οποίος εκφράζεται κανονικά στη µεµβράνη και έχει παρόµοια ενεργότητα και συγγένεια µεταφοράς ξανθίνης (K m περί τα 5 µm) µε τον φυσικού τύπου YgfO και, στη συνέχεια, χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα για στοχευµένα πειράµατα κυστεϊνικής σάρωσης (Cys-scanning mutagenesis). Σε πρώτη προσέγγιση, αναλύθηκε συστηµατικά η περιοχή του µοτίβου-«υπογραφή» (Εικόνα 1.4) (Karatza et al., 2006). Με την µέθοδο µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής σάρωσης και µε περαιτέρω διεξοδικές µελέτες σηµειακής µεταλλαξιγένεσης βρέθηκε ότι το κατάλοιπο ln324 είναι καθοριστικό για την αναγνώριση του υποστρώµατος (ξανθίνης) και των ειδικών προσδετών του YgfO (αναλόγων ξανθίνης) µε υψηλή συγγένεια, το κατάλοιπο sn325 είναι αναντικατάστατο για την ενεργό µεταφορά ξανθίνης, ενώ τα κατάλοιπα Thr332 και ly333 είναι σηµαντικά για την εξειδίκευση του µεταφορέα ως προς το υπόστρωµα. ύο άλλα κατάλοιπα, Pro318 και ly340, φαίνεται ότι έχουν καθοριστική σηµασία για τη σωστή διαµόρφωση και έκφραση του YgfO στη µεµβράνη. Πειράµατα αναστολής µε το Ν-αιθυλµηλεϊµήδιο (ΝΕΜ) υποδεικνύουν δοµή α-έλικας για την τελευταία περιοχή των καταλοίπων που µελετήθηκαν (κατάλοιπα ), ενώ κατέδειξαν το la323 ως έναν δείκτη των αλλαγών διαµόρφωσης που συνδέονται µε την πρόσδεση υποστρώµατος (Karatza et al., 2006). Περαιτέρω, τα πειράµατα αυτά αποκαλύπτουν µία σειρά καταλοίπων (la323, sn326, ly327, Val328, le329, Thr332, ly333, er336, Val339) που σχηµατίζουν µία συνεχόµενη όψη, ευαίσθητη στο ΝΕΜ και σε άλλα Hαντιδραστήρια. Πρόκειται για µια περιοχή, η οποία αποτελείται από µία µικρή θηλειά που εµπεριέχει το NT motif και ένα τµήµα α- έλικας αµέσως µετά την αλληλουχία του ΝΑΤ motif (Εικόνα 1.6). Συνολικά, η περιοχή αυτή φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στις αλλαγές διαµόρφωσης που συµβαίνουν κατά τον κύκλο λειτουργίας του µεταφορέα (turnover) και η αλκυλίωση των αντίστοιχων θέσεων µε την οµοιοπολική πρόσδεση της οµάδας του µηλεϊµιδίου (NEM) παρεµποδίζει ουσιαστικά τον µηχανισµό λειτουργίας

23 Η ξανθίνη αυξάνει την ευαισθησία στο NEM FP-tag Εικόνα 1.6: Μοντέλο εργασίας για την εξέλιξη των αναλύσεων µεταλλαξιγένεσης του µεταφορέα YgfO (eorgopoulou et al., 2007). Τα χρησιµοποιούµενα σύµβολα είναι: Περαιτέρω πειράµατα µεταλλαξιγένεσης είναι σε εξέλιξη και εστιάζονται κυρίως στην περιοχή πριν το µοτίβο (κατάλοιπα ) και στην περιοχή της έλικας-12 (κατάλοιπα ). Τα συνεχιζόµενα πειράµατα κυστεϊνικής σάρωσης αναµένεται ότι θα οδηγήσουν στον προσδιορισµό των κύριων καθοριστών του µηχανισµού αναγνώρισης, δέσµευσης και µεταφοράς ξανθίνης στον YgfO, αλλά και ένα γενικότερο µοντέλο του µηχανισµού πρόσληψης πουρινών από τους µεταφορείς NT (Karatza et al., 2006). Σε αυτή την προσπάθεια, εποικοδοµητική είναι η παράλληλη συνεργασία µε ερευνητικές οµάδες του εξωτερικού για αναλυτικές βιοφυσικές µελέτες, όπως µε ηλεκτρονικό παραµαγνητικό συντονισµό EPR- οµάδα J. C. Voss (University of California Davis), και για δοκιµασίες κρυσταλλογραφίας του YgfO και οµόλογων µεταφορέων από θερµόφιλους µικροοργανισµούς συνεργασία µε την οµάδα H. R. Kaback (University of California os ngeles)

24 1.5 ιαµεµβρανικά φορτισµένα κατάλοιπα Η παρουσία δυνητικά ιοντιζόµενων οµάδων αµινοξέων σε κατάλοιπα διαµεµβρανικών τµηµάτων δεν ευνοείται ενεργειακά λόγω της χαµηλής διηλεκτρικής σταθεράς του ενδοµεµβρανικού περιβάλλοντος. Ωστόσο, τέτοιες οµάδες απαντώνται συχνά σε διαµεµβρανικά τµήµατα και, στις περιπτώσεις αυτές, τα ιοντιζόµενα διαµεµβρανικά κατάλοιπα έχουν σηµαντικούς ρόλους για την δοµή ή λειτουργία του µακροµορίου. Σε µεµβρανικές πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς, θετικά ή αρνητικά ιοντιζόµενα κατάλοιπα µπορεί να σταθεροποιούν τη λειτουργική δοµή ή την διαµόρφωση του κέντρου δέσµευσης µέσω δηµιουργίας γεφυρών άλατος (salt bridges) µεταξύ αντίθετα φορτισµένων οµάδων, ή µπορεί να συµµετέχουν άµεσα σε αλληλεπιδράσεις µε το µόριο υποστρώµατος κατά την δέσµευση και/ή διαµεµβρανική µεταφορά του, διαδραµατίζοντας κεντρικό ρόλο στον µηχανισµό. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγµα του µεταφορέα λακτόζης acy της E. coli του οποίου η διεξοδική µεταλλαξιγένεση έδειξε ότι µόνο 6 από τα 417 κατάλοιπα είναι αναντικατάστατα στον µηχανισµό της ενεργού µεταφοράς, και αυτά τα 6 είναι κατάλοιπα ιοντιζόµενων οµάδων αµινοξέων σε διαµεµβρανικές έλικες του µορίου (Frillingos et al, 1998; bramson et al., 2003a; Kaback et al., 2007). Συγκεκριµένα, rg144 (έλικα V) και lu126 (έλικα V) είναι αναντικατάστατα για τη δέσµευση της λακτόζης, His322 (έλικα X), lu325 (έλικα X) και rg302 (έλικα ΙΧ) είναι αναντικατάστατα για την συµµεταφορά του πρωτονίου, ενώ το lu269 (έλικα V) είναι αναντικατάστατο τόσο για τη δέσµευση της λακτόζης όσο και για την συµµεταφορά πρωτονίου:λακτόζης. Επίσης, δύο ακόµη ζεύγη ιοντιζόµενων διαµεµβρανικών καταλοίπων έχουν κρίσιµο ρόλο, αν και όχι αναντικατάστατο, για τον µηχανισµό (sp240-ys319) ή για την διατήρηση της δοµής της acy (sp237-ys358) (Frillingos et al, 1998; bramson et al., 2003a; Kaback et al., 2007). Βιβλιογραφικά υποστηρίζεται ότι φορτισµένα αµινοξέα που ανήκουν σε διαφορετικά διαµεµβρανικά τµήµατα του µεταφορέα σχηµατίζουν µεταξύ τους ιοντικά ζεύγη ή γέφυρες άλατος (salt bridges), όπως ονοµάζονται, και έτσι είναι περισσότερο σταθερά από ό,τι ως ανεξάρτητα ιονισµένα κατάλοιπα σε χαµηλά διηλεκτρικά µέσα (ee et al., 1992, 1993; ahin-toth et al., 1992; Dunten et al., 1993; Frillingos and Kaback, 1996). Έχει προταθεί ότι, ενώ απαιτούνται 10 kcal/mol για την είσοδο ενός φορτισµένου αµινοξέος σε µια περιοχή χαµηλού διηλεκτρικού, µία γέφυρα άλατος απαιτεί µόνο περί το 1 kcal/mol και µε την παρουσία επιπλέον οµοιοπολικών δεσµών η γέφυρα άλατος µπορεί να είναι εξαιρετικά σταθερή ακόµη και σε ιδιαίτερα υδρόφοβο περιβάλλον (Honig and Hubbell, 1984). Είναι πιθανό πολλά φορτισµένα κατάλοιπα σε υδρόφοβες περιοχές να εξουδετερώνονται από γειτονικά κατάλοιπα αντίθετου φορτίου (Frillingos and Kaback, 1996; Honig and Hubbell, 1984). Οι γέφυρες άλατος µπορούν να έχουν ενεργειακά τουλάχιστον δύο διαφορετικές λειτουργίες στις µεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφορείς. Η πρώτη πιθανή λειτουργία είναι δοµικού χαρακτήρα: η γέφυρα άλατος συµβάλλει στη σωστή τοποθέτηση των α-ελίκων στον χώρο, στο «δέσιµό» τους σε συγκεκριµένη αναδίπλωση για την κατάλληλη είσοδο της πρωτεΐνης στην µεµβράνη (insertion) και κατ επέκταση για την εξασφάλιση της σωστής λειτουργίας του µεταφορέα (Dunten et al., 1993; ahin-toth et al., 1992, ahin-toth and Kaback, 1993; Frillingos et al., 1995; Frillingos and Kaback, 1996). Η δεύτερη πιθανή λειτουργία έχει τον χαρακτήρα της άµεσης και καθοριστικής συµµετοχής στον µηχανισµό: η γέφυρα άλατος µπορεί να συµβάλλει στην βελτιστοποίηση των αλληλεπιδράσεων στο κέντρο δέσµευσης υποστρώµατος ώστε να επιτρέπει την πρόσδεση του υποστρώµατος µε την

25 κατάλληλα υψηλή συγγένεια δέσµευσης (binding affinity) (Frillingos et al., 1997; Venkatesan and Kaback, 1998) ή συµβάλλει δυναµικά στην µεταφορά του πρωτονίου µέσω ενός κύκλου πρωτονίωσης-αποπρωτονίωσης των συµµετεχουσών καρβοξυλοµάδων ή αµινοµάδων (Kaback, 1997; Frillingos et al., 1998; ahin-toth et al., 2000; Kaback et al., 2001). Αρκετά και χαρακτηριστικά είναι τα παραδείγµατα ιοντιζόµενων διαµεµβρανικών καταλοίπων που έχει δειχθεί, µε µεθόδους στοχευµένης µεταλλαξιγένεσης (King et al., 1991; Jung et al., 1993, 1995; He et al., 1997; He and Kaback, 1997; Broke et al, 2001; Zomot et al., 2005), ότι είτε σχηµατίζουν γέφυρες άλατος (βλ. παραπάνω) είτε συµµετέχουν σε άλλες σηµαντικές πολικές ή ιοντικές αλληλεπιδράσεις και παίζουν κρίσιµο ρόλο στον µηχανισµό, σε πολλές πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς. Στην βακτηριοροδοψίνη (bacteriorhodopsin, br), για παράδειγµα, µεταξύ των καταλοίπων sp85-rg82 και sp96-rg227 σχηµατίζονται γέφυρες άλατος, και µάλιστα θεωρείται ότι τα δύο κατάλοιπα ασπαρτικού (sp85, sp96) εµπλέκονται άµεσα στην µεταφορά πρωτονίου (Khorana,1988, tern and Khorana, 1989). Οµοίως, το ιοντικό ζεύγος lu219-his245 στην υποµονάδα a της F o F 1 -TPάσης (Cain and imoni,1988), καθώς και το κατάλοιπο sp61, η πρωτονίωση-αποπρωτονίωση του οποίου επιτρέπει την περιστροφή του δακτυλίου c (Miller et al.,1990; ambongi et al., 1999) και την µετακίνηση του πρωτονίου διά µέσου της µιτοχονδριακής µεµβράνης (Berg et al., 2005). Γέφυρες άλατος έχει προταθεί ότι συµβάλλουν στον µηχανισµό µιας µεγάλης σειράς µεταφορέων ιόντων, όπως στην πρωτεΐνη αποσύζευξης των µιτοχονδρίων (UCP-1) (Kliingenberg, 1988), στον τασεο-εξαρτώµενο δίαυλο Na + (voltage-gated Na + channel) (Catterall, 1988), στην Na + /K + -TPάση (oldshleger et al., 1992; hainskaya et al., 2000), στην πρωτεΐνη UncE σε διάφορους µικροοργανισµούς (enior, 1983) και στον µεταφορέα ανιόντων των ερυθροκυττάρων (NHE3) (Μacara and Cantley,1981). Κλασικό είναι, τέλος, και το παράδειγµα των 5 διαµεµβρανικών ιοντικών ζευγών της περµεάσης λακτόζης acy, που εκτέθηκε αναλυτικά παραπάνω (Frillingos et al, 1998; bramson et al., 2003a; Kaback et al., 2007). Ιοντιζόµενα διαµεµβρανικά κατάλοιπα που φαίνεται να διαδραµατίζουν καθοριστικό ρόλο στην δοµή και στην λειτουργία ενός µεταφορέα εµφανίζονται µε συστηµατικά υψηλά ποσοστά συντήρησης ανάµεσα στα µέλη της οικογένειας στην οποία ανήκει η πρωτεΐνη. Ενδεικτικά, µπορεί να αναφερθεί η περίπτωση της απόλυτης συντήρησης µεταξύ των µελών της οικογένειας µεταφορέων νιτρικού (nitrate transporters) δύο καταλοίπων αργινίνης (rg87 στο TM2 και rg368 στο TM8), που θεωρείται ότι συµµετέχουν στο κέντρο δέσµευσης υποστρώµατος (Unkles et al., 2004). Επίσης, η περίπτωση ενός ιδαίτερα συντηρηµένου διαµεµβρανικού καταλοίπου rg282 (TM7) του µεταφορέα διπεπτιδίων και τριπεπτιδίων, PepT1 (proton-coupled di- and tripeptide transporter), των θηλαστικών, που έχει δειχθεί ότι είναι αναντικατάστατο για την λειτουργία της πρωτεΐνης (Meredith, 2004), αλλά και οι περιπτώσεις των lu126 και rg144 της acy (βλ. παραπάνω) που είναι κατάλοιπα µε υψηλό βαθµό συντήρησης σε όλα τα µέλη της Μείζονος Υπεροικογένειας ιευκολυνόµενης µεταφοράς (Major Facilitator uperfamily, MF) (Venkatesan and Kaback, 1998; Kasho et al., 2006)

26 - 16 -

27 1.6 Σκοπός της εργασίας Σήµερα, το εργαστήριό µας έχει χαρακτηρίσει και χρησιµοποιεί τον YgfO, έναν νέο µεταφορέα της οικογένειας NT/NC2, µε σκοπό την µελέτη του µηχανισµού λειτουργίας του και την ανάλυση της δοµής του στα πλαίσια µιας ευρύτερης προσπάθειας για τον λειτουργικό χαρακτηρισµό µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων. Η παρούσα εργασία εστιάζεται στην ανάλυση του ρόλου των διαµεµβρανικών ιοντιζόµενων καταλοίπων (rg, sp, lu, His και ys) του µεταφορέα YgfO, χρησιµοποιώντας το βιολογικό σύστηµα της E. coli Κ-12 και τις τεχνολογίες µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής σάρωσης, στοχευµένης µεταλλαξιγένεσης και ειδικής τροποποίησης H-οµάδων. Ειδικότερα οι άµεσοι στόχοι µας ήταν: 1. Εντοπισµός και ανάλυση των πιθανών διαµεµβρανικών καταλοίπων µε µεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής στόχευσης. 2. ιεξοδικότερη µελέτη των σηµαντικότερων καταλοίπων (όπως προκύπτουν από το 1) µε περαιτέρω µεταλλαξιγένεση σηµειακής στόχευσης. 3. Αρχική διερεύνηση των πιθανών αλληλεπιδράσεων καταλοίπων, µέσω ελέγχου για την δυνατότητα δέσµευσης ιόντων καδµίου σε µεταλλάγµατα ζευγών κυστεΐνης (paired-cys mutants)

28 - 18 -

29 ΚΕΦΑΛΑΙΙΟ 2 ο ο :Υλιικά καιι Μέθοδοιι

30 - 20 -

31 2.1 Όργανα Κατά την εκπόνηση της παρούσας µεταπτυχιακής εργασίας χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω εργαστηριακά όργανα (σε αλφαβητική σειρά): Επιτραπέζια µικροφυγόκεντρος Eppendorf Centrifuge 5415 D Μετρητής υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (iquid cintillation Counter) (Packard nstruments, Meriden, Connecticut) του Λειτουργικού- Κλινικοεργαστηριακού Τοµέα της Ιατρικής Σχολής (εργαστήριο Φαρµακολογίας) ή του Τοµέα Οργανικής Χηµείας και Βιοχηµείας του Χηµικού Τµήµατος (εργαστήριο Βιοχηµείας) Μετρητής ph (πεχάµετρο) (ph Meter, ph 340 Package, 240V) (Beckmann nstruments, UK) Συσκευή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης enemp PCR ystem 9700 (pplied Biosystems, Foster City, California) Συσκευή ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Protean xi Cell (Bio-Rad, Hercules, California). Σύριγγα φόρτωσης δειγµάτων (Microliter yringes), Hamilton (Bonaduz, witzerland) Συσκευή ηλεκτροφορητικής µεταφοράς Mini Trans-Blot transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, California). Η ηλεκτροφορητική µεταφορά (blotting) έγινε σε µεµβράνη πολυ-βινυλιδενικού διφθοριδίου (polyvinylidene difluoride, PVDF) (Pall Corporation, nn rbor, Missouri) Συσκευή ταχείας διήθησης (glass filter holder assembly) (Fischer cientific, Pittsburgh, P). Χρησιµοποιήθηκαν ηθµοί διήθησης (Whatman F/C,25 mm-circle, µε διάµετρο πόρων 1.2 µm) για την κατακράτηση του κυτταρικού κλάσµατος. Συσκευή υπερήχων digital sonifier model 250-D (Branson Ultrasonics, Danbery, Connecticut) Υδατόλουτρο (ED-5 open Bath Circulator) (Julabo, ermany) Υπερφυγόκεντρος Beckmann Optima TM Ultracentrifuge (Beckmann nstruments, Palo lto, California) του Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Ερευνών του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων (Ι.Β.Ε.Ι) Φυγοκεντρικός συµπυκνωτής κενού (peedvac concentrator) (avant nstruments, Hicksville, New York) Φυγόκεντρος Heraeus Megafuge 1.0R (Kendro aboratory Products mbh, Hanau, ermany) Φυγόκεντρος orvall RC-5B (Du Pont nstruments, Newton, Connecticut) Φωτόµετρο Ultraspec-2001 (Biochrom, Cambridge, England) DN Photographic Transilluminator ystem (Fotodyne, New Berlin, Winsconscin) Για την επαλήθευση της αλληλουχίας DN στα µεταλλάγµατα που κατασκευάσθηκαν µε in vitro µεταλλαξιγένεση, δείγµατα DN απεστάλησαν στην εταιρεία MW-Biotech (Ebersberg, ermany) όπου και αναλύθηκαν, µε την µέθοδο του F. anger (ενζυµική αντίδραση πολυµερισµού και τερµατισµός µε 2,3 -διδεοξυνουκλεοτίδια) σε Αυτόµατο Αναλυτή Αλληλουχίας (pplied Biosystems)

32 2.2 Χηµικά Αναλώσιµα Για την υλοποίηση των πειραµατικών µεθόδων αναλώθηκαν τα παρακάτω χηµικά υλικά: Ραδιενεργός [8-3 Η] ξανθίνη (18 Ci/mmol) της εταιρείας Moravek Biochemicals (Brea, C). Φυσικές νουκλεοτιδικές βάσεις (αδενίνη, γουανίνη, θυµίνη, κυτοσίνη, ουρακίλη, ξανθίνη) της εταιρείας igma (t. ouis, Missouri) Ολιγο-δεοξυριβονουκλεοτίδια, που συντέθηκαν κατά παραγγελία από την εταιρεία Biopring mbh (Frankfurt, ermany) και χρησιµοποιήθηκαν ως εκκινητές (primers) σε αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Ένζυµα (enzymes) κλωνοποίησης-ανασυνδυασµού του DN: Στην αντίδραση PCR χρησιµοποιήθηκε είτε η Phusion High Fidelity DN πολυµεράση (Phusion High Fidelity PCR ystem) από την εταιρεία Tools for Molecular Biology-FNNZYME (Espoo, Finland) είτε η Platinum Pfx DN πολυµεράση της εταιρείας nvitrogen (roningen, Netherlands). Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες BamH, pa, η DN λιγάση (συνδετάση) του βακτηριοφάγου Τ4, η οποία χρησιµοποιήθηκε στις αντιδράσεις ανασύνδεσης (ligation), καθώς και η αλκαλική φωσφατάση (για την αποφωσφορυλίωση των τµηµάτων DN που χρησιµοποιήθηκαν ως φορείς-vectors) ήταν της εταιρείας MB Fermentas mbh (t. eon-rot, ermany) ή της εταιρείας Takara (BO NC., Japan). Αντισώµατα (antibodies):το αντίσωµα έναντι της αλληλουχίας ιστιδινών (anti-pentahis-g) είναι της εταιρείας Qiagen (West ussex, UK), η πρωτεΐνη Α συνδεδεµένη µε το ένζυµο υπεροξειδάση (horseradish peroxidase (HPR)-labeled protein ), η οποία χρησιµοποιείται ως δεύτερο αντίσωµα, καθώς και το σύζευγµα αβιδίνης- υπεροξειδάσης (avidin-hrp) είναι της εταιρείας mersham Pharmacia BioTech (Upsala, weden). Το αντίσωµα έναντι του πράσινου µηλεϊµιδίου του Oregon ήταν της εταιρείας Molecular Probes (Eugene, Oregon). είκτες πρότυπων µοριακών βαρών: eneruler TM 100bp DN ladder plus, ready to use Fermentas (t. eon-rot, ermany), Prestained D- PE tandards, ow Range Bio-Rad abatories (Hercules, California). Σφαιρίδια νικελίου (Ni 2+ ) (Ni-D beads) ProBond TM Resin nvitrogen (roningen, Netherlands). Πακέτα υλικών (kits): πακέτο υλικών καθαρισµού DN από δείγµατα πήγµατος αγαρόζης Nucleospin Extract Macherey-Nagel (Duren, ermany), πακέτο αποµόνωσης πλασµιδιακού DN Nucleospin Plasmin Macherey-Nagel (Duren, ermany), πακέτο - πρωτόκολλο ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας EC TM Western Blotting Detection Reagents mersham E Healthcare (Buckinghamshire, UK). H-αντιδραστήρια (thiol-reactive dyes): Το Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (ΝΕΜ) ήταν της εταιρείας igma. Tο µεθανο-θειο-σουλφονικό αιθυλσουλφονικό (άλας νατρίου) (MTE - ) καθώς και η µεθανο-θειο-σουλφονική αιθυλαµίνη (MTE + ) ήταν από την εταιρεία Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada)

33 Πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon (OM) από την εταιρεία Molecular Probes (Eugene, Oregon) Χλωριούχο κάδµιο (Cadmium Chloride) της εταιρείας igma Τα υπόλοιπα χηµικά υλικά που χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή των διαφόρων διαλυµάτων (βλ. 2.3) ήταν της υψηλότερης απαιτούµενης καθαρότητας και αγοράσθηκαν κατά κύριο λόγο από την εταιρεία igma

34 2.3 ιαλύµατα Χρησιµοποιήθηκαν, κατ αλφαβητική σειρά, τα παρακάτω διαλύµατα: ιάλυµα Αποδιάταξης: ιάλυµα Tris-NaCl µε 6Μ ουρία και 0.5% (w/v) D ιάλυµα ιαχωρισµού (eperation buffer), ph 8.8: Tris 1.5M, D 0.4% (w/v) Μέθοδος: Ηλεκτροφόρηση πηκτής D-ακρυλαµιδίου (D-PE) ( 2.9.2) ιάλυµα Επαναιώρησης (Resuspension buffer): Tris-HCl 50 mm, ph 8, NaCl 100mM, Na 2 EDT 1mM Μέθοδος: Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών( 2.8) ιάλυµα Επαναιώρησης TB, ph 6.7: Pipes 10 mm, MnCl 2 55 mm, CaCl 2 15mM, KCl 250 mm, αποστείρωση Μέθοδος: ηµιουργία επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων( 2.5.3) ιάλυµα Επιστοίβαξης (tacking buffer), ph 6.8: Tris 0.5M, D 0.4% (w/v) Μέθοδος: Ηλεκτροφόρηση πηκτής D-ακρυλαµιδίου (D-PE) ( 2.9.2) ιάλυµα Ηλεκτροφόρησης: Γλυκίνη Μ, Tris, ph 8.3, M, D 0.1% (w/v) Μέθοδος: Ηλεκτροφόρηση πηκτής D-ακρυλαµιδίου (D-PE) ( 2.9.2) ιάλυµα Μεταφοράς: Tris-Cl ph 8.3, 25 mm, Γλυκίνη 192 mm, µεθανόλη 20% (v/v) Μέθοδος: Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) ( 2.9.3) ιάλυµα [ 3 Η] Ξανθίνης (25µΜ): [8-3 Η] ξανθίνη (18 Ci/mmol) 10 µ, µ µη-ραδιενεργού ξανθίνης 25 µμ, 8.68 µl ddh 2 O Μέθοδος: οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς ( 2.7, 2.7.1, 2.7.2, 2.7.3) ιάλυµα Σακχαρόζης (ucrose buffer): Tris-HCl 25 mm, ph 8, σακχαρόζη 45% (w/v), Na 2 EDT 1mM Μέθοδος: Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών( 2.8) Tris-HCl 30 mm, ph 8, σακχαρόζη 30% (w/v), Na 2 EDT 10mM Μέθοδος: οκιµασία σήµανσης κυστεϊνών in vivo ( 2.10) ιάλυµα Τερµατισµού: KP i (ph 7.5, 2.3.1) 0.1M, icl 0,1M Μέθοδος: οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς ( 2.7, 2.7.1, 2.7.2, 2.7.3) ιάλυµα Tris-NaCl, ph 7.5: Tris 15 mm, NaCl 150 mm Μέθοδος: οκιµασία σήµανσης κυστεϊνών in vivo ( 2.10)

35 ιάλυµα Υπερθειϊκού Αµµωνίου (P): P 10% (w/v) Μέθοδος: Ηλεκτροφόρηση πηκτής D-ακρυλαµιδίου (D-PE) ( 2.9.2) ιάλυµα Φόρτωσης 4x (oading buffer): Tris ph mM, D 9.2% (w/v), DTT 100mM, Γλυκερόλη 40% (v/v), Μπλε της βρωµοφαινόλης 0.2% (w/v) Μέθοδος: Ηλεκτροφόρηση πήγµατος D-ακρυλαµιδίου (D-PE) ( 2.9.2) Θρεπτικό Υλικό OB, ph 7.5: Εκχύλισµα ζύµης 0.5% (w/v), Τρυπτόνη 2%(w/v), NaCl 10 mm, KCl 2.5 mm, MgCl 2 10 mm, MgO 4 10 mm, αποστείρωση Μέθοδος: ηµιουργία επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων ( 2.5.3) Πλήρες Θρεπτικό Υλικό B (uria Broth), ph 7.2: Εκχύλισµα ζύµης 0.5% (w/v), Πεπτόνη 1% (w/v), NaCl 1% (w/v), αποστείρωση Μέθοδος: ηµιουργία επιδεκτικών κυττάρων ( 2.5.3) και Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων E.coli ( 2.6) Πλήρες Θρεπτικό Υλικό B (uria Broth),και άγαρ: Εκχύλισµα ζύµης 0.5% (w/v), Πεπτόνη 1% (w/v), NaCl 1% (w/v), άγαρ 1.5% αποστείρωση Μέθοδος: Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DN ( 2.5.4) TBT 10X: Tris-HCl ph 7.4, 0.1 mm, NaCl 1.5 M, Triton X-100, 2% (v/v) Μέθοδος: Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) ( 2.9.3) Υγρό Σπινθηρισµού (cintillation fluid): Τολουόλιο 66%(v/v), Triton X %(v/v), 2,5-διφαινυλο-οξαζόλη (PPO) 4% (w/v), 1,4-δις(5-φαινυλοξαζολο-2-υλο)βενζόλιο (POPOP) 0.04%(w/v) Μέθοδος: οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς ( 2.7, 2.71, 2.7.2, 2.7.3)

36 Ρυθµιστικά ιαλύµατα πειράµατος ph Για το πείραµα εξάρτησης από το ph ( 2.7.3) παρασκευάσθηκαν 15 ρυθµιστικά διαλύµατα, ως εξής: Για ph από 3.8 µέχρι 4.8 χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα 0.1Μ οξικών (τελικού όγκου 10 m), που προκύπτει από ανάµιξη κατάλληλων όγκων οξικού οξέος CH 3 COOH (0.2M) και οξικού καλίου CH 3 COOK (0.2M) σύµφωνα µε τον Πίνακα1: Πίνακας 1: Ρυθµιστικά διαλύµατα οξικών 0.1Μ ph CH 3 COOH(0.2M) CH 3 COOK(0.2M) dh 2 O m 0.6m 5m m 1.324m 5m m 2.95m 5m Πίνακας 1: Στον πίνακα αυτό δίνεται η αναλογία των όγκων διαλύµατος CH 3 COOH (0.2M) (5.71 m και προσθήκη ddh 2 O µέχρι τα 500 m) και διαλύµατος CH 3 COOK (0.2M) (49 g στα 500 m ddh 2 O) (Θεοδώρου, 2006, tenesh, 1984) για την παρασκευή τριών ρυθµιστικών διαλυµάτων οξικών (0.1Μ) µε τιµές ph 3.8, 4.2 και 4.8. Για ph από 5.2 µέχρι 8.0 χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα 0.1Μ φωσφορικών (KP i, τελικού όγκου 10 m), που προκύπτει από ανάµιξη κατάλληλων όγκων µονοβασικού φωσφορικού καλίου KH 2 PO 4 (1M) και διβασικού φωσφορικού καλίου K 2 HPO 4 (1M) σύµφωνα µε τον Πίνακα 2 : Πίνακας 2: Ρυθµιστικά διαλύµατα φωσφορικών KP i 0.1Μ ph KH 2 PO 4 (1M) K 2 HPO 4 (1M) dh 2 O m 0.02m 9m m 0.055m 9m m 0.14m 9m m 0.25m 9m m 0.5m 9m m 0.73m 9m m 0.8m 9m m 0.97m 9m Πίνακας 2: Στον πίνακα αυτό δίνεται η αναλογία των όγκων διαλύµατος KH 2 PO 4 (1M) ( g στα 500 m ddh 2 O) και διαλύµατος K 2 HPO 4 (1M) (87.09 g στα 500 m ddh 2 O) για την παρασκευή οκτώ ρυθµιστικών διαλυµάτων φωσφορικών (0.1Μ) µε τιµές ph 5.2, 5.6, 6.0, 6.4, 6.8, 7.3, 7.5 και

37 Για ph από 8.5 µέχρι 10.0 χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα 0.1Μ βορικών που προκύπτει από ανάµιξη κατάλληλων όγκων χλωριούχου καλίου KCl µε H 3 BO 3 (0.2M) και καυστικού καλίου KΟΗ (0.2M) σύµφωνα µε τον Πίνακα 3: Πίνακας 3:Ρυθµιστικά διαλύµατα βορικών 0.1Μ ph KCl + H 3 BO 3 (0.2M) KΟΗ(0.2M) dh 2 O 8.6 5m 1.5m 3.5m 9.0 5m 2.3m 2.7m 9.5 5m 3.67m 1.36m m 5.5m - Πίνακας 3: Στον πίνακα αυτό δίνεται η αναλογία των όγκων διαλύµατος KCl + H 3 BO 3 (0.2M) (KCl g και H 3 BO g σε 500 m ddh 2 O) (Θεοδώρου, 2006) και διαλύµατος KOH (0.2M) (2.24 g KOH σε 200 m ddh 2 O) για την παρασκευή τεσσάρων ρυθµιστικών διαλυµάτων οξικών (0.1Μ) µε τιµές ph 8.6, 9.0, 9.5 και

38 2.4 Βακτηριακά στελέχη και πλασµίδια Για την κλωνοποίηση και τον πολλαπλασιασµό των πλασµιδίων χρησιµοποιήθηκαν ως ξενιστές (hosts) τα εξής εργαστηριακά στελέχη της Escherichia coli K-12: E. coli TOP10F (F {lac q, Tn10(Tet R )} mcr (mrr-hsdrm-mrcbc) φ80lacz Μ15 lacx74 deor rec1arad139 (ara-leu)7697 galu galk rps(tr R ) end1 nup) (nvitrogen): χρησιµοποιήθηκε για την αναπαραγωγή των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων σε µεγάλη κλίµακα λόγω του µεγάλου βαθµού επιδεκτικότητας (competence efficiency) που διαθέτει. E. coli Τ184 [lac + O + Z - Y - (), prs, met -, thr -, rec, hsdm, hsdr/f, lac q O + Z D118 (Y+ +)] (Teather et al., 1980): χρησιµοποιήθηκε για την επαγωγή της έκφρασης των διαπερασών YgfO εξωχρωµοσωµικά, µέσω του υποκινητή/χειριστή του οπερονίου λακτόζης, lacz(p/o), υπό τον µεταγραφικό έλεγχο του ισοπροπυλο-β,d-θειογαλακτοσιδίου (PT). Το γονιδίωµα του στελέχους T184 δεν περιέχει ενδογενή γονίδια που να επάγονται µε PT (lacz - Y - ). Τα αρχικά πλασµίδια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν: pt7-5: φορέας κλωνοποίησης των υπό µελέτη γονιδίων µε στόχο την υπερέκφρασή τους µέσω του υποκινητή/χειριστή του οπερονίου της λακτόζης (lacz p/o) [πρόκειται για πλασµίδιο µετρίου αριθµού αντιγράφων ανά κύτταρο (medium copy number), ahin-toth et al., 1995]. pt7-5/ygfo-cys-less-bd (Karatza et al., 2006): ανασυνδυασµένο pt7-5 που φέρει το γονίδιο (ygfo) της διαπεράσης YgfO µε αλλαγµένα τα 5 εγγενή κατάλοιπα κυστεϊνών σε σερίνες (Cys-less), υπό τον µεταγραφικό έλεγχο του lacz p/o, και την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (biotin-acceptor domain, BD) της οξαλοξικής αποκαρβοξυλάσης της Klebsiella pneumoniae (Consler et al., 1993) ακολουθούµενη από το C-τελικό 12πεπτίδιο της acy (RRQVNEV) (Carrasco et al., 1984) στο C- τελικό του άκρο. pt7-5/ygfo-his 10 (Karatza and Frillingos, 2005): ανασυνδυασµένο pt7-5 που φέρει το γονίδιο (ygfo) της διαπεράσης YgfO φυσικού τύπου (wt), υπό τον µεταγραφικό έλεγχο του lacz p/o, και αλληλουχία 10 συνεχόµενων καταλοίπων His (His 10 ) (mirnova and Kaback, 2003) στο C-τελικό άκρο. pt7-5/mely-bd (Frillingos and Kaback, 2001): ανασυνδυασµένο pt7-5 που φέρει το γονίδιο (mely) του µεταφορέα µελιβιόζης MelY και, ως C- τελικό άκρο, την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (BD) της οξαλοξικής αποκαρβοξυλάσης της K. pneumoniae και το καρβοξυτελικό 12πεπτίδιο της acy (C-τελικός επίτοπος)

39 pt7-5/lacy-c154-his 10 (mirnova and Kaback, 2003, bramson et al., 2003): ανασυνδυασµένο pt7-5 που φέρει το γονίδιο (lacy) του µεταφορέα λακτόζης (acy) της Ε. coli µε αλλαγµένη την κυστεϊνη στη θέση 154 σε γλυκίνη (όπως είχε χρησιµοποιηθεί για την αρχική κρυστάλλωση της acy) και µε την C-τελική αλληλουχία δέκα καταλοίπων ιστιδινών (His 10 ). pt7-5/ygfo-x#c-bd (παρούσα µελέτη), ανασυνδυασµένα pt7-5 που φέρουν το γονίδιο της YgfO µε αλλαγµένα τα 5 εγγενή κατάλοιπα κυστεϊνών σε σερίνες (Cys-less) και ένα επιπλέον εγγενές κατάλοιπο (X) στη θέση # (22, 31, 55, 164, 186, 187, 232, 249, 257, 272, 304, 337, 341, 385, 413 ή 429) αλλαγµένο σε Cys (C) (δηλ. single-cys mutants) και την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (BD) ακολουθούµενη από το C-τελικό 12πεπτίδιο της acy στο C-τελικό άκρο

40 2.5 Τεχνικές ανασυνδυασµένου DN Οι τεχνικές ανασυνδυασµένου DN (τεχνικές κλωνοποίησης DN ή γενετικής µηχανικής) χρησιµοποιούνται για την παραγωγή πολλών αντιγράφων από επιλεγόµενα τµήµατα DN µέσω µιας διαδοχικής σειράς in vitro και in vivo σταδίων, δηλ. παραγωγή πολλών κλώνων DN (DN cloning) καθως επίσης και για τον ανασυνδυασµό τµηµάτων DN που µας ενδιαφέρει να µελετήσουµε µε την τελική εισαγωγή τους σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς (DN recombination). Το σύνολο των σχετικών τεχνικών περιγράφεται συχνά ως µία τεχνολογία ανασυνδυασµένου DN (recombinant DN technology) που χρησιµοποιεί ιδιαίτερα µοριακά εργαλεία και µεθόδους Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) δύο σταδίων (overlap/extension) Η PCR δύο ή περισσότερων σταδίων (Ho et al., 1989, Frillingos et al., 1994, Karatza et al., 2006) χρησιµοποιεί κατάλληλα συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια ως εκκινητές (primers) για να δηµιουργήσει από τα γονίδιαστόχους τµήµατα DN µε επικαλυπτόµενα άκρα (στάδιο 1). Τα προϊόντα του σταδίου 1 συνδυάζονται και χρησιµοποιούνται σαν υποστρώµατα σε επόµενες αντιδράσεις PCR, όπου λόγω των επικαλυπτόµενων άκρων τους υβριδίζουν και, µε τη χρήση των ίδιων εξωτερικών ολιγονουκλεοτιδίων όπως στο στάδιο 1, επεκτείνονται και δίνουν ένα προϊόν που αποτελείται από την συνεχόµενη συνθετική αλληλουχία (contig) όλων των προηγούµενων τµηµάτων (στάδιο 2). Εφόσον απαιτείται από το πρωτόκολλο, τα νέα αυτά προϊόντα, του σταδίου 2, µπορούν και πάλι να συνδυασθούν και να υποβληθούν σε νέα αντίδραση PCR (στάδιο 3), και ούτω καθεξής (ahin-toth et al., 2000b). Η ανωτέρω µεθοδολογία, που περιγράφεται συνήθως ως PCR επικάλυψης/επέκτασης (overlap/extension) (Ho et al., 1989) αποτελεί µέθοδο εκλογής, µεταξύ των άλλων, για την κατασκευή χιµαιρικών γονιδίων, in vitro µεταλλαξιγένεση και δηµιουργία γονιδίων χωρίς κωδίκια Cys (C-less) µε συνδυαστική µεταλλαξιγένεση σε πολλές θέσεις (Frillingos et al., 1994, ahin- Toth et al., 2000b, Frillingos and Kaback, 2001, Karatza et al., 2006). Το βασικό πρωτόκολλο που ακολουθήσαµε στην παρούσα εργασία φαίνεται διαγραµµατικά στην Εικόνα 2.1. Στο τέλος κάθε σταδίου τα προϊόντα της αντίδρασης PCR διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης (1%) και ανακτώνται µε τη βοήθεια πακέτου υλικών καθαρισµού DN (Nucleospin Extract, Macherey-Nagel). Αναλυτικά, σε κάθε στάδιο PCR στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν: 100 ng πλασµιδιακού DN ή αντίστοιχες ποσότητες προϊόντων PCR µετά από καθαρισµό 10 µm από κάθε εκκινητή 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατος αντίδρασης και 50nM MgO 4 ή 10x ρυθµιστικού διαλύµατος που περιέχει MgCl mm από κάθε δεόξυριβονουκλεοτίδιο (ddtp, ddttp, ddctp, ddtp) 1 U/µl DN πολυµεράση (Physion ή Platinum Pfx) Αποστειρωµένο ddh2o από στήλη Millipore µέχρι τελικό όγκο 100 µ

41 Εικόνα 2.1: Σχεδιαγραµµατική απεικόνιση της µεθόδου PCR δύο σταδίων. εξωτερικός εκκινητής νοηµατικού κλώνου εσωτερικός εκκινητής νοηµατικού κλώνου εξωτερικός εκκινητής µη νοηµατικού κλώνου εσωτερικός εκκινητής µη νοηµατικού κλώνου Η PCR εφαρµόσθηκε σε 30 κύκλους αλλαγής θερµοκρασιών ως εξής: Για το πρώτο στάδιο 94 ο για 05:00 Για το δεύτερο στάδιο 94 ο για 05:00 94 ο για 01:00 (αποδιάταξη του δίκλωνου DN) 50 ο για 01:00 (πρόσδεση νουκλεϊκών οξέων) 72 ο για 01:30 (επιµήκυνση του DN) 72 ο για 07:00 94 ο για 01:00 (αποδιάταξη του δίκλωνου DN) 50 ο για 02:00 (πρόσδεση νουκλεϊκών οξέων) 72 ο για 02:00 (επιµήκυνση του DN) 72 ο για 07:

42 Οι δύο εξωτερικοί εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για όλες τις κατασκευές στις αντιδράσεις PCR είναι οι lacz(p/o)sense και Y k (pt7-5)- His 10 antisense: lacz(p/o)sense 5 - TTTCTTCCTCCTC-3 Y k (pt7-5)-10his antisense 5 -CTCCCTT-3 Οι εσωτερικοί εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν σε όλες τις κατασκευές για την αντίστοιχη αντίδραση PCR καθώς και τα τελικά προϊόντα της αντίδρασης δίνονται στους Πίνακες 2.1, 2.2 και 2.3. Ο Πίνακας 2.1 αναφέρεται στις κατασκευές DN για µεταλλάγµατα κυστεϊνών σε επιλεγµένες θέσεις του YgfO (single-cys mutants), ο Πίνακας 2.2 σε µεταλλάγµατα άλλων αµινοξέων εκτός κυστεϊνης, και ο Πίνακας 2.3 σε µεταλλάγµατα ζευγών κυστεϊνών (double-cys mutants). Ως υπόστρωµα των αντιδράσεων PCR, χρησιµοποιήθηκαν τα πλασµίδια pt7-5/ygfo-cys-less-his 10, pt7-5/ygfo- His 10, ή pt7-5/ygfo-x#c-bd, ανάλογα µε την περίπτωση, όπως αναφέρεται στους αντίστοιχους Πίνακες (βλ. και κεφάλαιο 2.4)

43 Πίνακας 2.1 Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 -CTCCCTTTTTCCTCTC TCCTTCCTCCTTT-3 5 -CTTTCCCTTCCCTC-3 5 -CCTTTTCTCCTTTC-3 5 -TTCCTTCTCCTCTC-3 5 -CTTCTCCTCCTT-3 5 -CTTTCTTCCTT-3 5 -CTCCTTCTCTCCTTT-3 5 -CTTTTTTCCTTCTCCTTCCT-3 5 -CTTCTCTTTTCTC-3 5 -CTCTTTCTTTTC-3 5 -TTTTCTCCCTC-3 5 -CTCTCTCTCTCCC-3 5 -CTCCTCTTCCCTCTTCTTTC-3 Προϊόν ανασυνδυασµού DN pt7-5/ ygfo (Cys-less)-H22C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-H31C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-K164C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-H187C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-K249C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-H257C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-R341C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-R385C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-E55C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-E186C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-D232C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-E272C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-D304C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)-D413C-BD Πίνακας 2.1: Οι εσωτερικοί εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν αντίστοιχα για κάθε κατασκευή µοναδικής κυστεϊνης, µε υπόστρωµα το πλασµίδιο pt7-5/ygfo-cys-less-his 10 ή το πλασµίδιο pt7-5/ygfo-his 10 για την αντίστοιχη αντίδραση PCR καθώς και τα προϊόντα του ανασυνδυασµού. Με έντονα υπογραµµισµένα γράµµατα φαίνονται οι τριπλέτες βάσεων που εισαγάγουν την αλλαγή στη θέση του επιλεγόµενου αµινοξέος, ενώ µε απλή υπογράµµιση φαίνονται οι «σιωπηλές» αλλαγές βάσεων που έγιναν κατά τον σχεδιασµό των εσωτερικών εκκινητών. Ο τρόπος ονοµασίας των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων είναι: όνοµα πλασµιδίου / όνοµα γονιδίου σύντµηση της µεταλλαγής (εγγενές κατάλοιπο, θέση αλληλουχίας, κατάλοιπο που εισαγάγει η µεταλλαγή) επίτοπος C-τελικής αλληλουχίας

44 Πίνακας 2.2 Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 -TCCTTCCCTTTC-3 5 -TCCTTCCCTCTTT-3 5 -TCCTTCCCCTTTC-3 5 -TCCTTCCCCTTTC-3 5 -TCCTTCCCTCTTT-3 5 -CCTTTCCTCCTTTC-3 5 -CTTTTCCTT-3 5 -CTTCTCTTTCTC-3 5 -CTTCTCTTCCTC-3 5 -CTCTCTTTTC-3 5 -CTCCTCTTTTC-3 5 -CTCCTTTCTCTCCC-3 Προϊόν ανασυνδυασµού DN pt7-5/ ygfo(wt)-h31k-bd pt7-5/ ygfo(wt)-h31-bd pt7-5/ ygfo(wt)-h31n-bd pt7-5/ ygfo(wt)-h31q-bd pt7-5/ ygfo(wt)-h31r-bd pt7-5/ ygfo(wt)-k164r-bd pt7-5/ ygfo(wt)-r385k-bd pt7-5/ ygfo(wt)-d232e-bd pt7-5/ ygfo(wt)-e272d-bd pt7-5/ ygfo(wt)-e272q-bd pt7-5/ ygfo(wt)-d304e-bd pt7-5/ ygfo(wt)-d304n-bd Πίνακας 2.2: Οι εσωτερικοί εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν για στοχευµένες µεταλλάξεις εκτός αντικατάστασης µε κυστεϊνη, µε υπόστρωµα το πλασµίδιο pt7-5/ygfo-his 10 για την αντίστοιχη αντίδραση PCR καθώς και τα τελικά προϊόντα της αντίδρασης. Με έντονα υπογραµµισµένα γράµµατα φαίνονται οι τριπλέτες βάσεων που εισάγουν την αλλαγή στην θέση του επιλεγόµενου αµινοξέος, ενώ µε απλή υπογράµµιση φαίνονται οι «σιωπηλές» αλλαγές βάσεων που έγιναν κατά τον σχεδιασµό των εσωτερικών εκκινητών. Ο τρόπος ονοµασίας των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων είναι: όνοµα πλασµιδίου / όνοµα γονιδίου σύντµηση της µεταλλαγής (εγγενές κατάλοιπο, θέση αλληλουχίας, κατάλοιπο που εισαγάγει η µεταλλαγή) επίτοπος C-τελικής αλληλουχίας

45 Μέθοδος εισαγωγής διπλής µετάλλαξης Στην περίπτωση της κατασκευής των διαπερασών µε διπλή µετάλλαξη, αντικατάσταση δηλαδή δύο αµινοξέων µε κυστεϊνη (double-cys mutants), χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο µε DN του single-cys YgfO µε µία κυστεϊνη σε µία από τις δύο θέσεις (~1 µg/µ), προϊόν προηγούµενης αντίδρασης PCR, και οι εσωτερικοί εκκινητές για την αντικατάσταση στην δεύτερη θέση µε κυστεϊνη. Κατ εξαίρεση, η διαπεράση YgfO µε την διπλή µετάλλαξη Ε186C/H187C, που φέρει αντικαταστάσεις σε δύο διαδοχικά κατάλοιπα αµινοξέων, προέκυψε κατευθείαν µε αντίδραση PCR µε κατάλληλους εσωτερικούς εκκινητές σε υπόστρωµα pt7-5/ygfo-cys-less- His 10. Οι εσωτερικοί εκκινητές και το υπόστρωµα των αντιδράσεων PCR καθώς και τα αντίστοιχα προϊόντα δίνονται στον Πίνακα 2.3. Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 -CTTCTCTTTTCTC-3 5 -CTCTTTCTTTTC-3 Πίνακας 2.3 DN-υπόστρωµα αντίδρασης PCR ygfo-h31c-bd ygfo-h31c-bd Προϊόν ανασυνδυασµού pt7-5/ ygfo (Cys-less)- H31C/E272C-BD pt7-5/ ygfo (Cys-less)- H31C/D304C-BD 5 -CTTCTCTTCTCC -3 ygfo-e186c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- R385C/E272C-BD 5 -CTCCTTCTCTCCTTT-3 ygfo-e186c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- R385C/D304C-BD 5 -CTTTTTTCCTTCTCCTTCCT-3 ygfo-e186c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E186C/H187C-BD 5 -TTTTCTCCCTC-3 ygfo-e186c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E186C/H257C-BD 5 -CTCTTTCTTTTC-3 ygfo-r385c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E186C/R341C-BD 5 -CTTCTCCTCCTT-3 ygfo-e429c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E429C/H187C-BD 5 -CTCCTTCTCTCCTTT-3 ygfo-e429c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E429C/K249C-BD 5 -CTTTTTTCCTTCTCCTTCCT-3 ygfo-e429c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E429C/H257C-BD 5 -TTTTCTCCCTC-3 ygfo-e429c-bd pt7-5/ ygfo (Cys-less)- E429C/R341C-BD Πίνακας 2.3: Οι εσωτερικοί εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν για εισαγωγή µία κυστεϊνης, σε υπόστρωµατα -προϊόντα PCR καθώς και τα τελικά προϊόντα της αντίδρασης PCR (βλ. Μέθοδος εισαγωγής διπλής µετάλλαξης). Με έντονα υπογραµµισµένα γράµµατα φαίνονται οι τριπλέτες βάσεων που εισάγουν την κυστεϊνη στην θέση του επιλεγόµενου αµινοξέος, ενώ µε απλή υπογράµµιση φαίνονται οι «σιωπηλές» αλλαγές βάσεων που έγιναν κατά τον σχεδιασµό των εσωτερικών εκκινητών. Ο τρόπος ονοµασίας των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων είναι: όνοµα πλασµιδίου / όνοµα γονιδίου σύντµηση της µεταλλαγής (εγγενές κατάλοιπο, θέση αλληλουχίας, κατάλοιπο που εισαγάγει η µεταλλαγή) επίτοπος C-τελικής αλληλουχίας

46 2.5.2 Κατασκευή ανασυνδυασµένου DN (περιοριστική πέψη-ανασύνδεση) Για την κατασκευή των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων, επωάστηκαν µέχρι πλήρους πέψης ο πλασµιδιακός φορέας pt7-5/mely-bd (από µεγάλης κλίµακας παρασκεύασµα maxi prep, 1 µg/µ) και τα προς ένθεση (insertion) προϊόντα DN, που είχαν προκύψει από τις αντιδράσεις PCR, µε χρήση των περιοριστικών ενζύµων pa και BamH (Εικόνα 2.2). Τα ένζυµα αυτά αναγνωρίζουν µοναδικές και επακριβώς αντίστοιχες περιοριστικές θέσεις τόσο στον φορέα pt7-5/mely-bd όσο και στα PCR προϊόντα που δηµιουργούνται µε εκµαγείο τα pt7-5/ygfo-cys-less-his 10, pt7-5/ygfo-his 10 (Karatza and Frillingos, 2005, Karatza et al., 2006) ή pt7-5/ygfo-x#c-bd, όπως αναφέρθηκε παραπάνω (κεφάλαιο 2.5.1). pa 5 CCC 3 3 CCC 5 BamH 5 ΑΤCC 3 3 CCT 5 Εικόνα 2.2: Αλληλουχίες αναγνώρισης των ενζύµων pa και BamH. Στο τέλος της περιοριστικής πέψης, έγινε αποφωσφορυλίωση µε αλκαλική φωσφατάση στα ελεύθερα 5 άκρα του φορέα (vector) pt7-5/mely- BD, προς αποφυγή ανεπιθύµητης ανασύνδεσης των ανοικτών άκρων του pt7-5 πριν την αντίδραση µε το insert DN. Τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήγµα αγαρόζης (1%), καθαρίσθηκαν και ανασυνδέθηκαν µε χρήση Τ4 DN λιγάσης. Η αντίδραση της λιγάσης έγινε στους 4 o C, 15 h, σε τελικό όγκο αντίδρασης 20 µ, µε ποσότητες ενθέµατος (insert) και φορέα (vector) σε µοριακή αναλογία 3:1. Ειδικά στην περίπτωση της διαπεράσης YgfO(H31C)-His 10 (κεφάλαιο 3.3.3), ως φορέας υποκλωνοποίησης χρησιµοποιήθηκε το πλασµίδιο pt7-5/lacυ-c154-his 10 και ως ένθεµα (insert) πλασµιδιακό DN ygfo-η31c- BD, που ήταν διαθέσιµο από την αρχική κατασκευή του YgfO(H31C)-BD ηµιουργία επιδεκτικών κυττάρων Κύτταρα E. coli TOP10F ή Τ184 προετοιµάστηκαν ώστε να γίνουν επιδεκτικά µετασχηµατισµού (competent) µε βάση το πρωτόκολλο των noue et al. (1990). Συγκεκριµένα, γίνεται πλήρης καλλιέργεια των βακτηριακών κυττάρων σε θρεπτικό υλικό B (10 m) στους 37 ο C, για 16 h. Στη συνέχεια, η καλλιέργεια αραιώνεται σε θρεπτικό διάλυµα.o.b. µέχρι τελικού όγκου 250 m. Η κυτταρική ανάπτυξη του στελέχους Τ184 γίνεται παρουσία του αντιβιοτικού στρεπτοµυκίνη (0.01 mg/m). Ακολουθεί ανάπτυξη των κυττάρων στους 37 ο C υπό αερόβιες συνθήκες και υπό ανάδευση στον επωαστήρα του θερµού θαλάµου µέχρι η οπτική πυκνότητα (OD 600 ) να φτάσει στην τιµή 0.6. Μετά από επώαση στον πάγο για 10 min, τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση στις 4000 rpm (10 min, 4 ο C) και αναδιαλύονται σε 80 m ψυχρού διαλύµατος ΤΒ. Το τελευταίο βήµα της διαδικασίας επαναλαµβάνεται µε επαναιώρηση σε 20 m ψυχρού ΤΒ που περιέχει 7% (v/v) διµεθυλο

47 σουλφοξείδιο (DMO) και τα κύτταρα χαρακτηρίζονται πλέον ως επιδεκτικά, έτοιµα για µετασχηµατισµό µε τα κατάλληλα πλασµίδια (plasmid DN prep) ή προϊόντα της αντίδρασης ανασύνδεσης (ligation products). Τα επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα αποθηκεύονται στους -80 ο C Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DN Το πλασµιδιακό DN (από ligation product) προστίθεται σε επιδεκτικά TOP10F και γίνεται επώαση σε πάγο, 5 min. Τα κύτταρα επιστρώνονται σε προθερµασµένα στους 37 ο C τρυβλία µε θρεπτικό υλικό B και άγαρ (( 2.3) που περιέχει αµπικιλλίνη (0.1 mg/m). Οι αποικίες επιλέγονται µε βάση την ανθεκτικότητά τους σε αµπικιλλίνη και στη συνέχεια πραγµατοποιείται αποµόνωση του DN σε µικρή κλίµακα µε βάση πρωτόκολλο πακέτου αποµόνωσης πλασµιδιακού DN ( 2.2). Σε κάθε περίπτωση, γίνεται επιβεβαίωση της αλληλουχίας του DN ανάµεσα στις περιοριστικές θέσεις BamH και Αpa, σε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας (MW-Biotech), όπως φαίνεται ενδεικτικά στην Εικόνα 2.3. Ακολουθεί εκ νέου µετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων, Ε. coli T184, µε το (επιβεβαιωµένο, πλέον, και καθαρισµένο) πλασµιδιακό DN και αποθήκευση των µετασχηµατισµένων κυττάρων σε B που περιέχει γλυκερόλη (30%), στους -80 ο C. Εικόνα 2.3: νάγνωση αλληλουχίας του µεταλλάγµατος Η31C-BD (κωδικόνια 1-142) από αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας (MW-Biotech)

48 2.6 Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων E.coli Τ184 που φέρουν τα αντίστοιχα πλασµίδια (κεφάλαια 2.4 και 2.5) αναπτύσσονται αρχικά σε καλλιέργεια των 3 m πλήρους θρεπτικού υλικού B, που περιέχει αµπικιλλίνη (0.1 mg/m) και στρεπτοµυκίνη (0.01 mg/m), για 16 h, στους 37 ο C, υπό ανάδευση, σε αερόβιες συνθήκες. Στη συνέχεια, γίνεται αραίωση σε B (1 m πλήρους καλλιέργειας + 9 m νέου B) και ανάπτυξη στις ίδιες συνθήκες για 2 h (µέχρι το µέσον της λογαριθµικής φάσης ανάπτυξης), προστίθεται ισοπροπυλο-β-d-θειογαλακτοσίδιο (PT) (τελική συγκέντρωση 0.5 mm) για επαγωγή της έκφρασης των πρωτεϊνών και, µετά από ανάπτυξη για 2 h ακόµη, ακολουθεί η φυγοκεντρική συγκοµιδή των κυττάρων (6000 rpm,10 min, 4 ο C). 2.7 οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport assay) Η πειραµατική αυτή διαδικασία ξεκινάει µε την ανάπτυξη κυττάρων E. coli T184 που είχαν µετασχηµατισθεί µε το πλασµιδιακό DN της προς µελέτη διαπεράσης. Μετά την ανάπτυξη, επαγωγή και συγκοµιδή των κυττάρων από 10 m καλλιέργειας (κεφάλαιο 2.6), τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 m ρυθµιστικού διαλύµατος KP i, ph 7.5, και φυγοκεντρούνται εκ νέου. Η διαδικασία της επαναιώρησης σε KP i, και φυγοκέντρησης επαναλαµβάνεται 2 φορές, µε τη διαφορά ότι τη δεύτερη φορά τα κύτταρα αναδιαλύονται σε 1 m KP i, ph 7.5. Στη συνέχεια, οι συγκεντρώσεις των κυτταρικών δειγµάτων ισορροπούνται µε φωτοµέτρηση στα 420 nm και προσθήκη κατάλληλου όγκου KP i, ph 7.5, έτσι ώστε η τελική τιµή οπτικής πυκνότητας να είναι OD 420nm = 10, που αντιστοιχεί σε ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης 0.7 mg/m, σύµφωνα µε αντίστοιχες καµπύλες αναφοράς (Frillingos et al.,1994). Η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [8-3 Η] ξανθίνης (18 Ci/mmol) γίνεται µε επώαση µε το ραδιενεργό υπόστρωµα (τελική συγκέντρωση 1 µμ) σε 50 µ κυττάρων για διάφορους χρόνους (από 5 sec έως 10 min) (όρα Karatza and Frilllingos, 2005). Ο τερµατισµός της αντίδρασης γίνεται µε 2 Χ 3 m διαλύµατος τερµατισµού (βλ. 2.3) µε ταχεία διήθηση υπό κενό (rapid filtration), σε ηθµό διήθησης Whatman F/C, 25 mm-circle, µε διάµετρο πόρων 1.2 µm (Frillingos et al., 1994). Μετά την επώαση, ο ηθµός µεταφέρεται σε κατάλληλα σωληνάρια σπινθηρισµού (scintiallation vials) και επωάζεται µε 2 x 4 m υγρού σπινθηρισµού (scintillation fluid) (βλ. 2.3) για 24 h. Τα δείγµατα 3 Η µετρούνται σε µετρητή υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (β counter) (βλ. 2.1)

49 2.7.1 Επίδραση αλκυλιωτικών H-αντιδραστηρίων Στα πειράµατα ελέγχου της επίδρασης ειδικών H-αντιδραστηρίων, προηγείται επώαση µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο (NEM, MTE +, ή MTE - ), σε τελική συγκέντρωση 1-2 mm για min, στους 25 o C. Για το Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (ΝΕΜ, Εικόνα 2.4) χρησιµοποιείται συγκέντρωση 2 mm (Karatza et al., 2006) και ο χρόνος προεπώασης είναι 10 min, ενώ για το µεθανο-θειο-σουλφονικό αιθυλσουλφονικό (MTE - ) και την µεθανο-θειοσουλφονική αιθυλαµίνη (MTE + ) (Εικόνα 2.5), χρησιµοποιείται 1 mm και ο χρόνος προεπώασης είναι 30 min (Dunten et al, 1993, Frillingos and Kaback, 1996). Τερµατισµός των αντιδράσεων γίνεται µε διθειοθρεϊτόλη (DTT) (σε µοριακή περίσσεια 10Χ έναντι του H-αντιδραστηρίου) και η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς ξανθίνης γίνεται παρουσία µεθοσουλφονικού φαιναζινίου (phenazine methosulphate, PM) (0.2 mm) και ασκορβικού καλίου (20 mm), για την ηλεκτρονιοδότηση της αναπνευστικής αλυσίδας (Konings et al., 1971, Frillingos et al., 1994). Εικόνα 2.4: Αντίδραση του Ν-αιθυλµηλεϊµιδίου (ΝΕΜ) µε τις H-οµάδες των κυστεϊνών (από Molecular Probes, Εικόνα 2.5: (α) MTE - odium(2-sulfonatoethyl)methane thiosulfonate) και (β) MTE + (2-minoethyl)methanethilsulfonate Hydrobromide) (από Toronto Research Chemicals,

50 2.7.2 Επίδραση χλωριούχου καδµίου (CdCl 2 ) Για τα πειράµατα της επίδρασης του χλωριούχου καδµίου (CdCl 2 ), γίνεται προεπώαση των 50 µl κυτταρικού δείγµατος µε την αντίστοιχη συγκέντρωση CdCl 2 στους 25 ο C, 10 min, και ακολουθεί η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς, όπως περιγράφεται ανωτέρω. Το CdCl 2 χρησιµοποιείται στην περιοχή συγκεντρώσεων από 10 µμ έως 20 mm (Broke et al., 2001) και τα αποτελέσµατα αναλύονται µε το πρόγραµµα Prism οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς σε διάφορα ph Στα πειράµατα όπου εξετάζεται η επίπτωση του ph, δείγµα 200 µ κυττάρων (OD 420nm 10) µεταφέρεται σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf, φυγοκεντρείται σύντοµα στις rpm (2 min) και επαναιωρείται σε 1 m ρυθµιστικού διαλύµατος του αντίστοιχου ph (βλ. 2.3). Μετά από 2 φυγοκεντρικές εκπλύσεις, τα κύτταρα συλλέγονται, αναδιαλύονται σε 200 µ του αντίστοιχου ρυθµιστικού διαλύµατος και ακολουθεί η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς, παρουσία νιγερισίνης (Frillingos et al., 1997, He and Kaback, 1997)

51 2.8 Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών Κλάσµατα µεµβρανών από την εσωτερική (κυτταροπλασµατική) µεµβράνη της E. coli παρασκευάσθηκαν µε τη µέθοδο συνδυασµού οσµωτικού shock, επώασης µε EDT και λυσοζύµη και θραύσης µε υπέρηχους (sonication) (Kaback, 1974, Frillingos et al.,1994). Αναλυτικότερα, η διαδικασία που ακολουθήσαµε δίνεται στην επόµενη παράγραφο. Μετά την ανάπτυξη, επαγωγή και συγκοµιδή των κυττάρων E. coli T184 από 10 m καλλιέργειας (κεφάλαιο 2.6), τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 m ρυθµιστικού ιαλύµατος Επαναιώρησης (διάλυµα Tris-NaCl-EDT, κεφάλαιο 2.3) και φυγοκεντρούνται εκ νέου. Η διαδικασία της επαναιώρησης και φυγοκέντρησης επαναλαµβάνεται 1 φορά, µε αναδιάλυση των κυττάρων σε 1 m ιαλύµατος Επαναιώρησης. Το εναιώρηµα (1 m) µεταφέρεται σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf, φυγοκεντρείται σε επιτραπέζια φυγόκεντρο eppendorf (13000 rpm, 2 min) και το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρείται σε 1 m ιαλύµατος Σακχαρόζης (βλ. 2.3). Το κυτταρικό εναιώρηµα αφήνεται να επωασθεί στο ιάλυµα Σακχαρόζης στους 4 0 C για 20 min. Στη συνέχεια, φυγοκεντρείται εκ νέου (13000 rpm, 1 min) και το κυτταρικό ίζηµα (pellet) επαναιωρείται σε 0.8 m ddh 2 O και αφήνεται για 10 min στους 4 0 C. Στη συνέχεια, προστίθεται λυσοζύµη (τελική συγκέντρωση mg/m) και το εναιώρηµα επωάζεται στους 4 0 C για 30 min. Ακολουθεί αµέσως θραύση των κυττάρων σε συσκευή υπερήχων (sonication) (2 ώσεις των 15 sec, σε ένταση 40%, στην συσκευή Branson 250-D) και, µετά από σύντοµη φυγοκέντρηση για την αποµάκρυνση των άθραυστων κυττάρων και υπολειµµάτων (cell debris) (13000 rpm, 2 min), τα υπερκείµενα υποβάλλονται σε υπερφυγοκέντρηση (Optima Ultracentrifuge, rpm, 10 min, 4 ο C). Το ίζηµα των µεµβρανών διαλυτοποιείται σε 40 µ ddh 2 O και τα δείγµατα υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση και περαιτέρω αναλύσεις (βλ 2.9) είτε αµέσως είτε µετά από h αφού ενδιάµεσα φυλαχθούν στους 4 ο C

52 2.9 Αναλύσεις πρωτεϊνών Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης µε την µέθοδο BC Ο ποσοτικός προσδιορισµός της ολικής πρωτεΐνης των δειγµάτων έγινε µε βάση το πρωτόκολλο BC Protein ssay Reagent Kit (Pierce). Το πρωτόκολλο βασίζεται στο συνδυασµό της αναγωγής του Cu +2 σε Cu +1 σε αλκαλικό περιβάλλον, µε την υψηλής ευαισθησίας χρωµατοµετρική ανίχνευση του κατιόντος χαλκού (Cu +1 ) (στα 562 nm) χρησιµοποιώντας δισ-κιγχονινικό οξύ (bicinchoninic acid) Ηλεκτροφόρηση σε πήγµα D-ακρυλαµιδίου (D-PE) Στα µεµβρανικά δείγµατα προστίθεται κατάλληλος όγκος ddh 2 O µέχρι την εξισορρόπηση της συγκέντρωσης των δειγµάτων στα 100 µg πρωτεΐνης ανά 50 µ. Στη συνέχεια, προστίθεται διάλυµα φόρτωσης (ample Buffer) (βλ. 2.3) σε αναλογία 4:1 (δείγµα:διάλυµα φόρτωσης) και τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου (12%) δωδεκυλοθειϊκού νατρίου(odium Dodecyl ulphate-polycrylamide el Electrophoresis, D- PE) (aemmli, 1970). Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιούνται πήγµα διαχωρισµού 12% και πήγµα επιστοίβαξης 5% (Πίνακας 2.4): Πίνακας 2.4 Πήγµα 30% 10% 10% TEMED ιάλυµα dh 2 O ακρυλαµίδιο D P Πήγµα διαχωρισµού 42m 1m 1m 0.05m ιαχωρισµού (βλ. 2.3) 32m (100 m) 25m Πήγµα επιστοίβαξης (30 m) 4.5m 0.3m 0.3m 0.03m Επιστοίβαξης (βλ. 2.3) 7.5m 17.4m Πίνακας 2.4: Πρωτόκολλο για την παρασκευή πήγµατος διαχωρισµού και πήγµατος επιστοίβαξης (Μέθοδος ηλεκτροφόρησης πηκτής D-ακρυλαµιδίου (D-PE) )

53 2.9.3 Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεϊνικές ζώνες µεταφέρονται µε ηλεκτροφορητική µεταφορά (4 h, 400 m) σε µεµβράνη πολυ-βινυλιδενικού διφθοριδίου (PVDF) (βλ. 2.2), σε ιάλυµα Μεταφοράς (διάλυµα Tris-γλυκίνης που περιέχει 20% µεθανόλη) (βλ. 2.3). Στη συνέχεια, η µεµβράνη PVDF επωάζεται για τουλάχιστον 16 h σε διάλυµα TBT που περιέχει 5% B (blocking buffer) (βλ. 2.3). Ακολουθεί ανοσοαποτύπωση µε χρήση των κατάλληλων αντισωµάτων και συζευγµάτων ενζύµου-αντισώµατος. Για τις βιοτινυλιωµένες διαπεράσες (YgfO-BD) χρησιµοποιείται το σύζευγµα αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1: σε TBT-5%B (Blocking Buffer) για 1 h και ακολουθούν 8 πλύσεις µε TBT πριν την ανίχνευση του σήµατος. Για τις διαπεράσες µε την ουρά των ιστιδινών (YgfO-His 10 ) χρησιµοποιείται σύζευγµα αντισώµατος έναντι των ιστιδινών (anti-pentahis- HRP) σε αραίωση 1: 5000 για 1 h και ακολουθούν 5 πλύσεις µε TBT πριν την ανίχνευση του σήµατος. Στην περίπτωση της δοκιµασίας σήµανσης κυστεϊνών in vivo (βλ. παρακάτω, κεφάλαιο 2.10), µετά την ανοσοαποτύπωση µε anti-pentahis b, εκπλένεται η περίσσεια συζεύγµατος και αντιδραστηρίων (ambrook et al., 1989), η µεµβράνη παραµένει για 16 h σε TBT-5%B (Blocking Buffer) και έπειτα προστίθεται αντίσωµα έναντι του πράσινου µηλεϊµιδίου του Oregon (anti-om) σε αραίωση 1:3.000 για 2 h, σε TBT-5%B, ακολουθούν 8 πλύσεις µε TBT, και επώαση µε σύζευγµα πρωτεΐνης Α-υπεροξειδάσης (HRP-labeled protein ) ως δεύτερο αντίσωµα, σε αραίωση 1:50000 για 1 h, σε TBT-5%B. Τέλος, ακολουθούν 5 πλύσεις µε TBT πριν την ανίχνευση του σήµατος OM. Σε όλες τις περιπτώσεις, για την τελική οπτικοποίηση του αποτελέσµατος (ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του σήµατος) χρησιµοποιείται η αντίδραση της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (EC) (βλ. 2.2)

54 2.10 οκιµασία σήµανσης κυστεϊνών in vivo Με την µέθοδο αυτή πραγµατοποιείται έλεγχος προσβασιµότητας των κυστεϊνών από ειδικά αντιδραστήρια προσβολής σουλφυδρυλοµάδων σε ακέραια κύτταρα (in vivo Cys-labelling assay). Η µέθοδος αποτελεί προσαρµογή άλλων πρωτοκόλλων που χρησιµοποιούν φθορίζοντα Hαντιδραστήρια (Yagur-Kroll and mster-choder, 2005, Nie et al., 2007) και έχει ήδη εφαρµοσθεί µε επιτυχία σε προηγούµενες αναλύσεις κυστεϊνικής στόχευσης του YgfO (Karatza et al., 2006). Για την πραγµατοποίηση του συγκεκριµένου πειράµατος (ανάλυση προσβασιµότητας της H31C, κεφάλαιο 3.3.3) χρησιµοποιούνται κύτταρα E. coli του στελέχους Τ184, τα οποία αναπτύσσονται όπως και προηγουµένως (κεφάλαιο 2.8). Μετά την ανάπτυξη, επαγωγή και συγκοµιδή των κυττάρων από 10 m καλλιέργειας (κεφάλαιο 2.6), τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 m ρυθµιστικού διαλύµατος Tris-NaCl (βλ. 2.3) και η οπτική πυκνότητα των δειγµάτων εξισορροπείται σε OD 420nm = 10 (βλ. και κεφάλαιο 2.7). είγµατα (1 m) µεταφέρονται σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf, φυγοκεντρούνται (13000 rpm, 1 min) και το ίζηµα επαναιωρείται σε διάλυµα Tris-NaCl (1 m). Η διαδικασία της φυγοκέντρησης και επαναιώρησης επαναλαµβάνεται 1 φορά, µε αναδιάλυση των κυττάρων σε 0.2 m διαλύµατος Tris-NaCl. Ακολουθεί επώαση του κυτταρικού δείγµατος (0.2 m) παρουσία ή απουσία 1 mμ ΝΕΜ (Εικόνα 2.4) ή MTE - (Εικόνα 2.5), για 10 min, στους 25 ο C. Στη συνέχεια, τα δείγµατα φυγοκεντρούνται (13000 rpm, 1 min) και το ίζηµα επαναιωρείται σε 1 m διαλύµατος Tris-NaCl. Η ίδια διαδικασία φυγοκέντρησης επαναιώρησης επαναλαµβάνεται 2 φορές και, έπειτα, τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 100 µ ιαλύµατος Σακχαρόζης (βλ. 2.3) που περιέχει λυσοζύµη (50 µg/m) και επωάζονται για 30 min στους 37 ο C. Μετά τα πρώτα 15 min της επώασης, προστίθενται στο εναιώρηµα και 0.6 m διαλύµατος MgO 4 15 mm

55 Μετά τις επωάσεις, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται σε επιτραπέζια µικροφυγόκεντρο (14000 rpm, 5 min, 4 ο C), αφαιρείται το υπερκείµενο και το ίζηµα επαναιωρείται σε 100 µ διαλύµατος Tris-NaCl που περιέχει 0.8% (w/v) n-δωδεκυλο-β-d-µαλτοπυρανοσιδίου (DDM) και επωάζεται υπό ελαφρά ανάδευση σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 min, για τη λύση των µεµβρανών και εκχύλιση των µεµβρανικών πρωτεϊνών (όρα Wu et al., 1994, Wu and Kaback, 1994). Σε κάθε δείγµα µεµβρανικού εκχυλίσµατος προστίθενται 300 µ διαλύµατος Tris-NaCl, το οποίο περιέχει 30 mm ιµιδαζολίου και 0.08% (w/v) DDM καθώς και 50 µ προ-εξισορροπηµένων σφαιριδίων Ni-D (Probond) και το µίγµα εκχυλίσµατος-σφαιριδίων αναδεύεται επί 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά την πρόσδεση των πρωτεϊνών YgfO-His 10, τα σφαιρίδια Ni-D πλένονται µε 1 m ιαλύµατος Αποδιάταξης (denaturation buffer, βλ. 2.3), επαναιωρούνται σε 0.1 m του ίδιου διαλύµατος που περιέχει 200 µm πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon (Oregon reen Maleimide, Εικόνα 2.6) και αναδεύονται για άλλα 20 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Για τον τερµατισµό της αντίδρασης OM και την έκλουση των δεσµευµένων πρωτεϊνών, τα σφαιρίδια Ni-D επωάζονται µε προσθήκη ιαλύµατος Αποδιάταξης (300 µ) που περιέχει 5 mm β-µερκαπτοαιθανόλη (3 min) και, στη συνέχεια, µε 28 µ ιαλύµατος Φόρτωσης (1Χ oading buffer) που περιέχει 0.07 Μ Na 2 EDT, ph 8, για 10 min, στους 30 ο C. Ακολουθεί ένα µικρό spin και συλλέγονται προσεκτικά τα υπερκείµενα τα οποία αναλύονται µε ηλεκτροφόρηση D-PE και ανοσοαποτύπωση (κεφάλαιο 2.9). Σηµείωση: Η προ-εξισορρόπηση των σφαιριδίων Ni-D γίνεται µε 2 διαδοχικές πλύσεις σε ddh 2 O, 4 πλύσεις µε διάλυµα Tris-NaCl (βλ. 2.3) και, τέλος, 1 πλύση σε διάλυµα Tris-NaCl που περιέχει 0.08% DDM και 30 mm ιµιδαζολίου (διάλυµα εξισορρόπησης)

56 - 46 -

57 2.11 n silico ανάλυση Η αλληλουχία DN του YgfO καθώς και οι αντίστοιχες αλληλουχίες αµινοξέων (Karatza and Frillingos, 2005) εξήχθησαν από βάσεις δεδοµένων που καταγράφουν την πλήρη αλληλουχία γονιδιώµατος της E.coli K-12, [όπως έχει κατατεθεί (Blattner et al., 1997) και ενηµερωθεί, βάσει της πλέον ενηµερωµένης έκδοσης 24 Ιουνίου 2004 ( Η προσέγγιση του τοπολογικού µοντέλου της πρωτεΐνης (Παράρτηµα Ι) έγινε µε 6 διαφορετικές βάσεις δεδοµένων που στηρίζονται σε διαφορετικούς προγνωστικούς αλγορίθµους. Οι βάσεις δεδοµένων καθώς και η ηλεκτρονική διεύθυνση των ιστοσελίδων στις οποίες είναι διαθέσιµες έχουν ως εξής: TMHMM ( Center for Biological equence nalysis Technical University of DenmarK HMM-TM ( Χαµόδρακας Σ.Ι., Βάγγος Π.Γ., Λιακόπουλος Θ. Τοµέας Βιολογίας κυττάρου και Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Αθηνών, Πανεπιστηµιόπολη Αθήνα OU ( frameo.html) Mitaku roup Department of pplied Physics Nagoya University TMpred ( TMpred - Prediction of Transmembrane Regions and Orientation ch. EMBnet.org D ( M. Cserzo, E. Wallin,. imon,. von Heijne and. Elofsson: Prediction of transmembrane alpha-helices in procariotic membrane proteins: the Dense lignment urface method PRED-C ( Pasquier, C., Promponas, V. and Hamodrakas,.J. Department of Cell Biology and Biophysics, Faculty of Biology, University of thens Η ανάλυση στοίχισης του πλήρους κωδικεύοντος τµήµατος των αλληλουχιών των µεταφορέων ΝΑΤ πραγµατοποιήθηκε µε το πρόγραµµα ClustalW ( Η ανάλυση των γονιδιωµάτων για την ύπαρξη οµολόγων που ανήκουν στην οικογένεια NT/NC2 και η κατάταξη των γονιδίων σε λειτουργικές οµάδες ορθολόγων βασίζεται στις βάσεις δεδοµένων TransportDB ( (Ren et al., 2004), TC-DB ( και COs (

58 - 48 -

59 ΚΕΦΑΛΑΙΙΟ 3 ο ο :Αποτελέσµατα

60 - 50 -

61 3.1 Πιθανά φορτισµένα διαµεµβρανικά κατάλοιπα του µεταφορέα YgfO Ως πρώτο βήµα, εξετάσαµε την πιθανή παρουσία ιοντιζόµενων διαµεµβρανικών καταλοίπων αµινοξέων (sp, lu, ys, rg ή His) στην διαπεράση YgfO, βάσει της προβλεπόµενης τοπολογικής της οργάνωσης σε διαµεµβρανικά τµήµατα (TMs). Το µοντέλο τοπολογικής οργάνωσης που χρησιµοποιούµε (Εικόνα 3.1) προέκυψε από συνδυασµό in silico ανάλυσης µε προγράµµατα που χρησιµοποιούν µία σειρά από διαφορετικούς προγνωστικούς αλγορίθµους (TMHMM, HMM-TM, PRED-C, TMPRED, OU, D) (Παράρτηµα της παρούσας µελέτης), συγκριτικής ανάλυσης όλων των λειτουργικά χαρακτηρισµένων µελών της οικογένειας NT/NC2 µε το πρόγραµµα ΤΜΗΜΜ (Karatza et al., 2006) και πειραµατικών δεδοµένων για την διευθέτηση του C-τελικού άκρου προς το κυτταρόπλασµα (ranseth et al., 2005) και για την προσβασιµότητα κυστεϊνικών µεταλλαγµάτων που ανήκουν σε πιθανά υδρόφιλα συνδετικά τµήµατα (Mermelekas et al., in preparation). NH 3 + cytoplasm D 304 COO - H 22 H E Κ c c 187 H E 186 E 272 c 257 c H D K R 337 R 341 R D c E 429 X periplasm Εικόνα 3.1: ιαγραµµατική απεικόνιση του πιθανού τοπολογικού µοντέλου της διαπεράσης YgfO. Το µοντέλο αυτό προκύπτει από προγράµµατα in silico ανάλυσης (Παράρτηµα ) σε συνδυασµό µε πειραµατικά δεδοµένα για την διευθέτηση του C-τελικού άκρου προς το κυτταρόπλασµα (ranseth et al., 2005, Karatza et al., 2006) καθώς και µελέτες προσβασιµότητας κυστεϊνικών µεταλλαγµάτων στο υδρόφιλο αντιδραστήριο MTE - (ubstituted Cysteine ccessibility Method; kabas et al., 1992; Karlin and kabas, 1998) (Mermelekas et al., in preparation). Τα 12 διαµεµβρανικά τµήµατα (TMs) απεικονίζονται ως κύλινδροι µε έντονα ορθογώνια περιγράµµατα. Τα κατάλοιπα που αναλύθηκαν στην παρούσα εργασία επισηµαίνονται µε περίγραµµα ερυθρού χρώµατος, ενώ µε τετράγωνο περίγραµµα επισηµαίνονται κατάλοιπα που ευρέθησαν σηµαντικά για τη λειτουργία της διαπεράσης (βλ. Κεφ.3 3.4). Εκτός των 12 TMs, χαρακτηριστική είναι η πιθανή παρουσία µιας ακόµη αµφιπαθούς περιοχής α-έλικας µεταξύ TM8 και TM9 (όπου ανήκει και η D304), αµέσως πριν από την συντηρηµένη ακολουθία των καταλοίπων (NT motif) και την ακολουθία που υποστηρίζεται πειραµατικά ότι έχει δοµή α-έλικας (Karatza et al., 2006) και αποτελεί µέρος του TM

62 Βάσει των ανωτέρω, επιλέξαµε να µελετήσουµε µε µεταλλαξιγένεση 16 κατάλοιπα, τα εξής: His22, His31 (TM1), lu55 (TM2), ys164 (TM5), lu186, His187 (TM6), sp232 (TM7), ys249, His257, lu272 (TM8), sp304 (TM8-9), rg337, rg341 (TM9), R385 (TM10), sp413 (TM11), lu429 (TM12). Ανάλυση στοίχισης (alignment) των µελών της οικογένειας NT/NC2 δείχνει ότι τα κατάλοιπα His31, lu272 και sp304 εντοπίζονται σε θέσεις υψηλής συντήρησης, ενώ τα κατάλοιπα His22, ys164, His257, rg337, rg341 και rg385 απαντώνται στο ίδιο TM ή σε απόσταση µικρότερη των 10 καταλοίπων αµινοξέων από θέσεις υψηλής συντήρησης (Εικόνα 3.2). Τα υπόλοιπα 7 κατάλοιπα (lu55, lu186, His187, sp232, ys249, sp413, lu429) δεν εµφανίζονται σε περιοχές υψηλής συντήρησης. Εικόνα 3.2: Ανάλυση στοίχισης αλληλουχιών των µελών της οικογένειας NT/NC2, σε περιοχές όπου απαντώνται πιθανά φορτισµένα διαµεµβρανικά κατάλοιπα του YgfO. Η ανάλυση έγινε µε το πρόγραµµα CUTW. Κατάλοιπα που µας ενδιαφέρουν εικονίζονται µε ερυθρούς χαρακτήρες. Από αυτά, κατάλοιπα που απαντώνται σε θέσεις υψηλής συντήρησης υποδηλώνονται µε περιγράµµατα ερυθρού χρώµατος, ενώ κατάλοιπα που απαντώνται στο ίδιο TM ή σε απόσταση <10 καταλοίπων αµινοξέων από θέσεις υψηλής συντήρησης υποδηλώνονται µε περιγράµµατα µπλε χρώµατος. Οι θέσεις υψηλής συντήρησης επισηµαίνονται µε µπλε σκίαση

63 3.2 Μεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής στόχευσης Χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα µία διαπεράση χωρίς εγγενή κατάλοιπα κυστεϊνών (Cys-less YgfO) (Karatza et al., 2006), κατασκευάσθηκαν 16 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης (single-cys mutants): H22C, H31C, K164C, H187C, K249C, H257C, R337C, R341C, R385C, E55C, E186C, D232C, E272C, D304C, D413C, E429C. Εκτός δύο περιπτώσεων διαπερασών (R337C, E429C) που ήταν ήδη διαθέσιµες στο εργαστήριο από προηγούµενες µελέτες (Πάνος, 2005, Παπακώστας, 2006), οι υπόλοιπες 14 κατασκευάσθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Οι διαπεράσες αυτές φέρουν επίσης κατάλληλα σήµατα C-τελικών αλληλουχιών, δηλ. το C-τελικό 12πεπτίδιο της acy (acy-epitope) και µία περιοχή δέσµευσης βιοτίνης από την αποκαρβοξυλάση οξαλοξικού της Klebsiella pneumoniae (biotin-acceptor domain,bd) (Karatza and Frillingos, 2005). Μετά την επιβεβαίωση της αλληλουχίας τους (MW-Biotech, dsdn sequencing), οι single-cys διαπεράσες εκφράσθηκαν µέσω PT-επαγόµενων, πλασµιδιακών φορέων σε κύτταρα E. coli Κ-12 (T184) και ελέχθησαν καταρχήν τα επίπεδα έκφρασης, η ενεργότητα και η επίδραση ειδικών H-αντιδραστηρίων Τα επίπεδα έκφρασης στην µεµβράνη ώδεκα (12) από τις 16 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης εκφράζονται στη µεµβράνη σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά της Cys-less YgfO (Εικόνα 3.3). Από τις υπόλοιπες 4 διαπεράσες, οι K164C, D232C και R385C εµφανίζουν επίπεδα έκφρασης στο 20-30% αυτών της Cys-less διαπεράσης, ενώ η E272C εµφανίζει επίπεδα περί το 60% (Εικόνα 3.3) Ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης έκα (10) από τις 16 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης παρουσιάζουν πολύ υψηλές αρχικές ταχύτητες πρόσληψης (60-110% αυτής του Cys-less) και µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (70-110%) (Εικόνα 3.4). Από τις υπόλοιπες, οι K164C, D232C και R385C εµφανίζουν χαµηλή ενεργότητα (αρχικές ταχύτητες, 20-40%, µέγιστα επίπεδα, 20-50%), η H31C κυµαίνεται σε πολύ χαµηλές τιµές ( 5%), ενώ οι E272C και D304C έχουν αµελητέα επίπεδα. Τα χαµηλά επίπεδα ενεργότητας των K164C, D232C και R385C (Εικόνα 3.4) αντιστοιχούν µε σχετικά χαµηλά επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 3.3). Αντίθετα, οι ανενεργές H31C, E272C και D304C έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη (Εικόνα 3.3)

64 Εικόνα 3.3: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των µεταλλαγµάτων µοναδικής κυστεϊνης. Κλάσµατα µεµβρανών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις. Τα δείγµατα µεµβρανών (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1:100000, και οπτικοποίηση του προϊόντος της αντίδρασης υπεροξειδάσης µε ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (EC). Στο αριστερό µέρος των ηλεκτροφορηµάτων, σηµειώνονται οι θέσεις µετανάστευσης πρωτεϊνών πρότυπων µοριακών βαρών (Bio-Rad, Prestained D-PE tandards, ow Range). Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των διαπερασών στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one

65 Εικόνα 3.4: Ενεργότητες πρόσληψης ξανθίνης των µεταλλαγµάτων µοναδικής κυστεϊνης E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C. Α) Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.07±0.01 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της Cys-less YgfO-BD (2.15±0.23 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 7 ανεξάρτητα πειράµατα. Β) Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε 1-10 min (όρα Karatza & Frillingos, 2005). Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.021±0.006 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της Cys-less YgfO- BD (0.86±0.07 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 7 ανεξάρτητα πειράµατα

66 3.2.3 Μεταλλαξιγένεση επιλεγµένων καταλοίπων στο φυσικού τύπου υπόστρωµα Συνοπτικά, ο λειτουργικός έλεγχος των 16 single-cys µεταλλαγµάτων έδειξε ότι τρία από αυτά, H31C, E272C, και D304C, εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη µεµβράνη αλλά έχουν αµελητέα ενεργότητα, ενώ τρία άλλα, K164C, D232C, και R385C, εκφράζονται σε σχετικά χαµηλά επίπεδα και έχουν αντίστοιχα χαµηλές τιµές ενεργότητας (Εικόνες ). Για να εξετάσουµε κατά πόσον αυτά τα αποτελέσµατα συνδέονται µε την έλλειψη των 5 εγγενών κυστεϊνών από τα ανωτέρω µεταλλάγµατα, οι single-cys µεταλλάξεις µεταφέρθηκαν στο υπόστρωµα της φυσικού τύπου διαπεράσης, YgfO(wt) BD, ώστε να κατασκευασθούν τα µεταλλάγµατα H31C(wt), K164C(wt), D232C(wt), E272C(wt), D304C(wt), R385C(wt), και να ελεγχθούν ως προς την έκφραση και ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης. Επίπεδα έκφρασης στην µεµβράνη Και οι έξι ανωτέρω διαπεράσες εκφράζονται στη µεµβράνη των E.coli Τ184 σε υψηλά επίπεδα, παρόµοια ή ελαφρώς µειωµένα [H31C(wt), K164C(wt)] σε σχέση µε την YgfO(wt) (Εικόνα 3.5). Εικόνα 3.5: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των H31C(wt), K164C(wt), D232C(wt), E272C(wt), D304C(wt), και R385C(wt). Κλάσµατα µεµβρανών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις. Τα δείγµατα µεµβρανών (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας 3.3, Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των διαπερασών στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantityone

67 Επίπεδα ενεργότητας Τα µεταλλάγµατα H31C(wt), D232C(wt) και R385C(wt) εµφανίζουν σηµαντική, αν και χαµηλή, ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης (20-60% σε σχέση µε την φυσικού τύπου διαπεράση), ενώ τα E272C(wt) και D304C(wt) έχουν αµελητέα ενεργότητα. Αντίθετα, το µετάλλαγµα K164C(wt) εµφανίζει ενεργότητα 75-80% σε σχέση µε την φυσικού τύπου διαπεράση (Εικόνα 3.6). Εικόνα 3.6: Ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των H31C(wt), K164C(wt), D232C(wt), E272C(wt), D304C(wt), και R385C(wt). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo- BD που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C. Α) Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.050±0.018 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (1.60±0.52 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 9 ανεξάρτητα πειράµατα. Β) Mέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε 1-10 min (όρα Karatza & Frillingos, 2005). Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.007 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (0.89±0.04 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 9 ανεξάρτητα πειράµατα

68 3.3 Επίδραση αλκυλιωτικών H-αντιδραστηρίων Στη συνέχεια, µελετήσαµε την επίδραση ειδικών H-αντιδραστηρίων [N-αιθυλµηλεϊµίδιο (NEM), µεθανο-θειο-σουλφονικό αιθυλσουλφονικό (MTE - ), µεθανο-θειο-σουλφονική αιθυλαµίνη (MTE - )] επί της ενεργότητας των 16 µεταλλαγµάτων µοναδικής κυστεΐνης (κεφάλαιο ). Τα αλκυλιωτικά αυτά H αντιδραστήρια αντιδρούν επιλεκτικά ή ειδικά, υπό κατάλληλες συνθήκες, µε τις σουλφυδρυλικές οµάδες των θειολών (Cys) της πρωτεΐνης και δίνουν σουλφίδια ως προϊόντα (myth, 1964; Karlin and kabas, 1998). Ως εκ τούτου, ανάλογα µε την προσβασιµότητα της κάθε θέσης κυστεϊνικού καταλοίπου και µε τις χηµικές ιδιότητες του κάθε Hαντιδραστηρίου (υδρόφοβο, υδρόφιλο, σταθερότητα και ταχύτητα αντίδρασης µε την H-οµάδα στο αντίστοιχο ρυθµιστικό περιβάλλον), τα αποτελέσµατα µπορούν να δώσουν µία εικόνα για την σπουδαιότητα των θέσεων της YgfO που εξετάζουµε. Στις περιπτώσεις π.χ. όπου η επώαση µε το αντιδραστήριο οδηγεί σε πτώση της ενεργότητας, υποδεικνύεται ότι η αντίστοιχη θέση single- Cys συµµετέχει σε µία σηµαντική αλληλεπίδραση κατά τον µηχανισµό δέσµευσης και µεταφοράς υποστρώµατος, η οποία παρεµποδίζεται από την οµοιοπολική δέσµευση του H-αντιδραστηρίου (αλκυλίωση). Επίσης, σε περιπτώσεις που αποδεικνύεται αλκυλίωση από ένα πολικό, υδρόφιλο αντιδραστήριο (όπως το MTE - ), η αντίστοιχη θέση single-cys µπορεί να θεωρηθεί ότι είναι προσβάσιµη από το υδρόφιλο, εξωκυτταρικό περιβάλλον Επίδραση του ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών Αρχικά, ελέγχθηκε η επίδραση του Ν-αιθυλµηλεϊµιδίου (ΝΕΜ), ενός µικρού, σχετικά υδρόφοβου H-αντιδραστηρίου που µπορεί να διαπερνά τη µεµβράνη και να έχει πρόσβαση τόσο σε περιπλασµικές, όσο και σε κυτταροπλασµατικές ή και ενδοµεµβρανικές θέσεις µιας πολυτοπικής µεµβρανικής πρωτεΐνης (Frillingos et al., 1998). Από τις 13 single-cys διαπεράσες που εµφανίζουν σηµαντικά επίπεδα ενεργότητας (Εικόνα 3.4), καµία δεν επηρεάζεται σηµαντικά από την προεπώαση µε NEM (2 mm). Μικρή µείωση ή αύξηση ενεργότητας παρατηρείται για τις διαπεράσες K249C (αύξηση X1.6) και R337C (µείωση X1.6), ενώ για τις υπόλοιπες η ενεργότητα παραµένει ουσιαστικά στα ίδια επίπεδα (75-120%, σε σχέση µε την αρχική) (Εικόνα 3.7) Επίδραση ιοντικών H-αντιδραστηρίων (MTE -, MTEΑ + ) Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η επίδραση ιοντικών H-αντιδραστηρίων, που δεν µπορούν να διαπερνούν τη µεµβράνη ((kabas et al., 1992; Dunten et al., 1993; Frillingos & Kaback, 1996; Kwaw et al., 2001), όπως το µεθανο-θειοσουλφονικό αιθυλσουλφονικό (MTE - ) και η µεθανο-θειο-σουλφονική αιθυλαµίνη (MTE + ). Το MTE - εξετάσθηκε για τα 6 µεταλλάγµατα single- Cys σε θέσεις όπου το εγγενές κατάλοιπο είναι πιθανώς αρνητικά φορτισµένο (E55C, E186C, D232C, E272C, D304C, E429C) (Εικόνα 3.8), ενώ το MTE + για τα 9 µεταλλάγµατα single-cys σε θέσεις όπου το εγγενές κατάλοιπο είναι πιθανώς θετικά φορτισµένο (H22C, H31C, K164C, H187C, K249C, H257C, R337C, R341C, R385C) (Εικόνα 3.9)

69 Εικόνα 3.7: Επίδραση του ΝΕΜ (2 mm) στην ενεργότητα των διαπερασών µοναδικής κυστεϊνης. E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C, µετά από προεπώαση µε ΝΕΜ (2 mm, 10 min, 25 ο C). Μετά την επώαση, η αντίδραση του NEM τερµατίσθηκε µε προσθήκη DTT (20 mm), η περίσσεια των αντιδραστηρίων αποµακρύνθηκε µε φυγοκέντρηση και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν και πάλι σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου, στην κατάλληλη συγκέντρωση (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m). Η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς έγινε παρουσία ασκορβικού καλίου (20 mm) και φαιναζινικού µεθοσουλφιδίου (0.2 mm). Παρουσιάζονται οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε 5 10 sec, ως εκατοστιαία ποσοστά επί των τιµών που µετρήθηκαν απουσία NEM για κάθε µετάλλαγµα, µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 πειράµατα. Η γκρίζα οριζόντια ζώνη αντιστοιχεί στον αντίστοιχο µέσο όρο και τυπική απόκλιση που µετρήθηκε για την Cys-less YgfO-BD (αρνητικό control) σε παράλληλα πειράµατα

70 Από τα αποτελέσµατα προκύπτει ότι (α) το MTE - δεν αναστέλλει καµία από τις διαπεράσες E55C, E186C, D232C ή E429C ούτε διασώζει έστω και µικρή ενεργότητα για τις ανενεργές E272C ή D304C, αλλά αυξάνει οριακά ( Χ) την ενεργότητα των E186C και E429C (Εικόνα 3.8), (β) το MTE + δεν αναστέλλει καµία από τις διαπεράσες H22C, K164C, H187C, K249C, H257C, R337C, R341C ή R385C, αλλά αναστέλλει πλήρως την µικρή ενεργότητα της H31C (βλ. Εικόνα 3.4Α) και αυξάνει ( Χ) την ενεργότητα των K164C, H187C, R337C, R341C και R385C (Εικόνα 3.9). Η αναστολή της H31C και η µικρή αύξηση ενεργότητας των διαπερασών K164C, H187C, R337C, R341C, R385C, E186C και E429C υποδεικνύει ότι οι θέσεις αυτές είναι προσβάσιµες από τα αντίστοιχα MT αντιδραστήρια (πρβλ. Εικόνα 3.1). Επίσης, οι µικρές αυξήσεις ενεργότητας, οι οποίες επαναφέρουν την αρχική ταχύτητα των µεταλλαγµάτων σε επίπεδα παρόµοια ή προσεγγίζοντα αυτά της Cys-less YgfO (πρβλ. Εικόνα 3.4Α), υποδεικνύουν ότι η παρουσία θετικού φορτίου στις θέσεις 164, 187, 337, 341 και 385 ή, αντίστοιχα, αρνητικού φορτίου στις θέσεις 186 και 429 εξασφαλίζει την µέγιστη δυνατή ενεργότητα, χωρίς όµως να είναι αναντικατάστατη στη λειτουργία της ενεργού µεταφοράς (Εικόνες 3.4 και ). Τέλος, η πλήρης απενεργοποίηση της H31C (Εικόνα 3.9) υποδεικνύει ότι η θέση αυτή είναι πολύ σηµαντική στον µηχανισµό και δεν επιδέχεται την ύπαρξη θετικού φορτίου (κατά συνέπεια, και η εγγενής His31 της YgfO είναι πιθανόν αποπρωτονιωµένη, χωρίς θετικό φορτίο, σε ph 7.5). Εικόνα 3.8: Επίδραση του MTE - στην ενεργότητα των E55C, E186C, D232C, E272C, D304C και E429C. E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C, µετά από προεπώαση µε MTE - (1 mm, 30 min, 25 ο C). Μετά την επώαση, η περίσσεια των αντιδραστηρίων αποµακρύνθηκε µε φυγοκέντρηση και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 3.7. Η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς έγινε παρουσία ασκορβικού καλίου (20 mm) και φαιναζινικού µεθοσουλφιδίου (0.2 mm). Παρουσιάζονται οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (5-10 sec), ως εκατοστιαία ποσοστά επί των τιµών που µετρήθηκαν απουσία MTE - για κάθε µετάλλαγµα, µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.). Η γκρίζα οριζόντια ζώνη αντιστοιχεί στον µέσο όρο και τυπική απόκλιση της Cys-less YgfO-BD (αρνητικό control)

71 Εικόνα 3.9: Επίδραση του MTEΑ + στην ενεργότητα των H22C, H31C, K164C, H187C, K249C, H257C, R337C, R341C και R385C. E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C, µετά από προεπώαση µε MTEΑ + (1 mm, 30 min, 25 ο C). Οι πειραµατικές συνθήκες ήταν όπως περιγράφονται στις Εικόνες 3.7 και 3.8. Παρουσιάζονται οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (5-10 sec), ως εκατοστιαία ποσοστά επί των τιµών που µετρήθηκαν απουσία MTEΑ +, µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 πειράµατα. Η γκρίζα οριζόντια ζώνη αντιστοιχεί στον µέσο όρο και τυπική απόκλιση της Cys-less YgfO-BD (αρνητικό control)

72 3.3.3 οκιµασίες αλκυλίωσης της διαπεράσης H31C in vivo Η His31 απαντάται στο µέσον του TM1 (Εικόνα 3.1) και είναι απόλυτα συντηρηµένη στους µεταφορείς NT/NC2 (Εικόνα 3.2). Από τα έως τώρα πειραµατικά µας δεδοµένα, η πολύ µικρή ενεργότητα της H31C (Εικόνα 3.4) καθώς και η πλήρης απενεργοποίησή της από το αντιδραστήριο MTE + (Εικόνα 3.9) υποδεικνύουν ότι το κατάλοιπο αυτό είναι σηµαντικό για τη λειτουργία της YgfO. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος της H31C, κατασκευάσαµε καταρχήν την H31C-Ηis 10 [µεταφέροντας την µετάλλαξη από το background της YgfO(C-less)-BD στο background της YgfO(C-less)-His 10 ] και εξετάσαµε το µετάλλαγµα αυτό σε δοκιµασίες αλκυλίωσης µε NEM και MTE -, παρουσία ή απουσία ξανθίνης, in vivo (όρα Karatza et al., 2006) (Εικόνα 3.10). Από τα πειράµατα αυτά προκύπτει ότι (α) η H31C είναι προσβάσιµη τόσο στο NEM όσο και στο MTE - (επιβεβαιώνοντας την προσβασιµότητά της από το υδρόφιλο, εξωκυτταρικό περιβάλλον που υποδηλώνουν και τα πειράµατα ενεργότητας, Εικόνα 3.9), (β) η παρουσία υποστρώµατος (ξανθίνης) δεν προστατεύει σηµαντικά την H31C από την σήµανση µε NEM, υποδεικνύοντας ότι η His31 ευρίσκεται πιθανόν µακριά από το κέντρο δέσµευσης και δεν υπάρχει άµεση στερεοχηµική παρεµπόδιση. Εικόνα 3.10: Αλκυλίωση της διαπεράσης Η31C-His 10 από τα αντιδραστήρια ΝΕΜ και MTE - in vivo. E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση της YgfO(H31C)-His 10 από το πλασµίδιο pt7-5/ygfo(h31c)-his 10 επωάσθηκαν µε ΝΕΜ (1 mm, 10 min, 25 ο C) ή MTE - (1 mm, 10 min, 25 ο C), παρουσία ή απουσία ξανθίνης (10 mm), όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Μετά την επώαση, παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών, εκχυλίσθηκαν οι µεµβρανικές πρωτεΐνες (µε δωδεκυλοµαλτοσίδιο, DDM, 0.8% w/v) και η YgfO(H31C)-His 10 αποµονώθηκε µε χρωµατογραφία συγγένειας ιόντων νικελίου (Ni 2+ -D, Probond), κατά την οποία η διαπεράση δεσµεύθηκε εντός της στήλης των σφαιριδίων Ni 2+ -D, αποδιατάχθηκε πλήρως µε διάλυµα D/ουρίας, και οι υπολειπόµενες ελεύθερες Cys σηµάνθηκαν µε Oregon reen Maleimide (OM) (0.2 mm). Τα δείγµατα εξήχθησαν από τη στήλη µε διάλυµα aemmli και υπεβλήθησαν αµέσως σε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση, µε χρήση (α) αντισώµατος έναντι του OM, για τον έλεγχο του ποσοστού σήµανσης [άνω] και (β) αντισώµατος anti-pentahis για τον έλεγχο της ολικής ποσότητας YgfO(H31C)-His 10 που εκλούεται από τη στήλη [κάτω]

73 3.4 Εκτενής µεταλλαξιγένεση των καταλοίπων H31, K164, R385, D232, E272, D304 Η αρχική ανάλυση κυστεϊνικής στόχευσης (κεφάλαιο 3.2) έδειξε ότι αντικατάσταση µε Cys σε έξι θέσεις της YgfO (31, 164, 232, 272, 304, 385) οδηγεί σε χαµηλή έως αµελητέα ενεργότητα, είτε συνδεόµενη µε χαµηλά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη (K164C, D232C, R385C) είτε συνδεόµενη µε την παρουσία των 5 καταλοίπων er στις αντίστοιχες θέσεις εγγενών Cys της Cys-less YgfO (H31C), είτε συνδεόµενη µε έναν σηµαντικό λειτουργικό ρόλο των εγγενών καταλοίπων που δεν µπορεί σε καµία περίπτωση να υποκατασταθεί από την Cys (E272C, D304C) (Εικόνες ). Είναι ενδιαφέρον, επίσης, ότι, εξαιρέσει του sp232, τα αντίστοιχα εγγενή κατάλοιπα εµφανίζουν πολύ υψηλό βαθµό συντήρησης µεταξύ των µελών της οικογένειας NT/NC2 (His31, lu272, sp304) ή γειτνιάζουν µε θέσεις άλλων υψηλά συντηρηµένων καταλοίπων (ys164, rg385) (Εικόνα 3.2). Οι 6 θέσεις της YgfO υπεβλήθησαν σε εκτενέστερη µεταλλαξιγένεση σηµειακής στόχευσης (site-directed mutagenesis), αντικαθιστώντας καταρχήν µε τα κατά το δυνατόν συγγενέστερα αµινοξέα (rg αντί ys, ys αντί rg, ys ή rg αντί His, lu ή sn αντί sp, sp ή ln αντί lu) και, στη συνέχεια, µε άλλες οµάδες αµινοξέων, στις περιπτώσεις όπου η συντηρητικότερη µεταλλαγή έδινε ελάχιστη ενεργότητα

74 3.4.1 Τα κατάλοιπα His31, ys164, rg385 Η ιστιδίνη στην θέση 31 (His31) Η His31 είναι απόλυτα συντηρηµένη στην οικογένεια µεταφορέων NT/NC2 στο µέσον περίπου του TM1, σε όλες τις περιπτώσεις (Εικόνες 3.1 και 3.2). Αντικατάσταση της His31 της YgfO µε πιθανώς θετικά φορτισµένα κατάλοιπα (ys, rg) οδηγεί σε ελάχιστη έως αµελητέα έκφραση στη µεµβράνη και µηδενική ενεργότητα [H31K(wt), H31R(wt)] (Εικόνα 3.11). Το αποτέλεσµα αυτό ενισχύει την προηγούµενή µας υπόθεση ότι η θέση της His31 είναι µεν προσβάσιµη από το υδρόφιλο εξωκυτταρικό περιβάλλον αλλά δεν µπορεί να δεχθεί την ύπαρξη θετικού φορτίου (κεφάλαιο 3.3.2). Στη συνέχεια κατασκευάσθηκαν και εξετάσθηκαν τα µεταλλάγµατα H31N(wt), H31Q(wt) και H31(wt). Τα µεταλλάγµατα αυτά, όπως και το H31C(wt) που είχε ελεγχθεί στο κεφάλαιο (Εικόνα 3.6), εµφανίζουν σηµαντική ενεργότητα, που είναι ανάλογη µε τα επίπεδα έκφρασής τους στη µεµβράνη (Εικόνα 3.11). Ως εκατοστιαία ποσοστά επί αυτών της YgfO(wt), οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης είναι 40%, 50%, 90% ή 140% και τα µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης 50%, 60%, 110% ή 150%, για τις H31C(wt), H31(wt), H31N(wt) ή H31Q(wt), αντίστοιχα (Εικόνα 3.11Α). Τα επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη είναι περί το 70%, 60%, 100% ή 120% αυτών της YgfO(wt), για τις H31C(wt), H31(wt), H31N(wt) ή H31Q(wt), αντίστοιχα (Εικόνα 3.11Β)

75 Εικόνα 3.11: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των µεταλλαγµάτων στη θέση 31 της YgfO(wt). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των H31K(wt), H31(wt), H31N(wt), H31Q(wt), H31R(wt), H31C(wt) από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C (Α). Σε παράλληλα πειράµατα (Β), παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών από τα ίδια κύτταρα και δείγµατα (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE (12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνηςυπεροξειδάσης (avidin-hrp), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας 3.3. Α) Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (µαύρο) µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.05±0.03 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως ποσοστά επί των τιµών της YgfO(wt)-BD (1.43±0.37 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 4 πειράµατα. Τα µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (γκρι) µετρήθηκαν σε 1-10 min. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.005 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (1.15±0.40 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 4 πειράµατα. Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των H31K(wt), H31(wt), H31N(wt), H31Q(wt), H31R(wt) και H31C(wt) στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one

76 Η λυσίνη στη θέση 164 (ys164) και η αργινίνη στη θέση 385 (rg385) Αντικατάσταση της ys164 ή της rg385 µε κατάλοιπα που διατηρούν τη δυνατότητα ύπαρξης θετικού ιοντικού φορτίου στις θέσεις αυτές (rg, ys) οδηγεί σε διαπεράσες που εκφράζονται στη µεµβράνη της E. coli σε επίπεδα περίπου ίσα [R385K(wt)] ή και ελαφρά µεγαλύτερα [K164R(wt)] από αυτά της φυσικού τύπου YgfO (Εικόνα 3.12Α) και, αντίστοιχα, υψηλή ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης, περί το 50-60% [R385K(wt)] ή 150% [K164R(wt)] σε σχέση µε την διαπεράση φυσικού τύπου (Εικόνα 3.12Β). Εικόνα 3.12: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των µεταλλαγµάτων στις θέσεις 164 και 385 της YgfO(wt). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των K164R(wt) και R385K(wt) από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C (Α) Σε παράλληλα πειράµατα (Β), παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών από τα ίδια κύτταρα και δείγµατα (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE (12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin- HRP), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας

77 Α) Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (µαύρο) µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.14±0.01 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως ποσοστά επί των τιµών της YgfO(wt)-BD (1.33±0.20 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 4 πειράµατα. Τα µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (γκρι) µετρήθηκαν σε 1-10 min. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.006 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (1.20±0.04 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 4 πειράµατα. Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των K164R(wt) και R385K(wt) στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one

78 3.4.2 Τα κατάλοιπα sp232, lu272, sp304 Επίπεδα έκφρασης Κατασκευάσθηκαν τα µεταλλάγµατα µε τις συντηρητικότερες δυνατές αντικαταστάσεις για τις θέσεις sp232, lu272 και sp304, που διατηρούν την καρβοξυλοµάδα (lu, sp) ή εισάγουν µία καρβονυλοµάδα µε αντίστοιχου µεγέθους πλευρική αλυσίδα (sn, ln). Αυτά τα µεταλλάγµατα εκφράζονται στη µεµβράνη της E. coli σε επίπεδα ίσα [E272D(wt)], λίγο χαµηλότερα [E272Q(wt), D304E(wt),D304N(wt)] ή και υψηλότερα [D232E(wt)] από τα επίπεδα της YgfO(wt)-BD (Εικόνα 3.13). Εικόνα 3.13: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των E272D(wt), E272Q(wt), D304E(wt), D304N(wt) και D232E(wt). Κλάσµατα µεµβρανών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις. Τα δείγµατα µεµβρανών (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας 3.3. Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των διαπερασών στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one. Επίπεδα ενεργότητας Τα µεταλλάγµατα E272Q(wt), D304E(wt) και D304N(Wt) εµφανίζουν αµελητέες τιµές αρχικής ταχύτητας ( 2%) και πολύ χαµηλά (<10%) [D304E(wt), D304N(Wt)] έως µηδενικά [E272Q(wt)] επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (Εικόνα 3.14). Η E272D(wt) χαµηλές τιµές ενεργότητας (αρχική ταχύτητα 3%, επίπεδα συσσώρευσης 30%), ενώ η D232E(wt) έχει πολύ υψηλή ενεργότητα [75-80% της YgfO(wt)] (Εικόνα 3.14)

79 Ενεργότητα πρόσληψης ξανθίνης (% wt) Αρχική ταχύτητα Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης D232E(wt) E272D(wt) E272Q(wt) D304E(wt) D304N(wt) Εικόνα 3.14: Ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των D232E(wt), E272D(wt), E272Q(wt), D304E(wt) και D304N(wt). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C. Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (µαύρο) µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.06±0.03 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (1.44±0.30 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 5 ανεξάρτητα πειράµατα. Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (γκρι) µετρήθηκαν σε 1-10 min. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.006 nmol mg 1 min - 1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt)-BD (1.02±0.24 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 5 ανεξάρτητα πειράµατα

80 3.4.3 Ενεργότητα σε σχέση µε το ph Για να εκτιµηθεί κατά πόσον η καρβοξυλοµάδα στη θέση lu272 ή στη θέση sp304 επηρεάζει το pk a ή συνδέεται µε την λειτουργική εξάρτηση του µεταφορέα YgfO από το ph, εξετάσαµε την ενεργότητα µεταφοράς υποστρώµατος [ 3 Η]ξανθίνης για τους µεταφορείς YgfO(wt), YgfO-E272D(wt) και YgfO-D304E(wt) σε ένα εύρος διαφορετικών τιµών ph, από 3.8 έως 10.0 (Εικόνα 3.15). Ο µεταφορέας φυσικού τύπου, YgfO(wt), έχει υψηλές τιµές ενεργότητας, ιδιαίτερα στην περιοχή ph 6.8 έως 8.2, µε µέγιστο σε ph 7.5. Οι YgfO-E272D(wt) και YgfO-D304E(wt) έχουν πολύ µικρές τιµές ενεργότητας σε όλο το εύρος των ph, µε µέγιστες τιµές σε ph Εικόνα 3.15: Εξάρτηση της ενεργότητας µεταφοράς [ 3 Η] ξανθίνης από το ph για τους µεταφορείς YgfO(wt)-BD ( ), YgfO-E272D(wt)-BD ( ) και YgfO- D304E(wt)-BD ( ). ίνονται οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ραδιενεργού υποστρώµατος ξανθίνης(18ci/mmol), τελικής συγκέντρωσης 1µΜ, σε τιµές ph 3.8, 4.2, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0, 6.33, 6.8, 7.3, 7.45, 8.2, 8.6, 9.0, 9.5, Οι αρχικές ταχύτητες µετρήθηκαν σε sec, όπως µε την τυπική απόκλιση που σηµειώνεται. Το διάγραµµα της µικρογραφίας εστιάζεται στα αποτελέσµατα για τους µεταφορείς YgfO-E272D(wt)-BD( ),YgfO-D304E(wt)-BD ( )

81 3.5 Μεταλλαξιγένεση ζευγών κυστεϊνών (paired-cysteine mutagenesis) Επόµενο βήµα στην παρούσα µελέτη ήταν η ανίχνευση σχέσεων εγγύτητας στον µεταφορέα, η οποία βασίζεται στην αλληλεπίδραση µεταξύ ζευγών κυστεϊνών από διαφορετικά διαµεµβρανικά τµήµατα της πρωτεΐνης (Wu and Kaback, 1996, Kaback et al., 1997, Frillingos et al., 1998). Ως πρώτη προσέγγιση, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, εφαρµόσαµε µία έµµεση πειραµατική µεθοδολογία, εξετάζοντας κατά πόσον δύο θέσεις καταλοίπων του YgfO όπου έχουν εισαχθεί οµάδες Cys µπορούν να αλληλεπιδράσουν µεταξύ τους σχηµατίζοντας θέσεις δέσµευσης ιόντων καδµίου (Cd 2+ ), µε ανιχνεύσιµη συνέπεια την πτώση της ενεργότητας του µεταφορέα: η µεθοδολογική αυτή προσέγγιση έχει εφαρµοσθεί και σε άλλους µεταφορείς (Broke et al, 2001, Zomot et al., 2005). Γι αυτόν τον λόγο, κατασκευάσαµε διαπεράσες µε ζεύγη κυστεϊνών σε επιλεγµένες θέσεις (double-cys mutants) χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα τον ελεύθερο κυστεϊνών µεταφορέα YgfO και προχωρήσαµε στον λειτουργικό χαρακτηρισµό τους. Οι θέσεις που επιλέξαµε να συνδυάσουµε για την εισαγωγή των δύο κυστεϊνών αφορούν είτε κατάλοιπα των οποίων οι διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης παρουσιάζουν µικρή έως µηδενική ενεργότητα (Συνδυασµός Ι) είτε κατάλοιπα των οποίων οι διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης έχουν πολύ υψηλή ενεργότητα (Συνδυασµός ΙΙ). Στον Συνδυασµό επιδιώκουµε να εντοπίσουµε πιθανά ζεύγη ιοντικών γεφυρών που δεν είναι αναντικατάστατα για τη λειτουργία του µεταφορέα αλλά επιτρέπουν επαναφορά της κανονικής έκφρασης και/ή ενεργότητας όταν επανέλθει η ισορροπία διαµεµβρανικών φορτίων (ahin-toth et al., 1992; Dunten et al., 1993; Frillingos et al., 1995). Στον Συνδυασµό, επιδιώκουµε να εντοπίσουµε πιθανές αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στον σχηµατισµό κέντρων δέσµευσης Cd 2+ µεταξύ των ζευγών Cys-Cys και ανιχνεύσιµη αναστολή της ενεργότητας (Broke et al, 2001, Zomot et al., 2005)

82 3.5.1 ιαπεράσες διπλών κυστεϊνών: Συνδυασµός θέσεων Ι Στην πρώτη οµάδα διαπερασών έγινε περαιτέρω µεταλλαξιγένεση σε δεύτερες θέσεις στα µεταλλάγµατα εκείνα που βρήκαµε ότι εµφανίζουν χαµηλή ενεργότητα (µηδενική ή πολύ κάτω από 50%), ώστε να εντοπισθούν, αν υπάρχουν, πιθανά ιοντιζόµενα ζεύγη όπου η αποκατάσταση της ενδοµεµβρανικής ισορροπίας φορτίων να επαναφέρει την ενεργότητα (Frillingos and Kaback, 1996, Frillingos et al., 1995). Πρόκειται για τις διαπεράσες µε δύο µόνο κυστεΐνες (double Cys) H31C/E272C, H31C/D304C, R385C/E272C και R385C/D304C οι οποίες όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.16 εκφράζονται σε ποσοστά 60%-80% σε σχέση µε τον µεταφορέα Cys-less-YgfO. Σηµειωτέον ότι η διαπεράση E272C έχει και από µόνη της σχετικά µειωµένη έκφραση (60% του C-less, Εικόνα 3.3). Εικόνα 3.16: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των διαπερασών µε δύο κυστεΐνες στις θέσεις 31 και 385 σε συνδυασµό µε τις θέσεις 272 και 304 (Συνδυασµός Ι). Κλάσµατα µεµβρανών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις. Τα δείγµατα µεµβρανών (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας 3.3. Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης των διαπερασών στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one

83 Στη συνέχεια µετρήσαµε την ενεργότητα των διαπερασών Συνδυασµού θέσεων Ι και είδαµε ότι τα 4 διπλά µεταλλάγµατα εµφανίζουν µηδενικές τιµές τόσο στην αρχική ταχύτητα πρόσληψης υποστρώµατος όσο και στα µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης [ 3 Η] ξανθίνης (Εικόνα 3.17). Οµοίως, όπως προαναφέρθηκε (Εικόνα 3.4), και οι 4 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης στις αντίστοιχες θέσεις παρουσιάζουν πολύ µικρή (R385C, H31C) έως µηδενική ενεργότητα (E272C, D304C). Εικόνα 3.17: Ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των διαπερασών µε δύο κυστεΐνες στις θέσεις 31 και 385 σε συνδυασµό µε τις θέσεις 272 και 304 (Συνδυασµός Ι). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C. Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (µαύρο) µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.004 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO-Cys-less-BD (3.78±0.72 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 ανεξάρτητα πειράµατα. Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (γκρι) µετρήθηκαν σε 1-10 min. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.003 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO- Cys-less-BD (1.16±0.17 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 ανεξάρτητα πειράµατα

84 3.5.2 ιαπεράσες διπλών κυστεϊνών: Συνδυασµός θέσεων ΙΙ Στην δεύτερη οµάδα διαπερασών έγινε περαιτέρω µεταλλαξιγένεση σε δεύτερες θέσεις στα µεταλλάγµατα εκείνα που βρήκαµε ότι εµφανίζουν πολύ υψηλή ενεργότητα (πάνω από 60% του C-less, Εικόνα 3.4), ώστε να εντοπισθούν, αν υπάρχουν, ζεύγη θέσεων καταλοίπων που είναι κοντά µεταξύ τους στην τριτοταγή δοµή και µπορούν να συµβάλλουν στον σχηµατισµό κέντρων δέσµευσης Cd 2+ και ανιχνεύσιµη αναστολή της ενεργότητας παρουσία των ιόντων καδµίου (Broke et al, 2001, Zomot et al., 2005). Μία τέτοια περίπτωση συνδυασµού καταλοίπων θα υποδήλωνε επίσης ότι οι αντίστοιχες θέσεις είναι προσβάσιµες από το εξωκυτταρικό υδρόφιλο περιβάλλον (ιόντα Cd 2+ ), πράγµα που µπορεί να αντιπαραβληθεί και µε το τοπολογικό µοντέλο της Εικόνας 3.1 καθώς και µε δεδοµένα του εργαστηρίου µας για την προσβασιµότητα των αντίστοιχων περιοχών του µορίου στο αντιδραστήριο MTE - (Mermelekas et al., in preparation). Ως πρώτο βήµα, εξετάσαµε την έκφραση και ενεργότητα των διαπερασών διπλών κυστεϊνών Συνδυασµού Ι Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.18, οι διαπεράσες E186C/H257C, E186C/R341C, E429C/H257C και E429C/R341C έχουν επίπεδα έκφρασης παρόµοια µε αυτά του Cys-less-YgfO, ενώ η E429C/K249C εκφράζεται περίπου στο 70% και οι διαπεράσες E186C/H187C και E429C/Η187C στο 30% του Cys-less-YgfO. Συγκριτικά, όλες οι αντίστοιχες διαπεράσες µονής κυστεϊνης εκφράζονται σε επίπεδα παρόµοια µε του C-less YgfO (Εικόνα 3.3). Οι ενεργότητες των διαπερασών Συνδυασµού θέσεων ΙΙ δίνονται στην Εικόνα Εκτός της E429C/H187C που εµφανίζει ελάχιστη ενεργότητα ( 2% του C-less), αλλά και πολύ χαµηλά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη (Εικόνα 3.18), οι υπόλοιπες διαπεράσες διπλών κυστεϊνών διατηρούν σηµαντική ενεργότητα, σε επίπεδα 60-80% (Ε186C/H257C, E429C/H257C) 30-50% (Ε186C/R341C, E429C/R341C) ή 15-30% του C-less YgfO (E186C/H187C, E429C/K249C)

85 Εικόνα 3.18: Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των διαπερασών µε δύο κυστεΐνες στις θέσεις 186 και 429 σε συνδυασµό µε τις θέσεις 187, 249, 257 και 341 (Συνδυασµός ΙΙ). Κλάσµατα µεµβρανών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις. Τα δείγµατα µεµβρανών (100 µg ολικής πρωτεΐνης ανά διαδροµή) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση D-PE(12%) και ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp), όπως ακριβώς και στα πειράµατα της Εικόνας 3.3 και ποσοτική εκτίµηση των επιπέδων έκφρασης όλων των διαπερασών στη µεµβράνη µε το πρόγραµµα Quantity-one

86 Εικόνα 3.19: Ενεργότητες µεταφοράς ξανθίνης των διαπερασών µε δύο κυστεΐνες στις θέσεις 186 (Α) και 429 (Β) σε συνδυασµό µε τις θέσεις 187, 249, 257 και 341 (Συνδυασµός ΙΙ). E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfο(cys-less)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0.7mg ολικής πρωτεΐνης ανά m) και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1µΜ), στους 25 ο C. Αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης (µαύρο) µετρήθηκαν σε sec. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.006 nmol mg 1 min -1 ) (κύτταρα µετασχηµατισµένα µε «κενό» πλασµίδιο pt7-5) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO-Cys-less-BD (2.6±0.5 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 ανεξάρτητα πειράµατα. Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (γκρι) µετρήθηκαν σε 1-10 min. Η τιµή του αρνητικού µάρτυρα (0.020±0.009 nmol mg 1 min -1 ) αφαιρέθηκε από τις τιµές των δειγµάτων σε κάθε περίπτωση. Οι τιµές εκφράζονται ως εκατοστιαία ποσοστά επί των αντίστοιχων τιµών της YgfO- Cys-less-BD (1.14±0.15 nmol mg 1 min -1 ) µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 ανεξάρτητα πειράµατα

87 Επίδραση ιόντων Cd 2+ στην ενεργότητα των διαπερασών µε δύο κυστείνες Τα ιόντα καδµίου Cd 2+ είναι γνωστό ότι µπορούν να αντιδρούν µε την πλευρική αλυσίδα της Cys (Perez-arcia et. al, 1996, lusker, 1991), σε θέσεις βέβαια όπου το κατάλοιπο αυτό είναι προσβάσιµο, και η συγγένεια της αλληλεπίδρασης Cys-Cd 2+ ενισχύεται σηµαντικά, µε την ταυτόχρονη δέσµευση και δεύτερης κυστεΐνης µε το δισθενές κατιόν καδµίου, ώστε να σχηµατισθούν κέντρα συντονισµού για δέσµευση, του τύπου Cys-Cd 2+ -Cys (Bénitah et al., 1996). Η ιδιότητα αυτή των ιόντων καδµίου έχει αξιοποιηθεί για αρχικές µελέτες προσβασιµότητας και ελέγχου της πιθανής γειτνίασης στην τριτοταγή δοµή συγκεκριµένων ζευγών καταλοίπων και σε άλλες διαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς, όπως στον µεταφορέα γλουταµικού lt1 (Brocke et al., 2001), στον µεταφορέα του γ-αµινο-βουτυρικού (B) T-1 (Zomot et al., 2005) και οµόλογα του µεταφορέα σεροτονίνης ERT (Henry et al., 2006). Στην παρούσα εργασία, εισαγάγουµε την µεθοδολογία αυτή και στη µελέτη του µεταφορέα ξανθίνης YgfO της οικογένειας NT. Συγκεκριµένα, ελέγξαµε την επίδραση του χλωριούχου καδµίου επί της ενεργότητας των double-cys διαπερασών Ε186C/H257C, E429C/H257C, Ε186C/R341C, και E429C/R341C (Εικόνα 3.19), εν συγκρίσει προς την Cys-less YgfO και τις single-cys διαπεράσες E186C, H257C, R341C και E429C. Όπως δείχνει η Εικόνα 3.20, βρήκαµε ότι µόνο η E429C/H257C εµφανίζει σηµαντική αναστολή ενεργότητας (50-60%, µε 1 mm, 4 mm, 10 mm ή 20 mm CdCl2), η οποία µπορεί να τιτλοδοτηθεί (µε προσαρµογή στις κατάλληλες εξισώσεις µε το πρόγραµµα Prism4) και δίνει µία τιµή C 50 περί τα 100 µμ. Αυτό το αποτέλεσµα υποδηλώνει ότι, αφενός, οι single-cys θέσεις 429 (έλικα 12) και 257 (έλικα 8) είναι πιθανό να γειτνιάζουν στη δοµή της YgfO ώστε να µπορούν να δηµιουργούν από κοινού κέντρο συντονισµού για δέσµευση του καδµίου και, αφετέρου, είναι προσβάσιµες από το υδρόφιλο εξωκυτταρικό περιβάλλον ώστε να µπορούν να δεσµεύουν το κατιόν του καδµίου (πρβλ. και το τοπολογικό µοντέλο της Εικόνας 3.1)

88 Εικόνα 3.20: Επίδραση CdCl 2 στην ενεργότητα των διαπερασών ζευγών κυστεϊνών. E. coli Τ184 που είχαν επαχθεί µε PT για την έκφραση των υπό µελέτη διαπερασών από πλασµίδια pt7-5/ygfo(cys-less)-bd, pt7-5/ygfo(single- Cys)-BD και pt7-5/ygfo(double-cys)-bd που έφεραν τις αντίστοιχες µεταλλάξεις συνελέγησαν µε φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα KP i, ph 7.5, και υπεβλήθησαν σε δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η]ξανθίνης (1 µμ), στους 25 ο C, µετά από προεπώαση µε CdCl 2 (10µΜ-20mM, 10 min, 25 ο C). Παρουσιάζονται οι αρχικές ταχύτητες πρόσληψης ξανθίνης, όπως µετρήθηκαν σε 5 10 sec, ως εκατοστιαία ποσοστά επί των τιµών που µετρήθηκαν απουσία CdCl 2 για κάθε µετάλλαγµα, µε τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (.D.), από 3 πειράµατα

89 ΚΕΦΑΛΑΙΙΟ 4 ο ο :Συζήτηση

90 - 80 -

91 Συζήτηση Ιοντιζόµενα διαµεµβρανικά κατάλοιπα πολλών πρωτεϊνών ενεργού µεταφοράς που απαντώνται σε εξελικτικά συντηρηµένες θέσεις της αλληλουχίας έχει δειχθεί ότι είναι σηµαντικά είτε για τη σταθεροποίηση της λειτουργικής δοµής µέσω σχηµατισµού ιοντικών γεφυρών είτε ως αναντικατάστατες συνιστώσες του κέντρου δέσµευσης και µεταφοράς υποστρώµατος (Μacara and Cantley,1981, Karlish et al., 1985, enior, 1983, Cain and imoni,1988, Catterall, 1988, Kliingenberg, 1988, tern and Khorana, 1989,,Miller et al.,1990, Frillingos et al, 1998, ambongi et al., 1999, bramson et al., 2003, Kaback et al., 2007). Στην παρούσα εργασία, εξετάσαµε µε σηµειακή µεταλλαξιγένεση τα 16 πιθανώς ιοντιζόµενα διαµεµβρανικά κατάλοιπα του µεταφορέα YgfO, ο οποίος αποτελεί πρότυπο µοριακό σύστηµα µελέτης για την οικογένεια των µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων NT/NC2. Στόχος µας ήταν να εντοπίσουµε θέσεις καταλοίπων µε σηµαντικό ή αναντικατάστατο ρόλο για τη λειτουργία των πρωτεϊνών NT/NC2 και να συµβάλουµε έτσι στην ανάλυση των σχέσεων δοµήςλειτουργίας των µεταφορέων αυτών, οι οποίοι δεν έχουν ακόµη µελετηθεί αναλυτικά στο µοριακό επίπεδο (Karatza et al., 2006; Pantazopoulou and Diallinas, 2007). Τα κύρια ευρήµατα της µελέτης µας ήταν: (1) οι καρβοξυλοµάδες των συντηρηµένων καταλοίπων lu272 και sp304 του YgfO, που εντοπίζονται ανοδικά της περιοχής του µοτίβου-υπογραφή NT (Karatza et al., 2006), είναι αναντικατάστατες στον µηχανισµό της ενεργού µεταφοράς ξανθίνης, (2) η απόλυτα συντηρηµένη µεταξύ των µεταφορέων ΝΑΤ His31, στο µέσον του πρώτου διαµεµβρανικού τµήµατος (TM1), είναι σηµαντική για την βέλτιστη έκφραση στη µεµβράνη, (3) οι H257C (TM5) και E429C (TM12) φαίνεται να αλληλεπιδρούν, πιθανόν σχηµατίζοντας κέντρο συντονισµού για δέσµευση των ιόντων καδµίου που οδηγεί σε αναστολή της ενεργότητας της διαπεράσης Η257C/E429C. Περαιτέρω πειράµατα απαιτούνται για την ανάλυση τόσο του ρόλου των αναντικατάστατων καταλοίπων που αποκαλύφθηκαν όσο και των αλληλεπιδράσεων µεταξύ διαφορετικών περιοχών αλληλουχίας του YgfO. Από την αρχική διερεύνηση της έκφρασης και ενεργότητας µιας σειράς 22 µεταλλαγµάτων µε µία νεο-εισαγόµενη Cys, τόσο στο υπόστρωµα της YgfO χωρίς κατάλοιπα Cys (Cys-less) όσο και στο υπόστρωµα της φυσικού τύπου YgfO, καθώς και 11 µεταλλαγµάτων ζευγών Cys, προκύπτει ότι µόνο δύο από τα 16 πιθανώς ιοντιζόµενα διαµεµβρανικά κατάλοιπα του µεταφορέα YgfO είναι αναντικατάστατα για τη λειτουργία. Η αντικατάσταση των δύο αυτών θέσεων, lu272(tm8) και sp304 (TM8-9), µε Cys οδηγεί στην απενεργοποίηση του YgfO ως προς την µεταφορά ξανθίνης, χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης στην µεµβράνη. Αποκατάσταση µιας πιθανής διαµεµβρανικής ισορροπίας φορτίων, µε µεταλλάγµατα ζευγών Cys µεταξύ sp304/lu272 και His31 ή rg385, ή πιθανή επαναφορά ενός αρνητικού φορτίου στις θέσεις αυτές µε τροποποίηση της E272C ή της D304C µε το αντιδραστήριο MTE -, δεν διασώζει την ενεργότητα. Άρα, δεν φαίνεται εδώ να υπάρχει η περίπτωση ιοντικών ζευγών, όπως των sp240-ys319 ή sp237-ys358 της acy, όπου αναντικατάστατα δεν είναι τα ίδια τα κατάλοιπα αλλά η ύπαρξη θετικού ή αρνητικού φορτίου στις αντίστοιχες θέσεις ή η ισορροπία φορτίων του διαµεµβρανικού ζεύγους (ahin-toth et. al., 1992; bramson et al., 2003)

92 Περαιτέρω, ακόµη και συντηρητικότερες αντικαταστάσεις στις θέσεις E272 και D304, µε διατήρηση της καρβοξυλοµάδας και αυξοµείωση της πλευρικής της αλυσίδας κατά µία µεθυλενοµάδα (sp σε lu ή lu σε sp) ή εισαγωγή µίας καρβονυλοµάδας µε πλευρική αλυσίδα αντίστοιχου µεγέθους (sn, ln) οδηγούν στην απώλεια ενεργότητας. Εποµένως, η ύπαρξη αυτή καθαυτή της καρβοξυλοµάδας αλλά και η γεωµετρία της πλευρικής αλυσίδας στις θέσεις αυτές είναι πολύ σηµαντικές για τη λειτουργία. Είναι ενδιαφέρον ότι και τα δύο αυτά κατάλοιπα είναι ιδιαίτερα συντηρηµένα µεταξύ όλων των µεταφορέων της οικογένειας NT/NC2 (σχεδόν πάντοτε lu στην αντίστοιχη θέση 272 και sp, lu ή sn στην αντίστοιχη θέση 304), ενώ η sp304 γειτνιάζει στην αλληλουχία µε µία σηµαντική περιοχή του µεταφορέα ( , µοτίβο-«υπογραφή» της οικογένειας NT) που έχει προταθεί ότι συµµετέχει στο µονοπάτι µεταφοράς υποστρώµατος και στον καθορισµό της εξειδίκευσης αναγνώρισης πουρινών, τόσο στον µεταφορέα ξανθίνης YgfO (Karatza et al., 2006) όσο και στον µεταφορέα ουρικού/ξανθίνης Uap του ασκοµύκητα spergillus nidulans (Koukaki et al., 2005). Για να κατανοήσουµε τον ρόλο των καταλοίπων αυτών πληρέστερα, απαιτούνται περαιτέρω πειράµατα για δοκιµασίες δέσµευσης υποστρώµατος και επιµέρους αντιδράσεις µεταφοράς (ανταλλαγή ή εκροή ξανθίνης) σε µεµβρανικά κυστίδια. Από τα υπόλοιπα κατάλοιπα που µελετήθηκαν, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η His31, που είναι απόλυτα συντηρηµένη στην οικογένεια µεταφορέων NT/NC2 στο µέσον περίπου του πρώτου διαµεµβρανικού τµήµατος (TM1). Από την ανάλυση µιας σειράς µεταλλαγµάτων της φυσικού τύπου YgfO στη θέση αυτή, φαίνεται ότι η επίδραση των εισαγόµενων µεταλλαγών είναι κατά βάση στην έκφραση και/ή σταθερότητα του µορίου στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη και δευτερευόντως στην ενεργότητα. Συγκεκριµένα, αντικαταστάσεις που διατηρούν τον πολικό χαρακτήρα (ln, sn) οδηγούν σε υψηλή έκφραση στη µεµβράνη και υψηλή ενεργότητα, αντικαταστάσεις µε περισσότερο υδρόφοβο χαρακτήρα (Cys, eu) οδηγούν σε χαµηλότερα επίπεδα έκφρασης και σχετικά µικρή ενεργότητα, ενώ αντικαταστάσεις µε κατάλοιπα που εισάγουν θετικό φορτίο (ys, rg) οδηγούν σε ελάχιστη έκφραση και ελάχιστη ή αµελητέα ενεργότητα. Επίσης, η διαπεράση µονής κυστεΐνης H31C είναι προσβάσιµη σε αλκυλιωτικά Hαντιδραστήρια όπως το NEM και η µικρή ενεργότητα που παρατηρείται για την διαπεράση αυτή αναστέλλεται πλήρως από το αντιδραστήριο MTEΑ + που εισάγει επίσης θετικό φορτίο. Συνοπτικά, φαίνεται ότι η His31 συµµετέχει σε κάποια υδρόφιλη, αλλά µη ιοντικού χαρακτήρα, αλληλεπίδραση που έχει σηµαντικό ρόλο, κυρίως για τη βέλτιστη έκφραση ή σταθερότητα του YgfO στη µεµβράνη. Είναι ενδιαφέρον ότι, και στον οµόλογο µεταφορέα Uap του ασκοµύκητα. nidulans, µεταλλαγές στο αντίστοιχο κατάλοιπο His86 του TM1 οδηγούν σε µειωµένη έκφραση στο επίπεδο της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης, καθώς και ανεπιτυχή στόχευση, µε παραµονή της πρωτεΐνης είτε στο ενδοπλασµατικό δίκτυο (H86D) είτε στα χυµοτόπια (H86, H86K) (Pantazopoulou and Diallinas, 2006). Τέλος, συνδυάζοντας ανά δύο µία σειρά µεταλλαγµάτων κυστεϊνών σε επιλεγµένες θέσεις του µορίου του YgfO, µε βάση και το µοντέλο τοπολογίας (Εικόνα 3.1), πήραµε µία πρώτη ένδειξη ότι δύο θέσεις της αλληλουχίας που εντοπίζονται προς την περιπλασµική πλευρά των διαµεµβρανικών τµηµάτων TM5 (His257) και TM12 (lu429) είναι πιθανόν γειτονικές στη δοµή του µεταφορέα ώστε να µπορούν να αλληλεπιδρούν οδηγώντας σε δέσµευση ιόντων Cd 2+ και αναστολή της ενεργότητας του Η257C/E429C. Αν και παρόµοια πειράµατα επίδρασης Cd 2+ έχουν χρησιµοποιηθεί για αρχικές

93 αναλύσεις της τριτοταγούς δοµής σε τασεοεξαρτώµενους διαύλους νατρίου (Benitah et al., 1996) και σε µεταφορείς των νευροδιαβιβαστών γλουταµικού (Brocke et al., 2002), γ-αµινο-βουτυρικού (B) (Zomot et al., 2005) και σεροτονίνης (Henry et al., 2005), τα αποτελέσµατά µας στο σηµείο αυτό θα πρέπει να θεωρηθούν προκαταρτικά. Μελλοντικά, περαιτέρω, πειράµατα διασταυρούµενης σύνδεσης κυστεϊνών (cross-linking) και, πιθανόν, η ανάλυση της κρυσταλλικής δοµής οµόλογων µεταφορέων θα επιτρέψουν πιο ολοκληρωµένα και ασφαλή συµπεράσµατα για την οργάνωση των διαµεµβρανικών τµηµάτων του µεταφορέα YgfO

94 - 84 -

95 Βιιβλιιογραφίία

96 - 86 -

97 1. bramson, J., mirnova,., Kasho, V., Verner,., Kaback, H. R., and wata,. (2003a) tructure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. cience 301, bramson, J., mirnova,., Kasho, V., Verner,., wata,., and Kaback, H. R. (2003b) The lactose permease of Escherichia coli: overall structure, the sugar- binding site and the alternating access model for transport. FEB ett. 555, kabas, M.H., tauffer, D.., Xu, M., and Karlin,. (1992) cetylcholine receptor channel structure probed in cysteine-substitution mutants. cience 258, lberts, B., Bray, D., Johnson,., ewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. (2000) Essential cell biology: an introduction to the molecular biology of the cell. arland Publishing, nc, New York and ondon 5. millis,., Koukaki, M., and Diallinas,. (2001) ubstitution F569 converts Uap, a specific uric acid-xanthine transporter, into a broad specificity transporter for purine-related solutes. J. Mol. Biol. 313, ndersen, P.., Frees, D., Fast, R., and Mygind, B. (1995) Uracil uptake in Escherichia coli K-12: isolation of ura mutants and cloning of the gene. J. Bacteriol. 177, Bénitah, J.P., Tomaselli.F., and Marban E. (1996) djacent pore-lining residues within sodium channels identified by paired cysteine mutagenesis. Proc Natl cad ci U 93, Berg, M. J., Tymoczko,. J. and tryer,. (2005) Biochemistry, 5 th edition, W.H Freeman and Company, an Francisco 9. Blattner, F. R., Plunkett,., Bloch, C.., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado- Vides, J., lasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew,. F., regor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H.., oeden, M.., Rose, D. J., Mau, B., and hao, Y. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. cience 277, Burton, K. (1983) Transport of nucleic acid bases into Escherichia coli. J en. Microbiol. 129, Brocke., Bendahan., runewald M., and Kanner. B. (2002) Proximity of Two Oppositely Oriented Reentrant oops in the lutamate Transporter T- 1 dentified by Paired Cysteine Mutagenesis. J. Biol. Chem. 277, Cain, B. D., and imoni, R. D. (1988) nteraction between lu-219 and His- 245 within the a subunit of F1F0-TPase in Escherichia coli. J. Biol. Chem 263, Carrasco, N., Herzlinger, D.,Mitchell R. DeChiara., Danho, W., abriel, T.F., and Kaback, H.R. (1984) ntramolecular dislocation of the COOH terminus of the lac carrier protein in reconstituted proteoliposomes. Proc. Natl. cad. ci. U 81,

98 14. Catterall, W.. (1988) tructure and function of voltage-sensitive ion channels. cience 242, Cecchetto,., millis,., Diallinas,., cazzocchio, C., and Drevet, C. (2004). The zg purine transporter of spergillus nidulans: characterisation of a protein belonging to a new phylogenetic cluster. J. Biol. Chem. 279, Diallinas,., Valdez, J., ophianopoulou, V., Rosa,., and cazzocchio, C. (1998) Chimeric purine transporters of spergillus nidulans define a domain critical for function and specificity conserved in bacterial, plant and metazoan homologues. EMBO J. 17, de Koning, H. P., and Jarvis,. M. (1999) denosine transporters in bloodstream forms of Trypanosoma brucei brucei: substrate recognition motifs and affinity for trypanocidal drugs. Mol. Pharmacol. 56, de Koning, H., and Diallinas,. (2000) Nucleobase transporters. Mol. Membr. Biol., 17, Dunten, R.., ahin- Tόth, M., and Kaback, H. R. (1993) Role of the charge pair aspartic acid-237-lysine-358 in the lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 32, Feilmeier, B.J, seminger,., chroeder, D., Webber H., Phillips.J. (2000) reen fluorescent protein functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli. J Bacteriol, 182, Forrest,. R., Tavoulari,., Zhang, Y. W., Rudnick,., and Honing, B. (2007) dentification of a chloride ion binding site in Na + /Cl - -dependent transporters. Proc Natl cad ci U 104, Frillingos,., and Kaback, H. R. (1996) Chemical rescue of sp237 la and ys358 la mutants in the lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 35, Frillingos,., and Kaback, H. R. (2001) ltering sugar transport specificity of a bacterial oligosaccharide H + symporter (OH) by site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem. 268, Frillingos,., ahin-tόth, M., Persson, B., and Kaback, H. R. (1994) Cysteine-scanning mutagenesis of putative helix V in lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 33, Frillingos,., ahin-tóth, M., Wu, J., engeler, W. J., and Kaback, H. R. (1995) Helix packing in the sucrose permease of Escherichia coli: Properties of engineerd charge pairs between helices V and X. Biochemistry 34, Frillingos,., onzalez,., and Kaback, H. R. (1997) Cysteine-scanning mutagenesis of helix V and the adjoining loops in the lactose permease of Escherichia coli: lu126 and rg144 are essential. Biochemistry 36,

99 27. Frillingos,., ahin-tóth, M., Wu, J., and Kaback, H. R. (1998) Cys-scanning mutagenesis: a novel approach to structure-function relationships in membrane proteins. FEB J. 12, eorgopoulou, E., Mermelekas,., Karena, E., Karatza, P., Panos, P., and Frillingos,. (2007) The role of 324 QN 325 and flanking sequences of the nucleobases-ascorbate transporters (NT) in purine:h + symport. FEB J. 274, (uppl. 1), lusker, J. P. (1991) tructural aspects of metal liganding to functional groups in proteins. dv. Protein Chem. 42, oldshleger, R., Tal., D. M., Moorman, J., tein, W. D., and Karlish,. J. (1992) Chemical modification of lu-953 of the alpha chain of Na +,K + - TPase associated with inactivation of cation occlusion. Proc. Natl. cad. ci. U 89, oudela,., Karatza, P., Koukaki, M., Frillingos,., and Diallinas,. (2005) Comparative substrate recognition by bacterial and fungal purine transporters of the NT family. Mol. Membr. Biol. 22, ranseth, E., Daley, DO, Rapp, M., Melen, K.,von Heijne,. (2005) Experimentally constrained topology models for 51,208 bacterial inner membrane proteins. J. Mol. Biol. 352, uan,., and Kaback, H. R. (2006) essons from lactose permease. nnu. Rev. Biophys. Biomol. truct. 35, uan,., Mizra, O., Verner,., wata,., and Kaback, H. R. (2007) tructural determination of wild-type lactose permease. Proc. Natl. cad. ci. U 104, He, M. M., and Kaback, H. R. (1997) nteraction between residues lu269 (helix V) and His322 (helix X) of the lactose permease of Escherichia coli is essential for substrate binding. Biochemistry 36, He, M. M., Voss, J., Hubbell, W.., and Kaback, H. R. (1997) rginine 302 (helix X) in the lactose permease of Escherichia coli is in close proximity to glutamate 269 (helix V) as well as glutamate 325. Biochemistry 36, Henry,.K., Field, J.R., dkins, E.M., Parnas, M.., Vaughan, R.., Zou, M.F., Newman,.H., Blakely, R.D (2006). Tyr-95 and le-172 in transmembrane segments 1 and 3 of human serotonin transporters interact to establish high affinity recognition of antidepressants. J. Biol. Chem. 281, Ho,. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., and Pease,. R. (1989) ite-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. ene 77, Honig, B. H., and Hubbel, W.. (1984) tability of salt bridges in membrane proteins. Proc. Natl. cad. ci. U 81,

100 40. Jung, K., Jung, H., Wu, J., Privé,.., and Kaback, H. R. (1993) Use of sitedirected fluorescence labeling to study proximity relationships in the lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 32, Jung. K., Voss, J., He, M., Hubbell, W.., and Kaback, H. R. (1995) Engineering a metal binding site within a polytopic membrane protein, the lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 34, Kaback, H. R. (1997) molecular mechanism for energy coupling in a membrane transport protein, the lactose permease of Escherichia coli. Pro. Natl. cad. ci. U 94, Kaback, H. R., Reeves, J. P., hort,.., and ombardi, F. J. (1974) Mechanisms of active transport in isolated bacterial membrane vesicles: XV. The mechanism of action of carbonylcyanide m- chlorophenylhydrazone. rch. Biochem. Biophys. 160, Kaback, H. R., ahin-tóth, M., and Weinglass,. (2001) The kamikaze approach to membrane transport. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2, Kaback, H. R, Dunten, R., Frillingos,., Venkatesan, P., Kwaw,., Zhang, W., and Ermolova, N. (2007) ite-directed alkylation and the alternating access model for acy. Proc. Natl. cad. ci. U 104, Kanner, B.. (2006) tructure and function of sodium-coupled B and glutamate transporters. J Membr Biol. 213, Karatza, P., and Frillingos,. (2005) Cloning and functional characterization of 2 bacterial members of the NT/NC2 family in Escherichia coli. Mol. Membr. Biol. 22, Karatza, P., Panos, P., eorgopoulou, E., and Frillingos,. (2006) Cysteinescanning analysis of the Nucleobase-scorbate transporter signature motif YgfO permease of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 281, Karlin,., and kabas, M.H. (1998) ubstituted-cysteine accessibility method. Methods Enzymol. 293, Kasho V. N, mirnova. N, Kaback H. R. (2006) equence alignment and homology threading reveals prokaryotic and eukaryotic proteins similar to lactose permease. J. Mol. Biol. 358, Khorana, H.. (1988) Bacteriorhodopsin, a membrane protein that uses light to translocate protons. J. Biol. Chem. 263, King C.., Hansen. C., and Wilson T. H. (1991) The interaction between aspartic acid 237 and lysine 358 in the lactose carrier of Escherichia coli. Biochim. Biophys. cta 1062, Klingenberg, M. (1988) Nucleotide binding to uncoupling protein. Mechanism of control by protonation. Biochemistry 27,

101 54. Koukaki, M., Vlanti,., oudela,., Pantazopoulou,., ioule, H., Tournaviti,., and Diallinas,. (2005) The nucleobase-ascorbate transporter (NT) signature motif in Uap defines the function of the purine translocation pathway. J. Mol. Biol. 350, Kraupp, M., and Marz, R. (1995). Membrane transport of nucleobases: interaction with inhibitors. en. Pharmacol. 26, Kwaw,., Zen, K. C., Hu, Y, and Kaback, H. R. (2001) ite-directed sulfhydryl labeling of the lactose permease of Escherichia coli: helices V and V that contain the major determinants for substrate binding.. Biochemistry 40, aemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, ee, J.., Hwang, P. P., Hansen, C., and Wilson, T. H. (1992) Possible salt bridges between transmembrane a-helices of the lactose carier of Escherichia coli. The journal of Biological Chemistry 267, ee, J.., Hwang P. P., and Wilson T. H. (1993) ysine 319 interacts both lutamic acid 269 and spartic acid 240 in the lactose carrier of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268, iang, W. J., Johnson, D., and Jarvis,. M. (2001) Vitamin C transport systems of mammalian cells. Mol. Membr Biol. 18, odish H., Berk., Matsudaira P., Kaiser.C., Krieger M., cott P.M., Zipursky.. and Darnell J. (2004) Molecular Cell Biology, W.H Freeman and Company, New York 62. Macara,.., and Cantley,. C. (1981) Mechanism of anion exchange across the red cell membrane by band 3: interactions between stilbenedisulfonate and NP- taurine binding sites. Biochemistry 20, Manoil, C., Beckwith, J. (1986) genetic approach to analyzing membrane protein topology. cience 233, Meintanis, C., Karagouni,. D., and Diallinas,. (2000) mino acid residues N450 and Q449 are critical for the uptake capacity and specificity of Uap, a prototype of a nucleobase-ascorbate transporter family. Mol. Membr. Biol. 17, Melen, Κ., Krogh,., von Heijne,. (2003) Reliability measures for membrane protein topology prediction algorithms. J. Mol. Biol. 327, Meredith, D. (2004) ite-directed mutation of arginine 282 to glutamate uncouples the movement of peptides and protons by the rabbit proton-peptide cotransporter PepT1. J. Biol. Chem. 279, Miller, M. J., Oldenburg, M., and Fillingame, R. H. (1990) The essential carboxyl group in subunit c of F 1 F 0 TP-synthase can be moved and H + - translocating function retained. Proc. Nat. cad. ci. U 87,

102 68. Mizra, O., uan,., Verner,., wata,., and Kaback, H. R. (2006) tructural evidence for induced fit and a mechanism for sugar/h + symport in acy. EMBO J. 25, Nie, Y., Ermolova, N., and Kaback, H. R. (2007) ite-directed alkylation of acy: Effect of the proton electrochemical gradient. J. Mol. Biol., in press 70. Pantazopoulou, and Diallinas. (2006) The first transmembrane segment (TM1) of Uap contains determinants necessary for expression in the plasma membrane and purine transport. Mol. Membr. Biol. 23, Pantazopoulou,., and Diallinas,. (2007) Fungal nucleobase transporters. FEM Microbiol. Reviews 31, Perez-arcia, M. T., Chiamvimonvat, N., Marban, E., and Tomaselli,. F. (1996) tructure of the sodium channel pore revealed by serial cysteine mutagenesis. Proc. Natl. cad. ci. U 93, Raunser,., ppel, M., anea, C., eldmacher-kaufer, U., Fendler, K., Kuhlbrandt, W. (2006) tructure and function of prokaryotic glutamate transporters from Escherichia coli and Pyrococcus horikoshii. Biochemistry 45, Roy-Burman, Visser DW (1975) Transport of purines and deoxyadenosine in Escherichia coli. J Biol. Chem. 250, Rudnick,. (2006) tructure/function relationships in serotonin transporter: new insights from the structure of a bacterial transporter. Handb. Exp. Pharmacol. 175, Ryan, R. M., and Mindell, J.. (2007) The uncoupled chloride conductance of a bacterial glutamate transporter homolog. Nat truct Mol Biol. 14, ahin-tóth, M., and Kaback, H. R. (1993) Properties of interacting aspartic acid and lysine residues in the lactose permease of Escherichia coli. Biochemistry 32, ahin-tóth, M., Dunten, R.., onzalez,., and Kaback, H. R. (1992) Functional interactions between putative intramembrane charged residues in the lactose permease of Escherichia coli. Proc. Natl. cad. ci. U 89, ahin-tóth, M., Frillingos,., engeler, J. W., and Kaback, H. R. (1995) ctive transport by the CscB permease in Escherichia coli K-12. Biochem. Biophys. Res. Com. 208, ahin-tóth, M., Karlin,., and Kaback, H. R. (2000a) Unraveling the mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Proc. Natl. cad. ci. U 97,

103 81. ahin-tóth, M., Frillingos,., awrence, M. C., and Kaback, H. R. (2000b) The sucrose permease of Escherichia coli: Functional significance of cysteine residues and properties of cysteine-less transporter. Biochemistry 39, aier, M. H. Jr. (2000) functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, ambongi, Y., ko, Y., Tanabe, M., Omote, H., wamoto-kihara,., Ueda,., Yanagida, T., Wada, Y., and Futai, M. (1999) Mechanical rotation of the c subunit oligomer in TP synthase (F 0 F 1 ): direct observation. cience 286, ambrook, J., Fritisch, E. F. & Maniatis, T. (1989).Molecular Cloning: aboratory Manual, Cold pring Harbor aboratory Press, Cold pring Harbor, NY. 85. ato, Y., Zhang, Y. W., ndroutsellis-theotokis,., and Rudnick,. (2004) nalysis of transmembrane domain 2 of rat serotonin transporter by cysteine scanning mutagenesis. J. Biol. Chem. 279, enior,. E. (1983). econdary and tertiary structure of membrane proteins involved in proton translocation. Biochim. Biophys. cta 726, lotboom, D. J., Konings, W. N., and olkema, J.. (2001) Cysteine-scanning mutagenesis reveals a highly amphipathic, pore-lining membrane-spanning helix in the glutamate transporter ltt. J. Biol. Chem. 276, hainskaya,., chneeberger,., pell, H. J., and Karlish,. J. (2000) Entrance port for Na + and K + ions on Na +,K + -TPase in the cytoplasmic loop between transmembrane segments M6 and M7 of the alpha subunit. Proximity of the cytoplasmic segment of the beta subunit. J. Biol. Chem. 275, mirnova,., and Kaback, H. R. (2003). mutation in the lactose permease of Escherichia coli that decreases conformational flexibility and increases protein stability. Biochemistry 42, myth, D.., Blumenfeld, O.O., and Komingsberg, W. (1964) Reactions of N-ethylmaleimide with peptides and amino acids. Biochem. J. 91, tenesh J. (1984) Experimental Biochemistry University Western Michigan 92. tern,. J., and Khorana, H.. (1989) tructure-function studies on bacteriorhodopsin X. ndividual substitutions of arginine residues by glutamine affect chromophore formation, photocycle, and proton translocation. J. Biol. Chem. 264, Teather, R. M., Muller-Hill, B., brutsch, U., ichele,., and Overath, P. (1978) mplication of the lactose carrier protein in Escherichia coli using a plasmid vector. Mol. en. enet 159,

104 94. Tsukaguchi, H., Tokui, T., Mackenzie, B., Berger, U. V., Chen, X. Z., Wang, Y., Brubaker, R. F., and Hediger, M.. (1999) family of mammalian Na + - dependent -ascorbic acid transporters. Nature 399, Unkles,. E., Rouch, D.., Wang, Y., iddiqi, M. Y., lass,. D., and Kinghorn, J. R. (2004) Two perfectly conserved arginine residues are required for substrate binding in a high-affinity nitrate transporter. Proc. Natl. cad. ci. U 101, Valdés, R., iu, W., Ullman, B. and andfear, M.. (2006) Comprehensive examination of charged intramembrane residues in a nucleoside transporter. J. Biol. Chem. 281, Venkatesan, P., and Kaback, H. R. (1998) The substrate-binding site in the lactose permease of Escherichia coli. Proc. Natl. cad. ci. U 95, Vlanti,., millis,., Koukaki, M., and Diallinas,. (2006) novel-type substrate-selectivity filter and ER-exit determinants in the Uap purine transporter. J. Mol. Biol. 357, von Heijne,. (1999) Day in the life of Dr K. or How learned to stop worrying and love ysozyme: a tragedy in six acts. J. Mol. Biol. 293, Wallace., J., Candlish D., and de Koning H. P. (2002) Different substrate recognition motifs of human and trypanosome nucleobase transporters. elective uptake of purine antimetabolites. J Biol. Chem. 277, Willins, D.., Kessler, M., Walker,.., Reyes,. R., and Cottarel,. (2002) enomics strategies for antifungal drug discovery from gene discovery to compound screening. Curr. Pharmacol. Design 8, Wu, J., and Kaback, H.R. (1994) Cysteine 148 in the lactose permease of Escherichia coli is a component of a substrate binding site. 2. ite-directed fluorescence studies. Biochemistry 33, Wu, J, and Kaback, H. R. (1996) general method for determining helix packing in membrane proteins in situ: helices and are close to helix V in the lactose permease of Escherichia coli. Proc. Natl. cad. ci. U 93, Wu, J., Frillingos,., Voss, J., and Kaback, H. R. (1994) igand-induced conformational changes in the lactose permease of Escherichia coli: evidence for two binding sites. Protein cience 3, Wu, J., Frillingos,., and Kaback, H. R. (1995) Dynamics of lactose permease of Escherichia coli determined by site-directed chemical labeling and fluorescence spectroscopy. Biochemistry 34, Xi, H., chneider, B.., and Reitzer,. (2000) Purine catabolism in Escherichia coli and function of xanthine dehydrogenase in purine salvage. J. Bacteriol. 182,

105 107. Yagur-Kroll,., and mster-choder, O. (2005) Dynamic membrane topology of the Escherichia coli beta-glucoside transporter BgF. J. Biol. Chem. 280, Yamashita,., ingh,. K., Kawate, T., Jin, Y., and ouaux, E. (2005) Crystal structure of a bacterial homologue of Na + /Cl dependent neurotransmitter transporters. Nature 437, Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., and ouaux, E. (2004) tructure of glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature 431, Zalkin, H., Nygaard, P. (1996). Biosynthesis of purine nucleosides. n: Neidhardt F.C. et al. editors. Escherichia coli and almonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. 2 nd edn. Washington, DC: merican ociety for Microbiology, Zhang, Y. W., and Rudnick,. (2005) erotonin transporter mutations associated with obsessive- compulsive disorder and phosphorylation alter binding affinity for inhibitors. Neuropharmacology 49, Zomot E., Zhou Y., and Kanner. (2005) Proximity of transmembrane domains 1 and 3 of the γ-aminobutyric acid transporter T-1 inferred from paired Cysteine mutagenesis. J. Biol. Chem. 280, Zomot, E., Bendahan,., Quick, M., Zhao, Y., Javitch, J.., Kanner, B.. (2007) Mechanism of chloride interaction with neurotransmitter:sodium symporters. Nature 449, Γκουντέλα, Σ. (2006) Μόρια-κλειδιά στην συστηµατική αντιµετώπιση της Candida ablicans: µεταφορείς πουρινών. ιδακτορική ιατριβή, Πανεπιστήµιο Αθηνών 115. Θεοδώρου, Ι. Λ. (2006) Μελέτες επί του µηχανισµού δράσης κυστεϊνοπρωτεϊασών. ιατριβή µεταπτυχιακής ειδίκευσης, Τµήµα Χηµείας Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων 116. Καρατζά, Π. (2006) Ανάπτυξη ενός πρότυπου βακτηριακού συστήµατος για τη µελέτη των σχέσεων δοµής λειτουργίας στους µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού (NT Transporters) ιδακτορική ιατριβή, Εργαστήριο Βιολογικής Χηµειας Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων 117. Πάνος, Π. (2005) Συστηµατική ανάλυση του «µοτίβου» υπογραφή της οικογένειας µεταφορέων NT/NC2. ιατριβή µεταπτυχιακής ειδίκευσης, Εργαστήριο Βιολογικής Χηµειας Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων 118. Παπακώστας, Κ. (2006) Ο ρόλος του TM12 στους µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού. Πτυχιακή εργασία, Εργαστήριο Βιολογικής Χηµειας Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων

106 - 96 -

107 Παραρτήµατα

108 - 98 -

109 Παράρτηµα Ι Όταν απουσιάζουν τρισδιάστατες δοµές υψηλής ευκρίνειας, σηµαντικό για την ανάλυση των µεµβρανικών πρωτεϊνών είναι ένα κατά το δυνατόν ακριβέστερο τοπολογικό µοντέλο. Ένα τοπολογικό µοντέλο περιγράφει τον αριθµό των διαµεµβρανικών τµηµάτων και τα όρια της πρωτεΐνης σε σχέση µε την λιπιδιακή διπλοστοιβάδα, βασιζόµενο σε in silico πρόβλεψη από την αλληλουχία αµινοξέων της πρωτεΐνης και σε κατάλληλες πειραµατικές προσεγγίσεις (Melen et al., 2003). Εξετάσαµε την πιθανή παρουσία ιοντιζόµενων διαµεµβρανικών καταλοίπων αµινοξέων (sp, lu, ys, rg, His) στην διαπεράση YgfO συνδυάζοντας (α) θεωρητικές τοπολογικές προβλέψεις και (β) πειραµατικές παρατηρήσεις. (α) in silico πρόβλεψη της τοπολογικής οργάνωσης Χρησιµοποιήσαµε βάσεις δεδοµένων που χρησιµοποιούν µία σειρά από διαφορετικούς προγνωστικούς αλγορίθµους (TMHMM, HMM-TM, PRED- C, TMPRED, OU, D) και δίνουν το πιθανό τοπολογικό µοντέλο της πρωτεϊνης YgfO βάσει της προβλεπόµενης τοπολογικής της οργάνωσης σε διαµεµβρανικά τµήµατα (TMs). P P F H Q V HT V HT MPVF MPVF PTV PTV V E Q TW 56 MM V V N Q R TTY TTY M K VY VY Q Q FNV FNV VF VF MVT MVT D F VV F VFV M E E H F Α)Data base: TMHMM R R V T Y P P T F VV F VFV M F K V MVV V MVV K K V V FD FD F T Y N E P Q R R E E V Y M Q T R P T K D R R FNCC VV V V H M R N P N M VC Y C FDVM T P H EV EV V V TY TY VV VV HQF HQF F Y K F P FF FF DV V 323 V V P FTT FF FPM VMV RT T P T YV R Q N N V N K T V R Q M R E T V OUT DV V V V V TM TM FM FM M M TR N T C VENP YV P V K F Y D E P T

110 P P F H Q V HT VF VMP PT V Q WQ T Y V R N V M M 58 YV YV VQ FN TVF MV 104 T T E E E M H K D F Β)Data base: HMM-TM 117 R R V T Y P P T F VV F FV V M N V V MVV MVV K K V V V Y D Y E Q P E R E Q Q N K F T F N T K P T V R V V R P P Q T T V D M E M R V P T R Y C N R T R V V K V M T P C V D V N C R E N FN VV V V YEH C YV C FDVM EV V Y VT QFV FFH RVY RVY T T VMV VMV 358 PF M F D N F F F M F T R T T Y V N K P F F P P K H T P T R M MF 371 MT OUT Γ)Data base: OU P P F H Q 26 V V HT HT VF VF VMP VMP PT PT V Y V R QVN TW MM YV ETT ETT VQ FN VTVF M M K Q D H F F VV F E E R R V T Y P P T FV V M V V MVV MVV 172 K K V V FD FD 188 N PR CCR FN VV V V M C YV MC FDV 299 Q M V N N T V Q R F Y PTT PTT V V VV VV D D V V 361 TRV MV V F MP TFF K F H M Q T E Y R R Y E N E P N Q R P K P R M E V F V T V D T T T V V F P Q Y T H P F F F H K Y F V TN R FM MTM 368 K R R TE TE TV TV V V PDY KF FE P OUT N T C NP VVE Y

111 )Data base: TMpred P P F H Q V HT 25 V HT F F MPV MPV PTV PTV V V Q Y T T E QVN TW M V Y R VM VM 104 VQ FFN MVTV P Y R F 134 VV F VFV 116 M R V VTP VV M K T V M T V T R R D P Q E E Y V Q R E M K R V Y N P P CCR CCR FN FN VV VV V V V V C YV C VM Y VT FV FV Y VT FHQ FHQ FF D H D Y P E F E F E K T M Y M F T H R K N P F F F N H D K T F P T P Q N N V M Q DV DV V V 317 V T 361 VMV T Y V R R V T P FFT M FP 345 V TM FM M E R R R K T N OUT Y P V K V F E N YDPE V T 397 TV CP T N 450 YP R Q E N V P T E E M D Ε)Data base: D P P F H Q 26 V V HT HT VF VMP PT 48 VF VMP PT V Q 61 Y T T E NRY WQV T M VM Q V V 81 N VM 94 VFF MVT R R V Y T P P F VV VT VT F FV V VT VT VV VV M M R R P V M Q N T E E T Y P Q R D R C R K M V C V P E N D 305 F VV V V C Ι YV M Q P D V M M F H D T K F F H E F T F F D E Y F E N Y F H M Q K R F N K F T N P N H P V M P Q T VK C V V Y Y VT VT FV FV 315 V V V V 342 R V Y R V T FFTT PM F MV TV 366 V V TM 387 FM M R V T N T K E R R Y V V P E N K P F C E P D OUT VY 401 T T T N 449 N P Y R N E Q V P T E E M D

112 ΣΤ)Data base: PRED-C P P F H Q 24 V V HT HT MPVF MPVF PTV PTV V Q V RY RY QVN TW TW MM MM YV ETT ETT VQ FFN MVTV R PY F VV F FV V TVR TVR VTP VTP VV VV M M K K V V N CCR FN VV V V YEH RP M C YV C N D D F F M F M K T M D R E F N F E H K P Q P E R E Y R Q V R M K T V T D D VM V VE VE Y Y VT VT QFV FFH FFH T QFV YF YF K F P H P 323 V V V TP FT OUT TP V 369 FFT M M PM F MV TV YVR M FMT Q R R N N V Q M V T N N M K R R E FMT MF MF V T T C ENP V YV 442 P F K E P D Y V T Εικόνα Π.1: Σχεδιαγραµµατική απεικόνιση του πιθανού τοπολογικού µοντέλου του µεταφορέα YgfO σύµφωνα µε την βάση δεδοµένων ανάλυσης τοπολογικών µοντέλων διαµεµβρανικών πρωτεϊνών: Α)TMHMM ( Β)HMM-TM ( Γ)OU ( frameo.html ) )TMPRED ( TMPRED_form.html) Ε)D ( ΣΤ)PRED-C ( Με ορθογώνια απεικονίζονται τα διαµεµβρανικά τµήµατα της πρωτεΐνης, µε κόκκινα βέλη σηµειώνονται τα διαµεµβρανικά φορτισµένα κατάλοιπα, που τονίζονται µε κόκκινο, ενώ µε µωβ χρώµα σηµειώνονται τα κατάλοιπα κυστεϊνών και η περιοχή του ΝΑΤ «µοτίβου»(βλ. Εισαγωγή, Κεφ.1.3)

113 Συγκεκριµένα, µας ενδιέφερε ο εντοπισµός των φορτισµένων αµινοξέων, που η κάθε βάση προβλέπει ως διαµεµβρανικά κατάλοιπα, η σύγκριση µεταξύ τους και ο καθορισµός κοινών αποτελεσµάτων. Η ανάλυση αυτή συνοψίζεται στο σχήµα της Εικόνας Π.2: Εικόνα Π.2: Σχηµατική απεικόνιση των δυνητικά ιοντιζόµενων διαµεµβρανικών καταλοίπων από 6 διαφορετικά µοντέλα τοπολογικής πρόβλεψης (TMHMM, HMM-TM, PRED-C, TMPRED, OU, D). Με ορθογώνια συµβολίζονται τα διαµεµβρανικά τµήµατα, ενώ το κάθε διαµεµβρανικό κατάλοιπο συµβολίζεται µε το αντίστοιχο χρώµα. Αριστερά σηµειώνεται το όνοµα του αλγορίθµου που χρησιµοποιήθηκε. Με γκρι σηµειώνεται η πιθανή παρουσία µιας ακόµη αµφιπαθούς περιοχής α-έλικας µεταξύ TM8 και TM9 Από το παραπάνω σχήµα προκύπτει πως και οι έξι βάσεις δεδοµένων συµφωνούν απόλυτα πως τα κατάλοιπα H31, K164 και R385 είναι διαµεµβρανικά, τα κατάλοιπα E186, H187, D232 και E429, υποδεικνύονται από πέντε αλγορίθµους, τα Ε55, H257,E272 και D304 από τέσσερις, το R205 από τρεις, τα D169, R210, R337, R341 και Ε415 από δύο και τέλος τα R78, R144, D413, K249 και Κ418 από µία. Επίσης, ο αριθµός των πιθανών διαµεµβρανικών τµηµάτων που δίνουν οι βάσεις δεδοµένων διαφέρει: τρεις από τις βάσεις (TMHMM, OU, PRED-C) υπολογίζουν 12 διαµεµβρανικά τµήµατα, δύο (TMPRED,D) δίνουν 13 διαµεµβρανικά τµήµατα και µία (HMM-TM) καταλήγει σε 10 διαµεµβρανικά τµήµατα

114 Συγκριτική ανάλυση των µελών της οικογένειας NT/NC2: Χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα ΤΜΗΜΜ αναλύθηκαν όλοι οι λειτουργικά χαρακτηρισµένοι µεταφορείς της οικογένειας NT/NC2 ως προς την τοπολογία τους και διαπιστώθηκε ότι στις περισσότερες περιπτώσεις το τοπολογικό µοντέλο προβλέπει 12 διαµεµβρανικά τµήµατα α-ελίκων (Karatza et al., 2006), γεγονός που αντικρούει τα µοντέλα των 10 και 13 διαµεµβρανικών τµηµάτων των αλγορίθµων TMPRED, D και HMM-TM (Εικόνα 1, 1Ε και 1Β). Ωστόσο, η in silico αυτή ανάλυση δεν είναι σαφής για την τοπολογία του C-τελικού ηµίσεος και ιδιαίτερα των ελίκων

115 (β) πειραµατικές παρατηρήσεις Η θέση του καρβοξυτελικού άκρου: Η τοπολογική προσέγγιση µπορεί να βελτιωθεί σηµαντικά όταν συνδυασθεί µε πειραµατικά δεδοµένα, όπως δεδοµένα για την θέση του C-τελικού άκρου. Συγκεκριµένα, στις µεµβρανικές πρωτεΐνες της E. coli, πειραµατικές ενδείξεις µπορούν να προκύψουν ευκολότερα µέσω της χρήσης τοπολογικών πρωτεϊνικών δεικτών (topology reporter proteins) όπως είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (FP) και η αλκαλική φωσφατάση (Pho): η πρώτη (FP) παίρνει την σωστή διαµόρφωση και φθορίζει µόνο όταν βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα (Feilmeier et al., 2000) και η δεύτερη (Pho) είναι ενεργός µόνο όταν βρίσκεται στο περίπλασµα (Beckwith and Manoil, 1986). Έτσι, µετά από πειράµατα σήµανσης του C-τελικού άκρου του µεταφορέα YgfO µε την FP, που έγιναν για πρώτη φορά από την οµάδα του von Heijne (ranseth et al., 2005) στα πλαίσια µιας σφαιρικής τοπολογικής ανάλυσης του πρωτεώµατος της εσωτερικής µεµβράνης της E. coli K-12 (Daley et al., 2005), βρέθηκε ότι ο σηµασµένος µεταφορέας εκφράζεται στην µεµβράνη και φθορίζει, άρα έχει το C-τελικό άκρο του διευθετηµένο προς το κυτταρόπλασµα. Εξάλλου, αποτελέσµατα του εργαστηρίου µας δείχνουν ότι µετά από σήµανση του C- τελικού άκρου µε FP, ο µεταφορέας YgfO διατηρεί πλήρη ενεργότητα, εκφράζεται στη µεµβράνη σε υψηλά επίπεδα και φθορίζει in vivo, επιβεβαιώνοντας τo παραπάνω συµπέρασµα (Karatza and Frillingos, 2005, Mermelekas, eorgopoulou, Karatza, and Frillingos, unpublished). Εποµένως, θεωρούµε ότι το C-τελικό άκρο βρίσκεται προς το κυτταρόπλασµα, κάτι που έρχεται σε αντίθεση µε τα µοντέλα που δίνουν οι βάσεις TMPRED και D (Εικόνα 1 και 1Ε). Τοπολογία των διαµεµβρανικών τµηµάτων 8-12: Κατασκευάστηκαν διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης σε θέσεις που πιθανολογείται ότι βρίσκονται σε υδροφιλικές θηλειές ανάµεσα στο 8 ο και στο 12 ο διαµεµβρανικό τµήµα (295C, 319C, M331C,366C, R394C, 419C) και ο λειτουργικός έλεγχος έδειξε ότι τα µεταλλάγµατα αυτά είναι ενεργά ως προς την πρόσληψη υποστρώµατος και εκφράζονται κανονικά στην µεµβράνη. Στην συνέχεια ο έλεγχος της προσβασιµότητας του υδρόφιλου αντιδραστηρίου MTE - στα κυστεϊνικα αυτά µεταλλάγµατα (ubstituted Cysteine ccessibility Method, CM) (kabas & Karlin, 1992) από την περιπλασµατική πλευρά της µεµβράνης έδειξε ένα µοτίβο εναλλασσόµενης προσβασιµότητας του αντιδραστηρίου στις θέσεις αυτές, που συµφωνεί µε το µοντέλο της Εικόνας Π.3. Παρόµοιος έλεγχος προσβασιµότητας έγινε και σε µεµβρανικά κλάσµατα και επιβεβαίωσε την πρόσβαση του υδρόφιλου αντιδραστηρίου από τον εξωµεµβρανικό χώρο και κατ επέκταση τον εντοπισµό των αντίστοιχων καταλοίπων σε υδρόφιλες θηλειές που βλέπουν είτε προς τον κυτταροπλασµατικό (295C, 319C, M331C, R394C) είτε προς τον περιπλασµατικό χώρο (366C, 419C) (Mermelekas et al., in preparation)

116 Εικόνα Π.3: Επικρατέστερη τοπολογική οργάνωση των διαµεµβρανικών τµηµάτων 8-12 του µεταφορέα YgfO, βάσει των πειραµάτων CM (βλ. κείµενο) Επιπλέον πιθανό διαµεµβρανικό τµήµα: Εκτός των 12 TMs, χαρακτηριστική είναι η πιθανή παρουσία µιας ακόµη αµφιπαθούς περιοχής α- έλικας µεταξύ TM8 και TM9 (όπου ανήκει και η D304), αµέσως πριν από την συντηρηµένη ακολουθία των καταλοίπων (NT motif) και την ακολουθία που υποστηρίζεται πειραµατικά ότι έχει δοµή α-έλικας (Karatza et al., 2006) και αποτελεί µέρος του TM