ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθµ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΤΟΥ ΚΕΝΤΡΙΚΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ (ΚΝΣ) ΑΠΟ ΕΝΤΕΡΟΪΟΥΣ. KAMAL AK DUMAIDI ΒΙΟΛΓΟΣ Msc.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Α ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α. ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθµ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΤΟΥ ΚΕΝΤΡΙΚΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ (ΚΝΣ) ΑΠΟ ΕΝΤΕΡΟΪΟΥΣ KAMAL AK DUMAIDI ΒΙΟΛΓΟΣ Msc. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φ. ΦΡΑΝΤΖΙ ΟΥ-Α ΑΜΟΠΟΛΟΥΛΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΠΑΠΑ-ΚΟΝΙ ΑΡΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ (ΦΩΤΙΟΥ), ΚΑΦΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φ. ΦΡΑΝΤΖΙ ΟΥ-Α ΑΜΟΠΟΛΟΥΛΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΠΑΠΑ-ΚΟΝΙ ΑΡΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ (ΦΩΤΙΟΥ), ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Σ. ΑΑΛΕΞΙΟΥ- ΑΝΙΗΛ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Β. ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ- ΑΛΑΙΝΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ε. ΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Π. ΝΙΚΟΛΑΙ ΗΣ, ΚΑΦΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισης της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί άποδοχήν των γνωµών του συγγραφέως». (Νόµος 5343/32, άρθρ. 202 & 2 και ν. 1268/82, άρθρ. 50& 8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΜΠΟΝΤΗΣ

4

5 Στην αγαπηµένη µου σύζυγο Woroud Και στα παιδιά µου Talah, Yazan και Ahmed

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΟΜΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΦΥΣΙΚΕΣ ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ, ΕΙΣΟ ΟΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΠΟΥ ΑΙΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΘΡΩΠΕΙΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚ ΗΛΩΣΕΙΣ Λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος Πολιοµυελίτιδα Άσηπτη µηνιγγίτιδα και εγκεφαλίτιδα Καρδιακά νοσήµατα Σακχαρώδης διαβήτης και παγκρεατίτιδα Λοιµώξεις του αναπνευστικού συστήµατος. Ερπητική κυνάγχηεξανθήµατα Επιπεφυκίτιδα Λοίµωξη νεογέννητων και νεογνών Νοσήµατα του µυϊκού συστήµατος-πλευρωδυνία-σύνδροµο χρονιάς κόπωσης ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Αποµόνωση του ίου Ανίχνευση αντισωµάτων Μοριακή διάγνωση ΠΡΟΛΗΨΗ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Πρόληψη Θεραπεία Ιντερφερόνες Ανοσοσφαιρίνες Φάρµακα που αναστέλλουν το καψίδιο...50 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΟ Ασθενείς ΜΕΘΟ ΟΙ Αποµόνωση του ιού σε καλλιέργειες κυττάρων και δοκιµασία εξουδετέρωσης...57 α. Αποµόνωση του ιού σε καλλιέργειες κυττάρων...57 β. Τυποποίηση των εντεροϊών µε εξουδετερωτική δοκιµασία Ορολογικές µέθοδοι για ανίχνευση αντισωµάτων Μοριακές µέθοδοι...60 α. Εκχύλιση ιικού RNA...61 β. RT-nested PCR για την ενίσχυση της γονιδιακής περιοχής VP1-2A...61 γ. RT-PCR για την ενίσχυση του 5 άκρου της γονιδιακής περιοχής VP δ. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR

8 ε. Καθαρισµός του προϊόντος της PCR...65 στ. Αλληλούχιση των νουκλεοτιδίων (sequencing) των προϊόντων της PCR..65 ζ. Φυλογενετική ανάλυση Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επιδηµιολογικά στοιχεία ασθενών Κλινικές εκδηλώσεις ασθενών και αποτελέσµατα εργαστηριακής ανάλυσης του εγκεφαλονωτιαίου υγρού Κλινικά χαρακτηριστικά ιογενών λοιµώξεων του ΚΝΣ από εντεροϊούς: Σύγκριση θετικών και αρνητικών περιπτώσεων...72 α. Άσηπτη µηνιγγίτιδα β. Εγκεφαλίτιδα Σύγκριση εργαστηριακών ευρηµάτων από το ΕΝΥ µεταξύ θετικών και αρνητικών για εντεροϊούς δειγµάτων...73 α. Άσηπτη µηνιγγίτιδα...73 β. Εγκεφαλίτιδα Επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών µε λοιµώξεις από εντεροϊούς Έκβαση Εποχιακή κατανοµή των λοιµώξεων από εντεροϊό Αποτελέσµατα από την αποµόνωση του ιού και τη δοκιµασία εξουδετέρωσης...78 α. Αποµόνωση του ιού...78 β. Αποτελέσµατα τυποποίησης µε τη δοκιµασία εξουδετέρωσης Αποτελέσµατα ορολογικών µεθόδων για την ανίχνευση αντισωµάτων Αποτελέσµατα µοριακών µεθόδων...81 α. Εφαρµογή της RT-nested PCR για την ενίσχυση της VP1-2A περιοχής...81 β. Εεφαρµογή της RT-PCR για την ενίσχυση του 5 άκρου της γονιδιακής περιοχής VP Τυποποίηση του προϊόντος της RT-PCR µε αλληλούχιση νουκλεοτιδίων (sequencing) και εφαρµογή BLAST Συνοπτικά αποτελέσµατα Σύγκριση µοριακών (RT-PCR, αλληλούχιση βάσεων) και συµβατικών µεθόδων (καλλιεργητική αποµόνωση, δοκιµασία εξουδετέρωσης) για τη διάγνωση και τυποποίηση των εντεροϊών...86 (α) ιάγνωση λοίµωξης...86 (β)τυποποίηση εντεροϊών α. Αποτελέσµατα φυλογενετικής ανάλυσης της VP1-2A περιοχής β. Αποτελέσµατα φυλογενετικής ανάλυσης στην περιοχή 5 άκρου της VP Αποτελέσµατα από τον έλεγχο για ύπαρξη γενετικού ανασυνδυασµού ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι Εντεροϊοί του ανθρώπου είναι RNA ιοί και αποτελούν µέλη της µεγάλης οικογένειας Picornaviridae. Στους εντεροϊούς που προσβάλλουν τον άνθρωπο υπάγονται οι ιοί της πολιοµυελίτιδας, οι ιοί Coxsackie A και Β, οι ιοί Echo, και νεότεροι εντεροϊοί(τύποι 68-71). Πρόσφατα, µε βάση την οργάνωση του γονιδιώµατος και τη φυλογενετική ανάλυση έχει προταθεί η ταξινόµηση τους σε 5 είδη: Ιός πολιοµυελίτιδας (3 ορότυποι), Εντεροϊός του ανθρώπου Α (HEV-A) 12 ορότυποι, B (HEV-B) 35 ορότυποι, C (HEV-C) 11 ορότυποι, D (HEV-D) 3 ορότυποι. Ένα σύνολο 68 διαφορετικών οροτύπων εντεροϊών είναι γνωστό ότι κυκλοφορούν παγκοσµίως και προκαλούν λοιµώξεις στον άνθρωπο, ενώ επιπρόσθετοι ορότυποι έχουν προταθεί. Το γένος των εντεροϊών περιλαµβάνει πολλά και σηµαντικά παθογόνα είδη, αίτια λοιµώξεων στον άνθρωπο. Το πρωτότυπο στέλεχος του ιού της πολιοµυελίτιδας είναι το αίτιο της νόσου πολιοµυελίτιδας. Η νόσος ήταν από τις πιο σοβαρές ιογενείς νόσους που γνώρισε η προηγούµενη γενιά, λόγω των παραλύσεων και των αναπηριών από αυτές. Μετά την ανάπτυξη και τη συστηµατική χορήγηση αποτελεσµατικών εµβολίων στο τέλος της δεκαετίας 50 η νόσος περιορίσθηκε σηµαντικά. Η Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας (ΠΟΥ) το 1988 πήρε την πρωτοβουλία και έθεσε ως στόχο την εκρίζωση του άγριων στελεχών του ιού της πολιοµυελίτιδας από τον πλανήτη το Μέχρι σήµερα, τέλος του 2006, αν και είµαστε πολύ κοντά στο στόχο, αυτός δεν έχει επιτευχθεί ακόµη. Ο εµβολιασµός για την πολιοµυελίτιδα θα σταµατήσει µόνο στην περίπτωση που θα πιστοποιηθεί η εκρίζωση του άγριου στελέχους πολιοµυελίτιδας. Για το λόγο αυτό εξακολουθεί να είναι εξαιρετικά σηµαντική η τυποποίηση των εντεροϊών και αναγκαία η διάκριση του άγριου ιού της πολιοµυελίτιδας από τα στελέχη του εµβολίου σε κλινικά και περιβαλλοντικά δείγµατα. Με βάση το γεγονός ότι οι περισσότερες λοιµώξεις από τον ιό της πολιοµυελίτιδας είναι ασυµπτωµατικές, η απουσία περιστατικών παραλυτικής πολιοµυελίτιδας δε µπορεί να θεωρηθεί αξιόπιστος δείκτης και θα πρέπει να συνοδεύεται από επιδηµιολογική παρακολούθηση των εντεροϊών. Με την επιδηµιολογική παρακολούθηση των περιπτώσεων οξείας χαλαρής παράλυσης εκτιµάται η αποτελεσµατικότητα των προγραµµάτων εµβολιασµού, τίθεται η διάγνωση των περιστατικών παραλυτικής 7

10 πολιοµυελίτιδας που συσχετίζονται µε τον εµβολιασµό, και τέλος αποκλείονται άλλοι εντεροϊοί που προκαλούν νόσο µε συµπτώµατα πολιοµυελίτιδας. Οι µη- πολιο εντεροϊοί συνδέονται µε ευρύ φάσµα νόσων ή κλινικών συνδρόµων στον άνθρωπο. Οι λοιµώξεις από τους µη- πολιο εντεροϊούς αν και είναι συχνές, συνήθως έχουν ήπια ή µέτριας σοβαρότητας κλινική διαδροµή. Όµως, σε ορισµένες περιπτώσεις αυτές οι λοιµώξεις είναι σοβαρές και µερικές φορές θανατηφόρες. Τα κυριότερα κλινικά σύνδροµα από αυτούς τους εντεροϊούς συνδέονται µε λοιµώξεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος (ΚΝΣ), όπως η άσηπτη µηνιγγίτιδα ή εγκεφαλίτιδα. Επιπλέον, οι µη-πολιο εντεροϊοί µπορούν να προκαλέσουν µηνιγγοεγκεφαλίτιδα, µυοκαρδίτιδα, παράλυση και µερικές φορές ακόµη να οδηγήσουν στο θάνατο. Οι εντεροϊοί είναι το πιο συχνό αίτιο άσηπτης µηνιγγίτιδας. Άλλες κλινικές εκδηλώσεις από το ΚΝΣ, όπως οι εµπύρετοι σπασµοί ή παράλυση, το σύνδροµο Guillain-Barre, η εγκάρσια µυελίτιδα, η εγκεφαλική αταξία και η περιφερική νευρίτιδα, µπορεί να συνδέονται µε λοιµώξεις του ΚΝΣ από εντεροϊούς. Οι λοιµώξεις του ΚΝΣ από εντεροϊούς είναι συχνές σε παγκόσµια κλίµακα. Αυτές εµφανίζονται είτε ως σποραδικά κρούσµατα, κυρίως όµως ως επιδηµικά κρούσµατα τους θερινούς µήνες στις περιοχές µε εύκρατο κλίµα. Εποµένως, η τυποποίηση των εντεροϊών είναι σηµαντική για τους ακόλουθους λόγους: να διαπιστωθεί η ποικιλία των συν-κυκλοφορούντων εντεροϊών, να καθορισθεί η σχέση των κυτταρικών και βιοχηµικών δεδοµένων από την ανάλυση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) και της φορείας του ιού, και να βραθούν οι συσχετίσεις µεταξύ του τύπου του εντεροϊού και της συµπτωµατολογίας, συµπεριλαµβοµένων των σπάνιων κλινικών εκδηλώσεων, και τέλος να διερευνηθούν οι τρόποι µετάδοσης κατά τη διάρκεια της επιδηµικής έξαρσης. Ακόµη, η αιτιολογική διάγνωση των λοιµώξεων από εντεροΐούς είναι σηµαντική για τη διάκριση των λοιµώξεων από ιούς πολιοµυελίτιδας από τις λοιµώξεις που προκαλούνται από άλλα στελέχη εντεροϊών, στο πλαίσιο του προγράµµατος εκρίζωσης της πολιοµυελίτιδας από την ΠΟΥ. Τέλος, η επιδηµιολογική επιτήρηση των εντεροϊών συµβάλλει στον έλεγχο της παρατεταµένης απέκκρισης των πολιοϊών που προέρχονται από το εµβόλιο σε ανοσοκατασταλµένα άτοµα. 8

11 Γενικά, οι νευρολογικές κλινικές εκδηλώσεις που προκαλούνται από εντεροΐούς δε µπορούν να διακριθούν από αυτές που παρατηρούνται σε άλλες ιογενείς λοιµώξεις. Μέχρι σήµερα δεν υπάρχει ειδική θεραπευτική αντιµετώπιση των λοιµώξεων από εντεροΐούς. Ωστόσο η χορήγηση σε ενήλικες και σε µεγαλύτερης ηλικίας παιδιά του pleconaril, ενός νέου αντιιΐκού παράγοντα για τους Picorna ιούς, έχει συσχετιστεί µε µειωµένη σοβαρότητα και διάρκεια των συµπτωµάτων. Η µετάδοση των εντεροϊών γίνεται κυρίως µε την κοπρανο-στοµατική οδό. Παραδοσιακά η διάγνωση των λοιµώξεων από εντεροΐούς και η τυποποίηση των στελεχών των εντεροϊών, βασίζεται στην αποµόνωση των ιών από τα κλινικά δείγµατα σε καλλιέργειες κυττάρων. Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρουσία ζώντων ιών και µειονεκτεί γιατί είναι χρονοβόρα και έχει µικρή σχετικά ευαισθησία. Επιπλέον, το σύνολο των εντεροΐών δεν αναπτύσσεται σε καλλιέργειες κυττάρων. Για την αποµόνωση και τυποποίηση της πλειονότητας των Coxsackie A ιών είναι αναγκαίος ο εµβολιασµός σε θηλάζοντα ποντίκια. Η ορολογική διάγνωση έχει περιορισµένο ρόλο στη διαγνωστική προσέγγιση, εξαιτίας του µεγάλου αριθµού οροτύπων. Οι µοριακές µέθοδοι εµφανίζουν αυξηµένη ευαισθησία και παρέχουν ταχεία διάγνωση και για το λόγο αυτό η χρησιµοποίησή τους στα εργαστήρια συνεχώς αυξάνει. Σηµαντικός αριθµός RT-PCR πρωτοκόλλων έχει αναπτυχθεί για τη διάγνωση των λοιµώξεων από εντεροϊούς, χρησιµοποιώντας εκκινητές µε περιορισµένο αριθµό νουκλεοτιδίων, οι οποίοι εµφανίζουν συµπληρωµατικότητα µε συντηρηµένη περιοχή που εντοπίζεται στην 5 µη µεταφραζόµενη περιοχή του γονιδιώµατος ή µε την περιοχή που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη VP2 του καψιδίου. Ωστόσο τα δεδοµένα που προέκυψαν από τη χρήση αυτών των εκκινητών δεν είναι επαρκή για την τυποποίηση εξαιτίας της έλλειψης συσχέτισης µεταξύ της αλληλούχισης του νουκλεΐνικού οξέος και της ειδικότητας του οροτύπου. Πρόσφατα, η ανάπτυξη µιας βάσης δεδοµένων της ακολουθίας όλης της VP1 περιοχής όλων των οροτύπων των ανθρωπίνων εντεροϊών, απέδειξε ότι η VP1 περιοχή σχετίζεται καλύτερα µε τον ορότυπο. Ο σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η ανίχνευση και η αποµόνωση των πιο συχνών εντεροϊών, οι οποίοι προκαλούν λοιµώξεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος ( άσηπτη µηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα και άλλα) στον 9

12 Ελλαδικό χώρο µε την εφαρµογή της RT- PCR µε στόχο την VP1 περιοχή και τον προσδιορισµό της αλληλουχίας απευθείας από δείγµα ΕΝΥ και όχι από καλλιέργεια κυττάρων, η οποία αποτελεί τη µέθοδο αναφοράς. Ακόµη, στόχος ήταν η µοριακή τυποποίηση και η επιδηµιολογία των εντεροϊών που κυκλοφορούσαν κατά τη χρονική περίοδο της µελέτης µε την εφαρµογή της αλληλούχισης και της φυλογενετικής ανάλυσης σε σχέση µε τα στελέχη των εντεροϊών, οι οποίοι είχαν αποµονωθεί τα προηγούµενα έτη στην Ελλάδα καθώς και στην Ευρώπη και τις άλλες χώρες. Η µελέτη αποτελείται από το γενικό και το ειδικό µέρος. Το γενικό µέρος περιλαµβάνει τα γενικά χαρακτηριστικά των εντεροϊών: την ιστορία, την ταξινόµηση, τη δοµή, τις φυσικές και χηµικές ιδιότητες, την οργάνωση του γονιδιώµατος, την αντιγραφή του ιού, την παθογένεση των λοιµώξεων και τις κλινικές εκδηλώσεις αυτών, την επιδηµιολογία, την πρόληψη και τη θεραπεία. Το ειδικό µέρος περιλαµβάνει: το υλικό και τις µεθόδους που εφαρµόσθηκαν, τα αποτελέσµατα, τη συζήτηση των ευρηµάτων και τη σύγκριση τους µε τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδοµένα, την περίληψη, τα συµπεράσµατα και βιβλιογραφικές αναφορές. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές ευχαριστίες προς τα µέλη της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής. Προς την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μικροβιολογίας του Α.Π.Θ. κ. Φ. Φραντζίδου-Αδαµοπούλου κυρίως επιβλέπουσα της διατριβής µου, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη και να τις ευχαριστίες µου για την ευγένειά της, τη φιλοξενία και κυρίως για την απεριόριστη επιστηµονική καθοδήγηση και το χρόνο που διέθεσε σε όλη τη διάρκεια τόσο του πειραµατικού µέρους όσο και της συγγραφής της διατριβής. Επίσης, ιδιαίτερα θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Α. Παπά-Κονιδάρη για τις πολύτιµες συµβουλές και την καθοδήγηση που µου παρείχε κατά τη διάρκεια της εφαρµογής και βελτιστοποίησης των µοριακών τεχνικών της RT-PCR και της αλληλούχισης του DNA, καθώς και την προπαρασκευή και τη συγγραφή της διδακτορικής διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον ιευθυντή του Εργαστηρίου καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Α. Αντωνιάδη για τη φιλοξενία και την υποστήριξή του σε όλα τα στάδια της διδακτορικής διατριβής. Θα ήταν παράλειψη αν δεν εξέφραζα την εκτίµησή µου στη κ. Μ. Τσακιροπούλου, τεχνολόγο του Α Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Α.Π.Θ. 10

13 και την Ε. Παπαδηµητρίου, Βιολόγο του εργαστηρίου, των οποίων η βοήθεια τους στο πειραµατικό µέρος ήταν πολύτιµη. Ευχαριστίες θέλω να εκφράσω επίσης προς την κ. Φ. Καµάρια, Επιµελήτρια Παθολογίας στο Νοσοκοµείο Ειδικών Παθήσεων Θεσσαλονίκης για τη συλλογή του µεγαλύτερου µέρους των κλινικών δειγµάτων. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ακόµη και όλο το υπόλοιπο προσωπικό του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και ιδιαίτερα τη κ. Ε. ίζα-ματαυτσή για τη φιλοξενία, την ευγένεια και τη βοήθεια που µου παρείχαν στα τρέχοντα προβλήµατα που ανέκυπταν. Επίσης, θερµά ευχαριστώ το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ) για τη δυνατότητα που µου παρείχε να πραγµατοποιήσω το όνειρό µου και να ολοκληρώσω τη διδακτορική µου διατριβή. Τέλος, οι θερµές ευχαριστίες από το βάθος της καρδιάς µου ανήκουν στη γυναίκα µου και τα παιδιά µου για τη συνεχή ενθάρρυνση, στήριξη και υποµονή που επέδειξαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής και η οποία απαιτούσε την απουσία µου από το οικογενειακό περιβάλλον. 11

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 12

15 1. ΙΣΤΟΡΙΑ Η ιστορία των εντεροϊών είναι ταυτισµένη µε την ιστορία του ιού της πολιοµυελίτιδας. Οι ιοί της πολυοµυελίτιδας, µέλη του γένους των εντεροϊών, αναγνωρίστηκαν από τον 14 ο αιώνα π.χ. στην αιγυπτιακή τέχνη από την απεικόνιση παραλυτικών µορφών 1. Η πρώτη κλινική περιγραφή της πολιοµυελίτιδας έγινε τον 19 ο αιώνα, µε την περιγραφή το 1840 περιπτώσεων εµπύρετης παραλυτικής νόσου 2. Η πολιοµυελίτιδα µε χαλαρή παράλυση χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά από τους Heine και Medin, για αυτό και ονοµάστηκε νόσος των Heine και Medin. Το 1909 η πολιοµυελίτιδα θεωρήθηκε ιογενής νόσος, όταν οι Landsteiner και Popper µετέδωσαν την παραλυτική νόσο σε πιθήκους µε ενοφθαλµισµό εκχυλίσµατος κοπράνων από ασθενή µε παραλυτική νόσο 3.Το 1948 στην πόλη Coxsackie της πολιτείας της Ν. Υόρκης των Ηνωµένων Πολιτειών (ΗΠΑ) αποµονώθηκαν ιοί από νεογέννητα ποντίκια, στα οποία είχε ενοφθαλµισθεί εκχύλισµα κοπράνων ελεύθερο κυττάρων, προερχόµενο από παιδιά µε παράλυση. Αυτοί οι ιοί δεν εξουδετερώνονταν από αντιορούς εναντίον των τριών τύπων του ιού της πολιοµυελίτιδας. Οι ιοί αυτοί ήταν οι πρώτοι που αποµονώθηκαν από την οµάδα των ιών Coxsackie Α 4. Η κυριότερη πρόοδος για τη διάγνωση και τον έλεγχο της πολιοµυελίτιδας ήταν η ανακάλυψη από τους Enders και συνεργάτες ότι ο ιός µπορούσε να πολλαπλασιαστεί σε καλλιέργειες εµβρυικών ανθρώπινων κυττάρων 5. Η ανακάλυψη αυτή για την οποία ο Enders και συνεργάτες τιµήθηκαν µε το Βραβείο Nobel, διευκόλυνε την παρασκευή των εµβολίων κατά των ιών της πολιοµυελίτιδας, του αδρανοποιηµένου εµβολίου (Salk) και του από του στόµατος χορηγούµενου εµβολίου από ζωντανούς εξασθενηµένους ιούς (Sabin). Επίσης η δυνατότητα αυτή επέτρεψε την αναγνώριση και άλλων οροτύπων των ιών picorna και καθιερώθηκε ως «χρυσή διαγνωστική µέθοδος» για πολλούς ιούς που προηγουµένως ήταν άγνωστοι. Ο πρώτος ιός Coxsackie της οµάδας Β αποµονώθηκε το 1949 από περιπτώσεις ασθενών µε διάγνωση µη παραλυτική πολιοµυελίτιδα ή άσηπτη µηνιγγίτιδα 6. Οι ιοί Coxsackie διακρίθηκαν σε δύο οµάδες, Α και Β, µε βάση την παθογόνο δράση σε νεογέννητα ποντίκια και την ικανότητα τους να αναπτύσσονται σε καλλιέργειες κυττάρων 7. Αργότερα κατά την αποµόνωση 13

16 και µελέτη των ιών πολιοµυελίτιδας σε καλλιέργειες κυττάρων νέοι ιοί αποµονώθηκαν, οι οποίοι όµως ενώ προκαλούσαν κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις στις καλλιέργειες κυττάρων, παρόµοιες µε αυτές από τους ιούς πολιοµυελίτιδας και Coxsackie, δεν ήταν γνωστό αν συνδέονταν µε νόσο. Αρχικά, επειδή δεν µπορούσαν να συσχετισθούν µε νόσο στον άνθρωπο και δεν ήταν παθογόνοι για τα νεογέννητα ποντίκια ονοµάστηκαν ορφανοί ιοί ενώ αργότερα έγιναν γνωστοί ως Echo (Enteric Cytophathogenic Human Orphan). Αργότερα όµως έγινε προφανές ότι οι ιοί αυτοί µπορούσαν να αποµονωθούν από υγιή παιδιά, όπως και από ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα ή άλλα κλινικά σύνδροµα. Επίσης, βρέθηκε ότι ορισµένα στελέχη των ιών Coxsackie µπορούσαν να αναπτυχθούν σε καλλιέργειες κυττάρων ενώ δεν προκαλούσαν παράλυση σε νεογέννητα ποντίκια. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι ορισµένα στελέχη ιών Echo είναι παθογόνα για τα νεογέννητα ποντίκια. Γρήγορα έγινε φανερό ότι αυτό το σχήµα ήταν ανεπαρκές για την ταξινόµηση των ανθρώπινων εντεροϊών. Έτσι αποφασίστηκε ότι κάθε νέος εντεροϊός θα µπορούσε να προσδιοριστεί µε ένα διαδοχικό αραβικό αριθµό, αρχίζοντας µε τον εντεροϊό 68 (EV68) 8, ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Η κατάταξη των ιών σε οικογένειες βασίζεται κυρίως στη µορφολογία του βιρίου, τη φύση του γονιδιώµατος και τον τρόπο αντιγραφής. Αλλες βιολογικές, φυσικοχηµικές και αντιγονικές ιδιότητες είναι επίσης σηµαντικές για την ταυτοποίηση και ταξινόµηση 10. Οι ανθρώπινοι εντεροϊοί είναι µέλη του γένους των εντεροΐών της οικογένειας Picornaviridae, η οποία έχει έξι γένη: αφθοϊός, καρδιοϊός, εντεροϊός, ηπατοϊός, parechovirus και ρινοϊός (aphthovirus, cardiovirus, enterovirus, hepatovirus, parechovirus, and rhinovirus). Όλα αυτά τα γένη περιλαµβάνουν ιούς που προσβάλλουν τα σπονδυλωτά 11, 12. Οι ανθρώπειοι εντεροϊοί ήταν αρχικά ταξινοµηµένοι σε τέσσερις κατηγορίες σύµφωνα µε τους ιστικούς υποδοχείς, τους αντιγονικούς προσδιοριστές, την κλινική εικόνα των νόσων στον άνθρωπο και την ευαισθησία των νεογέννητων ποντικών µετά πειραµατικό εµβολιασµό: (i) Ιοί πολιοµυελίτιδας (polioviruses), τύποι 1-3, αίτια της πολιοµυελίτιδας στον 14

17 άνθρωπο, γενικά µη παθογόνοι στα ποντίκια, (ii) Ιοί Coxsackie A, τύποι 1-22 και 24 (CAV1-22, 24), που σχετίζονται µε λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος και ερπητική κυνάγχη, και προκαλούν χαλαρή παράλυση στα ποντίκια, (iii) Ιοί Coxsackie B, τύποι 1-6 (CBV 1-6), που σχετίζονται µε λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος και καρδιακές παθήσεις στον άνθρωπο, και προκαλούν σπαστική παράλυση στα ποντίκια, και (iv) Ιοί Echo (Echoviruses-Ε), τύποι 1-7,11-21,24-27, και 29-33, που δεν είναι λοιµογόνοι για τα ποντίκια και αρχικά δεν συνδέθηκαν µε γνωστά νοσήµατα στον άνθρωπο 12, 13, 14. Εντούτοις, γρήγορα έγινε προφανές ότι αυτό το σχήµα ήταν ανεπαρκές για την ταξινόµηση των ανθρώπινων εντεροϊών, καθώς αποµονώθηκαν ιοί λοιµογόνοι για τα ποντίκια που ήταν ορολογικά ταυτόσηµοι µε τους γνωστούς ιούς Echo, όπως επίσης αποδείχθηκε ότι οι ιοί Echo σχετίζονται µε µεγάλη ποικιλία ανθρώπινων νόσων 13, 15. Ως εκ τούτου οι νέοι ανθρώπειοι ορότυποι των εντεροϊών που αποµονώθηκαν µετά 1969 ονοµάστηκαν απλά εντεροϊοί και αριθµήθηκαν διαδοχικά, αρχίζοντας από τον αριθµό 68 8, 9. Από τότε αναγνωρίσθηκαν συνολικά 68 ορότυποι 16, ενώ από το 2002 έχουν προταθεί και άλλοι νέοι ορότυποι 17, 18, 19, 21, 21. Με την πρόσφατη ταξινόµηση, που λαµβάνει υπό όψη βιολογικές και µοριακές ιδιότητες των ιών, οι ανθρώπειοι εντεροϊοί χωρίζονται σε πέντε είδη( species): : (i) Poliovirus (PV1, PV2, PV3), (ii) Human enterovirus A (HEV-A) που περιλαµβάνει τους τύπους CAV2 - CAV8, CAV10, CAV12, CAV14, CAV16, and EV71), (iii) Human enterovirus Β (HEV-B), τύποι CAV9, CBV1 - CBV6, Echo 1-7, 9, 11-21, 24-27, 29-33, Enterovirus 69 και 73 (EV69 και EV73), (iv) Human enterovirus C (HEV- C),τύποι CAV1, CAV11, CAV13, CAV15, CAV17 - CAV22, και CAV24 και (v) Human enterovirus D (HEV-D),τύποι EV68 and EV70 12, 16 (Πίνακας 1). Λόγω της στενής γενετικής σχέσης ανάµεσα στους ιούς της πολυοµυελίτιδας και στα µέλη του είδους HEV-C, διάφοροι ερευνητές έχουν προτείνει την ταξινόµηση αυτών σε ένα είδος 10, 22,

18 Πίνακας 1: Είδη του γένους των εντεροϊών βασιζόµενα στην οργάνωση του γονιδιώµατος και στην οµοιότητα της αλληλουχίας βάσεων. Είδος (species) Ορότυπος (serotype) Poliovirus τύποι 1, 2, 3 HEV-A ( 16 ορότυποι) CAV 2-8, 10, 12, 14,16, και HEV71, 76, 89, 90 και 91 HEV-B (43 ορότυποι) CAV 9, CBV 1-6, E 1-7, 9,11-21, 24-27, και EV 69, 73, 74, 75, 77, 78 HEV-C (11 ορότυποι) CAV 1, 11, 13, 15, 17-22, A24 HEV-D (2 ορότυποι) EV 68,70 HEV: Εντεροϊοί του ανθρώπου, CAV: Ιοί Coxsackie Α, CBV: Ιοί Coxsackie B, Ε: Ιοί Echo. Οι ιοί Coxsackie A 23, Echo 8, 10, 22, 23, 28 και 34 έχουν επαναταξινοµηθεί σε άλλα γένη 3. ΟΜΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Οι εντεροϊοί είναι σωµατίδια χωρίς περίβληµα, µε διάµετρο περίπου 30 nm, αποτελούµενα από εξήντα αντίγραφα από κάθε µία από τις τέσσερις δοµικές πρωτεΐνες VP1 - VP4 που περιβάλλουν ένα θετικής πολικότητας RNA γονιδίωµα µε περίπου 7500 νουκλεοτίδια. Το εικοσάεδρο καψίδιο περιέχει 12 πενταµερή σχήµατος πενταγώνου των 5 πρωτοµερών, κάθε ένα δε πρωτοµερές σχηµατίζεται από ένα αντίγραφο κάθε µίας δοµικής πρωτεΐνης. Η βασική οργάνωση του καψιδίου είναι κοινή σε όλους τους ιούς picorna. Σήµερα, η ατοµική ανάλυση των δοµών αρκετών εντεροϊών έχει επιτευχθεί µε κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Αυτές οι δοµές περιλαµβάνουν τον ιό πολιοµυελίτιδας τύπου 1 (PV1) 24, PV3 25, coxsackie virus B3 (CBV3) 26, PV2 27, and coxsackie virus A9 28. Όλες αυτές οι δοµές είναι σε σηµαντικό βαθµό παρόµοιες, ενώ διαφοροποίηση υπάρχει στην επιφάνεια και στις εσωτερικές δοµές του καψιδίου. Οι κυριότερες πρωτεΐνες του καψιδίου VP1 - VP3 είναι η κάθε µία διπλωµένες σε οκτάστροφα αντιπαράλληλα β-φύλλα µε τοπογραφία που οµοιάζει µε κύλινδρο πηκτής (jelly-roll topology). Αυτοί οι β κύλινδροι από τα 5 αντίγραφα της VP1 είναι τοποθετηµένοι γύρω από τον πενταπλό άξονα, ενώ οι VP2 και VP3 είναι γύρω από τον τριπλό άξονα. Η VP4 είναι πολύ µικρότερη από τις άλλες δοµικές πρωτεΐνες έχοντας µία λιγότερο σαφή δοµή, 16

19 ενώ είναι τοποθετηµένη στην εσωτερική επιφάνεια του καψιδίου, αντικρίζοντας το RNA (Σχήµα 1). Σχήµα 1. Οργάνωση δοµής εντεροϊού Ένα από τα πιο εντυπωσιακά δοµικά χαρακτηριστικά των picorna ιών είναι το κυκλικό βύθισµα δίκην φαραγγιού ( round canyon) γύρω από τον πενταπλό άξονα, που για πρώτη φορά έγινε αντιληπτό στη δοµή του ανθρώπινου ρινοϊού Η υπόθεση του βυθίσµατος υπαινίσσεται ότι µία στρατηγική για να διαφεύγει ο ιός την επιτήρηση του ανοσολογικού συστήµατος του ξενιστή, θα ήταν να κρύβει το σηµείο σύναψης µε τους κυτταρικούς υποδοχείς σε µία εσοχή της επιφάνειας του ιού 28, 30. Αυτό θα µπορούσε στερεοχηµικά να προστατεύσει το σηµείο δέσµευσης από τα αντισώµατα, επιτρέποντας παράλληλα αναγνώριση από τον υποδοχέα της επιφάνειας των κυττάρων που θα µπορούσε να είναι στενότερη από αυτή ενός αντισώµατος. Το βύθισµα βρίσκεται περίπου ανάµεσα στη VP1 στη βόρεια πλευρά (πλευρά πλησιέστερα προς τον πενταπλό άξονα) και τη VP2 και VP3 στη νότια πλευρά. Αυτή η οργάνωση αφήνει 5 αντίγραφα της VP1 σαν προεξοχή στον πενταπλό άξονα. Η γενική τοπογραφία του βυθίσµατος κυµαίνεται στους διάφορους εντεροϊούς, ενώ στην CVA9 εµφανίζεται περισσότερο σαν πέντε ξεχωριστές εσοχές παρά σαν ένα µόνο βύθισµα

20 Αποδείχθηκε επίσης ότι η VP4 είναι απαραίτητη στην απέκδυση ή την είσοδο στο κύτταρο, καθώς µία µη βιώσιµη µεταλλαγµένη VP4 ήταν ικανή να σχηµατίσει δοµικά ενδιάµεσα που θεωρούνταν απαραίτητα για την λοίµωξη, και τα οποία όταν µεταφέρθηκαν στα κύτταρα, το cdna ήταν ικανό να αρχίσει τη λοίµωξη που οδήγησε προφανώς σε ώριµα βίρια 31. Όλες οι γνωστές δοµές των εντεροϊών και των ρινοϊών περιέχουν µία υδρόφοβη θήκη στη βάση του βυθίσµατος καλυµµένη από δακτυλίους VP1 28. Αυτό το διάστηµα υποτίθεται ότι φυσιολογικά είναι γεµάτο από ένα φυσικό παράγοντα, ένα λιπαρό οξύ µε µία αλειφατική αλυσίδα µε κυµαινόµενο µήκος. Αυτή η θήκη είναι το σηµείο δράσης αρκετών αντιϊικών φαρµάκων, τα οποία πιθανόν συνδέονται µε τη θήκη πιο σταθερά από ότι ο φυσικός παράγοντας και έτσι εµποδίζεται η απέκδυση του ιού 32, ΦΥΣΙΚΕΣ ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Οι εντεροϊοί ξεχωρίζουν από τα άλλα γένη της οικογένειας των picornaviridae λόγω των φυσικών ιδιοτήτων τους, όπως η ελαφρά πυκνότητα επίπλευσης σε χλωριούχο καίσιο και η σταθερότητα σε ασθενή οξέα. Οι εντεροϊοί είναι σταθεροί σε ph Αυτό το χαρακτηριστικό τους κάνει ικανούς να επιβιώνουν κατά τη µεταφορά µέσω του όξινου περιβάλλοντος του στοµάχου και να φτάνουν στον κατώτερο εντερικό σωλήνα 12, 34. Ο λοιµογόνος εντεροΐός είναι σχετικά ανθεκτικός σε πολλά κοινά εργαστηριακά αντισηπτικά, όπως η 70% αιθανόλη, ισοπροπανόλη, διαλυµένη λυσόλη, τετραγενή µείγµατα αµµωνίου. Ο ιός επίσης δεν είναι ευαίσθητος σε διαλυτικά λίπους και είναι σταθερός σε πολλά απολυµαντικά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Οι εντεροϊοί αδρανοποιούνται από τη φορµαλδεΰδη, τη γλουτεραλδεΰδη, τα ισχυρά οξέα, το υποχλωριώδες νάτριο και την ελεύθερη από υπόλειµµα χλωρίνη. Η αδρανοποίηση τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση, το ph, τα εξωγενή οργανικά υλικά και τον χρόνο της επαφής. Τελικά, οι περισσότεροι από τους παράγοντες που αδρανοποιούν τους εντεροϊούς προκαλούν ενεργό χηµική τροποποίηση του βιρίου, ενώ τα περισσότερα διαλυτικά που χρησιµοποιούνται για εκχύλιση δεν έχουν κανένα αποτέλεσµα 35. Οι εντεροϊοί είναι σχετικά σταθεροί στη θερµοκρασία δωµατίου. Σχεδόν οι περισσότεροι εντεροϊοί αδρανοποιούνται στους 42 o C, εν τούτοις κάποιοι 18

21 παράγοντες που ελαττώνουν τις σουλφυδρικές οµάδες και τα κατιόντα µαγνησίου µπορούν να σταθεροποιήσουν τους ιούς ώστε να αντέχουν στους 50 o C 36, 37. Όπως και µε άλλους λοιµογόνους παράγοντες, το υπεριώδες φως µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην αδρανοποίηση των εντεροϊών, ειδικά σε επιφάνειες. Εντούτοις, η αδρανοποίηση της µολυσµατικότητας µπορεί να µη σχετίζεται άµεσα µε την καταστροφή του ιικού γονιδιώµατος, γιατί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ενίσχυση του ιικού RNA ακόµη και µετά την αδρανοποίηση του ιού 38. Αυτό το γεγονός ίσως σηµαίνει ότι κάτω από ορισµένες συνθήκες µπορεί να συµβεί επανενεργοποίηση του ιού. 5. ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ Το γονιδίωµα του εντεροϊού είναι µονής έλικας θετικής πολικότητας RNA από περίπου 7.5 kb, µε µία πρωτεΐνη 22 αµινοξέων, την VPg, που κωδικοποιείται από τον ιό, οµοιοπολικά ενωµένη στο 5 άκρο (Σχήµα 2). Και στο 5 και στο 3 άκρο του γονιδιώµατος υπάρχει µία µη µεταφραζόµενη περιοχή (NTR). Η 5 NTR αποτελεί περίπου το 10% του γονιδιώµατος. Αυτή η 5 NTR σχετίζεται µε την έναρξη της µετάφρασης, κατευθύνοντας τα ριβοσωµάτια στο εσωτερικό σηµείο εισόδου των ριβοσωµατίων IRES (Internal Ribosome Entry Site) 39, 40. Η 3 NTR είναι µικρότερη, µόλις νουκλεοτίδια (nts) σε µήκος και ακολουθείται από µία poly-a ουρά. Η 3 NTR χρησιµοποιείται στην έναρξη της σύνθεσης του αριστερόστροφου RNA, αλλά ακόµη και µεταλλαγµένα ιοί χωρίς το 3 NTR έχουν αποδειχθεί λοιµογόνοι για τις καλλιέργειες κυττάρων 41. Η περιοχή που κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες, κωδικοποιεί µία πολυπρωτεΐνη που διαχωρίζεται πρωτεολυτικά σε πρόδροµες πρωτεΐνες Ρ1, Ρ2 και Ρ3 και µετά η P1 διαχωρίζεται στις δοµικές πρωτεΐνες VP1 έως VP4, ενώ Ρ2 και Ρ3 σε επτά µη δοµικές πρωτεΐνες. Πολλά από τα ενδιάµεσα παράγωγα του διαχωρισµού είναι επίσης λειτουργικά. Οι πρωτεΐνες 2A, 3C και 3CD είναι πρωτεάσες, η 3D είναι η RNA εξαρτώµενη RNA πολυµεράση, η 2C είναι προφανώς µία ελικάση, και έχει λειτουργία στην 19

22 εγκαψιδίωση του RNA και οι 2B, 2BC, 3A και 3AB συµµετέχουν σε διάφορες λειτουργίες αντιγραφής του ιικού RNA 42. Σχήµα 2: Οργάνωση του γονιδιώµατος του εντεροϊού. Επάνω: διάγραµµα του ιικού RNA γονιδιώµατος µε την ενωµένη µε το γονιδίωµα πρωτεΐνη VPg στο 5 άκρο, την 5 µη µεταφραζόµενη περιοχή, την περιοχή που κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες, την 3 µη µεταφραζόµενη περιοχή και την πολύ-α ουρά. Οι περιοχές κωδικοποίησης των ιικών πρωτεϊνών παραθέτονται. Κάτω: διαδικασία διαχωρισµού της πολυπρωτεΐνης του εντεροϊού. Η περιοχή κωδικοποίησης έχει χωριστεί σε τρεις περιοχές, Ρ1, Ρ2, Ρ3, οι οποίες διαχωρίζονται µε αναπτυσσόµενο σπάσιµο από δύο ιικές πρωτεΐνάσες, 2A και 3C. Τα ενδιάµεσα και τελικά προϊόντα διαχωρισµού παραθέτονται. Η πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τον διαχωρισµό του VP0 δεν έχει αναγνωριστεί. Σπάσιµο µεταξύ των πρωτεϊνών P1 και P2 από τις πρωτεΐνες 2Α, επίσης αυτές προκαλούν τη δική τους ελευθέρωση στο σηµείο σύνδεσης µε τη 2Β. Τα υπόλοιπα σπασίµατα γίνονται από την 3C πρωτεϊνάση και τη την πρόδροµη της 3CD. 6. ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ, ΕΙΣΟ ΟΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Η έναρξη της ιικής λοίµωξης εξαρτάται από την προσκόλληση σε ένα µόριο κυτταρικού υποδοχέα. Η προσκόλληση σε αυτά τα µόρια είναι ειδική, και κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, οι ιοί έχουν προσαρµοστεί να χρησιµοποιούν µία πλειάδα υποδοχέων. Αρκετοί τέτοιοι υποδοχείς και συνυποδοχείς είναι γνωστοί για τους διάφορους εντεροϊούς (Πίνακας 2). 20

23 Πίνακας 2. Κυτταρικοί υποδοχείς εντεροϊών Στέλεχος ιού Υποδοχέας Τύπος υποδοχέα Συνυποδοχέας Polioviruses 1-3 PVr Ig-like Coxsackieviruses A13, A18, A21 ICAM-1 Ig-like Coxsackievirus A21 Decay- accelerating SCR-like (complement ICAM-1 factor CD55 cascade) Coxsackievirus A9 α v β 3 (Vitronectin Integrin receptor) Coxsackieviruses B1-6 CAR (coxsackievirus- Ig-like adenovirus receptor) Coxsackieviruses B1, B3, B5 Decay- accelerating SCR-like (complement α v β 6 -integrin factor CD55 cascade Echoviruses 1,8 α 2 β 1 -Integrin Integrin Β 2 - Microglobulin Echoviruses 3,6, 7, 11-13, 20, 21, 24,29,33 Decay- accelerating factor CD55 SCR-like (complement cascade) Enterovirus 70 Decay- accelerating factor CD55 SCR-like (complement cascade) Ig: ανοσοσφαιρίνη, SCR: short consensus repeat, PVr: Poliovirus receptor. O κύκλος αντιγραφής πραγµατοποιείται µε τη προσρόφηση του ιού µέσω των πρωτεϊνών του, οι οποίες συνδέονται στη θέση του βυθίσµατος του καψιδίου του ιού µε τον υποδοχέα επιφανείας του κυττάρου ξενιστή. Αρκετά παραδείγµατα ιών που σχετίζονται στενά χρησιµοποιούν για την είσοδο διαφορετικούς υποδοχείς. Από την άλλη πλευρά κάποιοι εξελικτικά διαφορετικοί ιοί µπορεί να χρησιµοποιούν τον ίδιο υποδοχέα, όπως φαίνεται από τον υποδοχέα για τον ιό Coxsackie virus και τον αδενοϊό (Coxsackie virus adenovirus receptor-car) 43. Επιπλέον, υπάρχουν ιοί που φαίνεται να χρησιµοποιούν τουλάχιστον δύο διαφορετικούς υποδοχείς. Ένα παράδειγµα τέτοιου ιού είναι ο CAV9 44. Εκτός από τα µόρια του αρχικού υποδοχέα, αρκετοί, αν όχι όλοι οι ιοί, χρειάζονται επιπρόσθετες πρωτεΐνες για την είσοδο, που ονοµάζονται συνυποδοχείς. Ο CAV21 έχει αποδειχθεί ότι χρειάζεται την 21

24 παρουσία και του ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule) και του παράγοντα εκφύλισης-επιτάχυνσης (Decay accelerating Factor- DAF) για την είσοδο στα κύτταρα 45, ενώ για την διαδικασία εισόδου του CAV9 υπάρχει, µετά την προσκόλληση, ανάγκη για β2-µικροσφαιρίνη 44. Τελικά, οι ανθρώπειοι εντεροϊοί όχι µόνο έχουν ένα στενό εύρος ξενιστή, αλλά και µέσα στο πρωτεύον θηλαστικό που έχει µολυνθεί, η αντιγραφή περιορίζεται σε ειδικά κύτταρα και ιστούς (τροπισµός υποδοχέων και ιστών). Οι εκφράσεις των υποδοχέων των εντεροϊών επηρεάζουν την κατανοµή των λοιµώξεων των εντεροϊών. Για παράδειγµα, ο πολλαπλασιασµός και οι λοιµώξεις του ιού της πολιοµυελίτιδας περιορίζονται σε ορισµένες θέσεις, τους νευρώνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου µυελού και µη διευκρινισµένες εξωνευρωνικές θέσεις. Από την άλλη µεριά, τα κύτταρα της νευρογλοίας δεν προσβάλλονται από τον ιό της πολυοµυελίτιδας. Αυτό είναι ένα παράδειγµα του περιορισµού του ιστικού τροπισµού, και καθορίζεται από την κατανοµή των υποδοχέων 46. Εντούτοις, υπάρχουν υψηλότερα επίπεδα του PVr υποδοχέα (Polio Virus receptor) εκπεφρασµένα στο ανθρώπινο ήπαρ, τους πνεύµονες και την καρδιά, από ότι στον εγκέφαλο, παρ ότι αυτοί οι ιστοί δεν θεωρούνται ότι φυσιολογικά προσβάλλονται από τον ιό της πολυοµυελίτιδας 47. Οι εξηγήσεις για το γεγονός αυτό είναι ότι υπάρχουν και άλλοι παράγοντες, εκτός από τους ιικούς υποδοχείς, που καθορίζουν τη διασπορά της ιικής λοίµωξης 48, όπως η οδός του ενοφθαλµισµού, οι ιστοί του ξενιστή, το γονιδίωµα του ιού και ορισµένοι παράγοντες µέσα στα κύτταρα του ξενιστή 49, 50. Αφού συνδεθεί µε τον υποδοχέα του ο εντεροϊός υφίσταται δοµικές τροποποιήσεις που έχουν ως αποτέλεσµα ένα σωµατίδιο που έχει χάσει το µεγαλύτερο µέρος από την εσωτερική πρωτεΐνη του καψιδίου VP4, έχει εξωτερικεύσει το Ν άκρο της VP1, και έχει ένα διαφορετικό συντελεστή καθίζησης (135S αντί 160S στο αρχικό βίριο), διαφορετικές αντιγονικές ιδιότητες και αυξηµένη ευαισθησία στις πρωτεάσες. Μερικά τροποποιηµένα σωµατίδια του ιού έχουν βρεθεί σε ενδοσωµάτια λίγο µετά την µόλυνση, αλλά το σηµείο εισόδου δεν είναι ακόµη γνωστό 51. Πριν από τη σύνθεση συµπληρωµατικών αρνητικής πολικότητας αντιγράφων του γονιδιώµατος, το γονιδιακό RNA λειτουργεί ως πρότυπο για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Οι ιικές πρωτεΐνες για να συντεθούν χρειάζεται να 22

25 έχουν την RNA-εξαρτώµενη RNA πολυµεράση που λείπει από την κυτταρική µηχανή. Η µετάφραση αρχίζει από την εσωτερική ριβοσωµατική θέση εισόδου (IRES), παρούσα στην 5 NTR περιοχή 39, 40. Το σύνολο της περιοχής που κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες µεταφράζεται σαν µία απλή πολυπρωτεΐνη, η οποία κατά την µετάφραση διαχωρίζεται µε τη βοήθεια των ιικών πρωτεασών σε τρείς πρόδροµες πρωτεΐνες, Ρ1, Ρ2 και Ρ3 52. Οι Ρ2 και Ρ3 πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε επτά µη δοµικές πρωτεΐνες, µαζί µε αρκετές µορφές λειτουργικών ενδιαµέσων, χρησιµεύοντας στην αντιγραφή του RNA και στην παραγωγή πρωτεϊνών. Τα προϊόντα του διαχωρισµού της Ρ3 περιλαµβάνουν τις πρωτεάσες 3C και 3CD, που χρειάζονται στο διαχωρισµό άλλων ιικών πρωτεϊνών από τις πρόδροµες µορφές. Το ίδιο µόριο RNA που έχει χρησιµοποιηθεί στη µετάφραση, χρησιµοποιείται ως µήτρα για τη σύνθεση αριστερόστροφων RNA µορίων, µε την πολυµεράση 3D που κωδικοποιείται από τον ιό. Αυτές οι αλυσίδες χρησιµοποιούνται στη σύνθεση µεγάλων ποσοτήτων αντιγράφων θετικής πολικότητας που χρησιµοποιούνται για τη µετάφραση των ιικών πρωτεϊνών, όπως επίσης και για να ενσωµατωθούν στο καψίδιο του συναρµολογούµενου βιρίου. Η µικρή VPg πρωτεΐνη ενώνεται στο 5 άκρο όλων των αντιγράφων 53. Η διαδικασία της λοίµωξης προάγεται από το διαχωρισµό του ευκαρυωτικού παράγοντα εκκίνησης 4GII (eif4gii) 54, 55, και επίσης από την πολύ-α δεσµευτική πρωτεΐνη 56, µε µηχανισµό όπου συµµετέχει η πρωτεάση 2A 57. Αυτοί οι διαχωρισµοί είναι µεταξύ των γνωστών αλλαγών στα κύτταρα του ξενιστή, µε αποτέλεσµα τη διακοπή της κυτταρικής πρωτεΐνοσύνθεσης (cap-dependent) µε µηχανισµούς που δεν είναι πολύ κατανοητοί. Οι εντεροϊοί χρησιµοποιούν µία διαφορετική µέθοδο έναρξης της µετάφρασης (cap-independent), όντας ικανοί να προκαλούν πρωτεϊνοσύνθεση στο µολυσµένο κύτταρο 39, 40. Η συναρµολόγηση ενός νέου βιρίου αρχίζει καθώς η Ρ1 πρόδροµη πρωτεΐνη διαχωρίζεται στις VP0, VP1 and VP3 πρωτεΐνες του καψιδίου και αυτές οι πρωτεΐνες αποτελούν ένα ετεροτριµερές 58. Μετά, πέντε από αυτά τα ετεροτριµερή συνδέονται σε µία πενταµερή δοµή, που είναι ουσιαστικά ένα 15µερές από πέντε αντίγραφα από κάθε µία από τις προκαψιδιακές πρωτεΐνες VP0, VP1 και VP3 59. Στη συνέχεια, 12 από αυτά τα πενταµερή συνδέονται µαζί και σχηµατίζουν προκαψίδια (VP01360), που περιέχουν ένα αντίγραφο από το θετικής πολικότητας γονιδίωµα. εν είναι γνωστό αν πρώτα σχηµατίζονται άδεια 23

26 προκαψίδια και µετά ενσωµατώνεται το µόριο του RNA, ή αν τα προκαψίδια συνδέονται γύρω από το µόριο του RNA. Κατά τη διάρκεια της ενσωµάτωσης του RNA στο καψίδιο, το µεγαλύτερο µέρος της πρωτεΐνης VP0 χωρίζεται σε VP2 και VP4. Αυτό ονοµάζεται σχίσιµο ωρίµανσης και πρέπει να είναι το τελευταίο στάδιο πριν από τη συναρµολόγηση του καψιδίου σε ένα σταθερό, ώριµο βίριο. Ένα µόνο µολυσµένο κύτταρο µπορεί τυπικά να παράγει 10 4 µε 10 5 σωµατίδια ιού πολυοµυελίτιδας, που απελευθερώνονται µε τη λύση του κυττάρου. Η λύση υποτίθεται ότι συµβαίνει λόγω αυξηµένης διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης 60, η οποία οφείλεται στις αυξηµένες συγκεντρώσεις των µη δοµικών πρωτεϊνών 3A και 3AB 61, 62, 2BC 63 και 2B 62, 64. Πρόσφατα δεδοµένα προτείνουν ότι η απόπτωση µπορεί επίσης να είναι ένας σηµαντικός παράγοντας στα συµπτώµατα που προκύπτουν από επίµονες λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος 65, και ότι η πρωτεΐνη 3C του ιού της πολιοµυελίτιδας προάγει την απόπτωση µε µηχανισµό εξαρτώµενο από την κασπάση 66, ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΠΟΥ ΑΙΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΘΡΩΠΕΙΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Οι εντεροϊοί είναι κυτταρολυτικοί και πολλές από τις νόσους που προκαλούν είναι αποτέλεσµα της καταστροφής των κυττάρων του συγκεκριµένου ιστού. Οι λοιµώξεις είναι γενικά από ασυµπτωµατικές έως ήπιες και οι εντεροϊοί θεωρούνται µη σηµαντικοί ως ανθρώπινα παθογόνα. Εντούτοις, οι εντεροϊοί µπορούν να προκαλέσουν σοβαρές, έως θανατηφόρες νόσους 68. Κάποιες εκδηλώσεις των νόσων, όπως το εξάνθηµα ή η µυοκαρδίτιδα, είναι αποτέλεσµα ανοσιακής απάντησης του ξενιστή στη 2, λοίµωξη 12. Όµως στις περισσότερες περιπτώσεις οι πραγµατικοί µηχανισµοί της νόσου που προκαλείται από τον ιό, δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Κάποιες γνώσεις για την µυοκαρδίτιδα στον άνθρωπο έχουν αποκτηθεί από πρόσφατες µελέτες που χρησιµοποιούν ζωικά µοντέλα 69, 70. Κυρίως, ο ιός µετά την κατάποση, αρχικά εµφυτεύεται και πολλαπλασιάζεται στους ευαίσθητους ιστούς του φάρυγγα ή σε αποµακρυσµένα τµήµατα του εντέρου. Ο πολλαπλασιασµός του ιού στο λεµφικό ιστό του ειλεού 24

27 ανιχνεύεται 1-3 ηµέρες µετά την κατάποση του ιού. Η ποσότητα του ιού που µπορεί να ανακτηθεί από τις αµυγδαλές είναι µικρότερη από ότι από τις πλάκες του Peyer. Η µέγιστη διάρκεια της απέκκρισης του ιού είναι 3-4 εβδοµάδες από τον λαιµό και 5-6 εβδοµάδες, ή και περισσότερο, από τα κόπρανα. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι εντεροϊοί πολλαπλασιάζονται µε µεγαλύτερη επιτυχία στο λεπτό έντερο 34. Όλοι οι ιοί της πολιοµυελίτιδας, οι ιοί Coxsackie οµάδας Α και Β και οι ιοί Echo έχουν περίοδο επώασης που κυµαίνεται από 2-35 µέρες µε µέσο όρο 7-14 µέρες. Η συντοµότερη περίοδος επώασης, ώρες, έχει παρατηρηθεί σε οφθαλµικές λοιµώξεις από τον εντεροϊό Μετά τον υποβλεννογόνιο πολλαπλασιασµό στον λεµφικό ιστό (πλάκες του Peyer και αµυγδαλές), ο ιός περνά στους αυχενικούς και µεσεντέριους λεµφαδένες προκαλώντας µία µικρή ιαιµία (πρωτογενής ιαιµία), µε επακόλουθη εισβολή στο συστηµατικό ενδοθηλιακό ιστό, όπως στο ήπαρ, τον σπλήνα, το µυελό των οστών και στους εν τω βάθει λεµφαδένες. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι οποίες οδηγούν σε υποκλινικές µορφές, η ιική αντιγραφή σταµατά ή περιορίζεται από τους αµυντικούς µηχανισµούς. Σε ορισµένες όµως, λίγες, περιπτώσεις η αντιγραφή συνεχίζεται και ακολουθεί µία κύρια ιαιµία που ταυτίζεται µε την έναρξη της ελάσσονος νόσου της πολιοµυελίτιδας και πιθανόν µε τις µη ειδικές εµπύρετες νόσους που προκαλούν οι λοιµώξεις από τους άλλους εντεροϊούς. Πρωτογενής ιαιµία έχει καταδειχθεί µε τον άγριο ιό της πολιοµυελίτιδας και µε ιούς Echo 34. Η κύρια ιαιµία οδηγεί στη διασπορά των εντεροϊών στα όργανα στόχους, όπως το ΚΝΣ, η καρδιά, το δέρµα. Σε αυτούς τους ιστούς έχει παρατηρηθεί νέκρωση και φλεγµονώδεις βλάβες. Ο βαθµός της νέκρωσης και των φλεγµονωδών βλαβών εξαρτάται από το φορτίο του µολυσµατικού ιού. Η σοβαρότητα της λοίµωξης σε πειραµατόζωα προάγεται από την άσκηση, την έκθεση στο ψύχος, την κακή διατροφή, την εγκυµοσύνη και την ανοσοκαταστολή λόγω κορτικοειδών ή ακτινοβολίας 34. Οι µηχανισµοί παθογένεσης της νόσου από εντεροϊούς στον άνθρωπο φαίνονται στο Σχήµα 3. 25

28 Σχήµα 3: Παθογένεση των λοιµώξεων από εντεροϊούς. Οι ιστοί-στόχοι που µολύνονται από εντεροϊό καθορίζουν την κυρίαρχη εκδήλωση της νόσου. Η λοίµωξη από εντεροϊό προκαλεί µία έντονη χυµική ανοσιακή απάντηση. Συχνά αυτή η απάντηση είναι ετερότυπη. ηλαδή η λοίµωξη µε έναν ορότυπο παράγει διασταυρούµενη ανοσιακή απάντηση έναντι άλλων ορότυπων. Τα µικρά παιδιά αναπτύσσουν κυρίως απάντηση έναντι του ιδίου τύπου, ενώ τα µεγαλύτερα παιδιά και οι ενήλικες και έναντι των άλλων τύπων. Αυτή η διαφορά ηλικίας στην ειδικότητα της αντισωµατικής απάντησης στη λοίµωξη από εντεροϊό, αντανακλά την έκθεση σε µεγαλύτερο αριθµό ορότυπων µε την αύξηση της ηλικίας. Η βάση της ετερότυπης απάντησης δεν είναι γνωστή, αλλά ίσως δηλώνει την παρουσία επιτόπων που µοιράζονται µεταξύ πολλαπλών ορότυπων 71,

29 8. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚ ΗΛΩΣΕΙΣ 8.1. Λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος Οι λοιµώξεις του ΚΝΣ από τους εντεροϊούς είναι γνωστές από την αρχαιότητα, εξ αιτίας των δραµατικών σωµατικών επιπτώσεων των προτύπων των εντεροϊών, των ιών της πολιοµυελίτιδας. Σήµερα, η νόσος πολιοµυελίτιδα έχει εκριζωθεί από την Αµερική, την Ευρώπη και από τις περισσότερες αναπτυγµένες χώρες. Η εκρίζωση της πολιοµυελίτιδας από τον πλανήτη, το 2007, συνεχίζει να είναι στόχος προτεραιότητας του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας στις αναπτυσσόµενες χώρες. Τα πιο σοβαρά κλινικά σύνδροµα που προκαλούνται από µη πολιο-εντεροϊούς, επίσης αφορούν το ΚΝΣ 12, 73. Οι κυριότερες λοιµώξεις του ΚΝΣ που σχετίζονται µε τους εντεροϊούς είναι: Πολιοµυελίτιδα Η πιο κοινή συµπτωµατική νόσος που προκαλείται από τους πολιοϊούς ονοµάζεται εκτρωτική πολιοµυελίτιδα, η οποία είναι µία ήπια, εµπύρετη νόσος, µε γαστρεντερικά συµπτώµατα, και συµβαίνει περίπου στο 4-8% των µολυνθέντων ατόµων. Λιγότερο συχνά, η λοίµωξη από τους πολιοϊούς µπορεί να οδηγήσει σε άσηπτη µηνιγγίτιδα, µε πυρετό, πονοκέφαλο και µηνιγγιτιδικά σηµεία, αλλά µε απουσία σηµείων συµµετοχής του παρεγχύµατος του ΚΝΣ. Η µηνιγγίτιδα συνήθως αυτοπεριορίζεται. Έχει βρεθεί ότι 1 στις 200 λοιµώξεις από πολιοϊό σε πλήρως ευαίσθητο πληθυσµό, προκαλεί την παραλυτική νόσο, γνωστή ως πολιοµυελίτιδα 2. Η νόσος προκαλεί εκλεκτική καταστροφή των κινητικών νευρώνων, οδηγώντας σε παράλυση και, σε κάποιες περιπτώσεις, σε αναπνευστική ανεπάρκεια και θάνατο 65. Η περίοδος επώασης από τη µόλυνση µέχρι την έναρξη της παράλυσης είναι συνήθως 4-10 µέρες, µερικές φορές συντοµότερη ή πιο παρατεταµένη 2. Η παθολογοανατοµική βλάβη στην πολιοµυελίτιδα είναι η φλεγµονή και η καταστροφή της φαιάς ουσίας του ΚΝΣ, ιδίως στον νωτιαίο µυελό. Οι κινητικοί νευρώνες πάνω και κάτω από τον νευράξονα µπορούν επίσης να προσβληθούν, περιλαµβάνοντας τους ανώτερους κινητικούς νευρώνες του εγκεφαλικού στελέχους και των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, µαζί µε τους 27

30 κατώτερους κινητικούς νευρώνες των προσθίων κεράτων του νωτιαίου µυελού. Επώδυνοι σπασµοί και έλλειψη συνεργασίας των µη παράλυτων µυών µπορούν να συµβούν. Πρόσφατες έρευνες στα διαγονιδιακά ποντίκια µε έλλειψη PVr έδειξαν ότι οι νευρώνες του νωτιαίου µυελού πεθαίνουν από απόπτωση 74. Μελέτες σε καλλιέργειες κυττάρων, επίσης έδειξαν απόπτωση των κυττάρων µετά από µόλυνση µε πολιοϊό 66. Πολιοµυελίτιδα ή οξεία χαλαρή παράλυση µπορεί επίσης να προκληθεί από άλλους τύπους εντεροϊών, όπως ο EV 70 και 71 και Coxsackie Α7 76, , 75, Αρκετά έτη µετά από την λοίµωξη και την ανάρρωση από την πολιοµυελίτιδα, µερικοί ασθενείς παρουσιάζουν επί πλέον µυική αδυναµία, κόπωση και πόνο, το σύνδροµο µετά την πολιοµυελίτιδα. Υπάρχει η υπόνοια ότι το σύνδροµο αυτό οφείλεται σε µερικές περιπτώσεις στην παραµονή της λοίµωξης από τον ιό στα κύτταρα των νευρώνων, λόγω της ανίχνευσης ενδορραχιαίων αντισωµάτων κατά του ιού και της παρουσίας RNA του ιού στο ΕΝΥ 78. Η εµµονή της λοίµωξης από πολιο ή άλλους εντεροϊούς στο ΚΝΣ έχει ενοχοποιηθεί στην αιτιολογία της νόσου του κινητικού νευρώνα. Η παρουσία του RNA στο ΕΝΥ ή στον νευρικό ιστό έχει ανακοινωθεί σε µικρό αριθµό ασθενών 78, Άσηπτη µηνιγγίτιδα και εγκεφαλίτιδα Άσηπτη µηνιγγίτιδα ονοµάζεται η κάθε είδους φλεγµονή των µηνίγγων, που δεν συνοδεύεται από την παραγωγή πύου. Είναι συνήθως καλόηθες σύνδροµο 80. Οι εντεροϊοί είναι η πιο κοινή αιτία άσηπτης µηνιγγίτιδας στις χώρες όπου η παρωτίτιδα έχει ελεγχθεί µε τον εµβολιασµό 65. Τα πιο χαρακτηριστικά συµπτώµατα που συνδέονται µε την ιογενή µηνιγγίτιδα, είναι ο πυρετός, η κεφαλαλγία, η φωτοφοβία, η δυσκαµψία του αυχένα ή της ράχης, µυική αδυναµία, διάρροια, έµετοι και νωθρότητα 81. Η άσηπτη µηνιγγίτιδα που προκαλείται από εντεροϊούς έχει συνήθως πλήρη ανάρρωση από την πάρεση 65. Οι λοιµώξεις του ΚΝΣ από εντεροϊούς αφορούν κυρίως τα παιδιά, µε 7000 δηλωµένες περιπτώσεις κάθε χρόνο στις ΗΠΑ, ενώ η πραγµατική συχνότητα υπολογίζεται δεκαπλάσια 73. Οι εντεροϊοί είναι η κύρια 28

31 αναγνωρίσιµη αιτία άσηπτης µηνιγγίτιδας σε παιδιά και ενήλικες στις αναπτυγµένες χώρες και αποτελούν το 85-95% των περιπτώσεων άσηπτης µηνιγγίτιδας στις οποίες ο αιτιολογικός παράγων αναγνωρίζεται 82. Σε µία µελέτη από τη Φινλανδία, άσηπτη µηνιγγίτιδα είχαν 219 από παιδιά κάτω του ενός έτους και 19 από παιδιά 1-4 ετών, δείχνοντας µείωση στη συχνότητα µε την αύξηση της ηλικίας 83. Μία άλλη µελέτη έδειξε ότι οι ιοί Coxsackie της οµάδας Β αποµονώθηκε σε ποσοστό 62% από βρέφη κάτω των τριών µηνών µε άσηπτη µηνιγγίτιδα 84. Περιστασιακές επιδηµίες λοίµωξης του ΚΝΣ από εντεροϊό συµβαίνουν κυρίως µεταξύ ενηλίκων 85. Η εξήγηση για αυτά τα ευρήµατα που φαινοµενικά δείχνουν αντικρουόµενα µε την ηλικιακή επίπτωση, πιθανόν να βρίσκεται στο πρόσφατο ιστορικό διασποράς ορισµένων ορότυπων σε µελετηθείσες γεωγραφικές περιοχές. Οι ορότυποι µε ένδειξη ενδηµικότητας, που εµφανίζονται µε σηµαντική συχνότητα κάθε έτος, είναι πιθανό να αφορούν περισσότερο τα µικρά παιδιά. Αυτή η οµάδα ασθενών είναι συνήθως πιο ευαίσθητη σε πολλές κοινές λοιµώξεις, λόγω της έλλειψης προηγούµενης έκθεσης και ανοσίας. Τα µεγαλύτερα παιδιά και οι ενήλικες είναι πιο πιθανό να προσβληθούν από εντεροϊό κατά τη διάρκεια µιας επιδηµίας από ένα ορότυπο που δεν ήταν παρόν στην κοινότητα για αρκετά χρόνια, καθώς δηµιουργήθηκε µία δεξαµενή από ευαίσθητα παιδιά που γεννήθηκαν µετά την τελευταία εµφάνιση αυτού του ορότυπου, ή εµφανίσθηκε µια νέα ποικιλία ενός γνωστού ορότυπου 73. Όταν η φλεγµονή αφορά το εγκεφαλικό παρέγχυµα, ο κατάλληλος όρος που χρησιµοποιείται είναι εγκεφαλίτιδα. Χαρακτηριστικά αυτής είναι διαταραχή του επιπέδου συνείδησης, εστιακά νευρολογικά σηµεία και σπασµοί 73. Η εγκεφαλίτιδα από εντεροϊό µπορεί να είναι πιο σοβαρή νόσος, µε πιο καταστροφικές µακροχρόνιες επιπλοκές. Η νόσος συνήθως ξεκινά σαν άσηπτη µηνιγγίτιδα, µε πρόδροµα συµπτώµατα πυρετό, µυαλγίες και συµπτώµατα από το ανώτερο αναπνευστικό. Η έναρξη της νόσου είναι συνήθως απότοµη, µε σύγχυση, αδυναµία, λήθαργο, νωθρότητα ή ευερεθιστότητα. Εξέλιξη της νόσου σε κώµα ή γενικευµένους σπασµούς µπορεί να συµβεί. Όταν συνυπάρχουν µηνιγγιτιδικά σηµεία και πλειοκυττάρωση του ΕΝΥ, ο σωστότερος όρος για την περιγραφή του συνδρόµου είναι µηνιγγοεγεφαλίτιδα 73. Οι εντεροϊοί και οι αρµποϊοί είναι τα πιο κοινά αίτια εγκεφαλίτιδας, µετά τους ερπητοϊούς 86. Μελέτη του Glaser και 29

32 συνεργατών το 2003, µε τη χρησιµοποίηση της τεχνικής PCR έδειξε ότι σε 334 ασθενείς µε εγκεφαλίτιδα οι εντεροϊοί ήταν η δεύτερη πιο κοινή αιτία εγκεφαλίτιδας, µετά τον απλό έρπητα 87. Οι ιοί Coxsackie οµάδας B και A (ειδικά οι τύποι B1-6, A7, A9), πολλοί ιοί Echo (τύποι 4, 6, 11, 13, 14, 16, 25, 30, 31), όπως και ο εντεροϊός 71, έχει βρεθεί ότι σχετίζονται µε τις λοιµώξεις του ΚΝΣ 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99. Η κλινική εικόνα των λοιµώξεων του ΚΝΣ από εντεροϊό, εξαρτάται από την ηλικία του ξενιστή και την ανοσία. Τα νεογνά που προσβάλλονται είναι σε µεγαλύτερο κίνδυνο για σηµαντική νοσηρότητα και θνητότητα, όταν τα σηµεία της νόσου εµφανιστούν τις πρώτες µέρες της ζωής, γιατί η άσηπτη µηνιγγίτιδα µπορεί να συνοδεύεται από συστηµατική νόσο, όπως ηπατίτιδα, µυοκαρδίτιδα και εγκεφαλίτιδα 100. Το ποσοστό νοσηρότητας και θνητότητας των λοιµώξεων από εντεροϊό στα νεογέννητα είναι υψηλό, 74 και 10% αντίστοιχα 84. Όµως οι λοιµώξεις από εντεροϊό µε εξαίρεση αυτές των νεογνών σπάνια συνοδεύονται από σοβαρή νόσο ή κακή έκβαση. Η έναρξη είναι συνήθως απότοµη και ο πυρετός είναι το πιο συχνό σύµπτωµα, σε ποσοστό % των περιπτώσεων 73. Αυχενική δυσκαµψία υπάρχει σε περισσότερους από τους µισούς ασθενείς, ειδικά σε παιδιά πάνω από 1-2 ετών 73. Κεφαλαλγία υπάρχει κυρίως στους ενήλικες και στα µεγάλα παιδιά και επίσης κοινή είναι η φωτοφοβία. Άλλα µη ειδικά συµπτώµατα, που εµφανίζονται µε µικρότερη συχνότητα, είναι ο έµετος, η ανορεξία, το εξάνθηµα, η διάρροια, ο βήχας, οι λοιµώξεις του ανώτερου αναπνευστικού και οι µυαλγίες 73. Μερικές φορές η άσηπτη µηνιγγίτιδα που προκαλείται από ορισµένους ορότυπους, συνοδεύεται από ειδικά συµπτώµατα, π.χ. το σύνδροµο χεριών-ποδιώνστόµατος που προκαλείται από τους ιούς EV71 and Coxsackie A Εξανθήµατα µπορεί να συνοδεύουν τις λοιµώξεις του ΚΝΣ που προκαλούνται από τους ιούς Coxsackie A5, A9, A16, and Echo 4, 6, 9, Αρκετές µελέτες έδειξαν ότι οι εντεροϊοί προκαλούν κάθε χρόνο επιδηµίες το καλοκαίρι και το φθινόπωρο, µε σποραδικά κρούσµατα ανάµεσα στις επιδηµίες. Στις εύκρατες περιοχές άσηπτη µηνιγγίτιδα από εντεροϊούς συνήθως συµβαίνει καλοκαίρι και φθινόπωρο, ενώ στα τροπικά κλίµατα λοιµώξεις συµβαίνουν κατά τη διάρκεια όλου του έτους 73, 101, 102,

33 Οι λοιµώξεις του ΚΝΣ από εντεροϊούς σε ανοσοκατασταλµένα άτοµα προδιαθέτουν προς ένα σύνδροµο άσηπτης µηνιγγίτιδας ή µηνιγγοεγεφαλίτιδας από εντεροϊούς που µερικές φορές προκαλεί µία εµµένουσα λοίµωξη του ΚΝΣ 2. Η νόσος είναι συνήθως πιο σοβαρή, µε πονοκεφάλους, σπασµούς, αταξία, διαταραχή επιπέδου συνείδησης, κινητικές και αισθητικές διαταραχές, και διαταραχές προσωπικότητας µε γνωστική έκπτωση. Οι ασθενείς είναι δυνατόν επίσης να παρουσιάσουν άλλες διαταραχές, όπως σύνδροµο δερµατοµυοσίτιδας, εξανθήµατα, οίδηµα και ηπατίτιδα 104. Η µηνιγγίτιδα από εντεροϊό συµβαίνει πιο συχνά στους άνδρες από ότι στις γυναίκες (αναλογία 1,4:1) 105, 106. Η κατανοµή αυτή δεν είναι κατανοητή, αλλά έχει αποδειχθεί από πολλαπλές µελέτες 107. Οι ασθενείς µε λοιµώξεις του ΚΝΣ έχουν διαυγές εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), µε φυσιολογική ή ελαφρά αυξηµένη πίεση. Επίσης, υπάρχει πλειοκυττάρωση του ΕΝΥ, της τάξης των /mm 3 (µερικές φορές και µε µεγαλύτερο αριθµό, που δεν φτάνει όµως τις τιµές της βακτηριακής µηνιγγίτιδας), µε υπεροχή των λεµφοκυττάρων. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της πρώτης ηµέρας µετά την έναρξη των συµπτωµάτων, µπορεί να υπάρχει υπεροχή των πολυµορφοπύρηνων 108. Μία µελέτη έδειξε υπεροχή των πολυµορφοπύρηνων, ανεξάρτητα από το χρόνο µεταξύ της έναρξης των συµπτωµάτων και της οσφυονωτιαίας παρακέντησης 109. Η συγκέντρωση της πρωτεϊνης είναι φυσιολογική ή ελαφρώς αυξηµένη, και η τιµή της γλυκόζης φυσιολογική Καρδιακά νοσήµατα Η µυοκαρδίτιδα είναι φλεγµονή του µυοκαρδίου, που συνοδεύεται από βλάβη που δεν σχετίζεται µε ισχαιµία. Η µυοκαρδίτιδα είναι υποκλινική και αυτοπεριοριζόµενη, µε λίγες, αν όχι καθόλου, επιπλοκές. Από την άλλη µεριά, η οξεία νόσος µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική νοσηρότητα, ακόµη και θάνατο. Οι εντεροϊοί και ειδικά οι ιοί Coxsackie οµάδας Β1-5 (ειδικά ο ιός Coxsackie Β3 έχει βρεθεί ότι σχετίζεται µε το 63% των περιπτώσεων µυοκαρδίτιδας) έχουν ενοχοποιηθεί σαν αιτιολογικοί παράγοντες της ιογενούς µυοκαρδίτιδας στους ανθρώπους, µε αποτέλεσµα εµφανή καρδιακά 31

34 συµπτώµατα και σηµεία 14, 76. Η µυοκαρδίτιδα είναι πολύ συχνό εύρηµα στην αυτοψία παιδιών που έχουν καταλήξει από βαριά λοίµωξη από ιό Coxsackie 2. Η συχνότητα των λοιµώξεων από εντεροϊό στην οξεία µυοκαρδίτιδα, που βασίζεται σε ορολογικές µελέτες, έδειξε ότι 34% των ασθενών που ελέγχθηκαν είχε θετική δοκιµασία για εντεροϊούς, σε σύγκριση µε 4% της οµάδας ελέγχου 111. Επίσης, άλλη µελέτη που χρησιµοποίησε µοριακές τεχνικές για να επιβεβαιώσει την ενοχοποίηση των εντεροϊών στην οξεία µυοκαρδίτιδα, έδειξε παρουσία γονιδιώµατος των εντεροϊών στον καρδιακό ιστό στο 23% των ασθενών και στο 6% της οµάδας ελέγχου 112. Η λοίµωξη του µυοκαρδίου από εντεροϊούς πιστεύεται ότι είναι προϋπόθεση για µυοκαρδίτιδα, αν και απαντήσεις της κυτταρικής ανοσίας έναντι των ιών και ενεργοποίηση Τ κυττάρων από απελευθέρωση αποµονωµένων αυτοαντιγόνων ως αποτέλεσµα της ιστικής καταστροφής, φαίνεται να συµβάλλουν στην παθογένεση της µυοκαρδίτιδας 113, 114. Ο Klingel και συνεργάτες το 2000, καθώς και ο Ahn και συνεργάτες το 2005 έδειξαν ότι ιοί Coxsackie της οµάδας Β σχετίζονται µε σοβαρές, µη αναστρέψιµες δοµικές αλλαγές της αρχιτεκτονικής του καρδιακού κυττάρου σε κάθε στάδιο της νόσου. Ακόµη, σε πειραµατικές καλλιέργειες κυττάρων και σε διαγονιδιακά ποντίκια, αποδείχθηκε ότι οι ιοί Coxsackie της οµάδας Β µπορούν να προκαλέσουν βλάβες του τύπου της µυοκαρδίτιδας και, επίσης, υπάρχει ένδειξη ότι οι εντεροϊοί, κατά την πορεία της λοίµωξης, είναι ικανοί να ενεργοποιούν ειδικό κυτταρικό σήµα στις οδούς µεταγωγής 114, 115. Η οξεία µυοκαρδίτιδα µπορεί να οδηγήσει σε χρόνια µυοκαρδίτιδα ή διατατική µυοκαρδιοπάθεια (Dilated Cardiomyopathy DCM). Σε αντίθεση µε την οξεία µυοκαρδίτιδα, δεν υπάρχουν αναφορές αποµόνωσης εντεροϊών από την καρδιά στη χρόνια διατατική µυοκαρδιοπάθεια, γιατί πιθανόν ο ιός έχει περιορισµένη έκφραση ή εξαφανίζεται µετά την οξεία νόσο. Η διατατική µυοκαρδιοπάθεια είναι µία µεταφλεγµονώδης νόσος, που είναι σηµαντική αιτία καρδιακής ανεπάρκειας και αιφνίδιου καρδιακού θανάτου και µία από τις πιο συχνές αιτίες που οδηγούν σε καρδιακή µεταµόσχευση 74. Όπως αναφέραµε προηγουµένως, ότι οι εντεροϊοί και ειδικά οι Coxsackie της οµάδας Β είναι οι πιο συχνή αιτία οξείας µυοκαρδίτιδας, υπάρχουν τώρα ισχυρές ενδείξεις ότι αυτοί µπορούν να προκαλέσουν εµµένουσα νόσο που σχετίζεται µε χρόνια µυοκαρδίτιδα και χρόνια διατατική µυοκαρδιοπάθεια 116, 117. Η 32

35 παραµονή του εντεροϊού στην ανθρώπινη καρδιά και η πιθανότητα ότι αυτή έχει σχέση µε την παθογένεση, έχει επιβεβαιωθεί σε διάφορα µοντέλα ποντικών µε προκληθείσα µυοκαρδίτιδα από τον ιό Coxsackie 118, 119. RNA εντεροϊών έχει ανιχνευθεί σε καρδιακό ιστό σε ένα ποσοστό των περιπτώσεων, µε υβριδισµό νουκλεϊνικού οξέος ή µε RT-PCR, που επιβεβαιώνει τον ρόλο του ιού σε αυτή τη χρόνια νόσο 115, 120, 121, Σακχαρώδης διαβήτης και παγκρεατίτιδα Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 1 (Σ τύπου 1) είναι µία αυτοάνοση νόσος, στην οποία τα κύτταρα των νησιδίων του παγκρέατος που εκκρίνουν ινσουλίνη έχουν προοδευτικά καταστραφεί. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως λοιµώξεις από εντεροϊούς, έχουν ενοχοποιηθεί στην αιτιολογία του Σ τύπου 1. Αρκετές ορολογικές επιδηµιολογικές µελέτες έχουν δείξει κάποια σχέση µεταξύ των λοιµώξεων από εντεροϊούς και στην εµφάνιση Σ τύπου 1 23, 124, 125, 126. Σε µερικές µελέτες επέτυχε η αποµόνωση Coxsackievirus B4 από το πάγκρεας ασθενών µε οξείας έναρξης νόσο, όπως και από θανατηφόρες περιπτώσεις Σ τύπου 1 127, 128. Με ορολογικές και µοριακές µεθόδους βρέθηκε ότι και άλλοι ορότυποι εντεροϊών, όπως οι ιοί Coxsackie B1, 2, 3, 5 and Coxsackievirus A9, ότι σχετίζονται µε Σ τύπου 1 129, 130. Ο Σ τύπου 1 ως αποτέλεσµα λοιµώξεων από εντεροϊούς, δεν είναι πλήρως κατανοητός. Οι Varela- Calvino και Peakman το 2003 πρότειναν ότι η µοριακή µίµηση και η επακόλουθη καταστροφή λόγω ενεργοποίησης ανοσιακών µηχανισµών µπορεί να είναι οι παθολογοανατοµικές συνέπειες των λοιµώξεων από εντεροϊούς. Επίσης δείχνουν την προτίµηση στην υπόθεση ότι η λοίµωξη από εντεροϊούς συµπεριφέρεται ως τοπικός υποβοηθητικός παράγων, διεγείροντας το ανοσιακό σύστηµα να δηµιουργήσει ένα προφλεγµονώδες περιβάλλον, συνοδευµένο από καταστροφή των β-κυττάρων και επακόλουθη παρουσίαση των απελευθερωµένων αυτοαντιγόνων των νησιδίων

36 8. 4. Λοιµώξεις του αναπνευστικού συστήµατος. Ερπητική κυνάγχηεξανθήµατα Αρκετοί εντεροϊοί έχει βρεθεί ότι σχετίζονται µε ήπιες νόσους του ανώτερου αναπνευστικού συστήµατος, όπως κοινό κρυολόγηµα και επιγλωττίτιδα, ειδικά κατά τις εποχές έξαρσης λοιµώξεων από εντεροϊούς (καλοκαίρι και φθινόπωρο). Σε µία πρόσφατη µελέτη στις ΗΠΑ, οι εντεροϊοί αποτελούσαν το 1,7% από 3119 δείγµατα από το αναπνευστικό που υποβλήθηκαν σε καλλιέργεια για ιούς το διάστηµα , και το 6,4% από όλους τους ιούς που αποµονώθηκαν από αυτά τα δείγµατα 132. Οι εντεροϊοί που κυρίως σχετίζονται µε λοιµώξεις του αναπνευστικού είναι οι Coxsackie A2, 10, 21, 24 and Coxsackie B2, 5 και Echo 2, 11, 19, 20, Η ερπητική κυνάγχη είναι µία εµπύρετη νόσος µε δυσκαταποσία, που συνοδεύεται από εµέτους και κοιλιακά συµπτώµατα. Μικρές φυσαλιδώδεις βλάβες υπάρχουν στα παρίσθµια, στο φάρυγγα, στην υπερώα, στη σταφυλή και στις αµυγδαλές. Υλικό από το υγρό των φυσαλίδων ή άλλα σηµεία µπορεί να βοηθήσει στη διαφορική διάγνωση της νόσου από τις πρωτοπαθείς λοιµώξεις από απλό έρπητα 74. Οι εντεροϊοί που κυρίως ενοχοποιούνται για αυτή τη νόσο είναι οι ορότυποι Coxsackie της οµάδας A και B και οι τύποι των ιών Echo 6, 9,11,16,17, Η νόσος χεριών-ποδιών-στόµατος είναι ένα ελκωτικό εξάνθηµα του βλεννογόνου των παρειών, µε µέτριο πυρετό, που συνοδεύεται από επώδυνες φυσαλιδώδεις βλάβες των χεριών και των ποδιών. Λιγότερο συχνά, βλάβες µπορεί να υπάρχουν στους γλουτούς και στα γεννητικά όργανα. Αυτή η λοίµωξη σχετίζεται µε αρκετά στελέχη εντεροϊών, (CAV 4, 5, 9 and CBV 2 and 5), αλλά συχνότερα µε CAV 16 και EV Το 1998 υπήρξε µεγάλη επιδηµία στην Ασία και στον Ειρηνικό, µε επιπλοκές όπως άσηπτη µηνιγγίτιδα, οξεία χαλαρή παράλυση, εγκεφαλίτιδα που συνοδευόταν από πνευµονικό οίδηµα ή αιµορραγία, µυοκαρδίτιδα και ερπητική κυνάγχη. Χιλιάδες άνθρωποι είχαν προσβληθεί, η δε θνητότητα που ανακοινώθηκε στα νήπια έφθασε το 0,1%. Κάποια από τα άτοµα που επέζησαν είχαν υπολειπόµενες νευρολογικές διαταραχές 133,

37 8. 5. Επιπεφυκίτιδα Η επιπεφυκίτιδα από εντεροϊό χαρακτηρίζεται από σύντοµη περίοδο επώασης ωρών, µε απότοµη έναρξη συµπτωµάτων και σηµείων από το ένα ή και τα δύο µάτια. Η επιπεφυκίτιδα εκδηλώνεται µε δακρύροια, πόνο, περιοφθαλµικό οίδηµα και αιµοραγίες του επιπεφυκότα 135. Η πρώτη πανδηµία αιµορραγικής επιπεφυκίτιδας αναγνωρίστηκε το 1969 στην Αφρική. Εντός 2 ετών, δύο εντεροϊοί, µία ποικιλία του CAV24 και ένας νέος τύπος εντεροϊού EV70 αναγνωρίστηκε ότι εµπλεκόταν στην επιδηµία 136. Άλλοι εντεροϊοί που σχετίζονται µε το σύνδροµο είναι οι Echo 7 and 11 and CBV2 74, Λοίµωξη νεογέννητων και νεογνών Η ευαισθησία των νεογνών για λοίµωξη από εντεροϊό τις πρώτες ηµέρες της ζωής τους είναι µεγάλη. Η µεγάλη αυτή ευαισθησία εµφανίζεται και στους ανθρώπους και τα πειραµατόζωα 2. Γενικά, στις λοιµώξεις των νεογνών υπάρχει πάντα πυρετός που συνοδεύεται από εµέτους, ανορεξία, εξάνθηµα, σηψαιµία και ευρήµατα από το ανώτερο αναπνευστικό. Η συµµετοχή από το κεντρικό νευρικό σύστηµα µπορεί να περιλαµβάνει ή όχι ερεθισµό των µηνίγγων µε αυχενική δυσκαµψία και προβολή της πρόσθιας πηγής. Μπορεί να υπάρχουν συστηµατικές εκδηλώσεις, όπως ηπατική νέκρωση, µυοκαρδίτιδα και νεκρωτική εντεροκολίτιδα 138. Οι ιοί Echo και Coxsackie οµάδας Α και Β έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται µε νεογνικές λοιµώξεις 139. Η συχνότητα της νοσηρότητας και της θνητότητας δεν έχουν επακριβώς γνωστή, κυµαίνεται όµως µεταξύ 74% και 10% αντίστοιχα 84, Νοσήµατα του µυϊκού συστήµατος-πλευρωδυνία-σύνδροµο χρονιάς κόπωσης Η σχέση ανάµεσα στους εντεροϊούς και στη φλεγµονή των µυών είχε αρχικά αναγνωριστεί λόγω µυοτροπισµού των ιών Coxsackie στα θηλάζοντα ποντίκια. Αυτή η παρατήρηση έγινε για πρώτη φορά όταν βρέθηκε ότι οι ιοί σχετίζονται µε την επιδηµία της πλευρωδυνίας στο νησί Bornholm της ανίας. Η νόσος είναι χαρακτηριστική µε πυρετό και µυαλγία που αφορά το 35

38 στήθος και την κοιλιά, χωρίς µυική αδυναµία. Οι περισσότεροι ασθενείς βελτιώνονται σε µία εβδοµάδα. Μπορεί να συµβούν υποτροπές 2, 74. Οι ιοί Coxsackievirus της οµάδας B, και ειδικώς οι τύποι B3 and B5 είναι οι πιο συχνά αναγνωρισµένοι αιτιολογικοί παράγοντες. Και άλλοι εντεροϊοί έχουν αποµονωθεί, όπως οι τύποι των ιών Echo 1, 6, 9, 16, 19, and Coxsackie A όπως CAV4, 6, 9, and 10 74, 141. Τα φλεγµονώδη νοσήµατα των µυών µπορεί να είναι οξέα ή χρόνια. Τα οξέα είναι η οξεία πολυµυοσίτιδα (οξεία µυοσίτιδα). Αυτές οι περιπτώσεις συνοδεύονται από πυρετό, µυαλγία, αύξηση των µυικών ενζύµων και µυοσφαιρινουρία 74. Το σύνδροµο χρόνιας κόπωσης είναι νόσος που δεν έχει χαρακτηρισθεί πλήρως. Αναφέρεται επίσης ως µυαλγικό σύνδροµο, Royal Free νόσος, Ισλανδική νόσος, µεταϊικό σύνδροµο κόπωσης και νευροµυασθένεια. Το κύριο χαρακτηριστικό της είναι η µεγάλη κόπωση των σκελετικών µυών που ίσως συνοδεύεται και από µυικό πόνο. Άλλα συµπτώµατα µπορεί να είναι η κεφαλαλγία, αδυναµία συγκέντρωσης, διαταραχή της πρόσφατης µνήµης και δυσκολία στην οπτική προσαρµογή, που παρουσιάζονται σποραδικά, ή σαν επιδηµία 74. Αρκετές µελέτες έδειξαν ότι υπάρχει ένδειξη εµµένουσας λοίµωξης από εντεροϊό. Οι περισσότερες µελέτες έδειξαν ότι οι ασθενείς µε σύνδροµο χρόνιας κόπωσης είχαν σε µεγαλύτερη συχνότητα IgM αντισώµατα για ιούς Coxsackie B σε σχέση µε την οµάδα ελέγχου 142, 143. Σε µία εργασία όπου έγινε ανίχνευση εντεροϊών µε ειδικό DNA ανιχνευτή σε βιοψίες σκελετικών µυών 96 ασθενών 20 βρέθηκαν θετικές για εντεροϊό, ευρήµατα που υπαινίσσονται εµµένουσα νόσο 144. Όµως δεν είναι ακόµη σαφές, αν η νόσος των µυών είναι αποτέλεσµα της ιογενούς λοίµωξης ή είναι µία αυτοάνοση διαδικασία, όπου ο ιός πυροδοτεί την αντίδραση 2, ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Οι εντεροϊοί αποβάλλονται για µεγάλο χρονικό διάστηµα από τα κόπρανα, επίσης µπορούν να αποµονωθούν και από τις αναπνευστικές εκκρίσεις για σύντοµο χρονικό διάστηµα, περίπου µίας εβδοµάδας από τη λοίµωξη 146. Εποµένως, η κοπρανοστοµατική οδός και η επαφή µε τις αναπνευστικές εκκρίσεις είναι οι πιο σηµαντικοί τρόποι µετάδοσης. Η σχετική 36

39 σπουδαιότητα των δύο τρόπων µετάδοσης πιθανόν κυµαίνεται ανάλογα µε τον ιό και το περιβάλλον. Επιπλέον, οι εντεροϊοί που προκαλούν φυσαλιδώδες εξάνθηµα µπορούν να µεταδοθούν µε άµεση ή έµµεση επαφή µε το υγρό των φυσαλίδων που περιέχει µολυσµατικό ιό 147. Εξαίρεση στους συνηθισµένους τρόπους µετάδοσης των εντεροϊών, είναι οι παράγοντες της οξείας αιµορραγικής επιπεφυκίτιδας, οι EV70 και παραλλαγές του CVA24 (variants). Αυτοί οι δύο ιοί σπάνια αποµονώνονται από το αναπνευστικό σύστηµα ή από τα κόπρανα. Πιθανόν µεταδίδονται µε άµεση ή έµµεση επαφή µε τις οφθαλµικές εκκρίσεις 147. Πληροφορίες για την επίπτωση των νοσηµάτων που προκαλούνται από τα διάφορα είδη των εντεροϊών µπορούν να εξαχθούν από προοπτικού χαρακτήρα µακροχρόνιες µελέτες ενός συγκεκριµένου πληθυσµού, ή από ένα δείγµα πληθυσµού, όπου µπορεί να υπολογιστεί µε αξιοπιστία η συχνότητα της νόσου ή των λοιµώξεων. Λιγότερο χρήσιµες πληροφορίες βασίζονται στο εύρηµα µιας παθητικής περίπτωσης. Αλλά αυτός ο τρόπος είναι λιγότερο αξιόπιστος, γιατί αυτό το είδος του συστήµατος επιτήρησης είναι πιθανό να αναγνωρίζει µόνο τις περιπτώσεις που είναι εύκολα αναγνωρίσιµες και γίνονται αντιληπτές από κάποιον που αποφασίζει να τις δηλώσει. Με αυτό το σύστηµα επιτήρησης οι πληροφορίες έχουν περισσότερο ποιοτική αξία, γιατί θα χαθούν κάποιες περιπτώσεις που δεν θα δηλωθούν ή κάποιοι ασθενείς που είχαν αρνητικές εργαστηριακές εξετάσεις 148, 149. Πολλές µελέτες έχουν προσδιορίσει τη συχνότητα των αντισωµάτων έναντι των εντεροϊών σε συγκεκριµένους πληθυσµούς 148, 150, 151. Αρκετά σηµαντικά συµπεράσµατα µπορούν να βγουν από τέτοιες ορολογικές µελέτες. Πρώτον, ο αριθµός των ανθρώπων που έχουν εξουδετερωτικά αντισώµατα έναντι οποιουδήποτε συγκεκριµένου εντεροϊού είναι µεγάλος και δείχνει υψηλή επίπτωση παλιάς λοίµωξης. Μεγάλη επίπτωση πρόσφατης λοίµωξης δείχνουν επίσης µελέτες ανίχνευσης της ειδικής IgM ανοσοσφαιρίνης, οι οποίες δείχνουν θετικότητα σε ποσοστό 4-6%. εύτερον, λοιµώξεις από ένα ορότυπο εντεροϊών, µπορούν να προκαλέσουν αναµνηστική αύξηση του τίτλου άλλων τύπων εντεροϊών, έτσι όπως µετρούνται µε την ανίχνευση των ειδικών IgM ή µε την εξουδετέρωση. Το πλαίσιο της ετερότυπης αντίδρασης κυµαίνεται ανάλογα µε τον ορότυπο και ανάλογα µε το άτοµο. Τρίτον, η συχνότητα ανίχνευσης των αντισωµάτων κυµαίνεται ανάλογα µε τη 37

40 γεωγραφική κατανοµή, τη χρονική περίοδο που έγινε η µελέτη και την ηλικία των εξετασθέντων. Γιαυτό, πληροφορίες συχνότητας από διαφορετικά έτη και περιοχές, δεν είναι άµεσα συγκρίσιµες. Αυτά τα τρία στοιχεία πρέπει να λαµβάνονται υπ οψη, όταν αξιολογούνται τα ευρήµατα ορολογικών µελετών σε σχέση µε τη λοίµωξη και νοσήµατα από εντεροϊούς 2. Μία σηµαντική ιδέα στη κατανόηση της επιδηµιολογίας των εντεροϊών είναι η διαφοροποίηση σε σχέση µε τον ορότυπο, το χρόνο, τη γεωγραφική κατανοµή και το νόσηµα. Αυτή η ιδέα είναι εµφανής σε µελέτες αποµόνωσης και τυποποίησης των ιών από λοιµώξεις µε µη-πολιο εντεροϊούς 91, 149, 152, 153, 154, 155. Υπάρχουν δύο επικρατούντα πρότυπα συχνότητας των εντεροϊών, το ενδηµικό και το επιδηµικό 146. Για παράδειγµα το επιδηµικό πρότυπο, όπως αυτό προσδιορίσθηκε για τον ιό Echo 9 στις ΗΠΑ, χαρακτηρίζεται από απότοµη αύξηση του αριθµού των αποµονώσεων, που ακολουθείται από περιόδους µε λίγες αποµονώσεις. Από το , µεγάλες επιδηµίες από τον ιό Echo 9 συνέβαιναν στις ΗΠΑ κάθε 3-4 χρόνια. Ο ιός Echo 30 επίσης παρουσιάζει ένα επιδηµικό πρότυπο, αλλά µε αύξηση του αριθµού των αποµονώσεων για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα. Αντίθετα, ο CVB3 αποµονώνονταν στους ίδιους περίπου αριθµούς κάθε χρόνο, εκτός από µία απότοµη αύξηση το 1980, εκφράζοντας το ενδηµικό πρότυπο κυκλοφορίας. Παρόµοια επιδηµικά και ενδηµικά πρότυπα παρατηρούνται και για άλλους εντεροϊούς, αλλά η βιολογική βάση για την επιδηµική ή ενδηµική µορφή παραµένει άγνωστη 146. Η υιοθέτηση µοριακών τεχνικών για τη µελέτη της επιδηµιολογίας των εντεροϊών, επεκτείνει αυτή τη γνώση. Η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων των εντεροϊών χρησιµοποιήθηκε πρώτα ως επιδηµιολογικό εργαλείο για να χαρακτηρίσει τη γεωγραφική κατανοµή των άγριων πολιοϊών, χρησιµοποιώντας την αλληλουχία 150 νουκλεοτιδίων που περιβάλλουν το σηµείο σύνδεσης της VP1 και 2A περιοχής 156. Αυτές οι µελέτες έδειξαν ότι οι πολιοϊοί που κυκλοφορούν σε µία συγκεκριµένη γεωγραφική περιοχή, τείνουν να σχετίζονται στενά γενετικά, και διαφέρουν από άλλους που κυκλοφορούν σε γειτονικές περιοχές. Από τότε, αυτό το παράθυρο της αλληλουχίας έχει επεκταθεί και περιλαµβάνει όλο το VP1 γονίδιο (~ 900 νουκλεοτίδια), για να παρέχει µεγαλύτερη ανάλυση, και αυτή η περιοχή έχει υιοθετηθεί ως δεδοµένη για µοριακές επιδηµιολογικές µελέτες και για πολιο και µη-πολιο 38

41 εντεροϊούς 157. Η επιδηµική συµπεριφορά κάποιων εντεροϊών φαίνεται καθαρά στον ιό Echo 30, όπου οι γενεές που επικρατούν αντικαθιστούν λιγότερο εδραιωµένες γενεές 88, 89, 158. Οι γενεές (lineages) του Echo 30 δε φαίνονται να είναι γεωγραφικά περιορισµένες, καθώς µία συγκεκριµένη γενεά µπορεί να κυκλοφορεί σε διαφορετικές περιοχές του κόσµου την ίδια χρονική περίοδο. Η αιφνίδια εµφάνιση του Echo 13 ως πιο προέχοντος εντεροϊού παγκοσµίως το , 96, και η µετέπειτα εξαφάνισή του, δείχνει τη δυνατότητα των εντεροϊών να κυκλοφορούν απρόβλεπτα µε σηµαντικές κλινικές νόσους, και υπογραµίζει την ανάγκη για συνεχή παρακολούθηση των εντεροϊών. Η παγκόσµια κυκλοφορία των οροτύπων των εντεροϊών που προκαλούν διαδεδοµένα κλινικά νοσήµατα, έχει παρατηρηθεί στο παρελθόν, ειδικά µε τους Echo 9, 30, and EV70, and EV71 159, 160, 161. Η ενδηµική συµπεριφορά άλλων εντεροϊών σε µοριακό επίπεδο έχει ως παράδειγµα τη σύγχρονη κυκλοφορία ειδών CVB4 που ανήκουν σε διαφορετικές γενιές, µέσα στην ίδια χώρα 162. Ο CVB4 µπορεί να κυκλοφορεί στην ίδια περιοχή για αρκετές δεκαετίες, όπως στην Ολλανδία, όπου µεταξύ βρέθηκαν να κυκλοφορούν οι ίδιοι γονότυποι. Σε ορισµένες περιπτώσεις, όµοιοι γονότυποι βρέθηκαν να κυκλοφορούν σε γεωγραφικές περιοχές που βρισκόταν µακριά η µία από την άλλη, γεγονός που σηµαίνει είτε προηγηθείσα επιδηµική διασπορά, είτε παγκόσµια παραµονή του γονότυπου

42 10. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Οι εντεροϊοί υπολογίζεται ότι προκαλούν 5-10 εκατοµµύρια συµπτωµατικές λοιµώξεις ετησίως στις ΗΠΑ 149. Αυτές λοιµώξεις έχουν µεγάλο ενδιαφέρον, γιατί οι εντεροϊοί µιµούνται άλλα παθογόνα, όπως βακτήρια ή άλλους ιούς που προκαλούν άσηπτη µηνιγγίτιδα 148. Η διάκριση της άσηπτης µηνιγγίτιδας από εντεροϊό από αυτήν από κοινά βακτήρια ή άλλους ιούς συχνά είναι δύσκολη µε βάση την κλινική εικόνα 148. Για αυτό συχνά σε λοιµώξεις από εντεροϊό εφαρµόζονται µη απαραίτητες θεραπείες 163. Επίσης, καµία νόσος δεν σχετίζεται µοναδικά µε κάποιο συγκεκριµένο ορότυπο, και κανένας ορότυπος δεν σχετίζεται µε µία µόνο νόσο 14, 163. Εγκεφαλονωτιαίο υγρό, κόπρανα, πρωκτικό επίχρισµα, φαρυγγικό επίχρισµα, ρινικό επίχρισµα, ορός, ούρα και άλλα δείγµατα, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την αποµόνωση ή την ανίχνευση των εντεροϊών από ασθενείς µε λοίµωξη του ΚΝΣ Αποµόνωση του ίου Η µοντέρνα εποχή της διαγνωστικής ιολογίας χρονολογείται από τις πρώτες περιγραφές της αποµόνωσης ιού σε καλλιέργειες κυττάρων από τους Weller και Enders το1948 και Enders και συνεργάτες το , 163. Πράγµατι, η ανάγκη για τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας είναι σηµαντική για τη λειτουργία ιολογικών εργαστηρίων ξεχωριστών από τα άλλα γενικά κλινικά εργαστήρια, καθώς η αποµόνωση και ο πολλαπλασιασµός του ιού απαιτεί ζωντανά κύτταρα. Παρ όλο ότι η σηµασία της ιικής αποµόνωσης ως διαγνωστικής µεθόδου µειώνεται, ακόµη παραµένει απαραίτητη, γιατί είναι η µόνη τεχνική που είναι ικανή να δώσει µία βιώσιµη αποµόνωση που µπορεί να χρησιµοποιηθεί για περαιτέρω χαρακτηρισµό. Επιπλέον, οι καλλιέργειες κυττάρων έχουν το πλεονέκτηµα σε σχέση µε την στη ανίχνευση αντιγόνου ή στις µοριακές µεθόδους, ότι η ιική καλλιέργεια επιτρέπει την αποµόνωση πολλαπλών ιών, και όχι µόνο αυτών για τους οποίους ζητείται η καλλιέργεια επειδή είναι ύποπτοι για νόσο 165. Οι εντεροϊοί µπορούν να αποµονωθούν σε καλλιέργειες κυττάρων από σε δείγµατα συµπαγών ιστών, από αίµα, ΕΝΥ, ούρα, κόπρανα, δείγµατα από 40

43 το αναπνευτικό και άλλα. Εντούτοις, η αποµόνωση των εντεροϊών από κόπρανα, φαρυγγικό ή πρωκτικό επίχρισµα, είναι µόνο περιστασιακό πειστήριο της αιτιολογίας, καθώς η απλή αποµόνωση του ιού από αυτές τις θέσεις δε σηµαίνει απαραίτητα και νόσο, ειδικά στα παιδιά και κατά περιόδους επιδηµίας 166. Η εµβολιασµός σε καλλιέργειες κυττάρων και η εξουδετερωτική δοκιµασία (συµβατικές µέθοδοι) θεωρούνται µέθοδοι αναφοράς για την αποµόνωση και την ταυτοποίηση των εντεροϊών, παρά τη φτωχή προτυποποίηση αυτών ανάµεσα στα εργαστήρια 90, 167. Εντούτοις, καµία κυτταρική σειρά από αυτές που χρησιµοποιούνται σήµερα δεν εξασφαλίζει την ανάπτυξη όλων των γνωστών εντεροϊών 163. Για να επιτευχθεί η µέγιστη δυνατότητα αποµόνωσης, πρέπει να χρησιµοποιηθούν πάνω από µία κυτταρικές σειρές. Αρκετές κυτταρικές σειρές κατάλληλες για την ανάπτυξη των εντεροϊών χρησιµοποιούνται σήµερα, όπως BGM (νεφρά πράσινου πιθήκου-buffalo green monkey kidney), RD (ραβδοµυοσάρκωµα ανθρώπουhuman rhabdomyosarcoma), Hep-2 (επιδερµικός καρκίνος ανθρώπου- human epidermoid carcinoma), A-549 (καρκίνος πνεύµονα ανθρώπου-human lung carcinoma), Vero ( νεφρά αφρικανικού πράσινου πιθήκου- African Green monkey kidney cells) και άλλες. Όµως είναι γνωστό ότι µερικοί ορότυποι εντεροϊών, ειδικά οι Coxsackie οµάδας Α, δεν αναπτύσσονται καλά, ή και καθόλου σε καλλιέργειες κυττάρων. Για το λόγο αυτό εµβολιάζονται θηλάζοντα ποντίκια 168, αλλά λόγω των πρακτικών δυσκολιών αυτή η τεχνική σπάνια χρησιµοποιείται. Αυτός είναι προφανώς ο λόγος για το ότι οι λοιµώξεις από τους ιούς Coxsackie A υποδιαγνώσκονται ή υποεκπροσωπούνται στις επιδηµιολογικές µελέτες 149. Το κυριότερο µειονέκτηµα των κυτταροκαλλιεργειών είναι ότι ποσοστό 25-35% των δειγµάτων από ασθενείς µε χαρακτηριστικές EV λοιµώξεις (πχ. λοιµώξεις ΚΝΣ) κάθε ορότυπου είναι αρνητικά στις κυτταροκαλλιέργειες 169. Αυτό µπορεί να οφείλεται σε εξουδετέρωση από αντισώµατα, µη ικανοποιητική συλλογή, χειρισµό και επεξεργασία του δείγµατος, ή εγγενή έλλειψη ευαισθησίας των κυτταρικών σειρών που χρησιµοποιούνται. Επιπρόσθετα, ο χρόνος που χρειάζεται για τις κυτταροκαλλιέργειες είναι συνήθως 3,7-8,2 µέρες για θετικό αποτέλεσµα και 10 µέρες για αρνητικό αποτέλεσµα 163. Η αποµόνωση των εντεροϊών από θέσεις που το φορτίο του 41

44 ιού είναι υψηλός (κόπρανα, φαρυγγικό επίχρισµα), συνήθως επιτυγχάνεται σε συντοµότερο χρόνο 163. Μετά την αποµόνωση στις κυτταροκαλλιέργειες, µε την παρακολούθηση των χαρακτηριστικών κυτταροπαθολογικών αλλοιώσεων (Cytopathic Effects- CPEs) των EVs, για την τυποποίηση των εντεροϊών χρησιµοποιείται η µέθοδος της οροεξουδετέρωσης, µε χρήση υπεράνοσων ορών σε µείγµατα (pools), που συνιστώνται από την Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας. Μείγµατα αντιορών έχουν αναπτυχθεί στο Εθνικό Ιστιτούτο ηµόσιας Υγείας και Περιβάλλοντος, στην Ολλανδία, που επιτρέπει την ταυτοποίηση 42 διαφορετικών οροτύπων εντεροϊών, στη θέση των αρχικά χρησιµοποιούµενων µειγµάτων του Lim-Benyesh Melnick (LMB) 170. Όµως, οι προσπάθειες τυποποίησης µε τη µέθοδο της οροεξουδετέρωσης, συχνά µπορούν να αποτύχουν, επειδή οι υψηλοί ρυθµοί εξέλιξης των αντιγονικών επιτόπων έχουν ως αποτέλεσµα την εµφάνιση των λεγοµένων αρχικών (prime) στελεχών, τα οποία αποτελούν µία αντιγονική συνέχεια ήδη γνωστών ορότυπων και δεν µπορούν να τυποποιηθούν µε τους αντιορούς που διαθέτουµε. Επίσης, µε τη µέθοδο της οροεξουδετέρωσης είναι πιθανό να µην τυποποιηθούν άγνωστοι ορότυποι που δεν είχαν αναγνωρισθεί προηγουµένως 166. Τα ίδια µειονεκτήµατα µε αυτά της οροεξουδετέρωσης έχουµε και άλλες µεθόδους τυποποίησης όπως µε τον ανοσοφθορισµό µε τη χρησιµοποίηση µονοκλωνικών αντισωµάτων ή µε τη µέθοδο του έµµεσου ανοσοφθορισµού, οι οποίες και χρησιµοποιούνται για την απλή και γρήγορη ταυτοποίηση των εντεροϊών. Η οροεξουδετέρωση είναι µία στατική µέθοδος, µε την έννοια ότι δεν µπορεί να ανιχνεύσει αντιγονικές παραλλαγές ή νεοεµφανιζόµενους οροτύπους, και επίσης ακριβή, επειδή είναι πολύ δύσκολο να δηµιουργηθεί ένας πλήρης κατάλογος από µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι συγκεκριµένων ιικών στελεχών 171. Η µέθοδος shell vial culture πρώτα αναπτύχθηκε για τον κυτταροµεγαλοϊό 172. Αυτή η τεχνική µείωσε δραµατικά τον χρόνο που χρειάζεται για την ανίχνευση των ιών στις κυτταροκαλλιέργειες 173. Η µέθοδος περιλαµβάνει φυγοκέντρηση του δείγµατος πάνω στη µονοστοιβάδα κυττάρων που έχουν αναπτυχθεί σε καλυπτρίδα, και επώαση για 1-2 ηµέρες. Ακολουθεί χρώση της κυτταροκαλλιέργειας µε φθορίζον αντίσωµα, ασχέτως αν οι κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις είναι ορατές. Αυτή η µέθοδος 42

45 χρησιµοποιείται σήµερα για να επιταχύνει την ανίχνευση των εντεροϊών και άλλων ιών. Μερικά από τα µειονεκτήµατα της καλλιέργειας ρουτίνας φαίνεται ότι υπάρχουν και σε αυτή την τεχνική, όπως η ανικανότητα να ανιχνεύσει αντιγονικές παραλλαγές ή νεοεµφανιζόµενους οροτύπους, και το κόστος Ανίχνευση αντισωµάτων Η πιο βασική ορολογική δοκιµασία είναι η αντίδραση εξουδετέρωσης. Αυτή η τεχνική είναι παρόµοια µε αυτή που χρησιµοποιείται για την ταυτοποίηση των αποµονώσεων, εκτός από ότι ένας γνωστός ιός αναµιγνύεται µε διαδοχικές αραιώσεις ορού των ασθενών. Μία τετραπλάσια ή µεγαλύτερη αύξηση στον τίτλο των ειδικών εξουδετερωτικών αντισωµάτων σε δύο δείγµατα ορού θεωρείται διαγνωστική της λοίµωξης. υστυχώς, αντισώµατα µπορεί ήδη να υπάρχουν όταν το αρχικό δείγµα συλλέγεται, εξ αιτίας της παρατεταµένης περιόδου επώασης και της προδρόµου περιόδου πολλών λοιµώξεων από εντεροϊούς, περιπλέκοντας την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Η δοκιµασία είναι επίπονη και τα αποτελέσµατα σπάνια είναι διαθέσιµα πριν 3-4 µέρες 2. Όµως, αυτή η εξέταση χρησιµοποιείται γενικά για οροεπιδηµιολογικές µελέτες, για τον καθορισµό της έκθεσης και της ανοσίας µιας οµάδας πληθυσµού σε διάφορες λοιµώξεις από εντεροϊούς, περιλαµβάνοντας και την απάντηση στον εµβολιασµό για πολιοµυελίτιδα 2, 163. Πρόσφατα, αρκετές µελέτες χρησιµοποιούν την ανοσοενζυµική µέθοδο Elisa για την ανίχνευση IgM αντισωµάτων σαν απόδειξη πρόσφατης λοίµωξης µε εντεροϊό 174, 175. Αυτή η µέθοδος χρησιµοποιείται ευρέως ως εναλλακτική της εξουδετερωτικής δοκιµασίας και άλλων ορολογικών µεθόδων, όπως η σύνδεση συµπληρώµατος και ο ανοσοφθορισµός. Η ανοσενζυµική µέθοδος Elisa βρέθηκε θετική στο 90% των επιβεβαιωµένων µε καλλιέργεια λοιµώξεων από Coxsackie Β και µπορεί να γίνει εύκολα και γρήγορα. Η µέθοδος Elisa έχει χρησιµοποιηθεί επιτυχώς σε επιδηµιολογικές µελέτες εξάρσεων των λοιµώξεων από εντεροϊούς, καθώς και για ειδική διαγνωστική χρήση 176. Όµως τα IgM Elisa αντισώµατα δεν είναι απολύτως ειδικά για κάποιον ορότυπο, γιατί έχει βρεθεί ότι η ανοσολογική απόκριση του ανθρώπου στη λοίµωξη από εντεροϊό, περιλαµβάνει αντισώµατα που αντιδρούν µε επιτόπους ειδικούς για τον ορότυπο αλλά και µε κοινούς για όλους τους εντεροϊούς 43

46 επιτόπους 177. Στη θερµή εποχή για λοίµωξη από εντεροϊό (καλοκαίρι και φθινόπωρο), οι µέθοδοι Elisa που χρησιµοποιούνται σε επιδηµιολογικές µελέτες, έχουν πολύ καλή ευαισθησία και φαίνεται ότι είναι ειδικές για τις λοιµώξεις από εντεροϊούς. Όµως αυτές οι εξετάσεις ανιχνεύουν ετερότυπα αντισώµατα, που προέρχονται από άλλες λοιµώξεις από εντεροϊούς, και έτσι δεν µπορούν να θεωρηθούν τελείως ειδικά για τον ορότυπο. Επίσης, έχουν βρεθεί λίγες διασταυρούµενες αντιδράσεις µε ρινοϊούς, ιό ηπατίτιδας Α, EBV και CMV Μοριακή διάγνωση Το 1984, δύο µελέτες ανέφεραν την επιτυχή ανίχνευση πολλαπλών οροτύπων εντεροϊών, από µία διαφορετική υποταξινόµηση, µε γενικό µοριακό γενετικό ανιχνευτή (probe) προερχόµενο από έναν ορότυπο 179, 180. Αυτό το επίτευγµα έδειξε για πρώτη φορά ότι η γενετική οµολογία ανάµεσα στους εντεροϊούς επεκτείνεται πολύ περισσότερο από τους λίγους οροτύπους για τους οποίους ήταν γνωστή η γονιδιακή ακολουθία. Οι έρευνες αυτές, καθώς και άλλες που έγιναν τα επόµενα 5-6 χρόνια, έδωσαν αξιόλογα δεδοµένα, όσον αφορά τις καλά συντηρηµένες αλληλουχίες, πριν από την επίτευξη αλληλούχισης ειδικών οροτύπων των εντεροϊών 181, 182, 183. Επιπλέον, αυτή η προσέγγιση αναγνώρισε περιοχές του γονιδιώµατος που ήταν κοινές, αν όχι σε όλους, στους περισσότερους ορότυπους, και θα µπορούσαν να γίνουν δυνητικά γενετικοί ανιχνευτές για όλους τους εντεροϊούς για κλινική διάγνωση. Έτσι, βρέθηκε ότι ο γενετικός ανιχνευτής προερχόµενος από την 5 NTR περιοχή του γονιδιώµατος των εντεροϊών φαίνεται να αντιδρά ευρέως µε τους περισσότερους εντεροϊούς λόγω διασταυρούµενης αντίδρασης 184. Έκτοτε, πολλοί ερευνητές έχουν επεκτείνει αυτές τις παρατηρήσεις χρησιµοποιώντας cdna probes, RNA probes και ολιγοµερή probes. Όµως η χρήση αυτής της τεχνικής στην ανίχνευση των εντεροϊών σε κλινικά δείγµατα, όπως στο ΕΝΥ, έδειξε ευαισθησία 33% ή και λιγότερο, σε σχέση µε τις κυτταροκαλλιέργειες 163. Μειονέκτηµα σε όλες τις µεθόδους που βασίζονται στον υβριδισµό είναι η χαµηλή συγκέντρωση των εντεροϊών σε πολλά δείγµατα, ειδικά στο ΕΝΥ, σε ασθενείς µε λοιµώξεις του ΚΝΣ 163. Όµως, µε βάση την εµπειρία πολλών εργαστηρίων µε γενετικούς ανιχνευτές (probes) νουκλεϊκών οξέων, 44

47 προερχόµενα από όλες τις περιοχές του γονιδιώµατος των εντεροϊών, έχουν καθοριστεί οι περιοχές µε τη µεγαλύτερη σταθερότητα ανάµεσα στους ορότυπους των εντεροϊών. Αυτή η γνώση διευκόλυνε τον σχεδιασµό των εκκινητών και ανιχνευτών για την πιο υποσχόµενη εξέλιξη στην άµεση ανίχνευση των εντεροϊών, την εφαρµογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR). Οι Chapman και συνεργάτες το1990, Hyypia και συνεργάτες το 1989 και Rotbart το 1990 ήταν οι πρώτοι που σχεδίασαν RT-PCR για τη διάγνωση των εντεροϊών, σχεδιάζοντας τρία ζεύγη εκκινητών έναντι της πολύ καλά διατηρηµένης περιοχής της µη µεταφραζόµενης περιοχής (5 NTR) του γονιδιώµατος του ιού 185, 186, 187. Επίσης το 1992 οι Zoll και συνεργάτες πέτυχαν να σχεδιάσουν RT-PCR µε τρία ζεύγη εκκινητών µε στόχο το 5 NTR 188. Όλοι αυτοί οι RT-PCR εκκινητές πέτυχαν να ανιχνεύσουν 60 από τους 66 ορότυπους εντεροϊών που είχαν αναγνωριστεί έως τότε. Έκτοτε, αρκετοί ερευνητές έχουν ανακοινώσει εκκινητές και ανιχνευτές από την περιοχή 5 NTR, που υπερσκελίζουν ή είναι πολύ κοντά στα τρία ζεύγη εκκινητών που περιγράφηκαν αρχικά. RT-PCR για εντεροϊούς (EV-RT-PCR) µε αυτά τα ζεύγη εκκινητού-ανιχνευτή έχουν δοκιµαστεί στην κλινική πράξη από πολλούς ερευνητές και έχουν δείξει ευαισθησία από % και ειδικότητα από % 187, 189, 190, 191. Το 1999, ο Romero µε βάση αρκετές δηµοσιευµένες µελέτες που χρησιµοποίησαν την RT-PCR από το 1989 έως το 1999, έδειξε ότι τα δύο ζεύγη εκκινητού-ανιχνευτή που πιο συχνά χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση των εντεροϊών από κλινικά δείγµατα ήταν αυτά που αναφέρθηκαν για πρώτη φορά από τους Rotbart και Chapman και συνεργάτες (1990). Σύµφωνα µε τον ίδιο ερευνητή οι εκκινητές και ανιχνευτές µε στόχο τις πολύ συντηρηµένες περιοχές νουκλεοτιδίων , και της 5 NTR περιοχής των εντεροΐών (αρίθµηση σύµφωνα µε το γονιδίωµα του poliovirus type 1 Mahoney strain) αντιδρούν µε όλους τους ανθρώπινους εντεροϊούς 192. Ένας περιορισµός στις περισσότερες µεθόδους RT-PCR που περιγράφηκαν έως τώρα για τη διάγνωση των λοιµώξεων των εντεροϊών είναι η αδυναµία τυποποίησης των οροτύπων, ή άλλης υποκατηγοριοποίησης των εντεροϊών. Έτσι, αν χρειάζεται τέτοια πληροφορία, συµβατικές µέθοδοι πρέπει να χρησιµοποιηθούν παράλληλα, ώστε να αποµονωθεί ένας ιός και στη 45

48 συνέχεια να τυποποιηθεί 166. Όµως, σε πολλές περιπτώσεις ο ιός δεν αποµονώνεται στις κυτταροκαλλιέργειες, αν και έχει ανιχνευθεί µε PCR, λόγω της υψηλής ευαισθησίας της PCR. Έτσι, αρκετά εργαστήρια έχουν χρησιµοποιήσει τον προσδιορισµό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων της 5 NTR περιοχής και του VP4-VP2 δεσµού ως διαγνωστικά και επιδηµιολογικά εργαλεία, µε κάποια επιτυχία 193, 194, 195. Μειονέκτηµα είναι ότι οι αλληλουχίες σε αυτές τις περιοχές δεν αντιστοιχούν πάντοτε καλά µε τον ορότυπο 193, 196, 197. Άλλες µελέτες χρησιµοποιούν διαφορετικές µεθοδολογίες όπως πολυµορφισµό µήκους θραύσµατος µε περιοριστικά ένζυµα (RFLP) 199, 200, 201, υβριδισµό µε ειδικούς του ορότυπου ανιχνευτές 170, 198, πολυµορφισµό απλής διαµόρφωσης (Single strand Conformational Polymorphism-SSCP) 170. Όλες αυτές οι µέθοδοι χρησιµοποιούν την 5 NTR περιοχή ως στόχο για τυποποίηση. Η µέθοδος RFLP έχει σηµαντικά µειονεκτήµατα λόγω της δοµής του RNA γονιδιώµατος των εντεροϊών και της έλλειψης δραστηριότητας διόρθωσης των λαθών της RNA πολυµεράσης που κωδικοποιεί τον ιό 202. Συγχρόνως όµως είναι µέθοδος απλή, ταχεία, επαρκής και οικονοµική, και επιπλέον µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την επιδηµιολογική τυποποίηση των εντεροϊών σε καταστάσεις επιδηµίας 203. Επίσης, οι Patel και συνεργάτες το 2004 πέτυχαν να τυποποιήσουν τους ιούς Coxsackie οµάδας Β σε υπότυπους 1-6 µε τη χρήση RT-PCR-RFLP από ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα 204. Ενώ, η Georgopoulou και συνεργάτες το 2001 βρήκαν µία υψηλή απόκλιση στη 5 NTR περιοχή στα στελέχη αναφοράς των Coxsackie B και των ιών Echo και στις κλινικές αποµονώσεις µε RT-PCR-RFLP 205. Η µέθοδος ανάλυσης SSCP περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Orita και συνεργάτες το 1989 και έδειξε σε γέλη ουδέτερης πολυακρυλαµίδης ότι η αντικατάσταση ενός απλού νουκλεοτιδίου ήταν αρκετή να προκαλέσει µία κινητική στροφή σε µία µονή αλυσίδα του µονόστροφου DNA. Το µειονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι είναι αµφίβολο αν είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθεί για την τυποποίηση στελεχών άγριου τύπου, καθώς και µελών του ιδίου οροτύπου που υπάρχουν στον πληθυσµό (quasispecies), που διαφέρουν ελάχιστα στη γενετική τους σύσταση, ακόµη και σε πολύ συντηρηµένες περιοχές, όπως η 5 NTR 206. Παρά τα µειονεκτήµατα, οι Maisonneuve και συνεργάτες το 1999 εφάρµοσαν µία RT-PCR-SSCP για να 184 και 46

49 µελετήσουν τη γενετική διαφορά ανάµεσα σε 30 στελέχη ιού Echo που ήταν υπεύθυνα για επιδηµία άσηπτης µηνιγγίτιδας στη Γαλλία, και κατόρθωσαν να δείξουν την ύπαρξη δύο γονοτύπων υπεύθυνων για την συγκεκριµένη επιδηµία 207. Πρόσφατα, η παρατήτηση ότι οι πιο σηµαντικές θέσεις εξουδετέρωσης του ιού βρίσκονται στη VP1 περιοχή, έδωσε την ιδέα ότι η ακολουθία της περιοχής VP1, ή κάποιου τµήµατός της θα µπορούσε να σχετισθεί µε τον ορότυπο. Επίσης, η πρόσφατη ανάπτυξη µίας βάσης δεδοµένων πλήρους VP1 ακολουθίας από όλους τους ορότυπους των ανθρώπειων εντεροϊών απέδειξε ότι η VP1 ακολουθία φαίνεται να σχετίζεται καλύτερα µε τον ορότυπο, από ότι η ακολουθία 5 NTR ή ο VP4-VP2 δεσµός. Η µεθοδολογία αυτή βρέθηκε καλύτερη από κάθε άλλη µοριακή µέθοδος που έχει δηµοσιευθεί 193, 194, 195, 196, 197, 208,209, 210, 211, 212. Για αυτό, πολλές µελέτες ανέπτυξαν πρωτόκολλα RT-PCR και αλληλούχισης που είχαν στόχο ένα τµήµα ή όλη την περιοχή VP1 είτε στα κλινικά στελέχη ή άµεσα στο κλινικό δείγµα, όπως το ΕΝΥ, χρησιµοποιώντας αποδοµηµένους εκκινητές (degenerated primers). Έτσι φάνηκε ότι υπήρχε 100% συσχέτιση ανάµεσα στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων και στην αντιγονική τυποποίηση µε την κλασσική µέθοδο της εξουδετέρωσης 18, 19, 88, 90, 94, 213, 214, 215. Αυτή η προσέγγιση διευκόλυνε την τυποποίηση νέων στελεχών εντεροϊών, τα οποία δεν µπορούσαν να τυποποιηθούν µε τη µέθοδο της εξουδετέρωσης 216, 217, , 20, 21, Οι Oberste και συνεργάτες το 2000, 2001 και 2004 πρότειναν ειδικά κριτήρια για τη ερµηνεία των δεδοµένων της VP1 αλληλουχίας, όταν η VP1 αλληλουχία συγκρίνεται µε αλληλουχίες αναφοράς από όλους τους ορότυπους ανθρώπειων εντεροϊών: (i) Μία µερική 75% ή πλήρης ταυτότητα σε αλληλουχίες νουκλεοτιδίων της περιοχής VP1 (85% ταυτότητα σε επίπεδο αµινοξέων) ανάµεσα σε ένα κλινικό στέλεχος και το πρωτότυπο στέλεχος, µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την καθιέρωση του ορότυπου της αποµόνωσης, υπό τον όρο ότι η πλησιέστερη οµοιότητα στην αλληλουχία προς ένα άλλο ορότυπο είναι <70%. (ii) Μία ταυτότητα αλληλουχίας νουκλεοτιδίων <70% µπορεί να δείχνει ότι η αποµόνωση αντιπροσωπεύει ένα άγνωστο, δηλαδή ένα νέο ορότυπο. (iii) Μία ταυτότητα αλληλουχίας µεταξύ 70 και 75% δείχνει 47

50 ότι χρειάζεται περαιτέρω χαρακτηρισµός πριν η αποµόνωση τυποποιηθεί πλήρως 18, 19, 20. Σήµερα µε βάση όλα τα ανωτέρω, είναι αποδεκτό ότι χρησιµοποιώντας ένα πρωτόκολλο RT-PCR- αλληλούχισης µε αποδοµηµένους εκκινητές και στόχο ένα µέρος ή όλη την περιοχή VP1, η διαδικασία της διάγνωσης των λοιµώξεων από εντεροϊούς και η τυποποίηση αυτών απευθείας από το κλινικό δείγµα µπορεί να αντικαταστήσει τις συµβατικές µεθόδους (καλλιεργητική αποµόνωση και δοκιµασία εξουδετέρωσης). 11. ΠΡΟΛΗΨΗ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Πρόληψη Μέχρι τώρα, κανένα εµβόλιο για τους µη πολιο-εντεροϊούς δεν έχει αναπτυχθεί µε επιτυχία, λόγω του µεγάλου αριθµού διαφορετικών τύπων εντεροϊών. Το µόνο αποτελεσµατικό µέτρο για τον έλεγχό τους είναι οι υψηλές συνθήκες ατοµικής και οµαδικής υγιεινής. Η αποµόνωση των ασθενών σε περιόδους εξάρσεων των λοιµώξεων δεν είναι αποτελεσµατική, γιατί υπάρχουν σε µεγάλη συχνότητα υποκλινικές λοιµώξεις 74. Η ανάπτυξη εµβολίων κατά της πολιοµυελίτιδας κατέστη δυνατή καθώς υπάρχουν µόνο τρεις τύποι πολιο-ιών. Το 1954, ο Dr Jonas Salk και το 1960 Dr Albert Sabin και οι συνεργάτες τους ανέπτυξαν το νεκρό ενδοµυικό εµβόλιο (IPV) και το από του στόµατος εξασθενηµένο (OPV) αντίστοιχα. Και τα δύο εµβόλια οδηγούν στην παραγωγή αντισωµάτων κατά του ιού της πολιοµυελίτιδας, µε επακόλουθο την προστασία από τη νόσο 2. Μετά την εισαγωγή των εµβολίων στο τέλος της δεκαετίας του 50 και αρχές του 60, το µεγαλύτερο µέρος του αναπτυγµένου κόσµου είναι τώρα ελεύθερο από την πολιοµυελίτιδα. Σε πολλές αναπτυσσόµενες χώρες, το επιχορηγούµενο από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας (WHO) πρόγραµµα εκρίζωσης της πολιοµυελίτιδας, έχει κάνει πολύ µεγάλη πρόοδο. Η επιστηµονική κοινότητα σε δέκα οκτώ χρόνια µετά την πρωτοβουλία του WHO για την εκρίζωση της πολιοµυελίτιδας από τον κόσµο το 1988, πιστεύει ότι είναι πολύ κοντά στον στόχο

51 Θεραπεία Μέχρι τώρα, κανένα φάρµακο έναντι των picorna ιών δεν έχει πάρει έγκριση για θεραπεία των λοιµώξεων από εντεροϊούς. Όµως αρκετή πρόοδος έχει επιτευχθεί όσον αφορά τη µελέτη του κύκλου πολλαπλασιασµού των εντεροϊών, που είναι δυνητικός στόχος αντιϊικής θεραπείας. Η ευαισθησία των κυττάρων, η προσκόλληση του ιού, η απέκδυση του ιού, ο αναδιπλασιασµός του RNA του ιού και η πρωτεϊνοσύνθεση του ιού, έχουν µελετηθεί ως πιθανοί στόχοι έναντι των ιών picorna 1. Στις επόµενες παραγράφους γίνεται µία σύντοµη περιγραφή αυτών των στόχων Ιντερφερόνες Οι ιντερφερόνες είναι δυνητικοί εκλεκτικοί µεσολαβητές των κυτταρικών αλλαγών, που προκαλούν έναν αριθµό αντι-ιικών, αντιπολλαπλασιαστικών και ανοσολογικών δράσεων που όλες συλλογικά επηρεάζουν την ευαισθησία των κυττάρων στις λοιµώξεις από εντεροϊούς. Κλινικώς, παιδιά µε οξεία µηνιγγίτιδα από EV έχουν σηµαντική αύξηση των επιπέδων της ενδογενούς ιντερφερόνης στο ΕΝΥ 220, 221, γεγονός ίσως σηµαντικό για την ανάρρωση από τη νόσο. Αν και η ίδια η α-ιντερφερόνη είναι σηµαντικός αναστολέας των λοιµώξεων από picorna ιούς, συνεργικά προστατευτικά αποτελέσµατα έχουν βρεθεί όταν χρησιµοποιείται µε ουσίες που αναστέλλουν το σχηµατισµό του καψιδίου 222, µε νουκλεοσιδικά ανάλογα 223 ή γ-ιντερφερόνη 224. Οι ιντερφερόνες µπορούν επίσης να δράσουν σε συνεργασία µε τη χυµική ανοσία και τα µακροφάγα, ώστε να εξουδετερώσουν τις λοιµώξεις από picorna ιούς 225. Η α- και β-ιντρεφερόνη έχουν βρεθεί ότι είναι δραστικές κατά των λοιµώξεων από Coxsackievirus A24, ελαττώνοντας την ευαισθησία των κυττάρων στη λοίµωξη 226. Η Arya το 2000, ανέφερε κλινική βελτίωση µετά από έγκαιρη χορήγηση ιντερφερόνης σε µία επιδηµία άσηπτης µηνιγγίτιδας από εντεροϊό. Παρά τη δράση τους in vitro, οι ιντερφερόνες δεν έχουν ευρέως αξιολογηθεί κλινικά στις EV λοιµώξεις

52 Ανοσοσφαιρίνες Ο ξενιστής καθαίρει τις EV λοιµώξεις κυρίως µέσω της χυµικής ανοσίας. Έτσι, οι ασθενείς που δεν µπορούν να παράγουν αντισώµατα λόγω συγγενούς ή επίκτητης ανοσοανεπάρκειας είναι πολύ ευαίσθητοι στις EV λοιµώξεις 228. Παρόµοια, τα φυσιολογικά νεογέννητα είναι σε υψηλό κίνδυνο για σοβαρές EV λοιµώξεις, λόγω της σχετικής έλλειψης EV αντισωµάτων 229, 230. Τα αντισώµατα δρουν δεσµεύοντας τους EV και εµποδίζοντας την προσκόλληση και την ένωση µε τα κύτταρα του ξενιστή, γεγονός που σχετίζεται µε την εξουδετέρωση των EV από τα αντισώµατα που παρατηρείται στις κυτταροκαλλιέργειες 1. Ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρινών µπόρεσε να σταθεροποιήσει και να βελτιώσει κάποιες λοιµώξεις από εντεροϊούς, ειδικά σε ανοσοκατεσταλµένα άτοµα ή νεογνά µε υποψία λοίµωξης από εντεροϊό 231, 232. Μία τυφλή τυχαιοποιηµένη µελέτη ήταν πολύ µικρή για να δείξει κλινικά πλεονεκτήµατα, αλλά έδειξε µία µείωση του ιικού τίτλου σε βρέφη που πήραν ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη και στη συνέχεια βρέθηκε ότι αυτά είχαν σε υψηλό τίτλο αντισώµατα έναντι του λοιµογόνου ορότυπου 229. Όπως στη σηψαιµία των νεογνών, κάποιοι ασθενείς ανοσοανεπαρκείς φάνηκαν να ωφελούνται από τη χορήγηση ανοσοσφαιρίνης, άλλοι επιδεινώθηκαν και κατέληξαν, παρά τη θεραπεία 228. Από τότε που οι ανοσοανεπαρκείς ασθενείς παίρνουν ανοσοσφαιρίνη σε δόσεις συντήρησης, η συχνότητα της χρόνιας, προοδευτικής EV µηνιγγοεγκεφαλίτιδας έχει µειωθεί και η κλινική εικόνα των ασθενών που αναπτύσσουν τέτοιες λοιµώξεις, έχει τροποποιηθεί Θεραπευτικό αποτέλεσµα σε εγκατεστηµένη EV µηνιγγοεγκεφαλίτιδα σε ανοσοανεπαρκείς ασθενείς έχει µόνο ανεκδοτολογικά µελετηθεί Φάρµακα που αναστέλλουν το καψίδιο Οι ουσίες που αναστέλλουν το καψίδιο, µπλοκάρουν προσκόλληση του ιού στους υποδοχείς των κυττάρων του ξενιστή και την απέκδυση αυτού. Η σειρά WIN των ουσιών που έχουν αναπτυχθεί από εταιρεία Sterling Winthrop Pharmaceuticals έχουν αξιολογηθεί κλινικά στις λοιµώξεις από αναπνευστικούς ιούς και εντεροϊούς. Αυτές οι ενώσεις (µόρια που συνδέονται µε το καψίδιο) βρέθηκαν δραστικές για ορισµένους εντεροϊούς και όχι για 50

53 όλους. Αυτές σταµατούν την απέκδυση του ιού και εµποδίζουν την προσκόλληση αυτού στους υποδοχείς των κυττάρων του ξενιστή 233. Σε µία µελέτη φάνηκε ότι η χορήγηση της ουσίας WIN ελάττωσε σηµαντικά τον αριθµό των λοιµώξεων του ανώτερου αναπνευστικού µετά από επαφή µε Coxsackie A Όµως ανεπιθύµητες ενέργειες σταµάτησαν περαιτέρω έρευνες µε αυτό το φάρµακο. Η pleconaril (3-13, 5-dimethly-4-[[3-methly-5-iso-xazoly) propyl]-5- (trifluoromethyl)-1, 2, 4-oxadiazole) είναι το πρώτη ουσία από µία νέα γενεά µεταβολικά σταθερών αναστολέων του καψιδίου. Αυτή έχει αξιολογηθεί κλινικά περισσότερο σε όλες στις λοιµώξεις από εντεροϊούς και έδειξε ένα ευρύ φάσµα δράσης έναντι εντεροϊών και ρινοϊών και έχει υψηλή βιοδιαθεσιµότητα όταν χορηγείται από το στόµα 235, 236, 237, 238. Σε µία δοκιµή συγκρινόµενη µε placebo του pleconaril σε 221 παιδιατρικούς ασθενείς µε EV µηνιγγίτιδα, τεκµηριώθηκε σηµαντική µείωση στην ολική θνητότητα (σύνθετη µέτρηση όλων των συµπτωµάτων της νόσου) και σφαιρική αποτίµηση (εκτίµηση από τους θεράποντες της νόσου) για όλη τη µελέτη των ασθενών που θεραπεύτηκαν µε pleconaril. Η διάρκεια του πονοκεφάλου ήταν µειωµένη σηµαντικά σε παιδιά µεγαλύτερα των 8 ετών. Η απάντηση άρχισε 24 ώρες µετά την έναρξη της θεραπείας. Η διασπορά του ιού στο φάρυγγα ήταν επίσης µειωµένος στην οµάδα που πήρε pleconaril συγκριτικά µε το placebo 239. Η pleconaril έχει επίσης µελετηθεί σε ενήλικους ασθενείς µε EV µηνιγγίτιδα. Σε µία διπλή-τυφλή συγκρινόµενη µε placebo µελέτη, 198 ασθενείς, ηλικίας ετών, πήραν, είτε 200 mg pleconaril τρεις φορές την ηµέρα για επτά ηµέρες, είτε placebo. Αυτοί που πήραν pleconaril είχαν µείωση δύο ηµερών στη διάρκεια του πονοκέφαλου και δύο ηµερών γρηγορότερη ανακούφιση από όλα τα συµπτώµατα της µηνιγγίτιδας. Επίσης επέστρεψαν δύο ηµέρες νωρίτερα στη δουλειά ή στο σχολείο 240. Σε µία άλλη µελέτη, η pleconaril χρησιµοποιήθηκε ως παρηγορική θεραπεία (by compassionate release) σε σχεδόν 400 ασθενείς µε δυνητικά απειλητικές για τη ζωή λοιµώξεις από EV, 38 από τους οποίους παρακολουθήθηκαν αρκετά ώστε να αποτιµηθούν οι θεραπευτικές απαντήσεις 241. Μεταξύ 16 ασθενών µε υπογαµµασφαιριναιµία που έπασχαν από χρόνια EV µηνιγγοεγκεφαλίτιδα, 12 έδειξαν κάποια κλινική βελτίωση, ενώ άλλοι τρεις σταθεροποιήθηκαν µε τη θεραπεία. Έξι από οκτώ από αυτούς τους ασθενείς καθήραν τον ιό και οκτώ 51

54 από τους εννέα είχαν βελτίωση σε άλλες εργαστηριακές παραµέτρους. Κλινικές απαντήσεις επίσης έδειξαν τρεις από τέσσερις ασθενείς µε σοβαρή νεογνική EV λοίµωξη, 3 από 4 περιπτώσεις µε µυοκαρδίτιδα, 3 στους 3 ασθενείς µε χρόνια EV λοίµωξη που σχετίζονταν µε µεταµόσχευση µυελού, 2 στους 3 ασθενείς µε πολιοµυελίτιδα άγριου τύπου ή σχετιζόµενη µε εµβολιασµό, και 1 ασθενής µε σύνδροµο µυικής ατροφίας µετά από πολιοµυελίτιδα 241. Όµως, οι Bryant και συνεργάτες το 2004 έδειξαν ότι σε 7 νεογνά µε Coxsackie B λοίµωξη µε κλινικά χαρακτηριστικά που περιελάµβαναν µηνιγγοοεγκεφαλίτιδα, θροµβοπενία, διάχυτη ενδαγγειακή πήξη, καρδιοµυοπάθεια και ηπατίτιδα, η θεραπεία µε pleconaril εµποδίζει τον περαιτέρω ιικό πολλαπλασιασµό, αλλά δεν αναστρέφει τις ιστικές βλάβες που έχουν ήδη γίνει. Έτσι, έχει µικρό αποτέλεσµα σε νεογνά µε εγκατεστηµένη πολυοργανική νόσο, ειδικά µυοκαρδίτιδα, καθώς 2 στα 4 νεογνά µε προϋπάρχουσα καρδιοµυοπάθεια, πέθαναν παρά τη χορήγηση του pleconaril 242. Συνεπώς, ο ρόλος του φαρµάκου στη θεραπεία των EV λοιµώξεων φαίνεται υποσχόµενος, αλλά δεν µπορεί να υποστηριχθεί, µέχρις ότου µεγάλες πολυκεντικές τυχαιοποιηµένες διπλές-τυφλές µελέτες σε σύγκριση µε placebo ολοκληρωθούν, ώστε να επιβεβαιώσουν, αν το φάρµακο έχει θέση στη θεραπεία των EV λοιµώξεων. Άλλα φάρµακα µε στόχο την περιοχή που κωδικοποιεί την 3A πρωτεΐνη (αναστέλλει την αντιγραφή του RNA) ή την 3C πρωτεάση (αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση του ιού) είναι υπό έρευνα 1. 52

55 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 53

56 1. ΣΚΟΠΟΣ Καθώς δεν υπήρχαν στην Ελλάδα προηγούµενες συστηµατικές µελέτες σχετικές µε τα κλινικά δεδοµένα και την επιδηµιολογία των εντεροϊών σε ασθενείς µε λοιµώξεις του ΚΝΣ, σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν: α) η αποµόνωση και η ανίχνευση των εντεροϊών που κυκλοφορούν στην Ελλάδα και προκαλούν λοιµώξεις του ΚΝΣ, όπως άσηπτη µηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα και άλλες, και η συσχέτισή τους µε τις κλινικές εκδηλώσεις και τα ευρήµατα από την ανάλυση του ΕΝΥ, β) Η εφαρµογή µοριακών µεθόδων που να επιτρέπουν τη διάγνωση και την τυποποίηση των εντεροϊών άµεσα στο ΕΝΥ, καθώς και η σύγκριση αυτών µε τις συµβατικές µεθόδους, και γ) Ο µοριακός χαρακτηρισµός και η επιδηµιολογία των εντεροϊών που θα κυκλοφορούσαν κατά τη διάρκεια της µελέτης στην Ελλάδα, σε σύγκριση µε τα επιδηµιολογικά δεδοµένα τυποποίησης εντεροϊών προηγουµένων ετών στην Ελλάδα, την Ευρώπη και άλλες χώρες, µε µελέτη της αλληλουχίας των βάσεων και τη φυλογενετική ανάλυση. Παρόµοια δεδοµένα θα είναι πολύ αξιόλογα για κάθε µελλοντική στρατηγική όσον αφορά τη διάγνωση, το χειρισµό και τη θεραπεία των λοιµώξεων από εντεροϊούς. Ακόµη, η ανάλυση της αλληλουχίας βάσεων των εντεροϊών της παρούσας µελέτης, σε σύγκριση µε αυτή των πρωτότυπων στελεχών καθώς και στελεχών εντεροϊών από άλλες χώρες, θα δώσει χρήσιµες πληροφορίες για τη µοριακή επιδηµιολογία της εξέλιξης των εντεροϊών και των επιδηµιών της νόσου και για τη γενετική µεταβλητότητα µεταξύ των στελεχών των εντεροϊών από την Ελλάδα και τις γειτονικές χώρες. Τα δεδοµένα της µελέτης αυτής θα προσθέσουν γνώση χρήσιµη στη ανάπτυξη νέων µεθόδων για τη διάγνωση και την τυποποίηση των εντεροϊών άµεσα από τα κλινικά δείγµατα. 54

57 2. ΥΛΙΚΟ Ασθενείς Κατά το χρονικό διάστηµα Μαρτίου Σεπτεµβρίου 2006, ελέγχθηκαν για λοίµωξη από εντεροϊό 167 Έλληνες ασθενείς µε λοίµωξη του ΚΝΣ. Οι 86 (51,5%) περιπτώσεις είχαν συµπτωµατολογία άσηπτης µηνιγγίτιδας, οι 60 (35,9%) εγκεφαλίτιδας και οι 21 περιπτώσεις (12,6%) παρουσίασαν άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ, και συγκεκριµένα, 6 ασθενείς είχαν συµπτώµατα µηνιγγοεγεφαλίτιδας, 7 οξείας χαλαρής παράλυσης, ενώ 8 είχαν απροσδιόριστη λοίµωξη του ΚΝΣ. Στο Α Εργαστήριο Μικροβιολογίας του ΑΠΘ στάλθηκαν δείγµατα ΕΝΥ από όλους τους 167 ασθενείς, οι οποίοι είχαν νοσηλευτεί σε νοσοκοµεία διαφόρων περιοχών κυρίως της Βόρειας Ελλάδας (νοµοί Θεσσαλονίκης, ράµας, Σερρών, Λάρισας), καθώς και από το Καραµανδάνειο Παιδιατρικό Νοσοκοµείο Πατρών (Πίνακας 3). είγµατα ορού αίµατος στάλθηκαν από 88 από τους 167 ασθενείς. Επιπλέον, µελετήθηκαν 34 δείγµατα ΕΝΥ από ασθενείς µε συµπτώµατα άσηπτης µηνιγγίτιδας που πάρθηκαν κατά τη διάρκεια µίας επιδηµία που παρατηρήθηκε στην Παλαιστίνη το Έτσι, ο συνολικός αριθµός των ασθενών αυτής της µελέτης ανήλθε στους 201. Το ιστορικό των ασθενών, τα επιδηµιολογικά δεδοµένα και τα αποτελέσµατα της ανάλυσης του ΕΝΥ πάρθηκαν από τους φακέλους των ασθενών των αρχείων των νοσοκοµείων. Τα δείγµατα του ΕΝΥ και του ορού συλλέχθηκαν κατά την οξεία φάση της νόσου και στάλθηκαν στο εργαστήριο το συντοµότερο δυνατό. Αν υπήρχε καθυστέρηση στη µεταφορά, αυτά φυλάσσονταν στους -70 o C ή -20 o C. Μετά την παραλαβή τους, τα δείγµατα του ΕΝΥ εξετάζονταν άµεσα ή διατηρούνταν στους -70 o C µέχρι να αρχίσει η µελέτη τους. Η διατήρηση των δειγµάτων του ορού γινόταν στους -20 o C. 55

58 Πίνακας 3. Κατανοµή κλινικών δειγµάτων κατά γεωγραφική περιοχή και Νοσοκοµείο. Γεωγραφική περιοχή Νοσοκοµείο Πιθανή διάγνωση Άσηπτη µηνιγγίτιδα Εγκεφαλίτιδα Άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ Σύνολο Θεσσαλονίκη Ειδικών παθήσεων ΑΧΕΠΑ Ιπποκράτειο Παπανικολάου Σ.Ν Άλλα Νοσοκοµεία ράµα Γενικό Περιφερειακό Σέρρες Γενικό Περιφερειακό Λάρισα Γενικό Περιφερειακό Πάτρα Παιδιατρικό Παλαιστίνη Κεντρικό Νοσοκοµείο Nablus Σύνολο

59 3. ΜΕΘΟ ΟΙ Αποµόνωση του ιού σε καλλιέργειες κυττάρων και δοκιµασία εξουδετέρωσης α. Αποµόνωση του ιού σε καλλιέργειες κυττάρων Όταν ο όγκος του ΕΝΥ ήταν επαρκής, ποσότητα αυτού εµβολιαζόταν σε κατάλληλες κυτταρικές σειρές, για την αποµόνωση του εντεροϊού. Καθώς δεν υπάρχει καµία κυτταρική σειρά σε χρήση που να υποστηρίζει την ανάπτυξη όλων των γνωστών εντεροϊών, δύο κυτταρικές σειρές, τα Hep-2 κύτταρα (επιδερµοειδές καρκίνωµα ανθρώπου) και τα RD (ραβδοµυοσάρκωµα) χρησιµοποιήθηκαν για την αποµόνωση του ιού, σύµφωνα µε τις οδηγίες του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας 243. Οι καλλιέργειες κυττάρων φέρονταν σε κλειστά πλαστικά σωληνάρια µε βιδωτό πώµα και στρογγυλό πυθµένα και αρχικά περιείχαν 2 ml θρεπτικού υλικού ανάπτυξης (Growth Medium), το οποίο αποτελούνταν από Minimum Essential Medium-MEM, (Biochrom Ag, Berlin, Germany), 10% ορό εµβρύου βοός (Fetal Bovine Serum- FBS της Invirogen corpοration, Paisely, Scotland, UK), 2mM L-glutamine, 2,5 ml δικαρβονικού νατρίου 7,5% (Sodium Bicarbonate-SB της Biochrom Ag, Berlin, Germany), και αντιβιοτικά (πενικιλλίνη 100 U/ml και στρεπτοµυκίνη 200 µg/ml) 244. Όταν τα κύτταρα σχηµάτιζαν συρρέουσα µονοστιβάδα, το θρεπτικό υλικό καλλιέργειας αντικαθίστατο µε 2 ml υλικού διατήρησης (Maintenance Medium-MM) το οποίο είχε την ίδια σύσταση µε το υλικό ανάπτυξης αλλά περιείχε µικρότερη ποσότητα ορού (1-2%). Ποσότητα 200µl από κάθε δείγµα ΕΝΥ εµβολιάζονταν σε κάθε ένα σωληνάριο και στις δύο κυτταρικές σειρές (εις διπλούν όταν η ποσότητα του ΕΝΥ ήταν επαρκής). Για κάθε κυτταρική σειρά επίσης, υπήρχαν δύο σωληνάρια κυτταροκαλλιέργειας χωρίς εµβολιασµό, που χρησίµευαν ως µάρτυρες ελέγχου ανάπτυξης των κυττάρων (control cells). Όλη η εργασία γινόταν σε θάλαµο βιοασφάλειας (biosafety cabinet) για την αποφυγή επιµόλυνσης των κυτταροκαλλιεργειών από άλλους µικροοργανισµούς, καθώς και διασποράς των ιών. Μετά τον εµβολιασµό, όλα τα σωληνάρια τοποθετούνταν σε περιστρεφόµενο κύλινδρο (rolling drum) και επωάζονταν στους 36 o C για 7 µέρες. 57

60 Τα σωληνάρια εξετάζονταν καθηµερινά για την παρουσία κυτταροπαθολογικών αλλοιώσεων (cytopathic effects-cpes) σε σύγκριση µε τους µάρτυρες κυττάρων, σε ανεστραµµένο οπτικό µικροσκόπιο και καταγράφονταν ο βαθµός των αλλοιώσεων. Οι κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις που προκαλούσαν οι εντεροϊοί χαρακτηρίζονταν από συρρίκνωση και αποστρογγυλοποίηση των κυττάρων. Όταν κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις παρατηρούνταν τουλάχιστον στο 75% των κυττάρων της µονοστιβάδας, τότε τα κύτταρα αποκολλούνταν από τα τοιχώµατα του σωληνάριου µε σιφώνιο Pasteur, συγκεντρώνονταν και φυλάσσονταν στους - 70 o C για περαιτέρω έλεγχο, αφού προηγουµένως γινόταν µία ανακαλλιέργεια για επιβεβαίωση του αποτελέσµατος. Στις καλλιέργειες κυττάρων που δεν παρατηρούνταν κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης των 7 ηµερών, πριν να χαρακτηρισθούν ως αρνητικές, γινόταν ένα τυφλό πέρασµα σε άλλο σωληνάριο κυτταροκαλλιέργειας και ακολουθούσε επώαση 7 ηµερών. β. Τυποποίηση των εντεροϊών µε εξουδετερωτική δοκιµασία Μετά την αποµόνωση, ακολούθησε ορολογική τυποποίηση των εντεροϊών µε εξουδετερωτική δοκιµασία µε τη χρήση ειδικών αντιορών ίππου του RIVM Ινστιτούτου (National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands), σύµφωνα µε τις οδηγίες του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας 243. Οι συγκεκριµένοι αντιοροί διατίθενται σε µείγµατα αντιορών (pools). Για την τυποποίηση χρησιµοποιήθηκαν τα pools για εντεροϊούς Α-G και το pool για τους ιούς Coxsackie Β 1-6. Με αυτούς τους αντιορούς είναι δυνατή η τυποποίηση 42 διαφορετικών ορότυπων. Η δοκιµασία εξουδετέρωσης βασίζεται στην ικανότητα του αντιορού να δρα ειδικά µε τον ιό και να εξουδετερώνει την ικανότητα να προκαλεί κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις. Ιοί που δεν τυποποιήθηκαν µε αυτή τη συγκεκριµένη διαδικασία χαρακτηριζόταν ως εντεροϊοί µη τυποποιηθέντες µε εξουδετερωτική δοκιµασία και χρησιµοποίηση των αντιορών του RIVM Ινστιτούτου. Όλα τα αποµονωθέντα στελέχη εντεροϊών ανακαλλιεργήθηκαν στις ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Hep-2 και RD) και επωάσθηκαν για µερικές 58

61 ηµέρες, ώστε να υπάρχει ικανή ποσότητα µολυσµένων κυττάρων (75-100% CPEs) για την εξουδετερωτική δοκιµασία. Πριν από την τυποποίηση έγινε τιτλοποίηση των αποµονωθέντων στελεχών µε λογαριθµική σειρά αραιώσεων ( ), για να καθοριστεί η αραίωση του ιού που προκαλεί µόλυνση του 50% των κυττάρων στα οποία έχει ενοφθαλµιστεί (tissue culture infective dose-tcid 50 ). Για την εξουδετέρωση χρησιµοποιήθηκαν 100 TCID 50 εναιωρήµατος του ιού. Οι τίτλοι των εξουδετερωτικών αντιορών και οι οδηγίες για τις αραιώσεις αυτών, προκειµένου να χρησιµοποιηθούν στη δοκιµασία, δίνονταν από το RIVM Ινστιτούτο της Ολλανδίας. Η εξουδετερωτική δοκιµασία έγινε σε αποστειρωµένες πλάκες µικροαραιώσεων. Ποσότητα 50 µl του τιτλοποιηµένου προς τυποποίηση ιού αναµειγνύονταν µε ίσο όγκο των διαθέσιµων αντιορών εις διπλούν στα αντίστοιχα βυθίσµατα της πλάκας και επωάζονταν για 1 ώρα στους 37 o C. Σε κάθε δοκιµασία συµπεριλαµβάνονταν µάρτυρας για τον ιό και µάρτυρας για τα κύτταρα. Στην συνέχεια, σε όλα τα βυθίσµατα προσθέτονταν 50 µl εναιωρήµατος κυττάρων σε αραίωση 2 x 10 5 κύτταρα/ml. Η πλάκα καλύπτονταν µε αποστειρωµένο κάλυµµα και επωάζονταν στους 36 o C παρουσία 5% CO 2 για 4-5 ηµέρες. Η ανάγνωση της δοκιµασίας γινόταν καθηµερινά σε ανάστροφο µικροσκόπιο για την παρουσία και το βαθµό ή την απουσία κυτταροπαθολογικών αλλοιώσεων. Η αξιολόγηση της δοκιµασίας γινόταν σε σύγκριση των κυτταροπαθολογικών αλλοιώσεων των δειγµάτων µε τους µάρτυρες ιού και κυττάρων. Το στέλεχος του ιού που µετά την εξουδετέρωση µε τον αντίστοιχο αντιορό δεν προκαλούσε κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις, καθόριζε τον τύπο του ιού Ορολογικές µέθοδοι για ανίχνευση αντισωµάτων Τα δείγµατα των ορών που πάρθηκαν κατά την οξεία φάση εξετάστηκαν για IgM and IgG αντισώµατα έναντι των ιών Coxsackie B 1-6 και Echo χρησιµοποιώντας σειρά αντιδραστηρίων Elisa του εµπορίου της εταιρείας Serion (Institute Virion/Serion GmbH, Wurzburg, Germany), σύµφωνα µε τις οδηγίες των κατασκευαστών. Χρησιµοποιήθηκαν δύο σειρές αντιδραστηρίων, µία για τους ιούς Coxsackie Β και µία για τους ιούς Echo. Αυτά τα αντιδραστήρια Elisa περιέχουν υψηλής καθαρότητας 59

62 αδρανοποιηµένους µε θερµότητα ιούς Coxsackie Β, τύπου 1 και 5, και Echo τύπου 6 και 9, και ανιχνεύουν αντισώµατα έναντι όλων των οροτύπων των Coxsackie Β και Echo αντίστοιχα. Προκειµένου να αποφευχθούν τα ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσµατα από την τυχόν παρουσία του ρευµατοειδούς παράγοντα, οι οροί που επρόκειτο να ελεγχθούν για την παρουσία IgM αντισωµάτων, υφίσταντο πριν από την κυρία δοκιµασία µία κατεργασία µε κατάλληλο προσροφητικό. Με βάση τις οδηγίες, στα βυθίσµατα της µικροπλάκας που είναι καλυµµένα µε αντιγόνο προστίθεται ο υπό εξέταση ορός αραιωµένος (1:100 ) σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS (Phosphate buffer saline µε πρωτεΐνη και Tween 20) και ακολουθεί επώαση 1 ώρας στους 37 ο C, ώστε κάθε ειδικό αντίσωµα να συνδεθεί µε το οµόλογο αντιγόνο. Μετά την αποµάκρυνση µε πλύσιµο του υλικού που µένει ασύνδετο, προστίθεται αντί- IgM ή αντί-igg ορός συνδεδεµένος µε το ένζυµο αλκαλική φωσφατάση (conjugate), ο οποίος και αντιδρά µε το ανοσοσύµπλεγµα στη περίπτωση θετικής αντίδρασης. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C ακολουθεί πλύσιµο για την αποµάκρυνση του µη συνδεδεµένου αντιορού (conjugate) και στη συνέχεια προσθήκη του κατάλληλου υποστρώµατος (Paranitrophenylphosphate), που στη περίπτωση διάσπασης του αναπτύσσεται χρώµα. Η ένταση του χρώµατος είναι ανάλογη µε το επίπεδο του συγκεκριµένου αντισώµατος και η µέτρηση γίνεται φωτοµετρικά Μοριακές µέθοδοι Μοριακές µέθοδοι εφαρµόστηκαν στα δείγµατα ΕΝΥ όλων των ασθενών της µελέτης αυτής. Το πρωτόκολλο για τη διάγνωση και την τυποποίηση των εντεροϊών περιλάµβανε: α. Εκχύλιση (extraction) του RNA άµεσα από τα δείγµατα του ΕΝΥ ή/και από τα υπερκείµενα των θετικών καλλιεργειών. β. Εφαρµογή RT-PCR που ενισχύει τη γονιδιακή περιοχή VP1-2A. γ. Εφαρµογή RT-PCR που ενισχύει το 5 άκρο της γονιδιακής περιοχής VP1. δ. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR. ε. Καθαρισµός (purification) του προϊόντος της PCR. στ. Αλληλούχιση των νουκλεοτιδίων (sequencing) των προϊόντων της PCR. ζ. Φυλογενετική ανάλυση. 60

63 α. Εκχύλιση ιικού RNA Το RNA του ιού εκχυλίστηκε από το ΕΝΥ ή/και από υπερκείµενο της θετικής κυτταροκαλλιέργειας µε τη χρήση της σειράς αντιδραστηρίων QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN Gmbh, Hilden, Germany), ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών, µε µόνη διαφορά τον µικρότερο τελικό όγκο του διαλύµατος εκλούσεως στα δείγµατα του ΕΝΥ (30µl αντί 70 µl). Το αποµονωθέν ιικό RNA είτε χρησιµοποιήθηκε αµέσως για την RT-PCR, ή αποθηκεύτηκε στους -20 o C µέχρι τη χρήση του. Αναλυτικά ή διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 140µl του ΕΝΥ ή/και του υπερκείµενου της θετικής καλλιέργειας, προσθέτονταν σε 560µl λυτικού διαλύµατος (AVL buffer containing carrier RNA) και ακολουθούσε επώαση επί δέκα λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Το λυτικό ρυθµιστικό διάλυµα περιέχει φορέα RNA, ο οποίος προάγει τη σύνδεση του ιικού RNA στη µεµβράνη και περιορίζει την πιθανή διάσπαση τον ιικού RNA από τυχόν υπάρχοντα ένζυµα. Κατόπιν προσθέτονταν 560µl καθαρής αιθανόλης (96-100%) και το διάλυµα αναµειγνυόταν καλά επί 15 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια το διάλυµα µεταφερόταν σε σωληνάριο µε φίλτρο, και ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε 6000g για 10 δευτερόλεπτα. Το φίλτρο που περιείχε το αποµονωθέν RNA, τοποθετούνταν σε νέο σωληνάριο, ακολουθούσε προσθήκη διαλύµατος πλύσεως AW1 και AW2 (500µl από έκαστο), και φυγοκέντρηση σε 6000g και 20000g αντίστοιχα, για την αποµάκρυνση πρωτεϊνών και λιπιδίων. Ακολουθούσε µία επιπλέον φυγοκέντρηση, προκειµένου να αποµακρυνθούν τυχόν υπολείµµατα του διαλύµατος AW2. Το ιικό RNA λαµβανόταν µε προσθήκη 30µl διαλύµατος εκλούσεως (AVE elution buffer), και τοποθετούνταν σε σωληνάριο eppendorf όπου συντηρούνταν στους -20 o C µέχρι τη χρήση του. β. RT-nested PCR για την ενίσχυση της γονιδιακής περιοχής VP1-2A Στο ιικό RNA που εκχυλίστηκε από όλα τα δείγµατα της µελέτης αυτής, εφαρµόστηκε µία φωλιασµένη RT-PCR (RT-nested PCR) που πολλαπλασιάζει ένα κοµµάτι ~ 609 ζευγών βάσεων (bp) από την περιοχή VP1-2A του γονιδιώµατος των εντεροϊών χρησιµοποιώντας δύο ζεύγη 61

64 εκκινητών 214. Η ανάστροφη µεταγραφή και η επακόλουθη ενίσχυση του cdna έγινε σε ένα σωληνάριο, ώστε να µειωθεί η πιθανότητα επιµόλυνσης. Οι αλληλουχίες των βάσεων των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν και η αντίστοιχη θέση τους στο πρωτότυπο στέλεχος Barty του ιού Εcho 9 φαίνονται στον Πίνακα 4. Πίνακα 4. Εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν στην RT-Nested PCR Εκκινητής Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Πολικότητα Θέση β PCR VP1-1S 5 -GGTTYGAYITGGARITIACITTYGT 3 α Sense γ η VP1-1A 5 -TGIGAYTGRTAYCTIKYKGGRTARTA-3 α Antisense δ η VP1-2S 5 -ARWTWATGTAYRTICCICCIGGIG-3 α Sense γ η VP1-2A 5 -CCIGTKKWRCAIYKRCAYCTIGC-3 α Antisense δ η α I: Deoxyinosine, Y: T/C,, R: A/G, W: T/A, K: T/G. β Η θέση των εκκινητών µε αναφορά στο στέλεχος Barty του ιού Echo 9, (X92886). γ Κατεύθυνση στο γονιδίωµα: 5 προς 3 άκρο. δ Κατεύθυνση στο γονιδίωµα: 3 προς 5 άκρο. Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης της πρώτης PCR ήταν 50µl. 10 µl ιικού RNA προσθέτονταν στο διάλυµα της αντίδρασης το οποίο περιείχε 5µl του ανάλογου 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατος (200 mm Τris-HCl ph 8.4, 500 mm KCl), 2µl MgCl 2 συγκέντρωσης 50mM, 4µl τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) συγκέντρωσης 10mΜ, 30 pmoles από κάθε εκκινητή, VP1-1S και VP1-1A, 10 U/µl αντίστροφης τρανσκρυπτάσης και 2,5U Taq DNA πολυµεράσης. Όλα τα αντιδραστήρια ήταν της εταιρείας Invitrogen Life Τechnology, USA. Ο αρχικός κύκλος για την ανάστροφη µεταγραφή γινόταν στους 40 o C για 45 λεπτά. Η αντίδραση PCR διεξαγόταν σε 40 κύκλους. Κάθε κύκλος περιελάµβανε µετουσίωση (denaturation) στους 94 o C για 30 sec, σύζευξη (annealing) των εκκινητών στις συµπληρωµατικές τους αλληλουχίες στους 50 o C για 3 min, και σύνθεση-επέκταση (extension) νέων αλυσίδων DNA µε τη δράση της Taq πολυµεράσης στους 68 o C για 30 sec. Η τελική φάση επέκτασης µετά την ολοκλήρωση των 40 κύκλων διαρκούσε 5 min στους 68 o C. 62

65 Ακολουθούσε η φωλιασµένη PCR (npcr), κατά την οποία 3µl από το προϊόν της πρώτης αντίδρασης προσθέτονταν σε 47µl του διαλύµατος της αντίδρασης, που περιείχε 5µl του ανάλογου 10X ρυθµιστικού διαλύµατος (200 mm Τris-HCl ph 8,4, 500 mm KCl), 2µl MgCl 2 των 50 mm, 4µl των 10µΜ τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), 60 pmoles από κάθε ένα εκκινητή, VP1-2S και VP1-2A, και 2,5U Taq DNA πολυµεράσης. Η διαδικασία της npcr περιελάµβανε ένα αρχικό κύκλο στους 94 o C για 2 min (µετουσίωση), και στη συνέχεια 30 κύκλους στις αντίστοιχες θερµοκρασίες και χρόνους: µετουσίωση 94 o C επί 30 sec, σύζευξη 50 o C επί 1 min, και σύνθεσηεπέκταση 72 o C επί 30 sec. Η τελική φάση επέκτασης µετά την ολοκλήρωση των 30 κύκλων διαρκούσε 5 min στους 72 o C. Σε κάθε αντίδραση PCR συµπεριλαµβανόταν αρνητικός µάρτυρας (απεσταγµένο νερό), ενώ ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε αραίωση 10-3 ιού Coxsackie B5, που προστέθηκε σε 140 µl εγκεφαλονωτιαίου υγρού, αρνητικού για εντεροϊούς. γ. RT-PCR για την ενίσχυση του 5 άκρου της γονιδιακής περιοχής VP1 Κατά τους τελευταίους µήνες της µελέτης, δηµοσιεύτηκε ένα άρθρο των Oberste και συν. 245, οι οποίοι περιέγραψαν µία RT-PCR σε δείγµατα υπερκειµένου καλλιέργειας εντεροϊών, η οποία πολλαπλασιάζει ένα κοµµάτι 727 bp που βρίσκεται στο 5 άκρο της περιοχής VP1 του γονιδιώµατος των εντεροϊών. Οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι αυτή η περιοχή είναι καλύτερη για την τυποποίηση των εντεροϊών. Έτσι, για την καλύτερη µοριακή τυποποίηση ορισµένων στελεχών αυτής της µελέτης, εφαρµόστηκε η συγκεκριµένη RT- PCR. Οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή την PCR φαίνονται στον Πίνακα 5. 63

66 Πίνακας 5. Εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν στην RT- PCR για την ενίσχυση του 5 άκρου της γονιδιακής περιοχής VP1. Εκκινητής Αλληλουχία νουκλεοτιδίων α Πολικότητα Θέση β Περιοχή 490 TGIGTIYTITGYRTICCITGGAT Sense γ VP3 492 GGRTTIGTIGWYTGCCA VP1 Antisense δ VP1 α Τροποποιηµένες θέσεις (degenerated positions) I: Deoxyinosine, Y: T/C,, R: A/G, W: T/A. β Η θέση των εκκινητών µε αναφορά στο στέλεχος Farouk του ιού Echo 1 (AF029859). γ Κατεύθυνση στο γονιδίωµα: 5 προς 3 άκρο δ Κατεύθυνση στο γονιδίωµα: 3 προς 5 άκρο. Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης της PCR ήταν 50µl. ύο µl ιικού RNA προσθέτονταν στο διάλυµα της αντίδρασης το οποίο περιείχε 5µl του ανάλογου 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατος (200 mm Τris-HCl ph 8.4, 500 mm KCl, 2µl MgCl 2 συγκέντρωσης 50mM, 4µl τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) συγκέντρωσης 10mΜ, 50 pmoles από κάθε εκκινητή (490 και 492), 10 U/µl αντίστροφης τρανσκρυπτάσης και 2,5U Taq DNA πολυµεράσης. Όλα τα αντιδραστήρια ήταν της εταιρείας Invitrogen Life Τechnology, USA. Ο αρχικός κύκλος για την ανάστροφη µεταγραφή γινόταν στους 40 o C για 30 λεπτά, και ακολουθούσε επώαση στους 94 o C για 3 min. Η αντίδραση PCR διεξαγόταν σε 35 κύκλους. Κάθε κύκλος περιελάµβανε µετουσίωση στους 94 o C για 30sec, σύζευξη των εκκινητών στους 42 o C για 30 sec, και σύνθεση-επέκταση νέων αλυσίδων DNA µε τη δράση της Taq πολυµεράσης στους 72 o C για 30 sec. Η τελική φάση επέκτασης µετά την ολοκλήρωση των 35 κύκλων διαρκούσε 5 min στους 72 o C. δ. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR Όγκος 15µl από κάθε προϊόν PCR αναλύθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% που περιείχε βρωµιούχο αιθίδιο (ethidium bromide - 1µg/ml). Η ηλεκτροφόρηση έλαβε χώρα σε ρυθµιστικό διάλυµα 1Χ TBE (89mM Tris-boric acid buffer, 2,5mM EDTA) σε 100 Volts επί 1 ώρα. Μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή αγαρόζης µεταφερόταν σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας για την αποτύπωση των αποτελεσµάτων µε σύστηµα ψηφιακήs φωτογράφισης και γινόταν αποθήκευση της φωτογραφίας. 64

67 ε. Καθαρισµός του προϊόντος της PCR Το προϊόν της PCR που επρόκειτο να αλληλουχηθεί, κοβόταν από τη γέλη αγαρόζης και καθαριζόταν µε τη χρήση εµπορικής σειράς αντιδραστηρίων (QIAquick PCR purification kit) της εταιρείας Qiagen (Leiden, Germany) σύµφωνα µε τις οδηγίες των κατασκευαστών. Αναλυτικά η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: η ταινία του DNA κοβόταν από την πηκτή αγαρόζης µε τη χρήση ενός καθαρού µαχαιριδίου και ζυγιζόταν σε ζυγό ακριβείας. Τρεις όγκοι ρυθµιστικού διαλύµατος QG που περιείχε ισοθειοκυανική γουανιδίνη προσθέτονταν σε έναν όγκο της πηκτής (100 mg πηκτή ~ 100µl). Το µείγµα επωαζόταν στους 50 o C επί 10 λεπτά ή µέχρι την πλήρη διάλυση της πηκτής. Για να διευκολυνθεί η διάλυση, το σωληνάριο αναδευόταν κάθε 2-3 λεπτά κατά τη διάρκεια της επώασης. Στη συνέχεια προσθέτονταν όγκος ισοπρανόλης ίσος προς τον όγκο της πηκτής. Μετά από καλή ανακίνηση το όλο µείγµα µεταφερόταν σε σωληνάριο των 2ml, στο οποίο είχε τοποθετηθεί ειδικό φίλτρο (QIAquick spin column). Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό µε σκοπό την αποµάκρυνση του διαλύµατος καθαρισµού. Μία δεύτερη φυγοκέντρηση µετά την προσθήκη 0,5 ml ρυθµιστικού διαλύµατος QC είχε σκοπό τον καλύτερο καθαρισµό του προϊόντος. Ακολουθούσε προσθήκη 0,75ml διαλύµατος έκπλυσης, και φυγοκέντρηση επί 1 λεπτό για την πλήρη αποµάκρυνση κάθε υπολοίπου του διαλύµατος QC. Κατόπιν γινόταν τοποθέτηση του φίλτρου σε σωληνάριο eppendorf και προσθήκη 30µl ρυθµιστικού διαλύµατος EB (10mM Tris-ΗCl, ph 8,5), επώαση για 1 λεπτό σε θερµοκρασία δωµατίου, και τέλος φυγοκέντρηση για 1 λεπτό. Ακολουθούσε αποµάκρυνση του φίλτρου, ενώ στο σωληνάριο παρέµενε το καθαρό προϊόν της PCR. στ. Αλληλούχιση των νουκλεοτιδίων (sequencing) των προϊόντων της PCR Ο προσδιορισµός της αλληλουχίας των βάσεων του προϊόντος της PCR έγινε µε την εφαρµογή της µεθόδου Sanger (1977) 246. Η µέθοδος αυτή βασίζεται στη χρήση σεσηµασµένων διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntps). Τα ddntps είναι σεσηµασµένα µε τέσσερις διαφορετικές χρωστικές, µία για κάθε 65

68 βάση και στερούνται της 3 -OH οµάδας, µε αποτέλεσµα να ενσωµατώνονται στη νουκλεοτιδική αλληλουχία και να εµποδίζουν την προσθήκη άλλων νουκλεοτιδίων. Έτσι προκύπτουν αλληλουχίες DNA µε ποικίλο µήκος που αντιστοιχούν σε διαφορετικές θέσεις ενσωµάτωσης των ddntps και ανιχνεύονται µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακριλαµίδης. Η αρχική φάση γίνεται όπως και η PCR σε θερµικό κυκλοποιητή, µε τη διαφορά ότι ενώ στην PCR χρησιµοποιείται ζεύγος εκκινητών και επιτυγχάνεται εκθετικός πολλαπλασιασµός του DNA-στόχου, στην ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων χρησιµοποιείται ένας εκκινητής, που οδηγεί σε γραµµικό πολλαπλασιασµό των προϊόντων επέκτασης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκε το εµπορικό kit Thermo Sequenase TM Cy TM 5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare UK Lmd, Buckinghamshire UK). Αυτό το κit συνδυάζει πολλές καινοτοµίες για την αλληλουχία βάσεων DNA. Πρώτον, το σηµασµένο ddntp είναι πιο αποτελεσµατικό από άλλα επισηµασµένα νουκλεοτίδια για την πειραµατική σήµανση αλληλουχίας βάσεων, επειδή επισηµαίνει µόνο τις διδεοξυ-τελικές (terminated) DNA αλυσίδες. Επειδή οι αλυσίδες που τερµατίζουν πρόωρα δεν σηµαίνονται, σταµατά τα τεχνικά λάθη (artifacts) µε αποτέλεσµα να εξαλείφονται οι περισσότερες ταινίες του υπόβαθρου. Με αυτή τη µέθοδο, ένας κλώνος DNA συντίθεται in vitro µε ενσωµάτωση του Cy 5.5 ddntp µε τη χρησιµοποίηση της πολυµεράσης παρουσία ενός εκµαγείου (DNA template) και ενός εκκινητή για τη σύνθεση. Η επέκταση του εκκινητή συνεχίζεται µέχρις ότου η πολυµεράση ενσωµατώσει το φθορίζον Cy 5.5 ddntp στο 3 άκρο. Αυτή η στρατηγική διασφαλίζει ότι επισηµαίνονται µόνο οι κλώνοι του DNA που τερµατίζουν κατάλληλα και είναι ορατοί κατά τον προσδιορισµό της αλληλουχίας των βάσεων. Τα σηµασµένα τεµάχια ανιχνεύονταν σε αυτόµατο µηχάνηµα προσδιορισµού αλληλουχίας βάσεων (Bayer Healthcare OpenGene system). Με συντοµία, στο καθαρισµένο PCR προϊόν (~600nt) προσδιορίστηκε η αλληλουχία των βάσεων προς µία κατεύθυνση χρησιµοποιώντας ένα από τα ζεύγη εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στη nested PCR (VP1-2S ή VP1-2A). Για κάθε δείγµα, 4 ξεχωριστές αντιδράσεις σε 4 διαφορετικά σωληνάρια που περιείχε όλα τα απαραίτητα αντιδραστήρια για την in vitro σύνθεση του DNA και ένα από τα σηµασµένα µε διαφορετική φθορίζουσα χρωστική διδεοξυριβινουκλεοτίδιο (ddatp ή ddttp ή ddctp ή 66

69 ddgtp). Με τον τρόπο αυτό δηµιουργούνταν 4 οµάδες διαφορετικά σηµασµένων DNA θραυσµάτων (fragments) διαφορετικού µήκους, µε διαφορά µίας βάσης, που αντιστοιχούσαν σε διαφορετικές τυχαίες θέσεις ενσωµάτωσης των σηµασµένων ddntps. Για την τελική ανίχνευση των θραυσµάτων του DNA ακολουθούσε ηλεκτροφόρηση σε τέσσερις παράλληλες σειρές σε πηκτή πολυακριλαµίδης. Κατόπιν γινόταν εκτύπωση του ηλεκτροφορήµατος και η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων λαµβανόταν σε µορφή text file για περαιτέρω ανάλυση. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας της ενισχυµένης VP1-2A και 5 VP1 περιοχές για κάθε δείγµα έγινε µε το πρόγραµµα BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) που διατίθεται από το NCBI (National Center for Biotechnology Information) και καταδεικνύει την οµολογία του υπό µελέτη στελέχους µε γνωστό τύπο εντεροϊού, τα στοιχεία του οποίου είναι καταχωρηµένα στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank). ζ. Φυλογενετική ανάλυση Για τη φυλογενετική ανάλυση των στελεχών των εντεροϊών αυτής της µελέτης χρησιµοποιήθηκαν διάφορα προγράµµατα. Αναλυτικά για τη στοίχιση των νουκλεοτιδίων εφαρµόστηκε το πρόγραµµα CLUSTAL W ( όπου συµπεριελήφθησαν οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων αυτής της µελέτης και αντίστοιχες από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank Data Base). Ακολούθησε µέτρηση των γενετικών αποστάσεων χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα Distance του φυλογενετικού πακέτου PHYLIP 247. Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν µε το πρόγραµµα Neighbor, ενώ τα ποσοστά αυτοδυναµίας υπολογίστηκαν µε το πρόγραµµα Seqboot. Στα φυλεγενετικά δέντρα αναγράφηκαν µόνο τα ποσοστά που σηµαίνουν ικανή αυτοδυναµία (µεγαλύτερα του 60%). Για την µελέτη παρουσίας ανασυνδυασµού στα στελέχη χρησιµοποιήθηκε το πρόγραµµα Simplot ( 67

70 4. 4. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των στοιχείων έγινε µε το πρόγραµµα SPSS Window v.11 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Για όλες τις στατιστικές δοκιµασίες, τιµή του p<0,05 θεωρήθηκε στατιστικώς σηµαντική. Επειδή τα στοιχεία που αφορούσαν τις τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων δεν είχαν κανονική κατανοµή, οι στατιστικές συγκρίσεις ανάµεσα στις οµάδες έγιναν µε τη µη παραµετρική δοκιµασίa Mann-Whitney και x 2. Η ευαισθησία και ειδικότητα υπολογίσθηκαν σύµφωνα µε τα αναφερόµενα στο Clinical Epidemiology and Biostatistics (1992)

71 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Με την εφαρµογή τόσο των καλλιεργητικών όσο και των µοριακών µεθόδων, από τους 201 ασθενείς µε λοίµωξη ΚΝΣ, από τους οποίους οι 167 ήταν κάτοικοι της Ελλάδας και οι 34 κάτοικοι της Παλαιστίνης, βρέθηκαν 48 (23,9%) θετικοί για λοίµωξη µε εντεροϊό, από τους οποίους οι 45 (26,9%) ήταν από την Ελλάδα και οι 3 (8,8%) από την Παλαιστίνη. Παρακάτω φαίνονται αναλυτικά τα αποτελέσµατα όσον αφορά τα επιδηµιολογικά στοιχεία καθώς και από την εφαρµογή των συµβατικών (καλλιεργητικών και ορολογικών) όσο και των µοριακών µεθόδων Επιδηµιολογικά στοιχεία ασθενών Κατά τη διάρκεια της περιόδου Μαρτίου Σεπτεµβρίου 2006, µελετήθηκαν για εντεροϊούς συνολικά 201 ασθενείς µε οξεία λοίµωξη του ΚΝΣ. Με βάση τα κλινικά κριτήρια, η µελέτη περιλάµβανε 120 ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα (86 από την Ελλάδα και 34 από την Παλαιστίνη), 60 ασθενείς µε εγκεφαλίτιδα και 21 µε άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ, από τους οποίους 6 παρουσίασαν µηνιγγοεγεφαλίτιδα, 7 οξεία χαλαρή παράλυση και 8 απροσδιόριστη λοίµωξη του ΚΝΣ. Όλοι οι ασθενείς, εκτός από δύο (ένας µε AIDS και ένας λέµφωµα) ήταν ανοσοεπαρκείς. Στο Σχήµα 4 φαίνεται η κατανοµή των 167 περιπτώσεων λοίµωξης ΚΝΣ που παρατηρήθηκαν στην Ελλάδα. 4% 5% 4% άσηπ τη µηνιγγίτιδα εγκεφαλίτιδα 36% 51% µηνιγγοεγκεφαλίτιδα χαλαρή παράλυση απ ροσδιόριστη λοίµωξη του ΚΝΣ Σχήµα 4. Κατανοµή 167 περιπτώσεων λοίµωξης ΚΝΣ στην Ελλάδα (σύµφωνα µε την πιθανή κλινική διάγνωση). 69

72 Τα γενικά χαρακτηριστικά και η δηµογραφική κατανοµή των ασθενών όσο αφορά την ηλικία, το φύλο και την προέλευση, φαίνονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6α. Γενικά χαρακτηριστικά και δηµογραφική κατανοµή των Ελλήνων ασθενών µε λοίµωξη του ΚΝΣ Νόσος Οµάδες ηλικιών Αριθµός ασθενών µε διαθέσιµα στοιχεία Ηλικιακή κατανοµή % α Άσηπτη µηνιγγίτιδα Εγκεφαλίτιδα Άλλες λοιµώξεις ΚΝΣ < 1 έτους 11 12,8 1-5 ετών , ετών 27 31,4 >15 ετών 33 38,4 < 1 έτους 1 1,8 1-5 ετών 5 8, ετών ,7 >15 ετών 46 78,6 < 1 έτους 1 5,9 1-5 ετών , ετών 3 17,6 >15 ετών 9 47,4 Γεωγραφική περιοχή Θεσσαλονίκη 121 Πάτρα 34 ράµα 5 Σέρρες 4 Λάρισα 3 α Επί % αναλογία, βασισµένη στον αριθµό των ασθενών µε διαθέσιµες επιδηµιολογικές και κλινικές πληροφορίες. Η ηλικία και η αναλογία άρρεν/ θήλυ των Ελλήνων ασθενών µε λοιµώξεις του ΚΝΣ φαίνονται στον πίνακα 6β. Πίνακας 6β. Γενικά χαρακτηριστικά των Ελλήνων ασθενών µε λοιµώξεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος Νόσος Αριθµός ασθενών µε διαθέσιµα στοιχεία Μέση ηλικία (εύρος) έτη Αναλογία αρρένων/ θηλέων Άσηπτη µηνιγγίτιδα 86 19,5 (21 ηµέρες - 72 έτη) 1,45:1 Εγκεφαλίτιδα 58 39,5 (0,37-78 έτη) 1,6:1 Άλλες λοιµώξεις ΚΝΣ (0, έτη) 2:1 70

73 Η µέση ηλικία των 34 ασθενών από την Παλαιστίνη ήταν 11,3 έτη (4 µήνες 19 έτη). Η πλειονότητα αυτών (67,6%) ήταν παιδιά ηλικίας µικρότερης των 15 ετών. Η αναλογία αρρένων θηλέων ήταν 3,2: Κλινικές εκδηλώσεις ασθενών και αποτελέσµατα εργαστηριακής ανάλυσης του εγκεφαλονωτιαίου υγρού Πλήρες ιστορικό υπήρχε διαθέσιµο για τις 114 από τις 167 περιπτώσεις Ελλήνων ασθενών, και συγκεκριµένα για 83 περιπτώσεις άσηπτης µηνιγγίτιδας και για 31 περιπτώσεις εγκεφαλίτιδας. Από τους ασθενείς µε τις υπόλοιπες λοιµώξεις ΚΝΣ δεν ήταν δυνατή η συλλογή κλινικών πληροφοριών. Η πλειοψηφία των ασθενών µε άσηπτη µηνιγγίτιδα παρουσίαζε τα τυπικά συµπτώµατα και σηµεία της νόσου, όπως πυρετό (98,2%), κεφαλαλγία (78,2%), ναυτία/εµέτους (72,7%), δυσκαµψία αυχένα (47,3%), και φωτοφοβία (28,2%). Άλλα συµπτώµατα ήταν: εξάνθηµα σε 4 ασθενείς και διαταραχές επιπέδου συνείδησης σε 3 ασθενείς. Οι ασθενείς µε εγκεφαλίτιδα παρουσίασαν πυρετό σε αναλογία 92,1%, κεφαλαλγία 92,1%, διαταραχές του επιπέδου συνείδησης 78,6% και ναυτία στο 33,3% των περιπτώσεων. Επιληπτικοί σπασµοί, δυσκαµψία αυχένα και εξάνθηµα δηλώθηκαν σε 6 (21,4%), 5 (18,5%) και 3 (11,1%) ασθενείς αντίστοιχα (Πίνακας 7). Εργαστηριακά ευρήµατα από την ανάλυση του ΕΝΥ υπήρχαν διαθέσιµα για 115/167 ασθενείς, και συγκεκριµένα για 82 περιπτώσεις άσηπτης µηνιγγίτιδας και 33 περιπτώσεις εγκεφαλίτιδας. Κατά την κυτταροχηµική εξέταση του ΕΝΥ παρατηρήθηκε αύξηση των λευκών αιµοσφαιρίων (εύρος /mm 3 ) µε υπεροχή των λεµφοκυττάρων, επίπεδα πρωτεΐνης ελαφρώς αυξηµένα (εύρος mg/dl), ενώ τα επίπεδα γλυκόζης ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων (<60mg/dl). Αναλυτικά, στους ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα, οι τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων στο ΕΝΥ κυµαίνονταν από κύτταρα/mm 3 (µέση τιµή, 240 κύτταρα). Πλειοκυττάρωση (περισσότερα από 5 λευκά αιµοσφαίρια /mm 3 ΕΝΥ) παρατηρήθηκε σε όλους (100%) τους ασθενείς. Η σχέση λεµφοκυττάρων / πολυµορφοπύρηνων ήταν γνωστή σε 71/82 ασθενείς. Υπήρχε υπεροχή των λεµφοκυττάρων (>50%) στο 83,1% (59/71) των περιπτώσεων, ενώ στους υπόλοιπους παρατηρήθηκε υπεροχή των πολυµορφοπύρηνων. Τα επίπεδα πρωτεΐνης στο ΕΝΥ κυµαίνονταν από 18-71

74 298 mg/dl (µέση τιµή, 59 mg/dl), και στις περισσότερες (64,4%) των περιπτώσεων ήταν αυξηµένα >45 mg/dl (ΦΤ mg/dl). Τα επίπεδα της γλυκόζης στο ΕΝΥ ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων (Πίνακας 8). Στους ασθενείς µε εγκεφαλίτιδα οι τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων κυµαίνονταν από κύτταρα/mm 3 ( διάµεση τιµή = 86), µε υπεροχή των λεµφοκυττάρων στις περισσότερες (88,8%) των περιπτώσεων. Η πρωτεΐνη του ΕΝΥ ήταν ελαφρώς αυξηµένη και κυµαίνονταν από mg/dl ( µέση τιµή= 87,4 mg/dl) και η γλυκόζη εντός των φυσιολογικών ορίων Κλινικά χαρακτηριστικά ιογενών λοιµώξεων του ΚΝΣ από εντεροϊούς: Σύγκριση θετικών και αρνητικών περιπτώσεων α. Άσηπτη µηνιγγίτιδα εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στα κλινικά συµπτώµατα και σηµεία, ανάµεσα στις οµάδες παιδιών και ενηλίκων µε λοίµωξη από εντεροϊό, σε σχέση µε τους αρνητικούς ασθενείς. Και τα παιδιά και οι ενήλικες µε λοίµωξη από εντεροϊό είχαν υψηλό πυρετό (100%), πονοκέφαλο (67,7%), ναυτία / εµετούς (58%), δυσκαµψία αυχένα (41,9%) και φωτοφοβία (29,4%). Τρία παιδιά και ένα ενήλικας µε λοίµωξη από εντεροϊό είχαν εξάνθηµα. ιαταραχές επιπέδου συνείδησης είχαν 3 ασθενείς (ένας ενήλικας µε λοίµωξη από εντεροϊό και σε 2 ασθενείς αρνητικοί για εντεροϊό). Τα κλινικά σηµεία και συµπτώµατα των θετικών για εντεροϊό, καθώς και των αρνητικών ασθενών, φαίνονται στο Πίνακα 7. β. Εγκεφαλίτιδα Οι ασθενείς µε λοίµωξη από εντεροϊό είχαν υψηλό πυρετό (100%), κεφαλαλγία (100%), διαταραχές του επιπέδου συνείδησης (80%), ναυτία/εµετούς (60%). Σπασµοί, εξάνθηµα και δυσκαµψία αυχένα αναφέρθηκαν σε 2 (40%), 2 (40%) και 1 (20%) ασθενής αντίστοιχα. εν βρέθηκαν σηµαντικές διαφορές στα συµπτώµατα και σηµεία ανάµεσα στους θετικούς για εντεροϊό και αρνητικούς ασθενείς. 72

75 Πίνακας 7. Κλινικά συµπτώµατα και σηµεία στους θετικούς και αρνητικούς για εντεροϊούς ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα. Κλινικά σηµεία και συµπτώµατα Σύνολο ασθενών (Nο 83) Παιδιά (Nο 52) Ενήλικες (Nο 31) EVs Θετ. No. (%) EVs Αρν. No. (%) EVs Θετ. No. (%) EVs Αρν. No. (%) EVs Θετ. No. (%) EVs Αρν. No. (%) Κεφαλαλγία 21/31 (67.7) 35/52 (76,3) 16/26 (61.5) 18/26 (69,2) 8/8 ( 100) 23/23 (100) Πυρετός 31/31 (100) 51/52 (98) 26/26 (100) 25/26 (96,1) 8/8 ( 100) 23/23 (100) Φωτοφοβία 9/31 (29,4) 16/52(30,7) 7/26 (26.9) 8/26 (30,7) 4/8(50) 10/23(43,5) Ναυτία / εµετοί 18/31 (58) 38/52 (73) 15/26 (57.7) 16/26 (61,5) 6/8 (75) 17/23 (73,9) υσκαµψία αυχένα 13/31(41,9) 25/52 (48) 10/26(38.5) 11/26 (42,3) 3/8 (37,5) 9/23(39,1) Εξάνθηµα 4/31 (12,9) 2/52(3,8) 3/26 (11.5) 4/26 (15,3) 1/8 (12.5) 2/23 (8,7) ιαταραχές επιπέδου συνείδησης 1/31 (3,2) 2/52 (3,8) 0/26 (0) 0/52 (0) 1/8 (12.5) 2/23 (8,7) Σύγκριση εργαστηριακών ευρηµάτων από το ΕΝΥ µεταξύ θετικών και αρνητικών για εντεροϊούς δειγµάτων Το φάσµα των εργαστηριακών ευρηµάτων στο ΕΝΥ στους θετικούς και αρνητικούς για εντεροϊό ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα ή εγκεφαλίτιδα φαίνεται στον πίνακα 8. α. Άσηπτη µηνιγγίτιδα Οι τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων του ΕΝΥ στους θετικούς για εντεροϊό ασθενείς ήταν διαθέσιµες σε 30/33 περιπτώσεις και κυµαίνονταν από κύτταρα/mm 3 (µέση τιµή, 256 κύτταρα). Υπήρχε υπεροχή των λεµφοκυττάρων σε 25 από 30 (83,3%), ενώ σε 5 από 30 (16,7%) των πολυµορφοπύρηνων. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ΕΝΥ κυµαίνονταν από mg/dl (µέση τιµή, 63 mg/dl) και σε 19 από τα 30 (63.3%) δείγµατα ήταν ελαφρά αυξηµένα. Οι τιµές της γλυκόζης του ΕΝΥ κυµαινόταν εντός των φυσιολογικών ορίων για όλα τα διαθέσιµα δείγµατα, θετικά και αρνητικά για εντεροϊό. Στην οµάδα των παιδιών, δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ θετικών και αρνητικών για εντεροϊό δειγµάτων όσο αφορά την ηλικία, 73

76 στις τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων, πρωτεΐνης και γλυκόζης του ΕΝΥ. Στην οµάδα των ενηλίκων, η ηλικία και οι τιµές των λευκών αιµοσφαιρίων του ΕΝΥ ήταν στατιστικώς σηµαντικά υψηλότερες στους θετικούς για εντεροϊό ασθενείς, σε σύγκριση µε τους αρνητικούς. Στην οµάδα των ενηλίκων δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ως προς την πρωτεΐνη και τη γλυκόζη, αν και υπήρχε µία µικρή αύξηση των τιµών πρωτεΐνης στους θετικούς ασθενείς. β. Εγκεφαλίτιδα Στα θετικά για εντεροϊό παιδιά δεν υπήρχαν δεδοµένα ανάλυσης του ΕΝΥ, ενώ στα αρνητικά ήταν διαθέσιµες µόνο οι τιµές πρωτεΐνης και γλυκόζης, οι οποίες και ήταν φυσιολογικές. Στους θετικούς για εντεροϊό ενήλικες, υπήρχε πλειοκυττάρωση του ΕΝΥ µε υπεροχή των λεµφοκυττάρων (100%). Οι τιµές της πρωτεΐνης του ΕΝΥ ήταν αυξηµένες και της γλυκόζης φυσιολογικές. Στο ΕΝΥ των αρνητικών ασθενών υπήρχε πλειοκυττάρωση µε υπεροχή των λεµφοκυττάρων στο 76,9% των περιπτώσεων. Η πρωτεΐνη του ΕΝΥ ήταν ελαφρά αυξηµένη και η γλυκόζη φυσιολογική. Τα επίπεδα του λευκώµατος ήταν σηµαντικά αυξηµένα στους θετικούς για εντεροϊό ενήλικες σε σχέση µε τους αρνητικούς. εν υπήρχαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές σε άλλες παραµέτρους. 74

77 Πίνακας 8. Εργαστηριακή ανάλυση του ΕΝΥ σε 43 θετικούς και 101 αρνητικούς για εντεροϊό ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα ή εγκεφαλίτιδα. Χαρακτηριστικά Ανίχνευση Ηλικία/έτη Εργαστηριακά ευρήµατα από ΕΝΥ ασθενών εντεροϊού m/(r) Λευκά αιµοσφαίρια ΕΝΥ Λεµφοκύτταρα Ουδετερόφιλα Πρωτεΐνη Γλυκόζη mg/dl m (r) 50%, 50, mg/dl (m) No. (%) No. (%) m Οµάδα No. Άσηπτη µηνιγγίτιδα 86 περιπτώσεις Παιδιά (45, 3%) 8,2 (0,06-115) 321 (8-900) 19/24 (79,2%) 5/24(20,8%) 64 (28-122) 56 (33-92) 29 (54, 7%) 5,8 (0,13-15) 302( ) 22/29(78,5%) 6/29 (20,74%) 60,9 (18-298) 55 (31-95) Ενήλικες (27,3%) 45 (30-72) 510 ( ) 7/7 (100%) 0/7 (0%) 74 (45-100) 65 (35-101) 24(72, 7%) 37,5(21-73) 360 ( ) 20/22 (90,9%) 2/22 (9, 1%) 84 (30-160) 54 (36-69) Εγκεφαλίτιδα 58 περιπτώσεις Παιδιά 12 +3/12 (25%) 14,5 (14-15) Μ Μ Μ Μ Μ 9/12 (75%) 5,4(1,3-15) 14 (2-39) Μ Μ 33,6 (22-45) 62 (49-81) Ενήλικες 46 +7/46 (15,2 %) 41,3 (25-58) 122 (30-220) 4/4 (100%) 0/4 (0%) 139 (58-200) 57 (45-83) 39/46 (84,8%) 49,3 (17-78) 98 (1-350) 19/24 (79,2 %) 5/24 (20,8%) 73,9 (20-198) 58 (24-140) Μ : µη διαθέσιµα, m:µεσή τιµή, r:εύρος, P< 0,05, +: θετικό αποτέλεσµα, -:αρνητικό αποτέλεσµα 75

78 5. 5. Επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών µε λοιµώξεις από εντεροϊούς Συνολικά, καλλιεργητική αποµόνωση και/ή RT-PCR για εντεροϊό ήταν θετική σε 45 από τις 167 (26,9%) περιπτώσεις λοιµώξεων του ΚΝΣ. Η αναλογία αρρένων / θηλέων ήταν 2,46:1. Από τις 45 θετικές περιπτώσεις οι 33 ήταν ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα. Είκοσι τέσσερα (72,7%) ασθενείς ήταν παιδιά ηλικίας µικρότερης των 15 ετών, και οι υπόλοιποι 9 (27,3%) ήταν ενήλικες. Τα περισσότερα από τα παιδιά 16 από τα 24 (66,7%) ήταν ηλικίας από 5-15 ετών, 4 (16,7%) ήταν ηλικίας από 1-5 ετών και 4 (16,7%) µικρότερης του ενός έτους. Τα παιδιά-ασθενείς ήταν κυρίως αγόρια (15 από τα 24, 62,5%) και η αναλογία αρρένων / θηλέων ήταν 1,66: 1. Από τους 33 ενήλικες µε άσηπτη µηνιγγίτιδα, 9 (27,3%) βρέθηκαν θετικοί για εντεροϊό, από τους οποίους 7 ήταν άνδρες. Από τις 60 περιπτώσεις (12 παιδιά, 46 ενήλικες και 2 µε άγνωστη ηλικία) ασθενών µε εγκεφαλίτιδα, 10 (16,6%) βρέθηκαν θετικές για εντεροϊό, από τις οποίες οι 3 ήταν παιδιά κάτω των 15 ετών (25%) και οι 7 (75%) ήταν ενήλικες. ύο από τους 21 ασθενείς µε άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ βρέθηκαν θετικοί για εντεροϊό. Ο ένας παρουσίαζε παραπάρεση και ήταν άνδρας ηλικίας 73 ετών και ο άλλος ήταν γυναίκα ηλικίας 43 ετών µε µη ειδική λοίµωξη του ΚΝΣ (Σχήµα 4). 4% 22% άσηπτη µηνιγγίτιδα εγκεφαλίτιδα άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ 74% Σχήµα 4: Κατανοµή λοιµώξεων του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος από εντεροϊούς 76

79 5. 6. Έκβαση Η βαρύτητα των περιπτώσεων άσηπτης µηνιγγίτιδας στη µελέτη µας ήταν ελαφρά έως µέτρια και η τελική έκβαση ήταν γενικά καλή, χωρίς θανάτους και επιπλοκές. Οι περιπτώσεις εγκεφαλίτιδας από εντεροϊό ήταν πιο σοβαρές. ύο περιπτώσεις κατέληξαν, η µία αφορούσε ένα παιδί 15 ετών υπό ανοσοκαταστολή λόγω υποκείµενης νόσου (λέµφωµα) και η άλλη µία γυναίκα 58 ετών µε προοδευτική επιδεινούµενη εγκεφαλίτιδα. Ένας άλλος ασθενής 55 ετών χρειάστηκε διασωλήνωση και νοσηλεία στη µονάδα εντατικής θεραπείας. Οι υπόλοιπες περιπτώσεις είχαν καλή έκβαση Εποχιακή κατανοµή των λοιµώξεων από εντεροϊό Η εποχιακή κατανοµή των λοιµώξεων του ΚΝΣ από εντεροϊό που επιβεβαιώθηκαν µε RT-PCR ή/και καλλιεργητική αποµόνωση φαίνεται στο Σχήµα 5. Από τις 45 θετικές για εντεροϊό περιπτώσεις που διαγνώσθηκαν την περίοδο της µελέτης, οι 36 περιπτώσεις (80%) συνέβηκαν την περίοδο άνοιξηςκαλοκαιριού και φθινοπώρου (Μάρτιος-Νοέµβριος), ενώ οι 9 περιπτώσεις (20%) την περίοδο των ψυχρών µηνών ( εκέµβριος-φεβρουάριος). Μία µικρή επιδηµία άσηπτης µηνιγγίτιδας παρατηρήθηκε κατά την περίοδο της µελέτης στην πόλη της Πάτρας. Η επιδηµία αυτή άρχισε τον Ιούλιο, κορυφώθηκε τον Οκτώβριο (4 περιπτώσεις), και τελείωσε το εκέµβριο. Έτσι, η διακύµανση στη συχνότητα ακολούθησε το τυπικό µοντέλο των εντεροϊών, µε υψηλότερη συχνότητα το καλοκαίρι και φθινόπωρο κατά τα τρία χρόνια της µελέτης. 77

80 Μάρτιος 04 Απρίλιος 04 Μάϊος 04 Ιούνιος 04 Ιούλιος 04 Αύγοστος 04 Σεπτέµβριος 04 Οκτώµβριος 04 Νοέµβριος 04 εκέµβριος 04 Ιανούαριος 05 Φεβρουάριος 05 Μάρτιος 05 Απρίλιος 05 Μάϊος 05 Ιούνιος 05 Ιούλιος 05 Αύγοστος 05 Σεπτέµβριος 05 Οκτώµβριος 05 Νοέµβριος 05 εκέµβριος 05 Ιανούαριος 06 Φεβρουάριος 06 Μάρτιος 06 Απρίλιος 06 Μάϊος 06 Ιούνιος 06 Ιούλιος 06 Αύγοστος 06 Σεπτέµβριος 06 Αρθµός Μήνας Σχήµα 5. Εποχιακή κατανοµή λοιµώξεων του ΚΝΣ στην Ελλάδα, την περίοδο Μάρτιος Σεπτέµβριος Αποτελέσµατα από την αποµόνωση του ιού και τη δοκιµασία εξουδετέρωσης α. Αποµόνωση του ιού Στις περιπτώσεις όπου υπήρχε διαθέσιµη επαρκής ποσότητα ΕΝΥ, εφαρµόστηκαν οι διαδικασίες αποµόνωσης του ιού. Συνολικά 75 δείγµατα ΕΝΥ (49 από άσηπτη µηνιγγίτιδα και 26 από εγκεφαλίτιδα) ενοφθαλµίστηκαν στις κατάλληλες κυτταρικές σειρές (Hep-2 και RD cells). Εντεροϊοί αποµονώθηκαν από 11 από τα 49 (22,5%) δείγµατα άσηπτης µηνιγγίτιδας, 9 από δείγµατα Ελλήνων ασθενών και 2 από δείγµατα ασθενών από την Παλαιστίνη. εν αποµονώθηκε εντεροϊός από κανένα δείγµα εγκεφαλίτιδας, ενώ δεν ενοφθαλµίστηκε κανένα δείγµα µε άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ. Τέσσερα στελέχη εντεροϊών αποµονώθηκαν σε κύτταρα Hep-2, ενώ άλλα 7 στελέχη αποµονώθηκαν µόνο σε RD κύτταρα. Κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις (αποµόνωση ιού) παρατηρήθηκαν από την 3 η 12 η ηµέρα (µέση διάρκεια 5 ηµέρες). Οκτώ στελέχη εντεροϊών αποµονώθηκαν από παιδιά < 15 ετών και άλλα τρία από ενήλικες. 78

81 Στο Σχήµα 6 φαίνονται οι κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις που οι εντεροϊοί προκαλούν στα Hep-2 και RD κύτταρα σε σύγκριση µε τους µάρτυρες φυσιολογικών κυττάρων. Α1 Α2 Β1 Β2 Σχήµα 6. Κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις χαρακτηριστικές των εντεροϊών σε Hep-2 και RD κύτταρα σε σύγκριση µε τους µάρτυρες κυττάρων. Α1: Μάρτυρας RD κυττάρων, Α2: RD κύτταρα µολυσµένα µε τον ιό Echo11, B1: Μάρτυρας Hep-2 κυττάρων, Β2: Hep-2 κύτταρα µολυσµένα µε τον ιό Coxsackie B5. β. Αποτελέσµατα τυποποίησης µε τη δοκιµασία εξουδετέρωσης. Στα 11 στελέχη εντεροϊών που αποµονώθηκαν, επιχειρήθηκε η τυποποίηση µε τη δοκιµασία εξουδετέρωσης, κάνοντας χρήση δεξαµενών ίππειων αντιορών (RIVM/ National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands). Εφαρµόζοντας τη δοκιµασία εξουδετέρωσης, 9 από τα 11 στελέχη τυποποιήθηκαν και περιλάµβαναν: 79

82 4 στελέχη ιού Coxsackie Β (από Έλληνες ασθενείς), 3 στελέχη ιού Echo 6 (2 από Έλληνες ασθενείς και 1 από Παλαιστίνιο ασθενή), 1 στέλεχος ιού Echo 11 (από Έλληνα ασθενή), και 1 στέλεχος ιού Echo 14 (από Παλαιστίνιο ασθενή). ύο στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα δεν ήταν δυνατόν να τυποποιηθούν µε τις δοκιµασίες εξουδετέρωσης µε τους συγκεκριµένους αντιορούς και τα στελέχη χαρακτηρίσθηκαν ως µη τυποποιηθέντα. Ένα από τα δύο αυτά στελέχη είχε αποµονωθεί το Σεπτέµβριο του 2003 από ένα κορίτσι ηλικίας 12 ετών, κατοίκου περιοχής Θεσσαλονίκης, ενώ το δεύτερο στέλεχος είχε αποµονωθεί τον Ιανουάριο του 2006 από ένα αγόρι ηλικίας 13 ετών, κατοίκου περιοχής Πάτρας. Τα 4 στελέχη των ιών Coxsackie B αποµονώθηκαν σε κύτταρα Hep-2, ενώ τα στελέχη των εντεροϊών Echo 6, Echo11, Echo14, καθώς και τα δύο µη τυποποιηθέντα στελέχη αποµονώθηκαν µόνο σε RD κύτταρα Αποτελέσµατα ορολογικών µεθόδων για την ανίχνευση αντισωµάτων Από τις 201 περιπτώσεις λοιµώξεων του ΚΝΣ, µόνο στις 88 υπήρχε διαθέσιµο δείγµα ορού της οξείας φάσης της νόσου και το οποίο εξετάστηκε για ανίχνευση IgM και IgG αντισωµάτων έναντι των ιών Coxsackie της οµάδας Β και ιών Εcho µε τη µέθοδο Elisa. Συνολικά, IgM αντισώµατα ανιχνεύτηκαν σε 11 (12,5%) από τα 88 δείγµατα ορού. Επτά (25.9%) από αυτά προέρχονταν από 27 ασθενείς µε µηνιγγίτιδα και θετική αποµόνωση/ανίχνευση εντεροϊού (για τους υπόλοιπους 21 ασθενείς µε θετική αποµόνωση/ανίχνευση δεν υπήρχε διαθέσιµος ορός), ενώ 4 (6,5%) από αυτά προέρχονταν από τους 61 ασθενείς µε αρνητική αποµόνωση/ανίχνευση εντεροϊού (τρεις ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα και µία µε εγκεφαλίτιδα). 80

83 Αποτελέσµατα µοριακών µεθόδων α. Εφαρµογή της RT-nested PCR για την ενίσχυση της VP1-2A περιοχής Η RT- npcr που είχε στόχο τη VP1-2A περιοχή του γονιδιώµατος του ιού εφαρµόστηκε απευθείας σε όλα τα δείγµατα ΕΝΥ των 201 ασθενών. Από τα 167 δείγµατα ΕΝΥ Ελλήνων ασθενών, 44 (26,6%) βρέθηκαν θετικά για εντεροϊούς. Μόνο σε ένα δείγµα η PCR ήταν αρνητική ενώ η κυτταροκαλλιέργεια ήταν θετική. Στην περίπτωση αυτή ο ιός ανιχνεύθηκε µε την RT-PCR στο υπερκείµενο της κυτταροκαλλιέργειας. Αναλυτικά, 32 θετικά δείγµατα προερχόταν από 86 (37,2%) ασθενείς µε άσηπτη µηνιγγίτιδα, 10 από 60 (16,6%) ασθενείς µε εγκεφαλίτιδα και 2 από 21 (9,5%) ασθενείς µε άλλη λοίµωξη του ΚΝΣ. Όσον αφορά την οµάδα των ασθενών µε άσηπτη µηνιγγίτιδα από την Παλαιστίνη, 3 από τους 34 (8,8%) βρέθηκαν να έχουν λοίµωξη µε εντεροϊό. Στο Σχήµα 7 φαίνεται το αποτέλεσµα της µεγέθυνσης θετικών περιπτώσεων µετά ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Σχήµα 7. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης προϊόντος της RT-PCR µε στόχο τη VP1-2A περιοχή (~ 609) του RNA γονιδιώµατος του εντεροϊού από περιπτώσεις άσηπτης µηνιγγίτιδας, κατά την περίοδο της µελέτης. N: αρνητικός µάρτυρας, L:δείκτης µοριακών βαρών (100bp), Σειρές: 131a, 132a, 133a, 134a και 135a θετικά δείγµατα ΕΝΥ από περιπτώσεις άσηπτης µηνιγγίτιδας. 81