Νεότερες Γενετικές & Μοριακές Τεχνικές στην Ανδρολογία

Transcript

1 EAA-Εκπαιδευτικό κέντρο Θεσσαλονίκης Μαθήµατα ανδρολογίας Νεότερες Γενετικές & Μοριακές Τεχνικές στην Ανδρολογία ΣΤΕΦΑΝΙΑ ΛΥΜΠΕΡΗ, MSc, PhD

2 OVERVIEW Ενδείξεις για γενετικό έλεγχο στην ανδρολογία Είδη ΓΝΩΣΤΩΝ γενετικών ανωµαλιών-τρόπος ανίχνευσης Αλγόριθµος για γενετικά τεστ Ανερχόµενες τεχνολογίες Γενετική συµβουλευτική

3 Ενδείξεις για γενετικό έλεγχο Διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου Οικογενειακό ιστορικό (επαναλαµβανόµενες αποβολές) Υπογονιµότητα Σοβαρή ολιγοζωοσπερµία ή αζωοσπερµία (6-10% των υπογόνιµων ανδρών έχουν κάποια γενετική ανωµαλία) Ανεξήγητη υπογονιµότητα?

4 Είδη διαθέσιµων γενετικών τεστ Κυτταρογενετικές µέθοδοι- Καρυότυπος «Μοριακός Καρυότυπος», acgh FISH - Florescene in sit hybridization Ανευπλοειδίες σπερµατοζωαρίων PCR µικροελλείψεις χρωµοσώµατος Υ Αλληλούχιση γονιδίων Kallman syndrome, Cystic fibrosis Whole genome seqencing

5 Γνωστές γενετικές ανωµαλίες Μη φυσιολογικός Καρυότυπος (~7%) v Φυλετικά χρωµοσώµατα (Kleinefelter syndrome) v Αµοιβαία ή Robertsonian µετάθεση Μικροελλείψεις του χρωµοσώµατος Y (~7,5%) Μεταλλάξεις σε µεµονωµένα γονίδια (κυστική ίνωση, Kallmann syndrome)

6 Μη φυσιολογικός καρυότυπος Kleinefelter syndrome (47,XXY) v v v 46, ΧΧ v 1:500 1:1000 γεννήσεις αρρένων 50% ανεύρεση σπερµατοζωαρίων µε TESE 48, ΧΧΧΥ, 48ΧΧΥΥ µετάθεση τµήµατος του της περιοχής SRY του Υ χρωµοσώµατος 47, ΧΥΥ (1:1000) Ring Y chromosome Ισοκεντρικό Υ χρωµόσωµα Αµοιβαίες ή Robertsonian µετατοπίσεις v v 1:1000 γεννήσεις 10 φορές πιο συνχές σε άνδρες µε υπογονιµότητα

7 Καρυότυπος - Kleinefelter syndrome

8 Καρυότυπος-Robertsonian µεταθέσεις

9 ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΣ Πλεονεκτήµατα v Μπορούµε να δούµε ολόκληρο το γονιδίωµα v Μπορούµε να δούµε µεµονωµένα κύτταρα και µεµονωµένα χρωµοσώµατα Μειονεκτήµατα v Η ανάλυση περιορίζεται στα 5Mb v Απαιτείται καλλιέργεια κυττάρων

10 array Comparative Genomic Hybridization (acgh)-μοριακός Καρυότυπος Μοριακή-κυτταρογενετική τεχνική γενωµικού ιβριδισµού για την ανάλυση του αριθµού αντιγράφων (gains/losses) στο περιεχόµενο του DNA ενός συγκεκριµένου δείγµατος Η τεχνική συγκρίνει την ποσότητα του DNA που βρίσκεται σε κάθε χρωµόσωµα ενός µοναδικού κυττάρου µε αυτήν ενός φυσιολογικού προτύπου δείγµατος Επιτρέπει την αξιολόγηση και των 23 ζεύγων χρωµοσωµάτων σε ένα κύτταρο σε ένα µόνο πείραµα Γρήγορα αποτελέσµατα Καταλήγουµε µε έναν µεγάλο όγκο πληροφοριών που θα πρέπει να αναλυθεί µε το κατάλληλο λογισµικό

11 array Comparative Genomic Hybridization (acgh)-μοριακός Καρυότυπος Patient DUPLICATION DELETION

12 array Comparative Genomic Hybridization (acgh)-μοριακός Καρυότυπος Δεν µπορούν να ανιχνευτούν ισοζυγισµένες µεταθέσεις Δεν µπορεί να ανιχνεύσει αλλαγές στον αριθµό σε περιοχές του γονιδιώµατος που δεν υπάρχουν στην πλατφόρµα του χρησιµοποιείται Μπορεί να αποκαλύψει αλλαγή στον αριθµό περιοχών αµφιβόλου κλινικής σηµασίας Δεν µπορεί να ανιχνεύσει µωσαϊκισµό Είναι πολύ χρήσιµος για ανεξήγητες µαθησιακές δυσκολίες, διανοητική καθυστέρηση, προβλήµατα συµπεριφοράς και αυτισµό

13 Ανευπλοειδίες σπερµατοζωαρίων - FISH Floresence in sit hibridization (FISH) Επαναλαµβανόµενες αποβολές Αποτυχηµένες προσπάθεις εξωσωµατικής Ανεξήγητη υπογονιµότητα Μωσαϊκισµός στα γενετικά κύτταρα

14 Μικροελλείψεις χρωµοσώµατος Υ Η πρώτη περιγραφή έγινε to1976 Tiepolo and Zffardi AZF (Azoospermia Factor) è AZFa, AZFb and AZFc Yq11 ευχρωµατινική περιοχή Τουλάχιστον 26 γονίδια έχουν περιγραφεί

15 Επιπολασµός µικροελλείψεων Υ Αζωοσπερµία ή σοβαρή ολιγοζωοσπερµία <5x10 6 /ml

16 Χρωµόσωµα Υ Γενετικοί δείκτες Eropean Academy of Andrology (EAA) and the Eropean Moleclar Genetics Qality Network (EMQN)

17 Μικροελλείψεις Υ PCR Lane 1: Ladder Lane 2: Negative control (water) Lane 3: Female DNA Lane 4: Normal male DNA Lane 5: AZFb deletion Lane 6: AZFc deletion

18 AZFa ελλείψεις Μέγεθος ~1100kb Η πιο σπάνια έλλειψη (0,5-4%) Περιλαµβάνει δύο γονίδια USP9Y(DFFRY) DDX3Y (DBY) Πλήρης έλλειψη της περιοχής οδηγεί σε Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS) και αζωοσπερµία Διάγνωση è πρακτικά καµία πιθανότητα ανεύρεσης σπερµατοζωαρίων µε TESE

19 AZFb και AZFbc ελλείψεις Μέγεθος 6,5Mb και 7,7Mb ή 7Mb αντίστοιχα Επιπολασµός 1-5% και 1-3% αντίστοιχα 24 γονίδια σε πολλαπλά αντίγραφα (συνολικά 46 αντίγρaφα) Πλήρης έλλειψη AZFb και AZFbc προκαλεί SCOS ή αναστολή σπερµατογένεσης Διάγνωση à ελάχιστες πιθανότητες ανεύρεσης σπερµατοζωαρίων µε TESE (έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία spermatid arrest και κρυπτο/ολιγοζωοσπερµία)

20 AZFc ελλείψεις Μέγεθος 3,5Mb Η πιο συχνή έλλειψη (80%) Ο κλινικός και ιστολογικός φαινότυπος ποικίλει Μπορεί να υπάρχει σπερµατογένεση και οι άνδρες αν και έχουν σοβαρή ολιγοζωοσπερµία µπορεί σε σπάνιες περιπτώσεις να κληροδοτήσουν την έλλειψη Σε περιπτώσεις αζωοσπερµίας 50% πιθανότητα ανεύρεσης σπερµατοζωαρίων µε TESE

21 Γονίδια χρωµοσώµατος Υ Gene symbol Gene name AZF location (amplicon nit) Role in the male germline Homologos genes (location) USP9Y Ubiqitin specific peptidase 9, Y-linked AZFa Involved in protein trnover in spermatogenesis (?) USP9X (X chr.) DDX3Y DEAD (Asp-Gl-Ala-Asp) box polypeptide 3, Y-linked AZFa RNA metabolism in pre-meiotic germ cells (dedced by similarity) DDX3X (X chr.) CYorf15A CYorf15B Chromosome Y open reading frame 15A/B AZFb n/a CXorf15 (X chr.) RPS4Y2 Ribosomal protein S4, Y-linked 2 AZFb Reglation of mrna binding to the ribosome dedced by similarity) RPS4Y1 (Y chr.) RPS4X (X chr.) EIF1AY Ekaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked AZFb Reglation of translation initiation(dedced by similarity) EIF1AX (X chr.) KDM5D Lysine (K)-specific demethylase 5D AZFb Chromatin remodelling in meiosis KDM5C (X chr.) XKRY XKRY2 XK, Kell blood grop complex sbnit-related, Y-linked/2 XKRY: AZFb (yel3) XKRY2: AZFb (yel4) Gamete interaction (?) HSFY1 HSFY2 Heat shock transcription factor, Y-linked 1/2 HSFY1: AZFb (b5) HSFY2: AZFb (b6) Gene expression reglation (?) HSFX1 (X chr.) HSFX2 (X chr.) PRY PRY2 PTPN13-like, Y-linked/2 PRY: AZFb (b1) PRY2: AZFb/c (b2) Germ cell apoptosis (?) RBMY1A1 RNA binding motif protein, Y-linked, family 1, member A1 6 fnctional copies in AZFb, 2 of them in amplicon nits (t1 and t2) RNA splicing and metabolism, signal transdction and meiotic reglation RBMX (X chr.) RBMXL1(Chr. 1) RBMXL2(Chr. 11) RBMXL9(Chr.9) BPY2 BPY2B BPY2C Basic charge, Y-linked, 2 B/C BPY2: AZFb/c (g1) BPY2B: AZFb/c (g2) BPY2C: AZFc (g3) Reglation of the cyto skeletal network (?) CDY1 CDY2 Chromodomain protein, Y-linked, 1/2 CDY1A: AZFb/c (yel1) CDY1B: AZFc (yel2) CDY2A: AZFb (yel3) CDY2B: AZFb (yel4) Gene expression reglation and and post-meiotic nclear remodelling CDYL (Chr. 6) CDYL2 (Chr. 16) DAZ1 DAZ2 DAZ3 DAZ4 Deleted in azoospermia 1/2/ 3/4 DAZ1: AZFb/c (r1) DAZ2: AZFb/c (r2) DAZ3: AZFc (r3) DAZ4: AZFc (r4) Pre-meiotic reglation of transcript transport/storage, translation initiation and protein interaction DAZL (Chr. 3) BOLL (Chr. 2) Navarro-Costa, P et al, 2010

22 Μεταλλάξεις σηµείου Αλληλούχιση γονιδίου

23 Μεταλλάξεις σηµείου Αλληλούχιση γονιδίου

24 Μεταλλάξεις σηµείου Αλληλούχιση γονιδίου Κυστική ίνωση Αυτοσωµικός υπολοιπόµενος τρόπος κληρονόµησης Χρωµόσωµα 7q31.2 Επιπολασµός 1:2500 Μεταλλάξεις στο γονίδιο του CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Condctance Reglator) Διαµεµβρανική πρωτείνη που λειτουργεί ως κανάλι ιόντων χλωρίου

25 Κυστική ίνωση Εκ γενετής απουσία του σπερµατικού πόρου στο 70-80% των περιπτώσεων συσχετίζεται µε µεταλάξεις στο γονίδιο της κυστικής ίνωσης Ενδείξεις Αζωοσπερµία Χαµηλό ph Χαµηλή φρουκτόζη Απουσία σπερµατικού πόρου

26 Κυστική ίνωση Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων ανινχεύεται µία µετάλλαξη στο γονίδιο CFTR Σε ελάχιστες περιπτώσεις οι ασθενείς είναι οµόζυγοι για µία µετάλλαξη και Στις υπόλοιπες είναι φορείς δύο διαφορετικών µεταλλάξεων (compond heterozygotes) Με συχνότερο τον συνδυασµός του 5Τ αλληλόµορφου (απουσία εξονίου 9 è χαµηλή έκφραση λειτουργικής πρωτεΐνης) και της πιο κοινής µετάλλαξης ΔF508 στο άλλο αντίγραφο Ο γενετικός έλεγχος συνήθως περιλαµβάνει την αναζήτηση µεταλλάξεων

27 Γενετικά σύνδροµα και υπογονιµότητα

28

29 Ανερχόµενες τεχνολογίες Metabolomics Transcriptomics Proteomics

30 Ανερχόµενες τεχνολογίες - Μεταβολοµική Μελέτη των µικρού µοριακού βάρους µεταβολιτών ενός βιολογικού συστήµατος Οι πιο καλά µελετηµένοι µεταβολίτες είναι τα reactive oxygen species (ROS) Υψηλή συγκέντρωση ελεύθερων ριζών σε άνδρες µε υπογονιµότητα Υψηλή συγκέντρωση ελεύθερων ριζών è Οξειδωτικό στρες è κατακερµατισµό του DNA è Απόπτωση

31 TUNEL (Terminal deoxyncleotidyl transferase dutp nick end labeling) Παθολογικό εαν DFI>20% Θεραπεία è αγωγή µε αντιοξειδωτικές ουσίες

32 Ανερχόµενες τεχνολογίες - mirna Μικρά µη κωδικά RNA που εµπλέκονται στην γονιδιακή σίγηση και στον µετα- µεταγραφικό έλεγχο της έκφρασης γονιδίων Χρησιµοποιώντας µικροσυστοιχίες mirna (mirna microarray assays) και qrt-pcr έχουν βρεθεί διαφορές στην έκφραση των mirna µεταξύ αζωοσπερµικών και φυσιολογικών ανδρών Αλλά και µεταξύ φυσιολογικών ανδρών και ολιγοασθενοζωοσπερµιών ανδρών

33 Ανερχόµενες τεχνολογίες Proteomics

34 Ανερχόµενες τεχνολογίες Μεθυλίωση του DNA Επιγενετική è ρύθµιση έκφρασης γονιδίων µεθυλίωση è σίγηση γονιδίων Διαταραχές στην µεθυλίωση του DNA στα σπερµατοζωάρια οδηγεί σε ολιγοζωοσπερµία, ασθενοζωοσπερµία και τερατοζωοσπερµία Προγνωστική αξία για την έκβαση της κύησης Παρεκλίνουσα µεθυλίωση συγκεκριµένων γονιδίων όπως των IGF2/H19 και MEST σε ολιγοζωοσπερµικούς άνδρες Recently, hyper methylation of promoters of several genes inclding MTHFR, PAX8, NTF3, SFN, HRAS, JHM2DA, IGF2, H19, RASGRF1, GTL 2, PLAG1, D1RAS3, MEST, KCNQ1, LIT1 and SNRPN have been reported to be associated with poor semen parameters or male infertility

35 NEXT GENERATION SEQUENCING Και τα 46,XY χρωµοσώµατα µπορούν να ελεγχθούν ταυτόχρονα Μπορούν να ελεγχούν ταυτόχρονα ποικιλία µονογονιδιακών ασθενειών Περιορίζονται τα λάθη καθώς από την πρώτη στιγµή σε κάθε δείγµα δίνεται ένας µοριακός κώδικας Η αλληλούχηση DNA περιγράφεται σας µέθοδος αναφοράς (model for others), κυρίως λόγω του άµεσου διαβάσµατος του DNA χωρίς τη µεσολάβηση ανιχνευτών Χαµηλότερο κόστος

36 NEXT GENERATION SEQUENCING

37

38

39

40

41

42

43

44

45 Dring replication, each addition of a dntp releases pyrophosphate In the reaction mixtre, PPi allows adenosine phosphoslfate (APS) to be converted to ATP; this ATP allows lciferase to lciferate (emit light). Add datp. If light is emitted, yor seqence starts with A. If not, the datp is degraded (or eltes past immobilized primer). Add dgtp. If light is emitted, the next base mst be a G. Measres strand extension as it happens

46

47

48

49 Γενετική συµβουλευτική Γενετικές ανωµαλίες è Κίνδυνος µεταβίβασης στις επόµενες γενιές Γενετικές τεχνικές είναι χρήσιµες όχι µόνο για την εύρεση της αιτίας της υπογονιµότητας αλλά και για την ενηµέρωση και απόφαση των µελλοντικών γονέων ICSI έδωσε τη δυνατότητα σε πολλούς υπογόνιµος άνδρες να γίνουν µπαµπάδες Πιθανότητες έρευσης σπερµατοζωαρίων µε TESE Έλεγχος άλλων µελών της οικογένειας

50 Γενετική συµβουλευτική Γνωστές γενετικές ανωµαλίες è Προεµφυτευτικός έλεγχος Άγνωστες γενετικές αιτίες και µελλοντικές επιπτώσεις Χρήση νέων τεχνολογιών για την έρευση περαιτέρω και επιγενετικών γενετικών µεταλλάξεων που προκαλούν υπογονιµότητα

51 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ