ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 4,6 -ΔΙΔΕΟΞ Υ-2 -ΚΕΤΟ ΑΚΟΡΕΣΤ Α-3 -ΦΘΟΡΟ-/Ή)- ΓΑΥΚΟΠΥΡΑΝΟΝΟΥΚΛΕΟΣΙΔΙΑ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΛΟΑΔΕΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 4,6 -ΔΙΔΕΟΞ Υ-2 -ΚΕΤΟ ΑΚΟΡΕΣΤ Α-3 -ΦΘΟΡΟ-/Ή)- ΓΑΥΚΟΠΥΡΑΝΟΝΟΥΚΛΕΟΣΙΔΙΑ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΛΟΑΔΕΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ Α^-ΒΕΝΖΟΫΛΟΚΥΤΟΣΙΝΗΣ: ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΖΗΝΓΚΟΥ ΛΕΝΙΤΣΑ ΛΑΡΙΣΑ 2009

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 4 ',6 '-ΔΙΔΕΟΞΥ-2 -ΚΕΤΟΑΚΟΡΕΣΤΑ-3 -ΦΘΟΡΟ-β-Ό- ΓΑΥΚΟΠΥΡΑΝΟΝΟΥΚΑΕΟΣΙΔΙΑ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΑΟΑΔΕΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΛΟΚΥΤΟΣΙΝΗΣ: ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΝΗΒζ ΝΗΒζ Ο Ο Ο ΖΗΝΓΚΟΥ ΛΕΝΙΤΣΑ ΛΑΡΙΣΑ 2009

3 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας > ήηρεσια ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Ειδική Συλλογή «Γκρίζα Βιβλιογραφία» Αριθ. Εισ.: Ημερ. Εισ.: Δωρεά: Ταξιθετικός Κωδικός: 7660/ Π.Θ. ΠΤ-ΒΒ 2009 ΖΗΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

4 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 4-6 -ΔΙΔΕΟΞΥ-2 -ΚΕΤΟΑΚΟΡΕΣΤΑ-3 '-<I>OOPO-y?-D- Γ Α ΥΚΟΠ ΥΡΑΝ ΟΝ Ο ΥΚΛΕΟΣΙΔΙΑ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΛΟΑΔΕΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ Λ^-ΒΕΝΖΟΫΑΟΚΥΤΟΣΙΝΗΣ: ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΑΟΓΙΚΗ ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΝΗΒζ ΝΗΒζ ΖΗΝΓΚΟΥ ΛΕΝΙΤΣΑ ΛΑΡΙΣΑ

5 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Κομιώττκ Ατηιήτρτκ - Αναπληρωτής Καθηγητής Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιαχυμείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας \Λί Μαρκουλάτος Παναγιώτης - Καθηγητής Εφαρμοσμένης Μικροβιολογίας του Τμήματος ^φχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Μαντά Στυλιανή - Διδάσκουσα ΠΔ 407/80 του Τμήματος Βιοχημείας -Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας 3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Οργανικής Χημείας κ. Κομιώτη Δημήτρη. Αισθάνομαι υποχρεωμένη να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στον κ. Κομιώτη Δημήτρη που μου έδειξε εμπιστοσύνη προσφέροντάς μου τη δυνατότητα να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα. Η επιστημονική κριτική του, οι πολύτιμες συμβουλές του, η υπομονή του, η ενθάρρυνση καθώς και η καθοδήγησή του συνέβαλαν στη σωστή διεκπεραίωση των πειραματικών διαδικασιών. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τη διδάσκουσα Π.Δ. 407/80 κ. Μαντά Στυλιανή καθώς και την υποψήφια διδάκτορα Νίκη Τζιουμάκη για την άψογη συνεργασία. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του εργαστηρίου Οργανικής Χημείας και όλους όσους συνέβαλαν άμεσα ή έμμεσα στην διεκπεραίωση της εργασίας αυτής. 2

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι υδατάνθρακες αποτελούν μια από τις τέσσερις κύριες κατηγορίες βιομορίων και απαντούν σε κάθε ζωντανό οργανισμό. Ουσιαστικά οι υδατάνθρακες είναι πολυϋδροξυαλδεϋδες (αλδόζες) ή πολυϋδροξυκετόνες (κετόζες) ή προϊόντα πολυμερισμού των ενώσεων αυτών. Το περισσότερο από το μισό οργανικό υλικό που βρίσκεται πάνω στη γη είναι υδατάνθρακες με εντονότερη την παρουσία τους στο φυτικό βασίλειο. Τροποποιημένοι υδατάνθρακες απαντούν στα μόρια του DNA που μεταφέρουν γενετικές πληροφορίες, άλλοι συνιστούν μέρος του περιβλήματος των κυττάρων, ενώ άλλοι χρησιμοποιούνται ως φάρμακα. Τα τροποποιημένα νουκλεοσίδια εμφανίζουν σημαντική αντικαρκινική, αντιική και αντιβιοτική δράση. Τα νουκλεοσίδια και τα ανάλογά τους έχουν μελετηθεί πολύ εντατικά ως δυνητικοί αντικαρκινικοί παράγοντες, ενώ αποτελούν το θεμελιώδη λίθο και για την ανάπτυξη αντιικών παραγόντων. Πολλά φυσικά αντιβιοτικά με σημαντική αντιική και αντικαρκινική δράση περιέχουν στη δομή τους νουκλεοσίδια συνδεδεμένα με ολιγοσακχαρίτες, ενώ αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι πολλά φυσικά αντιβιοτικά φέρουν στη δομή τους την κυτοσίνη ή την αδενίνη ως ετεροκυκλική βάση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον δόθηκε στη μελέτη των δεοξυ-φθορο-κετοακόρεστων πυρανονουκλεοσιδίων προκειμένου να βρεθούν νέα αντικαρκινικά, αντιικά, ή αντι- HIV φάρμακα με μεγαλύτερη εκλεκτικότητα και λιγότερα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα έναντι των έως τώρα κλινικά χρησιμοποιούμενων. Η προσθήκη φθορίου στο μόριο του σακχάρου αποδείχθηκε να είναι μια καλή μέθοδος ενίσχυσης της βιολογικής δράσης. 3

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υδατάνθρακες Κυκλικές δομές μονοσακχαριτών: σχηματισμός ημιακετάλης Κυκλικές δομές της γλυκόζης και της φρουκτόζης Νουκλεοσίδια Τρόπος δράσης νουκλεοσιδίων Νουκλεοσιδικά ανάλογα με σάκχαρο μία πεντόζη Zidovudine (ΑΖΤ: 3' -Azido- 2' -deoxythymidine i.4.2 Didanosine (DDI) Τριφθοριοθυμιδίνη Νουκλεοσιδικά ανάλογα με σάκχαρο μία εξόζη Κετο-πυρανονουκλεοσίδια Ακόρεστα κετονουκλεοσίδια Δεοξυ-πυρανονουκλεοσίδια Φθοριωμενα νουκλεοσίδια ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στόχος-σκοπός μελέτης Μεθοδολογία σύνθεσης Μεθοδολογία σύνθεση της 9-(4',6'-Διόεοξυ-3 '-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3 ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)- Α^-βενζοϋλοαδενίνης Μεθοδολογία σύνθεσης της 1-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3 ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)-^4-βενζοϋλοκυτοσίνης ΓΕΝΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Χρωματογραφία χάρτου (TLC: Thin Layer Chromatography) Χρωματογραφία στήλης Ξήρανση διαλυτών Ταυτοποίηση ενώσεων ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Σύνθεση της 9-(4',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκερο-εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2 ουλοζοι-δ^-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(3 '-Δεοξυ-3 '-φθορο-2',4'.6'-τρις-0-ακετυλο-/?-0-γλυκοπυρα\όζυλο)- Λ^-βενζοϋλοαδενίνης

8 4.1.2 Σύνθεση της 9-(3 ',4'-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν6- βενζοϋλοαδενίνης ,3_Σύνθεση της 9-(3 '-Δεοξυ-3 '-φθορο-6'-ιωδο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-λ6- βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(2',4'-Δις-Ο-ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-/?-ϋγλυκοπυρανοζυλο)-Λ/6-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(2',4'-Δις-0-ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)- Ν6 -βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(4'-0-Ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν6- βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2'- ουλοζο)-τν6-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 1 -(4',6'-Αιδεοςυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '- ουλοζο^λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1-(3'-Δεοξυ-3'-φθορο-4',6'-0-ισοπροπυλιδενο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)- Λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1-(2'-0-Ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-4',6'-<9-ισοπροπυλιδενο-/?-Ογλυκοττυρανοζυλο)-Λ/4-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1-(2'-Ο-Ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-^-Ο-γλυκοπυρανοζυλο)-^βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1 -(2'-Ο-Ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)- Λ^βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1-(2'-Ο-Ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν4- βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1 -(2 '-Ο-Ακετυλο-4 -Ο-βενζόϋλο-3 ',6 '-διδεοξυ-3 '-φθορο-/ί-0- γλυκοπυρανοζυλο^λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1 -(2 '-(9-Ακετυλο-3 '.6'-διδεοξυ-3 '-φθορο-/ί-π-γλυκοπυρανοζυλο)-λ'4- βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1 -(4',6'-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2'- ουλοζο)- Λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ Η NMR ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Χημικά χαρακτηριστικά Αντικαρκινική δράση ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Υδατάνθρακες Οι υδατάνθρακες αποτελούν μια ξεχωριστή κατηγορία ενώσεων με μοριακά βάρη που κυμαίνονται από μικρότερα του 100 μέχρι εκατοντάδες χιλιάδες. Οι περισσότεροι υδατάνθρακες ανταποκρίνονται στο γενικό τύπο (CH20)n. Γενικά χωρίζονται σε τέσσερεις κατηγορίες: Μονοσακχαρίτες ή απλά σάκχαρα τα οποία είναι μονομερείς ενώσεις, που αποτελούνται από 3-6 άτομα άνθρακα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η γλυκόζη και η φρουκτόζη, που αποτελούν τα μονομερή για τη σύνθεση πολυπλοκότερων δομών. Δισακχαρίτες που αποτελούνται από δύο μονοσακχαρίτες συνδεδεμένους με ομοιοπολικό δεσμό. Ο ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ των μονοσακχαριτών ονομάζεται γλυκοζιτικός δεσμός. Οι κυριότεροι δισακχαρίτες είναι: η μαλτόζη που προκύπτει από τη συμπύκνωση δύο μορίων γλυκόζης, η σακχαρόζη που προκύπτει από την ομοιοπολική σύνδεση ενός μορίου γλυκόζης και ενός μορίου φρουκτόζης και η λακτόζη που προκύπτει από τη συμπύκνωση ενός μορίου γλυκόζης και ενός μορίου γαλακτόζης. Η μαλτόζη αποτελεί προϊόν της διάσπασης του αμύλου. Η σακχαρόζη είναι συστατικό των φρούτων και πηγή γλυκόζης για ζωικούς οργανισμούς. Η λακτόζη είναι το σάκχαρο του γάλακτος. Ολιγοσακχαρίτες, οι οποίοι παρασκευάζονται με σύνδεση μερικών μονοσακχαριτών, συνήθως αποτελούνται από μονοσακχαρίτες. Πολυσακχαρίτες, οι οποίοι προκύπτουν από τον πολυμερισμο πολλών μορίων μονοσακχαριτών, όπως το άμυλο, το γλυκογόνο, η κυτταρίνη, και πολλά άλλα σημαντικά βιολογικά μόρια. Δεν υπάρχει σαφής διαχωρισμός μεταξύ ενός μεγάλου ολιγοσακχαρίτη και ενός μικρού πολυσακχαρίτη, αφού αυτοί οι όροι στην πραγματικότητα χρησιμοποιούνται απλά για να περιγράφουν ενώσεις οι οποίες έχουν μοριακό βάρος μέσα σε ένα ευρύ πεδίο τιμών. Ο γενικός τύπος (CH20)n ανταποκρίνεται ακριβώς στο μοριακό τύπο μόνο των μονοσακχαριτών οι οποίοι έχουν ίδιο αριθμό ατόμων άνθρακα και 6

10 οξυγόνου και διπλάσιο αριθμό ατόμων υδρογόνου στο μόριό τους. Οι ολιγοσακχαρίτες και οι πολυσακχαρίτες διαφέρουν ελαφρά από τον τύπο αυτό. 1.2 Κυκλικές δομές μονοσακχαριτών : σχηματισμός ημιακετάλης Οι υδατάνθρακες είναι αλδεϋδικές ή κετονικές ενώσεις με πολλαπλές υδροξυλικές ομάδες. Τα σάκχαρα που αποτελούνται από πέντε άτομα άνθρακα ονομάζονται πεντόζες και αυτά που αποτελούνται από έξι άτομα άνθρακα ονομάζονται εξόζες. Τα υδροξύλια, -ΟΗ, συντελούν στην υδατοδιαλυτότητά τους, ενώ το καρβονύλιο τους προσδίδει αναγωγικές ιδιότητες. Οι ανοιχτές αλυσίδες των πεντοζών και των εξοζών τείνουν να κυκλοποιούνται όταν βρεθούν εντός διαλύματος, δηλαδή η επικρατέστερη μορφή τους είναι η μορφή δακτυλίου*]> (εικόνα 1). Οι πενταμελείς και εξαμελείς κυκλικές ημιακετάλες είναι ιδιαίτερα σταθερά μόρια, γι αυτό αρκετοί υδατάνθρακες απαντούν σε κατάσταση ισορροπίας ανάμεσα στις δομές ανοικτής και κλειστής αλυσίδας. Τα στάδια του μηχανισμού του σχηματισμού της ημιακετάλης είναι τα εξής: Πρωτονίωση του καρβονυλικού οξυγόνου, η οποία πολώνει έντονα το καρβονύλιο. Ενεργοποίηση της καρβονυλικής ομάδας για πυρηνόφιλη προσβολή από το μονήρες ζεύγος ηλεκτρονίων του οξυγόνου της αλκοόλης Απόσπαση ενός πρωτονίου που οδηγεί σε ένα τετραεδρικό ενδιάμεσο, μια ουδέτερη ημιακετάλη. Εικόνα 1. Μηχανισμός σχηματισμού ημιακετάλης'11 7

11 1.2.1 Κυκλική δοαή ττκ γλυκόζης και της φρουκτόζης Στη γλυκόζη η C-1 αλδεϋδική ομάδα του τύπου ανοικτής αλυσίδας της γλυκόζης αντιδρά με το υδροξύλιο του C-5 για να σχηματίσει μια ενδομοριακή ημιακετάλη. Ο εξαμελής δακτύλιος του σακχάρου που παράγεται, καλείται πυρανόζη, λόγω της ομοιότητάς του με το πυράνιο(2) (εικόνα 2β). Η κετονική ομάδα στον C-2 του τύπου της ανοικτής αλυσίδας της φρουκτόζης είναι σε θέση να αντιδράσει με την υδροξυλική ομάδα του C-5 για να σχηματίσει μια ενδομοριακή ημιακετάλη. Ο πενταμελής δακτύλιος του σακχάρου καλείται φουρανόζη, λόγω της ομοιότητας του με το φουράνιο'2' (εικόνα 2α). Ο (α) (β) (γ) Εικόνα 2. (α) Φουράνιο, (β) Πυράνιο, (γ) γλυκόζη'2* Κατά την κυκλοποίηση της γλυκόζης δημιουργείται ένα πρόσθετο ασύμμετρο κέντρο. Ο άνθρακας C-1, ο καρβονυλικός άνθρακας στην ανοικτή αλυσίδα, μετατρέπεται σε ένα ασύμμετρο κέντρο στο δακτύλιο. Μπορεί να προκόψουν δύο δομές. Η «-D-γλυκοπυρανόζη και η /ί-ο-γλυκοπυρανόζη. Ο χαρακτηρισμός α σημαίνει ότι το υδροξύλιο που συνδέεται στον C-1 βρίσκεται κάτω από το επίπεδο του δακτυλίου, ενώ β σημαίνει ότι βρίσκεται πάνω από το επίπεδο του δακτυλίου. Ο άνθρακας C-1 καλείται ανωμερής και έτσι οι μορφές α και β καλούνται ανωμερείς. Η ίδια ονοματολογία εφαρμόζεται και στον φουρανοζικό δακτύλιο της φρουκτόζης, με τη διαφορά ότι τα α και β αναφέρονται στο υδροξύλιο που είναι ενωμένο στον άνθρακα C-2, που είναι ανωμερής. Η φρουκτόζη είναι δυνατόν να δημιουργήσει και δακτυλίους πυρανόζης. Ο εξαμελής δακτύλιος της πυρανόζης δεν είναι δυνατόν να είναι επίπεδος, λόγω της τετραεδρικής γεωμετρίας των κορεσμένων ατόμων άνθρακα. Αντίθετα, οι δακτύλιοι της πυρανόζης μπορούν να υιοθετήσουν στερεοδιατάξεις ανάκλιντρου, με αποτέλεσμα να εξουδετερώνονται όλες οι τάσεις, εφόσον όλοι οι γειτονικοί δεσμοί 8

12 C-H έχουν διαβαθμισμένη διαμόρφωση και οι γωνιές C-C-C μπορούν να προσεγγίσουν την απαλλαγμένη από τάσεις τιμή της κανονικής τετραεδρικής γωνιάς.(1) a e a Εικόνα 3. Μορφή ανάκλιντρου μιας πυρανόζης (e= ισημερινός υποκαταστάτης, a= αξονικός υποκαταστάτης)(1) Οι υποκαταστάτες των ατόμων άνθρακα του δακτυλίου είναι δύο ειδών: οι αξονικοί και οι ισημερινοί (εικόνα 3). Οι αξονικοί δεσμοί είναι σχεδόν κάθετοι προς το μέσο επίπεδο του δακτυλίου, ενώ οι ισημερινοί δεσμοί είναι σχεδόν παράλληλοι προς το επίπεδο αυτό. Οι αξονικοί υποκαταστάτες προβάλουν πάνω και κάτω από το μέσο επίπεδο του δακτυλίου, ενώ οι ισημερινοί υποκαταστάτες διατάσσονται στην περιφέρεια. Οι αξονικοί υποκαταστάτες, εκτός του υδρογόνου, παρεμποδίζουν στερεοχημικά ο ένας τον άλλο, αν ξεπροβάλουν από την ίδια πλευρά του δακτυλίου. Αντίθετα, υπάρχει πολύ περισσότερος χώρος για τους ισημερινούς υποκαταστάτες. Έτσι, ένας υποκαταστάτης είναι σταθερότερος στην ισημερινή απ ότι στην αξονική θέση. Η ενεργειακή διαφορά ανάμεσα στα αξονικά και ισημερινό διαμορφομερή, οφείλεται στη στερεοχημική τάση που προκαλείται από τις λεγάμενες 1,3-διαξονικές αλληλεπιδράσεις. Οι δακτύλιοι φουρανόζης, όπως και της πυρανόζης, δεν είναι επίπεδοι. Μπορούν να είναι πτυχωμένοι έτσι ώστε τα τέσσερα άτομα να είναι στο ίδιο επίπεδο και το πέμπτο εκτός του επιπέδου αυτού (εικόνα 4). Η 4-0 Η Εικόνα 4. Μορφή φακέλου της β-0-ριβόζης(2) 9

13 Αυτή η διαμόρφωση καλείται μορφή φακέλου γιατί η δομή αυτή μοιάζει με ανοιχτό φάκελο με το πίσω μέρος ανασηκωμένο. Οι δακτύλιοι της φουρανόζης είναι σε θέση να αλληλομετατρέπονται ταχύτατα σε διαφορετικές στερεοδιατάξεις. Είναι πολύ πιο ευέλικτοι από τους δακτυλίους της πυρανόζης, γεγονός που εξηγεί την επιλογή τους ως συστατικών του RNA και DNA.(I'2) 1.3 Νουκλεοσίδια Τα τελευταία χρόνια πληθώρα ερευνητικών προγραμμάτων εστιάζεται στη μελέτη, σύνθεση και βιολογική ταυτοποίηση νουκλεοσιδίων και νουκλεοσιδικών αναλογών. Έχει βρεθεί ότι τα νουκλεοσίδια επιδεικνύουν σημαντική αντικαρκινική, αντιβακτηριακή και αντιική δράση.(3) Συνεπώς έχουν γίνει πολλές τροποποιήσεις στο τμήμα της βάσης και του σακχάρου των φυσικών νουκλεοσιδίων με απώτερο σκοπό να διευρυνθεί το φάσμα των θεραπευτικών δραστηριοτήτων τους. Έχει διαπιστωθεί ότι πολλά φυσικά αντιβιοτικά με σημαντική αντιική και αντικαρκινική δράση περιέχουν στη δομή τους νουκλεοσίδια συνδεδεμένα με ολιγοσακχαρίτες. Τα νουκλεοσίδια είναι γλυκοσυλαμίνες που προέρχονται από την ένωση μιας νουκλεοβάσης (αδενίνη, γουανίνη. κυτοσίνη. Ουμίνη, ουρακίλη) και της ριβόώηο (ριβονουκλεοσίδια) ή της δεο υριβό6κ (δεοξυριβονουκλεοσίδια). Η πουρίνη ή πυριμιδίνη ενώνεται στη θέση 1' της πεντόζης με /ΑΎ-γλυκοσιδικό δεσμό, κατά τον οποίο η βάση βρίσκεται πάνω από το επίπεδο του σακχάρου.(4) Ο αποφασιστικής σημασίας παρόμοιος τρόπος γλυκοσιδικής σύνδεσης είναι προφανής σε πολλά βασικά μακρομόρια, όπως νουκλεοτίδια, RNA και DNA. Οι Α-γλυκοσιδικοί δεσμοί σε όλα τα φυσικά μακρομόρια έχουν στερεοδιάταξη βί2)(εικόνα 5). ΟΗΟΗ Εικόνα 5. Αδενοσίνη 10

14 1.4 Τρόπος δράσης νουκλεοσιδίων Η σύνθεση των νουκλεοσιδίων συνήθως πραγματοποιείται ενδοκυτταρικά. Μπορούν επίσης να εισέλθουν στα κύτταρα με παθητική διάχυση. Αυτό επιτρέπει στα ανάλογα νουκλεοσιδίων με αντιική ή/και αντικαρκινική δράση να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία πολλών ασθενειών.15' Το φάρμακο αρχικά πρέπει να αλληλεπιδράσει με ένα μοριακό στόχο ώστε να προκαλέσει κάποια δράση. Οι πρωτεΐνες ή τα νουκλεϊκά οξέα αποτελούν τους κύριους μοριακούς στόχους για τα περισσότερα φάρμακα.(6) Οι πιο κοινοί τύποι πρωτεϊνών-μοριακών στόχων των φαρμάκων είναι οι υποδοχείς, οι δίαυλοι ιόντων, τα ένζυμα και τα μόρια μεταφορείς. Τα νουκλεοσιδικά ανάλογα είναι χημικά τροποποιημένες ενώσεις των φυσικών νουκλεοσιδίων και στοχεύουν αποτελεσματικά τις ιικές πολυμεράσες. Τα φυσικά νουκλεοσίδια τροποποιούνται στα κύτταρα για να παράγουν τα νουκλεοτίδια, τα οποία χρησιμοποιούνται από τις πολυμεράσες ως βασικές δομικές μονάδες γενετικού υλικού DNA και RNA. Τα αντιικά φάρμακα νουκλεοσιδίων μιμούνται τα φυσικά νουκλεοτίδια και ανταγωνίζονται τη θέση τους. Έτσι κατά την αντιγραφή του ιικού γονιδιώματος από τις RNA πολυμεράσες τα ανάλογα νουκλεοσιδίων καταλαμβάνουν τη θέση των φυσικών νουκλεοσιδίων και επέρχεται καταστολή της μεταγραφής του ιού. Η καταστολή αυτή επιτυγχάνεται είτε μέσω αντιπολλαπλασιαστικών λειτουργιών είτε μέσω καταστολής της αντιγραφής του ιού στα μολυσμένα κύτταρα.(7) Ο βασικός λόγος που τα νουκλεοσιδικά ανάλογα χρησιμοποιούνται ως αντικαρκινικά και ως αντιικά είναι ότι μπορούν να τροποποιηθούν δομικά, έτσι ώστε να παράγουν φαρμακολογικά ενεργά παράγωγα. Παρόλο που αυτά τα θεραπευτικά ανάλογα είναι ανενεργό προφάρμακα, η ενδοκυτταρική φωσφορυλίωσή τους τα καθιστά ενεργά.(8) Αν και τα φωσφορυλιωμένα ανάλογα δεν μπορούν να διαπεράσουν την κυτταρική μεμβράνη, τα μη φωσφορυλιωμένα εισάγονται στο κύτταρο από πρωτέίνες-μεταφορείς νουκλεοσιδίων. Στη συνέχεια φωσφορυλιώνονται προς τις τριφωσφορικές τους μορφές από κυτταρικά ή ιικά ένζυμα, και καθώς είναι ενεργά, εμποδίζουν είτε άμεσα είτε έμμεσα τον κυτταρικό ή ιικό διπλασιασμό, ή προκαλούν διαταραχές στις δεξαμενές νουκλεοτιδίων, που με τη σειρά τους παρεμποδίζουν τον αναδιπλασιασμό του DNA. 11

15 Η πρώτη φωσφορυλίωση που οδηγεί στο σχηματισμό του 5'-μονοφωσφορικού νουκλεοσιδίου συνήθως καταλύεται από μία νουκλεοσιδική κινάση που κωδικοποιείται από το κύτταρο-ξενιστή ή τον ιό που μολύνει το κύτταρο-ξενιστή. Η μετατροπή του 5'-μονοφωσφορικού νουκλεοσιδίου προς τις αντίστοιχες 5'- διφωσφορικές και τριφωσφορικές δομές πραγματοποιείται από νουκλεοτιδικές κινάσες και νουκλεοσιδικές διφωσφορικές κινάσες, αντίστοιχα (εικόνα 6). Συνεπώς, τόσο οι κυτταρικές όσο και οι ιικές κινάσες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό και την αντιγραφή των κυττάρων και των ιών. Συνέπεια αυτού είναι η συσσώρευση των αναλογών φωσφορυλιωμένων νουκλεοτιδίων κυρίως στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιό. εςωκυττάριο μέσο κυτταρική μεμβράνη ενδοκυττάριο μέσο R Βάση ΟΗ Ουρακίλη Η Ουμΐνη OH Κοτοσίνη Νουκλεοσίδιο Νουκλεοσίδιο Νσυκλεοτιδ ικη κινάση Ο Ο HO-F -O-P-O OH ΟΗ 5 -μονοοωσφορικό νουκλεοσίδιο 5 -όιο»σ ορικό νουκλεοσίδιο Νουκλεοσιδική διφωσοορικί] κινάση Ο Ο Ο ΗΟ-Ρ-Ο-Ρ-Ο-Ρ-Ο ΒοΙ0Γ» OH OH 0Η Ί^-Ο-^Ι OH R 5 -τριοωσοορικό νουκλεοσΐδιο Εικόνα 6. Τροποποίηση των νουκλεοσιδικών αναλογών προς την ενεργή τους μορφή μέσω ενδοκυτταρικής φωσφορυλίωσης. 12

16 Τα τμήματα των νουκλεϊνικών οξέων διαμορφώνονται από τις κυτταρικές πολυμεράσες, οι οποίες συνδέουν το 5 -νουκλεοτίδιο στην ομάδα 3'-υδροξυλίου ενός άλλου νουκλεοτιδίου. Σε αυτή την διαδικασία, απελευθερώνεται πυροφωσφορική ομάδα (ΡΡΐ), και οι δύο ζάχαρες συνδέονται με φωσφοδιεστερική γέφυρα.(1,2,9) Το σάκχαρο, είναι το τμήμα του νουκλεοσιδίου που χρησιμεύει ως υπόστρωμα για τις κινάσες και τις πολυμεράσες για τη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων και την επιμήκυνση των αλυσίδων. Εάν ένα ανάλογο νουκλεοτιδίων δεν έχει μια ομάδα 3'- υδροξυλίου, δεν μπορεί να ενωθεί με τη 5'-φωσφορική ομάδα του επόμενου νουκλεοτιδίου, και αυτό παρεμποδίζει αποτελεσματικά την επιμήκυνση της αλυσίδας (εικόνα 7). Εικόνα 7. Τερματισμός αλυσίδας(10) Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων αναμένονται να είναι αποτελεσματικά ενάντια στις περισσότερες, εάν όχι σε όλες οι μορφές ιών. Η ειδικότητά τους έγκειται στο ότι ο ιός μπορεί με το ένζυμο του να ενεργοποιήσει τη δράση του φαρμάκου ή/και στο ότι οι ιικές πολυμεράσες μπορεί να είναι πολύ πιο ευαίσθητες στη δράση του φαρμάκου απ ότι στα αντίστοιχα ένζυμα του κυττάρου ξενιστή/111 Το ένζυμο του ιού δεν απαιτεί ειδική σύνδεση με το υπάρχον υπόστρωμα, σε αντίθεση με το ένζυμο του κυττάρου ξενιστή. Αυτό σημαίνει ότι το ένζυμο του ιού μπορεί να δρα και σε φάρμακα ανάλογων νουκλεοσιδίων (διαφορετικό υπόστρωμα) και να τα φωσφορυλιώνει, ενώ το κύτταρο ξενιστή θα τα αφήνει ανεπηρέαστα εφόσον δεν είναι εφικτή η σύνδεση ενζύμου-υποστρώματος/11,

17 Οι ιοί μπορούν να αντιμετωπιστούν εκλεκτικά με φάρμακα νουκλεοσιδίων και ανάλογων νουκλεοσιδίων. Η εκλεκτική αναστολή τους μπορεί να επιτευχθεί: (α) με την αναστολή ειδικών σταδίων της πορείας αναπαραγωγής του ιού, όπως η προσκόλληση του ιού σε κάποιο κυτταρικό υποδοχέα, η διείσδυση του στο κύτταρο, η αποβολή του περιβλήματος, η απελευθέρωση και (β) με την κατά προτίμηση αναστολή κάποιων σταδίων τα οποία είναι κοινά με το κύτταρο του ξενιστή και περιλαμβάνουν τη μεταγραφή και τη μετάφραση.(6) Τα νουκλεοσίδια μπορούν να ενεργήσουν με διαφορετικούς μηχανισμούς: μπορούν να αναστείλουν τη δράση των βασικών ενζύμων στο μεταβολισμό των νουκλεϊνικών οξέων ή/και μπορούν να ενσωματωθούν στα πρόσφατα συντεθειμένα νουκλεϊνικά οξέα προκαλώντας τον τερματισμό των αλυσίδων ή την παραγωγή μη λειτουργικών βιομορίων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο, ο οποίος είναι επιθυμητός όσον αφορά τη θεραπεία του καρκίνου και των αυτοάνοσων ασθενειών. Επιπλέον, οι ενώσεις που μπορούν να στοχεύσουν εκλεκτικά στα βακτηριακά ή στα προερχόμενα από ιό ένζυμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιβακτηριακοί ή αντιικοί παράγοντες.{6) 1.3 Νουκλεοσιδικά ανάλογα με σάκχαρο μία πεντόζη Πολλά ερευνητικά προγράμματα που είχαν ως στόχο την παραγωγή φαρμάκων με αντιική και αντικαρκινική δράση, επικεντρώθηκαν στη χρήση νουκλεοσιδικών αναλογών με σάκχαρο μία πεντόζη που φέρουν τη ^-απεικόνιση. Η σπουδαιότητα των νουκλεοσιδικών αναλογών με σάκχαρο μία πεντόζη πηγάζει από το γεγονός ότι όλα τα φυσικά νουκλεοσίδια στο DNA και RNA αποτελούνται από ένα D- πεντοφουρανοζικό σάκχαρο συνδεδεμένο με μία ετεροκυκλική νουκλεοβάση (πουρίνη ή πυριμιδίνη), μέσω ενός /?-Α-γλυκοσιόικού δεσμού.(b) Μερικά από τα νουκλεοσιδικά ανάλογα που διαθέτουν για σάκχαρο μία πεντόζη είναι: το Zidovudine (ΑΖΤ), το Didanosine (DDI) και η τριφθοριοθυμιδίνη. 14

18 1.4.1 Zidovudine (AZT: 3' -Azido-2' -deoxythymidine) To Zidovudine ή AZT (εικόνα 8) είναι ένα νουκλεοσιδικό ανάλογο αναστολέας της αντίστροφης μεταγραφάσης, δηλαδή του ενζύμου που χρησιμοποιούν οι ρετροιοί για να συνθέσουν DNA. Είναι ανάλογο της θυμιδίνης και χορηγείται για την αντιμετώπιση του ιού της ανθρώπινης επίκτητης ανοσοανεπάρκειας τύπου I, επομένως για τη θεραπεία του AIDS. Ο Ν=Ν=Ν Εικόνα 8. Η χημική δομή του ΑΖΤ(14) Η αντίστροφη μεταγραφάση, είναι το ένζυμο που χρησιμοποιεί ο ιός για να συνθέσει το νέο DNA. To Zidovudine αναστέλλοντας τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης, εμποδίζει την παραγωγή του DNA και κατά συνέπεια και των νέων ιών. Τα κυτταρικά ένζυμα μετατρέπουν το zidovudine στην ενεργή του μορφή, 5'- τριφωσφορικού άλατος (εικόνα 9). Η :η η Εικόνα 9. Ενεργή μορφή του ΑΖΤ. Στη θυμιδίνη προστίθενται τρία φωσφορικά οξέα. Το ένα προστίθεται από το ιικό ένζυμο και τα υπόλοιπα δύο από τα κυτταρικά ένζυμα/^ 15

19 Ο τερματισμός της αλυσίδας του DNA, είναι αποτέλεσμα της απουσίας της ομάδας του 3'-υδροξυλίου στο zidovudine, το οποίο καθιστά αδύνατη τη σύνδεση άλλων νουκλεοτιδίων. Μελέτες έδειξαν ότι ο τερματισμός των αλυσίδων αποτελεί τον παράγοντα της ανασταλτικής επίδρασης (15,16) (εικόνα 10). 5 3' 5' Ο* θ' Ο Εικόνα 10. Ανάλογα νουκλεοσιδίων στο τερματισμό αλυσίδων <16) Didanosine ή DPI To DDI (εικόνα 11) αποτελεί ένα νουκλεοσιδικό ανάλογο με αντιική δράση, αναστέλλοντας την αντιγραφή των ρετροιών όπως του HIV. Η δράση του είναι ανάλογη του ΑΖΤ, δηλαδή παρεμποδίζει τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης. (17) Ο Εικόνα 11. Η χημική δομή του DDI 16

20 1.4.3 Τριωθοριοθυμιδίνη Η τριφθοριοθυμιδίνη, είναι ένα φθοριωμένο ανάλογο θυμιδίνης (εικόνα 12). Ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση από κυτταρικά ένζυμα, σχηματίζοντας ένα τριφωσφορυλιωμένο παράγωγο. Το ενεργοποιημένο παράγωγο αναστέλλει τον ιό απλού έρπητα (HSV : Herpes Simplex Virus). Προκαλεί αναστολή της θυμιδιλικής συνθετάσης και της ιικής και κυτταρικής DNA πολυμεράσης και ενσωματώνεται στο DNA του ιού και του κυττάρου, προκαλώντας διαταραχή στη δομή του DNA. Προκλινικές μελέτες προβλέπουν πως η τριφθοριοθυμιδίνη έχει μεταλλαξιογόνο και τερατογόνο δράση.(18) ο,α OH Εικόνα 12. Η χημική δομή της τριφθοριοθυμιδίνης 1.5 Νουκλεοσιδικά ανάλογα με σάκχαρο μια εξόζη Λόγω των μειονεκτημάτων που εμφάνισε η χρήση των φουρανονουκλεοσιδικών αναλογών, όπως ανεπαρκή μεταβολισμό προς τις ενεργές τριφωσφορικές δομές τους, χημική ή ενζυματική απενεργοποίησή τους, τοξικότητα, εμφάνιση νέων ανθεκτικών ιών και όγκων και τέλος μικρό χρόνο ημιζωής και κατά συνέπεια μικρό χρόνο δράσης, οι έρευνες στράφηκαν στη μελέτη της αντικαρκινικής και αντιικής δράσης νέων νουκλεοσιδικών αναλογών που φέρουν ως σάκχαρο μια εξόζη (πυρανονουκλεοσίδια).<ι9) Το ενδιαφέρον των επιστημόνων στράφηκε προς τα πυρανονουκλεοσίδια επειδή μελέτες έδειξαν ότι το μόριο του εξαμελούς δακτυλίου έχει μεγαλύτερη σταθερότητα λόγω της απουσίας τάσεων και έχει μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής δηλαδή μεγαλύτερο χρόνο δράσης. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η έρευνα για την ανακάλυψη αντιικών και αντικαρκινικών νουκλεοσιδικών αναλογών με εξαμελή 17

21 υδατανθρακικό δακτύλιο είχε μείνει αρκετά βήματα πίσω σε σχέση με αυτή των βιολογικώς ενεργών νουκλεοσιδίων με τροποποιημένους πενταμελείς δακτυλίους. Παρόλα αυτά, νουκλεοσίδια με τροποποιημένους εξαμελείς υδατανθρακικούς δακτυλίους έχουν αξιολογηθεί για τις πιθανές αντιικές, αντικαρκινικές και αντιβιοτικές τους ιδιότητες, καθώς και ως δομικές μονάδες στη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων.(20) Κετο- πυρανονουκλεοσίδια Μία σημαντική τάξη πυρανονουκλεοσιδικών αναλογών αποτελούν τα κετοπυρανονουκλεοσίδια, τα οποία περιλαμβάνουν μία κετονομάδα στο τμήμα του σακχάρου, ως αποτέλεσμα της οξείδωσης ενός ασύμμετρου ατόμου άνθρακα και επιπλέον αποτελούν απαραίτητα ενδιάμεσα στη βιοσύνθεση πολλών φυσικών νουκλεοσιδικών αντιβιοτικών προϊόντων. Παρόλο που τα κετο-φουρανονουκλεοσίδια, στις περισσότερες περιπτώσεις αποδείχθηκαν ασταθή, τα κετο-πυρανονουκλεοσίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των αντιβιοτικών καθώς αποτελούν απαραίτητα ενδιάμεσα στη βιοσύνθεση πολλών από αυτά Ένας σημαντικός αριθμός κετο-πυρανονουκλεοσιδίων εμφανίζουν ενδιαφέρουσα αντικαρκινική και αντιική δράση.(2 ) Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν οι παρακάτω ενώσεις (εικόνα 13). Εικόνα 13. Κετο- πυρανονουκλεοσίδια 18

22 1.5.2 Ακόρεστα κετο- πυρανονουκλεοσίδια Μία ακόμη κατηγορία πυρανονουκλεοσιδίων αποτελούν τα ακόρεστα κετονουκλεοσίδια, τα οποία διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα αντικαρκινικών και αντιικών ιδιοτήτων. Στα συγκεκριμένα νουκλεοσίδια ο δακτύλιος του σακχάρου περιλαμβάνει ένα διπλό δεσμό άνθρακα-άνθρακα σε α,/?-θέση ως προς την κετονομάδα. Τα ακόρεστα κετονουκλεοσίδια είναι σημαντικά για την αντινεοπλασματική δραστικότητα και τα ανοσοκατασταλτικά τους χαρακτηριστικά.(22) Αποδείχθηκε ότι παρουσιάζουν ανασταλτική δράση έναντι της ανάπτυξης διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών in vitro και της λευχαιμίας L1210 in vivo αλλά επιπλέον αποτελούν και σημαντικά συνθετικά ενδιάμεσα στο πεδίο των νουκλεοσιδίων, λόγω της χημικής τους σταθερότητας στα διάφορα μέσα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αυτών των νουκλεοσιδίων, αποτελούν οι παρακάτω ενώσεις (εικόνα 14). Εικόνα 14. Ακόρεστα κετο -πυρανονουκλεοσίδια Οι έρευνες που πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σχέση δομήςδράσης των ακόρεστων κετο-νουκλεοσιδίων, απέδειξαν ότι μοναδική δομική απαίτηση για την εμφάνιση της αντικαρκινικής τους δράσης αποτελεί η ύπαρξη του ηλεκτρονιόφιλου C=C-C=0 συστήματος στο τμήμα του σακχάρου. Μία άλλη σημαντική παράμετρος που συνεισφέρει στη βιολογική σπουδαιότητα των παραπάνω μορίων αποτελεί η ύπαρξη του διπλού δεσμού στο τμήμα του σακχάρου, ο οποίος προκαλεί ακαμψία στο δακτύλιο, όμοια με αυτή ενός φουρανονουκλεοσιδίου, με αποτέλεσμα να μπορούν να θεωρηθούν ως (βιο)ισοστερή των φυσικών νουκλεοσιδίων και νουκλεοτιδίων.(23) 19

23 1.5.3 Αεο υ- πυρανονουκλεοσίδια Μια άλλη κατηγορία πυρανονουκλεοσιδίων είναι τα δεοξυπυρανονουκλεοσίδια. Στα δεοξυνουκλεοσίδια ένα υδροξύλιο έχει αντικατασταθεί από ένα υδρογόνο σε οποιαδήποτε θέση του σακχάρου, το οποίο ενώνεται απευθείας με την αζωτούχο βάση. Αξιοσημείωτη είναι η αντιική, αντικαρκινική καθώς και η αντιλευχαιμική δράση που εμφάνισαν ορισμένα πουρινικά και πυριμιδινικά 2'- δεοξυπυρανονουκλεοσίδια.(27) Μία ακόμη διαπίστωση που αυξάνει το ενδιαφέρον για τα συγκεκριμένα νουκλεοσίδια, αποτελεί το γεγονός ότι ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία περιέχουν διάφορα Αιδεοξυ-/?-0-ερυθρο-εξοπυρανονουκλεοσίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια.(24) Τα 2',4'-Διδεοξυ-/?-0-ερυθρο-εξοπυρανονουκλεοσίδια αποδείχθηκαν χρήσιμες δομικές μονάδες για τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων (ενώσεις α, εικόνα 1 5).<2?ι Εταπλέον, τα 1,5-ανυδροεξιτολο-νουκλεοσίδια εμφάνισαν αντιική δράση έναντι του ιού του απλού έρπητα τύπου 1 και τύπου 2, του κυτταρομεγαλοϊού καθώς και του ιού έρπητα ζωστήρα (ενώσεις β, εικόνα 15).(26) (α) 1: Β = κυτοσίνη II: Β = γουανίνη III: Β = αδενίνη I: Β = αδενίνη II: Β = κυτοσίνη III: Β = θυμίνη IV: Β = γουανίνη Εικόνα 15. Δεοξυ- πυρανονουκλεοσίδια 20

24 1.5.4 Φθοοιωμένα νουκλεοσίδια Για να βρεθούν νέα αντικαρκινικά και αντιικά φάρμακα με μεγαλύτερη εκλεκτικότητα και λιγότερες ανοσοκαχασταλτικές παρενέργειες σε σχέση με τα έως τώρα χρησιμοποιούμενα σε κλινικό επίπεδο, τα τελευταία χρόνια μελετώνται τα φθορονουκλεοσίδια.(27'3ι) Η εισαγωγή ενός φθορίου είτε στο τμήμα του σακχάρου είτε στη νουκλεοβάση των φουρανονουκλεοσιδίων, οδηγεί σε ενώσεις, οι οποίες διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα αντιικών και αντικαρκινικών ιδιοτήτων. 27'31} Η εισαγωγή ενός ατόμου φθορίου στο σάκχαρο των νουκλεοσιδίων μεταβάλλει με διάφορους τρόπους τη βιολογική δραστικότητα των διάφορων κυττάρων και ενζύμων, συμπεριλαμβανομένου των κινασών, DNA πολυμερασών, ριβονουκλεοτιδίων, αναγωγασών. 32) Η αντικατάσταση του υδρογόνου με φθόριο έχει ερευνηθεί εκτενώς στη βιοχημεία φαρμάκων και έχει διαπιστωθεί ότι ενισχύει τη βιολογική δραστικότητα και αυξάνει την χημική ή μεταβολική σταθερότητα καθότι: Έχει μικρή Wan der Waals ακτίνα (1.35 Α) που μοιάζει πολύ με την ακτίνα του υδρογόνου (1.20 Α). Η μεγάλη ηλεκτραρνητικότητά του ενισχύει τις ιδιότητες του μορίου. Η αυξημένη σταθερότητα και η μεγαλύτερη ισχύς του δεσμού άνθρακαφθορίου αναστέλλει τον μεταβολισμό με αποτέλεσμα την αύξηση του χρόνου ημιζωής του μορίου. Αυξάνει το λιπόφιλο χαρακτήρα του μορίου διευκολύνοντας έτσι τη διαπερατότητα της διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. 21

25 2. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Στόχος-σκοπός μελέτης Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η σύνθεση και μελέτη τροποποιημένων νουκλεοσιδίων για την εύρεση νέων αντικαρκινικών και αντιικών φαρμάκων με μεγαλύτερη εκλεκτικότητα και λιγότερα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα από τα μέχρι τώρα κλινικά χρησιμοποιούμενα. Έρευνες των τελευταίων ετών έχουν δείξει ότι: α) η κυτοσίνη και η αδενίνη συμμετέχουν σε ένα μεγάλο αριθμό βιολογικών διεργασιών β) η εισαγωγή φθορίου στο σάκχαρο ενός νουκλεοσιδίου έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της βιολογικής του δράσης και τέλος γ) τα κετοακόρεστα-πυρανονουκλεοσιδικά ανάλογα παρουσιάζουν ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες. Ειδικότερα από τις βιολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στα κετοακόρεστα νουκλεοσίδια, τα οποία συντέθηκαν στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, προέκυψε το συμπέρασμα ότι η ύπαρξη ενός πρωτοταγούς ελεύθερου υδροξυλίου στο σάκχαρο του νουκλεοσιδίου δεν αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την εμφάνιση αντικαρκινικής και αντιικής δράσης. Αντίθετα, τα νουκλεοσιδικά ανάλογα που φέρουν μία προστατευτική ομάδα στην 6'-θέση του σακχάρου, εμφανίστηκαν να είναι πιο αποτελεσματικοί αντικαρκινικοί και αντιικοί παράγοντες. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω στοιχεία, θεωρήθηκε πολύ σημαντική η σύνθεση και η βιολογική αποτίμηση μιας νέας τάξης φθοριωμένων ακόρεστων κετοπυρανονουκλεοσιδίων που θα φέρουν την Λ^-βενζοϋλοαδενίνη ή την Ν4- βενζοϋλοκυτοσίνη ως ετεροκυκλική βάση, δεοξυ στη θέση 6', φθόριο στη θέση 3', κετονομάδα στη θέση 2' και διπλό δεσμό στις θέσεις 3',4' του σακχάρου, ενώσεις 8 και 17 αντίστοιχα, (εικόνα 16). 22

26 NHBz NHBz (8) (17) Εικόνα 16. (8) 9-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)- Λ^-βενζοϋλοαδενίνη, (17) 1-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2'- ουλοζο)-τν4-βενζοϋλοκυτοσίνη 23

27 2.2 Μεθοδολογία σύνθεσης Σύνθεση της 9-(4\6'-Αιδεοξυ-3'-φθορο-/^Ρ-γλυκερο-ε -3'-ενοπυρανοζυλο- 2 -ουλο ο)-λ^-βεν οϋλοαδενίντις (8) Εικόνα 17. Μεθοδολογία σύνθεσης της 9-(4\6'-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3 ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)- Λ^ -βενζοϋλοαδενίνης: (i) A^ -AdcBz/HMDS/CHjCN, SnCU (ii) EtOH/pyridine, NaOH, Amberlite IR-120 (ΕΓ) (iii) CsE^^/E/PihP/THF (iv) Ac20, pyridine (v) EtOH, AcOEt, Et3N, 10% Pd/C, H2 (vi) ΝΗ2ΟΗ ΗΟ, CH3COONa, pyridine (vii) Ac20, DMSO Την πρώτη ύλη για τη συνθετική μας πορεία αποτελεί το σάκχαρο 3-δεοξυ-3- φθορο-1,2,4,6-τετρα-0-ακετυλογλυκοπυρανόζη (1). Ακολουθεί σύζευξη της 1 με τη βάση Λ^-βενζοϋλοαδενίνη παρουσία του διαλύτη ακετονιτρίλιο (CH3CN), του hexamethyldisilazane (HMDS) καθώς και της σακχαρίνης, η δράση των οποίων έγκειται στη σιλιλίωση της βάσης, και του χλωριούχου κασσίτερου (SnCU), δίνοντας τελικά το πλήρως προστατευμένο φθορονουκλεοσίδιο 9-(3'-Δεοξυ-3'-φθορο-2',4',6'- τρις-0-ακετυλο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-λκ -βενζοϋλοαδενίνη (2). 24

28 Στην ένωση 1 το ακετύλιο στη θέση 1' είναι ανωμερικό, το σάκχαρο βρίσκεται είτε ως α- είτε ως β- ανωμερές. Ο σχηματισμός με τον οποίο επικρατεί η /(-ανωμερική μορφή του νουκλεοσιδίου 2 φαίνεται στην παρακάτω εικόνα (εικόνα 12 ). SiMe (A) (Β) (F) Εικόνα 18: Μηχανισμός σύνθεσης νουκλεοσιδίου (32> 25

29 Ακολουθεί απακετυλίωση του νουκλεοσιδίου 2 και παραγωγή της 9-(3',4'- Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-Λ/6-βενζοϋλοαδενίνης (3). Το επόμενο στάδιο περιλαμβάνει την εκλεκτική ιωδίωση του μη προστατευμένου νουκλεοσιδίου της βενζοϋλοαδενίνης 3 μέσω αντίδρασής του με ιμιδαζόλιο (C3H4N2), τριφαινυλοφωσφίνη (ΡΙ13Ρ) και ιώδιο (Ι2) σε τετραϋδροφουράνιο (THF) οδηγώντας έτσι στο 6'-ιωδο-νουκλεοσιδικό παράγωγο 9- (3 '-Δεοξυ-3 '-φθορο-6 '-ιωδο-//-0-γλυκοπυρανοζυλο)-α/6-βενζοϋλοαδενίνη (4). Ακολουθεί η ακετυλίωση του προϊόντος 4 υπό ήπιες συνθήκες και συγκεκριμένα χρησιμοποιώντας 1.8 eq οξικού ανυδρίτη (AC2O) στους 4 C, ούτως ώστε να μην αντικατασταθεί η βενζοϋλομάδα της αδενίνης από ακετύλιο. Το ακετυλιωμένο παράγωγο της αδενίνης, η 9-(2',4'-Δις-0-ακετυλο-3'-Δεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-//-ϋγλυκοπυρανοζυλο)-Λ/6-βενζοϋλόαδενίνη (5) παράγεται σε πολύ ικανοποιητική απόδοση (89%). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται υδρογόνωση της ένωσης 5 με τη βοήθεια παλλαδίου (Pd) σε άνθρακα Pd/C 10%, με αποτέλεσμα να ληφθεί το 6'-δεοξυπαράγωγο της βενζοϋλοαδενίνης 9-(2',4'-Δις-0-ακετυλο-3',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-//- ί)-γλυκοπυρανοζυλο)-λ/6-βενζοϋλοαδενίνη (6). Η κατεργασία του προϊόντος 6 με υδροχλωρική υδροξυλαμίνη (ΝΤ^ΟΤΡΗΟ) και οξικό νάτριο (CHsCOONa) σε πυριδίνη οδηγεί στο μερικώς προστατευμένο ανάλογο, την 9-(4 '-Ο-Ακετυλο-3 ',6 '- Διδεοξυ-3 '-φθορο-//-0-γλυκοπυρανοζυλο)-δ6-βενζοϋλοαόενίνη (7), το οποίο λαμβάνεται σε απόδοση της τάξεως του 50%. Το τελικό στάδιο της συνθετικής πορείας περιλαμβάνει την οξείδωση του ελεύθερου υδροξυλίου στη 2'-θέση του σακχάρου της ένωσης 7, η οποία πραγματοποιείται μέσω αντίδρασης με ένα μίγμα Ac20-DMS0 στους 100 C, οπότε παράγεται, μετά από μια αντίδραση //-απόσπασης, η επιθυμητή ακόρεστη καρβονυλική ένωση, 9-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-//-ϋ-γλυκεροεξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-δ6-βενζοϋλοαδενίνη (8). Ωστόσο η συγκεκριμένη πορεία σύνθεσης δεν ήταν επιτυχής για τη σύνθεση του φθορονουκλεοσιδίου που θα έφερε τη Ν4-βενζοϋλοκυτοσίνη ως ετεροκυκλική βάση. Συγκεκριμένα στο έκτο βήμα (νΐ) της παραπάνω πορείας ήταν αδύνατη η εκλχκτική απακετυλίωση του αντιδρώντος με αποτέλεσμα την καταστροφή του. Η συνθετική πορεία που χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση της 1-(4',6'-Διδεοξυ-3'- φθορο-//-γ)-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο^/ν4-βενζοϋλοκυτοσίνης (17) είναι η ακόλουθη (εικόνα 19). 26

30 2.2.2 Σύνθεστι της 1-(4\6'-Αιδεο υ-3'-φθορο-^-ρ-γλυκερο-ε -3,-ενοπυρ«νοζυλο- 2 '-ουλοζονα/4-βενζοΐ)λοκυτοσίντΐ (17) Εικόνα 19: Μεθοδολογία σύνθεσης της 1 -(4 ',6'-Δχδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκερο-εξ-3 ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)-./ν4-βενζοϋλοκυτοσίνης: (i) (CH3)2C(OCH3)2, p-tsoh, DMF (ii) Ac20, pyridine (iii) 90% TFA/CH3OH (iv) C3H4N2/I2/Ph3P/THF (v) EtOH. AcOEt, Et3N, 10% Pd/C, H2 (vi) BzCl, pyridine (vii) EtOFI/pyridine, NaOFl, Amberlite IR-120 (FT) (viii) Ac20. DMSO 27

31 Η πρώτη αντίδραση αυτής της πορείας περιλαμβάνει την εκλεκτική προστασία των υδροξυλίων στις 4'- και 6'-θέσεις του σακχάρου του φθοριωμένου νουκλεοσιδίου 9 με μία ισοπροπυλιδενική ομάδα. Η αντίδραση πραγματοποιείται με τη χρήση του 2,2-διμεθοξυπροπανίου [(CH3)2C(OCH3)2] και του π- τολουολοσουλφονικού οξέος (p-tsoh) ως καταλύτη, σε διαλύτη DMF, οπότε παράγεται η 1-(3'-Δεοξυ-3'-φθορο-4',6'-0-ισοπροπυλιδενο-/λϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-.V7-βενζοϋλοκυτοσίνη (10). Ακολουθεί ακετυλίωση του ελεύθερου υδροξυλίου στη 2'-θέση της ένωσης 10, η οποία πραγματοποιείται παρουσία AC2O σε πυριδίνη, οδηγώντας έτσι στην 1-(2'-0- Ακετυλο-3 '-δεοξυ-3 '-φθορο-4',6'-0-ισοπροπυλιδενο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν7- βενζοϋλοκυτοσίνη (11). Στη συνέχεια το προϊόν 11 κατεργάζεται με διάλυμα 90% τριφθοροξικού οξέος (TFA) σε μεθανόλη (CH3OH) με αποτέλεσμα τη διάνοιξη της ισοπροπυλιδενικής ομάδας και τη δημιουργία του μερικώς ακετυλιωμένου νουκλεοσιδίου (12). Ακολουθεί εκλεκτική ιωδίωση της ένωσης 12 με χρήση C3H4N2, ΡΙ13Ρ και Ι2 σε THF, με αποτέλεσμα τη σύνθεση του ίωδο-παραγώγου 13. Υδρογόνωση της ένωσης 13, με τη βοήθεια παλλαδίου σε άνθρακα 10% έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία του μερικώς ακετυλιωμένου δεοξυ νουκλεοσιδίου 1-(2'-0-Ακετυλο-3',6'-Διδεοξυ-3'- φθορο-/λο-γλυκοπυρανοζυλο)-λ 7-βενζοϋλοκυτοσίνη (14). Η επόμενη αντίδραση της συνθετικής πορείας περιλαμβάνει τη βενζοϋλίωση του ελεύθερου υδροξυλίου στην 4'-θέση του σακχάρου της ένωσης 14, η οποία πραγματοποιείται με τη χρήση βενζόϋλο χλωριδίου (BzCl) σε διαλύτη πυριδίνη, με αποτέλεσμα την παραγωγή της 1-(2'-0-Ακετυλο-4'-0-βενζόϋλο-3',6'-Διδεοξυ-3'- φθορο-//-ε)-γλυκοπυρανοζυλο)-λ;7-βενζοϋλοκυτοσίνης (15). Ακολουθεί η απακετυλίωση της 15 με τη χρήση καυστικού νατρίου (NaOFI) και μεθανόλης με αποτέλεσμα την παραγωγή του δεοξυ βενζόϋλο νουκλεοσιδίου 16. Το τελικό στάδιο της συνθετικής πορείας περιλαμβάνει την οξείδωση του ελεύθερου υδροξυλίου στη 2'-θέση του σακχάρου της ένωσης 16, η οποία πραγματοποιείται μέσω αντίδρασης με ένα μίγμα AC2O-DMSO στους 100 C, οπότε παράγεται, μετά από μια αντίδραση /^-απόσπασης, η επιθυμητή τελική ένωση, 1- (4'.6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-Β-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο^'-ουλοζονα7- βενζοϋλοκυτοσίνη (17). 28

32 3. ΓΕΝΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Χρωματογραφία Χάρτου (TLC: Thin Layer Chromatography) Ον αντιδράσεις ελέγχονται με χρωματογραφία χάρτου, με πλάκες αλουμινίου επιστρωμένες με silica gel F254 (0.2 mm) της εταιρίας E.Merck. Γενικά, τα χρωματογραφήματα εμφανίζονται με ψεκασμό με διάλυμα θετικού οξέος 30%. Τα χρωματογραφήματα των κετονουκλεοσιδίων εμφανίστηκαν με ψεκασμό με διάλυμα 2.4-δινιτροφαινυλυδραζίνης (0.1 %). Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα Α: οξικός αιθυλεστέρας Διάλυμα Β: οξικός αιθυλεστέρας / μεθανόλη 90/10 Διάλυμα Γ: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 90/10 Διάλυμα Δ: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 80/20 Διάλυμα Ε: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 70/30 Διάλυμα Ζ: διχλωρομεθάνιο/μεθανόλη 9.5/0.5 Διάλυμα Η: διχλωρομεθάνιο/μεθανόλη 90/ Χρωματογραφία στήλης Η χρωματογραφία στήλης, επιτεύχθηκε με την εισαγωγή αέρα υπό πίεση σε silica gel 60 ( mesh) της εταιρίας Ε. Merck και οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι παρακάτω: Διάλυμα Α: οξικός αιθυλεστέρας Διάλυμα Β: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 90/10 Διάλυμα Γ: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 80/20 Διάλυμα Δ: οξικός αιθυλεστέρας/εξάνιο 70/30 Διάλυμα Ε: διχλωρομεθάνιο/μεθανόλη 9.5/0.5 Διάλυμα Ζ: διχλωρομεθάνιο/μεθανόλη 90/10 29

33 3.3 Ξήρανση διαλυτών Χρησιμοποιούνται άνυδροι διαλύτες ακετονιτρίλιο (CH3CN), πυριδίνη, DMSO, ΛζΑ-διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) και τετραϋδροφουράνιο (THF). Η ξήρανση CH3CN έγινε παρουσία υδριδίου του ασβεστίου με θέρμανση με κάθετο ψυκτήρα κατά τη διάρκεια μιας νύχτας. Στη συνέχεια έγινε απόσταξη υπό άζωτο και το απόσταγμα συλλέχθηκε σε φιάλη με μοριακά κόσκινα 3Ά (molecular sieves). To THF απεστάχθη από sodium/benzophenone αμέσως πριν από τη χρήση. Η πυριδίνη αποθηκεύθηκε σε φιάλη με μοριακά κόσκινα 4Α. To DMSO αποθηκεύτηκε σε φιάλη με μοριακά κόσκινα 3Α. 3.4 Ταυτοποίηση ενώσεων Η ταυτοποίηση των ενώσεων που συντέθηκαν έγινε με τη χρήση φάσματος πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού NMR (Nuclear Magnetic Resonance). Τα φάσματα *HNMR μετρήθηκαν με Bruker 400 MHz. To tetramethylsilan (TMS) χρησιμοποιήθηκε ως σημείο αναφοράς και η πολλαπλότητα των καμπύλων φαίνεται με s (single), d (double), m (multiple). Οι συχνότητες J μετρήθηκαν σε Hz. 30

34 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Οι συνθετικές πορείες της 3-Δεοξυ-3-φθορο-1,2,4,6-τετρα-(9- ακετυλογλυκοπυρανόζης (1) και της 1-(3',4'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋγλυκο7ΐυρανοζυλο)-Δ4-βενζοϋλοκυτοσίνης (9), που χρησιμοποιούνται ως πρόδρομες ενώσεις για τη σύνθεση των τελικών μορίων 9-(4 ',6 '-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋγλυκερο-εξ-3'-ενο7ΐυρανοζυλο-2'-ουλοζο)-λ/6-βενζοϋλοαδενίνης (8) και 1-(4',6'- Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-^4- βενζοϋλοκυτοσίνης (17) αντίστοιχα, είναι γνωστές. Οι ενώσεις 1 και 9 παρασκευάστηκαν στο εργαστήριο Οργανικής Χημείας του τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας από τη διδάσκουσα Π.Δ. 407/80 κ. Μαντά Στυλιανή 4.1 Σύνθεση της 9-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3'- ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-α"-βενζοϋλοαδενίνης (8) Σύνθεση τικ 9-(3'-Αεο υ-3γ-φθορο-2λ4λ6,-τρις-(9-ακετυλο-/?-ρ- γλυκοπυρανοζυλοι-λαβενζοϋλοαδενίνικ Ένα διάλυμα της Λ^-βενζοϋλοαδενίνης (4.44g, 18.55mmol), του HMDS (4.8mL, 23mmol) και της σακχαρίνης (0.16g, 0.85mmol) σε άνυδρο CH3CN (69mL), αναδεύεται για 45 λεπτά και όταν το μίγμα γίνει διαυγές προστίθεται η 3-Δεοξυ-3- φθορο-1.2,4,6-τετρα-0-ακετυλογλυκοπυρανόζη (1) (5.00g, 14.27mmol) και ο SnCl4 (1.65mL, 9.13mmol). Το μίγμα αναδεύεται για 5 ώρες με κάθετο ψυκτήρα στους 100 C. Ο έλεγχος της αντίδρασης γίνεται με TLC (πίνακας 1). Στη συνέχεια γίνεται εκχύλιση. Η υδατική φάση πλένεται με AcOEt και η οργανική με NaHC03 και Η2Ο. 31

35 Στην οργανική φάση προστίθεται άνυδρο Na2SC>4 και το διάλυμα διηθείται και συμπυκνώνεται. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το διάλυμα Γ. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται η 9-(3'-Δεοξυ-3'-φθορο- 2',4',6'-τρις-0-ακετυλο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-Α6-βενζοϋλοαδενίνη (2) (4.35g, 8.2mmol). Η σύνθεση του νουκλεοσιδίου 2 είχε απόδοση 58%. TLC (Διάλυμα Δ) Rf = 0.35 Απόδοση 58% Πίνακας 1. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1-(3'-Δεοξυ-3'-φθορο-2',4',6'-τρις-0-ακετυλο-/?- Ο-γλυκοπυρανοζυλοήΛ^-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση tiic Αιδεο&υ-3 '-φοορο-//-ρ-νλυκοπτ)ΐ)ανο υλο)-λ?ή- βενζοϋλοαδενίνικ AcO- ΗΟ- - ο AdeBz NJ NaOH, EtOH, Pyridine -O AdeBz \ AcO HO OAc OH Σε ένα διάλυμα του προϊόντος 2 (4.35 g, 8.2mmole) σε EtOH (82 ml) και σε ττυριδίνη (24.6 ml), προστίθεται NaOH 2Μ (16.4 ml). Το μίγμα αναδεύεται για 30 λεπτά στους 0 C. Στη συνέχεια προστίθεται ρητίνη Amberlite IR-120 (Η+) για να εξουδετερώσει τη βάση. Ακολουθεί διήθηση, η ρητίνη πλένεται με EtOH και πυριδίνη ( ml) και συμπύκνωση. Το στερεό υπόλειμμα κατεργάζεται με διαιθυλαιθέρα (2 x 30 ml) και με διχλωρομεθάνιο (2 x 30 ml) και διηθείται. Το επιθυμητό προϊόν, 9-(3 ',4'-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-α6- βενζοϋλοαδενίνη (3) (3.54 g, 8.77mmol) χρησιμοποιείται στο επόμενο στάδιο χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Η σύνθεση του νουκλεοσιδίου 3 είχε απόδοση 82%. 32

36 TLC (Διάλυμα Β) Rf = 0.22 Απόδοση 82% Πίνακας 2. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(3 ',4'-Διδεοςυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)- Λ^-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση ttic 9-(3 '-Αεο υ-3 '-φ()ορο-6 '-ιο^δο-ζ^ρ-γλυκοπυρανο^υλοϊ-α^- βε\<οϋλοαδενίνης C3H4N2,12, Ph3P, THF ^ Σε διάλυμα της ένωσης 3 (3.54g, 8.77mmol) σε άνυδρο THF (68.46mL), προστίθεται C3H4N2 (1.18g, 17.54mmol), Ph3P (3.44g, 13.17mmol) και ιώδιο (3.33g, 13.17mmol). Η αντίδραση ολοκληρώνεται στη 1 ώρα με θέρμανση με κάθετο ψυκτήρα στους 80 C. Στη συνέχεια γίνεται διήθηση και απομάκρυνση του διαλύτη υπό κενό. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το διάλυμα Ζ. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται η 9-(3'-Λεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-/?-ϋγλυκοπυρανοζυλο)-Λ^-βενζοϋλοαδενίνη (4) (2.12g, 4.14mmol) σε απόδοση 60%. TLC (Διάλυμα Ε) Rf = 0.39 Απόδοση 60% Πίνακας 3. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(3 '-Δεοςυ-3 '-φθορο-6'-κοδο-/ί-0- γλυκο7τυρανοζυλο)-λ/6-βενζοϋλοαδενίνης 33

37 4.1.4 Σύνθεση ttic 9-(2\4'-Αις-0-ακετυλο-3Γ-δεο υ-3'-οθορο-6'-ιωδο-/7-ρ- γλυκοπυρανοξυλοι-α^-βενξοϋλοαδενίντις Ac20, Pyridine 4 Σε διάλυμα της ένωσης 4 (2.12g, 4.14mmol) σε άνυδρη πυριδίνη (21.07mL) προστίθεται Ac20 (0.7lmL, 7.45mmol). Το μίγμα αναδεύεται κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 C. Στη συνέχεια προστίθεται μεθανόλη (0.0.37mL) για να εξουδετερωθεί η αντίδραση και το διάλυμα συμπυκνώνεται. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το διάλυμα Β για τη συλλογή του προϊόντος 5 (1.67g, 2.8mmol). Η σύνθεση της 9-(2',4'-Δις-0-ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-/?-0- γλυκοπυρανοζυλο)-λ^-βενζοϋλοαδενίνης (5) (1.67g, 2.8mmol) είχε απόδοση 79%. TLC (Διάλυμα A) 01 II 0 Απόδοση 19% Πίνακας 4. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(2'.4 -Δις-Ο-ακετυλο-3 '-δεοξυ-3'-φθορο-6'- ιωδο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν6-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεση της 9-(2',4'-Ακ;-0-ακετυλο-3λ6'-διδεοξυ-3'-<ΐ)θορ(Η!?-Ρ- γλυκοπυρανοξυλοι-λ^-βενξοϋλοαδενίντις AcO -Ο AdeBz 4 OAc EtOH, AcOEt, Et2N 10% Pd/C, H2 CHi -Ο AdeBz AcO N OAc

38 Αρχικά η ένωση 5 (1.67g, 2.8mmol) διαλύεται σε EtOH (86.09ml) και οξικό αιθυλεστέρα (86.09mL). Προστίθεται τριαιθυλαμίνη (0.78mL, 5.6mmol) και παλλάδιο σε άνθρακα 10% (0.39g). Ακολουθεί υδρογόνωση κατά τη διάρκεια της νύχτας. Την επόμενη μέρα το μίγμα διηθείται υπό κενό. Πραγματοποιείται καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας ως διαλύτη έκλουσης το διάλυμα Γ ώστε να διαχωριστεί το επιθυμητό προϊόν 6. Η σύνθεση της 9-(2',4'-Δις- (9-ακετυλο-3 ',6 '-διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-λ^-βενζοϋλοαδενίνης (6) (1.19g, 2.52mmol) είχε απόδοση 72%. TLC (Διάλυμα Α) Rf = 0.39 Απόδοση 72% Πίνακας 5. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(2',4'-Δις-ώ-ακετυλο-3 ',6'-διδεοξυ-3 '-φθορο-/?- ϋ-γλυκοπυρανοζυλοεα^-βενζοϋλοαδενίνης Σύνθεσιι της 9-(4'-0-Ακετυλο-3λ6 '-διδεο υ-3 '-οθορο-/?-ρ- ΥλυκοπυοανοώιλοΙ-Α^-βενίίοϋλοαδενίνυς CH3 Ο AdeBz AcOid OAc 6 Η ένωση 6 (1.19g, 2.52mmol) διαλύεται σε άνυδρη πυριδίνη (14.43mL). Ακολουθεί η προσθήκη NH20H*HC1 (0.71 g, 10.12mmol) και CHsCOONa (0.84g, 10.12mmol). To μίγμα αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες. Μετά προστίθεται ακετόνη (0.7lmL) και οι διαλύτες απομακρύνονται με διήθηση υπό κενό. Ακολουθεί καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας το διάλυμα Α. Η σύνθεση του (7) (554mg, 1.29mmol) είχε απόδοση 46%. 35

39 TLC (Διάλυμα Α) Rf = 0.29 Απόδοση 46% Πίνακας 6. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(4'-<9-Ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/ΑΟ- γλυ κοπυ ρανοζυλο)-α6 - β ε νζοϋ λο αδ ενί\τ ς Σύνθεση της 9-(4',6'-Αιδεο&ο-3'-<ρθορο-/?-Ρ-γλυκερο-εΕ-3'-ενο7η)ρανοζυλο- 2 '-ουλοζοι-λ^-βενζοϋλοαδενίντκ 7 8 Η ένωση 7 (554mg, 1.29mmol) διαλύεται σε άνυδρο DMSO (6.3lmL). Έπειτα προστίθεται AC2O (3.17mL, 33.54mmol). Το μίγμα θερμαίνεται στους 100 C για 10 λεπτά και στη συνέχεια αραιώνεται με οξικό αιθυλεστέρα και εκχυλίζεται μία φορά με νερό. Κατόπιν, η οργανική φάση ξηραίνεται με άνυδρο Na2S04 και ο διαλύτης απομακρύνεται υπό κενό. Ακολουθεί καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφία χρησιμοποιώντας το διάλυμα Α. Η σύνθεση του 8 (277.3mg, 0.755mmol) είχε απόδοση 50%. TLC (Διάλυμα Α) Rf = 0.26 Απόδοση 50% Πίνακας 7. Αποτελέσματα σύνθεσης της 9-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-Ό-γλυκερο-εξ-3'- ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)-7ν-βενζοϋλοαδενίνης 36

40 4.2 Σύνθεση της 1-(4',6'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκερο-εξ-3'- ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)- Λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεσιι της 1-(3Γ-Αεο υ-3'-φθορο-4\6'-0-ισοπροπυλιδενο-/?-ρ- γλυκοπυρανοζυλοι-α^-βενζοϋλοκυτοσίντκ ΗΟ ΗΟ /F qcybz ΟΗ 10 Σε ένα διάλυμα της ένωσης 1-(3',4'-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)- Λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης (9) (7g, 18.45mmol) με (CH3)2C(OCH3)2 (73.8mL) και άνυδρο DMF (233.32mL) προστίθεταιyi-tsoii (69.77mg, 3.7mmol) και το μίγμα αναδεύεται στους 60 C για 1 ώρα. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 8). Το μίγμα της αντίδρασης εξουδετερώνεται με Et3N έτσι ώστε η τιμή του ph να είναι 7. Το διάλυμα συμπυκνώνεται και ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το διάλυμα Β. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται το επιθυμητό προϊόν 1-(3'- Δεοξυ-3 '-φθορο-4 ',6 '-0-ισοπροπυλιδενο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-.Λ^βενζοϋλοκυτοσίνη (2) (5.75g, 13.7mmol). Η σύνθεση του νουκλεοσιδίου 2 (5.75g, 13.7mmol) είχε απόδοση 82%. TLC (Διάλυμα Γ ) -+) II ρ Απόδοση 82% Πίνακας 8. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1 -(3 '-Δεοξυ-3 '-φθορο-4 '.6 '-0-ισοπροπυλιδενο-/λ ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-α4-βενζοϋλοκυτοσίνης 37

41 4.2.2 Σύνθεστι της Ι-^'-Ο-Ακετυλο^'-δεοξυ^'-φθορο-^,ό'-Α-ισοπροπυλιδενο-/?- Ρ-γλυκοπυοανοίίυλο)-Α^-βεν οϋλοκυτοσίνης Σε διάλυμα της ένωσης 10 (5.75g, 13.7mmol) σε πυριδίνη (68.6mL) προστίθεται AC2O (1.16mL, 12.33mmol) και το μίγμα αναδεύεται για μία νύχτα στους 4 C. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC την επόμενη μέρα (πίνακας 9). Στη συνέχεια προστίθεται μεθανόλη (0.59mL) για να ανακόψει την αντίδραση. Ακολουθεί συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας ως διαλύτη έκλουσης το διάλυμα Δ. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται το επιθυμητό προϊόν 1 -(2 '-<9-Ακετυλο-3 '-δεοςυ-3 '-φθορο-4 '.6 '-0- ισοπροπυλιδενο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-α^-βενζοϋλοκυτοσίνη (11) (4.94g, mmol) σε απόδοση 86%. ΤΙΧ(Διάλυμα Ε) II 0 4- Απόδοση 86% Πίνακας 9. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1 -(2'-Ο-Ακετυλο-3 '-δεοξυ-3 '-φθορο-4',6 ισοπροπυλιδενο-^-ο-γλυκοπυρανοζυλο)-^4-βενζοϋλοκυτοσίνης 38

42 4.2.3 Σύνθεση της 1-(2'-0-Ακετυλο-3'-δεο υ-3'-φθορο-/?-ρ-ύλυκοπυρανο υλο)- Α4- [3 ενιοϋλο κυτο σίνη c Το προϊόν 11 (4.94g, 10.71mmol) διαλύεται σε 53.55mL 90% TFA σε μεθανόλη. Το διάλυμα αναδεύεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC την επόμενη μέρα (πίνακας 10). Ακολουθεί συμπύκνωση ώστε να απομακρυνθούν η μεθανόλη και τα ίχνη του TFA και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας ως διαλύτη έκλουσης το διάλυμα Α. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται το επιθυμητό προϊόν 1 -(2 '-ΟΑκετυλο-3 '-δεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-λ^βενζοϋλοκυτοσίνης (12) (4.15g, 9.84mmol). Η σύνθεση του νουκλεοσιδίου 12 είχε απόδοση 84%. TLC (Διάλυμα Α) Rf= 0.3 Απόδοση 84% Πίνακας 10. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1 -(2 '-<9-Ακετυλο-3 '-δεοξυ-3 '-φθορο-4',6 '-(7- ισοπροπυλιδενο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-λ/4-βενζοϋλοκυτοσίνης 39

43 4.2.4 Σύνθεση της 1-(2'-0-Ακετυλο-3,-δεο υ-3,-φθορο-6'-ιωδο-/7-ρ- γλυκοπυρανοζυλοι-α^-βενζοϋλοκυτοσίντις Σε διάλυμα της ένωσης 12 (4.15g, 9.84mmol) σε άνυδρο THF (76.8mL), προστίθεται ιμιδαζόλιο (1.33g, 19.68mmol), ΡΙψΡ (3.86g, 14.78mmol) και ιώδιο (3.74g, 14.78mmol). To διάλυμα θερμαίνεται με κάθετο ψυκτήρα στους 80 C για μία ώρα. Μετά η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 11). Ακολουθεί διήθηση, συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας το διάλυμα Δ. Έτσι λαμβάνεται η 1-(2'-0-Ακετυλο-3'-δεοξυ-3'-φθορο-6'-ιωδο-/?-Ογλυκοπυρανοζυλο)-ν-βενζοϋλοκυτοσίνη (13) (2.4g, 4.52mmol) σε απόδοση 58%. ΤΈ (Διάλυμα Ζ) Rf= 0.35 Απόδοση 58% Πίνακας 11. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1 -(2 '-(9-Ακετυλο-3 '-δεοξυ-3 '-φθορο-6 '-ιωδο-//-0- γλυκοπυρανοζυλο)-^4-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της 1-(2Γ-0-Ακετυλο-3λ6Λ-διδεοζυ-3'-φθορο-/7-Ρ- γλυκοπυρανοίιυ/.οί-α^-βενςοϋλοκυτοσίντις 40

44 Η ένωση 13 (2.4g, 4.52mmol) διαλύεται σε EtOH (139mL) και οξικό αιθυλεστέρα (139mL). Στη συνέχεια προστίθεται τριαιθυλαμίνη (1.26mL, 9.04mmol) και παλλάδιο σε άνθρακα 10% (0.6 lg). Το διάλυμα υδρογονώνεται για μία νύχτα. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται την επόμενη μέρα με TLC (πίνακας 12). Ακολουθεί διήθηση, συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας το διάλυμα Δ. Η σύνθεση της 1-(2'-(9-Ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0- γλυκοπυρανοζυλο)-α/4-βενζοϋλοκυτοσίνης (14) (1.25g, 3.08mmol) είχε απόδοση 52%. TLC (Διάλυμα Γ) Rf = 0.13 Απόδοση 52% Πίνακας 12. Αποτελέσματα σύνθεσης 1-(2'-0-Ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-Ό- γλυκοπυρανοζυλο)-α4-βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεσιι τικ 1-(2'-0-Ακετυλο-4'-0-βενξόϋλο-3λ6'-διδεο1;υ-3Γ-(ρθορο-/?-Ρ- γλυκοπυρανοζυλοι-λ^-βενζοϋλοκυτοσίντκ Το προϊόν 14 (1.25g, 3.08mmol) διαλύεται σε πυριδίνη (15.4mL) και στη συνέχεια προστίθεται BzCl (3.59mL, 30.8mmol). Το διάλυμα αναδεύεται για 1 ώρα. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται με TLC (πίνακας 13). Έπειτα προστίθεται μεθανόλη και ακολουθεί συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας το διάλυμα Δ. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται το προϊόν 7 (1.12g, 2.2mmol). Η σύνθεση της 1-(2'-0-Ακετυλο-4'-<9- βενζόϋλο-3 ',6'-διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-α4-βενζοϋλοκυτοσίνης (15) είχε απόδοση 90%. 41

45 TLC (Διάλυμα Γ) Rf = 0.26 Απόδοση 90% Πίνακας 13. Αποτελέσματα σύνθεσης 1 -(2 '-Ο-Ακετυλο-4 '-Ο-βενζόϋλο-3 ',6 '-διδεοξυ-3 φθορο-/?-0-γλυκοπυρανοζυλο)-./ν -βενζοϋλοκυτοσίνης Σύνθεση της Ι^'-Ο-Ακετυλο-Βλό'-διδεοξυ-νΤ-φθορο-^-Ρ- γλυκοπυρανοΰ)λοελ^-βεν οϋλοκυτοσίνικ Σε ένα διάλυμα του προϊόντος 15 (1.12g, 2.2mmol) σε πυριδίνη (19.9mL) και μεθανόλη (44mL), που βρίσκεται σε πάγο προστίθεται NaOH 2Μ (1.6mL). Το μίγμα αναδεύεται για 1!4 ώρα και στην συνέχεια η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται με TLC (πίνακας 14). Ακολουθεί διήθηση υπό κενό μέχρι η τιμή του ph να είναι 7, συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας το διάλυμα Ε. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και έτσι και λαμβάνεται η 1-(4 -Οβενζόϋλο-3 ',6 '-διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-λ^-βενζοϋλοκυτοσίνη (16) (495mg, 1.06mmol) σε απόδοση 44%. TLC (Διάλυμα Δ) Rf = 0.49 Απόδοση 44% Πίνακας 14. Αποτελέσματα σύνθεσης 1-(4'-0-βενζόϋλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?-Όγλυκο7ΐυρανοζυλο)-Λ /-βενζοϋλοκυτοσίνης 42

46 4.2.8 Σύνθεση της 1-(4λ6'-Διδεο υ-3'-(ρθορο-/?-ρ-γλυκερο-ε -3'-ενοπυρανοζυλο- 2 '-ουλοζοί- Λ^-βενζοϋλοκυτοσίντκ Η ένωση 16 (495mg, 1.06mmol) διαλύεται σε άνυδρο DMSO (5.18mL). Έπειτα προστίθεται AC2O (2.6mL). Το μίγμα θερμαίνεται στους 98 C για 10 λεπτά και η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 15). Ακολουθεί συμπύκνωση και καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφία χρησιμοποιώντας τα διαλύματα Γ και Β. Η σύνθεση της 1- (4 ',6 '-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ζ)-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-α^βενζοϋλοκυτοσίνης (17) (257.5mg, 0.75mmol) είχε απόδοση 52%. TLC (Διάλυμα Δ) Rf = 0.62 Απόδοση 52% Πίνακας 15. Αποτελέσματα σύνθεσης 1 -(4 ',6 '-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-γ)-γλυκερο-ες-3 ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)- Λ'4-βενζοϋλοκυτοσίνης 43

47 5. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ME *Η NMR ppm (11) Σχήμα 1: Φάσμα 'Η NMR του τελικού προϊόντος, 9-(4',6'-Διδεοξυ-3 '-φθορο-/)-0-γλυκερο- εξ-3'-ενοπυρανοζυλο-2'-ουλοζο)-λ'6-βενζοϋλοαδενίνη (8) 44

48 ppm (Π) Σχήμα 2. Φάσμα 'Η NMR του τελικού προϊόντος, 1 -(4',6'-Διόεοςυ-3'-φθορο-/?- ϋ-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-λ^-βενζοϋλοκυτοσίνη (17) 45

49 6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 6.1 Χημικά χαρακτηριστικά Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας νέας τάξης νουκλεοσιδίων με πιθανή αντιική και αντικαρκινική δράση. Συγκεκριμένα λαμβάνοντας υπόψη τις ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες των κετοακόρεστων και δεοξυ-πυρανονουκλεοσιδίων, την αύξηση της βιολογικής δράσης που επιφέρει η εισαγωγή φθορίου και το γεγονός ότι διάφορα φυσικά αντιβιοτικά φέρουν την αδενίνη και την κυτοσίνη ως ετεροκυκλικές βάσεις πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και η βιολογική αποτίμηση των διδεοξυ-κετοακόρεστων-φθορονουκλεοσιδίων που φέρουν την Λ^-βενζοϋλοαδενίνη και την Λ4-βενζοϋλοκυτοσίνη ως ετεροκυκλικές βάσεις. Παρατηρήθηκε ότι με μια σχετικά εύκολη πειραματική διαδικασία με μικρά και σύντομα βήματα, είναι δυνατή η σύνθεση τους. Συγκεκριμένα κατά την πρώτη συνθετική πορεία του νουκλεοσιδίου που φέρει την Λ^-βενζοϋλοαδενίνη ως ετεροκυκλική βάση, η σύνθεση της 9-(2',4'-Δις-0-ακετυλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο- />-1)-γλυκοπυρανοζυλο)-Λ?6-βενζοϋλοαδενίνης (6) είχε απόδοση 72%, η σύνθεση της 9-(4'-0-Ακετυλο-3 ',6'-διδεοξυ-3 '-φθορο-/?-ϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-λ/6- βενζοϋλοαδενίνης (7) είχε απόδοση 46% και τέλος η σύνθεσης της 9-(4',6'-Διδεοξυ- 3 '-φθορο-/ί-γ>γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-λ/6-βενζοϋλοαδενίνης (8) είχε απόδοση 50%. Κατά τη δεύτερη συνθετική πορεία δηλαδή του νουκλεοσιδίου που φέρει την,\4-βενζοϋλοκυτοσίνη ως ετεροκυκλική βάση, η σύνθεση της 1 -(2'-0-Ακετυλο-4' βενζόϋλο-3 ',6 '-διδεοξυ-3 '-φθορο-/λϋ-γλυκοπυρανοζυλο)-λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης (15) είχε απόδοση 90%, η σύνθεση της 1-(4'-0-βενζόϋλο-3',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-/?- ϋ-γλυκοπυρανοζυλο^λ^-βενζοϋλοκυτοσίνης (16) είχε απόδοση 44% και η σύνθεση της 1 -(4', 6 '-Διδεοξυ-3'-φθορο-/?-0-γλυκερο-εξ-3 '-ενοπυρανοζυλο-2 '-ουλοζο)-λ4- βενζοϋλοκυτοσίνης είχε απόδοση 52%. Οι τελικές ενώσεις 8 και 17 χαρακτηρίζονται από αναλύσεις φάσματος πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 'Η NMR. Στο φάσμα ]Η NMR του επιθυμητού νουκλεοσιδίου 8 (Σχήμα 1) εμφανίζεται το σήμα του πρωτονίου Η-4' στα 6.70 ppm με σταθερά σύζευξης J4.F = 10.7 Hz, ενώ στη συνέχεια παρουσιάζεται η απλή κορυφή που αντιστοιχεί στο πρωτόνιο Η-1' στα 6.53 ppm, καθώς και το σήμα του πρωτονίου 46

50 Η-5' στα 5.08 ppm, αντίστοιχα. Λογικό είναι, ότι το σήμα του πρωτονίου Η-2' έχει εξαφανιστεί, ενώ η διπλή κορυφή που εμφανίζεται στα 1.53 ppm με σταθερά σύζευξης = 5.3 Hz, αντιστοιχεί στα τρία πρωτόνια του CH3 του σακχάρου. Στο φάσμα 'Η NMR του επιθυμητού νουκλεοσιδίου 17 (Σχήμα 2) εμφανίζεται το σήμα του πρωτονίου Η-4' και H-1'στα 6.58 ppm με σταθερά σύζευξης f = 11.4Ηζ,, καθώς και το σήμα του πρωτονίου Η-5' στα 4.98 ppm, αντίστοιχα. Λογικό είναι, ότι το σήμα του πρωτονίου Η-2' έχει εξαφανιστεί, ενώ η διπλή κορυφή που εμφανίζεται στα 1.53 ppm με σταθερά σύζευξης Js\b' ~ 5.3 Hz, αντιστοιχεί στα τρία πρωτόνια του Θ^του σακχάρου. Εξαιτίας του αποδεδειγμένου γεγονότος ότι τα τροποποιημένα νουκλεοσίδια παίρνουν μέρος στην αντιμετώπιση και θεραπεία πολλών ασθενειών δρώντας ως αντιικά και αντικαρκινικά φάρμακα, θεωρήθηκε σημαντική η αποτίμηση της βιολογικής δράσης των νεοσυντιθέμενων νουκλεοσιδίων 8 και Αντικαρκινική δράση Τα νέα 4',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-2'-κετοακόρεστα νουκλεοσιδικά ανάλογα της Α'^-βενζοϋλοαδενίνης και της Λ4-βενζοϋλοκυτοσίνης (ενώσεις 8 και 17 αντίστοιχα) που παρουσιάστηκαν στην παρούσα εργασία, καθώς και τα 4',6'-διδεοξυ-3'-φθορο- 2'-κετοακόρεστα νουκλεοσιδικά ανάλογα που φέρουν ως ετεροκυκλική βάση την 5- φθοροουρακίλη (5FU), την ουρακίλη (U) και την θυμίνη (Thy), των οποίων η σύνθεση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του πανεπιστημίου Θεσσαλίας, μελετήθηκαν ως προς την ανασταλτική τους δράση έναντι του πολλαπλασιασμού των κυττάρων λευχαιμίας L1210 και των καρκινικών κυττάρων μαστού ποντικού FM3A, καθώς και των ανθρώπινων καρκινικών αυχενικών κυττάρων HeLa και των ανθρώπινων Τ- λεμφοκυττάρων CEM. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Rega Institute for Medical Research στο Βέλγιο και τα αποτελέσματα που προέκυψαν, απεικονίζονται στον πίνακα

51 Πίνακας 16: Ανασταλτική δράση των νέων 4',6'-διδεοξυ-3'-φθορο-2'-κετοακόρεστων νουκλεοσιδίων έναντι του πολλαπλασιασμού των κυττάρων L1210, FM3A, HeLa και CEM. Προϊόν L1210 FM3A IC50 (μμ)* HeLa CEM ch3 1.2 ± ± ± ±3 99 ± ±25 71 ±44 59 ±21 F Ο 8 ch3 134 ± ± ±6 131 ±76 C Η ± ± ±7 35 ±22 22 ±21 90 ±86 12 ±6 7.8 ± *Η τιμή IC5o αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του προϊόντος που προκαλεί αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά 50% Όπως φαίνεται από χον πίνακα 16, οι νέες ενώσεις παρουσιάστηκαν ικανές να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε τιμές IC50 που κυμαίνονται σε κλίμακα μεταξύ 0.21 και 219 μμ. Υπήρξαν διαφορές μεταξύ των προϊόντων ως προς την ισχύ της ανασταλτικής τους δράσης. Μέτρια ανασταλτική δράση εμφάνισαν τα ανάλογα της Λ^-βενζόϋλοαδενίνης 8 και της Ν4- βενζόϋλοκυτοσίνης 17 (IC50: μμ). Το νουκλεοσίδιο που φέρει ως βάση τη 5-φθοροουρακίλη παρουσίασε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων L1210, FM3A και HeLa (IC έως 48

52 1.2 μμ), ενώ εμφάνισε μέτρια ανασταλτική δράση έναντι του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CEM (IC50-12 μμ). Συμπερασματικά τα νεοσυντιθέμενα διδεοξυ 2'-κετοακόρεστα νουκλεοσιδικά ανάλογα παρουσίασαν αξιοσημείωτη ανασταλτική δράση έναντι σειράς καρκινικών κυτταρικών σειρών. Παρόλ αυτά εμφανίστηκαν λιγότερο αποτελεσματικά σε σχέση με τα 4'-κετοακόρεστα νουκλεοσιδικά ανάλογα, τα οποία είχαν συντεθεί παλαιότερα στο εργαστήριο Οργανικής Χημείας του τμήματος Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Θα μπορούσαμε λοιπόν να πούμε ότι η μεταφορά της κετονομάδας από τη θέση 4' στη θέση 2'-του σακχάρου του νουκλεοσιδίου μειώνει την αντικαρκινική δράση αυτού του τύπου ενώσεων. 49

53 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. John McMurry, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2000 : , Lubert Stryer, Βιοχημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 1997 : Μ. C. Τ. Hartman, J. Κ. Coward, J. Am. Chem. Soc., 2001, 124, Page, Curtis, Sutter, Walker, Hoffman, Ιατρικές Εκδόσεις Π. X. Πασχαλίδης, 1997 : 4, Wen Zhou, Giuseppe Gumina, Youhoon Chong, Jianing Wang, Raymond F. Schinazi, and Chung K. Chu, J. Med. Chem., 2004, 47 (13), Vander, M.D.Sherman, Ph.D.Luciano, Ph.D.M.Tsakoulos, Φυσιολογία του ανθρώπου, μηχανισμοί λειτουργίας του οργανισμού 7. nucleosides.html 8. Chong Υ, Gumina G, Mathew JS, Schinazi RF, Chu CK, 1-2',3'-Didehydro-2',3'- dideoxy-3'-fluoronucleosides: synthesis, anti-hiv activity, chemical and enzymatic stability, and mechanism of resistance, Med Chem Jul 17;46(15): John M.Clark, Jr and Robert L. Switzer, Πειραματική βιοχημεία, Πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης, Benjamin Lewin, Genes VIII : Christopher J. Bums, Current Medicinal Chemistry - Anti-Infective Agents, Vol. 4, No. 2, Bloomfield, V. A.; Crothers, D. M.; Tinoco, I. University Science Books, Sausalito, California, Vastmans, K.; Froeyen, M.; Kerremans, L.; Pochet, S.; Herdewijn, P. Nucleic Acids Res. 2001, 29,

54 21. Komiotis, D.; Delatre, S.; Holt, L.; Ollapally, A.; Balzarini, J.; De Clercq, E.; Ligo, M. Nucleosides Nucleotides 1991,10, Paterson, J.; Uriel, C.; Egron, M. J.; Herscovici, J.; Antonakis, K.; Alaoui, M. Antimicrob. Agents Chemother. 1998, 42, Herdewijn, P.; De Clercq, E. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001,11, Augustyns, K.; Rozenski, J.; Van Aerschot, A.; Busson, R.; Claes, P.; Herdewijn, P. Tetrahedron 1994, 50, Augustyns, K.; Rozenski, J.; Van Aerschot, A.; Janssen, G.; Herdewijn, P. J. Org. Chem. 1993, 58, Verheggen, I.; Van Aerschot, A.; Van Meervelt, L.; Rozenski, J.; Wiebe, L.; Snoeck, R.; Andrei, G.; Balzarini, J.; Claes, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. J. Med. Chem. 1995, 38, Manta, G. Agelis, T. Botic, A. Cencic, D. Komiotis, Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) S. Manta, G. Agelis, T. Botic, A. Cencic, D. Komiotis, Eur. J. Med. Chem. 43 (2008) S. Manta, N. Tzioumaki, E. Tsoukala, A. Panagiotopoulou, M. Pelecanou, J. Balzarini, D. Komiotis, Eur. J. Med. Chem. 2009, in press, doi: /j.ejmech Komiotis, D.; Manta, S.; Tsoukala, E.; Tzioumaki, N. Curr. Med. Chem.: Anti- Infect. Agents 2008, 7, N. Tzioumaki, E. Tsoukala, S. Manta, G. Agelis, J. Balzarini, D. Komiotis, Archiv der Pharmazie, 342 (2009) Kyeong Lee, Yongseok Choi, Elizabeth Gullen, Susan Schlueter-Wirtz, Raymond F. Schinazi, Yung-Chi Cheng, and Chung K. Chu, J. Med. Chem., 1999, 42 (7),