Χαρτογράφηση καταλοίπων σηµαντικών για την εξειδίκευση στους µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ - ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ Χαρτογράφηση καταλοίπων σηµαντικών για την εξειδίκευση στους µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού ΚΑΛΛΗΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2009

2 2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ - ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ Χαρτογράφηση καταλοίπων σηµαντικών για την εξειδίκευση στους µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού ΚΑΛΛΗΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΦΡΙΛΙΓΓΟΣ ΕΥΣΤΑΘΙΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Βιολογικής Χηµείας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ

4 4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία µεταπτυχιακής ειδίκευσης εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χηµείας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων στα πλαίσια του ιατµηµατικού Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών στην «Βιοτεχνολογία». Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη ΕΠ της συντονιστικής επιτροπής, που µου παρείχαν τη δυνατότητα να συµµετάσχω σε αυτό το πρόγραµµα και τους διδάσκοντες του προγράµµατος, για τις επιστηµονικές γνώσεις που µου παρείχαν. Ιδιαίτερα σηµαντική όµως ήταν και η συνδροµή του επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ευστάθιου Φριλίγγου, αφ ενός για την επιλογή του προς το πρόσωπό µου, αφ ετέρου για την άρτια καθοδήγησή του. Μέσω της αδιάκοπης του προσπάθειας και των γνώσεών του µου έδωσε τη δυνατότητα να διευρύνω τους επιστηµονικούς µου ορίζοντες. Καταλυτικό ρόλο βέβαια διαδραµάτισαν και τα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου δηµιουργώντας απόλυτα φιλικό περιβάλλον εργασίας. Ειδικότερα, ευχαριστώ τους υποψήφιους διδάκτορες Γεώργιο Μερµελέκα, Κωνσταντίνο Παπακώστα και Αικατερίνη Καρενά για τις πολύτιµες συµβουλές τους κατά την εφαρµογή των πειραµατικών τεχνικών και για την συµβολή τους στην γρήγορη και οµαλή προσαρµογή µου στο εργαστήριο. Θέλω, επίσης, να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Αικατερίνη Γεωργοπούλου, που µε βοήθησε στα πρώτα µου εργαστηριακά βήµατα και στην κατανόηση των επιστηµονικών τεχνικών. εν θα έπρεπε να λησµονήσω βέβαια τους γονείς µου, οι οποίοι µέσω δικών τους αγώνων και προσπαθειών µου έδωσαν τη δυνατότητα να δηλώσω συµµετοχή σε αυτό το µεταπτυχιακό πρόγραµµα. Η στήριξή τους σε στιγµές δύσκολες διαδραµάτισε καταλυτικό ρόλο στην ολοκλήρωση της µεταπτυχιακής εργασίας µου. Αυτοί µε έµαθαν να αγωνίζοµαι µε υποµονή και πείσµα για την εκπλήρωση των στόχων µου. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω τα αδέρφια µου για την υποµονή και την πολύτιµη υποστήριξή τους κατά τη διάρκεια των προ- και µεταπτυχιακών µου σπουδών. 5

6 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείµενο της µελέτης µας, αποτέλεσε ο µεταφορέαςygfo του βακτηρίου Escherichia coli, ένας συµµεταφορέας ξανθίνης:η +. Ο µεταφορέας αυτός ανήκει στην οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού NAT/NCS2, η οποία µε τη σειρά της αποτελεί την µεγαλύτερη και πιο συντηρηµένη εξελικτικά οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων. Περιλαµβάνει περισσότερα από 500 µέλη από όλα σχεδόν τα είδη οργανισµών (Gram-θετικά και Gram-αρνητικά βακτήρια, αρχαία, µύκητες, φυτά και θηλαστικά, εξαιρουµένων µόνο ορισµένων παρασιτικών πρωτοζώων, ζυµοµυκήτων και ενδοπαρασιτικών βακτηρίων). Πολύ λίγα όµως µέλη της έχουν κλωνοποιηθεί και µελετηθεί σε γενετικό και µοριακό επίπεδο ως σήµερα. Ειδικότερα, επικεντρωθήκαµε στην συστηµατική ανάλυση µιας αλληλουχίας 45 καταλοίπων του YgfO, γειτονικής προς την περιοχή ενός χαρακτηριστικού µοτίβου-«υπογραφή» της οικογένειας ΝΑΤ/NCS2 (NAT-signature motif), από Υ266 έως και V314 (εκτός των Ε272, S284, S295 και D304 που είχαν αποτελέσει αντικείµενο προηγούµενων µελετών) µε τη χρήση της µεθοδολογίας µεταλλαξιγένεσης σάρωσης κυστεϊνών. Βασιστήκαµε σε µια εναλλακτική και λειτουργική µορφή του ΥgfO, στην οποία οι πέντε εγγενείς Cys είχαν αντικατασταθεί από Ser (YgfO-Cys-less) και προχωρήσαµε σε αλλαγή όλων των αµινοξέων της αλληλουχίας , ενός προς ένα, µε Cys και λειτουργική ανάλυση των αντίστοιχων µεταλλαγµάτων κυστεϊνών (single-cys mutants). Ελέγχοντας την ενεργότητα µεταφοράς ξανθίνης και τα επίπεδα έκφρασης του µεταφορέα στην µεµβράνη, διαπιστώσαµε ότι η αντικατάσταση µε Cys σε πέντε θέσεις καταλοίπων (Τ278, Α279, Τ280, Α281 και G305) οδηγεί σε ελάχιστα ή µηδενικά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη, ενώ σε δύο άλλες θέσεις καταλοίπων (D276 και G299) οδηγεί σε υψηλά επίπεδα έκφρασης αλλά µηδενική ενεργότητα. Περαιτέρω µεταλλαξιγένεση των θέσεων G299 και G305 σε φυσικού τύπου υπόστρωµα, αποκάλυψε ότι η αντικατάσταση της Gly305 οδηγεί συστηµατικά σε χαµηλά (Ala) ή µηδενικά (Pro, Cys) επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη και αντίστοιχα µειωµένη ενεργότητα. Επιπρόσθετα, πειράµατα αναστολής της ενεργότητας µε χρήση του ΝΕΜ (Ναιθυλοµηλεϊµίδιο, ειδικό έναντι των σουλφυδρυλοµάδων των Cys αντιδραστήριο) αποκάλυψαν ότι δύο µεταλλάγµατα, τα Α273C και G275C, είναι ευαίσθητα σε απενεργοποίηση από NEM. Η περιοχή της αλληλουχίας εντοπίζεται ανοδικά µιας σηµαντικής περιοχής του µεταφορέα ( , ΝΑΤ motif), που έχει προταθεί ότι συµµετέχει στο µονοπάτι µεταφοράς υποστρώµατος και στον καθορισµό της εξειδίκευσης αναγνώρισης πουρινών, του µεταφορέα ξανθίνης YgfO αλλά και του µεταφορέα ουρικού/ξανθίνης UapA του ασκοµύκητα Aspergillus nidulans. Επιπρόσθετα, από άλλα πειράµατα της εργαστηριακής µας οµάδας (Αικατερίνη Καρενά, εργασία Μ Ε) γνωρίζουµε ότι η περιοχή περιέχει και δύο αναντικατάστατα κατάλοιπα, τα Glu272 και Asp304. Τα παραπάνω αποτελέσµατα θα µπορέσουν να αποτελέσουν τη βάση για συστηµατικότερη µελέτη αυτής της περιοχής, µε στόχο την εξονυχιστικότερη ανάλυση των σχέσεων δοµής λειτουργίας των µεταφορέων της οικογένειας NAT/NCS2. 7

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Κεφάλαιο 1 ο : Εισαγωγή ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς Η οικογένεια µεταφορέων NAT/NCS Μεταφορείς πουρινών του εντεροβακτηρίου Escherichia coli Ο µεταφορέας YgfO Το µοτίβο υπογραφή Οι στόχοι της παρούσας εργασίας ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο :Υλικά και µέθοδοι Όργανα Χηµικά Αναλώσιµα Πλασµίδια και κυτταρικά στελέχη Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης δυο σταδίων (overlap/extension PCR) Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA (περιοριστική πέψη-ανασύνδεση) Επιδεκτικά κύτταρα Μετασχηµατισµός κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DNA Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport Assay) Αλκυλίωση των σουλφυδρυλικών οµάδων των κυστεϊνών µε τo NEM Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) 24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο :Αποτελέσµατα Μεταλλαξιγένεση σάρωσης κυστεϊνών των καταλοίπων Υ266 - V314 της διαπεράσης YgfO Έκφραση των single-cys YgfOs Ενεργότητα των single-cys YgfOs Μεταλλαξιγένεση καταλοίπων στο φυσικού τύπου υπόστρωµα Ευρύτερη µεταλλαξιγένεση του καταλοίπου Gly Επίδραση αλκυλιωτικών αντιδραστηρίων στην ενεργότητα διαπερασών Επίδραση του ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο : Συζήτηση Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία

10 10

11 Συντµήσεις ATP (adenosine triphosphate) = τριφωσφορική αδενοσίνη Avidin- HRP = σύζευγµα αβιδίνης - υπεροξειδάσης C-less (Cys-less) = διαπεράση χωρίς κατάλοιπα κυστεϊνών BAD (biotin acceptor domain) = περιοχή δέσµευσης βιοτίνης BSA (Bovine Serum Albumin) = Αλβουµίνη ορού βοός DMSO (dimethyl sulfoxide) = διµεθυλο - σουλφοξείδιο DTT (dithiothreitol) = διθειοθρεϊτόλη EDTA = ethylene dinitrolotetra-acetic acid E.coli = εντεροβακτήριο Escherichia coli IPTG (isopropyl-β-d-thiogalactoside) = ισοπροπυλ-β-d-θειογαλακτοσίδιο LacY- epitope = επίτοπος LacY αλληλουχία του καρβοξυτελικού δωδεκαπεπτιδίου της διαπεράσης λακτόζης LacY lacz p/o (promoter/operator) = υποκινητής/χειριστής του οπερονίου της λακτόζης LB = θρεπτικό υλικό Luria Bertani ή Luria Broth NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter) = οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού NCS2 (Nucleobase-Cation Symporter-2) = οικογένεια-2 συµµεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων κατιόντων ΝΕΜ (N-ethylmaleimide) = Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο PCR (polymerase chain reaction) = αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης ph= ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθµος της συγκέντρωσης των ιόντων υδροξωνίου [Η 3 Ο + ] ενός διαλύµατος PMS (phenazinemethosulphate) = µεθοσουλφονικό φαιναζίνιο PVDF (polyvinylidene difluoride) = διφθοριούχο πολύ-βινυλιδένιο SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) = ηλεκτροφόρηση επί πήγµατος πολυακρυλαµιδίου-δωδεκυλoθειϊκού νατρίου TC system (Transport Commision system) = διεθνές σύστηµα φυλογενετικήςλειτουργικής ταξινόµησης και ονοµατολογίας των πρωτεΐνών µεταφοράς TMS (transmembrane segment) = διαµεµβρανικό τµήµα wt (wild-type) = φυσικού τύπου 11

12 12

13 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13

14 14

15 1.1 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς Οι βιολογικές µεµβράνες αποτελούν αναπόσπαστο κοµµάτι της ζωής. Προσδίδουν στα κύτταρα την ατοµικότητά τους, λειτουργούν ως φραγµοί µε επιλεκτική διαπερατότητα, ρυθµίζοντας την µοριακή και ιοντική ενδοκυτταρική σύσταση και ελέγχουν τη ροή πληροφοριών µεταξύ των κυττάρων και του περιβάλλοντός τους. Αποτελούνται κυρίως από λιπίδια και πρωτεΐνες. Τα µεν λιπίδια σχηµατίζουν ένα φραγµό διαπερατότητας καθορίζοντας τα διάφορα διαµερίσµατα, οι δε πρωτεΐνες λειτουργούν ως αντλίες, µεταφορείς ή κανάλια (δίαυλοι) µικροµορίων ή ιόντων, υποδοχείς σε πορείες µεταγωγής σηµάτων ή ένζυµα σε µηχανισµούς όπως η αναπνευστική αλυσίδα και η οξειδωτική φωσφορυλίωση. Από την συστηµατική ανάλυση των γονιδιωµάτων τόσο των ευκαρυωτικών όσο και των προκαρυωτικών οργανισµών προκύπτει ότι, κατά µέσο όρο, 30% του συνόλου των γονιδιακών προϊόντων είναι µεµβρανικές πρωτεΐνες. Από τις πρωτεΐνες αυτές, το µεγαλύτερο µέρος (5-15% του συνόλου των γονιδιακών προϊόντων, ανάλογα µε το είδος οργανισµού) είναι πρωτεΐνες διαµεµβρανικής µεταφοράς (Ren et al., 2004) ( Πολλοί διαφορετικοί εξειδικευµένοι διαµεµβρανικοί µεταφορείς εξυπηρετούν την ανάγκη πρόσληψης και ανακατανοµής στον οργανισµό µορίων όπως σάκχαρα, αµινοξέα, νουκλεοτιδικές βάσεις, ιόντα, ορµόνες, νευροδιαβιβαστές,εξασφαλίζοντας την αξιοποίηση των θρεπτικών πηγών άνθρακα, αζώτου,θείου, φωσφόρου (Diallinas et al., 1998, Abramson et al., 2003), τη ρύθµιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης µεταβολιτών (Lemieux et al., 2004, Yernool et al., 2004), τη ρύθµιση των µηχανισµών µεταγωγής σήµατος και του κύκλου λειτουργίας των νευροδιαβιβαστών, των ορµονών και άλλων διακυτταρικών σηµάτων (Yamashita et al., 2005), την αποµάκρυνση φαρµάκων, αντιβιοτικών, αντιϊϊκών παραγόντων και τοξινών (Murakami and Yamaguchi, 2003) και την ανακατανοµή αντιοξειδωτικών ουσιών (ασκορβικό και ουρικό οξύ) (Tsukaguchi et al., 1999, Diallinas et al., 1998). Οι µεµβρανικές πρωτεΐνες διακρίνονται σε ενσωµατωµένες (integral) και περιφερικές ή εξωµεµβρανικές (peripheral) και καταλύουν λειτουργίες όπως: (α) µεταγωγή σήµατος, (β) ενζυµική δράση, (γ) µεταφορά ουσιών από και προς το ενδοκυτταρικό περιβάλλον. Με τη σειρά τους οι πρωτεΐνες µεταφοράς, είτε σχηµατίζουν διαύλους διαµέσου των οποίων επιτελείται µεταφορά ουσιών από την µεγαλύτερη προς την µικρότερη συγκέντρωση χωρίς κατανάλωση ενέργειας, είτε επιτελούν ενεργό µεταφορά. Στην τελευταία περίπτωση µετακινούνται µόρια αντίθετα προς την ηλεκτροχηµική βαθµίδωση µέσω δέσµευσης και υδρόλυσης ΑΤΡ ή επιτελείται συµµεταφορά ή αντιµεταφορά πρωτονίων ή ιόντων (Εικόνες 1, 2). 15

16 Εικόνα 1. Είδη µεµβρανικών πρωτεϊνών µεταφοράς: (Α) πρωτεΐνες µεταφορείς και (Β) δίαυλοι ιόντων. Εικόνα 2. Είδη πρωτεϊνών-µεταφορέων (carrier proteins): οι πρωτεΐνες µεταφορείς (carrier proteins) διακρίνονται σε µονοµεταφορείς (uniporters) (καταλύουν τη µεταφορά µόνο ενός είδους µορίων), συµµεταφορείς (symporters) (δύο ειδών προς την ίδια κατεύθυνση) και αντιµεταφορείς (antiporters) (δύο ειδών προς αντίθετη κατεύθυνση). Ένας από τους στόχους στον τοµέα της έρευνας των βιολογικών µεµβρανών είναι και ο προσδιορισµός της δοµής των µεµβρανικών πρωτεϊνών. Η ευελιξία στερεοδιάταξης όµως, τα χαµηλά επίπεδα έκφρασης και η µεγάλη υδροφοβικότητά τους καθιστά δύσκολη την αποκάλυψη της δοµής και λειτουργίας τους. Σε χαµηλή δοµική ευκρίνεια, πληροφορίες µπορούν να µας παρέχουν τεχνικές όπως η in vitro 16

17 µεταλλαξιγένεση και η µεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής σάρωσης (Cys-scanning mutagenesis). Ενδεικτικά, παραδείγµατα εφαρµογής αυτής της τεχνικής συναντούµε στον µεταφορέα της λακτόζης LacY της E. coli (Frillingos et al., 1998, Kaback et al., 2001, Kaback et al., 2007), τον µεταφορέα τετρακυκλίνης TetA του E. coli (Tamura et al., 2001), τον µεταφορέα τοξινών MdfA της E. coli (Bibi et al., 2004), µεταφορείς νευροδιαβιβαστών όπως της σεροτονίνης (Rudnick, 2006), του γλουταµικού (Kanner, 2006) ή της ντοπαµίνης (Gether et al., 2006), και πολλές άλλες πρωτεϊνες ενεργού διαµεµβρανικής µεταφοράς. Ακολούθως, οι πληροφορίες αυτές µπορούν να ελεγχθούν µέσω κρυσταλλογραφίας, σε υψηλή ευκρίνεια (Abramson et al., 2003, Mizra et al., 2006, Yernool et al., 2004, Yamashita et al., 2005, Forrest et al., 2008). Με τη σύγχρονη εξέλιξη των κρυσταλλογραφικών και άλλων αναλυτικών βιοφυσικών µεθόδων και των γονιδιωµατικών - πρωτεωµικών προσεγγίσεων, οι µεµβρανικές αυτές πρωτεΐνες έχουν αρχίσει να ενδίδουν σε λεπτοµερείς αναλύσεις της δοµής και του µηχανισµού λειτουργίας τους. 1.2 Η οικογένεια µεταφορέων ΝΑΤ/ΝCS2 Η µεταφορά των πουρινών και πυριµιδινών είναι διαδικασία µεγάλης βιολογικής σηµασίας τόσο για τους προκαρυωτικούς όσο και για τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Συµµετέχουν σε διεργασίες όπως είναι η σύνθεση των νουκλεϊκών οξέων, η αντιγραφή του γονιδιώµατος και η µεταγραφή των γενετικών πληροφοριών σε RNA. Πέραν της φυσιολογικής τους σηµασίας στους διάφορους οργανισµούς, η µελέτη των νουκλεοτιδικών βάσεων είναι ιδιαίτερα σηµαντική εξαιτίας του γεγονότος ότι πολλά δοµικά ανάλογα τους χρησιµοποιούνται εκτενώς ως αντιµικροβιακά, αντιϊκά και αντικαρκινικά φάρµακα. Η 5-φθοροουρακίλη (5-fluorouracil, 5-FU), είναι ένα από τα πιο συνηθισµένα αντικαρκινικά φάρµακα, η οποία αναστέλλει τα ένζυµα που απαιτούνται για τη σύνθεση των πυριµιδινών µε συνέπεια την παρεµποδιση της σύνθεσης DNA. Η αλλοπουρινόλη (4-υδροξυπυραζολο-3,4-d-πυριµιδίνη) χρησιµοποιείται ως αντιµικροβιακό φάρµακο, όπως και για την αντιµετώπιση της υπερουριχαιµίας. Αναστέλλει τη δράση του ενζύµου οξειδάση ξανθίνης εµποδίζοντας τη σύνθεση του ουρικού οξέος από την οξείδωση των νουκλεοτιδικών βάσεων υποξανθίνης και ξανθίνης. Μελέτες µοριακής γενετικής και φυσιολογίας απέδειξαν την ύπαρξη πολλών ειδικών συστηµάτων µεταφοράς νουκλεοτιδικών βάσεων σε βακτήρια (Andersen et al., 1995, Schultz et al., 2001, Xi et al., 2000, Karatza and Frillingos, 2005, Karatza et al., 2006) και µύκητες (Diallinas et al., 1998, Koukaki et al., 2005, Goudela et al., 2005, 2006, Parageorgiou et al., 2008). Πολύ λίγα µέλη όµως της οµάδας των µεταφορέων πουρινών και πυριµιδινών έχουν ταυτοποιηθεί µέχρι σήµερα. Οι χαρακτηρισµένοι έως σήµερα µεταφορείς και οι οµόλογες πρωτεΐνες έχουν ταξινοµηθεί σε έξι οικογένειες. Η πρώτη και πιο διαδεδοµένη οικογένεια είναι γνωστή ως οικογένεια Μεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Ασκορβικού (Nucleobase Ascorbate Transporters, NAT) (de Koning and Diallinas, 2000) ή οικογένεια-2 Συµµεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Κατιόντων (Nucleobase Cation Symporters-2, NCS2) (TC 2.A.40, Πρόκειται για την µεγαλύτερη και πιο συντηρηµένη οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων καθώς περιλαµβάνει περισσότερα από 700 µέλη από όλα σχεδόν τα είδη οργανισµών (Gram-θετικά και Gram-αρνητικά βακτήρια, αρχαία, µύκητες, φυτά και θηλαστικά, εξαιρουµένων µόνο ορισµένων παρασιτικών πρωτοζώων, ζυµοµυκήτων και ενδοπαρασιτικών βακτηρίων) (de Koning and Diallinas, 2000). Τα µέλη αυτής της 17

18 οικογένειας, τα οποία προέρχονται από µικροοργανισµούς ή φυτά, αποτελούν µεταφορείς πουρινών ή πυριµιδινών (de Koning and Diallinas, 2000) ενώ τα αντίστοιχα, που προέρχονται από θηλαστικά, είναι µεταφορείς L-ασκορβικού (Tsukaguchi et al., 1999). Ελάχιστα µέλη όµως της οικογένειας NAT/NCS2 έχουν κλωνοποιηθεί και µελετηθεί σε γενετικό και µοριακό επίπεδο ως σήµερα. Αυτά µπορούν να ταξινοµηθούν σε τρεις οµάδες ανάλογα µε το υπόστρωµα τους: (α) µεταφορείς οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνης ή/και ουρικού οξέος), (β) µεταφορείς ουρακίλης και (γ) µεταφορείς L-ασκορβικού (βιταµίνης C) που απαντώνται σε θηλαστικά. Παρά την σπουδαιότητα των µεταφορέων της οικογένειας αυτής, τα µέλη της δεν έχουν µελετηθεί συστηµατικά ως προς τη σχέση δοµής λειτουργίας. 1.3 Μεταφορείς πουρινών του εντεροβακτηρίου Ε. coli Το εργαστηριακό βακτηριακό στέλεχος της E. coli Κ-12 αν και διαθέτει σύστηµα πρόσληψης οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνη) (Κaratza and Frillingos, 2005) δεν µπορεί να αναπτυχθεί µε ουρικό, ξανθίνη, υποξανθίνη ή άλλες φυσικές πουρίνες ως µοναδική πηγή αζώτου, εξαιρουµένης της αδενίνης. Τόσο η ξανθίνη όσο και η υποξανθίνη µπορούν να δράσουν συµπληρωµατικά στην ανάπτυξη του βακτηρίου όταν προστίθενται ως επιπλέον πηγές αζώτου σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό µε βασική πηγή αζώτου το χλωριούχο αµµώνιο ή το ασπαρτικό (Xi et al., 2000). εν είναι σε θέση, συνεπώς, να παρέχουν από µόνες τους την απαιτούµενη ποσότητα αζώτου που χρειάζεται για την ανάπτυξη. Με βάση in silico αναλύσεις, διαπιστώθηκε ότι, το γονιδίωµα της E. coli K-12 φέρει 10 παράλογα (uraa, yice, ygfo, ygfu, ycdg, ybby, yjcd, yico, yieg και ygfq) της οικογένειας µεταφορέων NAT/NCS2 (Blattner et al., 1997) και προβλέφθηκε ότι µπορούν να λειτουργήσουν ως µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων (Κaratza and Frillingos, 2005). H πρωτεΐνη UraA δρα ως ειδικός µεταφορέας ουρακίλης (Andersen et al., 1995), η YcdG ως πιθανός µεταφορέας ουρακίλης, οι YicE, YgfO ως ειδικοί, υψηλής συγγένειας µεταφορείς ξανθίνης (Κaratza and Frillingos, 2005) και οι YbbY, YjcD, YicO, YieG, YgfQ ως πιθανοί µεταφορείς ξανθίνης/ουρικού ή ουρακίλης ( Πρόσφατα, τέλος, ο YgfU βρέθηκε ότι δρα ως µεταφορέας ουρικού, που µπορεί να µεταφέρει, µε χαµηλή συγγένεια, και ξανθίνη (Papakostas and Frillingos, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Oι YgfO και YicE εµφανίζουν µεγαλύτερη οµοιότητα µε τους UapA και UapC του Aspergillus nidulans καθώς και µε τον Xut1 της Candida albicans, τρεις µεταφορείς ουρικού και ξανθίνης από ασκοµύκητες, µε 30% ταυτότητα καταλοίπων, περίπου, και 70% ταυτότητα στην αλληλουχία του µοτίβου «υπογραφή» (βλ. παρακάτω, 1.5) (Goudela et al., 2005). Τα γονίδια αυτών των δύο µεταφορέων (ygfo και yice) κλωνοποιήθηκαν από το γονιδίωµα του βακτηρίου E. coli και υπερεκφράστηκαν εξωχρωµοσωµικά µέσω του υποκινητή του οπερονίου της λακτόζης (lacz p/o) (Karatza and Frillingos, 2005). ιαπιστώθηκε ότι αποτελούν πρωτεΐνες ενεργού µεταφοράς δευτερογενούς τύπου, απόλυτα εξαρτώµενες από ηλεκτροχηµική διαβάθµιση πρωτονίων. Περαιτέρω µελέτη τους αποκάλυψε υψηλή ειδίκευσή τους στη µεταφορά ξανθίνης και ότι δεν µπορούν να µεταφέρουν καθόλου υποξανθίνη, ουρακίλη ή ουρικό οξύ. Ισχυρή αναστολή της πρόσληψης ξανθίνης προκαλούν συνθετικά ανάλογα (1-, 3-, 9-µεθυλοξανθίνη, 2-, 6- θειοξανθίνη), όχι όµως αυτά που φέρουν τροποποιήσεις στις θέσεις 7 και 8 του ιµιδαζολικού δακτυλίου (όπως 7-µεθυλοξανθίνη, 8-µεθυλοξανθίνη, 7-δεαζαξανθίνη) (βλ. και Εικόνα 3, παρακάτω) (Karatza and Frillingos, 2005). 18

19 1.4 Μεταφορέας ΥgfΟ Το εργαστηριακό βακτηριακό στέλεχος E. coli Κ-12 φέρει τα YgfO και YicE, δύο συντηρηµένα µέλη της οικογένειας µεταφορέων NAT/NCS2, τα οποία εµφανίζουν 45% ταυτότητα καταλοίπων. Ο µεταφορέας YgfO είναι µια πρωτεΐνη 466 αµινοξέων µε πιθανή δοµή 12 διαµεµβρανικών τµηµάτων που φέρει το καρβοξυτελικό της άκρο προς το κυτταρόπλασµα (Granseth et al., 2005; Karatza et al., 2006). Ως µέλος της οικογένειας NAT/ΝCS2 φέρει στην κυτταροπλασµατική θηλειά 8-9, την αλληλουχία υπογραφή [Q/E/P]-N-X-GX-X-X-X-T-[R/K/G] (Diallinas et al., 1998, Meintanis et al., 2000), που αποτελεί µια εξαιρετικά συντηρηµένη περιοχή. Πειράµατα διαµεµβρανικής µεταφοράς µε [ 3 Η] ξανθίνη και πειράµατα µε πρωτονιοφόρα µόρια φανέρωσαν αφ ενός ότι µπορεί να δράσει ως ειδικός και µε µεγάλη συγγένεια µεταφορέας ξανθίνης (K m 4.8 µμ, V max 6.6 nmol.mg -1.min -1 ), αφ ετέρου ότι η µεταφορά του υποστρώµατος εξαρτάται από τη συµµεταφορά πρωτονίων (Karatza and Frillingos, 2005), οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι αποτελεί έναν ειδικό συµµεταφορέα ξανθίνης:η +. Με πειράµατα ανταγωνισµού της πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης, αποδείχτηκε ότι αντίθετα µε τους µεταφορείς UapA (Amillis et al., 2001; Koukaki et al., 2005) και UapC (Diallinas et al., 1998) του A. nidulans, AfUapA του A. fumigatus (Goudela et al., 2008) και Xut1 του Candida albicans (Goudela et al., 2005), ο YgfO δεν µπορεί να µεταφέρει ή να αναγνωρίσει ουρικό οξύ ή ανάλογα ξανθίνης που φέρουν υποκαταστάτες στη θέση 7 ή 8 του ιµιδαζολικού δακτυλίου (Karatza and Frillingos, 2005). Υποδείχθηκε, επίσης, ότι για τη δέσµευση του υποστρώµατος λαµβάνουν χώρα αλληλεπιδράσεις του YgfO κυρίως µε τις οµάδες Ν3-Η και =Ο2 του πυριµιδινικού (ενώ οι UapA, Xut1 µε τις Ν1-Η και =Ο6) δακτυλίου ενώ η αλληλεπίδραση µε τον ιµιδαζολικό δακτύλιο της πουρίνης γίνεται κυρίως µέσω του Ν9 (για τους UapA και Xut1 µέσω των Ν7, Ν8 ή Ν9) (Karatza and Frillingos, 2005, Goudela et al., 2005) (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Ρόλος των θέσεων 1-9 του πουρινικού δακτυλίου της ξανθίνης στην αναγνώριση του υποστρώµατος από µυκητιακά (UapA/Xut1) ή βακτηριακά (YgfO/YicE) µέλη της οικογένειας µεταφορέων NAT/NCS2. Τα γκρι βέλη υποδεικνύουν θέσεις, η τροποποίηση των οποίων επηρεάζει σηµαντικά την αναγνώριση υποστρώµατος ενώ τα µαύρα τις θέσεις, οι οποίες όταν τροποποιηθούν, δεν επιτρέπουν την αναγνώριση υποστρώµατος. 19

20 Με στόχο την µελέτη των σχέσεων δοµής-λειτουργίας, της τοπολογίας, των αλληλεπιδράσεων στη θέση δέσµευσης υποστρώµατος, της δυναµικής της δοµής καθώς και άλλων στοιχείων του µηχανισµού λειτουργίας των µεταφορέων της οικογένειας NAT/NCS2, κατασκευάστηκε µε βάση τον µεταφορέα YgfO, ο µεταφορέας YgfO-Cys-less, στον οποίο αλλάχθηκαν οι πέντε εγγενείς του κυστεΐνες σε σερίνες (Karatza et al., 2006). Αυτός εκφράζεται κανονικά στη µεµβράνη και εµφανίζει παρόµοια ενεργότητα και συγγένεια στη µεταφορά ξανθίνης (K m 5.5 µμ, V max 10.2 nmol.mg -1.min -1 ) µε τον φυσικού τύπου YgfO. Ο µεταφορέας YgfO-Cysless χρησιµοποιείται σαν βάση για πειράµατα µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής σάρωσης (Cys-scanning mutagenesis), που έχουν δώσει σηµαντικά αποτελέσµατα για το ρόλο του µοτίβου-«υπογραφή» ΝΑΤ (Karatza et al., 2006) (βλέπε 1.5) και της περιοχής της τελευταίας διαµεµβρανικής έλικας του µορίου (Papakostas et al., 2008). Πρόσφατα, πειράµατα µεταλλαξιγένεσης στην περιοχή της έλικας-12 (κατάλοιπα ) (Papakostas et al., 2008) έδειξαν ότι τα κατάλοιπα Asn430 και Ile432, τα οποία βρίσκονται στο µέσο της διαµεµβρανικής έλικας-12, είναι σηµαντικά για τη λειτουργία του µεταφορέα. Το Asn430, όπως αποδεικνύεται από την ευαισθησία που εµφανίζει στο Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (ΝΕΜ) και την προστασία από την 2-θειοξανθίνη (ανάλογο υψηλής συγγένειας), βρίσκεται πιθανώς κοντά στη θέση πρόσδεσης. Ακολούθως, για το Ile432, το οποίο εδράζεται στην απέναντι πλευρά της α-έλικας αλλά στο ίδιο βάθος στη µεµβράνη όπως το Asn430, τα πειράµατα µεταλλαξιγένεσης έδειξαν ότι επιδρά στην περιοχή δέσµευσης µε έµµεσο τρόπο (Papakostas et al., 2008). Εκτός από την περίπτωση του Asn430 (ΤΜ12), έχει, επίσης, αποδειχθεί ότι τα πολικά κατάλοιπα Ηis31 (ΤΜ1) και Asn93 (ΤΜ3) υπόκεινται σε αυστηρούς περιορισµούς αντικαταστάσεων ως προς το µέγεθος ή τον υδρόφιλο χαρακτήρα της πλευρικής οµάδας (Καρενά Αικατερίνη, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Εξάλλου, εφαρµόζοντας δοκιµασίες αλκυλίωσης για έλεγχο προσβασιµότητας από υδατικό διάλυµα, σε κύτταρα, σε παρασκευάσµατα µεµβρανών και σε µεµβρανικά κυστίδια (χρησιµοποιήθηκε το πολικό αντιδραστήριο MTSES και Πράσινο Μηλεϊµίδιο του Oregon-488) διαπιστώθηκε ότι οι κυστεΐνες στις κορυφαίες θέσεις υδρόφιλων συνδετικών τµηµάτων (loops) ακολουθούν ένα µοτίβο εναλλασσόµενης προσβασιµότητας. Το στοιχείο αυτό είναι ενδεικτικό της ύπαρξης 12 διαµεµβρανικών τµηµάτων (TMs), µε την C-τελική πλευρά του TM9, καθοδικά του µοτίβου NAT, να προσανατολίζεται προς το περίπλασµα (Μερµελέκας Γιώργος, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). 1.5 Το µοτίβο υπογραφή Η οικογένεια Μεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Ασκορβικού (Nucleobase Ascorbate Transporters, NAT) (de Koning and Diallinas, 2000) ή οικογένεια-2 Συµµεταφορέων Νουκλεοτιδικών βάσεων Κατιόντων (Nucleobase Cation Symporters-2, NCS2) (TC 2.A.40, είναι η µεγαλύτερη και πιο συντηρηµένη οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων, όλα τα µέλη της οποίας φέρουν µία χαρακτηριστική αλληλουχία υπογραφή (συµµετέχει στην αναγνώριση του υποστρώµατος και στην εξειδίκευση του κέντρου δέσµευσης) (324[Q/E/P]-N-X-G-X-X-X-X-T-[R/K/G]333) (Diallinas et al., 1998, Amilis et al., 2001, Karatza and Frillingos, 2005) (Εικόνα 4). 20

21 UapA_A.nidulans 433-QNNGV I AL T R-442 (uric acid/xanthine) UapC_A.nidulans 407-QNNGV I AL T P-416 (uric acid/xanthine) Xut1_C.albicans 386-QNNGV I S I T K-395 (uric acid/xanthine) PucJ_B.SUBTILIS 298-QNAG L LQL T K-307 (uric acid) PbuX_B.subtilis 293-QNVG LV QL T G-302 (xanthine) YicE_ECOLI 336-QNNGV I Q L T G-345 (xanthine) YgfO_E.coli 324-QNNGV I QM T G-333 (xanthine) PyrP_Lactoccocus 306-E N IGV MA I T K-315 (uracil) Lpe1_Z.mays 346-E NAGL L AV T R-355 (uric acid/xanthine) SVCT1_Human 401-P N IGV L G I T K-500 (ascorbate) SVCT2_Human 401-P N IGV L G I T K-500 (ascorbate) Εικόνα 4. Το µοτίβο υπογραφή στην αλληλουχία µελών τις οικογένειας NAT/NCS2: Στην αριστερή πλευρά διακρίνονται µέλη της οικογένειας του γονιδιώµατος της E. coli ( στην δεξιά το αντίστοιχο υπόστρωµα των µεταφορέων και στο µεσαίο τµήµα η αλληλουχία που αντιστοιχεί στην περιοχή µοτίβο. Με το γκρι πλαίσιο εµφανίζεται ο µεταφορέας YgfO, ενώ µε την κόκκινη ένδειξη επισηµαίνονται τα πλήρως συντηρηµένα αµινοξέα. Στον µεταφορέα YgfO, αναλύθηκε αρχικά µε µεταλλαξιγένεση η περιοχή του µοτίβου (Karatza et al., 2006) και µέσω µεταλλαξιγένεσης κυστεϊνικής σάρωσης διαπιστώθηκε ότι το κατάλοιπο Gln324 είναι αναγκαίο για την αναγνώριση και πρόσληψη του υποστρώµατος και το Αsn325 για την ενεργό µεταφορά. Όλες οι θέσεις της αλληλουχίας είναι προσβάσιµες και ευαίσθητες σε αναστολή ενεργότητας, ενώ οι θέσεις της αλληλουχίας (Ιle329, Thr332, Gly333, Ser336, Val339) είναι εναλλασσόµενα προσβάσιµες/ευαίσθητες σε αναστολή ή µη, εµφανίζοντας περιοδικότητα α-έλικας. (η σύνδεση του NEM στις θέσεις αυτές παρεµποδίζει την αλλαγή διαµόρφωσης που επάγει φυσιολογικά η δέσµευση υποστρώµατος και διακόπτει την συνέχεια του καταλυτικού κύκλου) (Εικόνα 5). Σηµειακή µεταλλαξιγένεση στις θέσεις αυτές, δείχνει επίσης, ότι επηρεάζεται η αναγνώριση συγκεκριµένων αναλόγων πουρινών σε πειράµατα συναγωνιστικής αναστολής, υποδεικνύοντας ότι η «εκτεθειµένη» πλευρά αυτής της α-έλικας αποτελεί διαµορφωτική συνέχεια του κέντρου δέσµευσης (Γεωργοπούλου Αικατερίνη, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Τα κατάλοιπα Pro318 και Gly340 µε τη σειρά τους, φαίνεται ότι είναι σηµαντικά για τη σωστή διαµόρφωση και έκφραση του YgfO στη µεµβράνη, αφού τα µεταλλάγµατα στις θέσεις αυτές οδηγούν σε αµελητέα επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη (Karatza et al., 2006). Εφαρµόζοντας ακολούθως δοκιµασίες αλκυλίωσης σε κύτταρα, σε παρασκευάσµατα µεµβρανών και σε µεµβρανικά κυστίδια (χρησιµοποιώντας το πολικό αντιδραστήριο MTSES και Πράσινο Μηλεϊµίδιο του Oregon-488) αποδείχθηκε ότι οι κυστεΐνες στις θέσεις του µοτίβου NAT είναι προσβάσιµες σε µεγάλο βαθµό στο διάλυµα από την πλευρά του περιπλάσµατος. Η περιοχή αυτή, συνεπώς, είναι µέρος µιας υδρόφιλης κοιλότητας του πρωτεϊνικού µορίου προσβάσιµης στο υπόστρωµα (Μερµελέκας Γιώργος, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Πράγµατι, πειράµατα αλκυλίωσης µε ΝΕΜ που έγιναν παρουσία ή απουσία υποστρώµατος (ξανθίνης) σε µεµβρανικά κυστίδια έδειξαν ότι η αναντικατάστατη Asn325 βρίσκεται στην περιοχή του κέντρου δέσµευσης και η δέσµευση υποστρώµατος παρεµποδίζει στερεοχηµικά την πρόσβαση αντιδραστηρίων 21

22 στην θέση αυτή (Γεωργοπούλου Αικατερίνη, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Εξάλλου, αµέσως πρίν από το µοτίβο-«υπογραφή», έχει αποδειχθεί η ύπαρξη στην περιοχή µεταξύ των διαµεµβρανικών ελίκων 8 και 9 δύο καταλοίπων, τα Ε272 και D304, των οποίων η παρουσία κρίνεται απαραίτητη για τη λειτουργία του µεταφορέα, συµµετέχοντας πιθανόν σε ένα στάδιο αλλαγής διαµορφώσεων µετά τη δέσµευση υποστρώµατος (Καρενά Αικατερίνη, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). COO NH3 + κυτταρόπλασµα 304 D Q N E H 31 N N XII περίπλασµα Κατάλοιπα κρίσιµα για την έκφραση στη µεµβράνη Κατάλοιπα αναντικατάστατα για τη λειτουργία Κατάλοιπα µε αυστηρούς περιορισµούς πλευρικής αλυσίδας Εικόνα 5. Mοντέλο τοπολογικής οργάνωσης και του µοτίβου-«υπογραφή» του µεταφορέα YgfO: Το παραπάνω µοντέλο προκύπτει από in silico ανάλυση µε το πρόγραµµα TMHMM ( (Granseth et al., 2005) και προκαταρτικά δεδοµένα του εργαστηρίου από πειράµατα κυστεϊνικής στόχευσης και σηµειακής µεταλλαξιγένεσης. 22

23 1.6 Οι στόχοι της παρούσας εργασίας Με βάση τα µέχρι σήµερα δεδοµένα που συνδέουν το µοτίβο-«υπογραφή» µε το κέντρο δέσµευσης-µεταφοράς πουρινών τόσο στον βακτηριακό µεταφορέα YgfO όσο και στους οµόλογους µεταφορείς ΝΑΤ/NCS2 των ασκοµυκήτων και ζυµοµυκήτων, αλλά και τα ερωτήµατα που παραµένουν αναπάντητα για τη λειτουργία τους, εξετάσαµε την περιοχή πριν από το µοτίβο-«υπογραφή» της οικογένειας NAT/NCS2 (Τyr266 Val314) (υδρόφιλο κυτταροπλασµατικό τµήµα µεταξύ των διαµεµβρανικών ελίκων 8 και 9) µε µεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής σάρωσης, στον µεταφορέα ξανθίνης YgfO. Ο στόχος ήταν η αρχική διερεύνηση του ρόλου των καταλοίπων της περιοχής αυτής και ο εντοπισµός καταλοίπων σηµαντικών για την εξειδίκευση και τη λειτουργία του κέντρου δέσµευσης υποστρώµατος ή, γενικότερα, για τον µηχανισµό των µεταφορέων NAT/NCS2. Από τη µελέτη µας εξαιρέσαµε τα κατάλοιπα Ε272, S284, S295 και D304 που είχαν αποτελέσει αντικείµενο προηγούµενων µελετών του εργαστηρίου. Η περιοχή όπου εστιάζεται η µελέτη µας εντοπίζεται πριν από την ευρύτερη περιοχή του µοτίβου, για την οποία ήδη γνωρίζαµε οτι φέρει κατάλοιπα σηµαντικά για την έκφραση, λειτουργία και εξειδίκευση του µεταφορέα. Τα αναντικατάστατα Gln324 και Asn325 είναι απαραίτητα για τη µεταφορά της ξανθίνης, ενώ η Gly333 είναι αναγκαία για την εξειδίκευση του µεταφορέα YgfO ως προς την αναγνώριση προσδετών. Εξάλλου, τα κατάλοιπα Pro318 και Gly340 φαίνεται ότι διαδραµατίζουν καθοριστικό ρόλο για τη σωστή διαµόρφωση και έκφραση του YgfO στη µεµβράνη (Karatza et al., 2006). Βασιζόµενοι στις παραπάνω πληροφορίες, εστιάσαµε την προσοχή µας στην περιοχή Tyr266 Val314 αναζητώντας και άλλα κατάλοιπα που πιθανόν να παίζουν σηµαντικό ρόλο στην λειτουργία του κέντρου δέσµευσης- µεταφοράς ξανθίνης και στην εξειδίκευση. 23

24 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 24

25 25

26 2.1 Όργανα Τα εργαστηριακά όργανα που χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση της παρούσας εργασίας είναι (σε αλφαβητική σειρά): Επιτραπέζια µικροφυγόκεντρος Eppendorf Centrifuge 5415 D. Μετρητής υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (Liquid Scintillation Counter) Packard Instruments, Meriden, Connecticut) του εργαστηριακού Τοµέα της Ιατρικής Σχολής (εργαστήριο Φαρµακολογίας). Μετρητής ph (πεχάµετρο) (ph Meter, phi 340 Package, 240V) (Beckmann Instruments, UK). Συσκευή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California). Συσκευή ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Protean II xi Cell (Bio-Rad, Hercules, California). Σύριγγα φόρτωσης δειγµάτων (Microliter Syringes), Hamilton (Bonaduz, Switzerland). Συσκευή ηλεκτροφορητικής µεταφοράς Mini Trans-Blot transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, California). Συσκευή ταχείας διήθησης (glass filter holder assembly) (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA). Χρησιµοποιήθηκαν ηθµοί διήθησης (Whatman GF/C,25 mmcircle, µε διάµετρο πόρων 1.2 µm) για την κατακράτηση του κυτταρικού κλάσµατος. Συσκευή υπερήχων digital sonifier model 250-D (Branson Ultrasonics, anbery, Connecticut). Υδατόλουτρο (ED-5A open Bath Circulator) (Julabo, Germany). Υπερφυγόκεντρος Beckmann OptimaTM Ultracentrifuge (Beckmann Instruments, Palo Alto, California) του Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Ερευνών του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων (Ι.Β.Ε.Ι). Φυγόκεντρος Heraeus Megafuge 1.0R (Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germany). Φωτόµετρο Ultraspec-2001 (Biochrom, Cambridge, England). 2.2 Χηµικά αναλώσιµα Τα χηµικά υλικά που χρησιµοποιήθηκαν περιλαµβάνουν τα ακόλουθα: Ραδιενεργός [ 3 Η] ξανθίνη (18 Ci/mmol) της εταιρείας Moravek Biochemicals (Brea, CA). Μη ραδιενεργές νουκλεοτιδικές βάσεις της εταιρείας Sigma (St. Louis, MO). εοξυριβονουκλεοτίδια εκκινητές (primers) στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) της εταιρείας BioSpring GmbH (Frankfurt, Germany). Phusion High Fidelity Taq πολυµεράση (Phusion High Fidelity PCR System) (Finnzymes, Espoo, Finland) που χρησιµοποιήθηκε ως ένζυµο αντιγραφής του DNA στην αντίδραση PCR. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες BamHI και ApaI της εταιρείας Takara (Otsu, Japan). 26

27 Αλκαλική φωσφατάση (για την αποφωσφορυλίωση των τµηµάτων DNA που χρησιµοποιήθηκαν ως φορείς) και DNA λιγάση του βακτηριοφάγου Τ4 (για τις αντιδράσεις ανασύνδεσης DNA) της εταιρείας Takara (Otsu, Japan). Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (NEM) της εταιρείας Sigma. Το σύζευγµα αβιδίνης- υπεροξειδάσης (avidin-hrp) της εταιρείας Amersham Pharmacia BioTech (Upsala, Sweden). είκτες πρότυπων µοριακών βαρών για DNA: GeneRulerTM 100bp DNA ladder plus, ready to use, της εταιρείας Fermentas (St. Leon-Rot, Germany) είκτες πρότυπων µοριακών βαρών για πρωτεΐνες: Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range, της εταιρείας Bio-Rad (Hercules, California). Κιτ υλικών καθαρισµού DNA από δείγµατα πήγµατος αγαρόζης Nucleospin Extract II, και κιτ αποµόνωσης πλασµιδιακού DNA Nucleospin Plasmid, της εταιρείας Macherey-Nagel (Duren, Germany). Κιτ ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας ECL TM Western Blotting, της εταιρείας Detection Reagents Amersham GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). 2.3 Πλασµίδια και κυτταρικά στελέχη Τα πλασµίδια που χρησιµοποιήθηκαν περιλαµβάνουν τα: pt7-5: φορέας κλωνοποίησης των υπό µελέτη γονιδίων µε στόχο την υπερέκφρασή τους µέσω του υποκινητή/χειριστή του οπερονίου της λακτόζης (lacz p/o). pt7-5/ygfo-cys-less (Karatza et al., 2006): φέρει το γονίδιο για τη διαπεράση YgfO µε αλλαγµένα τα 5 κατάλοιπα εγγενών Cys σε Ser, υπό το µεταγραφικό έλεγχο του οπερονίου της λακτόζης, την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (biotin acceptor domain, BAD) της οξαλοξικής αποκαρβοξυλάσης του βακτηρίου Klebsiella pneumoniae (Consler et al., 1993) και το καρβοξυτελικό δωδεκαπεπτίδιο της LacY (LSLLRRQVNEVA, C-τελικός επίτοπος) τα οποία προστέθηκαν αµέσως µετά το καρβοξυτελικό άκρο του γονιδίου (Carrasco et al., 1984). pt7-5/ygfo-bad (Karatza and Frillingos, 2005): περιέχει το γονίδιο για τη διαπεράση YgfΟ φυσικού τύπου υπό το µεταγραφικό έλεγχο του οπερονίου της λακτόζης, την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (ΒΑD) και το C-τελικό επίτοπο. pt7-5/ygfo-cys-less-his 10, µε το γονίδιο για τη Cys-less διαπεράση YgfO που περιέχει και µια C-τελική αλληλουχία 10 ιστιδινών (Karatza et al., 2006) pt7-5/ygfo-his 10, µε το γονίδιο για τη διαπεράση YgfO φυσικού τύπου που περιέχει και µια C-τελική αλληλουχία 10 ιστιδινών (Karatza and Frillingos, 2005) pt7-5/mely-bad (Frillingos and Kaback, 2001, Tavoulari and Frillingos, 2008): ανασυνδυασµένο pt7-5 το οποίο περιέχει το γονίδιο (mely) του µεταφορέα µελιβιόζης MelY την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης (BAD) και τον C-τελικό επίτοπο. Ως ξενιστές για την κλωνοποίηση και τον πολλαπλασιασµό των πλασµιδίων χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα εργαστηριακά στελέχη της Escherichia coli K-12: Το στέλεχος TOP10F (F {laciq, Tn10(TetR)} mcra (mrr-hsdrms-mrcbc) φ80lacζ Μ15 lacx74 deor reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk 27

28 rpsl(strr) enda1 nupg) (Invitrogen) χάρη στον υψηλό βαθµό επιδεκτικότητάς του χρησιµοποιήθηκε για την αναπαραγωγή των ανασυνδυασµένων πλασµιδίων σε µεγάλη κλίµακα. Το στέλεχος T184 [laci+o+z-y-(a), prsl, Μet-, Τhr-, reca, hsdm, hsdr/f, laciqo+zd118(y+a+)] (lacz-y-) (Teather et al., 1980) χρησιµοποιήθηκε για την επαγόµενη έκφραση των διαπερασών εξωγενώς, µέσω του οπερονίου της λακτόζης, µιας και δεν φέρει ενδογενή γονίδια που επάγονται µε IPTG. 2.4 Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης δύο σταδίων (overlap/extension PCR) Πρόκειται για τεχνική που επιτρέπει την αλλαγή ενός κωδικονίου µιας αλληλουχίας DNA σε ένα άλλο, σε δύο στάδια (Ho et al., 1989). Στο πρώτο στάδιο χρησιµοποιούνται συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια ως εκκινητές για να δηµιουργηθούν τµήµατα DNA µε επικαλυπτόµενα άκρα, προερχόµενα από το ίδιο υπόστρωµα (στάδιο 1). Τα τµήµατα αυτά, ακολούθως, επιλέγονται ως εκµαγεία για το δεύτερο στάδιο PCR κατά το οποίο υβριδίζονται λόγω των επικαλυπτόµενων άκρων τους. Χρήσιµοποιώντας, στη συνέχεια, ολιγονουκλεοτίδια επεκτείνονται και δίνουν ένα προϊόν αποτελούµενο από τα προηγούµενα τµήµατα (στάδιο 2) (Εικόνα 6). Στο τέλος κάθε σταδίου τα προϊόντα της αντίδρασης PCR διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης (1%) και ανακτώνται µέσω κιτ υλικών καθαρισµού DNA (Nucleospin Extract II, Macherey-Nagel). Σε κάθε στάδιο PCR χρησιµοποιήθηκαν: 100 ng πλασµιδιακού DNA ή αντίστοιχες ποσότητες προϊόντων PCR µετά από καθαρισµό. 10 µm από κάθε εκκινητή. 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατος αντίδρασης και 50 nm MgSO 4 ή 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατος που περιέχει MgCl mm από κάθε δεόξυριβονουκλεοτίδιο (ddatp, ddttp, ddctp, ddgtp). 1 U/µl από την Physion High Fidelity Taq πολυµεράση (Finnzymes). Αποστειρωµένο ddh2o από στήλη Millipore µέχρι τελικό όγκο 100 µl. 28

29 Εικόνα 6. Σχηµατική απεικόνιση της µεταλλαξιγένεσης κατευθυνόµενης στόχευσης µε τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης δυο σταδίων. Εκκινητές: ως εξωτερικοί εκκινητές στις αντιδράσεις PCR χρησιµοποιήθηκαν οι lacz(p/o)sense (5 - ATTACGGATTCACTGGCCGTC-3 ) και Yk(pT7-5)- His10 antisense (5 -GACGGGGAGTCAGGCAACTATGG-3 ) και ως εσωτερικοί για όλες τις κατασκευές σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν αυτοί που αναφέρονται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 1). ΠΙΝΑΚΑΣ 1 Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 -GTTGGCACGATTTGTCTGCTTAG-3 5 -GGGACGATTTATTGTCTTAGCGTGCTG-3 5 -CGATTTATCTGTGCAGCGTGCTG-3 5 -CGATTTATCTGCACAGATAAATCG-3 5 -CTGCTTAGTTGTCTGGAAGCAGTC-3 5 -CTTAGCGTGTGTGAAGCAGTC-3 5 -GGCAGTGATATCACCAACACATTCCAGCAC-3 Προϊόν ανασυνδυασµού DNA pt7-5/ ygfo (Cysless)-Υ266C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-L267C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-L268C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-S269C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V270C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-L271C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-Α273C-BAD 29

30 5 -GGCAGTGATATCACCACATGCTTCCAG-3 5 -GGCGGTGATATCACAAACTGCTTC-3 5 -GAAGCAGTCGGTTGTATCACC-3 5 -GAAGCAGTTGGTGATTGTACCGCCAC-3 5 -GTTGGCGATATCTGTGCTACGGCAATG-3 5 -GTCGGCGATATCACTTGTACGGCAATG-3 5 -GTTGGCGATATCACTGCTTGTGCAATGG-3 5 -GTTGGCGATATCACTGCCACTTGTATGGTTTC-3 5 -CGATATCACTGCAACTGCATGTGTTTCCC-3 5 -GCAATGTGTTCTCGTCGTCCCATTC-3 5 -GCAATGGTTTCCTGTCGTCCCATTC-3 5 -CAATGGTTTCCCGTTGTCCCATTCAG-3 5 -GGTTTCCCGTCGTTGTATTCAGG-3 5 -CAATGGTTTCTCGTCGTCCTTGTCAAGGGGAAG-3 5 -CAATGGTTTCTCGTCGTCCTATTTGTGGGGAAG-3 5 -CCCATTCAGTGTGAAGAGTATCAGTCC-3 5 -CCATTCAGGGTTGTGAGTATCAGTCC-3 5 -CCCATTCAGΤGTGAATGCTATCAGTCC-3 5 -GGAAGAGTGTCAGTCTCGTCTGAAAG-3 5 -GGAAGAGTATTGCTCCCGTCTGAAAG-3 5 -GAGTATCAGTCTTGCCTGAAAGGC-3 5 -GTATCAGTCTCGTTGTAAAGGTGGTGTGCTG-3 5 -GTATCAGTCTCGTTTATGTGGTGGCGTG-3 5 -CGGCTGAAATGTGGTGTGCTG-5 5 -CTGAAAGGCTGTGTTCTGGCAG-3 5 -GAAAGGCGGTTGTCTTGCAGATG-3 pt7-5/ ygfo (Cysless)-V274C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-G275C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-D276C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-I277C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-T278C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-A279C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-T280C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-A281C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-M282C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V283C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-R285C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-R286C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-P287C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-I288C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-Q289C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-G290C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-E291C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-E292C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-Y293C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-Q294C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-R296C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-L297C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-K298C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-G299C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-G300C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V301C-BAD 30

31 5 -CGGCGTTTGTGCAGATGGTCTG-3 5 -GGCGTGCTTTGTGATGGTCTG-3 5 -GCTGGCAGATTGTCTGGTTTCTG-3 5 -CTGGCAGATGGGTGTGTTTCTG-3 5 -GATGGTCTGTGTTCCGTTATCGC-3 5 -GGTCTGGTTTGTGTTATCGCCTC-3 5 -CTGGTTTCTTGTATCGCCTCCG-3 5 -GTTTCTGTTTGTGCCTCCGCTG-3 5 -CTGTTATCTGTTCCGCTGTCGG-3 5 -GTTATCGCTTGTGCTGTCGGTTC-3 5 -GTTATCGCCTCTTGTGTCGGTTC-3 5 -GCCTCCGCTTGTGGTTCATTAC-3 5 -CGGCTGAAATGTGGTGTGCTG-5 5 -GCTGGCAGATTGTCTGGTTTCTG-3 5 -CTGGCAGATGCTCTGGTTTCTG-3 5 -CTGGCAGATCCTCTGGTTTCTG-3 pt7-5/ ygfo (Cysless)-L302C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-A303AD pt7-5/ ygfo (Cysless)-G305C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-L306C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V307C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-S308C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V309C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-I310C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-A311C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-S312C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-A313C-BAD pt7-5/ ygfo (Cysless)-V314C-BAD pt7-5/ ygfo (wt)- G299C-BAD pt7-5/ ygfo (wt)- G305C-BAD pt7-5/ ygfo (wt)- G305A-BAD pt7-5/ ygfo (wt)- G305P-BAD Πίνακας 1. Πινακας εσωτερικών εκκινητών: µε µαύρα υπογραµµισµένα γράµµατα υποδηλώνεται η θέση της εκάστοτε µετάλλαξης, ενώ µε κόκκινο χρώµα δηλώνεται η αλληλουχία αναγνώρισης της ΕcoRV Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA (περιοριστική πέψη-ανασύνδεση) Το τελικό προϊόν του δεύτερου σταδίου PCR ηλεκτροφορήθηκε σε πήγµα αγαρόζης και αποµονώθηκε µέσω Extraction Kit. Ακολούθως, το καθαρισµένο προϊόν υπέστη περιοριστική πέψη χρησιµοποιώντας ένα από τα ακόλουθα ζεύγη ενζύµων: BamHΙ και ΑpaI, ΒamHI και EcoRV, ApaI και EcoRV ανάλογα µε την κατασκευή µας (αναγνωρίζουν µοναδικές και επακριβώς αντίστοιχες περιοριστικές θέσεις τόσο στον φορέα pt7-5/mely-bad όσο και στα PCR προϊόντα που δηµιουργούνται µε εκµαγείο τα pt7-5/ygfo-cys-less-his 10, pt7-5/ygfo-his 10 ). Με τα ίδια ένζυµα κόπηκε και το πλασµίδιο φορέας κλωνοποίησης (pt7-5/mely-bad από µεγάλης κλίµακας παρασκεύασµα maxi prep, 1 µg/µl). Μετά τη δράση των περιοριστικών ενζύµων πραγµατοποιήθηκε αποφωσφορυλίωση των 5 άκρων µόνο του φορέα µε αλκαλική φωσφατάση (επώαση για 2 h στους 37 ο C) ώστε να αποφευχθεί επανακυκλοποίησή του. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων σε πήγµα αγαρόζης, καθαρισµός και ανασυνδιασµός µε χρήση Τ4 DNA λιγάσης στους 31

32 4 o C (overnight) και σε τελικό όγκο αντίδρασης 20 µl µε τις υπολογισµένες αναλογίες φορέα : ενθέµατος Επιδεκτικά κύτταρα Το κυτταρικό στέλεχος E. coli TOP10F (παρόµοια διαδικασία ακολουθήσαµε και για το Τ184), το οποίο θα µετασχηµατίζαµε µε το ανασυνδυασµένο προϊόν µας, το καταστήσαµε επιδεκτικό βάσει του πρωτοκόλλου των Inoue et al. (1990). Βακτηριακά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό LB (εκχύλισµα ζύµης 0.5% w/v, πεπτόνη 1% w/v, NaCl 1% w/v, ph 7.2), (10 ml) στους 37 ο C, για 16h (το στέλεχος Τ184 καλλιεργήθηκε υπό την παρουσία στρεπτοµυκίνης 0.01 mg/ml). Η άνωθεν καλλιέργεια µεταφέρθηκε υπό στείρες συνθήκες σε θρεπτικό διάλυµα S.O.B. (εκχύλισµα ζύµης 0.5% w/v, Τρυπτόνη 2% w/v, NaCl 10 mm, KCl 2.5 mm, MgCl2 10 mm, MgSO4 10 mm, ph 7.5) (250 ml). Ακολούθησε ανάπτυξη των κυττάρων υπό ανάδευση στους 37 ο C (για περίπου 2 h) µέχρι η οπτική πυκνότητα (OD600) να φτάσει στην τιµή 0,6. Συλλογή των 125 ml της καλλιέργειας, επώαση στον πάγο για 10 min, φυγοκέντρηση στις 6000 rpm (10 min, 4 ο C), επαναιώρηση σε 80 ml ψυχρού διαλύµατος ΤΒ (Pipes 10 mm, MnCl 2 55 mm, CaCl 2 15mM, KCl 250 mm, ph 6.7) δεύτερη φυγοκέντρηση, επαναιώρηση σε 20 ml ψυχρού ΤΒ αυτή τη φορά και προσθήκη 800 µl διµεθυλο-σουλφοξείδιου (DMSO) µας έδωσαν τα αντίστοιχα επιδεκτικά κύτταρα (αποθήκευση στους -80 ο C) Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DNA Κύτταρα TOP10F µετασχηµατίστηκαν µε το ανασυνδυασµένο DNA µέσω επώασης σε πάγο για 5 min. Ακολούθησε επίστρωση σε τρυβλία µε θρεπτικό υλικό LB και άγαρ που φέρουν αµπικιλλίνη (0.1 mg/ml) και καλλιέργειά τους για 16 h. Επιλέχθηκαν, έπειτα, αποικίες µε βάση την ανθεκτικότητα σε αµπικιλλίνη, οι οποίες καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό LB (3 ml) για 16 h. Με το κατάλληλο κιτ αποµονώθηκε DNA σε µικρή κλίµακα, που ελέγχθηκε ως προς την αλληλουχία του σε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας (MWG-Biotech) (Εικόνα 7). Αφού επιβεβαιώσαµε την αλληλουχία µας, µετασχηµατίσαµε µε το πλασµιδιακό DNA κύτταρα Τ184, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε LB (3 ml) για 16 h και αποθηκεύθηκαν στους -80 ο C παρουσία γλυκερόλης (33%). 32

33 Εικόνα 7. Τµήµα της αλληλουχίας (νουκλεοτίδια 1 453) του µαταλλάγµατος G299C, όπως προκύπτει από τον αυτόµατο αναλυτή αλληλούχισης της εταιρείας MWG. 2.5 Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων Σε όλα τα πειραµατικά πρωτόκολλα που εφαρµόσαµε (παράγραφοι 2.6, 2.7, 2.8) τα µετασχηµατισµένα κύτταρα E.coli Τ184, αρχικά αναπτύσσονταν σε πλήρες θρεπτικό υλικό LB (3 ml) παρουσία αµπικιλλίνης (0.1 mg/ml) και στρεπτοµυκίνης (0.01 mg/ml), για 16 h, στους 37 ο C, υπό ανάδευση, σε αερόβιες συνθήκες. Ακολουθούσε αραίωση 1/10 σε LB και εκ νέου ανάπτυξη στις ίδιες συνθήκες για 2 h, οπότε και προσθέταµε 5 µl ισοπροπυλο-β-d-θειογαλακτοσίδιο (IPTG) (τελική συγκέντρωση 0.5 mm) επάγοντας εξωγενώς την έκφραση του γονιδίου ygfo, µετά από ανάπτυξη για επιπλέον 2 h. Η συλλογή των κυττάρων γινόταν µέσω φυγοκέντρησης (υπερφυγόκεντρο Heraeus) στις 6000 rpm για 10 min στους 4 ο C. 2.6 οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport assay) Το κυτταρικό ίζηµα που συλλέχθηκε µετά τη φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκε µε 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ΚΡi (KH 2 PO 4 1M, K 2 HPO 4 1M), επαναφυγοκεντρήθηκε και επαναιωρήθηκε µε στόχο την αποµάκρυνση του θρεπτικού υλικού. Ακολούθησε τρίτη φυγοκέντρηση και το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml του ίδιου διαλύµατος. Μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 420 nm και τα δείγµατα αραιώθηκαν µε προσθήκη κατάλληλου όγκου ρυθµιστικού διαλύµατος, ώστε η τελική τιµή της οπτικής πυκνότητας στα 420 nm να είναι 10. Η τιµή αυτή 33

34 ισοδυναµεί µε συγκέντρωση πρωτεΐνης 0,7 mg/ml σύµφωνα µε πρότυπες καµπύλες παλαιότερων πειραµάτων (Karatza and Frillingos, 2005, Frillingos et al., 1994). Η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς [ 3 Η] ξανθίνης (18 Ci/mmol) έγινε µέσω επώασης µε το ραδιενεργό υπόστρωµα (τελική συγκέντρωση 1 µμ) σε 50 µl κυττάρων για χρόνους από 10 sec έως 10 min. Η αντίδραση τερµατίστηκε µε 2Χ3 ml διαλύµατος τερµατισµού (KPi 0.1M, LiCl 0.1M, ph 5.5) µε ταχεία διήθηση (rapid filtration) υπό κενό σε ηθµό διήθησης (Whatman GF/C, 25 mm-circle, µε διάµετρο πόρων 1.2 µm) (Frillingos et al., 1994). Ο ηθµός µεταφέρθηκε σε κατάλληλα σωληνάρια (scintiallation vials) και αναµίχθηκε µε υγρό σπινθηρισµού [µίγµα τολουόλιου, 66% (v/v) και Triton X-100, 33% (v/v) που περιέχει 2,5-διφαινυλοξαζόλη (ΡΡΟ), 4% (w/v), και 1,4-δις(5 φαινυλοξαζολ-2-υλ) βενζένιο (ΡΟΡΟΡ), (0.04% w/v)] (2Χ4 ml για 24 h). Η µέτρηση των δειγµάτων πραγµατοποιήθηκε σε µετρητή υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (β counter). 2.7 Αλκυλίωση των σουλφυδρυλικών οµάδων των κυστεϊνών µε τo αντιδραστήριo NEM Τα κυτταρικά δείγµατα ολικής συγκέντρωσης πρωτεΐνης 0.7 mg/ml, επωάστηκαν µε ή χωρίς ΝΕΜ (συγκέντρωση 2 mm) (Karatza et al., 2006) για 10 min σε υδατόλουτρο στους 25 0 C. Η αντίδραση τερµατίστηκε µε διθειοθρεϊτόλη (DTT) (σε µοριακή περίσσεια 10Χ έναντι του NEM). Ακολούθησε δοκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς παρουσία µεθοσουλφονικού φαιναζινίου (phenazine methosulphate, PMS) σε τελική συγκέντρωση 0.2 mm και ασκορβικού καλίου σε τελική συγκέντρωση 20 mm µε στόχο την ενεργοποίηση της αναπνευστικής αλυσίδας (Kaback, 1974). 2.8 Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών Τα κύτταρα E. coli T184 που συλλέχθηκαν (παράγραφος 2.5) επαναιωρήθηκαν σε 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατος επαναιώρησης (Tris-HCl 50 mm, ph 8, NaCl 100 mm, Na 2 EDTA 1mM) και επαναφυγοκεντρήθηκαν. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε µε αναδιάλυση των κυττάρων σε 1 ml διαλύµατος επαναιώρησης και 1 µl Pefablock. Ακολούθησε µεταφορά σε µικροσωληνάρια eppendorf και φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια µικροφυγόκεντρο (13000 rpm, 2 min). Το κυτταρικό ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε 1ml διαλύµατος σακχαρόζης (Tris-HCl 25 mm, ph 8, Sucrose 45%, Na 2 EDTA 1mM) και 1 µl Pefablock. Έπεται επώαση στον πάγο για 20 min, νέα φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια µικροφυγόκεντρο για 1 min και επαναιώρηση σε 0.8 ml ddh 2 O. Το εναιώρηµα επωάστηκε στον πάγο για 10 min, οπότε και προστέθηκε λυσοζύµη (τελική συγκέντρωση mg/ml) (επώαση για 30 min στον πάγο). Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε θραύση των κυττάρων σε συσκευή υπερήχων (sonication) (2 ώσεις των 15 sec, σε ένταση 40%, στην συσκευή Branson 250-D), φυγοκέντρηση (5 min) σε επιτραπέζια µικροφόκεντρο, συλλογή των υπερκείµενων και υπερφυγοκέντρηση αυτών (Optima Ultracentrifuge, rpm, 20 min, 4 ο C). Το ίζηµα των µεµβρανών διαλυτοποιήθηκε σε 40 µl ddh 2 O και τα δείγµατα φυλάχτηκαν για h στους 4 ο C. 34

35 2.9 Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης Ο ποσοτικός προσδιορισµός της ολικής πρωτεΐνης των δειγµάτων πραγµατοποιήθηκε βάσει του πρωτόκολλου BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce), που βασίζεται στο συνδυασµό της αναγωγής του Cu +2 σε Cu +1 σε αλκαλικό περιβάλλον, µε την υψηλής ευαισθησίας χρωµατοµετρική ανίχνευση του κατιόντος χαλκού (Cu +1 ) (στα 562 nm) χρησιµοποιώντας δισ-κιγχονινικό οξύ (bicinchoninic acid) Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) Πραγµατοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου δωδεκυλοθειϊκού νατρίου (Sodium Dodecyl Sulphate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) (SDS-PAGE). To πήγµα διαχωρισµού ήταν 12% ακρυλαµίδιο και το πήγµα επιστοίβαξης 5% και ως δείκτης πρότυπων µοριακών βαρών χρησιµοποιήθηκε ο Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range της εταιρείας Bio-Rad Laboratories (Hercules, California). Με το πέρας της ηλεκτροφόρησης οι πρωτεϊνικές ζώνες µεταφέρθηκαν µε ηλεκτροφορητική µεταφορά (4 h, 400 ma) σε µεµβράνη πολυ-βινυλιδενικού διφθοριδίου (PVDF), σε διάλυµα µεταφοράς (διάλυµα Tris-γλυκίνης που περιέχει 20% µεθανόλη). Κατόπιν, η µεµβράνη PVDF επωάστηκε για τουλάχιστον 16 h σε διάλυµα TBST (Tris-HCl ph 7.4, 0.1 mm, NaCl 1.5 M, Triton X-100, 2% v/v) που περιέχει 5% BSA (blocking buffer) (30 ml) και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση µε χρήση του κατάλληλου συζεύγµατος ενζύµου-αντισώµατος (avidin-hrp σε αραίωση 1:50000) για 1 h. Έξι - οχτώ πλύσεις µε ΤΒST απαιτούνται πριν την ανίχνευση του σήµατος, η οποία πραγµατοποιείται µε τη µέθοδο της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (ECL) (Amersham). 35

36 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 36

37 37

38 3.1 Μεταλλαξιγένεση σάρωσης κυστεϊνών των καταλοίπων Υ266 - V314 της διαπεράσης YgfO Χρησιµοποιώντας ως πειραµατικό εργαλείο τη διαπεράση YgfO χωρίς κανένα κατάλοιπο εγγενών κυστεϊνών (YgfO-Cys-less), που εκφράζεται σε παρόµοια επίπεδα µε τη διαπεράση YgfΟ φυσικού τύπου (YgfO-wt) και εµφανίζει παρόµοια ενεργότητα µε αυτή (Karatza et al., 2006), πραγµατοποιήσαµε µεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής σάρωσης για την περιοχή καταλοίπων Υ266 V314 (εκτός των Ε272, S284, S295 και D304 που είχαν εξετασθεί σε προηγούµενες µελέτες - Αικατερίνη Καρενά και Γιώργος Μερµελέκας, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Κατασκευάσαµε 45 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης (single- Cys YgfOs) µεταλλάσσοντας τα αντίστοιχα κατάλοιπα µέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης δυο σταδίων (βλ. Υλικά και Μέθοδοι) και εξασφαλίσαµε την παρουσία κατάλληλων σηµάτων C-τελικών αλληλουχιών, δηλ. το C-τελικό 12πεπτίδιο της LacY (LacY-epitope) και µίας περιοχής δέσµευσης βιοτίνης από την αποκαρβοξυλάση οξαλοξικού της Klebsiella pneumoniae (biotin acceptor domain, BAD) (Karatza and Frillingos, 2005). Αφού επιβεβαιώσαµε την αλληλουχία τους (MWG-Biotech, dsdna sequencing), οι single-cys διαπεράσες εκφράσθηκαν µέσω IPTG-επαγόµενων, πλασµιδιακών φορέων σε κύτταρα E. coli Κ- 12 (T184) και ελέγχθησαν τα επίπεδα έκφρασης, η ενεργότητα και η επίδραση ειδικών SH-αντιδραστηρίων (ΝΕΜ). 38

39 3.2 Έκφραση των single-cys YgfOs Η πρωτεϊνική έκφραση ελέγχθηκε µέσω ανοσοαποτύπωσης σε µεµβρανικά κλάσµατα των διαπερασών µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης - υπεροξειδάσης έναντι της βιοτυνυλιωµένης in vivo περιοχής δέσµευσης βιοτίνης. Παρατηρούµε ότι οι 38 από τις 45 single-cys διαπεράσες εκφράζονται σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά της YgfO-Cys-less. Από τις υπόλοιπες 7, τα επίπεδα έκφρασης των I277C και Υ293C είναι σηµαντικά αλλά πολύ χαµηλότερα συγκριτικά µε αυτά της YgfO-Cys-less, ενώ οι T278C, A279C, T280C, A281C και G305C εκφράζονται σε µηδενικά αµελητέα επίπεδα (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Έκφραση των single-cys YgfOs: από κύτταρα Τ184 παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών, τα οποία εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες και δείγµατά τους (100 µg ολικής πρωτεΐνης) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου 12%. Ακολούθησε ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1: και οπτικοποίηση του προϊόντος της αντίδρασης υπεροξειδάσης µε ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (ECL). Τα µοριακά βάρη που αναγράφονται αριστερά των εικόνων προέρχονται από το δείκτη πρότυπων µοριακών βαρών Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). 3.3 Ενεργότητα των single-cys YgfOs Οι 34 από τις 45 διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης παρουσιάζουν υψηλές αρχικές ταχύτητες πρόσληψης (>50% αυτής του Cys-less) και επίπεδα συσσώρευσης ξανθίνης (60-160%) (Εικόνες 9 και 10). Οι Υ266C, S269C, και V307C εµφανίζουν χαµηλές τιµές ενεργότητας (35-40% του Cys-less), ενώ οι D276C και G299C έχουν 39

40 πολύ περιορισµένη ενεργότητα (γύρω στο 10% του Cys-less). Η ενεργότητα της Ι277C, η οποία εκφράζεται ελάχιστα στη µεµβράνη (Εικόνα 8), είναι οριακή (5% του Cys-less), ενώ οι Τ278C, A279C, T280C, A281C και G305C έχουν µηδενικά επίπεδα ενεργότητας, πράγµα αναµενόµενο αφού δεν εκφράζονται καθόλου στη µεµβράνη της E. coli (Εικόνα 8). Από τις υπόλοιπες 4 διαπεράσες που είχαν εξετασθεί σε άλλες µελέτες του εργαστηρίου (Καρενά Αικατερίνη και Μερµελέκας Γιώργος, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα), οι E272C και D304C έχουν επίσης µηδενική ενεργότητα, αλλά µε κανονικά επίπεδα έκφρασης στη µεµβράνη, ενώ οι S284C και S295C έχουν πολύ υψηλή ενεργότητα (80-90% του Cys-less) και κανονικά επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 10). Εικόνα 9. Καµπύλες πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1µM) συναρτήσει του χρόνου από διαπεράσες single-cys YgfOs: ελέγχθηκαν κύτταρα T184 που εκφράζουν τις διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης G275C, G290C, G299C, G300C και G305C ή τη διαπεράση YgfΟ-Cys-less και απεικονίστηκε η ικανότητα πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης για 0 10 min. 40

41 Εικόνα 10: Ενεργότητες πρόσληψης ξανθίνης των µεταλλαγµάτων µοναδικής κυστεϊνης: έλεγχος πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1 µm) από µετασχηµατισµένα κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 0 C, επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα ΚΡi και δείγµατα τους (50 µl) ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα διαµεµβρανικής µεταφοράς ξανθίνης. Α) Αρχική ταχύτητα πρόσληψης ξανθίνης για χρόνους sec: η τιµή της διαπεράσης YgfO-Cys-less ήταν 1,55 ± 0.21 mol mg 1 min -1 (µέσος όρος 5 πειραµάτων). Οι τιµές των single-cys διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της ΥgfO-Cys-less στο ίδιο πείραµα. Οι τιµές ενεργότητας που δίνονται για τις E272C και D304C προέρχονται από αδηµοσίευτα πειράµατα της Αικατερίνης Καρενά, ενώ οι τιµές των S284C και S295C προέρχονται από αδηµοσίευτα πειράµατα των Σωτηρίας Λιµπανοβνού και Γιώργου Μερµελέκα. Β) Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης για χρόνους 2 10 min: η τιµή της διαπεράσης YgfO-Cys-less ήταν 0.73 ± 0.07 nmol -1 mg 1 (n=5). Οι τιµές των single- Cys διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της YgfO-Cys-less στο ίδιο πείραµα. Οι τιµές των E272C και D304C προέρχονται από αδηµοσίευτα πειράµατα της Αικατερίνης Καρενά, ενώ οι τιµές των S284C και S295C από αδηµοσίευτα πειράµατα των Σωτηρίας Λιµπανοβνού και Γιώργου Μερµελέκα. 41

42 3.4 Μεταλλαξιγένεση επιλεγµένων καταλοίπων στο φυσικού τύπου υπόστρωµα Από την αρχική ανάλυση µεταλλαξιγένεσης σε Cys, φάνηκε ότι υπάρχουν δύο σηµαντικές περιοχές µε κατάλοιπα που µπορεί να παίζουν σηµαντικό ρόλο για την έκφραση ή και τη λειτουργία του YgfO. Η µία είναι αυτή της αλληλουχίας , που περιλαµβάνει τα εκφραζόµενα αλλά ανενεργά ή ελάχιστα ενεργά µεταλλάγµατα E272C, D276C και I277C καθώς και τα τέσσερα διαδοχικά µεταλλάγµατα T278C, A279C, T280C και A281C, που δεν εκφράζονται καθόλου στη µεµβράνη. Η δεύτερη περιοχή είναι αυτή της αλληλουχίας , που περιλαµβάνει τα ανενεργά ή ελάχιστα ενεργά G299C, και D304C, καθώς και την G305C που δεν εκφράζεται καθόλου στη µεµβράνη. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωµατικής εργασίας, προσωρήσαµε σε εκτενέστερη µεταλλαξιγένεση των καταλοίπων Gly299 και Gly305 της δεύτερης ενδιαφέρουσας περιοχής αλληλουχίας, για να διαπιστώσουµε πόσο σηµαντική είναι η αντικατάσταση των θέσεων αυτών για τη λειτουργία και την έκφραση του πρωτεϊνικού µορίου. Έτσι, (α) µεταφέραµε τις δύο αντίστοιχες µεταλλαγές κυστεϊνών στο φυσικού τύπου υπόστρωµα (wt), για να εξετάσουµε αν η ενεργότητα µπορεί να επηρεάζεται από την παρουσία των 5 εγγενών κυστεϊνών (Karatza et al., 2006), και (β) κατασκευάσαµε δύο ακόµη µεταλλάγµατα του G305 στο φυσικού τύπου υπόστρωµα, µε πιο συντηρητικές αντικαταστάσεις (βλ. παρακάτω, 3.5). Ελέγχθηκε, αρχικά, η έκφραση των διαπερασών G299C(wt) και G305C(wt) και ακολούθως η ενεργότητά τους. ιαπιστώθηκε ότι η διαπεράση G299C(wt) είναι πλήρως ενεργή, και παρουσιάζει αρχική ταχύτητα πρόσληψης και µέγιστα επίπεδα έκφρασης αντίστοιχα της YgfO-BAD, ενώ η G305C(wt) έχει µηδενική ενεργότητα, ενώ παράλληλα δεν εκφράζεται καθόλου στη µεµβράνη (Εικόνες 11 και 12). Εικόνα 11. Έκφραση των YgfO(wt), G299C(wt) και G305C(wt): από κύτταρα Τ184 παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών, τα οποία εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες και δείγµατά τους. 100 µg ολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου 12%. Ακολούθησε ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1: και οπτικοποίηση του προϊόντος της αντίδρασης υπεροξειδάσης µε ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (ECL). Τα µοριακά βάρη που αναγράφονται αριστερά των εικόνων προέρχονται από το δείκτη πρότυπων µοριακών βαρών Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). 42

43 Εικόνα 12. Ενεργότητες πρόσληψης ξανθίνης των ΥgfO(wt), G299C(wt) και G305C(wt): έλεγχος πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1 µm) από µετασχηµατισµένα κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 0 C, επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα ΚΡi και δείγµατα τους (50 µl) ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα διαµεµβρανικής µεταφοράς ξανθίνης. Αρχική ταχύτητα πρόσληψης ξανθίνης για χρόνους sec: η τιµή της διαπεράσης YgfO(wt) ήταν 0,34 ± 0.07 nmol mg 1 min -1 (από 1 πείραµα). Οι τιµές των wild type διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt) στο ίδιο πείραµα. Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης για χρόνους 2 10 min: η τιµή της διαπεράσης YgfO(wt) ήταν 0.14 ± 0.04 nmol -1 mg 1 (n=1). Οι τιµές των wild type διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt) στο ίδιο πείραµα. 43

44 3.5 Ευρύτερη µεταλλαξιγένεση του καταλοίπου Gly305 Για να εξετασθεί καλύτερα ο ρόλος της Gly305, κατασκευάσθηκαν και ελέγχθηκε η έκφραση σε κλάσµατα µεµβρανών και η ενεργότητα πρόσληψης ξανθίνης των G305A(wt) και G305P(wt). ιαπιστώθηκε ότι η G305A(wt) εµφανίζει χαµηλά επίπεδα ενεργότητας [περί το 30-40% της ΥgfO(wt)], αλλά εκφράζεται στη µεµβράνη σε επίπεδα συγκρίσιµα µε την YgfO φυσικού τύπου, ενώ η G305P(wt) έχει µηδενική ενεργότητα και αµελητέα επίπεδα έκφρασης (Εικόνες 13 και 14). Εικόνα 13. Έκφραση των YgfO(wt), G305A(wt) και G305P(wt): από κύτταρα Τ184 παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών, τα οποία εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες και δείγµατά τους 100 µg ολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου 12%. Ακολούθησε ανοσοαποτύπωση µε χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1: και οπτικοποίηση του προϊόντος της αντίδρασης υπεροξειδάσης µε ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (ECL). Τα µοριακά βάρη που αναγράφονται αριστερά των εικόνων προέρχονται από το δείκτη πρότυπων µοριακών βαρών Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). 44

45 Εικόνα 14. Ενεργότητες πρόσληψης ξανθίνης των YgfO(wt), G305A(wt) και G305P(wt): έλεγχος πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1 µm) από µετασχηµατισµένα κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες. Τα κύτταρα Καλλιεργήθηκαν στους 37 0 C, επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα ΚΡi και δείγµατα τους (50 µl) ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα διαµεµβρανικής µεταφοράς ξανθίνης. Αρχική ταχύτητα πρόσληψης ξανθίνης για χρόνους sec: η τιµή της διαπεράσης YgfO(wt) ήταν 1,40 ± 0.45 nmol mg 1 min -1 (από 1 πείραµα). Οι τιµές των wild type διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt) στο ίδιο πείραµα. Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης για χρόνους 2 10 min: η τιµή της διαπεράσης YgfO(wt) ήταν 0.60 ± 0.02 nmol -1 mg 1 (n=1). Οι τιµές των wild type διαπερασών εκφράζονται ως επί τοις εκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών της YgfO(wt) στο ίδιο πείραµα. 3.6 Επίδραση αλκυλιωτικών αντιδραστηρίων στην ενεργότητα των διαπερασών Μελετώντας το ρόλο SH αντιδραστηρίων χρησιµοποιήσαµε το Ν- αιθυλµηλεϊµίδιο (ΝΕΜ), ένα σχετικά υδρόφοβο αλκυλιωτικό παράγοντα που αντιδρά επιλεκτικά ή ειδικά υπό κατάλληλες συνθήκες µε τη σουλφυδρυλοµάδα της κυστεΐνης και µπορεί να διαπερνά τη µεµβράνη και να έχει πρόσβαση τόσο σε περιπλασµικές, όσο και σε κυτταροπλασµατικές ή και ενδοµεµβρανικές θέσεις µιας πολυτοπικής µεµβρανικής πρωτεΐνης (Frillingos et al., 1998). Η προσβασιµότητα της κάθε κυστεΐνης σε συνάρτηση µε τις χηµικές ιδιότητες του ΝΕΜ µπορεί να µας δώσει µία εικόνα για την σπουδαιότητα των υπό εξέταση θέσεων της YgfO. Για αυτό µελετήσαµε την επίδραση του ΝΕΜ σε 37 από τα 45 µεταλλάγµατα µοναδικής Cys που κατασκευάσαµε, δηλ. όσα είχαν σηµαντική ενεργότητα (αρχική ταχύτητα πρόσληψης ξανθίνης πάνω από 10%) (Εικόνα 10) και µπορούσαν να εξετασθούν µε το πείραµα αυτό. Εκτός από τα 37 µεταλλάγµατα, υπάρχουν και άλλα δύο ενεργά µεταλλάγµατα στην περιοχή αυτή (S284C και S295C) που είχαν κατασκευασθεί και εξετασθεί ως προς την επίδραση του ΝΕΜ σε παλαιότερη µελέτη του εργαστηρίου (Μερµελέκας Γιώργος και Λιµπανοβνού Σωτηρία, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). 45

46 3.6.1 Επίδραση του ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών Από ένα σύνολο 39 ενεργών µεταλλαγµάτων µοναδικής Cys στην περιοχή αλληλουχίας (Εικόνα 15), µόνο 9 αναστέλλονται σε σηµαντικό βαθµό και 3 απενεργοποιούνται πλήρως από το Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (2 mm). Οι υπόλοιπες 27 διαπεράσες διατηρούν την ενεργότητά τους σε επίπεδα %, ή ακόµα και την αυξάνουν (µέχρι 140%). Από τις διαπεράσες που επηρεάζονται σηµαντικά, οι V274C, I288C, G290C, S295C, και A311C αναστέλλονται κατά 30-45%, οι Y293C, R296C, G300C, και V301C αναστέλλονται κατά 60-75%, ενώ οι Α273C, G275C και S284C απενεργοποιούνται πλήρως, διατηρώντας µόλις 1-10% της αρχικής τους ενεργότητας (Εικόνα 15). Εικόνα 15. Επίδραση του ΝΕΜ (2 mm) στην ενεργότητα των διαπερασών µοναδικής κυστεϊνης: έλεγχος πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1 µm) από µετασχηµατισµένα κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις αντίστοιχες διαπεράσες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 0 C, επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα ΚΡi και δείγµατα τους (50 µl) ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα διαµεµβρανικής µεταφοράς ξανθίνης µετά από προεπώαση µε ΝΕΜ (2 mm, 10 min, 25 ο C). Μετά την επώαση, η αντίδραση του NEM τερµατίσθηκε µε προσθήκη DTT (20 mm). Η δοκιµασία ενεργού µεταφοράς έγινε παρουσία ασκορβικού καλίου (20 mm) και φαιναζινικού µεθοσουλφιδίου (0.2 mm). 46