تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

Transcript

1 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى دليل المختبر الطبعة الثانية Steve Kitchen Angus McCraw Marión Echenagucia

2 صد ر عن االحتاد العاملي للهيموفيليا (WFH) World Federation of Hemophilia World Federation of Hemophilia, 2012 يشجع االحتاد العاملي للهيموفيليا على إعادة توزيع مطبوعاته ألغراض تعليمية من قبل املنظمات غير الربحية للهيموفيليا/ واضطرابات النزف. لغرض احلصول على ترخيص بإعادة طبع أو إعادة توزيع أو ترجمة هذه املطبوعة يرجى االتصال بقسم التواصل على العنوان التالي. تتوفر هذه املطبوعة على شكل ملف PDF باللغات اإلجنليزية والفرنسية واألسبانية والعربية والروسية والصينية على موقع االحتاد العاملي للهيموفيليا. ميكن طلب مطبوعات إضافية من: World Federation of Hemophilia 1425 René Lévesque Boulevard West, Suite 1010 Montréal, Québec H3G 1T7 CANADA Tel.: (514) Fax: (514) Internet:

3 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى دليل المختبر الطبعة الثانية Marión Echenagucia )مشارك في تأليف كتاب األمتتة( Banco Municipal de Sangre del D.C. Universidad Central" de Venezuela Caracas, Venezuela Angus McCraw أخصائي تدريب املختبرات في االحتاد العاملي للهيموفيليا )WFH( Katharine Dormandy Haemophilia Centre" and Thrombosis Unit The Royal Free Hospital London, U.K. Steve Kitchen أخصائي تدريب املختبرات في االحتاد العاملي للهيموفيليا )WFH( Sheffield Haemophilia and Thrombosis Centre Royal Hallamshire Hospital Sheffield, U.K. نيابة عن جلنة علوم املختبرات في االحتاد العاملي للهيموفيليا )WFH( الرئيس :)2010( U.K. Steve Kitchen, Sheffield, نائب الرئيس: Sukesh Nair, Vellore, India متت مراجعة هذه الطبعة من قبل الذوات التالية أسماؤهم الذين كانوا وقت الكتابة أعضاء جلنة املختبرات في االحتاد العاملي للهيموفيليا :)WFH( Clarence Lam Mansoor Ahmed Sukesh Nair Norma de Bosch Alison Street Ampaiwan Chuansumrit Alok Srivastava Marión Echenagucia Andreas Hillarp كما متت مراجعة بعض األقسام من قبل أعضاء االحتاد العاملي ملرض هيموفيليا )فون ويلبراند( وجلنة اضطرابات النزف النادرة. شكر وتقدير: يعتمد عدد من األساليب املذكورة على اإلجراءات املعيارية لتشغيل املختبرات التي قامت بصياغتها أنيت بوير من مركز شيفيلد ألمراض الهيموفيليا ونود التعبير هنا عن تقديرنا وعرفاننا ملساهمتها في ذلك. كما يعب ر االحتاد العاملي للهموفيليا WFH عن امتنانه لسهير عيد رئيسة قسم التخثر وأمراض الدم اجلزيئية والوراثة اخللوية في مركز األميرة إميان للبحوث وعلوم املختبرات ومركز امللك حسني الطبي عمان األردن ملراجعة هذه الترجمة. مالحظة حتذيرية: حيثما يرد مصدر جتاري في هذا الدليل فهو على سبيل املثال املناسب في وقت الكتابة وليس القصد منه توصية من قبل االحتاد العاملي للهيموفيليا )WFH( أو من املؤلف أو من جلنة علوم املختبرات في.)WFH( كما أنه ال يعني أن املصادر األخرى غير موثوقة أو غير مناسبة بأي شكل من األشكال. قد تقوم الشركات املصنعة للمواد املستخدمة في فحوصات املختبرات بتغيير تركيبة املواد لذا فإن االعتمادية املستقبلية لهذه املصادر غير معروفة في وقت الكتابة. معلومات االتصال باملؤلفني:

4

5 المحتويات 1 1. معدات املختبرات 3 2. التحقق من املاصة ومعايرة توازن قياس الوزن 5 3. سالمة املختبر جمع العينات واملتغيرات ما قبل التحليلية مراقبة اجلودة الداخلية وتقييم اجلودة اخلارجي تقنية األنبوب املائل يدويا إعداد ومعايرة البالزما الطبيعية املجمعة تأسيس نطاق مرجعي اعتيادي 27.9 الكواشف تعداد الصفائح زمن النزف زمن البروثرومبني )PT( زمن الثرومبوبالستني املنش ط جزئيا )APTT( مزج االختبارات ملزيد من التحقيق عن )PT( و) APTT ( غير الطبيعي زمن تخث ر الثرومبني زمن الثرومبني في وجود كبريتات البروتامني لكشف وجود الهيبارين زمن الريبتياليز الفيبرينوجني )مقايسة كالوس املعدلة( إزالة الهيبارين من البالزما مقايسة مضاد الفيبرينوجني بواسطة الفحص الشعاعي املناعي )RID( مراقبة العامل )XIII( املقايسات املعتمدة على أساس زمن البروثرومبني )العوامل X( VII V II

6 23. مقايسات العوامل املعتمدة على أساس )APTT( )مقايسة مرحلة واحدة من 66 ]FXII أو FXI FIX C:FVIII[ 24. مقايسات العامل )VIII:C( في الراسب القري )كريوبريسيبيتات( مقايسات التخثر على مرحلتني للعامل )VIII:C( إنتاج الكاشف املجتمع ملقايسة العامل )VIII:C( ذات املرحلتني مقايسة كروموجينيك للعلمل )VIII:C( 75 "27. املقايسة الداخلية ذات املرحلة الواحدة للبريكاليكرين )PKK( وملولد الكينينوجني ذي الوزن اجلزيئي العالي )HMWK( مراقبة مثبط معامل التخثر املعتمد على )APTT( 80 "29. فعالية العامل املساعد ريستوسيتني/ فعالية العامل فون ويلبراند )فعالية RCo( )VWF: أو ))VWF( إعداد الصفائح املستقرة مولد مضاد العامل فون ويليبراند بواسطة تقنية (VWF:AG( )ELISA) مقايسة ربط الكوالجني لعامل فون ويلبراند )VWF:CB( مقايسة ربط العامل )VIII( لتشخيص مرض فون ويلبراند نورماندي حتليل )VWF( مولتيمر )Multimer( القياس الكمي ملثبطات العامل )VIII( مقايسة مثبط العامل )IX( مقايسة فعالية العامل )XIII( مضاد تخثر الذئبة واألجسام املضادة للفسفوليبيد تخفيف راسيل لوقت سم األفعى )DRVVT( إعداد الصفائح املغسولة ل )DRVVT( اختبار وظائف الصفائح انكماش اجللطة قياس تراكم الصفائح جتفيف البالزما بتجميدها )ليوفياليزيشن( تقييم واستخدام مقاييس التخثر التحليل اجلزيئي الوراثي 142

7 1 معدات المختبرات سيتطلب أي مختبر يشترك في تشخيص وعالج اضطرابات النزيف باستخدام بعض من أو جميع التقنيات الوارد وصفها في هذا الدليل احلد األدنى من املعدات األساسية. علما بأنه سيتم تناول التقييم واستخدام مقاييس التخثر شبه اآللية واآللية بالكامل في القسم 41. والمعدات األساسية المطلوبة هي: ثالجة بدرجة حرارة 4 مئوية حلفظ الكاشف يجب احملافضة على الكاشف بصورة اعتيادية ما بني درجة حرارة 2 8 مئوية ما لم يتم حتديدغير ذلك من قبل الشركة املصنعة. وميكن أن تكون وحدة ذات درجة داخلية جيدة النوعية كافية. جتميد عميق قادر على احملافظة على درجة ما دون 35- مئوية تفيد درجة احلرارة املنخفضة مثل 70- درجة مئوية التخزين لفترة طويلة أكثر. وتكون عوامل التخثر مستقرة عند هذه الدرجة ملدة ستة أشهر على األقل )وودهامز وآخرون 2001(. وعادة ما تكون وحدات التجميد لغاية 20- درجة غير كافية لتخزين البالزما والكواشف للعديد من اختبارات التخثر والتميع )اإلرقاء(. واملجمدات )الفريزرات( ذات دورة اإلذابة التلقائية غير مناسبة متاما. تكون احلمامات املائية املنتظمة قادرة على احملافظة على درجة حرارة تتراوح بني )37 ± 0,5 مئوية(. كما تكون احلمامات اجلافة مناسبة او غير مناسبة اعتمادا على نوعية احلمام اجلاف. عادة ما تتم احملافظة على درجة حرارة أفضل باستخدام احلمام املائي. جهاز ملقياس درجة احلموضة مصدر الضوء )على سبيل املثال مصباح منضدة من نوع أجنلبويس( ساعة )ساعات( توقيت ماصات آلية معي رة قادرة على إعطاء عينة وكميات كواشف دقيقة وم حكمة في نطاق ما بني صفر ميكرولتر وحتى 1000 ميكرولتر. من املهم التحقق من دقة هذه املاصات )انظر القسم 2(. ماصة معي رة إلعطاء كميات من السائل تصل إلى 5 مل جهاز طرد مركزي قادر على توليد ما ال يقل عن 1700 غ )جاذبية( ميكن قبول الطرد املركزي ملعظم حتليالت التخثر في درجة حرارة الغرفة )20 25 درجة مئوية(. )ي نصح في بعض التقنيات بطرد مركزي 2500 غ وبدرجة 4 مئوية.( ميزان معايرة حتليلية قادر على إعطاء قياس دقيق للغرامات في ثالث خانات عشرية. أنظر القسم 2 لالطالع على إجراءات التحقق من الدقة. 1 تاربتخملا تادعم

8 وتشمل املعدات اإلضافية املطلوبة لبعض اإلجراءات: قارئ لوحة مايكروتيتر للتقنيات املناعية املرتبطة باإلنزميات Reader( )ELISA جهاز تراكم الصفائح aggregometer) (Platelet املعدات احملددة املذكورة في دليل املرافق الذي يشرح طرق عمل الفحص. وي عتبر تكييف الهواء في كل غرفة ميزة كبيرة في البلدان التي تكون درجات احلرارة فيها مرتفعة. يجب أن يتم جتهز مواد استهالكية كافية كما ينبغي جتنب إعادة استخدام أنابيب االختبار ورؤوس املاصات pipette tips املختبرية بعد غسلها ألن املواد املتبقية ميكن أن تؤثر على النتائج سلبا مما يسبب هدرا للوقت والكواشف. المراجع Woodhams B, Girardot O, Blanco MJ, Colesse G, and Gourmelin Y. Stability of coagulation proteins in frozen plasma. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

9 التحقق من الماصة ومعايرة توازن قياس الوزن 2 للمساعدة في إدارة اجلودة يجب أن يتم فحص معايرة التوازن ومعايرة حجم املاصة كل ثالثة إلى ستة أشهر. وينبغي إخراج األجهزة غير القابلة للمعايرة بشكل ملحوظ فورا من االستخدام حتى تتم إعادة معايرتها. ينبغي أن حتمل جميع املاصات رقم تعريف فريد. طريقة فحص معايرة الماصة 1 قد تكون املاصات لكمية واحد أو لكميتني أو ثالث أو أن تكون ملجموعة متواصلة من الكميات. يتم فحص املاصات ذوات اإلعداد الثابت الواحد أو اإلعدادين كل على حده. يتم فحص املاصات ذوات الثالثة إعدادات وهي ثابتة عند أدنى وأعلى إعداد. املاصات ذوات إعداد مجموعة الكميات املتواصلة: يتم فحص إعداد احلد األقصى وكذلك عند حوالي % 25 من إعداد احلد األقصى. وكما يلي: ماصة 10 مل عند 10 مل و 2.5 مل ماصة 5 مل عند 5 مل و 1.25 مل ماصة 1 مل عند 1 مل )1000 ميكرولتر( و 0.25 مل )250 ميكرولتر( ماصة 0.2 مل عند 0.2 مل )200 ميكرولتر( و 0.05 مل )50 ميكرولتر( ماصة 0.1 مل عند 0.1 مل )100 ميكرولتر( و مل )25 ميكرولتر( ماصة 50 ميكرولتر عند 50 ميكروليتر و 15 ميكرولتر 2 التحقق من املعايرة من خالل وزن خمس كميات مكررة من املاء املقطر )في درجة حرارة الغرفة( على امليزان. يتم تسجيل كل وزن بالغرام )حتى ثالث خانات عشرية(. ألغراض عملية يساوي كل 1000 مل وزن 1000 غرام. النتائج ينبغي تسجيل النتائج وأي إجراء يتم اتخاذه. عندما تظهر املاصة على أنها غير دقيقة بسبب اختالف الكمية املسحوبة بأكثر من % 10 من الكمية املذكورة نزولا سايق نزاوت ةرياعمو ةصاملا نم ققحتلا 3

10 فيجب إخراجها من االستخدام فورا وعدم استخدامها حتى تتم إعادة معايرتها بات باع تعليمات الشركة املصنعة. يجب أن تكون املاصات دقيقة على الوجه األفضل مبقدار يقل عن % 10 بشكل كبير. مالحظة: إذا كانت املاصة غير دقيقة خارج احلدود التالية )متوسط الوزن( يجب وقف استخدامها على الفور. ماصة 10 مل 10 مل: غ)غرام( غ 2.5 مل: غ غ ماصة 5 مل 5 مل: غ غ 1.25 مل: غ غ ماصة 1 مل 1 مل: غ غ 0.25 مل: غ غ طريقة فحص الموازين يتم قياس األوزان املعي رة بعد كل 6 أشهر وتسجيل القي م للتأكد من دقتها. ماصة 0 2 مل 0.2 مل: غ غ 0.05 مل: غ غ ماصة 0 1 مل 0.1 مل: غ غ 025 مل: غ غ ماصة 50 ميكرولتر 50 ميكرولتر: غ غ 15 ميكرولتر: غ غ 1 تصفير امليزان. 2 قياس وزن األوزان املعي رة الثالثة واحدا في كل مرة. قم بتسجيل األوزان إلى ثالثة مراتب عشرية )على سبيل املثال غ(. 3 إذا كان هناك أي وزن خارج احلدود املنصوص عليها )بأقل من %( 2 يتم أخرجها من االستخدام حتى يتم تصحيح هذه املشكلة. 4 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

11 3 الملتة في المختبر املختبرات التي تتعامل مع املواد الكيميائية والعينات البيولوجية هي أماكن خطرة. في السنوات األخيرة كان هناك اهتمام متزايد بأهمية سالمة ممارسات العمل في الصناعة ألسباب صحية وبيئية معا. وقد أدى هذا الوعي إلى مزيد من التشديد على أمور مثل التوثيق اآلمن وتدريب املوظفني وتقييم املخاطر. وتقع على عاتق أرباب العمل مسؤولية توفير مالبس ومعدات احلماية وهم مطالبون بتوفير التدريب على ممارسات العمل اآلمنة. إذا وجدت ممارسات العمل اآلمنة في مكان ما فسيتم تقليص احتمال تعرضك أو تعرض زمالئك أو العامة إلصابة خطيرة إلى حد كبير. مسؤولو الملتة من املهم أن يتم تعني مسؤول أو مسؤولي سالمة لكل قسم. ويأخذ هؤالء األشخاص على عاتقهم ومسؤوليات إدخال إجراءات السالمة واحملافظة عليها. ومع ذلك فالسالمة هي مسؤولية جميع موظفي املختبر. دليل الملتة يجب أن يكون هناك دليل شامل للسالمة يغطي جميع جوانب ممارسات العمل اآلمنة للقسم بأكمله. يجب على جميع املوظفني قراءة الدليل والتوقيع على بيان يثبت أنهم قد فهموا ما ورد فيه. يجب االحتفاظ بنسخ من هذا الدليل لدى مسؤول السالمة ووضعها أيضا في أماكن ميكن الوصول إليها بسهولة من قبل جميع أعضاء فريق العمل. تدابير الملتة: االحتياطات العالمية يتطلب نظام االحتياطات العاملية أن يتم جتنب وتقليل أية مخاطر للعدوى من أي مصدر وذلك بات باع ممارسات العمل اجليدة. ويجب اعتبار جميع عينات الدم ومنتجات الدم )مبا في ذلك الكواشف املنتجة من البالزما وأدواتها( وغيرها من مواد اجلسم البشري على أنها متثل خطرا محتمال للعدوى. وينبغي دائما اتخاذ التدابير الوقائية إلى أقصى حد ممكن عند التعامل مع أية مادة. بتخملا يف ةمالسلا 5

12 يجب أال يتم اتخاذ أي تصنيف آخر للمخاطر. ينبغي التعامل مع جميع سوائل اجلسم وغيرها من املواد غير الدم سواء مت جمعها أو جلبها إلى الوحدة لغرض الفحص أو ألي غرض آخر بنفس العناية التي تعطى للدم. املختبر ينبغي أن يكون املختبر نظيفا ومرتبا على الدوام كما ينبغي فصل أماكن األعمال املكتبية عن مناطق الفحوصات املختبرية. حاولوا عدم استخدام املختبر لتخزين املواد الفائضة. وحاولوا ضمان مشاركة اجلميع في احملافظة على املختبر منظما. املالبس الواقية يجب على كل شخص يدخل املختبر مبا في ذلك الزوار ارتداء معطف املختبر. يجب استبدال املعطف فورا إذا أصبح ملوثا. قفازات االستعمال ملرة واحدة ال يحب كثير من الناس ارتداء القفازات ولكن حتتوي كل عي نة يتم التعامل معها في املختبر على خطورة ما. ينبغي دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع املواد السامة. لن حتمي القفازات واملعاطف بشكل واضح ضد حوادث الوخز باإلبر ولكنها ستمنع على سبيل املثال مصل فيروس نقص املناعة املوجب أو السموم التي ميكن أن تالمس أية جروح أو خدوش على بشرتك. دائما استبدل القفازات إذا كانت مقطوعة أو مثقوبة على الفور. غسل العني ميكن أن حتصل العديد من حاالت العدوى بسهولة عن طريق االتصال باألغشية املخاطية للعينني. اغسل عينيك مباشرة بالكثير من املاء البارد اجلاري إذا حدث اتصال مع مادة محتملة العدوى. األدوات احلادة متثل األدوات احلادة مثل اإلبر والزجاج املكسور خطرا كبيرا : استخدم صندوقا لألدوات احلادة قابال الحتوائها دون أن يتعرض ألي ثقب. كانت هناك عدة حاالت أصيب فيها العمال بالعدوى نتيجة للوخز باإلبر. الهباء اجلوي جتنب جميع املمارسات التي قد تسبب رذاذا أو قطرات متطايرة أو غبارا في املختبر املفتوح. يجب أن تتم العمليات التي تولد الهباء دائما داخل خزانة مناسبة للحماية من االدخنة ويجب ارتداء نظارات السالمة. يجب تنظيف جميع البقع فورا وذلك باستخدام مواد التبيض املعقمة أو العوامل احملايدة عند الضرورة. 6 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

13 املواد السامة والقابلة لالشتعال يجب حفظ املواد السامة أو القابلة لالشتعال دائما داخل خزانة احلماية من االدخنة أو داخل صندوق آمن مناسب. املعدات الكهربائية يجب اتخاذ تدابير عناية خاصة عند التعامل مع أية معدات تستخدم السوائل مثل خزانات املياه الكهربائية وحمامات املاء. يترك أمر التركيب والصيانة واإلصالح دائما للموظفني املؤهلني. املمتلكات والسلوك الشخصي عدم إحضار احلاجيات الشخصية مثل األقالم واحلقائب واألمشاط إلى املختبر. جتنب وضع يديك على وجهك أو على األغشية املخاطية )العيون األنف الفم( أثناء وجوك في املختبر أما إذا كان عليك القيام بذلك فاغسل يديك أوال دائما. يجب أال يتم إحضار الطعام والسجائر ومستحضرات التجميل إلى املختبر. عدم وضع املاصة في الفم أبدا. دائما اغسل يديك جيدا قبل مغادرة املختبر. احلوادث يجب اإلبالغ فورا عن جميع احلوادث كما يجب تسجيلها في سجل احلوادث الذي يحتفظ به مسؤول السالمة في القسم. وهذا األمر مهم ال سيما فيما يتعلق بإصابات الوخز باإلبر. وفي هذه األحوال ات بع نظم املستشفى احمللي للتسجيل واإلبالغ إضافة إلى أية إجراءات أو تكليفات موصى بها محليا. التحكم في المواد الخطرة على الصحة )COSHH( يتم ات باع هذا التشريع في مختبرات اململكة املتحدة هو دليل مفيد لتحديد األخطار واملخاطر. األخطار واملخاطر األخطار التي حتملها املواد هي أمكانيتها على إحداث الضرر. املخاطر الناجتة عن هذه املادة هي احتمال إضرارها بشخص حتت ظروف استخدامها الفعلية. حتديد املخاطر ي عتبر حتديد املخاطر شرطا أساسيا لتقييم اخلطر. ويختلف الوقت الذي يتطلبه حتديد املخاطر وفقا للمادة نفسها. بتخملا يف ةمالسلا 7

14 تقييم األخطار أخذ احلقائق التالية بعني االعتبار: املخاطر شروط االستخدام الكميات التي سيتم استخدامها الطرق أو املواقع احملتمل تعرضها )االستنشاق االبتالع واجللد أو العينني( وستحدد نتيجة تقييم املخاطر: ظروف التخزين إجراءات معاجلة طريقة االستعمال إجراءات التخلص من الفضالت شرط املراقبة والرصد الصحي إجراءات الطوارئ يجب مراجعة تقييم املخاطر وحتديثها سنويا إذا لزم األمر. انظر الشكلني 1.3 و 2.3 أدناه للحصول على أمثلة حول كيفية تسجيل املعلومات لتقييم املخاطر في هذه احلاالت باستخدام إجراء.COSHH الغرض من هذا النموذج هو حتديد املخاطر وتدابير الرقابة املرتبطة باملعدات املستخدمة في إجراء معني ما. يجوز للموظفني املختصني واملدرجني فقط تنفيذ أي إجراء وينبغي عليهم القيام بذلك فقط بعد مراجعة وثائق الصحة والسالمة املتعلقة بذلك الفحص املعني. 8 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

15 الشكل 1.3: التحكم في المواد الخطرة على الصحة )COSHH( لوقت البروثرومبين ومقايسات عامل التخثر المستند إلى )APTT( رقم مرجع )COSHH( المقايسات 1 مرجع المختبر مرحلة واحدة )مقايسات.)XII XI X IX VIII VII V II عنوان اإلجراء/ التجربة: المادة الكمية التقريبية المخاطر الم عر فة ضار في حال بلعه. >5 مل عازل جليوكسالين )إيميدازول( ويحتوي على )انظر**( ** إيميدازول 3.4 غ/ لتر مادة تسبب التآكل: مسببة للحروق. ضارة إذا تم استنشاقها أو بلعها أو امتصاصها من خلل الجلد. مهي جة للعينين. ** كلوريد الصوديوم 5.85 غ/ ل مهيج للعينين والرئتين. تجنب تلتمته للجلد. خطر العدوى. 1 مل البلاتا قليلة العامل Factor-deficient plasma ثرومبوبلستين 2 مل قليل الخطر. كاشف 2 APTT مل قليل الخطر. كلوريد الكالسيوم م 5 مل قليل الخطر. يحتوي على باربيتون. ضار عند بلعه. قد يسبب حساسية عند تلتمته للجلد أو استنشاقه. يسبب الحروق: مضر للعيون والجلد وغيرها. ال تخلطه مع غيره من المطهرات. يسبب التآكل. قد يسبب اتصاله بالمواد القابلة للشتعال حريقا. يحرر اتصاله بالحوامض غازات سامة. يتفاعل بشدة مع أتلح األمونيوم المذيبات العضوية يشكل خطر انفجار. >500 مل >50 مل العازل أورين buffer( )Owren s محلول تنظيف جهاز التخثر يحتوي على % 0.16 من حامض الهيدروكلوريك والمنظفات. مهيج: قد يؤذي العينين والجلد. >50 مل محلول تنظيف جهاز التخثر خطر العدوى. >1000 ميكرولتر البلاتا المعيارية/المراقبة/ المريضة بتخملا يف ةمالسلا 9

16 الشكل 2.3: التحكم في المواد الخطرة على الصحة )COSHH( لمقايسة العامل )XIII( عنوان اإلجراء/ التجربة: المادة الكمية التقريبية المخاطر الم عر فة كاشف منشط: ثرومبين بقري مثبط تجلط زجاجة 5 مل GLY-PRO-ARG-ALA-AMIDE( 0.01 ( G كلوريد الكالسيوم هيكساديميثرين بروميد )40 مايكروغرام( ألبومين بقري عازل بيسين ) 100 م م/ ل( و 2.5 ملغ من أزيد الصوديوم كاشف :)NADH( 2 ملغ NADH ألبومين زجاجة 5 مل بقري و 2.5 ملغ من أزيد الصوديوم كاشف تحديد: ببتيد م صطنع جليسين زجاجة 5 مل إيثييستر )7 ملغ( ألفا كيتوجلوتارات )13.5 ملغ( ألبومين بقري عازل )HEPES( و 5 ملغ من أزيد الصوديوم يحتوي على أزيد الصوديوم: شديد السمية إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد أو ابتلعه. قد يسبب ضررا جينيا متوارثا. يتفاعل مولدا انفجارا مع معادن معينة. يحتوي على أزيد الصوديوم: شديد السمية إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد أو ابتلعه. قد يسبب ضررا جينيا متوارثا. يتفاعل مولدا انفجارا مع معادن معينة. يحتوي على أزيد الصوديوم: شديد السمية إذا تم امتصاصه عن طريق الجلد أو ابتلعه. قد يسبب ضررا جينيا متوارثا. يتفاعل مولدا انفجارا مع معادن معينة. البلاتا المعيارية/ المراقبة/ المريضة >1000 ميكرولتر خطر العدوى. 10 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

17 4 جمع العينات ومتغيرات ما قبل التحليل يصف عدد من األدلة التوجيهية املفصلة إجراءات جمع ومعاجلة عينات الدم الختبارات التجلط.)CLSI 2007, 2008a, 2008b( يجب أخذ الدم الوريدي من عروق ثنية املرفق عندما يكون األمر ممكنا وذلك باستخدام رباط ضاغط لتسهيل عملية اجلمع. ويجب وضع الرباط الضاغط مباشرة قبل جمع العينة وأال يزيد قياس إبرة السحب )النيدل( عن قياس 21 للبالغني كما ينبغي جمع العينة باستخدام احل قن و/ أو انابيب نظام اجلمع بالتفريغ لتسمح باجلمع السريع لعينة الدم. يجب أن يتم سحب الدم بلطف إلى احلقنة ورمبا يكون استخدام إبرة بقياس 22 أو 23 لألطفال الرضع أمرا ضروريا. يجب التخلص من أية عينة لم يتم جمعها فورا من الوريد بنجاح وذلك الحتمال تنشيط نظام التخثر وال يجب عودة الدم مرة ثانية في اإلبرة بعد جمعه في احلقنة. يجب إزالة اإلبرة قبل ضخ الدم من احلقنة إلى انبوب مع مضاد للتخثر كما ال يجب أن يحدث أي تأخير بني جمع العينة ومزجها مبضاد التخثر. مبجرد امتزاج مضاد التخثر بالدم يجب إغالق االنابيب بإحكام وخلطها بالتقليب بلطف خلمس مرات مع جتنب الهز بقوة. يوصي بعض الكتاب بعدم استعمال أول 5 مللترات مسحوبة الختبارات التجلط. وإذا مت استخدام نظام اجلمع بانبوب نظام اجلمع بالتفريغ فينبغي مالحظة أن مزج العينة بتقليبها خلمس مرات بلطف مطلوب أيضا بعد أن مت سحب العينة في مضاد تخثر الدم. ينبغي أن ميزج الدم مع مضاد التخثر من سترات الصوديوم نسبة 9 أجزاء من الدم: جزء 1 من مضاد التخثر. ويجب أن يكون هذا 0,109 م )3,2 % من ثالثي ديهايدريت سترات الصوديوم( أو ما يشابهه )مثال 0,105 م السترات املضادة للتخثر املستعملة بنجاح في بعض األنظمة املفرغة(. وميكن تخزين محلول مضاد التخثر في درجة 4 مئوية ملدة تصل حتى ثالثة أشهر ولكن يجب فحصها قبل االستخدام أو التخلص منها إذا وجدت فيها جسيمات مادية - مثال عند حدوث تلوث. ويجب أال يحدث أي اتصال منشط انبوب العينة )مثال استخدام البالستيك أو زجاج السيليكون(. ميكن أن تتأثر النتائج إذا كان املريض يعاني من انخفاض في مكداس الدم أو إذا ارتفعت نسبة الكريات بشكل خاص. ويجب تعديل كمية مضاد التخثر لألخذ بعني االعتبار كمية البالزما املخفضة. يبني الشكل 1.4 دليال لكمية مضاد التخثر الالزمة لعينة 5 ملليلتر. ليلحتلا لبق ام تاريغتمو تانيعلا عمج 11

18 الشكل 1.4: كميات الدم ومضاد التخثر اللاتة للعينات التي لها مكداس دم غير طبيعي )هيماتوكريت(. مكداس الدم كمية مضاد التخثر كمية الدم % % 0.5 مل 4.5 مل % مل 4.3 مل % مل 4.6 مل % مل 4.75 مل % مل 4.8 مل وبدال من ذلك ميكن إبقاء حجم مضاد التخثر 0.5 مل ثابتا وإضافة كميات متباينة من الدم وفقا ملكداس الدم. ميكن احتساب كمية الدم التي جتب إضافتها )لكل 0.5 مل من السترات 0 109( وحسب املعادلة: كريات حمراء الطرد المركزي يتم حتضير البالزما الغنية بالصفائح )PRP( الختبار وظائف الصفائح الدموية بواسطة جهاز الطرد املركزي للدم مبضاد التخثر في درجة حرارة الغرفة عند 150 جاذبية 200 جاذبية ملدة 10 دقائق. تتم إزالة خالصة السائل واالحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة في زجاجة مقفولة أثناء االستخدام ملدة ال تزيد عن الساعتني. يتم استخدام البالزما قليلة الصفائح )PPP( ملعظم اختبارات التخثر. وينبغي أن تتم عملية الطرد املركزي للعينة على األقل ل 1700 جاذبية ملدة 10 دقائق على األقل. ميكن أن تتم هذه العملية في درجة حرارة الغرفة بشرط عدم جتاوز درجة احلرارة 25 درجة مئوية وفي هذه احلالة يجب استخدام العينة الناجتة من الطرد املركزي واملبردة إلى 4 درجات مئوية. تتطلب إجراءات بعض االختبارات أن يتم فصل البالزما بالطرد املركزي مرتني. وللقيام بذلك يتم حتويل البالزما قليلة الصفائح من عملية الطرد املركزي األولى إلى أنبوب بالستيكي مقفول وتعاد عملية الطرد املركزي مرة ثانية. يجب احلرص على عدم استخدام اجلزء األسفل من البالزما بعد عملية الطرد املركزي الثانية ألنه قد يحتوي على أية صفائح دم متبقية بعد عملية الطرد األولى. عينات االختبار الفوري يجب فحص العينات خالل أربع ساعات من أخذها قدر املستطاع. كما ينبغي جتنب تخزينها لفترات طويلة الختبارات الفحص ولقياس عامل تخثر الدم وعلى الرغم من ذلك يبدو أن عينات الدم الكاملة املخزنة في درجة حرارة الغرفة قد تكون مستقرة لقياسات وقت البروثرومبني )باجلني ولودينجتون 1997(. يجب احملافظة على العينات املعد ة الجراء اختبارات املراقبة ولفحص عامل )VII( في درجة حرارة الغرفة لتجنب إمكانية حتفيز البرودة للفحص. 12 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

19 العينات عالية الخطورة يجب توخي احلذر عند التعامل مع جميع عينات البالزما وذلك بسبب خطورة انتقال التهاب الكبد وفيروس نقص املناعة البشرية وغيرها من الفيروسات. أنظر القسم 3 سالمة املختبرات. طريقة تجميد البلاتا ميكن تخزين العينات املجمدة لغرض اختبارها الحقا. ويفضل التخزين في درجة -70 مئوية أو أقل من ذلك. إذ تكون عوامل التخثر في حالة مستقرة عند هذه الدرجة لستة أشهر على األقل )وودهامز أيتال 2001(. أما تخزين العينات للمدى القصير في درجة -35 مئوية فكاف ملعظم االختبارات بينما التخزين في درجة -20 مئوية فهو غير كاف في العادة. ويجب أن تتم عملية الطرد املركزي املزدوجة )انظر قسم الطرد املركزي أعاله( في حال مت جتميد العينات جتميدا شديدا قبل حتليل التخثر لداء الذئبة. مبا أن النتائج املستخلصة من بعض التقنيات ميكن أن تتأثر لذا من األفضل جتنب التجميد واإلذابة قبل حتديدات.)APTT( يجب نقل أية عينات بالزما مجمدة فورا إلى حمام مائي بدرجة 37 مئوية وإذابتها بني 4 إلى 5 دقائق وخلطها بتقليب لطيف قبل التحليل. ينبغي جتنب اإلذابة البطيئة في درجات حرارة منخفضة ملنع تشكل الراسب القري األمر الذي يقلل من VWF( )FVIII:C, ومحتوى الفيبرينوجني للبالزما الطافية. المراجع Baglin T, Luddington R. Reliability of delayed INR determination: implications for decentralised anticoagulant care with off-site blood sampling. Br J Haem 1997; 96: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipunture: Approved standard, 6th ed. 2007; Clinical and Laboratory Standards Institute Document H3-A6: 27(26). Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens: Approved standard, 6th ed (a); Clinical and Laboratory Standards Institute Document H4-A6: 28(25). Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Collection, transport, and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays and molecular hemostasis assays: Approved guideline, 5th ed (b); Clinical and Laboratory Standards Institute Document H21-A5: 28(5). Woodhams B, Girardot O, Blanco MJ, Colesse G, Gourmelin Y. Stability of coagulation proteins in frozen plasma. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: ليلحتلا لبق ام تاريغتمو تانيعلا عمج 13

20 5 مراقبة الجودة الداخلية وتقييم الجودة الخارجي ضمان اجلودة )QA( هو مصطلح شامل ميكن استخدامه لوصف جميع التدابير املتخذة لضمان موثوقية الفحوصات والتقارير املختبرية. ويشمل هذا اختيار الفحص جمع عينة صاحلة من املريض حتليل العينة وتسجيل النتائج بطريقة دقيقة وفي الوقت املناسب من خالل تفسير النتائج وفق االقتضاء وإبالغ هذه النتائج إلى طبيب التحويل. مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( وتقييم اجلودة اخلارجي )EQA( )ويشار اليها احيانا باسم اختبار الكفاءة( هما مكونان مختلفان ومتكامالن في الوقت ذاته لبرنامج ضمان جودة املختبر. يتم استخدام مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( لتحديد ما إذا كانت سلسلة من التقنيات واإلجراءات تؤدى باستمرار على مدى فترة من الزمن. وبالتالي يتم تطبيقها لضمان اتساق عمل املختبر يوما بعد يوم. ويستخدم تقييم اجلودة اخلارجي )EQA( لتحديد درجة التوافق بني نتائج مختبر واحد ما مع تلك املتحصلة من مراكز أخرى. ومن خالل مشروع تقييم اجلودة اخلارجي )EQA( األكبر يتيح التحليل بأثر رجعي للنتائج املتحصلة من مختبرات مشاركة التحديد ليس فقط لضعف أداء املختبر الفردي فحسب بل للكواشف والطرق التي تؤدي إلى ظهور نتائج غير موثوق بها أو مضللة أيضا. والغرض األساسي لتقييم اجلودة اخلارجي )EQA( هو اختبار الكفاءة لفحوصات املختبر كل على حدة. يتضمن برنامج )EQA( الدولي الذي يقدمه االحتاد العاملي الهيموفيليا التحليالت ذات األهمية اخلاصة لتشخيص وعالج اضطرابات النزيف )ملزيد من املعلومات يرجى االتصال باالحتاد الدولي للهيموفيليا.)WFH( لقد مت نشر بيانات عن هذا املشروع في املراجع التالية : Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Development of a World Federation of Hemophilia External Quality Assessment Scheme: results of a pilot study. Haemophilia 1996; 2: 4-46 Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Laboratory performance of haemophilia centres in developing countries: 3 years experience of the World Federation of Hemophilia External Quality Assessment Scheme. Haemophilia 1998; 4: Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID, Preston FE. Laboratory performance in the WFH EQA programme Haemophilia. 2009; 15: تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

21 معلومات االتصال ببرنامج تقييم الجودة الخارجي )EQA( للتحاد الدولي للهيموفيليا )WFH( )2010( املدير: بروفسور اف. اريك بريستون املدير العلمي: الدكتور ستيف كيتشني Rutledge Mews 3 Southbourne Road Sheffield S10 2QN اململكة املتحدة هاتف: فاكس: املوقع اإللكتروني: ميكن أن ت قدم مشاريع تقييم اجلودة اخلارجي )EQA( األكبر معلومات عن األداء النسبي لإلجراءات التحليلية مبا فيها مبدأ الطريقة والكواشف واألدوات. لقد مت ربط املشاركة املستمرة في مشاريع EQA لتحسني أداء املختبرات. وقد بدأ هذا جليا ليس على األداء العام والظاهر من خالل احلد من اختالفات النتائج بني املختبرات فحسب ولكن لدى املختبرات الفردية أيضا. إن تقييم أداء املختبر الفردي هو عنصر أساسي في مشاريع ) EQA (.ويقارن مشروع تقييم اجلودة اخلارجي )EQA( الذي يقدمه االحتاد الدولي للهيموفيليا )WFH( نتائج املشاركني مع نتائج العينات نفسها عندما يتم حتليلها في ما يصل إلى 700 مركز منتشر في مختلف أنحاء العالم والتي تشارك في املشروع الوطني لتقييم اجلودة اخلارجي لتخثر الدم في اململكة املتحدة NEQAS(.)UK هناك العديد من األسباب حول عدم إمكانية تقدمي مختبر ما نتائج ميكن اعتبارها غير مرضية. في حني أن سبب ذلك قد يكون واضحا على الفور إال أن حتديد املشكلة األساسية ليس سهال دائما. وتتمكن املشاريع األكبر من حتديد مشاكل األداء التي تتعلق حتديدا باختالفات الكاشف أو اختالفات املنهج. وتعد السرية التامة إحدى املزايا الهامة جلميع مشاريع تقييم اجلودة اخلارجي.)EQA( وفي مشروع تقييم اجلودة اخلارجي )EQA( الدولي املشار إليها أعاله فإن معلومات أداء املختبرات الفردية ليست متاحة ألي شخص غير رئيس القسم املعني إال من خالل تصريح مكتوب فقط. مراقبة الجودة الداخلية يتم استخدام مراقبة اجلودة الداخلية لتحديد ما إذا كانت سلسلة من التقنيات واإلجراءات تؤدى باتساق على مدى فترة من الزمن. يشيع استخدام مصطلح مراقبة اجلودة لوصف مجموعة من اإلجراءات املستخدمة للتحقق من أن نتائج الفحوص املختبرية موثوقة مبا يكفي لتقدميها ملساعدة األطباء في اتخاذ القرار ومراقبة املعاجلة وتشخيص حاالت اضطراب وقف النزف. ويجب تطبيق إجراءات مراقبة اجلودة بطريقة تضمن السيطرة الفورية واملستمرة الستخراج النتائج. يجراخلا ةدوجلا مييقتو ةيلخادلا ةدوجلا ةبقارم 15

22 وتتأثر جودة النتائج املتحصلة في إطار املختبر بعوامل كثيرة منها: جمع ومعاجلة العينات بطريقة مناسبة اختيار التقنيات املناسبة واحملافظة على دليل محد ث إلجراءات العمل القياسية استخدام كواشف ومواد مرجعية موثوقة اختيار اآلالت املناسبة والصيانة الكافية سجالت كافية نظام اإلبالغ عن النتائج وإضافة إلى ذلك تعتمد جودة النتائج التي يتم احلصول عليها من خالل املمارسات الدورية بدرجة كبيرة على التدريب واالختيار واحلافز كتكملة مناسبة للموظفني املالئمني. وتفيد مراقبة اجلودة الداخلية بشكل خاص في التعرف على درجة الدقة لتقنية معينة وتعني الدقة درجة التوافق بني القياسات املتكررة لعينة واحدة. من املهم اإلدراك أن األسلوب الدقيق ال يعني بالضرورة نتائج دقيقة والدقة تعني قياس قرب القيمة املقدرة للقيمة احلقيقية. مواد مراقبة الجودة لتقييم دقة أسلوب معني فمن الضروري إجراء حتليالت متكررة ملقادير متساوية من العينة نفسها. من املهم أن تشمل مراقبة اجلودة )QC( عينات ذات قي م طبيعية وقي م غير طبيعية لضمان أن الطريقة م سيطر عليها في مستويات مختلفة من حتليل محدد إذ قد تكون تغييرات طفيفة نسبيا في عملية حتليلية ما أكثر وضوحا عند اختبار مراقبة غير طبيعي. يجب أن تكون املواد املراقبة مشابهة في اخلصائص لعينات االختبار وأن يتم حتليلها بتزامن. مواد مراقبة اجلودة ذات األصل البشري أكثر تشابها لعينات االختبار البشرية. يجب أن تكون كل قنينة أو مقدار من مواد مراقبة اجلودة متطابقة عمليا بحيث أن أي تغير في نتائج االختبار ليس ناجتا عن استبدال قارورة محل أخرى. ينبغي أيضا أن تكون مراقبة اجلودة مستقرة للفترة املقصود استخدامها فيها. أما بخصوص فحوصات ومقايسات عمليات وقف النزف فيجب حفظ عينات البالزما مجمدة بشدة )يفضل بدرجة 35- مئوية أو أقل( أو مجففة بالتجميد لضمان قدر كاف من االستقرار الستخدامها كمادة ملراقبة اجلودة. الستعادة العينات املجففة بالتجميد الى محلول فمن املهم استخدام املاء املقطر بدرجة حموضة مابني 6,8 7,2 وإعطاء مهلة خلمس دقائق على األقل إلعادتها. إذا مت استخدام مواد جتارية ملراقبة اجلودة فيجب أن تتم إعادتها وفق تعليمات الشركة املصن عة باستخدام نظام مص دقيق. وإذا مت استخدام مواد مراقبة شديدة التجميد فيجب إذابتها بسرعة في درجة 37 مئوية ملدة خمس دقائق. يجب أخذ خطر انتقال الفيروسات املنتقلة عبر الدم بعني االعتبار في اختيار مواد املراقبة. ال يجب استخدام املواد ذات املخاطر العالية. 16 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

23 وينبغي أن تدرج مادة واحدة ملراقبة اجلودة على األقل مع كل مجموعة من فحوصات أو مقايسات املشاهدة. قد يكون من األنسب لفحوصات املشاهدة أن تشمل مراقبة اجلودة العادية في هذه الطريقة والختبار املواد غير العادية مرة واحدة في اليوم أو في املناوبة أو عند وجود شك بخصوص ما إذا كانت الطريقة حتت السيطرة. وللحصول على دليل الستكشاف املشاكل املتعلقة ب /APTT( )PT ومشاكل مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( عند حتليل مستويني مختلفني انظر الشكل 1.5 أدناه. الشكل 1.5: اكتشاف مشاكل مراقبة الجودة الداخلية )IQC( المستوى 1 من مراقبة الجودة الداخلية PT المستوى 2 من مراقبة الجودة الداخلية PT المستوى 1 من مراقبة الجودة الداخلية APTT المستوى 2 من مراقبة الجودة الداخلية APTT الخالصة/ التحقق خارج داخل داخل داخل مادة المستوى 1 من مراقبة الجودة الداخلية PT خارج خارج داخل داخل كاشف PT داخل داخل خارج داخل مادة المستوى 1 من مراقبة الجودة الداخلية APTT داخل داخل خارج خارج كاشف APTT خارج خارج خارج خارج األداة ينبغي إدراج مواد مراقبة اجلودة ذات املستوى املخف ض مع االختبارات املستخدمة لتشخيص ورصد النقص املتوارث حلاالت نزف الدم. يجب التعامل مع مواد التحكم في جميع احلاالت متاما مثل عينات االختبار إذا أمكن ذلك. ومبا أنه سيحدث بعض التباين بالضرورة نتيجة الختالفات بيولوجية وتقنية وحتليلية فيجب تسجيل كل نتيجة من نتائج مراقبة اجلودة وتقييمها باملقارنة مع الفئة التي تعتبر مقبولة وكما م بني في أدناه. حدود التباين المقبولة بالنسبة ملواد مراقبة اجلودة الداخلية التجارية غالبا ما ت قدم الشركات املصن عة للعينات النطاق املستهدف من القي م املقبولة. ستعتمد النتائج التي يتم احلصول عليها في حالة اختبارات املشاهدة والفحوصات التي تعمل في بعض االحيان على الكواشف ونظام الكشف النهائي املستخدم إلجراء االختبارات. ويجب أن يأخذ قيمة النطاق املستهدف Target Range هذا التأثير بعني االعتبار. واذا كان النطاق املستهدف غير متاح لتقنية معينة فيمكن القيام بذلك محليا. يجراخلا ةدوجلا مييقتو ةيلخادلا ةدوجلا ةبقارم 17

24 يتم اختبار مواد مراقبة اجلودة بشكل متكرر )10 مرات بحد أدنى( وفي أيام مختلفة عندما يتم التأكد من أن طريقة العمل مسيطر عليها )وكما مبني ضمن النتائج املستهدفة على مواد بديلة ملراقبة اجلودة على سبيل املثال(. ومن ثم يتم حساب املتوسط واالنحراف املعياري )SD( لهذه النتائج. واالنحراف املعياري )SD( هو اجلذر التربيعي ملجموع ( 2 D( مقسوما على )1-N( حيث أن )D( هو فرق النتائج الفردية من املتوسط و) N ( هو عدد التحديدات. و) SD ( هو مقياس انتشار النتائج: وكلما كبرت قيمة )SD( ازداد انتشار النتائج. وهناك مقياس مهم آخر وهو معامل التباين )CV( وهو )SD( معبر عنه كنسبة مئوية من املتوسط CV( SD = مقسوما على املتوسط ومضروبا في %(. 100 يجب أن يكون معامل التباين )CV( للنتائج في أيام مختلفة لوقت البروثرومبني ووقت الثرومبوبالستني املنشط جزئيا لعينة مراقبة اجلودة دائما أقل من % 8 ومن األفضل أن يكون أقل من ذلك. وملقايسات مثل العوامل FVIII:C( و )FIX فينبغى أن يكون معامل التباين ألقل من % 10 قابال للتحقيق لغرض االختبارات التي أجريت على مدى عدة أيام. في أغلب احلاالت ستظهر النتائج التي مت احلصول عليها لعينة مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( توزيعا عاديا )جاوسني(. ومن املمارسات الشائعة إلعداد نطاق الهدف لنتائج مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( حيث يكون الوسط ± 2SD فينبغي أن يشمل هذا % 95 من القيم. يجب أن يتم تسجيل النتائج الفردية على مخطط يحدد قيمة نطاق الهدف. املثال املبني في الشكل 2.5 أدناه. وتعتبر أية قي م مستقبلية تقع ضمن هذه احلدود مقبولة. وتشير النتائج اخلارجة عن هذا النطاق إلى أن مواد مراقبة اجلودة قد أتلفت أو مت التعامل معها بطريقة غير صحيحة أو أن طريقة العمل لم يتم التحكم بها بشكل صحيح. ستمنح إعادة اختبار مواد مراقبة اجلودة مزيدا من التفريق بني هذين االحتمالني ويؤكد جتاوز النتائج للحدود أن نظام االختبار خارج عن نطاق التحكم. ويعني االنحراف املتوسط أو طويل األجل في نتائج اختبار مراقبة اجلودة - على سبيل املثال والناجت عن األداة أو اخللل في الكاشف أو التغيير والذي سيظهر جليا عبر التدقيق في جداول السجل التراكمي. 18 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

25 الشكل 2.5: نتائج مقايسات )FVIII:C( على عينات مراقبة الجودة الداخلية التي تمت مقايستها في أيام مختلفة فعالية العامل الثامن VIII:C )وحدة دولية/ ديسيلتر( تاريخ الفحص كل نقطة هي مقايسة مختلفة على المواد نفسها. الخطوط المتصلة تمثل المتوسط وانحرافين معياريين من 20 مقايسة إجريت على هذه المادة والتي تعتبر أنها تمثل حدود النتائج المقبولة. يجراخلا ةدوجلا مييقتو ةيلخادلا ةدوجلا ةبقارم 19

26 6 تقنية األنبوب المائل يدويا على الرغم من توفر العديد من األدوات املختلفة الختبارات التخثر )انظر القسم 41 حول التحليل االلي( واستخدامها في جميع أنحاء العالم ما تزال تقنية إمالة األنبوب يدويا مستخدمة بنجاح من قبل العديد من املراكز. فقد يكون من الضروري القيام ببعض االختبارات يدويا حتى عندما تكون اآلالت قيد االستخدام نظرا لعدم توافق العينات العرضية واألداة املستخدمة. قد يكون هذا هو السبب في وجود تركيزات دهون مرتفعة بشكل كبير في البالزما أو في حتليل عينات اليرقان أو حيث يختلف منط تشك ل اجللطة في العينة بشكل ملحوظ عن العينات الطبيعية وخاصة عندما يتم خفض تركيز الفيبرينوجني بشكل ملحوظ. أفضل طريقة إلجراء اختبارات التخثر اليدوي هي استخدام األنابيب الزجاجية واحلجم املناسب هو ملم. وميكن استخدام أنواع مختلفة من األنابيب الزجاجية بنجاح إال أنها قد تؤثر على أوقات التخثر املتحصلة وخصوصا في اختبارات املشاهدة مثل وقت الثرومبوبالستني )APTT( املنش ط جزئيا. إذا مت تغيير مصدر أنابيب االختبار )امل صن ع أو التركيب( فينبغي األخذ بعني االعتبار احتمالية تأثر النتائج. وميكن القيام بذلك من خالل مقارنة عدد قليل من االختبارات مثل )APTT( مع نوعي األنابيب كليهما. إذا ظهرت اختالفات منهجية فيجب إنشاء نطاق عادي جديد. وينبغي جتنب غسل أنابيب االختبار وإعادة استخدامها قدر اإلمكان. وبسبب العديد من املتغيرات ومصادر التلوث احملتملة املرتبطة بالتقنيات اليدوية يجب أن تشمل هذه العملية تكرار االختبارات. وعلى أية حال إذا اختلف وقت التخثر لالختبارات املكررة بأكثر من % 10 فتجب إعادة االختبار. عند استخدام تقنينة إمالة األنبوب فمن املهم معرفة املزايا التالية: يجب أن تتم تدفئة الكواشف مسبقا حتى درجة 37 مئوية ملدة خمس دقائق على األقل قبل استخدامها في اختبارات التخثر. يجب أن يتم خلط مزيج بالزما االختبار والكاشف مباشرة بعد إضافة آخر عنصر من املزيج عن طريق الرج السريع املسيطر عليه ألنبوب االختبار ملدة ثانية أو ثانيتني وأن تبدأ ساعة التوقيت في الوقت ذاته. وعندها يجب إمالة اخلليط بزاوية قدرها 90 درجة ثالث مرات كل خمس ثوان حتت املراقبة في حني يتم تسجيل وقت التخثر. ويظهر هذا اإلجراء في الشكل 1.6 أدناه. يجب أن ي غمر أنبوب االختبار في حوض ماء بدرجة حرارة 37 مئوية )± 0,5 درجة مئوية( بني عمليات اإلمالة بحيث تغطس قاعدة أنبوب االختبار املائل حوالي 3-4 سم حتت سطح املاء لتساعد في احملافظة على درجة حرارة املزيج قريبة من 37 درجة مئوية قدر اإلمكان. يجب أن يتم تدقيق مزيج التخثر بصريا حتت مصدر ضوئي ملصباح أجنلوبوز أو ما شابه ذلك وتسجيل وقت التخثر. 20 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

27 الشكل 1.6: تقنية إمالة األنبوب اليدوية الختبارات التخثر ثوان إمالة األنبوب ثلث مرات كل خمس ثوان ايودي األنبوب بوبنأل يرويا 21

28 7 إعداد ومعايرة البلاتا الطبيعية المجمعة الجدول 1.7: جمع البلاتا الطبيعية المجم عة المتبرعون 20 فردا أصحاء طبيعيون ال يتناولون أدوية تتداخل مع عوامل التخثر وتفاعلت التجلط. من المقبول شمول النساء اللتي يتناولن حبوب منع الحمل ويفض ل أن يكون العدد متساويا تقريبا بين الذكور واإلناث وينبغي أن تتراوح أعمارهم بين 20 الى 50 عاما. مضاد التخثر م )% 3.2( من ديهايدرات سترات ثلثي الصوديوم المخزنة مع )N-2-ethanesulphonic) (HEPES( حامض )N-2-hydroxyethylpiperazine( في 5 غرام لكل 100 مل من سترات ثلثي الصوديوم. الجمع يتم سحب الدم من المتبرعين مابين 9 و 11 صباحا باستخدام محاقن بلستيكية ذات استخدام لمرة واحدة بحجم 60 مل وإبر فراشة قياس 21 غ. طريقة تحضير البلاتا الطبيعية المجم عة )PNP( 1 يجمع 54 مل من الدم وميزج مع 6 مل من مضاد التخثر في حاويات بالستيكية. 2 تخزين العينة على ثلج مذاب أثناء اإلعداد للتجميع. 3 إجراء عملية الطرد املركزي بدرجة 4 مؤية ملدة 15 دقيقة عند 2500 غرام. 4 جتميع البالزما في وعاء بالستيكي مانع لالتصال. 5 يتم تقسيمها في قنان زجاجية سعة 1.5 مل وفي كميات متساوية مبقدار 0.5 مل. 6 يتم جتميدها بسرعة فوق ثلج جاف/ ثنائي أوكسيد الكربون الصلب ( 2 )CO إذا توفر. وبدال من ذلك يوضع فورا على رف مفتوح بدرجة 70- مئوية. 7 يتم إكمال اإلجراءات الواردة أعاله خالل أربع ساعات. 8 تبقى مستقرة عند درجة 70- مئوية ألكثر من ستة أشهر. 22 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

29 ستحتوي البالزما الطبيعية املجم عة )PNP( التي أعدت بهذه الطريقة مستويات من العوامل II( )HMWK XII XI X IX VII V وعلى البريكاليكرين بحوالي وحدة واحدة لكل مل أو 100 وحدة لكل دل وعلى الرغم من أن اختالف مستويات العامل )FVIII( وعامل فون ويلبراند )VWF( بشكل واسع في جتمعات مختلفة من البالزما الطبيعية املجم عة.)PNP( يجب معايرة هذه البالزما الطبيعية املجم عة محليا على أساس الوحدة الدولية )IU( ومبا أن املعايير الدولية متاحة اآلن جلميع عوامل تخثر الدم املذكورة أعاله باستثناء العامل.)FXII( وميكن استخدام الكمية املجم عة دون معايرة مع كمية افتراضية من 100 وحدة/ دل U/dl أو وحدة واحدة/ مل U/ml لعامل.)FXII( ولغرض املعايرة وفق الوحدة الدولية )IU( فمن الضروري إما احلصول على إعدادات مرجعية معايرة ملنظمة الصحة العاملية )التي عقدت في املعهد الوطني للمعايير والرقابة البيولوجية جنوب ميمس بوتيرز بار هيرتز اململكة املتحدة( أو شراء بالزما جتارية مرجعية مناسبة متت معايرتها وفق الوحدة الدولية من قبل الشركة املصنعة. يجب األخذ بعني االعتبار استبدال هذه البالزما املجمعة كل 12 إلى 18 شهرا ما لم يكن هناك دليل من نتائج رقابة اجلودة الداخلية تشير إلى أنه متت احملافظة على االستقرار. طريقة معايرة البلاتا الطبيعية المجم عة )PNP( المحلية: 1 احلصول على املعايرة القياسية مثال : املعايير الدولية ملنظمة الصحة العاملية )IS( )زجاجتني بحد أدنى(. 2 تستخدم زجاجة واحدة من املعايير الدولية )IS( مع 4 مقادير متساوية من )PNP( احمللية في يومني مختلفني. 3 في اليوم األول اختبر )دولي محلي محلي محلي محلي دولي( وكرر هذه العملية باستخدام كميات مخففة جديدة من كل بالزما. 4 في اليوم الثاني اختبر )محلي محلي دولي دولي محلي محلي( وكرر هذه العملية باستخدام كميات مخففة جديدة من كل بالزما. 5 احسب قوة كل قدر من املعايير احمللية مقابل معدل النتائج مع اثنني من املعايير احمللية. ويتم تعيني متوسط الناجت للكميات املتساوية األربع تخفيفني يومني )ن = 16( على أنها قوة املعايير احمللية. عمجملا ةيعيبطلا امزالبلا ةرياعمو دادعإ 23

30 8 تأسيس نطاق مرجعي اعتيادي وإلعطاء التفسير الصحيح لنتيجة أي فحص مختبري فمن املهم احلصول على البيانات ذات الصلة بنتائج االختبار ألشخاص أصحاء طبيعيني. الصحة ليست شرطا جيد التعريف وغالبا ما تكون مصطلحا نسبيا. وميكن أن تكون املجموعة املثالية في بعض احلاالت متطابقة بشكل وثيق بني األشخاص اخلاضعني للدراسة في ما يخص العمر واجلنس في حاالت العوامل )FVIII/VWF( وفصائل الدم.)ABO( ومع ذلك فإن اختيارا دقيقا كهذا ليس ضروريا للعديد من اختبارات التخثر. وعمليا سيتأثر اختيار أشخاص بصحة اعتيادية إلنشاء نطاق طبيعي باعتبارات عملية. ميكن استخدام موظفي املستشفى األصحاء الذين ال يتناولون أية أدوية املتبرعني بالدم األصحاء أو املرافقني للمرضى البالغني. جميعهم ميكن استخدامههم لعمل عينات مرجعية وهناك عدد من االعتبارات املهمة في ما يتعلق باملجموعات العادية Normal rang وكما يرد أدناه. ميكن حلالة األشخاص الطبيعيني أن تؤثر على النتائج التي يتم احلصول عليها عند جمع الدم. ومتت مؤخرا مراجعة بعض هذه املتغيرات ما قبل التحليلية وفق دليل )ISTH( املتعلق بأمور الصحة النسائية )2007 al..)blomback et ويشمل هذا إعادة النظر في تأثيرات اإلجهاد البدني )على سبيل املثال استمرارية لغاية 10 ساعات من الزيادة بقدر ضعفني ونصف )2.5( في العوامل )FVIII/VWF( اإلجهاد الذهني )زيادة في )FVIII/VWF( بعد اإلجهاد الذهني احلاد( آثار الهرمونات التباينات اإليقاعية )الساعة البايولوجية( واآلثار الناجمة عن وضعية اجلسد والنظام الغذائي. لقد مت إعطاء بعض التوصيات العامة وهي ليست قاصرة على فحوصات املرضى من اإلناث. وعلى النحو التالي: االمتناع عن ممارسة الرياضة البدنية املكثفة ملدة 24 ساعة قبل سحب الدم من الوريد. استخدام بيئة يتم تخفيف اإلجهاد البدني والذهني فيها. االمتناع عن تناول االطعمة الدسمة والتدخني صباح يوم سحب الدم من الوريد. احلصول على العينات في الصباح الباكر )7 حتى 9 صباحا ( بعد أن يتم إجالس الشخص في وضع مريح ملدة 20 إلى 30 دقيقة. يجب دائما إنشاء نطاق طبيعي محليا وينبغي استخدام معلومات املصنع والتعليمات فقط كدليل. ويجب جمع العينات الطبيعية ومعاجلتها وحتليلها باستخدام تقنيات أقرب ما تكون إلى التطابق مع التقنيات املسخدمة لعينات املريض. والختبارات الكشف PT( )APTT حتديدا ينبغي النظر في احتمالية ان دفعة/ كمية جديدة من الكاشف من الشركة املصنعة نفسها حتتوي على مجموعة طبيعية مختلفة عن املواد السابقة املماثلة. ينبغي تدقيق بيانات مراقبة اجلودة الداخلية املتداخلة مع أي تغي ر. وتشير أية تغييرات إلى احلاجة ملجموعة طبيعية مختلفة. 24 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

31 ولغرض إجراء املقايسات ينبغي استخدام معلومات املصنع والتعليمات فقط كدليل. وأكثر تقنيات املقايسات مالءمة هي تلك التي ألجلها مت إنشاء املجموعة الطبيعية احمللية مشابهة إلى حد كبير لتلك املوجودة في التعليمات. وتختلف النطاقات العادية لبعض اختبارات التخثر لدى األطفال حديثي الوالدة )املولودون قبل املوعد أو مبدة احلمل الكاملة( واألطفال منها عند البالغني )1992 al.,1987,1990.)andrew et يجب استخدام النطاقات العادية وخصوصا الختبارات الكشف فقط كعامل مساعد للمعلومات السريرية. يتطلب بعض املرضى الذين لديهم تاريخ مرضي شخصي وعائلي مطابق املزيد من الفحوصات في حال وجود نتائج فحص طبيعية. أما املرضى اآلخرون ذوو نتائج الفحوصات غير الطبيعية فقد ال يتطلبون املزيد من الفحوصات حني يكون أمر النتائج غير الطبيعية جليا. لذا قد ال تكون احلدود الطبيعية متساوية حلدود القرار والتدخل. هناك أسباب إحصائية وراء احلاجة ل 120 شخصا على األقل لبناء مجموعة مرجعية صاحلة متاما ولكن ألغراض عملية ميكن احلصول على نتيجة مقاربة من خالل اختبار عدد أصغر بكثير وميكن اعتبارها مقبولة ألغراض سريرية من قبل عدد من اخلبراء امليدانيني )2008.)CLSI يجب أن ال يقل عدد األشخاص الطبيعيني الذين مت اختيارهم للتحليل عن 30 شخصا الختبارات فحوصات اإلرقاء املتعلقة باضطرابات النزف. يجب عند إنشاء نطاقات طبيعية جمع عينات من أشخاص طبيعيني ومعاجلتها وحتليلها محليا باستخدام تقنيات مطابقة لتلك املستخدمة في حتليل عينات املرضى. إذا كانت املمارسة العادية هي لعينات يتم تخزينها مجمدة لتحليل الدفعة فيجب أن يتم ذلك أيضا للعينات الطبيعية. إذا متت معاجلة عينات املريض بعد تأخير مت خالله نقل العينات إلى املختبر في غضون عدة ساعات فيجب أن يستخدم تأخير مماثل بني جمع العينات وفحصها بالنسبة لعينات األشخاص الطبيعيني املستخدمة الستخالص القيم املرجعية. ينبغي استخدام معلومات مصن ع الكاشف والتعليمات كدليل فقط. يتم استخدام النتائج التي مت احلصول عليها من عينات أشخاص طبيعيني وأصحاء في كل اختبار لبناء مجموعة مرجعية عادية. وي ظهر توزيع نتائج االختبار املتعلقة بأغلب فحوصات اضطرابات النزيف توزيعا عاديا أو مموها. ومن املفيد أن يتم تأكيد ذلك من خالل املراقبة البصرية للبيانات في شكل رسم بياني كما هو مبني في الشكل 1.8. قد تكون القيم املتطرفة الواضحة املوجودة بشكل غير متوقع بعيدا عن معظم القيم املرجعية األخرى نتائج شاذة على األرجح. من املقبول استبعادها من احلسابات األخرى. والعرف املستخدم كثيرا هو أن يشمل النطاق املرجعي أو العادي ال % 95 املركزية من القيم. إذا اختلف التوزيع بشكل ملحوظ عن ما موضح في الشكل 1.8 أن مييل في اجتاه واحد على سبيل املثال - فقد تكون هناك حاجة لعينات طبيعية إضافية. من املالئم استبعاد % 2.5 من القيم من الطرفني وترك ال % 95 املركزية. إذا كان التوزيع اعتياديا فمن املناسب حساب املتوسط واالنحراف املعياري للقيم العادية )كما هو موضح في القسم 5( واستخدام املتوسط زائدا ضعفي االنحراف املعياري )2SD( واملتوسط ناقصا ضعفي االنحراف املعياري )2SD( على أنها احلدود العليا والسفلى على التوالي. وعلى أي حال يجب فقط استخدام املعدل االعتيادي كدليل للمساعدة في التفسيرات السريرية. للحصول على املناقشة الكاملة حول إنشاء النطاقات املرجعية راجع ))2000).)CLSI يدايتعا يعجرم قاطن سيسأت 25

32 الشكل 1.8: توزيع نتائج )APTT( في مواضيع صحية واعتيادية عدد tested النتائج من بين normal subjects األشخاص amongst الطبيعين الذين results تم of فحصهم Number متوسط APTT 30 sec 30 ثانية Mean APTT standard ثوان 2.9 deviation االنحراف 2.9 القياسي sec النطاق sec الطبيعيrange ثاني Normal APTT (sec) APTT )بالثواني( 40 تلحظة: ت ظهر البيانات توزيعا عاديا موزعا بالتساوي على جانبي قيمة المتوسط. المراجع Andrew M, Paes B, Johnston M. Development of the hemostatic system in the neonate and young infant. Am J Pediatr Hematol Oncol 1990; 12: Andrew M, Paes B, Milner R, et al. Development of the human coagulation system in the full-term infant. Blood 1987; 70: Andrew M, Vegh P, Johnston, Bowker J, Ofosu F, Mitchell L. Maturation of the hemostastic system during childhood. Blood 1992; 80: Blomback M, Konkle BA, Manco-Johnson MJ, Bremme K, Hellgren M, Kaaja R on behalf of the ISTH SSC on Women s Health Issues. Preanalytical conditions that affect coagulation testing, including hormonal status and therapy. Thromb Haemost 2007; 5: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: Approved guideline, 2nd ed. 2000; Clinical and Laboratory Standards Institute Document C28-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-stage prothrombin time (PT) test and activate partial thromboplastin time (APTT) test: Approved guideline, 2nd ed. 2008; Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. 26 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

33 9 الكواشف كلوريد الكالسيوم على سبيل املثال مواد )BDH( الكيمياوية. احمللول املولي. :25mM يخفف 25 مل من احمللول )1M( إلى 1 لتر في دورق حجمي من املاء املقطر. حامض باربيتورات اورين المعزول ذي درجة الحموضة غ من ثنائي إثيل باربيتورات الصوديوم )الصوديوم باربيتون( غ من كلوريد الصوديوم 1 ضع املواد في الدورق احلجمي ثم أذب فيه ما مقداره 780 مل من املاء املقطر. 2 أضف 215 مل من حامض الهيدروكلوريك )0.1M(. 3 اضبط احلجم إلى لتر واحد باملاء املقطر. 4 إذا لزم األمر افحص درجة احلموضة واضبطها إلى 7.35 درجة. محلول اورين الملحي المعزول 200 مل من عازل باربيتورات اورين 800 مل محلول ملحي عادي )0.9 % غم كلوريد الصوديوم( عازل جليوكسالين 2.72 غ من جليوكسالني )إمييدازول( 4.68 غ من كلوريد الصوديوم 1 ضع املواد في الدورق احلجمي ثم أذب فيه ما مقداره 650 مل من املاء املقطر. 2 أضف مل من حامض الهيدروكلوريك )0.1M( واضبط درجة احلموضة إلى اضبط احلجم إلى لتر واحد باملاء املقطر إذا لزم األمر. 27 فشاوكلا

34 الكواشف المستخدمة الختبارات المشاهدة في املراحل األولى من فحوصات وتشخيص اضطرابات النزف فإن من األهمية البالغة اختيار وتطبيق فحص الكواشف املناسبة وال سيما بالنسبة الختبارات وقت البروثرومبني )PT( ووقت الثرومبوبالستني املنشط جزئيا.)APTT( وتتوفر العديد من الكواشف املختلفة في جميع أنحاء العالم. وحيث تتوفر التشكيلة الواسعة ينبغي عند االختيار األخذ بنظر االعتبار تباين احلساسية. وفي فحص اضطراب النزف بواسطة )PT( و) APTT ( يتعني أخذ مصادر املعلومات التالية املتعلقة باألداء احملتمل لكاشف معني بنظر االعتبار: البيانات املقارنة في ما يتعلق بالكواشف األخرى من مشاريع ضمان اجلودة اخلارجية )EQA( مثل مشروع ضمان اجلودة اخلارجية الدولي )انظر القسم 5( البيانات املنشورة اختبار محلي لبالزما مأخوذة من مريض معروف العلة وثائق بيانات املصن عني قد يكون اإلنتاج احمللي لكواشف )PT( و) APTT ( مغر من الناحية املالية إال أنه قد يسبب صعوبات في توحيد املقاييس وبالتالي من األفضل جتنبه. وجتد ر املالحظة أيضا أن بعض الشركات املصنعة تقدم كواشف مختلفة. وباإلضافة إلى ذلك قد تتغير تركيبة كواشف حتمل االسم نفسه من وقت آلخر. ويعني هذا أنه ال ميكن أعطاء توصيات باستخدام مصدر معني من املواد. 28 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

35 10 تعداد الصفائح المبدأ يتم مزج الدم مع سائل التخفيف الذي يؤدي إلى انحالل خاليا الدم احلمراء. يتم تعبئة عداد كريات الدم بسائل التخفيف وحت سب الصفائح الدموية حتت املجهر ويفضل باستخدام مجهر مرحلة التباين contrast( )phase إذا توفر. المواد/ المعدات حجرة عد رقيقة مسطحة القاع )جهاز عد اخلاليا نوعية نيوباور( لعد الصفائح بواسطة مجهر متايز طوري contrast( )phase مجهر متايز طوري contrast) (phase مجهز مبكثف طويل املدى إذا توفر وإال فيمكن استخدام مجهر ضوئي عادي ماصة 20 مايكرولتر ماصة مدرجة 2 مل أنبوب بحجم ملم خالط ميكانيكي الكاشف سائل تخفيف: % 1 من أكسالت األمونيوم في املاء املقطر. ي خزن في الثالجة وتتم تصفيته دائما قبل استعماله. العينة إذا كانت عينة الدم مأخوذة من وخز اإلصبع فيجب أن يكون الثقب نظيفا والدم يتدفق بسالسة. مت سح أول قطرة من الدم. إذا كانت عينة الدم مأخوذة من الدم الوريدي فال بد من جمعها في حقنة بالستيكية جافة )أو زجاجة بغطاء من السيليكون( ذات إبرة قصيرة ال تقل عن مقياس 21. يجب إزالة اإلبرة قبل أن ي سلم الدم في الوعاء البالستيكي مع.)EDTA( يجب أن يتم مزج الدم ومضاد التخثر بلطف لتجنب تزبده ودون أي تأخير. الطريقة 1 يتم مص 0.38 مل من سائل التخفيف إلى أنبوب اختبار. 29 حئافصلا دادعت

36 2 تعبئة املاصة ب 20 مايكرولتر حتى العالمة ثم مسح املاصة من اخلارج. 3 تفريغ محتوى املاصة في سائل التخفيف ويتم غسل املاصة بسحب الدم وتفريغه في األنبوب عدة مرات. مي زج ملدة ال تقل عن 10 دقائق يدويا أو ي فضل بواسطة خالط ميكانيكي. 4 تعبئة عداد الكريات وكما موضح أدناه. 5 تغطى احلجرة بطبق بتري petri dish ملدة 10 إلى 20 دقيقة إلتاحة استقرار الصفائح الدموية. تترك قطعة قطن مبللة أو ورق الترشيح داخل الطبق ملنع التبخر. 6 حت سب الصفائح باستخدام املجهر في مربعات كبرى مبساحة 1 ملم )= 0.1 مايكرولتر(. يتم عد الصفائح الدموية في عدة مربعات حسب الضرورة للحصول على عدد ال يقل عن 100. تظهر الصفائح مستديرة أو بيضوية وتتيح بنيتها احلبيبية الداخلية وملعانها األرجواني متييزها من دون بقية املكونات. وتبدو أشباح خاليا الدم احلمراء التي مت عزلها بواسطة أكسالت األمونيوم في اخللفية. إذا لم يتوفر مجهر التمايز الطوري فيمكن استخدام مجهر ضوئي عادي مع تخفيض املكثف باستمرار لتوفير كثافة ضوئية منخفضة. 7 حساب عدد الصفائح الدموية للتر الواحد من الدم وفقا للمعادلة الواردة أدناه. ع داد الكريات يتم إنشاء حجرة عداد الكريات مع نيوباور أو النيوباور القوي احملسن بحيث تكون املسافة بني اجلانب السفلي من زجاج الغطاء وسطح احلجرة 0.1 ملم. يحتوي سطح احلجرة على مجالني محكومني خصيصا بأبعاد كاملبينة في الشكل يحتوي امللمتر املربع املركزي على خطوط حدود ثنائية أو ثالثية. في املناطق الوسطى هناك 25 مربعا في النيوباور احملسنة و 16 مربعا في النيوباور املتحكمة. تبلغ مساحة كل مربع 0.04 ملم ) ملم(. وهذه املربعات بدورها مقسمة الى مربعات أصغر مبساحة ملم 2 لكل منها ) ملم(. واألرباع اخلارجي للمنطقة احلاكمة التي مساحة كل منها 1 ملم 2 وهي مقسمة إلى 16 مربعا. الحسابات معادلة حساب عدد اخلاليا هي: )N D/A ( العدد الكلي للخاليا احملسوبة التخفيف املساحة الكلية احملسوبة )بامللمتر املربع( العامل حلساب احلجم باملايكرولتر من املساحة )بامللمتر املربع( وعمق احلجرة )0.1 ملم( العامل لتحويل العدد من ( / مايكرولتر إلى / لتر( = = = = = = العدد )خاليا/لتر( حيث )N( )D( )A( )10( )10 6 ( 30 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

37 الشكل 10.1: حجرة الفرز لعداد الكريات )أ( نيوباور و )ب( نيوباور المحسنة )أ( 1 mm 3 mm 1 mm )ب( 1 mm 3 mm حئافصلا دادعت 31

38 مصادر الخطأ في عد ال ليا حني يتم استخدام الدم من األوعية الشعيرية يجب احلصول على قطرات حرة التدفق. عندما يتم استخدام الدم مبضاد التخثر يجب أن تكون العينة ممزوجة بعناية من خالل قلب أنبوب الدم مبا ال يقل عن 20 مرة قبل أخذ العينة. ال تقم برج األنبوب ألن رجه يولد رغوة مما يجعل املص الدقيق مستحيال. قم بإمالة األنبوب املمزوج جيدا بزاوية 45 أو أكثر قليال وقم باملص من حافة األنبوب باتباع اإلجراءات نفسها للدم الشعيري. يجب أن تكون ماصات أخذ عينات الدم نظيفة وجافة. يجب ملء املاصة بسرعة ويجب أن يتم سحب الدم بدقة باستخدام جهاز شفط املاصة املرفق بها والتعبئة إلى اخلط املطلوب. إذا مت جتاوز اخلط قليال فيمكن طرد الدم الزائد عن طريق مس حافة املاصة بقطعة من ورق الترشيح أو بقماش ناعم. إذا مت جتاوز اخلط فيجب استخدام ماصة جديدة. ال ينبغي وجود فقاعات هواء في عمود الدم. يجب أن مت سح املاصة من اخلارج من الدم )واحلرص على عدم سحب الدم من الطرف( قبل أن يتم إدخالها في سائل التخفيف. بعد أن مت تفريغ محتويات املاصة في املخفف يجب سحب سائل التخفيف إلى املاصة من خالل عدة مرات من الشفط املطرد لضمان أن يتم تفريغ جميع الدم في السائل. يجب رج األنبوب الذي يحتوي على الدم املخفف بلطف يدويا لدقيقتني على األقل أو يفضل استخدام هزاز ميكانيكي. وبعد رج األنبوب تتم تعبئة احلجرة فورا بواسطة ماصة باستور أو األنبوب الشعيري. مت أل احلجرة بواسطة اخلاصة الشعرية من خالل تدفق السائل من املاصة أو من الشعيرات املنتظمة بحيث متتلئ بسرعة وبسالسة. يجب أن يتم ملؤها متاما ولكن ال يجب أن ينتشر السائل إلى األخاديد. دع اخلاليا تستقر في منطقة العد ملدة بني 10 إلى 20 دقيقة ثم استمر في عملية العد. يجب أن تكون حجرة عد الكريات والغطاء الزجاجي نظيفة وجافة قبل استخدامها. وميكن أن حتدث أخطاء كبيرة نتيجة بصمات األصابع أو الشرائح الفلمية الدهنية. وال بد من حساب عدد كاف من اخلاليا لتقليل اخلطأ الناجم عن التوزيع االعتباطي للخاليا. وعمليا يجب أن يتم حساب ما ال يقل عن 100 خلية. وكمزيد من التدقيق للتوزيع الصحيح في احلجرة يجب أن ال يختلف عدد اخلاليا احملسوبة في كل منطقة )أي في املربعات الكبيرة( بأكثر من %. 10 الضوابط يجب القيام بعمليتي تخفيف وأخذ متوسط احلسابني ويجب أن يتفق احلسابان ضمن نطاق % تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

39 مصادر الخطأ في عد الصفائح إن الدم املأخوذ عن طريق وخز الوريد هو أفضل من الدم الشعيري ألن الصفائح تتمسك باجلرح والتخفيفات املتالحقة من وخز االصبع ليست قابلة للتكرار دائما. مت وصف األخطاء العامة لعملية السحب باملاصة وعد الكريات أعاله. وإضافة إلى ذلك يجب إيالء اهتمام خاص لضمان أن تكون حجرة العد نظيفة بدقة إذ ميكن أن يتم عد األوساخ والغبار على أنها صفائح دموية. اغسل احلجرة باملاء والصابون ثم اشطفها باملاء املقطر واتركها لتجف بانسياب املاء منها ثم امسحها بنسيج قماشي خال من الوبر. تأكد من أن قطعة الغطاء نظيفة قبل استخدامها. يحول وجود كتل من الصفائح الدموية دون اعتمادية العد. إذا كانت العينة حتتوي على كتل فيجب أخذ عينة جديدة. يجب أن يبقى مخفف أكسالت األمونيوم مبردا ويجب التخلص منه إذا كان هناك دليل على تلوث بكتيري. يجب القيام بحساب العينة خالل ثالث ساعات من جمعها. حئافصلا دادعت 33

40 11 زمن النزف المبدأ وقت النزف هو الوقت الذي يستغرقه اجللد املقطوع قياسيا لعمق وطول ثابتني إليقاف النزيف. حتدث إطالة وقت النزف للمرضى الذين يعانون من نقص الصفائح )thrombocytopenia( وأمراض فون ويلبراند وهن صفيحات جالنزمان thrombasthenia( )Glanzmann s ومتالزمة برنار سولييه )Bernard-Soulier( مرض عوز تخزين الصفائح واضطرابات الصفاح األخرى. الفيبرينوجني مطلوب وقد مت اقتراح دورا ل )FV( لذا قد ميكن إطالة وقت النزيف للمرضى الذين يعانون من نقص في الفيبرينوجني أو.)FV( وحتدث اإلطالة أيضا لدى املرضى الذين يعانون من أمراض الكلى وأمراض نقص بروتني الدم واضطرابات األوعية الدموية. المواد/ المعدات جهاز قياس ضغط الدم مسحات تطهير جهاز قالب وقت النزيف ورق ترشيح بسمك 1 ملم ساعة توقيت الطريقة 1 يوضع حزام جهاز قياس ضغط الدم حول أعلى الذراع وي نفخ حتى درجة 40 ملم من الزئبق. ويستمر هذا الضغط طوال االختبار. 2 يتم تنظيف السطح الظهري من الساعد ويوضع جهاز وقت النزيف بثبات على اجللد بدون ضغط. ي ضغط الزناد وتبدأ ساعة التوقيت. 3 ينبغي جتنب األوردة السطحية والندبات والكدمات. 4 عند الثانية 30 من الوقت نش ف تدفق الدم بواسطة ورق الترشيح. أحضر ورق الترشيح قريبا من الشقوق دون املساس بحافة اجلرح. 5 سجل الوقت من الوخز وحتى وقف النزيف. 34 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

41 التفسير يصل املعدل الطبيعي لدى البالغني الى ثماني دقائق لكنه قد يختلف وفقا للطريقة املستخدمة. الملحظات هناك نوعان من األجهزة املتوفرة جتاريا والقادرة على تنفيذ وقت النزيف عند كتابة هذا التقرير. ينبغي إنشاء معدل طبيعي محليا وبغض النظر عن اجلهاز املستخدم. ينبغي أن يكون الشق باجتاه مواز لطول الذراع. جتعل الشقوق العمودية النزف يستمر لوقت أطول. ينبغي تكرار النتيجة غير الطبيعية. ليس من الضروري أن ت سجل نقطة النهاية إذا استمر النزيف أكثر من 20 دقيقة. ينبغي األخذ بنظر االعتبار تأثير األدوية املتداخل مع وظيفة الصفائح. على سبيل املثال ميكن لألدوية التي حتتوي على األسبرين أن تسبب إطالة النزف. لذا يجب عدم تناول هذه األدوية قدر املستطاع ملدة سبعة أيام قبل االختبار. هناك احتمال حدوث ندبات في موقع شقوق وقت النزف. ويجب إعالم املرضى بهذا قبل تنفيذ الشق. المرجع Mielke CH. Measurement of the bleeding time. Thromb Haemost 1984; 52: فزنلا نمز 35

42 12 زمن البروثرومبين )PT( المبدأ يعكس هذا االختبار الكفاءة العامة للنظام اخلارجي فهو حساس لتغييرات العوامل )X V( VII وأقل حساسية للعامل )II( )البروثرومبني( كما أنه غير مناسب للكشف عن التغييرات الطفيفة في مستوى الفيبرينوجني إال أنه قد يكون غير طبيعي إذا كان مستوى الفيبرينوجني منخفضا جدا أو إذا كان هناك مانع ما. وتتأثر حساسية االختبار بالكاشف وبالتقنية املستخدمة فمن املهم إنشاء مجموعة مرجعية محليا. يظهر الشكل 1.12 أدناه املسار الذي مت قياسه في وقت البروثرومبني. ويحتوي الكاشف )PT( الذي غالبا ما ي طلق عليه الثرومبوبالستني على معامل أنسجة ودهون فوسفاتية. وتتوفر الكثير من الكواشف املناسبة جتاريا. يضم القسم 9 مالحظات حول اختيار الكواشف. الكواشف الثرومبوبالستني )قد يحتوي هذا الكاشف على كلوريد الكالسيوم( 25 م م من كلوريد الكالسيوم )مطلوب فقط إذا كان كاشف الثرومبوبالستني ال يحتوي على الكالسيوم( الطريقة: يدوية 1 أضف 0.1 مل من البالزما االعتيادية لألنبوبني األولني ودفئهما إلى درجة 37 مئوية ملدة دقيقتني. 2 أضف 0.2 مل من كاشف الثرومبوبالستني )املسخ ن مسبقا حتى 37 مئوية( )إذا و جد الكالسيوم في الكاشف(. 3 شغ ل ساعة التوقيت قم باملزج وسجل أوقات التخثر. 4 كرر العملية لكل عينة اختبار. 5 سج ل وقت التخثر للمريض بالثواني. 36 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

43 بالنسبة للتقنية اليدوية قم بأداء جميع االختبارات مكررة. وينبغي أال تختلف مرات التخثر املتكررة بأكثر من %. 10 بالنسبة لالختبارات اآللية التي تتخللها مقايسة )CV( بأقل من % 5 فسيكون اختبار واحد مقبوال عادة وت فحص النتائج املطولة املقدمة. الملحظات إذا لم يكن كاشف الثرومبوبالستني يحتوي على الكالسيوم فإن إجراء االختبار هو 0.1 مل بالزما 0.1 مل ثرومبوبالستني ويتخثر مع 0.1 من mm 25 من كلوريد الكالسيوم مسبق التسخني. تنشيط العامل )FIX( بواسطة عامل النسيج ( )FVII يحدث في اجلسم احلي. وفي ظروف أكثر اختبارات )PT( فإن العامل )X( مفعل بقوة بحيث أن املقايسة غير حساسة لنقص العامل )IX( أو.)VIII( ينبغي تسخني الثرومبوبالستني/ كلوريد الكالسيوم مسبقا ملدة مابني 5 إلى 30 دقيقة قبل االستخدام. تتأثر أوقات التخثر عادة باستخدام مقاييس تخثر مختلفة اعتمادا على كيف ومتى يتم الكشف عن نقطة النهاية. ويؤكد هذا أكثر على أهمية إنشاء نطاقات طبيعية للطريقة املستخدمة في املختبر حاليا. في حال وجود عيوب طفيفة في العوامل II( VII V أو X( فقد تكون درجة اإلطالة في حدها األدنى. في حالة نقصان العامل )II( قد يكون )PT( ضمن املعدل الطبيعي. ميكن أن تتأثر بعض كواشف )PT( بسبب وجود مضادات تخثر داء الذئبة/ مضادات الفسفوليبيد وبعض األنواع النادرة من األجسام املضادة والتي قد تؤدي إلى إطالة )PT( دون أي إطالة ل.)APTT( تكون الكواشف ذات تركيزات الفسفوليبيد األقل أكثر عرضة للتأثر مبا في ذلك بعض الكواشف التي يتم بناؤها بواسطة عوامل نسيج دهني مؤلف. ميكن أن يؤدي وجود العامل املنش ط )VII( إما بعد العالج بالعامل املؤتلف )VIIa( أو عند تنشيط العامل )VII( األصلي إلى تقصير.)PT( يعتمد التأثير على كاشف عامل النسيج املستخدم. إن الكواشف التي حتتوي على عامل النسيج البقري معرضة لهذا التأثير بشكل خاص )كيتشني وآخرون 1992(. يجب أال ت خزن عينات الدم ما بني درجات مئوية قبل حتديد )PT( إذ قد يحدث تنشيط )FVII( البارد. ميكن أن تكون كمية الدم املجموعة لتحديد )PT( مستقرة ملدة ال تقل عن 24 ساعة اعتمادا على الكاشف املستخدم. )بيجلني ولودجنتون 1997(. قد تختلف عينات )PT( ذات الكواشف التي حتتوي على معامل النسيج البشري عن العينات املستحصلة بالكواشف التي حتتوي عوامل نسيج من فصائل األخرى مثل األرانب. في حاالت كهذه فإن النتيجة التي مت احلصول عليها من كواشف عامل النسيج البشري تكون أكثر داللة خلطر النزيف. للحصول على املناقشة الكاملة عن املواضيع التعلقة )PT( انظر ((2008).(CLSI ( نيبمورثوربلا نمزمزز 37

44 الشكل 1.12: يتم قياس المسار من خلل اختبار وقت البروثرومبين VII العامل النسيجي + العامل السابع /PL/Ca++ العامل العاشر X العامل العاشر Xa مع /PL/Ca++ العامل الخامس V بروثرومبين )العامل الثاني )II ثرومبين )العامل الثاني )IIa فيبرينوجين فيبرين = تفعيل = PL فوسفوليبيد المراجع Baglin T, Luddington R. Reliability of delayed INR determination: implications for decentralised anticoagulant care with off-site blood sampling. Br J Haem 1997; 96: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-Stage Prothrombin time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test: Approved guideline, 2nd ed Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. Kitchen S, Malia RG, Preston FE. A comparison of methods for the measurement of activated factor VII. Thromb Haemost 1992; 68: تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

45 )APTT( زمن تفعيل الثرومبوبلستين الجزئي 13 المبدأ ليس هذا االختبار محددا للنظام اجلوهري system( )Intrinsic فحسب بل هو أكثر اختبارات املعاينة فائدة لكشف نقص العوامل الثامن VIII والتاسع IX واحلادي عشر XI والثاني عشر XII حني يقترن بوقت البروثرومبني الطبيعي. سيتعرض APTT إلى اإلطالة أيضا عند أي نقص ينطوي على مسارات مشتركة )نقص العوامل اخلامس V والعاشر X والثاني II و الفيبرينوجني إلى حد أقل( وفي حال وجود املثبطات. سيعمل وجود بعض املثبطات العالجية للتخثر مثل الهيبارين أيضا على إطالة.APTT ومن املهم أيضا استبعاد احتمال استخدام مثل هذه املعاجلات عند التحقيقات األولية ل APTTs املط ول. تتم إطالة أمد الAPTT في وجود البريكاليكرين )PKK( أو نقص مولد الكاينني ذي الوزن اجلزيئي العالي )HMWK( ما لم يتم إجراء االختبار باستخدام الكاشف الذي يحتوي على حامض إيالجيك كمنشط. في هذه احلالة سيكون APTT طبيعيا وحتى في غياب هذه العوامل بشكل كامل. ي ظهر الشكل 2.13 املسار الذي مت قياسه بواسطة.APTT الكواشف كاشفAPTT 25 ملم من كلوريد الكالسيوم الطريقة 1 ضع أنبوبا يحتوي على كلوريد الكالسيوم في درجة 37 مئوية ملدة خمس دقائق قبل االستخدام. 2 امتص مقدار 0,1 مل من كاشف APTT في أنبوبي تخثر زجاجيني في درجة 37 مئوية. 3 امتص مقدار 0,1 مل من بالزما التحكم في األنبوب األول. 4 ابدأ ساعة التوقيت الرئيسية. امزج. 5 أضف مقدار 0,1 مل من بالزما التحكم إلى األنبوب الثاني. امزج. (APTT) نيتسالبوبمورثلا ليعفت نمز (APT( 39

46 6 بعد وقت احلضانة * املوصى به أضف 0,1 مل من كلوريد الكالسيوم لكل أنبوب بالتعاقب وابدأ ساعة توقيت جديدة لكل أنبوب. امزج. سجل وقت تكو ن اخلثرة. بالنسبة للتقنية اليدوية قم بإجراء بجميع االختبارات بشكل مكرر. ال ينبغي أن تختلف أوقات التخثر املتكررة بأكثر من %. 10 بالنسبة لالختبارات اآللية باتباع مقايسة درجة التباين ما بينها ألقل من % 5 سيكون التكرار املفرد مقبوال في العادة شريطة أن يتم التحقق من النتائج املطولة. * ينبغي ات باع توصية الشركات املصنعة للكاشف. ويتم هذا عادة في نطاق دقيقتني إلى خمس دقائق. ومن املهم جدا أن يتم توقيت احلضانة بالضبط إذ سيؤثر االنحراف عن هذا عادة على النتائج مع فترات احلضانة املطو لة التي تعطي أوقات تخثر أقصر ألي كاشف معني. تفسير النتائج يجب إنشاء معدل طبيعي محليا. يشير APTT املطول مع PT الطبيعي إلى وجود نقص ممكن من العوامل,VIII( )XII,XI,IX ومولد الكاينني ذي الوزن اجلزيئي العالي والبريكاليكرين أو وجود مثبط ما. في حاالت APTT املطو ل يجب اختبار مزيج متساو من البالزما الطبيعية وبالزما االختبار )أي مزيج من جزء اختبار واحد وجزء بالزما طبيعية واحد ويسمى ذلك مزيج 50:50 كما مبني أدناه(. إذا مت تصحيح ال APTT بأكثر من % 50 من الفرق بني أوقات تخثر البالزما الطبيعية وبالزما االختبار فسيؤشر ذلك نقصا في العامل. قد يدل تصحيح الضعف على وجود مثبط ما ومن املمكن في أحد عوامل التخثر في النظام أو من نوع غير محدد مثل تخثر داء الذئبة )انظر القسم 25(. الشكل 1.13: مثال على تفسير APTT العينة النتيجة 35 ثانية التحكم ب APTT 60 ثانية االختبار إذا كان المزج 50:50 42 ثانية )هذا تصحيح جي د فعلى األرجح يوجد نقص في العامل( إذا كان المزج 50:50 52 ثانية )هذا تصحيح غير جي د لذا من المحتمل وجود مثبط ما( 40 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

47 الملحظات تتوفر العديد من الكواشف املناسبة جتاريا. وتتضمن هذه الكواشف موادا ذات حساسيات مختلفة. يضم القسم 9 مالحظات حول اختيار الكواشف. أما بخصوص PT فيمكن أن يتأثر التخثر باستخدام جهاز التخثر.)coagulometer( ضمن البالزما اخلاصة باالختبار ميكن للمستويات العالية من عامل تخثر واحد تعويض املستويات املنخفضة للعوامل األخرى. على سبيل املثال ميكن أن يؤدي االرتفاع امللحوظ مبستوى العامل الثامن )FXI( أو )FIX( اعتيادي في وجود انخفاض مستوى APTT خالل املرحلة احلرجة إلى )FVIII( والتي قد تكون لهما أهمية سريرية. إذا كان املريض يعاني من أعراض شخصية مواتية أو تاريخ عائلي مفترض الضطراب النزف فإن التحقق املكتمل مبا فيه من فحص لعوامل محددة قد يكون له ما يبرره في وجود APTT الطبيعي ال سيما إذا كانت النتيجة تكمن في اجلزء العلوي من مجموعة املرجع. يختلف تركيز الفسفوليبيد بشكل ملحوظ بني الكواشف. وهذا هو أحد األسباب التي جتعل درجة حساسية الكواشف مختلفة بشكل ملحوظ ملضادات التخثر عند وجود مرض الذئبة. إذا مت استخدام كاشف متحسس الذئبة لل APTT األولي فمن املفيد إجراء APTT ملرة ثانية باستخدام كاشف مثل األكتني FS( )Actin )دايد بهرنغ ماربورغ أملانيا( والتي حتتوي على تركيز عال جدا للفسفوليبيد )كيتشني وآخرون 1999(. إذا تسبب تخثر داء الذئبة باإلطالة مع الكاشف األول فإذن سيكون APTT الثاني على األغلب طبيعي دائما. إذ يطيل عدد قليل جدا من مضادات تخثر الذئبة ال APTT عند استخدام األكتني FS(.)Actin فحصوات التحقق من ال APTT الطويلة المعزولة بالنسبة للمرضى الذين لديهم وقت بروثرومبني عادي و APTT مطو ل يكون التسلسل الطبيعي للتحقيق الواجب اتباعه هو: 1 حتديد وقت الثرومبني )انظر القسم 15(. إذا كان طبيعيا أكمل إلى اخلطوات 2 و 3. إذا كان وقت الثرومبني أطول كرر مع وجود سلفات البروتامني )انظر القسم 16(. إذا مت تصحيح وقت الثرومبني إلى الوضع الطبيعي سيوحي هذا بوجود الهيبارين ولن يتطلب األمر اجراء املزيد من االختبارات املبينة أدناه. إذا لم ي عرف عن املريض تعاطيه ألي نوع من الهيبارين فيجب طلب تكرار العينة. 2 حدد ال APTT على مزيج من البالزما الطبيعية والبالزما املريضة )انظر القسم 14( باستخدام مزيج بنسبة )50 1:1 %( طبيعية:مريضة. يشير فشل تصحيح مزيج الAPTT بنسبة % 50 إلى الوضع الطبيعي وجود مثبط ما. 3 حدد ال APTT مع الكاشف الثاني الذي يحتوي على تركيز عالي للفوسفوليبيدات مثل األكتني FS( )Actin )دايد بهرنغ(. إذا كان APTT األولي طويل املدة بوضوح )مبا ال يقل عن ثالث ثوان فوق احلد األعلى الطبيعي لالستخدام( ويكون األكتني FS( )Actin طبيعيا فإن تخثر داء الذئبة هو السبب احملتمل. وميكن تأكيد هذا في وقت الحق عن طريق اختبارات معينة مثل وقت مزج رسل لسم االفعى DRVVT( انظر القسم 38( ورغم أن هذا ليس ضروريا عادة في غياب أية شروط حتقيق ممكنة لتخثر الذئبة )LAC( بوصفها عامل خطر لتجلط الدم. نادرا جدا ما يكون نقص البريكاليكرين سببا 41 (APTT) نيتسالبوبمورثلا ليعفت نمز (APT(

48 ممكنا آخر للAPTT االعتيادي مع األكتني FS( )Actin وال APTT طويل املدى امللحوظ مع كاشف يستخدم السليكا أو الكاولني كمنشط. ومثل معظم حاالت )LAC( ال يرتبط هذا مع أي من أخطار النزف. لذلك ومرة أخرى قد ال يكون التأكيد مطلوبا. 4 عندما يكون ال APTT األولي طويل األمد بوضوح )ثالث ثوان أو أكثر( ويكون األكتني APTT( )Actin FS طبيعيا ليست هناك حاجة إلجراء فحوصات العامل. 5 إذا كانت كال فترتي APTT طويلة نفذ فحوصات FVIII:C( FIX, و )FXI على النحو املطلوب )انظر القسم 23(. ميكن إجراء فحص )FXII( إذا لزم األمر ومبا أن النقص شائع نسبيا فيمكن أن يفسر هذا الكشف إطالة أمد ال.APTT وليس من الضروري استبعاد وجود اضطرابات النزف إذ ال يرتبط نقص ال FXII بخطر زيادة النزف. 6 ترتبط الكواشف مثل األكتني FS( )Actine التي تستخدم حمض اإليالجيك كمنشط اتصال مع النتائج الطبيعية في وجود نقص وحتى الشديد من البريكاليكرين. ميكن تطبيق اخلطوات 1 إلى 3 في وقت واحد توفيرا للوقت عند االقتضاء. الملحظات يستثني الAPTT العادي مع األكتني FS( )Actin املتجمع مع ال APTT األولي املطو ل IL( )Synthasil/ عادة وجود نقص في العوامل FVIII( FXI, أو )FXI وفي هذه احلالة ليست هناك حاجة لفحوصات العامل. ميكن أن يحدث الAPTT الطبيعي نادرا مع أي كاشف عندما تنخفض نسبة العوامل FIX( أو )FXI بشكل معتدل وحدة/ ديسلتر ويرتفع العامل الثامن FVIII بشكل ملحوظ. تكون قيمة ال APTT مع األكتني FS( )Actin طبيعية في كثير من األحيان اذا كانت قيمة العامل )FXII( في نطاق )20 وحدة/ ديسلتر( إلى )50 وحدة/ ديسلتر( اما في حال استعمال الكاولني أو السيليكا املنشطة تكون قيمة ال APTT املطو ل معتدلة. وليس لهذا العيب عالقة سريرية. يطيل عدد قليل من موانع تخثر داء الذئبة القوية أمد ال APTT مع األكتني FS(.)Actin تقوم أجسام مضادة معينة ل FVIII( أو FIX أو )FXI بإطالة أمد ال APTT بغض النظر عن الكاشف. لالطالع على مناقشة كاملة للمواضيع املتعلقة بتحديد APTT انظر )2008.)CLSI 42 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

49 الشكل 2.13: المسار الذي تم قياسه بواسطة APTT تفعيل االتصال الذي يتدخل فيه البريكالكرين الكينينيوجين عالي الوزن الجزيئي والسطح ذو الشحنة السالبة العامل الثاني عشر XII العامل الثاني عشر XIIa العامل التاسع IX العامل التاسع IXa مع /PL/Ca++ العامل السابع VII العامل العاشر X العامل العاشر Xa مع /PL/Ca++ العامل الخامس V العامل الثاني II العامل الثاني IIa الفيبرينوجين الفيبرين = تفعيل = PL فوسفوليبيد المراجع Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). One-Stage Prothrombin time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test: Approved guideline, 2nd ed Clinical and Laboratory Standards Institute Document H47-A2. Kitchen S, Cartwright I, Woods TA, Jennings I, Preston FE. Lipid composition of 7 APTT reagents in relation to heparin sensitivity Br J Haematol 1999; 106: (APTT) نيتسالبوبمورثلا ليعفت نمز (APT(

50 مزج االختبارات لمزيد من التحقيق عن )PT( و )APTT( غير الطبيعي 14 المبدأ ميكن أن تخضع عينات البالزما ذات نتائج االخبار غير الطبيعية )مثال )PT/ APTT للمزيد من الفحوصات لتحديد اخللل بواسطة اختبارات املزج. ومن املهم في بادئ األمر التثبت أن يتم تصحيح اخللل في بالزما املريض ببالزما طبيعية لغرض إزالة وجود املثبط. يشير تصحيح الشذوذ عن طريق إضافة واحد من الكواشف املوضحة أدناه إلى أن الكاشف املضاف يجب أن يحتوي على املادة الناقصة من عينة االختبار. ويتم تتكرر فحوصات العينات غير الطبيعية في مخاليط ذات حجم متساو )وكما يطلق عليه أدناه 50:50( من املضافات وبالزما االختبار. ميكن استخدام العوامل التالية الختبارات اخللط: البالزما العادية البالزما املعمرة البالزما املكثفة البالزما ناقصة )FVIII( البالزما ناقصة )FIX( البلاتا المعمرة 1 يضاف الدم الوريدي الطبيعي إلى 1/9 من حجم 0.1 م من أوكسالت الصوديوم. 2 يتم طرد الدم مركزيا للحصول على البالزما ذات الصفائح الدموية القليلة واملفصولة في ظروف معقمة ويتم حضنها بدرجة 37 مئوية ملدة يومني أو ثالثة أيام. 3 يجب أن يتجاوز وقت البروثرومبني في نهاية هذه العملية 90 ثانية مع الثرومبوبالستني احلساس. 4 ثم يتم توزيع البالزما مبقادير متساوية في حاويات بالستيكية وحفظها بدرجة 35- مئوية )أو أقل(. تعاني البالزما املعمرة نقصا في العوامل )V( و.)VIII( 44 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

51 البلاتا المكثفة 1 يتم حتضير هالم هيدروكسيد األلومنيوم )األلومينا( مبزج 1 غرام من الهالم املرطب مع 4 مل من املاء املقطر إلى للحصول على لزوجة سلسة. 2 يتم أخذ البالزما قليلة الصفائح املمزوجة باحلامض من خمسة متبرعني طبيعيني ويتم جمعها. 3 يضاف حجم عشر من هيدروكسيد األملنيوم إلى البالزما مسبقة التسخني املخلوطة واملوضوعة في احلاضنة ملدة ثالث دقائق بدرجة 37 مئوية. 4 ثم يتم طرد اخلليط فورا )1700 غ )gravety( ثالث دقائق بدرجة حرارة الغرفة( لترس ب الهالم. 5 يتم وضع البالزما الطافية في حاويات بالستيكية وميكن حفظها بدرجة 35- مئوية لعدة أسابيع. وللبالزما املكثفة نقص في العوامل IX VII II و X )العوامل املعتمدة على فيتامني- K (. ويجب أن يكون وقت البروثرومبني لهذه <60 ثانية مع كاشف حساس. مالحظة: يجب توخي احلذر عند وقت التكثيف إذ قد يؤدي التكثيف املفرط إلى فقدان عوامل تخثر الدم األخرى. البلاتا ذات النقص في العوامل FIX( )FVIII/ تكون البالزما املأخوذة من املرضى الذين يعانون من النقص احلاد املعزول )وحدة دولية واحدة/ دل )IU/dl من العامل )FVIII( أو )FIX( مفيدة جدا لدراسات املزج. حيثما توفرت ينبغي تفضيل استخدامها على البالزما املعمرة والبالزما املكثفة. وينبغي أن تكون البالزما التي يتم اختيارها لهذا الغرض ذات )PT( طبيعي مما يؤكد أن عوامل التخثر التوليفية األخرى في الكبد من املرجح أن تكون في مستويات عادية. وميكن لهكذا بالزما أن يتم جتميدها بالتجفيف لغرض التخزين طويل األجل أو تخزينها كبالزما بدرجة 35- مئوية )أو أقل( ملدة ال تقل عن ثالثة أشهر. باستخدام مزيج من املواد املضافة وبالزما املريض بنسبة 50:50 ميكن حتديد وصف الشذوذ. في احلاالت التي توجد فيها إطالة معزولة من APTT فت فضل البالزما ذات النقص في FVIII على البالزما املعمرة وباملثل ت فضل البالزما ذات النقص في FIX على البالزما املكثفة. تلحظات يتوفر هيدروكسيد األملنيوم من )BDH( بوول BH15 ITD انكلترا. ال تظهر املوانع غير احملددة التي تؤثر على )APTT( في العادة )مثل مضاد تخثر الذئبة( أي التصحيح ومع ذلك فمن احملتمل أن تكون البالزما التي حتتوي على مثبطات ضعيفة أو منخفضة العيار األضعف ذات تصحيح جزئي للبالزما العادية. نع االختبارات لمزير تق التح يس عق )زما جزم جزمارابتخالا جزم 45

52 قد ترتبط مثبطات محددة ضد FVIII مع قلة التصحيح الفوري لل APTT بواسطة البالزما الطبيعية املضافة. وفي حاالت أخرى هناك تصحيح فوري من قبل البالزما الطبيعية تليها إطالة APTT في اخلليط مبرور الوقت. وميكن اختبار مزيج بالزما االختبار والبالزما الطبيعية بعد ساعة واحدة في درجة 37 مئوية جنبا إلى جنب مع محددات APTT على البالزما الطبيعية وبالزما االختبار والتي مت احتضانها بشكل منفصل في الوقت ذاته. إن املوانع احملددة ضد عوامل التخثر األخرى نادرة بشكل خاص إال أنها ميكن ان حتدث. فمن غير املمكن التعميم حول سلوكها في جتارب املزج ما عدا أن موانع FIX عادة ما تكون سريع املفعول. ت ظهر بعض أمثلة APTTs لدي األشخاص ذوي الهيموفيليا املكتسبة )A( عيار األجسام املضادة ل FVIII وتأثير إضافة % 20 و 50 % من البالزما الطبيعية املجمعة وكما م بني في الشكل لدى طريقة APTT املستخدمة 37 ثانية كحد أعلى للمعدل الطبيعي. ويوضح هذا أنه في وجود هكذا أجسام مضادة ملكافحة FVIII ميكن أن يكون هناك تصحيح كامل في مزيج 50:50 للمريض والبالزما العادية املجمعة في بعض احلاالت. إذا مت حضن هذه اخلالئط في درجة 37 مئوية فإن هناك زيادة مطردة في.FVIII يعمل على تثبيط FVIII كجسم مضاد ل APTT الشكل 1.14: نمط مزج نتائج االختبار في وجود قصور لعامل فردي الخلل في اختبار البالزما البالزما المعمرة ذات النقص في FVIII البالزما المكثفة ذات النقص في FIX البالزما الطبيعية APTT غير طبيعي دون تصحيح تصحيح تصحيح FVIII غير طبيعي تصحيح دون تصحيح تصحيح FIX غير طبيعي تصحيح تصحيح تصحيح FXI / FXII المانع غير طبيعي دون تصحيح دون تصحيح دون تصحيح الخلل في اختبار البالزما البالزما المعمرة ذات النقص في FVIII البالزما المكثفة ذات النقص في FIX البالزما الطبيعية APTT PT غير طبيعي غير طبيعي تصحيح دون تصحيح تصحيح FVIII غير طبيعي غير طبيعي دون تصحيح تصحيح تصحيح FIX غير طبيعي طبيعي تصحيح دون تصحيح تصحيح FXI / FXII المانع غير طبيعي غير طبيعي تصحيح دون تصحيح تصحيح 46 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

53 الشكل 2.14: دراسات المزج الهيموفيليا )A( المكتسبة APTT + %50 بالزما طبيعية )بالثواني( APTT + %20 عيار بيثيسدا )وحدة/ مل( APTT )بالثواني( بالزما طبيعية )بالثواني( نع االختبارات لمزير تق التح يس عق )زما جزم جزمارابتخالا جزم 47

54 15 زمن تخث ر الثرومبين المبدأ يعكس وقت الثرومبني التفاعل بني ثرومبني والفيبرينوجني. ثرومبني الفايبرين الفيبرينوجني تتم اإلطالة عندما يكون مستوى الفيبرينوجني منخفضا جدا )أقل من 1.0 غرام /لتر( في وجود الهيبارين ومواد مثل الهيبارين وفي وجود موانع أخرى مثل منتجات حتلل الفيبرين )وجني( )FDP( وعندما يكون الفيبرينوجني )ديسفيبرينوجينيميا( غير طبيعي من حيث اجلودة ويشمل ذلك العيوب اخللقية واملكتسبة الثانوية بالنسبة ألمراض الكبد. الكاشف محلول الثرومبني الذي يشمل تخثر البالزما الطبيعية في حوالي 15 ثانية. تعطي احملاليل األقوى أوقات تخثر أقصر ورمبا تكون طبيعية في وجود عيوب خفيفة. الطريقة: يدويا 1 أفرغ 0.2 مل من املاصة في أنبوب تخثر زجاجي. 2 قم بتدفئته حتى درجة 37 مئوية. 3 أضف 0.2 مل من الثرومبني. 4 شغل ساعة اإليقاف. احسب وقت التجلط. 5 ينبغي إنشاء املعدل الطبيعي محليا. 6 كرر اختبار. 48 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

55 تلحظات يجب أن يكون تركز الثرومبني املستخدم بحيث يعطي وقت تخثر بنحو 15 ثانية مع البالزما الطبيعية املجمعة )مع املراقبة(. إذا مت استخدام الثرومبني املركز قم بتخفيفه حلوالي وحدة/ مل في احمللول امللحي ويتطلب األمر املزيد من التخفيف حتى يتم احلصول عليه في الوقت املراقبة املناسب. ميكن حفظ الثرومبني املتشكل بدرجة 35- مئوية أو أقل ويتم تخفيفه قبل االستخدام. سيتعرض الثرومبني املخفف للتلف في درجة حرارة الغرفة. ينبغي أن تدرج مراقبة البالزما املجمعة الطبيعية مع كل مجموعة من االختبارات. نيبمورث د ر ثخت نمز 49

56 زمن الثرومبين في وجود كبريتات البروتامين لكشف وجود الهيبارين 16 ميكن أن يسبب وجود بعض الهيبارين غير املجزأ ومنخفض الوزن اجلزيئي إطالة وقت الثرومبني. كما ميكن أن يتم حتييد أشكال الهيبارين الكبرى والتي تطيل وقت الثرومبني بإضافة سلفات البروتامني.)PS( وتتوفر سلفات البروتامني في العديد من صيدليات املستشفيات حيث يتم استخدامها كعامل عالجي لعكس تأثير الهيبارين. عادة ما يكون تركيز الدواء في اإلعدادات العالجية أعلى بكثير مما هو مفيد ألغراض الفحص في املختبرات. لذا ينبغي أن يتم تخفيف هذه األدوية إذا لزم األمر باستخدام احمللول امللحي حتى تركيز 40 ملغ % كمحلول للعمل. ويتم إعداد محلول العمل من الثرومبني مع )PS( بخلط تسعة أجزاء من كاشف الثرومبني مع جزء واحد من 40 ملغ % من.)PS( ومن ثم يستخدم هذا بدال من محلول الثرومبني املوصوف في القسم 15. وينبغي حتليل ومراقبة العادية. إذا متت إطالة وقت الثرومبني ولكن مت التصحيح مقابله في غضون ثوان من نتيجة املراقبة فسيتأكد وجود الهيبارين. 50 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

57 17 زمن الريبتيليز المبدأ الريبتيالز هو سم أفعى يتم احلصول عليه من أفعى أتروكس الدساس atrox(.)bothrops وهو انزمي مشابه للثرومبني ويعمل مباشرة على الفيبرينوجني لتحويله إلى الليفني. ال ميكن تثبيطه باستخدام مضاد الثرومبني لذا فهو ال يتأثر بوجود الهيبارين. ولذلك ميكن استخدامه لتقييم معدل حتويل الفيبرينوجني إلى الليفني في وجود الهيبارين. ومن املفيد التحقق فيما إذا كان وقت الثرومبني املطو ل ناجت عن وجود الهيبارين في العينة. إذا كان وقت الثرومبني مطوال والريبتيالز طبيعي فإن السبب األكثر ترجيحا هو وجود الهيبارين. وفي وجود الديسفيبرينوجينيميا فإن وقت الريبتيالز قد تكون أكثر حساسية )أي أطول( من وقت الثرومبني. الكواشف ريبتيالز )سيغما الدريتش الرمز V5375( املذاب في تركيز 25 ملغ في 15 مل من العازل اورين. هذا السم اخلام خطر ويجب توخي احلذر لتجنب استنشاق املسحوق. يجب على العامل بالفحص ارتداء قفازات وقناع أثناء التعامل مع السم اخلام. يجب أن يتم تخزين كمية احمللول مجمدة بشدة عند درجة 70- مئوية في كميات متساوية بحجم 0.5 مل. ستبقى مستقرة ملدة سنتني على األقل حتت هذه الظروف. إلعداد الكاشف اجلاهز لالستخدام قم بإذابة وتخفيف الكاشف املجمد 1/10 في عازل اورين قسمه إلى كميات متساوية وأعد جتميده إلى درجة 70- مئوية لغرض استخدامه مرات أخرى. هذا الكاشف اجلاهز لالستخدام مستقر حتت هذه الظروف ملدة ال تقل عن ثالثة أشهر. ينبغي إذابة الكميات املتساوية اجلاهزة لالستخدام واملجمدة في حمام مائي بدرجة 37 مئوية ملدة ثالث دقئق على األقل. ثم يكون هذا مستقرا لالستخدام ما ال يقل عن 12 ساعة عند درجة حرارة محيطية ما بني مئوية. البالزما الطبيعية: يتم حتضير البالزما الطبيعية املجمعة على النحو املبني في القسم 7. قم بإذابتها في حمام مائي بدرجة 37 مئوية حلوالي ثالث دقائق. الطريقة قم بجميع هذه االختبارات مكررة. 1 ضع أنابيب تخثر زجاجية بحجم ملم كافية في حمام مائي بدرجة 37 مئوية )اثنني لكل مريض باإلضافة إلى اثنني لغرض املراقبة(. زياليتبيرلا نمز 51

58 2 أفرغ من املاصة 0.3 مل من البالزما )املراقبة أو املريض( في أنابيب التخثر الدافئة. 3 دفئها ملدة دقيقة إلى دقيقتني. 4 أضف 0.1 مل من مزيج الريبتيالز املخفف وشغل ساعة التوقيت. 5 قم بإمالتها ثالث مرات ملزجها ثم ثالث مرات كل خمس ثوان حتى تشكيل اجللطة. 6 سجل وقت التخثر. 7 يجب أن يكون وقت املراقبة مابني ثانية. )إذا كان الوقت أقصر اضبطه باملزيد من التخفيف لكاشف ريبتيالز مع عازل اورين.( 8 إذا لم يحدث تخثر الدم سجل احلالة في التقرير على أنها أقل من 90 ثانية. المدى الطبيعي وينبغي أن يكون وقت املريض ضمن ثالث ثوان من وقت املراقبة. كما ينبغي اإلبالغ عن وقت املراقبة مع وقت املريض. التفسير الشكل 1.17: تفسير وقت الثرومبين المطو ل وقت الثرومبين وقت الريبتيالز السبب المالحظات مطو ل مطو ل بتسا و هايبو- أو أفيبرينوجينيميا قم بقياس الفيبرينوجين مطو ل مطو ل بشدة ديسفيبرينوجينيميا خلقي أو م كتسب مطو ل طبيعي الهيبارين مطو ل مطو ل بشيء قليل الهيبارين مع بعض الهايبو- أو ديسفيبرينوجينيميا حالة نادرة من الديسفيبرينوجينيميا قد تعطي هذا النمط مطو ل مطو ل بتسا و تجلط الدم المنتشر داخل األوعية )DIC( قم بقياس )D-dimers( 52 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

59 تلحظة تتوفر كواشف الريبتيالز بتركيزات جاهزة لالستخدام من قبل عدة شركات تصنيع جتارية. وميزتها عدم وجود احلاجة للتعامل مع السم اخلام وأمور الصحة والسالمة. وعند استخدام واحد من هذه الكواشف اتبع تعليمات االستخدام للشركة املصنعة. قد يكون املعدل الطبيعي مختلفا لتلك املذكورة أعاله إال أن تفسير النتائج يكون على النحو الوارد في الشكل ومبا أن الريبتيالز هو كاشف مكلف فيمكن استخدام طريقة حتييد البروتامني/ وقت الثرومبني )القسم 16( لتأكيد وجود الهيبارين في عينة االختبار. زياليتبيرلا نمز 53

60 18 الفيبرينوجين )مقايسة كلوس المعدلة( المبدأ يتم إعداد مخففات البالزما الطبيعية القياسية ذات محتوى الفيبرينوجني املعروف في عازل اجلليوكسالني. يتم قياس وقت التخثر بعد إضافة الثرومبني وإنشاء رسم بياني. يتناسب وقت التخثر مع تركيز الفيبرينوجني ويؤخذ تخفيف 1/10 لتمثيل القيمة في اإلعدادات القياسية. ت خفف بالزما االختبار بنسبة 1/10 وت قرأ النتيجة من السطر القياسي. الكواشف البالزما القياسية أو املرجعية ذات تركيز الفيبرينوجني املعروف ثرومبني 30 وحدة/ مل 100 وحدة/ مل )قد يختلف التركيز حسب املصدر( عازل اإلمييدازول )جليوكسالني( أو عازل اورين بدرجة حموضة 7.35 الطريقة 1 حض ر تخفيفات بنسبة 1/15 1/10 1/5 و 1/20 من البالزما املعيارية في عازل اإلمييدازول. 2 قم بتفريغ كميات 0.2 مل مكررة من جميع الكميات املخففة في أنابيب التخثر الزجاجية. 3 سخنها إلى درجة 37 مئوية ملدة دقيقتني. 4 أضف 0.2 مل من الثرومبني )30 وحدة/ مل 100 وحدة/ مل( ثم احسب وقت تشك ل اجللطة. 5 بالنسبة للتقنيات اليدوية قم باختبارات مكررة. وهذا ليس ضروريا بالنسبة ملعظم مقاييس التجل ط عند القيام باختبارات آلية. 6 ارسم متوسط وقت التخثر مقابل تركيز الفيبرينوجني على ورق رسم بياني )log/log( مع أخذ نسبة التخفيف 1/10 لتمثيل القيمة القياسية. 7 خفف بالزما االختبار إلى 1/10 حدد وقت التخثر واقرأ القيمة من الرسم البياني. 54 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

61 ينبغي وضع املعدل الطبيعي محليا إال أنه عادة ما يكون قريبا من 1.5 غ/ ل 3.5 غ/ ل. وألغلب تقنيات كالوس تكون العالقة بني وقت التخثر وتركيز الفيبرينوجني خطية على نطاق محدود من أوقات التخثر وتتراوح عادة بني 10 إلى 25 ثانية. للحصول على بالزما االختبار العادي ميكن استخدام تخفيف بنسبة 1/10. للحصول على تركيز أقل )مثال 0.75 غ/ ل 1.5 غم/ ل( ينبغي تخفيف البالزما بنسبة 1/5 )وتقرأ القيمة من الرسم البياني مضروبة في 5/10(. للحصول على مستويات أقل من 0.75 غ/ ل فيجب تخفيف بالزما االختبار بنسبة 1/20 )وتقرأ القيمة من الرسم البياني مضروبة في 2/10(. للحصول على مستويات أعلى من )4 غ/ ل( فيجب تخفيف بالزما االختبار بنسبة 1/20 )وتقرأ القيمة من الرسم البياني مضروبة في 20/10(. ال يتأثر االختبار مبستويات الهيبارين املستخدمة لعالج اجللطات الدموية الوريدية. ميكن أن تعمل املستويات العليا املستخدمة لألوعية القلبية إلطالة وقت التخثر مما يؤدي إلى التقليل من تقدير الفيبرينوجني ما لم يكن الكاشف يحتوي على محيدات الهيبارين ملواجهة ذلك. بيانات المعايرة النموذجية مالحظة: يجب أن يتم إنشاء منحنى معايرة باستخدام الكواشف املستخدمة محليا. البالزما املعيارية: 2.1 غ/ ل من الفيبرينوجني الشكل 1.18: مثال لمعايرة الفيبرينوجين التخفيف القياسي تركيز الفيبرينوجين )غ/ ل( وقت التخثر )بالثواني( / / / /20 أمثلة: بالزما االختبار 1: مخففة بنسبة 1 في 10 وقت التخثر 15 ثانية. الفيبرينوجني = 1.9 غ/ ل )من رسم املعايرة البياني( بالزما االختبار 2: مخففة بنسبة 1 في 5 وقت التخثر 16 ثانية. الفيبرينوجني = 1.8 غ/ ل من رسم املعايرة البياني 5/10 )حيث تخفيف 1/5 هو أكثر من 1/10( = 0.9 غ/ ل ةلدعملا سوالك ةسياقم) نيجونيربيفلا 55

62 وميكن لعدد من محلالت التخثر تقدير مستوى الفيبرينوجني أثناء حتديد وقت البروثرومبني. وهذا ممكن ألن التغير في التبعثر الطفيف أو االنتقال كنتيجة لتشك ل اجللطة يتناسب مع تركيز الفيبرينوجني األولي. وعادة ما ي شار إلى هذه الطرق على أنها الفيبرينوجني املشتق من.)PT( هناك قيود على معظم الطرق املشتقة من.)PT( وعلى وجه اخلصوص فغالبا ما تكون النتائج التي يتم احلصول عليها أعلى بكثير من تلك الناجتة عن مقايسة كالوس حني تكون هناك إما مستويات منخفضة جدا )أقل من 1.5 غ/ ل( أو مرتفعة )فوق 5 غ/ ل( من الفيبرينوجني. عادة ما تكون النتائج طبيعية في وجود الديسفيبرينوجينيميا. ملراجعة هذه األمور انظر ماكي وآخرين هناك طرق فيبرينوجني كالوس والتي ت عد مناسبة ملقايسة بالزما االختبار غير املخففة إال أن النتائج قد ال تكون قابلة للتبديل مع نتائج الفحوصات التي تستخدم مقايسات كالوس على نطاق واسع من خالل توظيف بالزما االختبار املخففة )جينينغز وآخرون 2009(. المراجع Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID. Differences between multifibrin U and conventional Clauss fibrinogen assays: data from the UK National External Quality Assessment scheme. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20: Mackie IJ, Kitchen S, Machin SJ, Lowe GD. Guidelines on fibrinogen assays. Br J Haematol 2003; 121: تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

63 19 إزالة الهيبارين من البلاتا المبدأ الهيباريناز 1 )املكو ن الفع ال للهيبزمي ))Hepzyme ( وهو محدد بالهيبارين الذي ي شتق في مواقع متعددة لكل جزيء وينتج األوليجوساكريدز الذي فقد نشاط جرعته. الهيبزمي )Hepzyme ( هو الهيباريناز 1 املنقى من البكتيريا والذي يتم إنتاجه في heparinum(.)flavobacterium وهو قادر على إزالة ما يصل حتى وحدتني دوليتني من الهيبارين لكل مل من البالزما. وميكن استخدام الهيبزمي )Hepzyme ( لتحييد تأثير الهيبارين في العينة بحيث ميكن تقييم حالة التخثر الكامنة. وخاصة أنه يستخدم في حاالت تلوث الهيبارين. الكاشف الهيبزمي )Hepzyme ( حتتوي القارورة على كمية محض رة ومجففة من الهيباريناز 1 مع املثبتات املص نع: دايد بهرنغ التخزين: بدرجة 4 مئوية االستقرار: وفقا لتاريخ انتهاء الصالحية احملدد من قبل املصن ع. ت ستخدم كل قارورة الختبار مريض واحد فقط. الطريقة 1 أضف 1.0 مل من البالزما احلامضية قليلة الصفائح الدموية إلى قارورة الهيبزمي.) Hepzyme( 2 أعد السدادة واقلبها بلطف 5 إلى 10 مرات. 3 اتركها في درجة حرارة الغرفة ملدة 15 دقيقة. 4 انقلها الى كوب عينة بالستيكي سعة 2 مل واسمح للفقاعات باالختفاء لبضع حلظات. 5 نفذ االختبار املطلوب. يجب أن يتم إدراج وقت الثرومبني للتحقق من إزالة جميع الهيبارين بنجاح. وينبغي إجراء االختبارات في أقرب وقت ممكن )أي ضمن مبادئ االختبار لذلك اإلجراء(. مزالبلا نم نيرابيهلا ةلازإ 57

64 التفسير ال يزيل هذا اإلنزمي أية عوامل تخثر )على عكس بعض التقنيات البديلة إلزالة الهيبارين( لذا يشير النقص احلقيقي لوقت التخثر في )APTT( أو وقت الثرومبني أو )PT( بعد املعاجلة بالهيبزمي إلى أن الهيبارين كان موجودا. مت تقليص جميع الهيبارين غير املجزأ والصيغ اجلزيئية املنخفضة بفعل هذا االنزمي. 58 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

65 20 مقايسة مضاد الفيبرينوجين بواسطة الفحص الشعاعي المناعي )RID( المقدمة يتم االشتباه بالديسفيبرنوجينيميا )النوع الثاني من نقص الفيبروجني( عندما تكون نتيجة مقايسة كالوس للفيبرينوجني منخفضة بكثير عن الفيبرينوجني املشتق من وقت البروثرومبني أو من نتائج مستضد الفيبرينوجني. حتدد مقايسة كالوس مستوى الفيبرينوجني من خالل حتديد معدل تكوين فايبرن )الليفن( بعد إضافة تركيز عال من الثرومبني في حني تفحص املقايسة املشتقة الكثافة البصرية/ التبعثرات الضوئية ضمن جلطة فايبرن )الليفن( املتشكلة بعد اكتمال تشكيل اجللطة. وتكشف مقايسة مستضد الفيبرينوجني الديسفيبرنوجينيميا على أنها منخفضة الفعالية من خالل مقايسة كالوس في وجود مستوى طبيعي من املستضد. قد يرافق فقدان األفيبرينوجني نزيف بسبب خلل تخثر البالزما ووظيفة الصفائح الدموية. وتسبب العديد من العيوب الديسفيبرنوجينيميا والتي قد تتسم بضعف إفراز الفيبرينوببتيد )B /A( وضعف في بلمرة الليفني املونومر. قد يكون النوع الثاني من العيوب ذو أعراض إال أن بعض املتغي رات ارتبطت بالتهيؤ للنزيف أو اجللطة. وميكن أن تكون قابلية املريض للنزف أو اجللطة ال عالقة له بالديسفيبرنوجينيميا والتي قد تكون نتيجة عرضية. المواد وعاء نور بارتيجني املسطح للفيبريجني Plate, NOR-Partigen Fibrinogen R.I.D. املص نع: دايد بهرنغ Dade Behring يحتوي كل وعاء على 12 حجرة. الكواشف البالزما املعايرة ذات تركيز الفيبرينوجني املعروف التي ميكن عزوها إلى معايير الفيبرينوجني الدولية اخلاصة مبنظمة الصحة العاملية. بالزما االختبار: يتم فحص البالزما احلامضية عادة غير مخففة أو مخففة باحمللول امللحي إلعطاء مستوى بحوالي 2.5 غ/ ل إذا كان من املتوقع أن يكون املستوى أكبر من 5 غ/ ل. ويتم تبليغ النتائج أقل من 0.5 غ/ ل على أنها أقل من 0.5 غ/ ل )احلد األدنى من احلساسية(. ( يعانملا يعاعشلا صحفلا ةطساوب نيجونيربيفلا داضم ةسياقماقمم 59

66 الطريقة 1 اسمح للوعاء املسطح RID بالتدفئة حتى درجة حرارة الغرفة ثم أزل الغطاء واتركها مفتوحة ملدة 5 دقائق حتى تتبخر الرطوبة الزائدة. 2 يتم اختبار البالزما املعيارية بشكل نقي وبنسب تخفيف % % و 25 % في احمللول امللحي. 3 أضف بالضبط 5 مايكرولتر من املخففات القياسية ومواد مراقبة اجلودة وبالزما املريض إلى األوعية )يفضل تكرارها(. عملية املص الدقيقة ضرورية للكميات الصغيرة املطلوبة. 4 مبجرد انتشار العينات في الهالم )ليس بأكثر من خمس دقائق بعد التطبيق( أعد الغطاء وضع الوعاء املسطح مسطحة في صندوق رطب في درجة حرارة الغرفة حلوالي 48 ساعة. 5 وميكن تقدير النتائج بعد 18 ساعة ما دامت األقطار ال تتجاوز 5.5 ملم. يجب اإلبالغ عن النتائج النهائية بعد يومني ما لم يبلغ القطر أكبر من 8 ملم وفي هذه احلالة تترك اللوحة يوما آخر إلتاحة اكتمال االنتشار. يشير القطر األكبر من 9.3 ملم إلى أن مستوى الفيبرينوجني هو أكبر من مستوى احلساسية للمقايسة وفي هذه احلالة يجب أن يتم تخفيف العينة باحمللول امللحي وي عاد اختبارها. 6 قم بقياس أقطار الراسب باستخدام جهاز قراءة الوعاء املسطح بهرنغ )متوفر مع االوعية(. قم بقياسها إلى أقرب 0.5 ملم واقرأها مرتني )األقطار ب 90 درجة من بعضها البعض(. 7 ارسم املنحنى القياسي: القطر املربع مقابل التركيز على ورقة الرسم البياني املخطط. 8 اقرأ باملقابل مراقبة اجلودة ومستويات املريض من هذا املنحنى. 9 أبلغ النتائج بالغرام/ لتر إذا كانت مراقبة اجلودة ضمن النطاق املستهدف 60 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

67 21 مراقبة العامل )XIII( المبدأ الثرومبني والكالسيوم مطلوبات لتفعيل العامل )FXIII( والذي سيعمل على تشع ب فايبرن الليفني بشكل مستقر. وفي هذه الطريقة وبالرغم من استخدام البالزما احلامضية ما تزال أيونات كافية من الكالسيوم متاحة لتفعيل.)FXIII( وتستخدم بالزما حامض اإليثيليندايامينيتيتراسيتيك )EDTA( الطبيعية املضادة للتخثر في املراقبة. وفي هذه البالزما تعمل نتائج )EDTA( في استخالب كامل أليونات الكالسيوم مما يعني أن العامل )FXIII( ليس قادرا على تشعب الليفني. إن إضافة مقدار % 2 من حامض اخلليك أو 5 م من اليوريا سينتج عنه حتلل للجلطات غير املتشعبة بينما لدى البالزما احلامضية ذات الوحدات األكثر من 10/ دل من العامل )FXIII( الفع ال فإن جلطة غير قابلة للتحلل. يكون االختبار عادة أكثر حساسية إذا مت استخدام حامض اخلليك )بدال من اليوريا( إذ ستذوب اجللطة في مستويات أعلى من العامل )FXIII( في وجود حامض اخلليك )جينينغز وآخرون 2003(. المواد/ الكواشف أنابيب زجاجية بقياس ملم 0.9 % محلول ملحي 30 وحدة/ مل من الثرومبني بالزما )EDTA( طبيعية 2 % حامض اخلليك الطريقة 1 أضف 0.2 مل من بالزما االختبار احلامضية إلى 0.2 من احمللول امللحي بنسبة % 0.9 في أنبوب زجاجي. ملراقبة إيجابية كرر العملية باستخدام 0.2 مل من بالزما.)EDTA( وللمراقبة السلبية كرر العملية باستخدام 0.2 مل من البالزما الستريتية الطبيعية..normal citrated plasma 2 أضف 0.1 مل من الثرومبني 30 وحدة/ مل. امزج. 3 اتركه ملدة 30 دقيقة بدرجة 37 مئوية. ( لماعلا ةبقارمقارمم 61

68 4 انفض األنابيب إلبعاد اجللطة من اجلانبني. 5 أضف 5 مل حامض اخلليك % 2 وسد األنبوب. اتركه في درجة حرارة الغرفة ملدة 12 ساعة. النتائج ال ينبغي أن يكون لبالزما )EDTA( جلطة مرئية. ينبغي أن يكون للبالزما احلامضية الطبيعية جلطة سليمة ومرئية. إذا كانت اجللطة غير مرئية فإن لدى الشخص نقص في العامل.)FXIII( المدى الطبيعي لدى األشخاص الطبيعيني جلطة مرئية بعد 12 ساعة في حامض اخلليك %. 2 تلحظة ميكن استخدام اليوريا 5 م بدال من حامض اخلليك %. 2 وعندها تكون مدة حضانة حتلل اجللطة 18 ساعة. وهذه الطريقة أقل حساسية من استخدام حامض اخلليك )املذكورة أعاله(. ينتج التجلط بالكالسيوم والتحلل باليوريا نتائج غير طبيعية فقط عندما تكون مستويات العامل )FXIII( أقل من 5 وحدات/ دل. وباملقارنة تنتج اجللطة ب 30 وحدة/ مل من الثرومبني التي يتبعها التحلل ب % 2 من حامض اخلليك نتائج غير طبيعية عند مستويات أقل من 10 وحدات/ دل )جينينغز وآخرون 2003(. أحيانا قد ينزف املرضى الذين يعانون من مستويات عامل )FXIII( أعلى من 5 وحدات/ دل )انظر بولتون - ميجز وآخرون 2004 للمراجعة(. المراجع Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Problems relating to the diagnosis of FXIII deficiency. Thromb Haemost 2003; 1: تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

69 22 المقايسات المعتمدة على أساس زمن البروثرومبين )العوامل )X VII V II )تحليل العوامل( المبدأ ميكن إجراء املقايسات على العوامل II( X( VII V باستخدام مقايسة ذات مرحلة واحدة استنادا إلى وقت البروثرومبني. وتتكون املقايسة أساسا من مقارنة قدرة تخفيفات البالزما املعيارية أو املرجعية وبالزما االختبار لتصحيح وقت البروثرومبني للبالزما املعروف عنها النقص التام في عامل التخثر الذي يتم قياسه. في مقايسة العامل )V( على سبيل املثال )موضحة أدناه( فإن البالزما تعاني نقصا في العامل )V( إال أنها حتتوي على كميات طبيعية من العوامل II( X( VII والفيبرينوجني. قد تكون عوامل التخثر II( X( VII قد خضعت للمقايسة بطريقة مشابهة باستبدال البالزما املعينة ذات النقص في العامل )V( بعينها والواردة في املثال أدناه وباستخدام البالزما املرجعية املناسبة بتركيز معروف للعامل اخلاضع للمقايسة. الكواشف البالزما التي تعاني من نقص العامل )V( هذا قد يكون نقصا خلقيا أو نقصا مصطنعا في العامل )V( )البالزما املعمرة( محلول اورين امللحي العازل عازل )OBS( أو اجلليوكسالني )انظر القسم 9( البالزما الستريتية الطبيعية. normal citrated plasma ذات النقص في صفائح الدم: االختبارية واملعيارية بالنسبة للمعيارية استخدم البالزما الطبيعية املجمعة من 20 متبرعا )احملفوظة بدرجة 70- مئوية أو أقل( أو املرجعية التجارية أو البالزما املعيارية الثرومبوبالستني/ الكالسيوم )كما مستخدم في اختبارات )PT( الطريقة 1 لكل من بالزما االختبار والبالزما املعيارية حض ر التخفيفات في أنابيب بالستيكية كما موضح في الشكل 1.22 أدناه. الشكل تحضر تخفيفات بلاتا االختبار والبلاتا المعيارية OBS )مل( التخفيف البالزما )مل( /5 1/10 لماوعلا) نيبمورثوربلا نمز ساسأ ىلع ةدمتعملا تاسياقملاملا تاسياقملادمتعملا تاسياقملا 63

70 OBS )مل( التخفيف البالزما )مل( )1/10( 0.5 )1/20( 0.5 1/20 1/40 مالحظة : امزج نسبة 1/10 من التخفيف جيدا قبل استخدامه إلعداد التخفيف 1/20. امزج التخفيف 1/20 جيدا قبل استخدامه إلعداد التخفيف 1/40. يجب اختبار تخفيفات البالزما مباشرة بعد حتضيرها. إذا جتاوزت درجة حرارة الغرفة 25 مئوية فقد يكون من الضروري وضع التخفيفات على اجلليد الرطب قبل حتليلها. 2 افحص كل تخفيف من البالزما املرجعية أو البالزما املعيارية على النحو التالي: أوال. أفرغ 0.1 مل من كل تخفيف باملاصة إلى أنبوب زجاجي بحجم ملم. ثانيا. ثالثا. رابعا أضف 0.1 مل من البالزما ذات النقص في العامل اخلامس. سخنه حتى درجة 37 مئوية ملدة دقيقتني. أضف 0.2 مل كاشف الثرومبوبالستني/ الكالسيوم مسبق التسخني. خامسا. ابدأ ساعة التوقيت وامزج. مالحظة: إذا لم يحتوي كاشف الثرومبوبالستني على الكالسيوم فيضاف 0.1 مل من الثرومبوبالستني إلى خليط البالزما املخفف والناقصة. وبعد تأخير مابني دقيقة عن التسخني إلى درجة 37 مئوية فسيتخثر هذا املزيج باستخدام 0.1 مل من الكالسيوم مسبق التسخني )حتى درجة 37 مئوية(. 3 سج ل وقت التخثر. 4 كرر العملية لتخفيفات بالزما االختبار. بالنسبة لبالزما االختبار التي ي توقع أن تكون طبيعية افحص التخفيفات 1/20 1/10 و 1/40. بالنسبة لبالزما االختبار التي ي توقع أن يكون لها مستويات منخفضة افحص التخفيفات 1/10 1/5 و 1/20. وينبغي أيضا اختبار عينة فارغة Blank على النحو التالي: 0.1 مل من )OBS( 0.1 مل من البالزما ذات النقص في العامل )V( 0.2 مل من كاشف الثرومبوبالستني/ الكالسيوم يعكس وقت التخثر للعينة الفارغة جودة البالزما الناقصة ويجب أن يكون معادال ألقل من % تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

71 النتائج ارسم أوقات تخثر بالزما املراقبة واالختبار مقابل تركيز العامل )V( على 3 دورات دورتني على ورق لوغاريتمي. ويظهر مثال على مثل هذا الرسم البياني )ملقايسة العامل )FVIII( في القسم 23. يتم تعيني قيمة اعتباطية للتخفيف 1/10 بنسبة % 100 وبالتالي فالتخفيف 1/5 يعادل نسبة % 200 وهكذا. وبدال من ذلك ارسم التركيز على مقياس لوغاريتمي ووقت التخثر على مقياس خطي. ويتم استقراء الكمية ذات الصلة للعامل )V( في بالزما املريض باملقارنة مع البالزما الطبيعية أو املواد املرجعية القياسية من الرسم البياني. ويظهر مثال على ذلك في القسم اخلاص باملقايسات املستندة إلى )APTT( )الشكل 1.23(. يقرأ وقت اختبار التخثر الذي يعادل % 100 )املكان الذي يجتاز فيه خط االختبار الفاعلية بنسبة %( 100 من اخلط املعياري )وبالتالي فإن التركيز املعياري الذي ميكن أن يعطي وقت التخثر احملدد هذا(. ويعطي هذا تركيز االختبار في نسبة من املعياري. وتتضاعف هذه النسبة بتركيز عامل التخثر في املستوى القياسي )بالوحدة الدولية/ دل( إلعطاء التركيز في االختبار )بالوحدة الدولية/ دل(. الملحظات يجب حتديد املعدل الطبيعي لكل من عوامل التخثر هذه محليا إال أنه غالبا ما يكون لها حد أدنى ما بني وحدة دولية/ دل بالنسبة للعامل VII( V وX (. إن احلد األدنى من الوضع الطبيعي بالنسبة للعامل )II( هو أعلى. في إحدى الدراسات فإن األشخاص الطبيعيون من األسر التي لديها تاريخ في نقص العامل )II( إضافة إلى أشخاص طبيعني آخرين غير ذوي عالقة لهم مستويات من العامل )II( في نطاق IU/dl وحدة دولية/ دل )جيروالمي وآخرون 1998(. لقد أفاد مركز مختلف نطاقا مرجعيا ما بني IU/dl وحدة دولية/ دل )بولتون ميجز وآخرون 2004(. ينبغي على األشخاص الذين يعانون من انخفاض مستوى العامل )V( أيضا إجراء فحص العامل )VIII( الستبعاد نقص )V و )VIII مجتمعني. في بعض حاالت نقص العامل )VII( قد يكون هناك تفاوت بني مستويات )FVII:C( املتحصلة اعتمادا على مصدر الثرومبوبالستني. لذا ي نصح باستخدام الثرومبوبالستني البشري على أساس أن النتائج أكثر عرضة لتعكس فعالية اجلسم احلي. )انظر بولتو ميجز وآخرين 2004( للمراجعة. وفي بعض احلاالت النادرة قد تكون النتيجة منخفضة جدا إذا مت استخدام ثرومبوبالستني أرنب إال أنها تكون طبيعية إذا استخدم في الفحص الثرومبوبالستني البشري. وقد يكون هذا هو السبب في أن بعض احلاالت النقص احلاد والواضح للعامل )VII( ليس لديها أعراض نزيف. المراجع Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): Girolami A, Scarano L, Saggiorato G, Girolami B, Bertomoro A, Marchiori A. Congenital deficiencies and abnormalitoies of prothrombin. Blood Coagul Fibrinol 1998: 9: لماوعلا) نيبمورثوربلا نمز ساسأ ىلع ةدمتعملا تاسياقملاملا تاسياقملادمتعملا تاسياقملا 65

72 مقايسات العوامل المعتمدة على أساس )APTT( مقايسة مرحلة واحدة من FVIII:C) FXI FIX أو (FXII 23 المبدأ يتم في هذا القسم وصف مقايسة املرحلة الواحدة للعامل.)VIII( وتستند هذه املقايسة على املقارنة بني قدرة تخفيفات البالزما املعيارية وبالزما االختبار على تصحيح APTT من البالزما املعروفة بالنقص التام في العامل )VIII( لكنها حتتوي على جميع العوامل األخرى املطلوبة للتخثر الطبيعي. وبالنسبة للعوامل XI( IX و )XII فإن املقايسة في األساس هي نفسها وتتم من خالل استبدال البالزما الناقصة ذات الصلة بالبالزما ذات النقص في العامل )VIII( وبعد اختيار البالزما املرجعية املناسبة. الكواشف البالزما الستريتية الطبيعية. normal citrated plasma والبالزما املعيارية standard plasma قليلة الصفائح ينبغي أن تكون البالزما املعيارية املستخدمة إما بالزما مجموعة ومحضرة محليا ومحفوظة بدرجة 70- مئوية أو أقل أو أن تكون بالزما جتارية عادية. في كلتا احلالتني يجب معايرة هذه البالزما املرجعية وفق معيار دولي للعامل.)VIII( إن من غير املقبول افتراض أن البالزما الطبيعية املجمعة لديها 100 وحدة/ دل من العامل.)FVIII:C( البالزما التي تعاني نقص العامل )VIII( تتوفر هذه البالزما جتاريا أو قد يتم جمعها من متبرع لديه مستوى العامل )VIII( أقل من وحدة واحدة/ دل والذي ليس لديه أجسام مضادة ل )VIII( ولم يتلق أي عالج ملدة أسبوعني ولديه اختبارات وظائف الكبد طبيعية. ميكن أن تؤدي وظيفة الكبد غير الطبيعية إلى انخفاض في عوامل تخثر الدم األخرى والتي تؤثر على خصوصية املقايسة. ميكن تخزين هذه البالزما في كميات متساوية املقدار بدرجة 35- مئوية. يفضل استخدام البالزما ذات النقص في العامل )VIII( التي تنتج عن عملية فصل العامل )VIII( من البالزما الطبيعية باستخدام األجسام املضادة وحيدة النسيلة. يتوفر هذا النوع من املواد جتاريا وله ميزة السالمة الفيروسية مقارنة بالبالزما املأخوذة من املصابني بالهيموفيليا الذين عوجلوا مبنتجات البالزما. ومع ذلك لم يتم العثور على أن جميع البالزما املفصولة مناعيا )immunodepleted( أقل من وحدة واحدة/ دل وينبغي االعتناء للتأكد من هذا. يرى بعض اخلبراء أن وجود تركيزات عادية من )VWF( في البالزما ذات النقص في العامل )VIII( قد يكون ميزة وهناك دليل يدعم هذا فيما يتعلق مبقايسات العامل )VIII( املنفذة كجزء من حتديدات مثبط العامل.)VIII( الكاشفAPTT محلول اورين امللحي املعزول OBS( أو عازل اجلليوكسالني انظر القسم 9( 25 م م mm من كلوريد الكالسيوم ( 2 )CaCl 66 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

73 الطريقة 1 اصنع تخفيفات 1/10 من البالزما املعيارية وبالزما االختبار في احمللول امللحي املعزول في أنابيب بالستيكية. )إذا كان من املتوقع لبالزما االختبار أن حتتوي على مستوى منخفض جدا للعامل )VIII( ابدأ التخفيف عند 1/5(. 2 قم بصنع تخفيفات مزدوجة باستخدام كميات 0.2 مل في OBS من البالزما املعيارية وبالزما االختبار من 1/10 إلى 1/40 في أنابيب بالستيكية. )قم مبزج كل تخفيف جيدا قبل االنتقال إلى األنبوب التالي(. يجب فحص تخفيفات البالزما مباشرة بعد حتضيرها. إذا جتاوزت درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية فقد يكون ضروريا وضع التخفيفات على جليد رطب قبل االختبار. 3 أفرغ مقدار 0.1 من املاصة من كل تخفيف قياسي إلى أنبوب زجاجي بحجم ملم. 4 أضف 0.1 مل من البالزما ذات النقص في العامل )VIII( وانقلها إلى حمام ماء بدرجة 37 مئوية. 5 أضف 0.1 مل من كاشف APTT وضعه في احلاضنة ملدة 5 دقائق 6 في الدقيقة 5 أضف 0.1 مل من كلوريد الكالسيوم ( 2 )CaCl وسجل وقت التخثر. وينبغي أيضا اختبار عينة فارغة على النحو التالي: 0.1 مل من )OBS( 0.1 مل من البالزما ذات النقص في العامل )VIII( 0.2 مل من كاشف APTT احتضان ملدة 5 دقائق 0.1 مل من كلوريد الكالسيوم ( 2 )CaCl يجب أن يكون وقت التخثر للعينة الفارغة أطول من % 1 من وقت فعالية العامل )VIII( من الرسم البياني القياسي للمعايرة. إذا كان الوقت أقصر فيشير هذا إلى أن البالزما الركيزة ليست ناقصة متاما للعامل )VIII( وبالتالي فهي ليست بالزما مناسبة كركيزة. النتائج مت وصف تخطيط النتائج في القسم 22 مما يتطلب ورقا بيانيا ذا مقياس لوغاريتمي أو لوغاريتمي/ خطي. يتم تعيني قيمة اعتباطية للتخفيف 1/10 بنسبة % 100 والتخفيف 1/20 بنسبة % 50 والتخفيف 1/40 بنسبة.% 25 ويجب احلصول على خطوط مستقيمة وموازية لبعضها البعض. اقرأ باملقابل تركيز عينة االختبار كما موضح في الشكل 1.22 )القسم 22(. وفي هذا املثال فإن تركيز العامل )VIII( في عينة االختبار هو % 7 من التركيز في العينة املعيارية. إذا كانت العينة املعيارية حتتوي على تركيز بقيمة 85 وحدة دولية/ دل فإن تركيز عينة االختبار هو 85 وحدة دولية/ دل 7 % = 6 وحدات دولية/ دل. ( ساسأ ىلع ةدمتعملا لماوعلا تاسياقمياقم ةدمتعملا لماوعلا تاسياقمياقمسياقما لماوعلا تاسياقمم 67

74 إذا لم تكن اخلطوط متوازية فينبغي إعادة املقايسة. قد حتدث اخلطوط غير املتوازية بسبب خطأ فني. إذا مت التخلص من اخلطأ الفني فرمبا يعود ذلك إلى وجود املانع والذي قد يعمل كمضاد للعامل )VIII( على وجه التحديد أو قد تكون من نوع الذئبة مما يبني وجود منط تقارب. اخلطوط متباينة منوذجية في عينة م فعلة. تلحظات إذا كان تركيز )VIII( )أو FXI FIX أو )FXII في بالزما االختبار قريبا من الصفر )أي أن أوقات التخثر جلميع التخفيفات مشابهة للعينة الفارغة( فقد حتدث خطوط غير متوازية. يجب أن يتم إنشاء نطاق طبيعي محليا ولكن غالبا ما يكون احلد األدنى وحدة دولية/ دل في حالة وجود )FIX( أو.)FXI( وفيما يتعلق ب )FXI( فإن الوحدة الدولية قد مت تأسيسها مؤخرا. في وقت كتابة هذا التقرير هناك القليل من البيانات حول مستويات )FXI( الطبيعية في الوحدة دولية. وأشارت املطبوعات التي سبقت إنشاء الوحدة الدولية إلى أن احلد األدنى للوضع الطبيعية للعامل )FXI( هو في حدود وحدة دولية/ دل )انظر بولتون ميجز وآخرون 2004 للمراجعة(. الشكل 1.23: الرسم البياني لمقايسة العامل )FVIII( زمن التخثر )بالثواني( 200 االختبار القياسي /40 1/20 1/ % لفعالية العامل الثامن VIII المرجع Bolton-Maggs PH, Perry DJ, Chalmers EA, Parapia LA, Wilde JT, Williams MD, Collins PW, Kitchen S, Dolan G, Mumford AD. The rare coagulation disorders review with guidelines for the management from the UK Haemophilia Centre Doctors Organization. Haemophilia 2004; 10(5): تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

75 24 مقايسات العامل )VIII:C( في الراسب القري )كريوبريسيبيتات( تكون ظروف املقايسة املبينة في القسم 23 مناسبة عند احتواء عينات االختبار على مستويات طبيعية أو شبه طبيعية من العامل.)FVIII:C( إذا ارتقى املستوى فوق 150 وحدة دولية/ دل فتحتاج الظروف عادة إلى تعديل لتصميم مقايسة كي تكون صاحلة. تتراوح مستويات العامل )FVIII:C( في الراسب القري بني املتبرعني الفرديني ولكنها عادة ما تكون ضمن نطاق ما بني وحدة دولية/ دل. وعند هذه املستويات يجب أن تكون مواد االختبار مخففة مسبقا للحد من التركيز قبل الفحص. وبالنسبة ملعظم وحدات الراسب القري فإن التخفيف املسبق من 1 في 5 أو 1 في 10 سيقلل التركيز على مستوى كهذا حتى ميكن استخدام املواد املخففة تصميم املقايسة املوصوفة في القسم 23 )أي أن املواد مسبقة التخفيف يتم تخفيفها أكثر بنسب 1/10 1/5 1/20 في عزل املقايسة وكما هو موضح(. إذا لم يكن الراسب القري مخففا مسبقا إلى التركيز املناسب فمن غير املرجح ان تتم تلبية متطلبات احلصول على خط مستقيم خالل تخفيفات عينة االختبار ولكي يكون هذا اخلط موازيا ملنحنى املعايرة. إذن فمثل هذا املقايسة ستبطل بعد ذلك ولن تكون النتائج دقيقة. يجب االنتهاء من التخفيف املسبق للراسب القري فورا قبل بدء مقايسة العامل.)FVIII:C( تستخدم بعض املراكز العوازل املستخدمة في مقايسة )FVIII:C( مثل )عازل اورين أو اإلمييدازول/ جليوكسيد( في حني تستخدم مراكز أخرى البالزما ذات النقص في العامل )FVIII:C( لهذا الغرض. وعموما فمن احملتمل أن تكون التخفيفات املسبقة كهذه أكثر استقرارا إذا مت إعدادها باستخدام البالزما ذات النقص في العامل.)FVIII:C( لذلك ي عد هذا هو املخفف املفضل. تشابه دقة مقايسات FVIII على الراسب القري بني املراكز لدقتها عند فحص عينات البالزما )جينينغز وآخرون 2009(. المرجع Jennings I, Kitchen DP, Woods TA, Kitchen S, Walker ID, Preston FE. Laboratory performance in the World Federation of Hemophilia EQA programme Haemophilia 2009; 15: ( لماعلا تاسياقماسياقم بسارلا يف (VIII:C) لماعلا تاسياقم 69

76 25 مقايسات التخثر على مرحلتين للعامل )VIII:C( المبدأ وكان أول وصف لهذه املقايسة في عام 1955 كتعديل الختبار تخفيف الثرومبوبالستني. وتستند مقايسة العامل )FVIII:C( ذات املرحلتني على مبدأ أن كمية )FVIII( احلالية في النظام هي محدودة النسبة أثناء تخثر خليط االختبار الذي يحتوي على العامل )FX( والعامل املنش ط )FIX( الفوسفوليبيد الكالسيوم والزيادة في.)FV( ويزيل امتصاص البالزما بواسطة هيدروكسيد األملنيوم العوامل املنشطة والعوامل املعتمدة على الفيتامني ك. هذا أمر ضروري إلزالة البروثرومبني بحيث ال وجود له في خليط احلاضنة األولي. من دون هذه اخلطوة سيحتوي اخلليط على جميع العناصر املطلوبة لتشك ل الليفني وسيتخثر اخلليط. وحت تضن تخفيفات البالزما املعيارية وبالزما االختبار املمتصة مع الكاشف املرافق في املرحلة األولى. ويؤدي هذا إلى توليد العامل.)FXa( ويضاف مصدر من البروثرومبني والفيبرينوجني من البالزما الطبيعية املجمعة في املرحلة الثانية التي تتيح تشك ل اجللطة والتي يعتمد وقت التخثر الناجت عنها على الكمية األولية للعامل.)VIII:C( الكواشف كاشف مختلط )انظر "إنتاج الكاشف املختلط" أدناه( عازل اورين فيرونا البالزما الطبيعية املجمعة )بالزما الركيزة(: تخزن بتجميد شديد البالزما املعيارية أو املرجعية مراقبة اجلودة الداخلية )IQC( م من كلوريد الكالسيوم ( 2 )CaCl )مثال 1 في تخفيفني من م من ( 2 )CaCl كما مستخدم في اختبار )APTT( تعليق هيدروكسيد األملنيوم )مثل رمز كتالوج سيجما )A8222((: يخزن في درجة حرارة الغرفة متطلبات العينة بالزما حامضية والتي ميكن تخزينها مجمدة قبل االختبار إذا لزم األمر. 70 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

77 الطريقة 1 حضر البالزما املعيارية باستخدام املاء املقطر قبل 10 دقائق من استخدامها والكاشف املجتمع مبا ال يقل عن 15 دقيقة قبل استخدامه مع 3 مل من م من كلوريد الكالسيوم. 2 هيء بالزما )IQC( وبالزما الركيزة. إذا كانت أي منهما مجمدة أذبها بدرجة 37 مئوية ملدة 5 دقائق قبل االستخدام. 3 قم بوضع عالمات على أنابيب بالستيكية كافية ذات استخدام واحد لكل واحدة من العينات عينات IQC واملعيارية. 4 ضع مقدار 0.45 مل من البالزما املعيارية بالزما املراقبة الداخلية وبالزما املريض في كل أنبوب بالستيكي. 5 أضف 50 مايكرولتر من األلومينا جيدة الرج إلى كل أنبوب وامزجها جيدا. 6 بالنسبة للكميات الصغيرة من البالزما استخدام مل من البالزما و 25 مايكرولتر من األلومينا. 7 ضعها في احلاضنة بدرجة 37 مئوية ملدة 3 دقائق ثم دو رها ل 5000 غ لدقيقتني في جهاز طرد مركزي مناسب. 8 انقل على الفور البالزما الطافية الى األكواب أو األنابيب البالستيكية املتوافقة مع احمللل املستخدم. احرص على عدم تعكير األلومينا الراسبة. مالحظة: تستند اخلطوات التالية على استخدام محلل من سلسلة CA(.)Sysmex ميكن إجراء االختبار على األجهزة من مصن عني متعددين آخرين. لقد أجرى أحد مؤلفي هذا الدليل مقايسات بنجاح على محلالت من Laboratory( )Instrumentation وعلى األرجح كانت الطريقة متوافقة مع أنواع أخرى من احمللالت. لذا مت إدراج هذه الطريقة احملددة كمثال توضيحي. 9 حم ل الكاشف املجتمع وعازل املقايسة والبالزما الطبيعية املجمعة/ الركيزة في احمللل اآللي. 10 تظهر البالزما املمتصة للتحليل بالترتيب التالي: املعيارية IQC بالزما املريض وأخيرا املعيارية الثانية. وتتم مقايسة العينات ذات التركيزات الطبيعية من )FVIII( عادة باستخدام ثالثة تخفيفات مختلفة ضمن النطاق - 1/50 1/400. وللمستويات املنخفضة من )FVIII( )أقل من 0.05 وحدة دولية/ دل( فقد تكون هناك حاجة للتخفيفات 1/20 1/10 و 1/50. وللمستويات املرتفعة )أكثر من 1.5 وحدة دولية/ دل( قد تكون هناك حاجة لتخفيفات - 1/800 1/3200. وبخالف ذلك فقد تكون خطوط استجابة املريض للجرعة غير موازية للخط القياسي. ( لماعلل نيتلحرم ىلع رثختلا تاسياقماسياقمم 71

78 النتائج مخطط النتائج واحلسابات لفعالية العامل )FVIII( كما موصوف في مقاسية املرحلة الواحدة )القسم 23( إنتاج الكاشف المجتمع لمقايسة العامل )VIII:C( ذات المرحلتين احصل على كمية كافية من العامل )FV( والفسفوليبيد إلنتاج نسبة 5:1:1 مع املصل املعمر املخفف )أي 5 أجزاء من املصل إلى جزء 1 من العامل FV وجزء 1 من الفسفوليبيد(. على سبيل املثال 240 مل املصل املخفف و 48 مل من العامل FV و 48 مل من الفسفوليبيد )أو 180 مل: 36 مل: 36 مل(. الكواشف مصل معمر 10 1 مل من الدم املأخوذ من 6 متبرعني طبيعيني على األقل في أنابيب زجاجية عادية دون إضافات. 2 ي حتضن ملدة 4 ساعات في درجة 37 مئوية ثم طوال الليل في 4 درجات مئوية. 3 يتم تدويرها في 3000 دورة في الدقيقة ملدة 10 دقيقة. 4 افصلها وامزج الطافي في الزجاج غير سيليكوني )ميكن تخزينه مجمدا (. بوفني )FV( )دايجنوستيك ريايجنت لتد. ثامي أوكسفوردشاير انكلترا( أعد كل واحدة منها مع 1 مل من عازل اجلليوكسالني. فسفوليبيد )بيل وألتون دايجنوستيك ريايجنت لتد. أوكسفورد انكلترا( أعد كل واحدة منها مع 1 مل من عازل اجلليوكسالني )مثال 5 مرات تركيز(. عازل اجلليوكسالني حامض )HEPES( )سيجما )H3375 الطريقة 1 خفف املصل املعمر 1/10 بعازل اجلليوكسالني. 2 قم بتفعيل املصل املخفف ملدة ساعة قبل إضافة كرة زجاجية صغيرة واحدة )كرة بالوتيني( لكل مل وضعها في خالط دوار ملدة ساعة مع غشاء مختبر بالستيكي )فيلم( في األعلى(. مالحظة: تزن 100 كرة بالوتيني 3.7 غ(. مالحظة: اعمل بأسرع ما ميكن للخطوات تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

79 3 أعد بالزما )FV( في 1 مل من عازل اجلليوكسالني. 4 أعد الفسفوليبيد في 1 مل من عازل اجلليوكسالني. 5 امزج املصل املخفف املفع ل العامل FV والفسفوليبيد بنسبة 5:1:1. 6 امزجه جيدا وأضف مسحوق )HEPES( مما يعطي تركيز % 1 الستقرار درجة احلموضة عند 7.0 درجة )مثال إذا كان السائل 300 مل أضف 3 غ من )HEPES( 7 أفرغه في كمية 0.5 مل. 8 ميكن أن ي جمد هذا جافا )انظر القسم 40 حول التجميد اجلاف(. 9 افحص كاشفا جديدا حتت الظروف املثلى وكما مبني في أدناه. تقييم استقرار توليد العامل )FXa( يتطل ب التخفيف األمثل للعينة وفترة احلضانة والكمية الكلية للمقايسة وكمية م من كلوريد الكالسيوم لغرض إعادة التشكيل وطول مدة اإلعادة واستقرار الكاشف املجتمع إعادة تقييم بشكل منتظم للحصول على استقرار توليد العامل.)FXa( إن الترتيب واملدى الذي يحدث فيه ما يلي ليس نهائيا. فهو عرضة للتغيير اعتمادا على الكمية. وهناك نقطة انطالق جيدة وهي استخدام الظروف نفسها التي تستخدمها الكمية احلالية ثم غي ر املقياس في كل مرة. كمية اإلعادة مع م من كلوريد الكالسيوم: 0.5 مل 1 مل 1.5 مل 2 مل 2.5 مل 3 مل 3.5 مل. طول مدة اإلعادة قبل استخدام/ االستقرار بعد اإلعادة: مباشرة قبل االستخدام 5 دقائق 10 دقائق 30 دقيقة 60 دقيقة 120 دقيقة. مدة احلضانة: 5 دقائق 6 دقائق 7 دقائق 8 دقائق 9 دقائق 10 دقائق. تخفيف العينة:.1/ 100 1/ 80 1/ 50 1/20 كمية الكاشف املجتمع في املقايسة: 20 مايكرولتر 30 مايكرولتر 40 مايكرولتر 50 مايكرولتر الخ. لكل عملية مقايسة سج ل جميع النتائج على ورق يباني نوع )log-log( كما في املثال املبني في الشكل اختر التخفيفات والظروف التي حتتوي على أكبر عدد من النقاط على اجلزء اخلطي للمنحنى. وللظروف املثالية أوقات تخثر بحوالي 20 إلى 30 ثانية ألول تخفيف. ( لماعلل نيتلحرم ىلع رثختلا تاسياقماسياقمم 73

80 تلحظات يتم جتميع البالزما الطبيعية املجمعة/ الركيزة من البالزما الطبيعية املتبقية من عمليات مراقبة التخثر العادية أو من أشخاص أصحاء طبيعيني. يجب أن حتتوي البالزما الطبيعية على )PT( عادية و )APTT( عادية. ميكن تخزين البالزما الطبيعية املجمعة في مجاميع من قنان بالستيكية بحجم 3 أو 5 مل بدرجة 80- مئوية لستة أشهر على األقل. الشكل 1.25: مثال استقرار توليد العامل )FXa( 74 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

81 26 مقايسة كروموجينيك للعامل )VIII:C( المقدمة املقايسة املفضلة األكثر شيوعا للعامل )VIII:C( في جميع أنحاء العالم لسنوات عديدة هي مقايسة املرحلة الواحدة املوصوفة في القسم 23. هناك قيود على مقايسة املرحلة الواحدة وتشمل التدخل إذا كان مضاد تخثر الذئبة موجودا. األهم من ذلك ال ت ستثنى الهيموفيليا )A( اخلفيفة من خالل العثور على مستوى عادي للعامل )VIII:C( في مقايسة املرحلة الواحدة. وقد أبلغت عدة مجموعات عن فئة فرعية من الهيموفيليا اخلفيفة )A( أن لدى املرضى تعارضا بني نشاط العامل )FVIII( وكما محدد باستخدام أنواع مختلفة من املقايسات )باركيه - جيرنيز وآخرون 1988 دنكان وآخرون 1994 كيلنغ وآخرون 1999(. ويرتبط أكثر من % 20 من مرضى الهيموفيليا اخلفيفة )A( بهذا التناقض الذي يعرف بأنه فرق ذو شقني بني النتائج التي مت احلصول عليها من خالل أنظمة مقايسات مختلفة )باركيه - جيرنيز وآخرون 1988(. في بعض احلاالت قد تكون نتيجة املقايسة ذات املرحلة الواحدة أعلى بخمس مرات من مقايسة التخثر ذات املرحلتني أو مقايسة الكروموجينيك )باركيه - جيرنيز وآخرون 1988(. واألكثر شيوعا أن نتيجة املقايسة ذات املرحلة الواحدة هي أعلى مرتني من مقايسة التخثر ذات املرحلتني أو مقايسة الكروموجينيك. ولدى أكثر من ثالثة أرباع مرضى كهؤالء تنخفض جميع نتائج املقايسات حتت احلد األدنى للنطاق املرجعي بحيث ميكن أن يكون التشخيص موثوق به بغض النظر عن الطريقة التي يتم ات باعها للتحليل. ومع ذلك تكون نتائج مقايسة املرحلة الواحدة جيدة ضمن املعدل الطبيعي لنسبة صغيرة من املرضى مع مستويات منخفضة باستخدام مقايسة التخثر ذات املرحلتني أو مقايسة الكروموجينيك )كيلينغ وآخرون 1999 مازورير وآخرون 1997(. ولدى هؤالء املرضى تاريخ نزف متوافق مع املستويات الدنيا التي مت احلصول عليها مقايسة التخثر ذات املرحلتني أو مقايسة الكروموجينيك. في كثير من احلاالت يتم التعرف على اخللل اجليني لذا ليس هناك شك في أن هؤالء األشخاص لديهم هيموفيليا بالفعل )رودزي وآخرون 1996 مازورير وآخرون 1997(. استنادا إلى التوجيهات املطبوعة فإن حوالي % 5-10 % من املرضى املؤكد إصابتهم بالهيموفيليا اخلفيفة )A( وراثيا لديهم نتيجة مقايسة ذات مرحلة واحدة طبيعية. ومبا أن فعالية العامل )FVIII( طبيعية في مقايسة املرحلة الواحدة املستندة إلى APTT فليس من املستغرب أن يكون APTT طبيعيا أيضا لدى مرضى كهؤالء. وهذا يعني أن املرضى الذين لديهم تاريخ سريري متوافق مع الهيموفيليا )A( ينبغي أن يكون لديهم تخثر على مرحلتني )انظر القسم 25( أو مقايسة الكروموجينيك حتى لو كان كل من APTT ومقايسة املرحلة الواحدة طبيعيني. ( لماعلل كينيجومورك ةسياقمةسياقمم 75

82 ولدى عدد من املصنعني مجموعات جتارية ملقايسة الكروموجينيك للعامل.)FVIII( والعديد منها مناسبة لتشخيص الهيموفيليا )A( في وجود نشاط عادي ذي مرحلة واحدة للعامل.)FVIII( وتظهر أمثلة على النتائج لهكذا مرضى في الشكل 1.26 أدناه. لقد كان طقم مقايسة الكروموجينيك املستعمل طقما جتاريا من شركة سيمينز/ دايد بيهرنغ إال أن إدراجها ال يشير إلى التفوق على مقايسات مماثلة أخرى والتي ميكن استخدامها بنجاح في هذا السياق. الشكل 1.26: أمثلة لمرضى يعانون من الهيموفيليا الخفيفة )A( المؤكدة راثيا وتناقضات المقايسة الحالة مقايسة ذات مرحلة واحدة )وحدة دولية/ دل( مقايسة ذات مرحلتين )وحدة دولية/ دل( مقايسة كروموجينيك )وحدة دولية/ دل( أ ب ج د ه و ز هناك حاالت من الهيموفيليا اخلفيفة )A( لديها فعالية منخفضة ملقايسة املرحلة الواحد ولكن لها نتائج طبيعية في مقاسية املرحلني أو مقايسة الكروموجينيك )مومفورد وآخرون 2002 ليال اتش وآخرون 2008(. في كثير من احلاالت )ولكن ليس جميعها( من هذا القبيل يرتبط النمط الظاهري السريري بنتيجة مقايسة التخثر الكروموجينيك أو مقاسية املرحلتني عند عدم وجود تاريخ شخصي أو عائلي للنزف مع عدم وجود متطلبات ملعاجلة استبدال العامل )FVIII( )ليال اتش وآخرون 2008(. وبناء على هذه النتائج فإن من املفيد جلميع مراكز الهيموفيليا أن توفر مقايسة الكروموجينيك أو مقايسة املرحلتني للتجلط. يجب أن يتم تنفيذ هذه االختبارات على األشخاص ذوي ال APTT الطبيعي وفعالية )FVIII( ذات املرحلة الواحدة مع وجود تاريخ شخصي أو عائلي يتوافق مع الهيموفيليا اخلفيفة. مت وصف مقايسة الكروموجينيك املعدلة )النسخة املعدلة من مقايسة كواماتيك إنسترومنتيشن البراتوري لتد(. إنها مناسبة ملقايسة املستويات املنخفضة جدا من العامل )FVIII( )ياتوف وآخرون 2006(. وإبالغ هذه الطريقة لتتيح قياسات دقيقة وم حكمة للعامل )FVIII( في نطاق وحدة دولية/ دل )0.1 2 من FVIII أو وحدة دولية/ مل(. 76 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

83 مبدأ التحليل في بعض حتاليل الكروموجينيك )ولكن ليس جميعها( يتم تفعيل كافة FVIII في العينة بواسطة الثرومبني. يتم تفعيل FVIII ثم تسريع حتويل العامل )FX( إلى العامل )FXa( في وجود العامل )FIX( املفع ل والفوسفليبيد وأيونات الكالسيوم. يتم تقييم فعالية )FXa( من خالل حتلل ركيزة )p-nitroanaline( إلى )FXa( بالتحديد. يتناسب املعدل األولي إلفراز )p-nitroanaline( )أصفر اللون( بقياس 405 نانومتر مع )FXa( الفعال وبالتالي إلى فعالية )FVIII( في العينة. للمراجعة انظر لوندبالد وآخرون 2000(. المراجع Duncan EM, Duncan BM, Tunbridge LJ, Lloyd JV. Familial discrepancy between the one-stage and two-stage factor VIII assay methods in a subgroup of patients with haemophilia A. Br J Haematol 1994; 87: Keeling DM, Sukhu K, Kemball-Cook G, Waseem N, Bagnall R, and Lloyd JV. Diagnostic importance of the two stage FVIII:C assay demonstrated by a case of mild hemophilia associated with His1954 Leu substitution in the FVIII A3 domain. Br J Haematol 1999; 105: Lundblad RL, Kingdon HS, Mann KG, White GC. Issues with the assay of FVIII activity in plasma and FVIII concentrates. Thromb Haemost 2000; 84: Lyall H, Hill M, Westby J, Grimley C, Dolan G. Tyr346 Cys mutation results in factor VII:C assay discrepancy and a normal bleeding phenotype: Is this mild haemophilia A? Haemophilia 2008; 14: Mazurier C, Gaucher C, Jorieux S, Parquet-Gernez A. Mutations in the FVIII gene in seven families with mild haemophilia A. Br J Haematol 1997; 96: Mumford AD, Laffan M, O Donnell J, McVey JH, Johnson DJD, Manning RA, Kemball-Cook G. A Tyr346 Cys substitution in the interdomain acidic region a1 of FVIII in an individual with FVIII:C assay discrepancy. Br J Haematol 2002; 118: Parquet-Gernez A, Mazurier C, Goudemand M. Functional and immunological assays of FVIII in 133 haemophiliacs: Characterisation of a subgroup of patients with mild haemophilia A and discrepancy in 1- and 2-stage assays. Thromb Haemost 1998; 59: Rudzi Z, Duncan EM, Casey GJ, Neuman M, Favaloro RJ, Lloyd JV. Mutations in a subgroup of patients with mild haemophilia A and familial discrepancy between one-stage and two-stage factor VIII:C methods. Br J Haematol 1996; 94: Yatuv R, Dayan I, Baru M. A modified chromogenic assay for the measurement of very low levels of FVIII activity (FVIII:C). Haemophilia 2006; 12: ( لماعلل كينيجومورك ةسياقمةسياقمم 77

84 المقايسة الداخلية ذات المرحلة الواحدة للبريكاليكرين )PKK( ولمولد الكينينوجين ذي الوزن الجزيئي العالي )HMWK( 27 المبدأ إن )HMWK( ويعرف بعامل فيتزجيرالد و) PKK ( عامل فليتشر هي عوامل تخثر موجودة في مسار االتصال. ويسبب االنخفاض في أي منهما إطالة كبيرة ل )APTT( مع أغلب كواشف )APTT( اعتمادا على املنش ط املستخدم. في ظل الغياب الكامل لكل من )HMWK( أو )PKK( )> وحدة دولية واحدة/ دل( فيكون )APTT( عادة أكبر من 200 ثانية وأطول من )APTT( مع نظام االختبار نفسه وفي وجود نقص كامل للعوامل IX(.)VIII ستعطي كواشف )APTT( التي تستخدم حامض إيالجيك كمنشط )على سبيل املثال األكتني )FS نتائج طبيعية متاما مع أي من النقص. لذا ال ميكن استخدام كواشف كهذه في مقايسة املرحلة الواحد لهذه العوامل. ينحدر منحنى استجابة اجلرعة في مقايسة املرحلة الواحدة لهذه العوامل مع بعض الكواشف أكثر من غيرها. وتصف الطريقة املبينة أدناه استخدام كاشف معني واحد الذي ينحدر إلى منحنى استجابة اجلرعة بشكل حاد مما يؤدي إلى نتائج مقايسة أكثر دقة وضبطا. الكواشف كاشف دوبتون )APTT( )تيكنوكلون فيينا النمسا( ي خزن بدرجة 2 8 مئوية وفق تعليمات الشركة املصن عة 25 م م كلوريد الكالسيوم ي خزن بدرجة 2 8 مئوية عازل اورين فيرونال ي خزن بدرجة 2 8 مئوية البالزما ذات النقص في البريكاليكرين )عامل فليتشر( مثال: جت مد مجففة )تيكنوكلون فيينا النمسا( ت خزن بدرجة 2 8 مئوية البالزما ذات النقص في )HMWK( )عامل فيتزجيرالد( مثال: جت مد مجففة )تيكنوكلون فيينا النمسا( ت خزن بدرجة 2 8 مئوية البالزما املرجعية )على سبيل املثال البالزما الطبيعية املجمعة راجع القسم 7( عينة مراقبة اجلودة الداخلية 78 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

85 الطريقة 1 مت وصف تصميم املقايسة على أنها مقايسة )FVIII( ذات مرحلة واحدة في القسم 23 )أي 3 تخفيفات معيارية 3 تخفيفات من بالزما االختبار(. 2 مت صنع التخفيفات باستخدام عازل اورين. 3 عادة ما تكون أكثر تخفيفات املقايسة مناسبة أعلى من تلك املستخدمة في مقايسات املرحلة الواحدة ل )FVIII( أو مقايسات )FIX( املوصوفة سابقا. 4 مت وصف التحليل وتركيب منحنى املعايرة وحساب نتائج االختبار حتت مقايسات )FVIII( ذات املرحلة الواحدة )القسم 23(. النطاقات العادية من األدلة اإلرشادية كما يلي: :)HMWK( وحدة/ مل 70( 120 وحدة/ دل( وحدة/ مل :)PKK( ال توجد معايير دولية لكل من )HMWK( أو )PKK( في وقت كتابة هذا الدليل. ( نيركيلاكيربلل ةدحاولا ةلحرملا تاذ ةيلخادلا ةسياقملاملالاكيربلل ةدحاولا ةلحرملا تاذ ةيلخادلا ةسياقملاقملاا 79

86 28 مراقبة مثبط عامل التخثر المعتمد على )APTT( المبدأ قد تكون مثبطات التخثر التي تؤثر على )APTT( فورية أو ذات مفعول يعتمد على الوقت. وست ظهر بالزما االختبار التي حتتوي على مثبط فوري املفعول عندما ت خلط مع البالزما الطبيعية تصحيحا ضئيال أو معدوما لوقت التخثر. ومن ناحية أخرى تتطلب املثبطات املعتمدة على الوقت فترة حضانة مع البالزما الطبيعية قبل أن يتم اكتشافها. يتم احتضان البالزما الطبيعية وبالزما االختبار بدرجة 37 مئوية ملدة ساعة إلى ساعتني بشكل منفصل وعلى شكل مزيج 50:50. وعندها يتم حتديد )APTT( على البالزما الطبيعية وبالزما االختبار واملزيج احملتضن وكذلك على مزيج محض ر من كميات متساوية للبالزما الطبيعية وبالزما االختبار بعد حضانة منفصلة )متزج على الفور(. وتتم مقارنة درجة تصحيح )APTT( لكل مزيج. ويوحي التصحيح الرديء في املزيج امل عد بعد حضانة منفصلة أن املثبط فوري املفعول. يوحي التصحيح الرديء للمزيج احملتضن أن املثبط معتمد على الوقت. الكواشف بالزما طبيعية: مجموعة من 20 متبرعا بالزما االختبار كواشف ل )APTT( الطريقة 1 قم بإعداد ثالثة أنابيب بالستيكية: أ ب و ج. 2 ضع 0.5 مل من البالزما الطبيعية في األنبوب أ وضع 0.5 مل من بالزما االختبار في األنبوب ب وضع 0.2 مل من كل من البالزما الطبيعية وبالزما االختبار في األنبوب ج. 3 ضعها في احلاضنة ملدة ساعة واحدة إلى ساعتني بدرجة 37 مئوية. 4 اقسم املزيج بنسبة 50:50 من األنابيب أ و ب. وهذا هو األنبوب د والذي هو مبثابة مزيج فوري 5 قم بإجراء )APTT( بتكرار على أ ج د و ب )بهذا الترتيب(. 80 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

87 النتائج والتفسير الشكل 1.28: مثال على مراقبة مثبط عامل التخثر المستند إلى APTT العينة أ: البلاتا الطبيعية ب: بلاتا االختبار ج: بلاتا االختبار + الطبيعية )محتضنة بعد مزجها معا ( د: بلاتا االختبار + الطبيعية )محتضنة على حدة قبل المزج( العينة 1: بالزما ذات خلل جوهري ولكن بدون مانع العينة 2: بالزما حتتوي على مثبط معتمد على الوقت العينة 3: بالزما حتتوي على مثبط فوري املفعول ( ىلع دمتعملا رثختلا لماع طبثم ةبقارمقارمم 81

88 فعالية العامل المساعد ريستوسيتين/ فعالية العامل فون ويليبراند )فعالية )VWF:RCo( أو ))VWF( 29 المقدمة إن قياس العامل املساعد ريستوسيتني ضروري لتشخيص مرض فون ويلبراند.)VWD( بينما ميكن القيام بتراكم الصفائح الدموية الشاملة للريستوسيتني )في البالزما الغنية بالصفائح الدموية( عند إجراء الدراسات على تراكم الصفائح الدموية واالختبار ليس حساسا مبا يكفي ورمبا يواجه التراكم الضعيف اضطرابات أخرى من غير.)VWD( أن مقايسة )VWF:RCo( مفيدة بشكل خاص في الكشف عن نوع )2B 2A وVWF 2M( حيث قد يكون )VWF:Ag( طبيعيا أو شبه طبيعي في حني ينخفض )VWF:RCo( بشكل ملحوظ. مقايسة العامل المساعد ريستوسيتين جتمع الطريقة املوصفوفة هنا طريقة املقايسة العيانية وتقنية تثبيت الصفائح من ايفانز واوسنت. الكواشف البالزما املرجعية الصفائح الدموية املثبتة واملنجرفة يتم حتضير الصفائح الدموية البشرية العادية املثبتة بالفورمالديهايد العادي من تركيزات الصفائح الدموية مثل تلك املستخدمة لعالج املرضى الذين يعانون من اضطرابات الصفائح من خالل طريقة ايفانز واوسنت )1977(. انظر "حتضير الصفائح املثبتة" أدناه. Ristocetin (Ristocetin A SO 4 Macrofarm Ltd., Third Floor, 27 Cockspur Street, Trafalgar Square, London SW1Y 5BN) ريستوسيتني )ريستوسيتني ( 4 A( SO ماكروفورم لتد. الطابق الثالث 27 كوكسبر ستريت ترافاجلار سكوير لندن 5BN( ))SW1Y يتم تخفيف 100 ملغ من املسحوق في 3.3 مل من احمللول امللحي ثم تفر غ إلى كميات من 0.1 مل في أنابيب بالستيكية بأغطية وتخزن بدرجة 70- مئوية. ولهذا احمللول امل خزن بالتالي تركيز 30 ملغ/ مل. يتطل ب التركيز النهائي في أنبوب التحليل 1.0 ملغ/ مل. ومبا أن هناك تخفيف 1 من 4 في التحليل فيتطلب هذا محلوال من 4.0 ملغ/ مل. للحصول على 4.0 ملغ/ مل أضف 0.65 مل من احمللول امللحي إلى 0.1 مل من احمللول امل خزن 30 ملغ/ مل. )وينبغي أن تعطي وقتا خاليا أي 0.2 صفيحة مل ريستوسيتني عازل ألكثر من 60 ثانية. 82 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

89 6 غ % من عازل األلبومني احلامضي املالح استخدم العازل احلامضي/ املالح )جزء واحد 0.11 م سترات ثالثي الصوديوم: 5 أجزاء احمللول امللحي اعتيادي( مع 1.2 غ من ألبومني املصل البقري املضاف. الطريقة استخدام عازل األلبومني احلامضي املالح خفف البالزما الطبيعية وبالزما االختبار على النحو التالي: البالزما املعيارية: 1/ 8 1/ 4 1/2 بالزما االختبار: 1/ 8 1/ 4 1/2 افحص كل تخفيف في درجة حرارة الغرفة على النحو التالي: أوال. في أنبوب تخثر زجاجي ضع: 0.2 مل من الصفائح املثبتة املغسولة )في عدد / في محلول تعليق الصفائح الدموية( 0.1 مل من البالزما املخففة ثانيا. امزج جيدا مع جتنب تشكيل فقاعات قدر اإلمكان. أضف 0.1 مل من الريستوسيتني )4.0 ملغ/ مل إعطاء تركيز نهائي من 1.0 ملغ/ مل(. ثالثا. ابدأ تشغيل ساعة التوقيت. أم ل األنبوب بخفة وجيئة وذهابا على خلفية داكنة مع مصباح ساطع موجه على األنبوب. رابعا. سجل الوقت الذي يستغرقه جتمع كمية مرئية كبيرة. افحص كل تخفيف مرتني وثالث مرات إذا كان الفرق بني املرتني أكبر من %. 10 الحساب سجل الوقت الذي يستغرقه جتمع تخفيفات البالزما الطبيعية مقابل التخفيف/ التركيز لدورتني على ورق.)log-log( سجل الوقت احلاصل مع تخفيفات بالزما االختبار. يجب أن يكون الرسم البياني بخطوط مستقيمة متوازية. ي قرأ تركيز عامل الريستوسيتني املساعد في بالزما االختبار من املستوى القياسي واملصحح للتخفيف وقيمة القياسي بطريقة مماثلة لتلك الوارد وصفها في القسم الذي يوضح مقايسة )FVIII( ذات املرحلة الواحدة )القسم 23(. وينبغي وضع النطاق الطبيعي محليا ولكنه عادة ما يكون قريبا من وحدة دولية/ دل. ( ةيلاعف) دناربيليو نوف لماعلا ةيلاعف /نيتيسوتسير دعاسملا لماعلا ةيلاعف ةيلاعفةيلاعفاعفعف 83

90 1.29 إعداد الصفائح الثابتة الشكل 1.29: الكواشف إلعداد الصفائح الثابتة 2 غ من ثنائي الصوديوم EDTA 8.5 غ من كلوريد الصوديوم ماء مقطر حتى لتر 1 بدرجة حموضة مل 40 % من محلول الفورمالديهايد )أو 22.2 مل % 36 فورمالدهايد(. 0.2 غ ثنائي الصوديوم EDTA 8.5 غ من كلوريد الصوديوم 0.4 من فوسفات الهيدروجين ثنائية الصوديوم 1.1 غ ثنائي هيدروجين الصوديوم ثنائي هيدرات الفوسفات ماء مقطر حتى لتر 1 درجة حموضة 6.4. جزء واحد من محلول سترات ثلثي الصوديوم )3.8 %( 5 أجزاء من محلول الماء الملحي درجة حموضة 6.4 مثل محلول الغسل ولكن بدرجة حموضة ثنائي الصوديوم EDTA 8.5 غ من كلوريد الصوديوم 0.10 غ من أزيد الصوديوم ماء مقطر حتى لتر 1 درجة حموضة 6.4 % 0.2 من محلول )EDTA( محلول التثبيت محلول الغسل محلول التعليق محلول الحفظ الطريقة 1 احصل على الصفائح الدموية حديثة قدر املستطاع في ديكستروز سيترات الفوسفات )كما مستخدم في جمع منتجات الدم( أو خذ الدم في م سيترات وقم بتحضير البالزما غنية الصفائح.)PRP( 2 اترك )PRP( في حاوية بالستيكية بغطاء في درجة حرارة الغرفة ملدة ساعة ثم بدرجة 37 مئوية ملدة ساعة. امزج تسعة أجزاء من )PRP( مع جزء واحد من محلول.)EDTA( دعها تركد ملدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة 3 أضف حجما متساويا من محلول التثبيت بدرجة 4 مئوية واتركه بدرجة 4 طوال الليل. 4 يطرد مركزيا في 280 غ )جاذبية( ملدة 20 دقيقة. جتاهل الطافي وأفرغ حبيبات الصفائح الدموية. 5 أضف % 2 من كمية البداية من )PRP( من محلول الغسل وأعد تعليق الصفائح. 6 خففه أكثر حتى % 25 من كمية البداية من )PRP( واتركه في درجة 4 مئوية ملدة ساعة. 7 يطرد مركزيا في 280 غ ملدة 20 دقيقة يفر غ ويعاد تعليقه في محلول التعليق لالستخدام الفوري أو في محلول التخزين خلزنه بدرجة 4 مئوية لالستخدام في وقت. 8 أعد تعليقه إلى تركيز يقارب / ل. 84 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

91 ستستقر الصفائح بالتخزين لتشكيل ترسبات طليقة. قبل البدء باملقايسة أزل محلول التخزين من فوق الصفائح واستبدله بكمية متساوية من محلول التعليق. وعندها تستقر الصفائح الدموية ملدة شهرين على األقل. المرجع Evans RJ, Austen DE. Assay of ristocetin cofactor using fixed platelets and a platelet counting technique. Brit J Haemato 1997; 37: ( ةيلاعف) دناربيليو نوف لماعلا ةيلاعف /نيتيسوتسير دعاسملا لماعلا ةيلاعف ةيلاعفةيلاعفاعفعف 85

92 مولد مضاد العامل فون ويليبراند بواسطة تقنية )ELISA) (VWF:AG( 30 المبدأ يرتبط اجلسم املضاد ذو النسائل املتعددة لعامل فون ويلبراند )VWF( البشري بالسطح البالستيكي لألوعية في صفيحة مايكروتيتر. تضاف تخفيفات البالزما املعيارية وبالزما االختبار ويتم احتضانها وخالل وقتها يرتبط )VWF( باجلسام املضاد. ويضاف األنزمي الثاني املسمى باجلسم املضاد والذي يرتبط بدوره ب.)VWF( كمية اجلسم املضاد مرتبطة وبعد ذلك يوجد )VWF( كميا وذلك بإضافة إنزمي الركيزة يليه اضافة املادة امللونة. العوازل عازل الكربونات 0.05 م بدرجة حموضة 9.6 لكل لتر : غ كربونات الصوديوم 0.93 غ كربونات هيدروجني الصوديوم 0.20 غ أزيد الصوديوم محلول الفوسفات امللحي املعزول 0.01 م بدرجة حموضة 7.2 لكل 1 لتر: غ فوسفات هيدروجني الصوديوم الثنائي غ فوسفات الهيدروجني ثنائية الصوديوم غ كلوريد الصوديوم توين )PBS( 20 1 مل/ ل توين )PBS( مل/ ل عازل سيترات الفوسفات 0.1 م بدرجة حموضة 0.5 لكل 1 لتر: 7.30 غ من حامض الستريك غ من فوسفات الهيدروجني ثنائية الصوديوم 12H 2 0 محلول االرتكاز soluation( )substrate 80 ملغ ثنائي كلوريد 1.2 كلوريد ثنائي األورثوفينيلينيديامني املذاب في 15 مل سترات الفوسفات العازلة و 10 ميكرولتر من 20 كمية. بيروكسيد الهيدروجني املضاف. مالحظة: يجب أن يحضر جديدا في كل مرة. مواد أخرى مضادات األجسام املضادة )VWF( مثال : مضاد )VWF( البشري أو من األرانب من داكو أي/ اس )إنتاج سفيج دي كي جالستروب الدمنارك(. 86 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

93 Anti VWF antibody Example: rabbit anti-human VWF from DAKO a/s (Production Svej, DK-2600, Glastrup, Denmark). مضادات األجسام املضادة )VWF( املترافقة مع انزمي البيروكسيديز )أيضا من داكو(. مالحظة: ميكن استخدام مصادر أخرى لألجسام املضادة وبنفس القدر من النجاح. قد تختلف تخفيفات األجسام املضادة املقترحة أدناه وفقا للمصدر وعدد مجموعة األجسام املضادة املستخدمة. ألواح مايكروتيتر لالستخدام مرة واحدة وقارئ ألواح 10 % من محلول حمض الكبريتيك الطريقة 1 أضف 100 مايكرولتر من اجلسم املضاد املخفف بنسبة 1/1000 في عازل الكربونات لكل وعاء يتم استخدامه. ضع اللوحة في احلاضنة ملدة ساعة واحدة في صندوق رطب في درجة حرارة الغرفة. 2 اغسل األوعية مبلئها 0.5 مل/ ل من توينPBS يليها قلبها وضربها بلطف على ورق االمتصاص. كرر أربع مرات. 3 اصنع تخفيفات من البالزما املعيارية 1/20( )1/320 1/160 1/80 1/50 1/40 1/30 وبالزما االختبار )1/20 1/60 1/80 1/40 بالنسبة للطبيعي 1/5 بالنسبة للنتائج املتوقعة املنخفضة( في 1 مل/ ل من توين.)PBS( 4 أضف 100 مايكرولتر من كل تخفيف إلى األوعية ضعها في احلاضنة ملدة ساعة واحدة كما في السابق واغسلها كما مر آنفا. 5. أضف 100 مايكرولتر مضاد البيروكسيداز املترافق للجسم املضاد )VWF( من داكو واملخفف بنسبة 1/1000 في 1 مل/ ل من توين )PBS( لكل وعاء وضعه في احلاضنة كما سبق.. 6. قم بتكوين الركيزة اآلن اتركها في الظالم باستخدام رقائق األملنيوم حولها من جميع اجلهات واتركها متتزج حتى تتحلل البلورات أو القرص. )أضف بيروكسيد الهيدروجني مباشرة قبل االستعمال.(. 7. شغل قارئ اللوحة. 8. اغسل مرتني في 0.5 مل/ ل )PBS( ومرة واحدة في 0.1 م من سيترات الفوسفات العازلة. 9. أضف 100 مايكرولتر من محلول الركيزة اجلديد لكل وعاء وضع اللوح في احلاضنة في درجة حرارة الغرفة في صندوق رطب لنحو ست دقائق )حتى يصبح اللون واضحا في أدنى تخفيف قياسي(. ( ةينقت ةطساوب دناربيليو نوف لماعلا داضم دلوماعلا داضم دلومم 87

94 10. أوقف التفاعل بإضافة 100 مايكرولتر من محلول حامض الكبريتيك بنسبة % 10 إلى كل وعاء في نفس املعدل الذي متت إضافة الركيزة إليه. إذا مت استخدام ماصة متعددة القنوات فمن السهل إضافة الركيزة إلى كل صف من األوعية بالتعاقب في مدة 10 ثوان ومن ثم إضافة حامض الكبريتيك في التسلسل نفسه في مدة 10 ثوان. 11. اقرأ الكثافة البصرية )OD( في 492 نانومتر. ويتم احلصول على النتائج من خالل تخطيط الكثافة البصرية مقابل التخفيف على ورق بياني.)log/log( مت وصف طريقة التخطيط واحلساب عند توضيح مقايسة )FVIII( ذات املرحلة الواحدة في القسم تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

95 31 مقايسة الكوالجين الملزمة لعامل فون ويليبراند )VWF:CB( المبدأ لدى عامل فون ويلبراند )VWF( عدة وظائف. إضافة إلى كونه البروتني الناقل ل )FVIII( في البالزما وتشكيل املركب الذي يحمي )FVIII( من التحلل البروتيني فهو يعمل أيضا كوسيط لتجميع الصفائح الدموية عن طريق ربط نفسه ملستقبالت غشاء الصفائح GpIb( وGpIIb/IIa ( بعد عملية حتفيز الصفائح الدموية. من املهم أيضا في عملية اإلرقاء األولية العمل كوسيط بني الصفائح وما حتت البطانة. أن )VWF:RCo( الواردة في )القسم 29( هي مقياس خلصائص التالصق ل VWF إال أنها قد ال تعكس وظيفتها الفسيولوجية دائما. إن قياس قدرة ال VWF على ربط الكوالجني قد تعكس بعض األحيان وظيفتها الفسيولوجية على نحو أفضل. وفي أغلب أحوال VWD )ولكن ليس كلها( هناك توافق بني نتائج )VWF:RCo( و) VWF:CB (. في حاالت نادرة من VWD تكون واحدة من هذه االنشطة قليلة الفعالية ويكون اآلخر هو ضمن املعدل الطبيعي. قد يحتاج التشخيص الكامل إجراء كال املقايسات رغم أن العديد من املراكز ال تستخدم سوى واحد من اثنني فقط. يختار بعض الكت اب )VWF:CB( في غياب فحص )VWF:RCo( املناسب الدقيق. وهناك عدد من املجموعات)مواد عمل الفحص( املتاحة جتاريا في السوق في وقت كتابة هذا الدليل. وهناك مثال أدناه ولكن البقية قد مت استخدامها بنجاح أيضا. إن إدراج هذه الطريقة ال يعني توصية مبنتج شركة معني. إذا قد يتم استخدام مصدر جتاري مختلف فمن املهم اتباع تعليمات الشركة املصن عة. الكاشف مجموعة تيكنوزمي )VWF:CB( إليسا )تكنوكلون فيينا النمسا( يحفظ بدرجة حرارة 2 8 مئوية وفق تعليمات الشركة املصن عة. العينات ميكن تخزين بالزما االختبار السيتراتية واملعايرة مجمدة بشدة في درجات حرارة أقل من 35- مئوية قبل التحليل. الطريقة 1. تأكد من إحضار مواد الطقم )Kit( بدرجة حرارة الغرفة ملدة 30 دقيقة قبل البدء. وميكن تقسيمه إلى ثالثة أو أربعة وفقا لعدد العينات املراد فحصها. ت ايمة الكوالجيق المل ةمزلملا نيجالوكلا ةسياقمةسياقمم 89

96 2. حضر العينات املعيارية وعينات املراقبة باستخدام 0.5 مل من املاء املقطر واتركها ملدة 15 دقيقة أو قم بإذابتها إذا كانت مجمدة مسبقا. امزجه جيدا بتدويره ملدة 10 ثوان. 3. خفف جميع بالزما االختبار واملراقبة والبالزما املعيارية )أي 20 مايكرولتر بالزما و 500 مايكرولتر عازل حضانة( ثم امزجه بتدويره. 4. قسمه بكميات متساوية وجمد بالزما املعايرة وبالزما املراقبة وخزنها بدرجة 80- مئوية. 5. أضف 100 مايكرولتر لكل عينة تخفيف في الوعاء املناسب قم بتغطيته بفيلم وضعه في احلاضنة ملدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة )20 25 مئوية(. قم بعمل جميع االختبارات مكررة. 6. هيئ عازل الغسيل. خفف جزءا واحدا من عازل الغسل املركز ب 9 أجزاء من املاء املقطر اخلطه جيدا. قبل التمديد حل أي رواسب بلورية تظهر من خالل احلاضنة بدرجة 37 مئوية ملدة 10 دقائق. 7. بعد 45 دقيقة اغسله ثالث مرات باستخدام 200 مايكرولتر من عازل الغسل املخفف لكل وعاء يليه قلبها واضربها بلطف على ورق االمتصاص. 8. هيئ محلول العمل املتقارن )conjugate( بتخفيف جزء متقارن واحد مع 50 جزءا من عازل احلاضنة buffer).)incubation شكل ها قبل االستخدام مباشرة إذ تكون مستقرة 60 دقيقة فقط. امزج 20 مايكرولتر متقارنة مع 1000 مايكرولتر من العازل ل 8 أوعية. 9. أضف 100 مايكرولتر من محلول العمل املتقارن لكل وعاء قم بتغطيته ثم ضعه في احلاضنة في درجة حرارة الغرفة ملدة 45 دقيقة. 10. اغسله ثالث مرات باستخدام 200 مايكرولتر من عازل الغسل كما مر سابقا يلي ذلك قلبها وضربها بلطف على ورق امتصاص. 11. أضف 100 مايكرولتر من محلول الركيزة لكل وعاء غط ه بفيلم وضعه في احلاضنة ملدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 12. أضف 100 مايكرولتر من محلول اإليقاف لكل وعاء. 13. قم برجه ملدة 10 ثوان. باستخدام قارئ لوحات مايكروتيتر reader,) )microtitre plate مناسب قم بقياس الكثافة البصرية )OD( ضمن 10 دقائق في 450 نانومتر. 14. خطط )يدويا أو باستخدام باقة اإلحصاءات( تركيز )VWF:CB( )على احملور السيني( مقابل )OD( )على احملور الصادي( باستخدام تقنية نقطة إلى نقطة خطي-خطي. املعدل الطبيعي: وحدة دولية/ مل 90 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

97 للمزيد من القراءة Favaloro EJ. An update on the VWF collagen binding assay: 21 years of age and beyond adolescence but not yet a mature adult. Semin Thromb Hemost 2007; 33: Laffan M, Brown SA, Collins PW, Cumming AM, Hill FG, Keeling D, Peake IR, Pasi KJ. The diagnosis of VWD: A guideline from the United Kingdom Haemophilia Centre Doctors Organisation. Haemophilia 2004; 10: ت ايمة الكوالجيق المل ةمزلملا نيجالوكلا ةسياقمةسياقمم 91

98 مقايسة ربط العامل )VIII( لتشخيص مرض فون ويلبراند نورماندي 32 المبدأ النوع الثاني من )VWD( هو شكل كمي من )VWD( يؤثر على وظيفة البروتني في.)VWF( ويتميز النوع 2 نورماندي )2N( مبستويات منخفضة بشكل غير طبيعي من )FVIII:C( بسبب انخفاض تقارب )VWF( من.)FVIII( ونتيجة لذلك فإن قلة )FVIII( ال بد منها وبالتالي فإن هذه القلة محمية من التدهور/ اإلزالة مما أدى إلى تركيز منخفض في البالزما. مت العثور على الطفرات املسؤولة عن نوع VWD( 2N( في املجال )FVIII( امللزم اخلاص ب.)VWF( وفي العادة يشابه املرضى ذوي النوع VWD( 2N( املرضى الذين يعانون من الهيموفيليا اخلفيفة - منخفضة )FVIII:C( مع املستويات الطبيعية من )VWF:RCo( و) VWF:Ag ( - ولكن لديهم منط مكبوت متنح بالوراثة. إن مقايسة )FVIII( امللزمة هي طريقة قائمة على )ELISA( لتحديد ما إذا كان )VWF( يلزم )FVIII( بشكل اعتيادي. تستخدم األجسام املضادة وحيدة النسيلة اللتقاط )VWF( ويتم استخدام كلوريد الكالسيوم إلزالة )FVIII( الذاتي من )VWF( وتتم إضافة كمية معروفة من املؤتلف )FVIII( لربط )VWF( ورفع الربط. ثم يقاس )FVIII( امللزم باستخدام مقايسة كروموجينيك ل.)FVIII( مت أدناه وصف طريقة ربط )FVIII( على أساس التقنية املنشورة )نسبيت وآخرون 1996(. مت نشر البيانات املتحصلة باستخدام مقايسة جتارية وضعت مؤخرا VWF:FVIIIB,( Asserachrom )Diagnostica Stago في صيغة مختصرة )كارون وآخرون 2009(. وتشابه هذه املقايسة تلك املوصوفه أدناه في خطوات التحليل األولية. وفيها يتم استخدام أوعية مايكروتيتر املغلفة مبضادات األجسام املضادة ل )VWF( من األرانب والتي تربط )VWF/FVIII( من بالزما املريض املخففة. بعد إزالة )FVIII( الذاتية )من املريض( يضاف )FVIII( املؤتلف والذي يرتبط ب )VWF( اخلاص باملريض تبعا لطبيعة جزيء )VWF( لدى املريض. ويختلف هذا االختبار عن االختبار املوضح أدناه في ما يتعلق بطريقة الكشف عن )FVIII( املرتبط: وفي هذا االختبار التجاري يتم استخدام مضادات الفئران املترافقة ضد أجسام )FVIII( املضادة البشرية. وقد ذكرت الدراسات أن املقايسة حساسة بنسبة % 100 وتعتمد خصوصا على حتليل 37 حالة مت تشخيصها سابقا من نوع VWD( 2N( و 13 ناقل طفرات متغايرة )كارون وآخرون 2009( مع معامل مقايسة داخلى للتباين بنسبة أقل من % 10 لقياسات النسبة املئوية من )FVIII( امللزم. الكواشف أجسام )533p )MAS املضادة وحيدة النسيلة ملوقع )GPIb( امللزم ل )VWF( أكسفورد بايوتكنولوجي OBT0085 أكسفورد اململكة املتحدة(. يحفظ بدرجة حرارة 4 مئوية وفق تعليمات الشركة املصن عة. ويالحظ أنه ميكن استخدام األجسام املضادة األخرى من مصادر مختلفة بنجاح. 92 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

99 تركيز )FVIII( 2.5 وحدة/ مل )مثل أدفيت باكستر فارماكيوتيكل( يحفظ بدرجة 80- مئوية. يتم تخفيف التركيز في عازل )HEPES( املصنوع من: غ/ ل من حامض HEPES غ/ ل من ملح HEPES غ/ ل من كلوريد الصوديوم أضف % 1 من BSA اصنعه بكمية 100 مل بدرجة حموضة حتى 7.35 طقم كوتيست )FVIII( كروموجينيك )إنسترومينتال البراتوري ليكسينجتون ماساتشوستس الواليات املتحدة األمريكية( طقم واحد يكفي للوحتني. استعمل طقم التصنيع وجم د الكواشف املتبقية بدرجة % حامض اخلليك عينات مراقبة اجلودة وتشمل املراقبة العادية إذا توفرت وت عروف مبراقبة VWD نورماندي. العوازل ميكن ترميز هذه العوازل بألوان من أصباغ الطعام مما يجعل رؤيتها أسهل في لوحة مايكروتيتر. كو ن عوازل جديدة لكل مقايسة. عازل سيترات الفوسفات 0.1 م بدرجة حموضة 0.5 لكمية 0.5 لتر: 3.65 غ من حامض الستريك )10081 )BDH 4.74 غ فوسفات الهيدروجني ثنائية الصوديوم الالمائية )102494C )BDH 10 تريس محلول ملحي معزول :)TBS( 50 م م تريس 100 م م كلوريد الصوديوم درجة احلموضة 8.0 لكمية 0.5 لتر: غ تريس )سيغما( غ كلوريد الصوديوم )سيغما( يحتاج حوالي 60 مل 1 م )HCL( لدرجة احلموضة. عازل غسل: (BSA( )TBS)/ 0.1 % لكمية 1 لتر: 100 مل 10 TBS 900 مل H 2 O 1 غرام ألبومني بقري )سيغما( ( لماعلا طبر ةسياقمياقمرم صيخشتل (VIII) لماعلا طبر ةسياقم 93

100 مخفف بالزما: TBS/ 3 % BSA لكمية 100 مل: 10 مل 10 TBS 90 مل H 2 O 3 غرام ألبومني بقري )سيغما( محلول كلوريد الكالسيوم 0.35 لكمية 50 مل: 17.5 مل 1 م كلوريد الكالسيوم 32.5 مل H 2 O مخفف FVIII لكمية 100 مل: 100 مل عازل غسل غ كلوريد الكالسيوم مل توين )سيغما P5927( اغمر الطرف األصفر في توين واترك قطرة واحدة تسقط في العازل. الطريقة يستغرق هذا االختبار ثالثة أيام متتالية. تأكد أن نتائج )VWF:Ag( لكل مريض اختبار متوفرة قبل بدء هذا االختبار. اليوم 1 )مساء ( 1. خفف جسما مضادا أحادي النسيلة )533p )MAS من )أكسفورد بايوتيكنولوجي( في كمية 1 م من عازل السيترات بدرجة حموضة )0.5( إلى تركيز 2.5 ميكروغرام/ ل )50 مايكرولتر من اجلسم املضاد بالضبط في 10 مل من العازل(. 2. غل ف لوحة مايكروتيتر )NUNC( باستخدام 100 ميكروليتر من مزيج األجسام املضادة/ العازل واتركه طوال الليل بدرجة 4 مئوية ومغطى بشريط بارافيلم.)parafilm( هناك فقط ما يكفي فقط لتغطية 11 صفا لذا أترك الصف 12 غير مغلف. اليوم 2 )مساء ( 3. اغسل أربع مرات باستخدام )50) TBS) م م تريس 100 م كلوريد الصوديوم درجة حموضة 8.0( ويحتوي على % 0.1 BSA وجفف السائل الزائد. 4. أضف 100 مايكرولتر من تخفيفات البالزما املتسلسلة )~ وحدة واحدة/ دل من (VWF:Ag-) وحدة/ دل من ))VWF:Ag( في /)TBS( 3 % من )BSA( وضعه في احلاضنة بدرج 4 مئوية طوال الليل في صندوق رطب. راجع بروتوكول التخفيف أدناه والشكل 1.32 ملخطط اللوحة. 94 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

101 بروتوكول التخفيف يتم إنتاج أربعة تخفيفات من كل بالزما اختبار من خالل التخفيف املزدوجة. ابدأ مبا ال يقل عن 0.6 مل من التخفيف األول. يجب أن تخفف كل عينة إلنتاج وحدة واحدة/ دل )0.01 وحدة/ مل( لذا يجب معرفة )VWF:Ag( قبل البدء بهذا االختبار. على سبيل املثال إذا كان )Ag:VWF( 0.90 وحدة دولية/ مل اصنع تخفيف بداية بنسبة 1/90 وإذا كان )Ag:VWF( 0.06 وحدة دولية/ مل اصنع تخفيف البداية 1/6 الخ. للحصول على عينات املرضى واملراقبة خفف وفقا ملستوى )VWF:Ag( إلى أقرب 0.05 وحدة/ مل )أي )Ag:VWF( = 0.13 تخفيف 1/15 إلى آخره(. اليوم 3 )ابدء فى حوالى الساعة 9:30 صباحا ( 5. اغسل كما مر سابقا. 6. إلزالة )FVIII( الذاتية ضعه في احلاضنة مرتني مع 100 مايكرولتر 0.35 م من كلوريد الكالسيوم ملدة ساعة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. جتاهل أول كلوريد الكالسيوم قبل إضافة الكمية الثانية. ال تقم بالغسل بينهما. 7. اغسل كما مر سابقا. 8. خفف 200 مايكرولتر من )FVIII( إلى 10 مل من مخفف )FVIII( النتاج 0.05 وحدة/ مل من.)FVIII( أضف 100 مايكرولتر لكل وعاء وضعه في احلاضنة ملدة ساعتني بدرجة 37 مئوية. 9. غسل كما مر سابقا. 10. استخدم طقم كوتيست )SP4FVIII( كروموجينيك على النحو التالي: أوال. أخرجه من الغرفة الباردة قبل 30 دقيقة من استخدامه لغرض تدفئته. ثانيا. كو ن الكواشف وفقا لتعليمات الطقم: العوامل (FX( )FIXa) + في 3 مل من املاء املقطر لتكوين قنينتي من كل واحد ( S( في 12 مل من املاء املقطر ثالثا. امزج في قنينة بالستيكية مناسبة ذات استخدام ملرة واحدة: 5 أجزاء من العوامل (4.12( (FX) FIXa) + مل( )طازجا ( جزء واحد من الفسفوليبيد )0.83 مل( 3 أجزاء 1/10 تخفيف من طقم العازل )250 مايكرولتر من قم العازل و 2.25 مل من املاء( رابعا. أضف 75 مايكرولتر من هذا اخلليط إلى كل وعاء ثم ضعه في احلاضنة ملدة خمس دقائق في درجة 37 مئوية. ( لماعلا طبر ةسياقمياقمرم صيخشتل (VIII) لماعلا طبر ةسياقم 95

102 11. دون جتاهل اخلليط أضف 25 مايكرولتر م من كلوريد الكالسيوم من الطقم إلى كل وعاء. ضعه في احلاضنة ملدة خمس دقائق في درجة 37 مئوية. 12. أضف 50 مايكرولتر من ركيزة الكروموجينيك )2765-S( إلى كل وعاء. 13. اتركه بدرجة 73 مئوية حتى يتطور اللون )عادة حوالي 20 دقيقة( وراقب 1.0 وحدة/ دل لديها كثافة بصرية )OD( من اقرأ باستخدام قارئ اللوحة بدرجة 405 نانومتر )املرشح 1(. 14. أوقفه باستخدام 50 ميكرولتر من % 20 من حامض اخلليك )املصنوع من 2 مل من حامض اخلليك املثلج و 8 مل من املاء(. 15. أعد قراءة االمتصاص لكل عينة باستخدام قارئ اللوحة بدرجة 405 نانومتر )املرشح 1(. 16. سجل تركيز املستضد )VWF( مقابل االمتصاص بدرجة 405 نانومتر من )FVIII( املرتبط. يجب إبالغ النتائج في صيغة رسم بياني وتقرير )انظر تفسير البيانات أدناه(. الشكل 1.32: تخطيط لوحة مايكروتيتر من 96 وعاء PT8 1.0 PT6 1.0 PT4 1.0 PT2 1.0 CTL 1.0 PT8 1.0 PT6 1.0 PT4 1.0 PT2 1.0 CTL 1.0 أ B1 PT8 0.5 PT6 0.5 PT4 0.5 PT2 0.5 CTL 0.5 PT8 0.5 PT6 0.5 PT4 0.5 PT2 0.5 CTL 0.5 ب B2 PT PT PT PT CTL 0.25 PT PT PT PT CTL 0.25 ج B3 PT PT PT PT CTL PT PT PT PT CTL د B4 N 1.0 PT7 1.0 PT5 1.0 PT3 1.0 PT1 1.0 N 1.0 PT7 1.0 PT5 1.0 PT3 1.0 PT1 1.0 ه B5 N 0.5 PT7 0.5 PT5 0.5 PT3 0.5 PT1 0.5 N 0.5 PT7 0.5 PT5 0.5 PT3 0.5 PT1 0.5 و B6 N 0.25 PT PT PT PT N 0.25 PT PT PT PT ز B7 N PT PT PT PT N PT PT PT PT ح B8 = B فارغة = CTL تداقبة البلاتا = PT عينات اختبار = N تعروفة على أنها VWD مراقبة نورماندي )إن و جدت( اختبار ثمانية مرضى في لوحة واحدة. 96 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

103 تفسير البيانات 1. احسب متوسط الكثافة البصرية )OD( لكل مريض واملراقبة واملراقبة السلبية. 2. ابدأ ورقة عمل جديدة في برنامج إيكسل Excel وأدخل البيانات التالية: العمود أ في أ 1 : )VWF:Ag( وحدة/ دل في أ 2 : 1.0 في أ 3 : 0.5 في أ 4 : 0.25 في أ 5 : العمود ب في ب 1 : اسم املريض ب 2-5 : متوسط الكثافات البصرية )ODs( لتخفيفات املريض األربع العمود ج في ج 1 : املراقبة العادية ج 2-5 : متوسط الكثافات البصرية )ODs( لتخفيفات املراقبة األربع العمود د في د 1 : مراقبة نورماندي د 2-5 : متوسط الكثافات البصرية )ODs( لتخفيفات )RD( األربع 3. اختر scatter Chart wizard XY مع خطوط ممهدة. اختر جميع األعمدة األربعة الكثافات البصرية )ODs( وتأكد من التسلسل في األعمدة. 4. على الرسم البياني الناجت ينبغي تسمية احملور السيني )VWF:Ag( وحدة/ دل. وقم بتسمية احملور الصادي 405 نانومتر من )FVIII( امللزم. ادمج الرسم البياني ككائن في الصحيفة رقم أضف خط االجتاه اخلطي خلطوط املراقبة العادية وخطوط املريض ثم اختر عرض التعادل على الرسم البياني. سيظهر هذا معادلة لكل سطر تشبه ص = 0...س ص. استخدم اجلزء 0... س حلساب نسبة تدرج املريض/ تدرج املراقبة. المراجع Caron C, Ternisien C, Wolf M, Fressinaud E, Goudemand J, Veyradier A. An accurate and routinely adapted ELISA for Type 2N von Willebrand disease diagnosis. Abstracts of Congress of International Society for Haemostasis and Thrombosis, Boston, Nesbitt IM, Goodeve AC, Guilliatt AM, Makris M, Preston FE, Peake IR. Characterisation of type 2N von Willebrand disease using phenotypic and molecular techniques. Thromb Haemost 1996; 75: ( لماعلا طبر ةسياقمياقمرم صيخشتل (VIII) لماعلا طبر ةسياقم 97

104 33 تحليل )VWF( مولتيمر المبدأ مبدأ حتليل املولتيمر هو الفصل الكهربي ملولتيمرات )VWF( على هالم أجاروس )SDS( اعتمادا على وزنها اجلزيئي يليها تصوير غير شعاعي باستخدام نظام األجسام املضادة املترافقة للفوسفاتيز القلوية. في طريقة إنايات يتم إنتاج ثالثة تركيزات من املواد الهالمية الفاصلة في نطاق بني % 1 و % 1.8 أجاروس )عادة % % 1.8 )% لغرض حتديد النطاق الكامل ملولتيمرات )VWF( )في )% 1 فضال عن البنية الثالثية الفردية لكل مولتيمر )بنسبة %(. 1.8 اشتقت هذه الطريقة من إنايات )1983( وروجيري )1981(. الشكل 1.33: جدول أعمل تحليل مولتيمر )VWF( اليوم/ الوقت اإلثنين/ الثالثاء الثالثاء/ األربعاء األربعاء/ الخميس الخميس/ الجمعة هيء العوازل باستثناء عازل الهلم السائل قبل يوم االختبار راقب صبغة المؤشر. توقف عند وصول الفتيل. قد يحتاج لزيادة التيار 8 ص اشطف الهلم ب H 2 O اشطف الهلم ب H 2 O اشطف الهلم ب H 2 O 9 ص اشطف الهلم بتوين/ TBS متجها لألعلى 8 مرات بنهاية اليوم اشطف الهلم بتوين/ TBS متجها لألعلى 8 مرات قبل 3 مساء تحضير عازل الهلم السائل أضف أجاروس جفف الهلم باستخدام مجفف شعر بارد.* 10 ص أنشئ اللوحات ضع عازل الهلم السائل في الميكروويف 11 ص اتركه يبرد حتى درجة مئوية قبل الصب 11:30 ص 98 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

105 اترك الهلم ليركد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم بدرجة 4 مئوية لمدة ساعة واحدة 12 م 2 م شغ ل المبرد. خفف مع درجة حموضة العازل الكهربائي. اقطع الفتائل. أذب عينات المرضى واألحواض الصفراء خفف حسب االقتضاء قص األوعية. أضف بلاتا المريض. شغ ل في 30 ميغا أمبير )230 فولت( لمدة 30 دقيقة. ضع الهلم في 150 مل % 5 من الحليب )TBS( متجها لألعلى في خلط مداري صب آخر غسلة وصب محلول AP على الهلم متجها لألعلى 3 م عندما تصبح العينة خارج الوعاء امأل األوعية بعازل الهلم السائل وخفض التيار الى 5 ميغا أمبير )110 فولت(. بعد تطو راللون 45( 60 - دقيقة( أوقف التفاعل بالشطف لعدة مرات ب H. 2 O جفف الهلم باستخدام مجفف شعر بارد. 4 م اشطف الهلم ب.H 2 O ضع الهلم متجها لألسفل في 25 مل من الجسم المضاد األولي في حوض زجاجي طوال الليل. اشطف الهلم ب.H 2 O ضع الهلم متجها لألسفل في 25 مل من الجسم المضاد الثانوي في حوض زجاجي طوال الليل. 5 م * اختياري: لتسريع عملية التجفيف كدس الهالم ملدة 30 إلى 60 دقيقة ثم جففه حتت هواء ساخن )مثال باستخدام مجفف شعر داخلي(. ( ليلحتلحتVWF ) ليلحت 99

106 الكواشف كو ن جميع العوازل جديدة لكل مقايسة. وت صنع جميع الكواشف من املاء املقطر ويتم تعديل درجة حموضتها. عازل الهالم السائل: 0.4 م تريس % 0.1 )SDS( درجة احلموضة غ تريس قاعدة )سيغما T1503( غ )SDS( دوديسيل كبريتات الصوديوم )436696N )BDH 100 مل ماء مقطر O( )H 2 اخلط معا في قمع مخروطي سعة 100 مل: 100 مل عازل الهالم السائل 1.6 غ سيكيم )HGT( أجاروس )50050 (P( (Seakem للحصول على الهالم العادي أو 1.8 غ أجاروس للتمييز الثالثي أو غ أجاروس ملولتيمرات )HMW( ذات وزن جزيئي عال استخدم % 1.6 ملولتيمرات )HMW( و 1.8 % للتمييز الثالثي. مالحظة: ت ظهر األجاروس املنخفضة بنسبة % 1.2 مولتيمرات )HMW( فقط وتظهر األجاروس املرتفعة بنسبة % 1.8 كال من الوزن اجلزيئي املنخفض )LMW( واملولتيمرات.)HMW( يكفي هذا احلجم لكميتني من الهالم. العازل الكهربائي: درجة احلموضة 8.35 مرك ز ب 10 أضعاف غ قاعدة تريس 72.1 غ جليسني 5 غ )SDS( 500 مل ماء مقطر O( )H 2 العمل أضف 200 مل من العازل املركز 10 أضعاف إلى 1800 مل ماء مقطر درجة حموضة 8 35 عازلة العينة: 10 م م تريس 1 م م )EDTA( درجة احلموضة 8.0 محلول مخز ن مرك ز ب 10 أضعاف 1.21 غ تريس/ قاعدة تريسما )سيغما T1503( 0.07 غ )EDTA( ملح ثنائي الصوديوم 10093( )BDH اصنع ما يصل الى 100 مل باملاء املقطر. العمل خفف عازل العينة املرك ز بنسبة 10:1 في 100 مل من املاء املقطر للحصول على محلول العمل ثم أضف: 4.8 غ يوريا W( )BDH 0.2 غ )SDS( كبريتات دوديسيل الصوديوم )436696N )BDH درجة احلموضة تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

107 تريس ماء امللح املعزول امل خزن :)TBS( 50 م م تريس 150 م م كلوريد الصوديوم درجة احلموضة غ قاعدة تريس 18 غ كلوريد الصوديوم 2 لتر ماء مقطر عازل احلجب 20 غ من مسحوق احلليب منزوع الدسم بنسبة % مل من )TBS( امل خزنة عازل الغسل 500 مايكرولتر توين مل من )TBS( امل خزنة األجسام املضادة األولية األجسام املضادة متعددة النسائل ل )VWF( البشري ومن األرانب )غالف )VWF:Ag( ab مثال داكو A0082( األجسام املضادة الثانوية األجسام املضادة الفوسفاتيز القلوية املترافقة من اخلنازير لألرانب )مثال داكو D0306( طقم الفوسفاتيز القلوية املترافق )بايوراد ( رباط دعم الهالم بالهالم )تطبيقات بايوويتاكر اجلزيئي 53750( الطريقة اليوم : 1 إعداد الهالم واحلي ز الكهربائي 1. ضع األجاروس وعازل الهالم السائل في امليكروويف حتى يصبحان واضحني ثم اتركهما ليركدا. أعد تذويبهما عندما تكون مستعدا للصب اتركهما ليبردا إلى درجة 65 مئوية قبل صبهما )مع وضع رقائق األملنيوم في األعلى لتجنب التبخر(. 2. صب الهالم على شكل ساندويتش يتم إنشاؤها باستخدام لوحني زجاجيني ) ملم( مع وضع فاصل على شكل حرف )15 U ملم( في اجلزء العلوي من اللوحة على النحو املبني أدناه. 3. اقطع قطعة من الفلم املربوط بالهالم بحجم يستخدم فاصل الهالم كدليل. بلل أحد ألواح الزجاج وضع رباط الهالم أعاله وجانبه إلى الورقة )اجلانب املبلل( إلى األعلى. استخدم األسطوانة إلزالة أية فقاعات هواء. وضع الفاصل في األعلى ثم ضع لوح الزجاج الثاني أعلى ثم أمسكهما مبشبك )bulldog( حول اجلوانب واألسفل. تأكد من أن اجلهاز مستوي قبل صب الهالم. 4. بينما يبرد محلول هالم األجاروس إلى درجة مئوية قم بتدفئة معدات صب الهالم بتمريرها حتت املاء الساخن باستخدام مجفف الشعر ( ليلحتلحتVWF ) ليلحت 101

108 5. صب األجاروس في حقنة دافئة ورشه في معدات الصب باستخدام قطعة أنبوب قصيرة من إبرة الفراشة. 6. احجز كمية صغيرة من هالم األجاروس في أنبوب اختبار مللء األوعية في وقت الحق. 7. دع الهالم يهدأ في درجة حرارة الغرفة ملدة ال تقل عن 30 دقيقة ثم ملدة ساعة بدرجة 4 مئوية في صندوق رطب لساعة. احفظه في الصندوق الرطب إذا لم يكن لالستخدام الفوري ولكن أحكم إغالق احلواف املفتوحة بشريط بارافيلم ملنع اجلفاف )ميكن حفظ الهالم طوال الليل إذا لزم األمر(. 8. قم بإعداد اخلزان الكهربائي للتبريد إلى درجة 14 مئوية. وأعد لترين من العازل الكهربائي املخفف بنسبة % 10 )بعد تخفيف درجة احلموضة(. ضع لترا واحدا من العازل في كل جانب من جوانب اخلزان. 9. عندما يركد الهالم استخدم القالب لقص 11 وعاء في األعلى. قم بترطيب اللوح الكهربائي باملاء املقطر وضع الهالم في وسط لوح التبريد األبيض/ واألزرق في اخلزان مع عينات األوعية إلى اجلانب البعيد املوجب )الكاثود(. 10. قم بقياس قطعة من ورق الترشيح بطول سم ) )WHATMAN اطوها وكرر العملية مرتني. اثنها بحدة ومزقها )وهذا عادة ما يعطي خطا أكثر إتقانا من القص( بحيث يكون لديك 5-3 طبقات في املجموع لكل جانب. قم بقياس العرض مقابل حجم الهالم واقطع العرض بالضبط. رط ب ورقة الترشيح مع العازل الكهربائي ثم ضع فتيل كل ورقة ترشيح على كل من نهايات الهالم اجعلها تتداخل بحوالي 5 ملم. 11. خفف عينات من املرضى واحلوض األصفر كمجموعة مراقبة. اصنع 1/10 تخفيف في عازل عينة العمل للبالزما ذات )VWF:Ag( بحوالي 1.0 وحدة دولية/ مل ولكن استعمل 1/2 إذا كنت تتوقع نتيجة منخفضة للغاية. ال ينصح باستخدام البالزما غير املخففة. )عادة ما يتم تخفيف صفائح )VWF( إلى.).1/2 12. اغسل معدات صب الهالم جيدا مباء ساخن بعد االستخدام. 13. أضف 20 مايكرولتر من العينة املخففة ثم 1 مايكرولتر من % 1 البروموفينول األزرق إلى كل وعاء. يتم تفريغ احلوض األصفر )املراقبة العادية( في املمرات 1 و 6 و ضع غطاء اخلزان الكهربائي في مكانه وشغل مجموعة الطاقة وحتقق من توصيل السلك األحمر بنقطة االتصال احلمراء والسلك األسود إلى النقطة السوداء. اسمح لهذه العينات باخلروج من األوعية عن طريق تشغيل التيار بأقصى طاقة ملدة 30 إلى 60 دقيقة. سجل الظروف الكهربائية على ورقة التحليل. 15. أوقف التيار وامأل األوعية بهالم األجاروس االحتياطي. 102 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

109 16. ابدأ عملية الكهربة بتيار مستمر من 5 مل أمبير حلوال 20 ساعة )ما يقارب 80 فولت(. إذا كان اجلهد عاليا جدا فستحتاج مقاومة الفتائل إلى تعديل )قانون أوم( لذا أضف فتيال لطرف الكاثود حتى يصبح اجلهد مقبوال. اليوم : 2 إعداد الهالم للتصوير 17. وفي صباح اليوم التالي ستنتقل عالمة البروموفينول الزرقاء نحو اجلانب السالب )األنود( من الهالم. 18. حني يكون سمك العالمة الزرقاء حوالي 1 سم من نهاية الهالم سجل مقاييس احلي ز الكهربائي وأوقفه. أزل الهالم من املعدات. 19. جتاهل أي عازل سابق واغسل اخلزان جيدا باملاء وامسح الفواصل البرتقالية على طول االسالك املعدنية بعناية. 20. ضع الهالم متجها لألعلى في حوض بالستيكي مملوء باملاء املقطر واغسله برفق ملدة ساعة الى ساعتني في خالط مداري أوهزاز متأرجح. غي ر املاء عدة مرات أثناء مدة الغسل. 21. أزل الهالم بعناية وجفف أية مياه زائدة إلى األنسجة. 22. إما أن جتفف مسطحة باستخدام مجفف الشعر بحرارة متوسطة مع إبقاء الرؤوس الهالمية في كال النهايتني أو ت دعك ملدة ساعة الى ساعتني ما بني ورقة الترشيح واملناشف الورقية على طاولة تسوية زجاجية مع وضع عدة كتب ثقيلة فوقها يلي ذلك جتفيف مبجفف الشعر وبحرارة متوسطة كما مر سابقا. قد يستغرق التجفيف اكثر من ساعة لكل هالم. 23. عندما يجف الهالم متاما )سيظهر المعا وجافا بشكل مسطح فوق أربطة الهالم( أزل أربطة الهالم الزائدة ولكن اترك ما ال يقل عن 5 ملم حول حافة الهالم. 24. ضع الهالم مواجها األعلى في حوض بالستيكي يحتوي )TBS( + حليب منزوع الدسم بنسبة % 5 )مارفل( وضعه في احلاضنة ملا ال يقل عن 90 دقيقة )كلما كان الوقت أطول كلما كان أفضل( وبسرعة بطيئة وهزاز ستيوارت. 25. اشطف الهالم عدة مرات باملاء املقطر. 26. هيئ تخفيفا بنسبة 1 في 2000 من )غالف( أضداد )VWF( لألجسام املضادة في.)TBS( استخدم 12.5 مايكرولتر من األجسام املضادة في 25 مل من.)TBS( ضع األجسام املضاد املخففة في طبق من البيركس لألجسام املضادة األولية. 27. جفف املاء الزائد من الهالم وضعه مواجها األسفل في األجسام املضادة املخففة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بني الهالم األجسام املضادة املخففة. ( ليلحتلحتVWF ) ليلحت 103

110 28. ضع الغطاء على العلبة وضعه في احلاضنة طوال الليل على الدكة في درجة حرارة الغرفة. اليوم أزل الهالم من محلول األجسام املضادة األولي واشطفه لفترة وجيزة في عدة كميات متغيرة من املاء املقطر 30. ضع الهالم مواجها األعلى في حوض بالستيكي. اغسله على األقل بثمانية كميات متغيرة من )TBS( % 0.05 توين ) مل لكل غسلة( على مدار اليوم بينما يهتز على اخلالط املداري. 31. هيئ تخفيفا بنسبة 1 في 2000 من أضداد )VWF( املترافقة الثانوية لألجسام املضادة من اخلنازير في.)TBS( استخدم 12.5 مايكرولتر من األجسام املضادة في 25 مل من.)TBS( ضع األجسام املضاد الثانوية في طبق من البيركس لألجسام املضادة الثانوية. 32. اشطف الهالم باملاء املقطر جفف املاء الزائد من الهالم وضعه مواجها األسفل في األجسام املضادة الثانوية. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بني الهالم األجسام املضادة الثانوية. 33. ضع الغطاء على العلبة وضعه في احلاضنة طوال الليل على الدكة في درجة حرارة الغرفة. اليوم 4: تصور املولتيمرات 34. أخرج الهالم من محلول األجسام املضادة الثانوي واشطفها ملدة وجيزة في عدة كميات متغيرة من املاء املقطر. 35. ضع الهالم مواجها األعلى في حوض بالستيكي. اغسله على األقل بثمانية كميات متغيرة من )TBS( % 0.05 توين ) مل لكل غسلة( على مدار اليوم بينما يهتز على اخلالط املداري. 36. أثناء آخر غسلة )حوالي الساعة 3 مساء ( هيئ 20 مل من البالزما الركيزة العاملة من مجموعة عازل تطوير اللون الفوسفاتيزي القلوي 25 )H102(. ولكل هالم خفف 800 ميكروليتر 25 عازل )AP( في 20 مل من املاء. ثم أضف 200 مايكرولتر من احمللول أ و 200 مايكرولتر من احمللول ب إلى العازل وامزجه جيدا. 37. أخرج الهالم من آخر غسلة وجفف أي سائل زائد. 38. ضع الهالم مواجها األعلى في طبق بيركس للتطوير واسكب مزيج الركيزة املهيأ فوق كامل الهالم. 39. هزه بلطف على الهزاز حتى يكتمل التفاعل وتنكشف أربطة املولتيمر. ميكن أن يستغرق هذا مدة تصل إلى 45 دقيقة. 40. حني يكتمل التفاعل جتاهل الركيزة واغسل الهالم في كميتني متغيرتني من املاء املقطر على األقل مع الهز ملدة 30 إلى 60 دقيقة ملنع التفاعل من االستمرار. 104 تشخيص مرض الهيموفيليا واضطرابات النزف األخرى

111 41. نشف أي السائل فائض من الهالم وجففه مبجفف الشعر كما مر سابقا. 42. ميكن أن ي فحص الهالم وي خزن إلكترونيا وحتدد كميته باستخدام قياس الكثافة إذا لزم األمر. ميكن إبالغ النتائج املتحصلة كما في الشكل 2.33 أدناه وفقا لنمط املولتيمر املشاهد على الهالم. الشكل 2.33: تفسير نمط المولتيمر نمط المولتيمر جميع مولتيمرات األوزان الجزيئية الموجودة تشكيل ثلثي مبالغ فيه ل )LMW( إجمالي االستنزاف ل مولتيمرات )HMW( زيادة في أول رابط ل )LMW( ال توجد مولتيمرات مرئية التفسير نمط العادي نوعي ا نقصان في )HMWM( زيادة طفيفة في )HMWM( نقصان طفيف في )HMWM( لم يتم الكشف عن مولتيمرات الشكل 3.33: مثال على هلم مولتيمر تلحظة: أشكال )VWF( ذات الوزن الجزيئي األعلى في قمة العمود. العمود 1 لمريض لديه النوع VWD( 2B( العمود 2 لمريض لديه النوع VWD( 2A( العمود 3 هو لبلاتا طبيعية ذات مولتيمرات سليمة جميعها ( ليلحتلحتVWF ) ليلحت 105