Λ.Χ. Μαργαρίτης ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑΣ, ΜΕΡΟΣ A. Τμήμα Βιολογίας Μάθημα: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ Γ εξάμηνο.

Transcript

1 Τμήμα Βιολογίας Μάθημα: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ Γ εξάμηνο. ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑΣ, ΜΕΡΟΣ A Λ.Χ. Μαργαρίτης...για περισσότερα...

2 Ηλεκτρονική μικροσκοπία Φροντιστήριο για την άσκηση στο πλαίσιο του μαθήματος «ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ» ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 2

3 Tι κοινό έχουν οι παρακάτω διαπιστώσεις Ο πυρήνας περιβάλλεται από δυο διπλοστοιβάδες λιπιδίων που διαθέτουν πυρηνικούς πόρους Οι πυρηνικοί πόροι έχουν οκταγωνική μορφή και διάμετρο 30 nm, ενώ ο αριθμός τους και η κατανομή τους εξαρτώνται από τη φάση του κυττάρου Ο διπλασιασμός του κυκλικού DNA στα βακτήρια πραγματοποιείται από διάφορα σημεία ταυτόχρονα Ο κυτταρικός σκελετός αποτελείται από μικροινίδια, ενδιάμεσα ινίδια και μικροσωληνίσκους Τα μιτοχόνδρια διαθέτουν εσωτερικές πτυχώσεις μεμβρανών ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014 Λ.Χ. Μαργαρίτης 3

4 Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο διέλευσης Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής Παν/μίου Αθηνών Philips EM300 Transmission Electron Microscope (TEM) ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 4

5 Κατά μήκος διατομή ΗΜ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 5

6 Προϋποθέσεις παρατήσεις στο ΤΕΜ Το παρασκεύασμα να είναι εντελώς στεγνό επειδή το εσωτερικό του ΗΜ ευρίσκεται υπό κενό αέρος (10-4 mmhg) Το πάχος του παρασκευάσματος δεν πρέπει να ξεπερνά τα 50 nm ώστε να το διαπερνούν τα ηλεκτρόνια Τα διάφορα βιομόρια (πρωτεΐνες, κλπ) θα πρέπει να έχουν δεσμεύσει βαρέα μέταλλα (όσμιο, ουράνιο, μόλυβδο) ώστε να γίνει σκέδαση και σχηματισμός εικόνας. ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 6

7 Υπάρχουν 3 τρόποι προετοιμασίας για το ΗΜ διέλευσης Πραγματοποίηση λεπτών τομών πάχους 500 Α με υπερμικροτόμο μετά από ειδική προετοιμασία Αρνητική χρώση Σκίαση ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 7

8 Με την υπερμικροτόμο Πραγματοποιούνται τομές πάχους 40 nm ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 8

9 Λεπτομέρεια υπερμικροτόμου Κεφαλή όπου στερεώνεται ο ιστός μετά τη διαδικασία της έγκλεισης Ιστός Λεπτές τομές πάχους 40 nm ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 9

10 Λεπτομέρεια κεφαλής και μαχαιριδίου από υπερμικροτόμο ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 10

11 Για να γίνουν λεπτές τομές του δείγματος για παρατήρηση στο ΗΜ θα πρέπει, Να έχει γίνει χημική μονιμοποίηση του ιστού Να έχει γίνει αφυδάτωση του ιστού Το δείγμα (κομμάτι ιστού) να είναι αρκετά σκληρό (πολυμερισμός ρητίνης) ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 11

12 Συνοπτικά η διαδικασία της «έγκλεισης» έχει ως εξής: Χημική μονιμοποίηση με αλδεϋδες Χημική μονιμοποίηση/ «χρώση» με OsO4 Αφυδάτωση με αλκοόλες (50, 70, 85, 95, 100%) και προπυλενοξείδιο. Έγκλειση σε ρητίνες Πολυμερισμός ρητίνης (60 0 C) Λεπτές τομές nm τοποθέτηση σε πλέγμα Χρώσεις με βαρέα μέταλλα, οξεικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 12

13 Συλλογή τομών-πλέγμα-χρώση ΣΥΛΛΟΓΗ ΤΟΜΩΝ ΣΤΟ ΠΛΕΓΜΑ ΧΡΩΣΕΙΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟ ΤΕΜ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΛΗΨΗ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 13

14 ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 14

15 Λειτουργία φακών Συγκεντρωτικοί, για ρύθμιση φωτισμού Αντικειμενικός, για ρύθμιση εστίασης Περίθλασης, ενδιάμεσος, προβολικός, για αλλαγή μεγέθυνσης ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 15

16 ΦΑΚΟΙ Συγκεντρωτικοί Ι, ΙΙ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΠΟΜΠΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΩΝ (ΚΥΛΙΝΔΡΟΣ WEHNELT) Αντικειμενικός Περίθλασης Ενδιάμεσος Προβολικός ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ ΜΕ ΤΟΥΣ ΗΛΕΚΤΡΟΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥΣ ΦΑΚΟΥΣ 16

17 Χειρισμός Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2011, Λ.Χ. Μαργαρίτης 17

18 ρύθμιση φωτισμού ΗΜ live 18

19 είσοδος παρασκευάσματος Οθόνη παρατήρησης μέσω βιντεοκάμερας βιντεοκάμερα 19

20 Απόκλιση δέσμης Μετακίνηση δείγματος Απόκλιση δέσμης 20

21 Αριστερός πίνακας ελέγχου ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ Λ.Χ. Μαργαρίτης φωτισμός Απόκλιση δέσμης Αριστερός Βερνιέρος Μετακίνησης δείγματος 21

22 em300d Πλήκτρο ενεργοποίησης αντλίας κενού πιέζουμε ανά 5 Αριστερός πίνακας ελέγχου 22

23 em300i Απόκλιση δέσμης 2 1 Αυτό το κουμπί Δεν το πειράζουμε φωτισμός Αριστερός πίνακας ελέγχου Αριστερός Βερνιέρος Μετακίνησης δείγματος 23

24 εστίαση μεγέθυνση δεξιός πίνακας ελέγχου Δεξιός βερνιέρος μετακίνησης δείγματος 24

25 Απόκλιση δέσμης μικρομετρική Κουμπιά εστίασης αδρή δεξιός πίνακας ελέγχου 25

26 2 1 Εστίαση αδρή μεγέθυνση δεξιός πίνακας ελέγχου 26

27 ΤΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΟΜΕΣ ΑΠΌ ΗΠΑP ΕΠΑΝΩ ΣΕ ΠΛΕΓΜΑ 27

28 Video clip Πλέγμα ΗΜ ΖΩΝΤΑΝΗ ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-b_2012, Λ.Χ. Μαργαρίτης 28

29 Υπερμικροσκοπική ανάλυση κυττάρων Απαιτεί ειδική εξάσκηση και παρατηρητικότητα Αποτελεί διείσδυση στο εσωτερικό της ζωής Έχει ως στόχο την απόλυτη κατανόηση της κυτταρικής λειτουργίας 29

30 ΠΑΡΑΔΕΊΓΜΑΤΑ ΛΕΠΤΟΜΕΡΕΙΩΝ ΠΟΥ ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΑΝΑΖΗΤΗΣΕΤΕ ΣΤΟ ΠΑΡΑΣΕΥΑΣΜΑ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΣΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-_2014 Λ.Χ. Μαργαρίτης 30

31 Κατηγορίες κυττάρων ήπατος Παρεγχυματικά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Φαγοκύτταρα Kupffer Κύτταρα αποταμίευσης λίπους Φυσικά φονικά κύτταρα (ηπατοειδικά) Συνδετικός ιστός (κολλαγόνο) Αγγεία με ερυθρά αιμοσφαίρια 31

32 αγγείο Διάγραμμα Ηπατικού ιστού λυσόσωμα ΠΥΡΗΝΑΣ Χολαγωγός με μικρολάχνες μιτοχόνδριο υπεροξύσωμα μικρολάχνες

33 ΓΕΝΙΚΗ ΑΠΟΨΗ ΗΠΑΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΣΕ ΠΟΛΥ ΧΑΜΗΛΗ ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-b_2012, Λ.Χ. Μαργαρίτης 33

34 ΚΥΤΤΑΡΑ ΗΠΑΤΙΚΟΥ ΠΑΡΕΓΧΥΜΑΤΟΣ μιτοχόνδρια ΚΕΔ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-b_2012, Λ.Χ. Μαργαρίτης 34

35 πυρήνας ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΟ- ΓΡΑΦΙΑ Ηπατικών Κυττάρων Με το Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

36 κυτταρόπλασμα Ηπατικού κυττάρου Κ.Ε.Δ. διακρίνονται μιτοχόνδρια

37 γλυκογόνο λυσόσωμα μιτοχόνδριο Κ.Ε.Δ. ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-b_2012, Λ.Χ. Μαργαρίτης Ριβοσώματα σε πολυριβόσωμα ασβέστιο 37

38 ασβέστιο ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΣΕ ΠΟΛΥ ΜΕΓΑΛΗ ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ

39 GOLGI

40 ΧΟΛΑΓΩΓΟΣ Με μικρολάχνες

41 ΧΟΛΑΓΩΓΟΣ Με μικρολάχνες Κ.Ε.Δ. πολυριβόσωμα 41

42 πολυριβόσωμα ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014 Λ.Χ. Μαργαρίτης 42

43 ΚΟΚΚΙΑ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ

44 ΣΥΝΔΕΤΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ ΙΝΕΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΜΙΚΡΟΛΑΧΝΕΣ ΣΕ ΧΟΛΑΓΩΓΌ liver4

45 ΠΑΡΕΓΧΥΜΑΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ (Π.Κ.) (Π.Κ.) (Π.Κ.) (Π.Κ.) (Π.Κ.) (Π.Κ.) ΑΓΓΕΙΟ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

46 ΑΓΓΕΙΟ ΜΕ ΕΡΥΘΡΟ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΟ

47 ΦΥΣΙΚΟ ΦΟΝΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ 49

48 Εναλλακτικό βιολογικό σύστημα ιππόκαμπος λειτουργία της μνήμης και μάθησης Εικόνα 1.23: Σχηματική παράσταση εγκάρσιας τομής ιππόκαμπου μετά από χρώση Golgi (από αρχείο Camillo Golgi). (Ανατύπωση από πηγή στο ιντερνέτ: Institute of Pathology of the University of Pavia original Golgi s lab preparation). el_prizes/medicine/laureates/1 906/golgiarticle.html ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 50

49 Κοκκιώδη κύτταρα οδοντωτής έλικας ιππόκαμπου ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 51

50 ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 52

51 ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 53

52 ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 54

53 Περισσότερα για λεπτή δομή Ιππόκαμπου Tem1-images-hippo Tem1-images

54 Περισσότερα για ηλεκτρονική μικροσκοπία Στην ειδική διάλεξη που έχει πραγματοποιηθεί και βρίσκεται στις ιστοσελίδες: 3d brain mapping E-lhm teliko_files/lobby0.htm ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ-2014 Λ.Χ. Μαργαρίτης 56

55 Η άσκηση θα γίνεται σε ομάδες των 6 ατόμων Σημειώστε τα ονόματά σας σε ημερολόγιο που βρίσκεται έξω από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο

56 Η άσκηση θα πραγματοποιηθεί μόνο Από όσους γνωρίζουν την ύλη που βρίσκεται στα κεφ. 2 και 3, στο φυλλάδιο ασκήσεων κα στην παρουσίαση αυτή

57 Τι πρέπει να γνωρίζετε πριν έλθετε για την άσκηση Ποιες είναι οι προϋποθέσεις για να εισαχθεί παρασκεύασμα στο ΤΕΜ Πόσοι φακοί υπάρχουν στο ΗΜ και ποια είναι η λειτουργία του καθενός Πως γίνεται η προετοιμασία ενός ιστού για παρατήρηση τομών ή για απομονωμένα μόρια. Με ποια κουμπιά γίνονται οι διάφορες λειτουργίες μεγέθυνση, εστίαση (ευκρίνεια), φωτισμός, ευθυγράμμιση δέσμης. Από ποια διάταξη εκπέμπονται τα ηλεκτρόνια και πως επιταχύνονται ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014, Λ.Χ. Μαργαρίτης 60

58 Η συνέχεια επί της οθόνης του ΤΕΜ ΒΙΟΛ. ΚΥΤΤΑΡΟΥ, ΑΣΚΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ_2014 Λ.Χ. Μαργαρίτης 61