ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΡΧΑΙΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΥΛΩΝ ΣΕ ΘΡΑΥΣΜΑ ΓΥΑΛΙΝΟΥ ΑΓΓΕΙΟΥ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΣΑΧΑΝΙΔΟΥ ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΑΝ. ΚΑΘ. Γ. ΖΑΧΑΡΙΑΔΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 213

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΑΧΑΝΙΔΟΥ ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΡΧΑΙΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΥΛΩΝ ΣΕ ΘΡΑΥΣΜΑ ΓΥΑΛΙΝΟΥ ΑΓΓΕΙΟΥ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσικής Χημείας του Τομέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπλ. Καθηγητής ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΖΑΧΑΡΙΑΔΗΣ- Επιβλέπων Καθηγητής Αναπλ. Καθηγητής ΑΡΙΣΤΕΙΔΗΣ ΑΝΘΕΜΙΔΗΣ- Μέλος εξεταστικής επιτροπής Αναπλ. Καθηγήτρια ΣΤΕΛΛΑ ΓΗΡΟΥΣΗ- Μέλος εξεταστικής επιτροπής 2

3 Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με τη Γ.Σ.Ε.Σ. 256/ , για τη κρίση της Διπλωματικής Εργασίας της Σαχανίδου Ευφροσύνης, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 1/9/213, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο ΑΡΧΑΙΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΥΛΩΝ ΣΕ ΘΡΑΥΣΜΑ ΓΥΑΛΙΝΟΥ ΑΓΓΕΙΟΥ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ και την ενέκρινε με βαθμό 1 (δέκ. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 8 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο : Οργανικά κατάλοιπα στην αρχαιολογία Ανάλυση οργανικών καταλοίπων στην Αρχαιομετρία Επιμολυντές αρχαιολογικών δειγμάτων Εφαρμογή της αέριας χρωματογραφίας σε αρχαιολογικά δείγματα Μοριακοί βιοδείκτες και η χρήση τους στην ταυτοποίηση των οργανικών καταλοίπων σε αρχαιολογικά δείγματα Βιολογικοί δείκτες λιπιδίων στην αρχαιολογία 13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Λιπίδια Συστατικά των λιπών και ελαίων Λιπαρά οξέα Άλλα συστατικά Φωσφολιπίδια Κηρώδη συστατικά Στερόλες-αλκοόλες Υδρογονάνθρακες Λιπίδια σε αρχαιολογικά δείγματα Κερί μέλισσας και μέλι σε αρχαιολογικά ευρήματα Γενικές ιδιότητες και χρήσεις του κεριού και του μελιού σε αρχαιολογικά ευρήματα Χαρακτηρισμός και ταυτοποίηση του κεριού σε αρχαιολογικά ευρήματα

5 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΥΖΕΥΞΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ (GC-MS) 3.1 Εισαγωγή στην αέρια χρωματογραφία (GC) Εισαγωγή δείγματος για ανάλυση (injection) Στήλες αέριας χρωματογραφίας Πληρωμένες στήλες Πλεονεκτήματα τριχοειδών στηλών Στατική Φάση Συστήματα Ανίχνευσης Ανιχνευτής Ιονισμού Φλόγας (Flame Ionization Detector, F.I.D.) Ανιχνευτής Θερμικής Αγωγιμότητας (Thermal Conductivity Detector T.C.D.) Ανιχνευτής Χημειοφωταύγειας Θείου Ανιχνευτής Δέσμευσης Ηλεκτρονίων (Electron Capture Detector E.C.D.) Θερμοϊονικοί Ανιχνευτής (TID) Πλεονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας Μειονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας Εισαγωγή στην αέρια χρωματογραφία σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας (GC-MS) Ιστορική αναδρομή της συνδυασμένης τεχνικής GC-MS Ανάλυση μιγμάτων με τεχνικές σε συνδυασμό με φασματόμετρα μάζας Εισαγωγή δειγμάτων Πηγές ιονισμού Ηλεκτρονικός Ιονισμός (Electron Ionization ή Electron Impact, EI) Χημικός Ιονισμός (Chemical Ionization, CI) Τύποι αναλυτών μάζας 37 5

6 Τετραπολικοί αναλυτές (Quadrupole) Αναλυτές Μαγνητικού Τομέα (Magnetic sector) Χρόνου Πτήσης αναλυτές (Time of flight, TOF) Ιοντοπαγίδες (Ion traps) Πλεονεκτήματα και Μειονεκτήματα της GC-MS 4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΜΙΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ (Solid Phase Microextraction, SPME) Μικροεκχύλιση Στερεής Φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) Επικάλυψη ίνας Αρχές της μικροεκχύλισης στερεής φάσης με εμβάπτιση (SPME) και από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME 4.4 Τα στάδια της μικροεκχύλισης στερεής φάσης με εμβάπτιση (SPME) και από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME) 4.5 Παράμετροι που επηρεάζουν την Μικροεκχύλιση Στερεής Φάσης (SPME) 4.6 Πλεονεκτήματα Μικροεκχύλισης Στερεής Φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ 51 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΟΡΓΑΝΑ-ΔΕΙΓΜΑΤΑ 6.1 Όργανα Δείγματα 57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ ΑΠΌ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΗ ΑΕΡΙΑ ΦΑΣΗ (HS- SPME) Εισαγωγή Βελτιστοποίηση του χρόνου εκχύλισης HS-SPME Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας εκχύλισης HS-SPME 63 6

7 7.4 Βελτιστοποίηση της μάζας του δείγματος στην εκχύλιση (HS-SPME) Συμπεράσματα επί της βελτιστοποίησης της HS-SPME 69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο ΑΝΑΛΥΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ GC-MS Ανάλυση χρωματογραφημάτων GC-MS από αρχαιολογικά υποδείγματα και ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε σύγχρονα δείγματα Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα μελιού Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα κεριού Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα γάλακτος Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα βουτύρου Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα λαδιού 122 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο 13 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 133 ABSTRACT 135 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 136 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 141 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Προχωρημένη Χημική Ανάλυση». Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστης μεθοδολογίας για την αρχαιομετρική ανάλυση υπόλευκης ουσίας σε θραύσματα ενός γυάλινου αγγείου το οποίο βρέθηκε σε αρχαιολογική ανασκαφή που πραγματοποιήθηκε στην περιοχή του Έβρου, ώστε να δοθεί απάντηση στον αρχαιολογικό προβληματισμό για το είδος και την σκοπιμότητα της ουσίας αυτής. Επίσης, η μελέτη και η ταυτοποίηση του αρχαιολογικού υλικού, χρησιμοποιώντας όσο το δυνατόν λιγότερο καταστρεπτική τεχνική. Για το λόγο αυτό, ήταν απαραίτητη η ανάπτυξη μεθοδολογίας που βασίζεται στην αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με τη φασματομετρία μάζας (GC-MS), η οποία είναι και η μέθοδος επιλογής βάση της βιβλιογραφίας. Για τη ταυτοποίηση των υπολειμμάτων οργανικών υλών χρησιμοποιήθηκαν σύγχρονα δείγματα, η μέθοδος αυτή είναι η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη με βάση τη βιβλιογραφία. Ως τεχνική προκατεργασίας χρησιμοποιήθηκε και βελτιστοποιήθηκε η μικροεκχύλιση στερεής φάσης από τον υπερκείμενο χώρο (HS-SPME). Θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα της μεταπτυχιακής μου εργασίας, Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γ. Ζαχαριάδη, για την ανάθεση του ενδιαφέροντος αυτού θέματος αλλά και για την συνεχή βοήθειά του και καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια της ερευνητικής μου προσπάθειας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Α. Ανθεμίδη και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Σ. Γηρούση, μέλη της εξεταστικής επιτροπής, για τις χρήσιμες συμβουλές τους και την υποστήριξή τους. Τον κ. Δ. Καρολίδη και την κα. Δ. Τερζοπούλου, μέλη του Αρχαιολογικού Μουσείο Θεσσαλονίκης για την συνεργασία τους. Τέλος, ευχαριστώ ιδιαίτερα την οικογένεια μου για την αμέριστη συμπαράσταση και στήριξή τους σε όλη τη διάρκεια της προσπάθειάς μου. Σαχανίδου Ευφροσύνη Θεσσαλονίκη, Σεπτέμβριος 213 8

9 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 o 1.1 Οργανικά κατάλοιπα στην αρχαιολογία Ο όρος οργανικά κατάλοιπα χρησιμοποιείται στην αρχαιολογία για να περιγράψει μια μεγάλη ποικιλία άμορφων, μικροσκοπικά ορατών ή αόρατων υλών τα οποία είτε είναι ουσίες που απαντούν στη φύση είτε είναι πολύπλοκα μίγματα συστατικών βιολογικής προέλευσης. Άμορφα οργανικά υπολείμματα (τροφίμων) σε διάφορα ευρήματα έχουν παρατηρηθεί και μελετηθεί χημικά από τους αρχαιολόγους από το τέλος του περασμένου αιώνα. Οι αρχικές μελέτες ωστόσο ήταν περιορισμένες σε ειδικές περιπτώσεις, όπως το κρασί, τα υπολείμματα μπίρας, το λάδι και τις αλοιφές. Καμία συστηματική προσέγγιση δεν είχε αναφερθεί ποτέ μέχρι τις αρχές του 197 όταν λεπτομερή αρχαιολογικά ερωτήματα θα μπορούσαν να αντιμετωπιστούν λόγω της βελτίωσης των αναλυτικών οργάνων. Η εφαρμογή της αναλυτικής χημείας στη μελέτη οργανικών υπολειμμάτων επεκτάθηκε και επικεντρώθηκε κυρίως στις λιπαρές ουσίες, οι οποίες είναι διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες [1]. Τα οργανικά υπολείμματα εμφανίζονται σε τρεις κύριες μορφές, οι οποίες είναι: υπολείμματα τα οποία διατηρούνται in situ. Περιπτώσεις όπου τα υπολείμματα διατηρούνται in situ είναι σπάνιες, έτσι ώστε να υπάρχουν παραδείγματα για χημική έρευνα, β) ορατά υπολείμματα στην εσωτερική και/ή εξωτερική επιφάνεια των αγγείων γ) υπολείμματα τα οποία έχουν προσροφηθεί και διατηρούνται στο εσωτερικό τοίχωμα των αγγείων και μικροσκοπικά αόρατα. Αυτή η τελευταία κατηγορία των υπολειμμάτων είναι μακράν η πιο κοινή και ίσως ο πιο διαδεδομένος τύπος των καταλοίπων. Οι χημικές έρευνες σε αρχαιολογικά ευρήματα έχουν δείξει ένα ευρύ φάσμα ενώσεων, οι οποίες έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση των καταλοίπων από διάφορες ηπείρους. Στα βασικά προϊόντα που αναγνωρίζονται, συμπεριλαμβάνονται: φυτικά έλαια, ζωικά λίπη, ρητίνες, φλοιοί από ξύλο σημύδας, πίσσα, κηροί, κηρήθρα, φοινικέλαιο, κακάο και άλλα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης και η ανίχνευση υπολειμμάτων κρασιού και άλλων αλκοολούχων ποτών [2]. 9

10 1.2 Ανάλυση οργανικών καταλοίπων στην Αρχαιομετρία Από τα αρχαία χρόνια η ανθρωπότητα είχε την ανάγκη για την μεταφορά τροφίμων και ποτών από τα κέντρα παραγωγής στους τόπους κατανάλωσης. Για το σκοπό αυτό, τα αγγεία χρησιμοποιούνταν συχνά για το μαγείρεμα αλλά και για τη διατήρηση ουσιών, όπως φάρμακα, αρώματα, χρωστικές κ. ά [3]. Έτσι στον τομέα της αρχαιολογίας η γνώση της χημικής σύνθεσης των άμορφων οργανικών υπολειμμάτων μας βοηθά ώστε να διευκρινιστούν διάφορες πτυχές της καθημερινής ζωής που σχετίζονται με θρησκευτικά έθιμα και τελετουργίες, τη διατροφή και ιατρικές πρακτικές [4, 5]. Η ανάλυση επίσης των οργανικών υπολειμμάτων μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο παρασκευής των τροφίμων, την αποθήκευση και τον τρόπο σερβιρίσματος στα διάφορα σκεύη. Η χημική ανάλυση των οργανικών υπολειμμάτων, τόσο των επιφανειακών όσο και αυτών που απορροφώνται από τα κεραμικά σκεύη, έλαβε χώρα την δεκαετία του 192, αλλά έχει επεκταθεί σημαντικά, λόγω της βελτίωσης των αναλυτικών οργάνων [6]. 1.3 Επιμολυντές αρχαιολογικών δειγμάτων Η πολυπλοκότητα της μελέτης των οργανικών υπολειμμάτων, οφείλεται σε χημικές και φυσικές ιδιότητες αλλά και στις αλλαγές που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της προκατεργασίας και της διαδικασίας διάσπασης [3]. Τα υπολείμματα προσβάλλονται εύκολα από μύκητες, βακτήρια και έντομα, καθώς και από χημικές διεργασίες του περιβάλλοντος ταφής [7]. Οι αλλαγές που μπορούν να υποστούν τα αρχαιολογικά ευρήματα με την πάροδο του χρόνου μπορεί να προέρχονται από διαδικασίες που έγιναν στο παρελθόν, όπως θέρμανση, μαγείρεμα, ανάμειξη, απανθράκωση, αποθήκευση ή ζύμωση, ή διαδικασίες μετά την χρήση όπως βιο-αποικοδόμηση, εμποτισμό από το χώμα, έκπλυση των αρχικών ενώσεων και τέλος μπορεί να προέρχονται από τον χειρισμό από τους αρχαιολόγους, όπως πλύσιμο, τρίψιμο, συσκευασία με χαρτί ή πλαστικό, επιμόλυνση με λιπαρά δάχτυλα, κόλλες, μελάνι ή σκόνη. Η ερμηνεία των χημικών αποτελεσμάτων για αυτό παραμένει δύσκολη [1, 8]. Υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την μελέτη των άμορφων οργανικών υλικών που έχουν βρεθεί σε αρχαιολογικούς χώρους. Η χημική ανάλυση αυτών των υλικών μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τα φυσικά προϊόντα, τα οποία χρησιμοποιούσαν οι άνθρωποι παλαιότερα. Οι αρχικές έρευνες περιορίζονταν αρκετά 1

11 από την έλλειψη κατάλληλων τεχνικών, αλλά και λόγω της πολυπλοκότητας και της φθοράς που επέρχεται με το πέρασμα του χρόνου. Η εμφάνιση της σύγχρονης οργανολογίας των χημικών και βιοχημικών τεχνικών έδωσε τα απαραίτητα εφόδια για την αποτελεσματική ανάκτηση, ανίχνευση και ταυτοποίηση των βιομορίων και των προϊόντων διάσπασης των αρχαιολογικών ευρημάτων [9]. 1.4 Εφαρμογή της αέριας χρωματογραφίας σε αρχαιολογικά δείγματα Συχνά στα αρχαιολογικά ευρήματα εμφανίζονται, φυσικές ρητίνες, φυσικά κεριά, λίπη φυτικής και ζωικής προέλευσης. Η ανάλυση αυτών των αρχαιολογικών υλικών εμφανίζει μια σειρά από προκλήσεις, όπως η μικρή ποσότητα του δείγματος που είναι διαθέσιμο, η παρουσία και άλλων ενώσεων στο προς ανάλυση δείγμα, η χημική αλλοίωση λόγω επεξεργασίας, αποσύνθεσης ή μόλυνσης [1, 8, 1, 11, 12]. Επιπλέον κάθε δείγμα είναι μοναδικό. Η παρουσία όλων αυτών αποτελεί αρνητικό παράγοντα στην ερμηνεία των αναλυτικών αποτελεσμάτων [1]. Τεχνικές όπως η φασματομετρία πυρηνικού μαγνητισμού, η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε συνδυασμό με την υπέρυθρη φασματοσκοπία και την χρωματογραφία υψηλής πίεσης είναι αρκετά χρήσιμες καθώς παρέχουν δακτυλικά αποτυπώματα των οργανικών υπολειμμάτων [9, 12]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις χρωματογραφικές τεχνικές έδωσαν την δυνατότητα να αναλυθούν ίχνη οργανικών καταλοίπων. Είναι δυνατόν να αναλυθούν μόρια σε ανόργανα υποστρώματα, όπως σε κεραμικά ή στο χώμα, ή σε μορφολογικά οργανικά υπολείμματα όπως λιπίδια σε σπόρους ή οστά. Αδιάλυτα ή πολυμερικά κλάσματα των υπολειμμάτων που δεν είναι αρκετά πτητικά μπορούν να διαχωριστούν με πυρόλυση επιτρέποντας έτσι τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση των θραυσμάτων [12]. Η αέρια χρωματογραφία παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάλυση των λιπιδίων που υπάρχουν στα βιολογικά υλικά. Η ανάπτυξη των σύγχρονων τριχοειδών στηλών έχει επεκταθεί σημαντικά, προσφέροντας την απαραίτητη διαχωριστική ικανότητα για τον διαχωρισμό των επιμέρους ενώσεων που υπάρχουν στα σύνθετα μίγματα των λιπιδίων που συχνά ανακτώνται από τα αρχαιολογικά υλικά [9, 13]. Η αέρια χρωματογραφία είναι επομένως μια αποτελεσματική και αποδοτική μέθοδος για την εξέταση των λιπαρών οξέων με την μορφή των παραγώγων μεθυλεστέρα σε αρχαιολογικά κατάλοιπα [13]. Όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την φασματομετρία μάζας (GC-MS) προσφέρει διαχωρισμό και on-line καταγραφή των φασμάτων μάζας. Η χρήση διαφορετικών τεχνικών ιονισμού, όπως ο 11

12 ιονισμός με ηλεκτρόνια (ΕΙ), ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό και ο χημικός ιοντισμός με ατμοσφαιρική πίεση (APCI), επιτρέπουν τον ιονισμό ενός μεγάλου φάσματος αναλυτών οι οποίοι μπορεί να είναι πτητικοί/μη πτητικοί, πολικοί/μη πολικοί και χαμηλού ή υψηλού μοριακού βάρους, τόσο σε καθαρή μορφή αλλά και σε πολύπλοκα μίγματα [14]. Οι υψηλές ευαισθησίες που επιτυγχάνονται από την GC-MS αποτελούν πλεονέκτημα στην ανάλυση των αρχαιολογικών ευρημάτων, ιδίως όταν η ποσότητα του δείγματος είναι περιορισμένη [9, 15]. Το δείγμα εγχύεται σε μία θερμαινόμενη στήλη και τα μόρια διαχωρίζονται με τις τεχνικές διαχωρισμού, μεταξύ της στατικής (στήλη) και της κινητής φάσης (φέρον αέριο). Έπειτα η ταυτοποίηση γίνεται με σύγκριση των χρόνων κατακράτησης σε ένα ή περισσότερα εξωτερικά πρότυπα [15]. Επομένως η αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με την φασματομετρία μάζας είναι η πιο χρήσιμη τεχνική για την ανάλυση λιπιδίων, δεδομένου ότι επιτρέπει την δομική αναγνώριση των επιμέρους ενώσεων, παρέχοντας την δυνατότητα χαρακτηρισμού των οργανικών υπολειμμάτων [9, 12]. Όλα αυτά είναι σημαντικά για να αποκτήσουμε πληροφορίες σχετικά με την χρήση των σκευών και, κατά συνέπεια για την χρήση των δοχείων και τη διατροφή, την κοινωνική ζωή και τα έθιμα των αρχαίων [14]. 1.5 Μοριακοί βιοδείκτες και η χρήση τους στην ταυτοποίηση των οργανικών καταλοίπων σε αρχαιολογικά δείγματα Στην ανάλυση αρχαιολογικών δειγμάτων θα πρέπει οι αναλυτικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται να είναι σε θέση να επιτύχουν ανάλυση σε μοριακό επίπεδο. Δεδομένου ότι όλα τα αρχαιολογικά υλικά που συναντώνται σε αρχαιολογικούς χώρους είναι βιολογικής προέλευσης, θα είναι μίγματα. Η πολυπλοκότητα αυτή αυξάνεται μέσω ανθρώπινων δραστηριοτήτων, αλλά και λόγω της αλλοίωσης, που οφείλεται στην φθορά κατά τη διάρκεια της ταφής [2]. Τα βιομόρια που περιλαμβάνουν προϊόντα φυτικής και ζωικής προέλευσης είναι ευπαθή σε οποιοδήποτε μηχανισμό αποσύνθεσης. Λίγες αναφορές υπάρχουν σχετικά με τους μηχανισμούς αποσύνθεσης ή διατήρησης των βιομορίων σε περιβάλλον αρχαιολογικής σημασίας. Η ευαισθησία των κυριότερων κατηγοριών των βιομορίων στην τροποποίηση της δομής και αποσύνθεσης ακολουθεί την σειρά: 12

13 λιγνίνη και άλλα φυτικά πολυμερή < λιπίδια (λιποπολυσακχαρίτες, γλυκολιπίδια και ρητίνες) < υδατάνθρακες< πρωτεΐνες< νουκλεοτίδια (RNA και DNA). Αυτή η σειρά σχετίζεται με την ευαισθησία στη χημική και μικροβιολογική προσβολή των διάφορων τύπων δεσμού που διαθέτουν τα μόρια. Ο βαθμός της συντήρησης (ή η έκταση της αποσύνθεσης) μιας συγκεκριμένης κατηγορίας ενώσεων, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από της φυσικοχημικές συνθήκες του περιβάλλοντος ταφής, π.χ. το ph, το δυναμικό οξειδοαναγωγής, την υγρασία, την θερμοκρασία και την βιομάζα. Όπως φαίνεται και από πιο πάνω, τα λιπίδια μπορούν να διατηρηθούν καλά σε σχέση με τους υδατάνθρακες, τις πρωτεΐνες και τα νουκλεοτίδια. Η ανθεκτικότητα των λιπιδίων στην αποσύνθεση σε συνδυασμό με την σταθερότητα τους στην αρχική θέση εναπόθεσης, λόγω του υδρόφοβου χαρακτήρα τους, τα καθιστά κατάλληλα για τη χρήση ως βιοδείκτες σε αρχαιολογικές έρευνες. Η παγίδευση των λιπιδίων σε ορισμένα αρχαιολογικά υλικά θα οδηγήσει σε ενίσχυση του δυναμικού διατήρησης. Σε ιδιαίτερα πυκνά υλικά όπως το γυαλί η μικροβιακή δραστηριότητα είναι περιορισμένη λόγω του μικρού πορώδους και η διαπερατότητα σε απαραίτητα θρεπτικά συστατικά [9]. 1.6 Βιολογικοί δείκτες λιπιδίων στην αρχαιολογία Οι μελέτες που εφαρμόζονται σήμερα, χρησιμοποιούν έναν βιολογικό δείκτη ή βιοδείκτη στην προσπάθεια τους να συσχετίσουν τα μοριακά συστατικά, ιδιαίτερα των λιπιδίων, που βρίσκονται εντός των οργανικών υπολειμμάτων με βιομόρια που υπάρχουν σε σύγχρονες μονάδες φυτικών και ζωικών ιστών. Αν και η σύνθεση των φυτικών και ζωικών λιπιδίων στα σύγχρονα υλικά είναι καθορισμένη, η επίδραση της αποσύνθεσης, π.χ. χημική, μικροβιολογική ή φυσική των λιπιδίων αλλά και των κατανομών τους, από την χρήση του δοχείου και από την ταφή είναι ελάχιστα κατανοητή [12]. Αυτό συμβαίνει επειδή η αποσύνθεση μεταβάλει το προφίλ των λιπαρών οξέων με έναν τρόπο που αλλάζει τις σχετικές ποσότητες [15]. Η εφαρμογή των αρχαιολογικών βιοδεικτών βασίζεται στην αντιστοιχία των δομών ή των κατανομών των «χημικών δακτυλικών αποτυπωμάτων» με γνωστές ενώσεις και μίγματα που υπάρχουν σε οργανισμούς που διασώζονται και είναι πιθανό να έχουν αξιοποιηθεί στο παρελθόν. Μερικές φορές η δομή ενός μεμονωμένου συστατικού 13

14 είναι επαρκής για να καθορίσει την προέλευση ενός συστατικού σε ένα οργανικό υπόλειμμα [2]. Η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την ταυτοποίηση της προέλευσης των λιπιδίων σε αρχαιολογικά δείγματα, βασίζεται στην αντιστοιχία των δομών των επιμέρους ενώσεων ή οι σχετικές αναλογίες των συστατικών ενός μίγματος με εκείνες που βρίσκονται σε σύγχρονα ζωικά και φυτικά φυσικά προϊόντα [9]. 14

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 2.1 Λιπίδια Ως λιπίδια χαρακτηρίζονται οι ουσίες οι οποίες είναι αδιάλυτες στο νερό, διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες, όπως χλωροφόρμιο, βενζόλιο, αιθέρα, περιέχουν μακριές αλυσίδες υδρογονανθράκων στα μόρια τους και υπάρχουν ή παράγονται από ζωντανούς οργανισμούς [16]. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των λιπιδίων είναι ότι εμφανίζουν μια μεγάλη ποικιλία δομών οι οποίες οφείλονται στην ικανότητα του δεσμού άνθρακα-άνθρακα σε μια μεγάλη ποικιλία ρυθμίσεων. Τα λιπίδια αποτελούνται κυρίως από άνθρακα, υδρογόνο και οξυγόνο και σε μικρότερο βαθμό από άζωτο, φώσφορο και θείο. Οι δομές τους αποτελούνται από γραμμικά, διακλαδισμένα και κυκλικά (μόνο- ή πολυκυκλικά) άτομα άνθρακα τα οποία είναι συνήθως πλήρως υποκατεστημένα από άτομα υδρογόνου. Όπως φαίνεται από το σχήμα 2.1 η δομή του παλμιτικού οξέος καλύπτεται από άτομα υδρογόνου. Χαρακτηριστικές ομάδες που περιέχουν οξυγόνο (π.χ. ομάδες εστέρων σε τριγλυκερίδια και υδρόξυλ ομάδες σε στερόλες) και διπλούς δεσμούς (π.χ. σε ακόρεστα λιπαρά οξέα και στερόλες) φαίνονται στο σχήμα 2.1 (3-5), εμφανίζονται στα λιπίδια. Μεγάλος αριθμός από πολυκυκλικές διτερπενοειδής (6) και τριτερπενοειδής (7) ενώσεις, εμφανίζονται σε φυσικές ρητίνες που παράγονται από ανώτερα φυτά [9]. Σχήμα 2.1: Δομές λιπαρών οξέων [9]. 15

16 2.2 Συστατικά των λιπών και ελαίων Τα λίπη και τα έλαια ανήκουν σε μια ομάδα βιολογικών ουσιών που ονομάζονται λιπίδια. Τα λιπίδια είναι βιολογικές χημικές ουσίες, που δε διαλύονται στο νερό. Τα λίπη διαφέρουν από τα έλαια καθώς είναι στερεά σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ τα έλαια είναι υγρά. Τα λίπη και τα έλαια αποτελούνται από γλυκερίδια ή ακυλογλυκερόλες, δηλαδή εστέρες της τρισθενούς αλκοόλης γλυκερόλης με λιπαρά οξέα (Σχήμα 2.2) [13, 17]. Στη φύση απαντούν σε μεγαλύτερη αναλογία τα τριγλυκερίδια, δηλαδή ενώσεις στις οποίες και τα τρία υδροξύλια της αλκοόλης είναι εστεροποιημένα. τριγλυκερίδιο γλυκερόλη λιπαρό οξύ Σχήμα 2.2: Σχηματισμός τριγλυκεριδίου [17]. Οι ιδιότητες των λιπών και των ελαίων εξαρτώνται από τη σύσταση σε λιπαρά οξέα και την κατανομή των οξέων αυτών στα μόρια των ακυλογλυκερολών. Επίσης από τη φύση και την συγκέντρωση των άλλων λιπιδίων που συνοδεύουν πάντοτε τους εστέρες αυτούς στα φυσικά λίπη [18]. 2.3 Λιπαρά οξέα Λιπαρά οξέα είναι τα αλειφατικά μονοκαρβονιλικά οξέα που βρίσκονται στην φύση. Τα περισσότερα από αυτά, έχουν άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα. Υπάρχουν τόσο κορεσμένα λιπαρά οξέα όσο και ακόρεστα με έναν ή περισσότερους διπλούς δεσμούς. Από τα κορεσμένα λιπαρά οξέα, τα πιο διαδεδομένα στη φύση είναι το παλμιτικό οξύ και το στεατικό οξύ. Από τα ακόρεστα δε, τα οξέα παλμιτελαϊκό, ελαϊκό, λινελαϊκό και λινολενικό [18, 19]. Στη φύση τα λιπαρά οξέα σπάνια βρίσκονται ελεύθερα. Συνήθως είναι ενωμένα με άλλα μόρια, είτε με εστερικούς είτε με αμιδικούς δεσμούς [18]. 16

17 Τα κύρια λιπαρά οξέα βρίσκονται σε φυτικά και ζωικά λιπίδια και αποτελούνται από ευθείες αλυσίδες καρβοξυλικών οξέων (σε συντομογραφία Cx:y, όπου x είναι ο αριθμός των ατόμων άνθρακα και y ο αριθμός των διπλών δεσμών C-C στην αλυσίδα. Τα πιο διαδεδομένα κορεσμένα λιπαρά οξέα (Πίνακας 2.1) είναι το λαουρικό (C 12: ), μυριστικό (C 14: ), παλμιτικό (C 16: ), στεατικό οξύ (C 18: ) και τα ακόρεστα λιπαρά οξέα είναι παλμιτελαϊκό (C 16:1 ), ελαϊκό (C 18:1 ), λινολεϊκό (C 18:2 ) και λινονελικό (C 18:3 ). Κατά τη διάρκεια της υδρολυτικής διάσπασης τα λιπαρά οξέα απελευθερώνονται από τα τριγλυκερίδια. Οι μικρές και μεσαίες αλυσίδες των λιπαρών οξέων (π.χ. C 4: έως C 14: ) είναι πιο υδατοδιαλυτές και πτητικές σε σχέση με τα λιπαρά οξέα μακριάς αλυσίδας. Έτσι η διάσπαση των λιπαρών ουσιών προσδιορίζεται από την υψηλή συγκέντρωση του παλμιτικού και στεατικού οξέος. Σε σύγκριση με σύγχρονες λιπαρές ουσίες αναφοράς μπορούν να αναγνωριστούν ζωικά λίπη, γάλα, φυτικά έλαια, κηροί, φύλλα φυτών και κερί μέλισσας [2]. Πίνακας 2.1: Λιπαρά οξέα που απαντούν στα λίπη και στα έλαια [16,18,19]. Συμβολισμός Χημική ονομασία Κοινή ονομασία Κορεσμένα οξέα C 4: n- Bουτανοϊκό Βουτυρικό C 6: n-εξανοϊκό Καπροϊκό C 8: n-οκτανοϊκό Καπρυλικό C 1: n-δεκανοϊκό Καπρικό C 12: n-δωδεκανοϊκό Λαουρικό C 14: n-δεκατετρανοϊκό Μυριστικό C 16: n-δεκαεξανοϊκό Παλμιτικό C 18: n-δεκαοκτανοϊκό Στεαρικό C 2: n-εικοσανοϊκό Αραχιδικό C 22: n-εικοσιδυανοϊκό Βεχενικό C 24: n-εικοσιτετρανοϊκό Λιγνοκηρικό C 26: n-εικοσιεξανοϊκό Κηρωτικό 17

18 Ακόρεστα οξέα C 16:1 9-Δεκαεξενοϊκό Παλμιτελαϊκό C 18:1 9-Δεκαοκτενοϊκό Ελαϊκό C 18: Δεκαοκταδιενοϊκό Λινελαϊκό C 18:3 9,12,15-Δεκαοκτατριενοϊκό Λινολενικό C 18:3 cis, trans, trans 9,11,13-Δεκαοκτατριενοϊκό Ελαιοστεατικό C 18:1-OH 12-υδροξυ, 9-Δεκαοκτενοϊκό Κικινελαϊκό C 2:4 5,8,11,14-Εικοσιτετραενοϊκό Αραχιδονικό C 22:1 13-Εικοσιδυενοϊκό Ερουκικό 2.4 Άλλα συστατικά Εκτός από τις τριακυλογλυκερόλες, τα λίπη και τα έλαια περιέχουν και άλλα λιπίδια σε μικρότερη αναλογία. Τα πιο σημαντικά λιπίδια είναι: μονο- και διακυλογλυεκρόλες, β) ελεύθερα λιπαρά οξέα, γ) φωσφατίδια, δ) κηρώδη συστατικά, ε) άκυκλες και τριτερπενοειδής αλκοόλες και ζ) υδρογονάνθρακες [18]. 2.5 Φωσφολιπίδια Όπως οι κηροί, τα λίπη και τα έλαια είναι εστέρες των καρβοξυλικών οξέων, έτσι και τα φωσφολιπίδια είναι εστέρες του φωσφορικού οξέος. Βρίσκονται στους ζωικούς και φυτικούς ιστούς και αποτελούν το κύριο συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών. Υπάρχουν δύο κύρια είδη φωσφολιπιδίων: τα φωσφογλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια. Τα φωσφογλυκερίδια σχετίζονται με τα λίπη και τα έλαια, καθώς περιέχουν ένα μόριο γλυκερόλης εστεροποιημένο με δύο μόρια λιπαρών οξέων και με ένα μόριο φωσφορικού οξέος. Παρόλο που τα λιπαρά οξέα μπορεί να είναι οποιαδήποτε από τα C 12 -C 2 που συνήθως απαντούν στα λίπη, η άκυλο ομάδα στον C 1 είναι σχεδόν πάντοτε κορεσμένη, ενώ η άκυλο ομάδα του C 2 είναι ακόρεστη. Επίσης, η φωσφορική ομάδα στον C 3 είναι ενωμένη με εστερικό δεσμό με μια άμινο αλκοόλη όπως η χολίνη ή η αιθανολαμίνη [21]. 18

19 Σχήμα 2.3: Ο γενικός τύπος ενός φωσφογλυκεριδίου [16]. 2.6 Κηρώδη συστατικά Οι κηροί είναι στερόλες λιπαρών οξέων με αλκοόλες μεγάλου μοριακού βάρους. Τέτοια συστατικά βρίσκονται στα ιχθυέλαια και ορισμένα φυτικά έλαια όπως το πυρηνέλαιο, το αραβοσιτέλαιο, το σογέλαιο και το ρυζέλαιο [16]. 2.7 Στερόλες Αλκοόλες Στα λίπη και στα έλαια απαντούν διάφορες αλκοόλες, όπως οι στερόλες. Οι στερόλες σε πολλά λίπη και έλαια αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των ασαπωνοποίητων συστατικών τους. Βρίσκονται στη φύση είτε ελεύθερες είτε ενωμένες ως εστέρες ή γλυκοζίτες [18]. Στις λιπαρές ύλες βρίσκονται στερόλες με συνήθως άτομα άνθρακα και διακρίνονται σε ζωοστερόλες και φυτοστερόλες. Όλες αυτές οι στερόλες έχουν υδροξύλιο στον C-3 σε β-προσανατολισμό ως προς το μεθύλιο στον C-1 [22]. Σχήμα 2.4: Χημική δομή ( χοληστερόλης και (β) σιτοστερόλης [23]. 19

20 Στενά συγγενείς από χημική άποψη προς τις στερόλες είναι οι 4,4-διμεθυλοστερόλες και οι αλκοόλες α- και β-αμυρίνη [18]. β-αμυρίνη Σχήμα 2.5: Χημική δομή β-αμυρίνης [23]. Όλες αυτές οι ενώσεις βρίσκονται στο ασαπωνοποίητο τμήμα των φυσικών λιπών και ελαίων με τη μορφή πολύπλοκων μιγμάτων και έτσι ο διαχωρισμός των συστατικών τους είναι δύσκολο να πραγματοποιηθεί. 2.8 Υδρογονάνθρακες Στα λίπη και στα έλαια βρίσκονται διάφοροι υδρογονάνθρακες, όπως τα καροτένια και το σκουαλένιο. Ο υδρογονάνθρακας αυτός αποτελεί ενδιάμεσο στη βιοσύνθεση των στερολών στα ζώα και στα φυτά, για αυτό βρίσκεται στην επιφάνεια του δέρματος. των λιπιδίων [24]. Πλούσια σε σκουαλένιο είναι τα ηπατέλαια. Σχήμα 2.6: Χημική δομή σκουαλένιου [18]. 2.9 Λιπίδια σε αρχαιολογικά ευρήματα Τα λιπίδια είναι η πιο συχνά εφαρμοζόμενη κατηγορία μεσαίου μεγέθους μορίων που παράγονται από ζωντανούς οργανισμούς και μπορούν να ανακτηθούν από 2

21 αρχαιολογικά ευρήματα. Ως λιπίδια ορίζονται τα συστατικά εκείνων των βιολογικών υλικών που είναι περισσότερο διαλυτά σε οργανικούς διαλύτες παρά σε υδατικά μέσα [9]. Η μη διαλυτότητα τους στο νερό και η σχετική τους αφθονία σε σχέση με άλλες κατηγορίες λιπιδίων, όπως οι στερόλες και οι κηροί, καθιστά τα λιπαρά οξέα κατάλληλα στην αρχαιολογική ανάλυση υπολειμμάτων [13]. Τα λιπίδια επίσης αποτελούν σημαντικούς βιοδείκτες για την αρχαιολογία, καθώς έχουν μεγάλη δυνατότητα διατήρησης σε σχέση με άλλες κατηγορίες βιομορίων. Επιπλέον πολλά οργανικά υλικά έχουν χαρακτηριστικό προφίλ οργανικών οξέων ή διαθέτουν άλλα διαγνωστικά λιπιδικά συστατικά [15]. 2.1 Κερί μέλισσας και μέλι σε αρχαιολογικά ευρήματα Γενικές ιδιότητες και χρήσεις του κεριού και του μελιού σε αρχαιολογικά ευρήματα Ο κηρός μελισσών και το μέλι παράγονται φυσικά από τις μέλισσες, από το νέκταρ των λουλουδιών. Ο κηρός μελισσών είναι ένα οργανικό συστατικό (και πιο συγκεκριμένα, λιπίδιο) και το πρώτο κηρώδες υλικό που χρησιμοποιήθηκε στο παρελθόν για διαφορετικούς σκοπούς, όπως στην περιποίηση του σώματος, ως φάρμακο, ως καύσιμο για το φωτισμό, ως υλικό για την σφράγιση των δοχείων και ως παράγοντας αδιαβροχοποίησης. Όλες αυτές οι χρήσεις μπορούν να αποδοθούν στο γεγονός ότι είναι ένα από τα πρώτα διαθέσιμα φυσικά προϊόντα, είναι πολύ αρωματικό, χαρακτηρίζεται από υδροφοβικότητα, πλαστικότητα/ευελιξία και διαθέτει θεραπευτικές ιδιότητες. Το μέλι έχει χρησιμοποιηθεί στην ιατρική από τα αρχαία χρόνια, καθώς περιέχει περίπου 2 ουσίες. Ως εκ τούτου, θεωρείται ένα πολύ σημαντικό συστατικό της παραδοσιακής ιατρικής. Όσον αφορά τη χημική ανάλυση των οργανικών υπολειμμάτων που διατηρούνται σε αρχαιολογικούς χώρους, οι βιοδείκτες του μελιού σπάνια έχουν βρεθεί σε αρχαιολογικά ευρήματα και αυτό μπορεί να αποδοθεί στην υψηλή ευαισθησία τους λόγω της αποσύνθεσης κάτω από τις συνθήκες περιβάλλοντος. Σε αντίθετη περίπτωση οι βιοδείκτες του κεριού είναι πιο σταθεροί και ανθεκτικοί στις διαδικασίες αποσύνθεσης και έχουν βρεθεί σε πολλά αρχαιολογικά ευρήματα [25]. 21

22 2.1.2 Χαρακτηρισμός και ταυτοποίηση του κεριού σε αρχαιολογικά ευρήματα Η χημική ταυτοποίηση των κεριών σε αρχαιολογικά ευρήματα βασίζεται στην ανίχνευση χαρακτηριστικών μοριακών συστατικών διαλυτών, που περιλαμβάνει μία σειρά από γραμμικούς υδρογονάνθρακες με μονό αριθμό ατόμων άνθρακα (C 21 -C 33 ), λιπαρά οξέα με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα (C 22 -C 3 ) και μακριάς αλυσίδας παλμιτικούς εστέρες της τάξης των C 4 -C 52, που προέρχονται από το παλμιτικό οξύ (C 16: ). Τα σύγχρονα κεριά παρουσιάζουν ένα πολύ αναγνωρίσιμο προφίλ από κορεσμένα και ακόρεστα n-αλκάνια, στα οποία το εικοσιεπτάνιο είναι η κύρια ένωση, από εστέρες όπου το βασικό συστατικό περιέχει 46 άτομα άνθρακα, διεστέρες, υδροξυεστέρες, φλαβονοειδή και ελεύθερα λιπαρά οξέα των οποίων το λιγνοκηρικό οξύ (C 24 ) είναι η βασική ένωση [25, 26, 27]. Το χρωματογραφικό προφίλ σε αρχαιολογικά υπολείμματα κεριού διαφέρει σημαντικά σε σχέση με το σύγχρονο, λόγω της αποσύνθεσης του κεριού μέσα στο χρόνο. Ωστόσο ο εστέρας παραμένει σταθερός παρά τη μερική υδρόλυσή του που οδηγεί στον σχηματισμό του παλμιτικού οξέος και μακριάς αλυσίδας αλκοόλες με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα, ενώ τα αλκάνια παρουσιάζονται τροποποιημένα και εξασθενισμένα [26]. Η παρουσία του κεριού είτε μόνο του είτε αναμεμιγμένο με άλλα υλικά σε αρχαιολογικά ευρήματα αποδίδεται στο γεγονός ότι τα σκεύη χρησίμευαν στο μαγείρεμα, την προετοιμασία, την επεξεργασία, τη μεταφορά, την αποθήκευση και κατανάλωση φυσικών οργανικών υλικών. Όλες αυτές οι χρήσεις εξηγούν την παρουσία οργανικών υπολειμμάτων στα αρχαιολογικά σκεύη [25]. 22

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΥΖΕΥΞΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ (GC-MS) 3.1 Εισαγωγή στην αέρια χρωματογραφία (GC) Η αέρια χρωματογραφία αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1944 από τους Martin και Synge και τα τελευταία τριάντα χρόνια έχει αναπτυχθεί αρκετά, καθώς θεωρείται εύκολη στη χρήση, σχετικά ανέξοδη και με μεγάλες δυνατότητες εφαρμογής [28,29]. Ο αέριος χρωματογράφος αποτελείται από την πηγή φέροντος αερίου, το σύστημα εισαγωγής του δείγματος, τη στήλη, τον ανιχνευτή και τον καταγραφέα. Το φέρον αέριο ρέει μέσα στο προθερμασμένο στόμιο εισαγωγής, στο οποίο εγχύεται μικρή ποσότητα του δείγματος. Το δείγμα ατομοποιείται και μεταφέρεται με την βοήθεια του φέροντος αερίου στην στήλη, όπου λαμβάνει χώρα ο διαχωρισμός του δείγματος στα επιμέρους συστατικά. Η στήλη βρίσκεται σε ένα θερμοστατικά ρυθμιζόμενο φούρνο, έτσι ώστε τα συστατικά να βρίσκονται με τη μορφή ατόμων. Μετά το διαχωρισμό κατευθύνονται στον ανιχνευτή όπου καταγράφονται στον καταγραφέα ή σε έναν υπολογιστή [28]. Φέρον αέριο Φούρνος Στήλη Ανιχνευτής Βαλβίδα έγχυσης Καταγραφέας Σχήμα 3.1: Σχηματική διάταξη ενός αέριου χρωματογράφου [3]. Ως φέρον αέριο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ήλιο ή άζωτο. Το φέρον αέριο θα πρέπει να είναι αδρανές, απαλλαγμένο από προσμίξεις και να μην περιέχει οξυγόνο. Χρησιμοποιείται για τη μεταφορά του δείγματος από το στόμιο εισόδου μέσω της στήλης στον ανιχνευτή. Στην αέρια χρωματογραφία δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ της κινητής φάσης και του αναλύτη. Γι αυτό ο χρόνος κατακράτησης του δείγματος εξαρτάται μόνο από την διαλυτότητά του στο αέριο και αυτό εξαρτάται 23

24 άμεσα από την πίεση των ατμών, η οποία σχετίζεται με την θερμοκρασία και την ενδομοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ του συστατικού και της στατικής φάσης. Επομένως το δείγμα θα πρέπει να είναι πτητικό [28]. Ωστόσο αυτό μπορεί να θεωρηθεί και ως ένα μειονέκτημα της αέριας χρωματογραφίας. Ένα άλλο πρόβλημα είναι ότι δεν μπορεί να αποδειχθεί η φύση των συστατικών που ανιχνεύονται καθώς αυτές διαχωρίζονται [31]. 3.2 Εισαγωγή δείγματος για ανάλυση (injection) Η συνηθέστερη τεχνική έγχυσης είναι η ένεση αερίου ή υγρού δείγματος με μικροσύριγγα, μέσω ενός αυτοσφραγιζόμενου ελαστικού διαφράγματος σιλικόνης (septum). Το δείγμα εισέρχεται από το στόμιο εισόδου στο χώρο ταχείας εξάτμισης, που βρίσκεται στην κεφαλή της στήλης. Ο άριστος διαχωρισμό προϋποθέτει εφαρμογή της ελάχιστης δυνατής θερμοκρασίας. Ωστόσο χαμηλή θερμοκρασία οδηγεί σε αύξηση του χρόνου έκλουσης και επομένως του απαιτούμενου χρόνου για την ολοκλήρωση του προσδιορισμού [32]. 3.3 Στήλες Αέριας Χρωματογραφίας Οι τριχοειδείς στήλες διακρίνονται σε δύο βασικούς τύπους: στις στήλες ανοικτού σωλήνα με επικάλυψη τοιχωμάτων (wall-coated open tubular, WCOT) και στις στήλες ανοικτού σωλήνα με επικάλυψη υλικού στήριξης (support-coated, open tubular column, SCOT). Οι στήλες με επικάλυψη τοιχωμάτων είναι τριχοειδείς σωλήνες με εσωτερικό τοίχωμα επικαλυμμένο με λεπτό στρώμα στατικής φάσης. Στις στήλες με επικάλυψη υλικού στήριξης, το εσωτερικό τοίχωμα του τριχοειδούς καλύπτεται με λεπτό υμένιο υλικού στήριξης, όπως η γη διατόμων. Αυτός ο τύπος στήλης συγκρατεί πολλαπλάσια ποσότητα στατικής φάσης σε σχέση με τις στήλες επικάλυψης τοιχωμάτων και για αυτό το λόγο χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη χωρητικότητα δείγματος. Γενικά η απόδοση μιας στήλης SCOT είναι μικρότερη από την απόδοση μιας στήλης WCOT, αλλά σημαντικά μεγαλύτερη από την απόδοση μιας πληρωμένης στήλης. Επίσης υπάρχουν και οι στήλες PLOT στις οποίες τα σωματίδια της στερεής στατικής φάσης προσδένονται απευθείας στο εσωτερικό τοίχωμα της στήλης [33]. 24

25 Σχήμα 3.2: Τριχοειδής στήλη [34]. Τριχοειδή στήλη πορώδους στιβάδας (PLOT) Τριχοειδής στήλη υγρής στατικής φάσης, WCOT Πάχος στρώματος 5-5μm εσωτερική διάμετρος,32-,53mm εξωτερική διάμετρος Τριχοειδής στήλη υλικού πλήρωσης και στατικής φάσης, SCOT Πάχος υμενίου,1-8μm Σχήμα 3.3: Τριχοειδείς στήλες PLOT, SCOT και WCOT [35] Πληρωμένες στήλες Οι πληρωμένες στήλες κατασκευάζονται από γυάλινους σωλήνες, μεταλλικούς ή πλαστικούς με τυπικό μήκος 2 έως 3 m και εσωτερική διάμετρο 2 έως 4 mm. Οι σωλήνες αυτοί πληρούνται πυκνά με ένα λεπτό και ομοιόμορφα κονιοποιημένο πληρωτικό υλικό, το οποίο είναι καλυμμένο με ένα λεπτό στρώμα στατικής φάσης [32]. 25

26 Πίνακας 3.1: Σύγκριση πεπληρωμένων στηλών (i.d.,136 cm), ευρείας διαμέτρου τριχοειδών στηλών (i.d.,53mm) και τριχοειδών στηλών [36]. Εσωτερική διάμετρος, mm 2,2,53,25 Πάχος στιβάδας, μm 5 1~5,25 Αναλογία όγκου φάσεων 15~3 13~25 25 Μήκος στήλης, m 1~2 15~3 15~6 Ταχύτητα ροής, ml/min Αριθμός θεωρητικών πλακών, N. m Τυπικό μέγεθος δείγματος 15 μg 5 μg 3.4 Πλεονεκτήματα τριχοειδών στηλών Τα πλεονεκτήματα των τριχοειδών στηλών είναι: 1. Μεγάλος αριθμός θεωρητικών πλακών (μέχρι 5. σε σχέση με τις στήλες πλήρωσης 2.). 2. Μικρότερη ποσότητα δείγματος (ng). 3. Μικρότερος χρόνος έκλουσης και ανάλυσης. 4. Μικρότερες θερμοκρασίες διαχωρισμού (2 o C). 5. Όρια ανίχνευσης περίπου ίδια, αλλά μικρότερη ποσότητα δείγματος. 6. Η εξέλιξη της τεχνολογίας επιτρέπει διαχωρισμό ουσιών που δε θα μπορούσαν να διαχωριστούν. 7. Με 3-4 στήλες μπορούν να διαχωριστούν οποιεσδήποτε ενώσεις. 8. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για σύζευξη με ανιχνευτές. 26

27 9. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν στήλες μεγάλου μήκους και να επιτευχθεί μεγάλη διαχωριστική ικανότητα [37]. 3.5 Στατική Φάση Τα υλικά που χρησιμοποιούνται ως στατικές φάσεις στην αέρια χρωματογραφία πρέπει να χαρακτηρίζονται από χημική και θερμική σταθερότητα. Ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας σε μια στήλη εξαρτάται από τη σταθερά κατανομής που συνδέεται με τη χημική σύσταση της στατικής φάσης. Οι διάφορες διαχωριζόμενες ουσίες πρέπει να χαρακτηρίζονται από διαφορετικές σταθερές κατανομής ως προς το ακινητοποιημένο υγρό, για να μπορεί το τελευταίο να χρησιμοποιηθεί στη χρωματογραφία. Επιπλέον οι σταθερές αυτές δεν πρέπει να είναι πολύ μεγάλες, ούτε πολύ μικρές. Για να είναι ο χρόνος παραμονής μιας ουσίας στη στήλη ικανοποιητικός θα πρέπει η ουσία αυτή να παρουσιάζει κάποιο βαθμό συμβατότητας στη στατική φάση. Σε γενικές γραμμές η πολικότητα της στατικής φάσης θα πρέπει να ταιριάζει με αυτή των διαχωριζόμενων ουσιών. Όταν το ταίριασμα αυτό είναι ικανοποιητικό, η σειρά έλκουσης καθορίζεται πλέον από το σημείο βρασμού των ουσιών [32]. πολυδιμέθυλοσιλοξάνιο Πολυ(5%διφαινυλο-95%-διμεθυλοσιλοξάνιο) Σχήμα 3.4: Υλικά που χρησιμοποιούνται ως στατικές φάσεις. 3.6 Συστήματα Ανίχνευσης Τα χαρακτηριστικά ενός ιδανικού ανιχνευτή είναι: υψηλή σταθερότητα και επαναληψιμότητα σε σχέση με το χρόνο ευαισθησία, η ευαισθησία των σύγχρονων ανιχνευτών κυμαίνεται στην περιοχή των g ουσίας/s εκλεκτικότητα 27

28 γραμμική απόκριση θερμοκρασία λειτουργίας έως 4 o C μικρός χρόνος απόκρισης, ανεξάρτητος της ροής μη καταστρεπτικός υψηλή αξιοπιστία και ευκολία στη χρήση [37, 38, 39, 4, 41] Ανιχνευτής Ιονισμού Φλόγας (Flame Ionization Detector, F.I.D.) Ο ανιχνευτής ιονισμού φλόγας χρησιμοποιείται συχνά στην αέρια χρωματογραφία και απαιτεί την παρουσία υδρογόνου και αέρα με αναλογία 1:1. Τα αέρια αναμιγνύονται και καίγονται πάνω στον πίδακα της φλόγας. Μεταξύ του πίδακα και του ηλεκτροδίου συλλέκτη εφαρμόζεται αρνητική τάση πόλωσης. Καθώς ο αναλύτης εκλούεται από τη στήλη, περνά μέσα από τη φλόγα, καίγεται και παράγονται ιόντα. Ο ανιχνευτής αυτός χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευαισθησία (~1-13 g/s), μεγάλη γραμμική περιοχή (~1 7 ) και χαμηλό θόρυβο. Επίσης μπορεί να αποκρίνεται γρήγορα, είναι αξιόπιστος και η λειτουργία του ρυθμίζεται εύκολα [42]. Μονωτής Φλόγα H 2 -αέρα Αέρας Εσωτερικό τοίχωμα φούρνου Υδρογόνο Έξοδος στήλης Σχήμα 3.5: Ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (Flame Ionization Detector, F.I.D.) [43]. 28

29 3.6.2 Ανιχνευτής Θερμικής Αγωγιμότητας (Thermal Conductivity Detector T.C.D.) Η αρχή λειτουργίας του βασίζεται στη διαφοροποίηση της θερμικής αγωγιμότητας του αερίου που περιβάλλει μια αντίσταση της οποίας η τιμή εξαρτάται σημαντικά από τη θερμοκρασία. Η διαφοροποίηση της θερμικής αγωγιμότητας οφείλεται σε μικρομεταβολές της σύνθεσης του αερίου που εξέρχεται από τη χρωµατογραφική στήλη (έκλουσµ. Το αισθητήριο στοιχείο είναι ένα λεπτό σύρμα λευκοχρύσου, χρυσού ή βολφραµίου, του οποίου η θερμοκρασία σε συνθήκες κατανάλωσης σταθερής ισχύος εξαρτάται από τη θερμική αγωγιμότητα και την ταχύτητα ροής του περιβάλλοντος αερίου. Η παρουσία μικρής ποσότητας ατμών προσμίξεων στο έκλουσµα της χρωµατογραφικής στήλης, μεταβάλλει ελάχιστα την θερμική αγωγιμότητα του αερίου µε αποτέλεσμα μια αντίστοιχη μικρή μεταβολή της θερμοκρασίας του αισθητήριου στοιχείου και επομένως της τιμής της αντίστασής του. Τα πλεονεκτήματα του ανιχνευτή θερμικής αγωγιμότητας είναι το χαμηλό κόστος, η απλότητα στη χρήση του, ο μη καταστρεπτικός του χαρακτήρας, η μεγάλη περιοχή θερμοκρασιών, η απόκριση σε όλες τις ενώσεις, η καλή γραμμικότητα και ότι δεν απαιτεί τη χρήση άλλου αερίου και δεν είναι απαραίτητο να είναι καύσιμο [32]. Θερμαινόμενο σύρμα Έξοδος ροής Είσοδος ροής Σχήμα 3.6: Ανιχνευτής θερμικής αγωγιμότητας (Thermal Conductivity Detector T.C.D.) [44]. 29

30 3.6.3 Ανιχνευτής Χημειοφωταύγειας Θείου Η αρχή λειτουργίας του στηρίζεται στην αντίδραση ενώσεων που περιέχουν θείο με όζον. Η ένταση της χημειοφωταύγειας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του θείου. Το εκλουστικό αναμιγνύεται με υδρογόνο και αέρα και καίγεται. Τα αέρια που παράγονται αναμιγνύονται με όζον και μετριέται η ένταση της ακτινοβολίας που εκπέμπεται [32]. Σήμα Η/Υ Η/Υ Από τριχοειδή στήλη Αντλία κενού Σχήμα 3.7: Ανιχνευτής χημειοφωταύγειας θείου [45] Ανιχνευτής Δέσμευσης Ηλεκτρονίων (Electron Capture Detector E.C.D.) Όπως φαίνεται στο σχήμα το έκλουσμα από τη στήλη διέρχεται πάνω από ένα ραδιενεργό υλικό. Ένα ηλεκτρόνιο από τη ραδιενεργό πηγή προκαλεί ιονισμό του φέροντος αερίου και την παραγωγή ενός σήματος ηλεκτρονίων [32]. Το φαινόμενο που λαμβάνει χώρα μέσα στο θάλαμο ιονισμού μπορεί να αποδοθεί με την αντίδραση: φέρον αέριο υψηλή ενέργεια χαμηλή ενέργεια N 2 β N 2 e - Ar β Ar e - Ar * 3

31 Μονωτής Ραδιενεργή πηγή ακτινοβολίας β Απόβλητα Από την στήλη GC Θετικό ηλεκτρόδιο Αρνητικό ηλεκτρόδιο Μονωτής Σχήμα 3.8: Ανιχνευτής δέσμευσης ηλεκτρονίων (Electron Capture Detector E.C.D.) [46]. Ο ανιχνευτής δέσμευσης ηλεκτρονίων είναι εκλεκτικός ως προς την απόκρισή του και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε μόρια που περιέχουν δραστικές ομάδες, όπως αλογόνα, υπεροξειδικούς δεσμούς και νιτροενώσεις [32] Θερμοϊονικοί Ανιχνευτής (TID) Ο θερμοϊονικός ανιχνευτής παρουσιάζει γραμμικότητα της τάξης του και η μεγάλη του εκλεκτικότητα στις οργανοφωσφορικές και οργανοαζωτούχες ενώσεις τον κάνουν απόλυτα απαραίτητο για τις αναλύσεις αυτού του είδους. Η απόκριση του προς ένα άτομο φωσφόρου είναι δέκα φορές μεγαλύτερη από την απόκριση προς ένα άτομο αζώτου και φορές σε σχέση με ένα άτομο άνθρακα [32]. 3.7 Πλεονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας Τα πλεονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας είναι: Γρήγορη ανάλυση, τα αποτελέσματα λαμβάνονται σε λίγα λεπτά. Δεν απαιτεί δείγματα με μεγάλο όγκο, συνήθως χρησιμοποιούνται δείγματα με όγκο σε μl. 31

32 Είναι κατάλληλη για τον διαχωρισμό πολύπλοκων μιγμάτων στα συστατικά τους. Έχει απλή οργανολογία και σχετικά οικονομική. Είναι ευαίσθητη για τον προσδιορισμό πτητικών οργανικών ενώσεων σε χαμηλές συγκεντρώσεις (pm). 3.8 Μειονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας Τα μειονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας είναι: Περιορίζεται στις πτητικές ενώσεις. Είναι ακατάλληλη για θερμικά ασταθείς ενώσεις. Μερικά δείγματα απαιτούν εκτεταμένη προκατεργασία. Τα δείγματα θα πρέπει να είναι διαλυτά και να μην αντιδρούν με την στήλη. Συνήθως απαιτεί τη χρήση φασματοσκοπίας (συνήθως φασματοσκοπία μάζας) για τον προσδιορισμό της ταυτότητας των ενώσεων. 3.9 Εισαγωγή στην αέρια χρωματογραφία σε σύζευξη με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) Σε ένα φασματόμετρο μάζας τα συστατικά ενός δείγματος μετατρέπονται σε κινούμενα ιόντα και διαχωρίζονται σε σχέση με το λόγο της μάζας προς το φορτίο (m/z). Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στην παρατήρηση ότι τα θετικά ιόντα αποκλίνουν της φοράς τους κατά την κίνηση τους σε ηλεκτρικά ή μαγνητικά πεδία. Το φασματόμετρο μάζας είναι ένα εξαιρετικό όργανο για τον προσδιορισμό της δομής μιας ένωσης, αλλά είναι λιγότερο χρήσιμο στην περίπτωση πολύπλοκων μιγμάτων, λόγω του μεγάλου πλήθους των παραγόμενων θραυσμάτων διαφορετικών τιμών m/z. Για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί τεχνικές οι οποίες συζευγνύονται με την φασματομετρία μάζας. Η αέρια χρωματογραφία για παράδειγμα, παρέχει τη δυνατότητα άριστου διαχωρισμού και ποσοτικού προσδιορισμού. Όμως τα συστήματα GC δεν μπορούν να επιβεβαιώσουν την ταυτότητα ή τη δομή οποιασδήποτε κορυφής. Έτσι ο συνδυασμός GC-MS σχηματίζει ένα όργανο που 32

33 επιτρέπει τον ικανοποιητικό διαχωρισμό των μιγμάτων στα επιμέρους συστατικά τους και στη συνέχει παρέχει ποιοτικές και ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με την χημική δομή της κάθε ένωσης [31, 47, 48, 49]. Η GC-MS παρέχει τη δυνατότητα: ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού πτητικών και ημι-πτητικών οργανικών ενώσεων σε πολύπλοκα μίγματα. προσδιορισμού του μοριακού βάρους και μερικές φορές τον προσδιορισμό της στοιχειακής σύνθεσης άγνωστων οργανικών ενώσεων σε πολύπλοκα μίγματα. τον συντακτικό προσδιορισμό άγνωστων οργανικών ενώσεων σε πολύπλοκα μίγματα με την δυνατότητα αντιστοίχησης με τα φάσματα αναφοράς [5]. 3.1 Ιστορική αναδρομή της συνδυασμένης τεχνικής GC-MS Ο προσδιορισμός της δομής μιας οργανικής ένωσης αποτελούσε δύσκολο και χρονοβόρο εγχείρημα κατά τον 19ο και στις αρχές του 2ου αιώνα. Τις τελευταίες δεκαετίες, όμως, σημειώθηκαν καταπληκτικές πρόοδοι στον τομέα αυτό [51]. Αρχικά ο J.J Thomson το 1913 χρησιμοποίησε το φασματόμετρο μάζας για τον διαχωρισμό των ατομικών ισοτόπων και από τότε το MS αναπτύχθηκε και βελτιώθηκε ως αναλυτικό εργαλείο [52]. Σήμερα υπάρχουν διαθέσιμες εκλεπτυσμένες τεχνικές μέθοδοι, που απλοποιούν σημαντικά το πρόβλημα του προσδιορισμού κάποιας δομής [51]. Η επόμενη μεγάλη εξέλιξη ήταν η διασύνδεση της αέριας χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας. Η πρώτη GC-MS σύζευξη έγινε στα τέλη του 195, μόνο 4-5 χρόνια μετά την εισαγωγή της GC από τους James και Martin. Η φασματομετρία μάζας ήταν ακόμα καινούργια στον χαρακτηρισμό οργανικών ενώσεων και γενικά η χρήση της περιοριζόταν εξαιτίας της πολυπλοκότητας, του μεγέθους και της τιμής του οργάνου και την ανάγκη για εξειδικευμένο προσωπικό [42]. Με την εφαρμογή της GC-MS, ο φασματογράφος μαζών μπορεί να αποτελέσει τον ανιχνευτή στην αέρια χρωματογραφία και ο αέριος χρωματογράφος να αποτελέσει το σύστημα κατεργασίας-εισαγωγής του δείγματος για το φασματογράφο μαζών. Η συνδυασμένη τεχνική GC-MS χρησιμοποιεί τα πλεονεκτήματα που προσφέρει χωριστά η καθεμία 33

34 τεχνική, δηλαδή τη δυνατότητα άριστου διαχωρισμού και ποσοτικού προσδιορισμού και τη δυνατότητα ταυτοποίησης Ανάλυση μιγμάτων με τεχνικές σε συνδυασμό με φασματόμετρα μάζας Στο σχήμα 3.9 φαίνεται η σχηματική αναπαράσταση ενός χαρακτηριστικού φασματομέτρου μάζας που χρησιμοποιείται συνήθως με τον αέριο χρωμα.τογράφο. Αποτελείται από ένα σύστημα έγχυσης του δείγματος, τον εγχυτήρα. Επίσης είναι εφοδιασμένο με μια φιάλη φέροντος αερίου (He ή H 2 ), βαλβίδες ελέγχου για τον έλεγχο της θερμοκρασίας του φούρνου, έναν μικροεπεξεργαστή και σωληνώσεις για τη σύνδεση του εγχυτήρα στην στήλη και στην έξοδο για τη διασύνδεση με το φασματόμετρο μάζας. Η στήλη θα πρέπει να είναι επικαλυμμένη με μια στατική φάση, στην οποία λαμβάνει χώρα ο διαχωρισμός. Στη μονάδα διασύνδεση, οι ενώσεις που διαχωρίζονται μεταφέρονται στην πηγή ιονισμού του φασματογράφου, χωρίς να υπάρχει κίνδυνος να γίνει ξανά ανάμιξη των διαχωρισθέντων συστατικών. Το φασματόμετρο μάζας αποτελείται από την πηγή ιονισμού, το φακό εστίασης, τον αναλυτή μάζας, τον ανιχνευτή ιόντων και πολλαπλές βαλβίδες άντλησης. Τέλος, περιλαμβάνει ένα σύστημα ελέγχου που γίνεται η επιλογή της μάζας, έλεγχος του ανιχνευτή, επεξεργασία των δεδομένων και διασύνδεση του GC με τον σύστημα εισαγωγής του δείγματος [31]. Σύστημα εισαγωγής Ανιχνευτής MS Παροχή αερίου Διασύνδεση Διαχωρισμός GC Είσοδος δείγματος Ανιχνευτής Αναλυτής μαζών Πηγή ιόντων Στήλη Αντλία Σύστημα κενού Φούρνος Σχήμα 3.9: Σχηματική διάταξη αερίου χρωματογράφου σε σύζευξη με φασματόμετρο μάζας [53]. 34

35 Η εισαγωγή του δείγματος και ο διαχωρισμός των συστατικών βάση της διαφορετικής συγκράτησής τους στη στατική φάση γίνεται στον αέριο χρωματογράφο, ενώ ο φασματογράφος μάζας λειτουργεί σαν ανιχνευτής. Ο φασματογράφος μάζας παρέχει πληροφορίες για τον χρόνο ανίχνευσης, το λόγο μάζας προς φορτίο (m/z) και την ένταση του λαμβανόμενου σήματος. Έτσι λόγω της χρωματογραφικής διάταξης πραγματοποιείται καλός διαχωρισμός και υψηλή ταχύτητα ανάλυσης, ενώ με το φασματόμετρο μάζας πραγματοποιείται ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των ενώσεων. Η ταυτοποίηση της κάθε ένωσης του αναλυόμενου δείγματος επιτυγχάνεται με τον έλεγχο του χρόνου συγκράτησης της με τον χρόνο του γνωστού προτύπου, καθώς και με σύγκριση του φάσματος μάζας με τα φάσματα μάζας από τη βιβλιοθήκη φασμάτων MS που υπάρχει στο λογισμικό του οργάνου [37, 54, 55] Εισαγωγή δειγμάτων Η διάταξη σύζευξης μπορεί να είναι διαχωριστής τύπου jet, διαχωρισμός έγχυσης ή μεμβράνη. Ενώ όταν χρησιμοποιείται το αντιδρών αέριο του χημικού ιονισμού, τότε η εισαγωγή γίνεσαι απευθείας στο MS. Στο διαχωριστή τύπου jet, το δείγμα που εκρέει από το GC εισάγεται σε ένα θάλαμο κενού, ενώ το φέρον αέριο απομακρύνεται με έγχυση. Η επιλεκτική μεμβράνη διαπερατότητας είναι κατασκευασμένη από σιλικόνη και επιτρέπει τη μεταφορά οργανικών μη πολικών μορίων και αποτρέπει τη μεταφορά του φέροντος αερίου. Το φέρον αέριο έχει μικρή διαπερατότητα, ενώ τα οργανικά μόρια διαπερνούν τη μεμβράνη και εισάγονται στον θάλαμο υψηλού κενού του MS. Παρά το γεγονός ότι είναι μια αποτελεσματική διαδικασία εμπλουτισμού, δεν είναι αποτελεσματική για πολικούς αναλύτες και προκαλεί διεύρυνση των κορυφών. Η μοριακή έγχυση βασίζεται στον διαχωρισμό του αερίου εκροής μέσω ενός πορώδους γυαλιού. Η στήλη εκροής περνά μέσα από τον πορώδη σωλήνα που βρίσκεται σε ένα θάλαμο κενού. Τα μικρά μόρια διασχίζουν τους μικροσκοπικούς πόρους στα τοιχώματα του σωλήνα, ενώ αυτά που έχουν μεγάλο μοριακό βάρος μεταφέρονται στην πηγή ιονισμού [42]. 35

36 Διαχωριστής τύπου jet Μεμβράνη επιλεκτικής διαπερατότητας Από GC Προς MS Από GC Προς MS Έξοδος Προς αντλία κενού Μοριακής έγχυσης Άμεση εισαγωγή Από GC Προς MS Ροή στήλης Πηγή MS Προς αντλία Κενού Σχήμα 3.1: Διατάξεις σύζευξης GC-MS [42] Πηγές ιονισμού Για να αναλυθεί μια ένωση με MS, πρέπει προηγουμένως να ιονιστεί στην πηγή ιονισμού (Ionization Source). Η επιλογή της μεθόδου ιονισμού για ανάλυση με MS, είναι η επιλογή μιας τεχνικής που θα διατηρεί τις ιδιότητες του δείγματος που ενδιαφέρει να μελετηθούν, ενώ ταυτόχρονα να το μετατρέπει σε ιόντα που να μπορούν να αναλυθούν στο φασματόμετρο μαζών. Η πλειονότητα των φασματόμετρων μαζών εφαρμόζει ιονισμό σε αέρια φάση. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τον ιονισμό σε αέρια φάση είναι: Ιονισμός με ηλεκτρόνια (Electron Impact), β) Χημικός ιονισμός (Chemical Ionization) και γ) Ψεκασμός σε ηλεκτρικό δυναμικό (Electrospray) [56] Ηλεκτρονικός Ιονισμός (Electron Ionization ή Electron Impact, EI) Στον ηλεκτρονικό ιονισμό, η προς ανάλυση ένωση εισάγεται στο θάλαμο υψηλού κενού ( Torr) όπου αεριοποιείται και στη συνέχεια βομβαρδίζεται με ηλεκτρόνια ενέργειας 1-1 ev. Η πρόσκρουση αυτού του υψηλής ενέργειας 36

37 ρεύματος ηλεκτρονίων οδηγεί στην απομάκρυνση ενός των ηλεκτρονίων σθένους και τη δημιουργία μιας κατιονικής ρίζας ([RH]. ) [56]. RH e - [RH]. 2e Χημικός Ιονισμός (Chemical Ionization, CI) Ο σκοπός του χημικού ιονισμού είναι να χρησιμοποιήσει μια αντίδραση ιόντοςμορίου για να μεγιστοποιήσει την ένταση του μοριακού ιόντος και παράλληλα να ελαχιστοποιήσει την παρουσία άλλων ιόντων (θραυσμάτων). Χρησιμοποιούνται σχετικά υψηλές πιέσεις (,5-1,5 Τorr) και το υπόστρωμα ιονίζεται με αντίδραση με ένα αντιδραστήριο αέριο το οποίο έχει προϊονισθεί με δέσμη ηλεκτρονίων. Το ιονισμένο αέριο μπορεί να αλληλεπιδράσει με ένα υπόστρωμα μέσω αντιδράσεων ανταλλαγής πρωτονίου ή φορτίου. Για το μεθάνιο, η διαδικασία ιονισμού φαίνεται παρακάτω: CH 4 e - CH 4 2e - CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 [56] Τύποι αναλυτών μάζας Η βασική λειτουργία του φασματόμετρου μαζών είναι να διαχωρίσει τα ιόντα, που παράγονται στην πηγή ιόντων, ανάλογα με τις διαφορετικές τιμές των λόγων m/z. Ο διαχωρισμός είναι απαραίτητος, έτσι ώστε το μετρούμενο ιοντικό ρεύμα στον ανιχνευτή ιόντων, που ακολουθεί τον αναλυτή μαζών, να αντιστοιχεί σε ιόντα με συγκεκριμένο λόγο m/z. Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό σε έναν αναλυτή μαζών είναι η διαχωριστική του ικανότητα (Resolution, R). Η διαχωριστική ικανότητα ορίζεται από την σχέση : R= Μ/ΔΜ όπου Μ είναι η μάζα της πρώτης κορυφής και ΔΜ είναι η διαφορά μαζών δύο διαδοχικών κορυφών. Οι χαρακτηριστικοί αναλυτές μάζας για GC-MS είναι οι τετραπολικοί ή παγίδας ιόντος. Άλλες συσκευές ανάλυσης είναι: οι αναλυτές 37

38 μαγνητικού τομέα (απλή και διπλής εστίαση) και οι πιο σύγχρονοι όπως οι αναλυτές χρόνου πτήσης Τετραπολικοί αναλυτές (Quadrupole) Μόλις το δείγμα ιονιστεί, τα ιόντα που δημιουργούνται εστιάζονται και διοχετεύονται στον αναλυτή μάζας. Ο τετραπολικός αναλυτής μαζών είναι η καρδιά του φασματόμετρο μάζας. Αποτελείται από τέσσερις παράλληλες ράβδους οι οποίες είναι τοποθετημένες συμμετρικά γύρω από την οδό πτήσης των ιόντων. Κάθε ένα από τα αντίθετα ζεύγη των ράβδων είναι ηλεκτρικά συνδεδεμένο και ένα ηλεκτρικό πεδίο δημιουργείται ανά ζεύγος με συνεχή (dc) και εναλλασόμενη (rf) τάση. Τα ιόντα εισέρχονται στον τετραπολικό αναλυτή και κινούνται μέσα σε ένα τρισδιάστατο ημιτονοειδές κύμα από το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο του αναλυτή. Τα ιόντα που περνούν διαμέσου της κεντρικής περιοχής επηρεάζονται και από τα δύο αυτά είδη δυναμικού. Τα περισσότερα χάνουν το δρόμο τους και προσπίπτουν πάνω στις ράβδους αλλά αυτά με κατάλληλο m/z αποκτούν ελικοειδή τροχιά και καταλήγουν στον ανιχνευτή [31]. Μόρια?????????? Ιόντα?????????? Ανιχνευτής Επιλεγμένο ιόν???????????? Τετραπολικός???????? αναλυτής???????????????? Πρόσκρουση??? των ηλεκτρονίων??????????? από???? τον ιονιστή??????? πάνω στα μόρια Σχήμα 3.11: Τετραπολικός αναλυτής μαζών [57] Αναλυτές Μαγνητικού Τομέα (Magnetic sector) Ο αναλυτής μαγνητικού τομέα διαχωρίζει τα ιόντα σε ένα μαγνητικό πεδίο σύμφωνα με το δυναμικό και το φορτίο του ιόντος. Τα ιόντα επιταχύνονται από την περιοχή της πηγής μέσα στον αναλυτή από 1 έως 1 kv. Η ακτίνα της κυκλικής πορείας κάθε ιόντος εξαρτάται από το λόγο m/z [58]. 38

39 Μαγνήτης Απομονωτής Δέσμη ιόντων Μόνο τα ιόντα με κατάλληλο m/z Δέσμη ηλεκτρονίων Πηγή ιόντων Εκτρεπόμενα ιόντα, σύμφωνα με το m/z τους Σχισμές Προς αντλία κενού εισέρχονται στον ανιχνευτή Σχισμές ανιχνευτή Ανιχνευτής Σωλήνας εισαγωγής δείγματος Δείγμα Πλάκα επιτάχυνσης Καταγραφέας Σχήμα 3.12: Αναλυτής μαγνητικού τομέα [59] Χρόνου Πτήσης αναλυτές (Time of flight, TOF) Ο ανιχνευτής χρόνου πτήσης διαχωρίζει τα ιόντα σύμφωνα με το χρόνο, καθώς αυτά εισέρχονται σε έναν θάλαμο με μήκος L, χρησιμοποιώντας σταθερή τάση ενώ δεν απαιτείται η χρήση μαγνητικού πεδίου. Ο χρόνος πτήσης κάθε θραύσματος εξαρτάται από το λόγο m/z [31, 58]. Πλέγμα επιτάχυνσης Εισαγωγή δείγματος Ιονισμός Ελαφρύτερα ιόντα Ανιχνευτής Βαριά ιόντα Θάλαμος κενού Μέτρηση του χρόνου Σχήμα 3.13: Αναλυτής χρόνου πτήσης [6] Ιοντοπαγίδες (Ion traps) Η καρδιά της ιοντοπαγίδας αποτελείται από ένα δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο και δύο καπάκια τερματισμού. Δημιουργείται δυναμικό rf στο δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο ενώ τα καπάκια τερματισμού είναι γειωμένα. Τα ιόντα της προς ανάλυση ουσίας εισάγονται ακαριαία μέσω μιας λεπτής σχισμής του άνω καπακιού τερματισμού και 39

40 αρχίζει η μεταβολή της rf. Τα ιόντα με τη σωστή τιμή m/z εκτελούν κυκλική τροχιά στην περιοχή μέσα στο ηλεκτρόδιο (παγιδεύονται). Αυτά που έχουν μικρότερες τιμές εξέρχονται από το κάτω καπάκι και οδεύουν στον ανιχνευτή [31]. Δακτυλιοειδή ηλεκτρόδια Ηλεκτρόδια χώρου Τετράπολο εστίαση εισόδου Ηλεκτρόδια εστίασης Εισαγωγ ή ιόντων Παγιδευμέ να ιόντα Εξαγωγή ιόντων Ηλεκτρόδιο εισαγωγής Ηλεκτρόδιο εξαγωγής Σχήμα 3.14: Ιοντοπαγίδα [61] Πλεονεκτήματα και Μειονεκτήματα της GC-MS Το GC-MS συνδυάζει τα πλεονεκτήματα και των δύο τεχνικών, την δυνατότητα διαχωρισμού και την ευαισθησία από την GC και την ταυτοποίηση από το MS. Παρέχει τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά στοιχεία για το δείγμα. Η αποτίμηση των φασμάτων γίνεται με σύγκριση με τα φάσματα που υπάρχουν στη βιβλιοθήκη του υπολογιστή. Ο συνδυασμός GC-MS είναι το όργανο αναφοράς για τον προσδιορισμό πολλών πτητικών-ημιπτητικών ενώσεων. Εφαρμόζεται στην ανάλυση οργανικών ενώσεων όπως, πετρελαιοειδών, αιθέριων ελαίων, ζιζανιοκτόνων, φαρμάκων, ναρκωτικών και γενικότερα σε μια μεγάλη σειρά χημικών ενώσεων. Πολλές φορές η ανάλυση με GC-MS για την απόλυτη ταυτοποίηση μιας ένωσης σε άγνωστα δείγματα (τοξικολογική ανάλυση, μέτρηση ρύπων σε περιβαλλοντικά δείγματα, ανάλυση τροφίμων κ.λ.π) θεωρείται απαραίτητη. Από την άλλη μεριά τα όργανα GC-MS είναι ακριβά και περίπλοκα στον χειρισμό τους και επίσης απαιτείται εμπειρία του χρήστη [62]. 4

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΜΙΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ (Solid Phase Microextraction, SPME) 4.1 Μικροεκχύλιση στερεής φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) Η μικροεκχύλιση στερεή φάσης (SPME) αναπτύχθηκε το 1989 από τον Pawliszyn, είναι μία σχετικά νέα τεχνική η οποία δεν απαιτεί την χρήση διαλύτη [63, 64]. Η συσκευή, που χρησιμοποιείται (Σχήμα 4.1), αποτελείται από μια τριχοειδή ίνα πηκτής τετηγμένου διοξειδίου πυριτίου 1 cm, η οποία επικαλύπτεται εξωτερικά από τη στατική φάση. Η ίνα είναι συνδεδεμένη με ένα ατσαλένιο έμβολο και μια συσκευή συγκράτησης που μοιάζει με μικροσύριγγα. Το δείγμα τοποθετείται σε φιαλίδιο, με διάτρητο πώμα, που σφραγίζεται με διάφραγμα (septum). Πριν την ανάλυση η ίνα πρέπει να καθαριστεί, προς αποφυγή προσμείξεων που προκαλούν θορύβου στο χρωματογράφημα. Η εισαγωγή της ίνας στο δείγμα, γίνεται τρυπώντας το διάφραγμα του δοχείου και πιέζοντας το έμβολο προς τα κάτω, οπότε εκτίθεται η ίνα στον υπερκείμενο χώρο του δείγματος. Πραγματοποιείται, λοιπόν ισορροπία κατανομής μεταξύ της στατικής φάσης της ίνας και του δείγματος. Η συγκέντρωση της ουσίας που έχει προσροφηθεί από την ίνα είναι ανάλογη με την αρχική της ποσότητα, γεγονός το οποίο επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό πριν επέλθει πλήρης ισορροπία στο σύστημα. Κατόπιν, η ίνα εκτίθεται στον εισαγωγέα του αέριου χρωματογράφου [65]. 41

42 Περίβλημα Έμβολο Βίδα συγκράτησης εμβόλου Σχισμή Παράθυρο οπτικής εξέτασης Ρύθμιση βάθους Σωλήνας πρόσδεσης ίνας Βελόνα τρυπήματος septum GC Επικαλυμμένη ίνα Σχήμα 4.1: Ίνα που χρησιμοποιείται στην SPME [66]. Η μικροεκχύλιση στερεής φάσης (SPME) παρουσιάζει μοναδικές δυνατότητες για την χρωματογραφική ανάλυση αραιών δειγμάτων σε δύσκολα υποστρώματα. Ουσιαστικά αποτελείται από δύο βήματα. Αρχικά γίνεται προσρόφηση της διαλυμένης ουσίας από το υπόστρωμα του δείγματος (Σχήμα 4.2) σε ένα παχύ σχετικά με τις συμβατικές τριχοειδούς στήλες GC- στρώμα σιλικόνης και έπειτα μεταφορά των αναλυτών στο χρωματογραφικό σύστημα με αέρια ή υγρά μέσα. Η SPME έχει σημαντική δυνατότητα να μειώσει ή να εξαλείψει την κατανάλωση διαλυτών και επομένως και όλα τα συνακόλουθα θέματα των διαλυτών για την διάθεση τους στην προκατεργασία του δείγματος. Η SPME έχει χρησιμοποιηθεί σε διαχωρισμούς τόσο στην αέρια (GC) όσο και στην υγρή (LC) χρωματογραφία. Η SPME βασίζεται στην εκχύλιση των διαλυτών ουσιών από ένα δείγμα στο προσροφητικό στρώμα της SPME. Μετά από μία περίοδο δειγματοληψίας, κατά την οποία η εκχύλιση έχει φτάσει σε ιδανική κατάσταση ισορροπίας, οι διαλυμένες ουσίες που έχουν προσροφηθεί μεταφέρονται με ένα στρώμα SPME σε ένα σύστημα εισαγωγής που εκροφά την διαλυτή ουσία στην αέρια (για GC) ή στην υγρή φάση (για LC). Η επιτυχία εξαρτάται από την επιλογή των συνθηκών, ώστε οι αναλύτες να προσροφηθούν στο υλικό πλήρωσης της SPME, όσο το δυνατόν περισσότερο 42

43 παρουσία του συνολικού δείγματος και στην συνέχεια να εκροφηθούν όσο το δυνατόν γρηγορότερα για χρωματογραφική ανάλυση LC-GC [67]. Σχήμα 4.2: Προσρόφηση των ουσιών στην ίνα [65]. 4.2 Επικάλυψη ίνας Η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας εκχύλισης εξαρτάται από την σταθερά κατανομής του αναλύτη μεταξύ της επικάλυψης και του υποστρώματος του δείγματος. Αυτή η χαρακτηριστική παράμετρος περιγράφει τις ιδιότητες της επικάλυψης και την εκλεκτικότητα της ως προς τον αναλύτη σε σχέση με τα άλλα συστατικά του υποστρώματος. Ο όγκος της επίστρωσης καθορίζει επίσης την ευαισθησία της μεθόδου, μεγαλύτερος όγκος επίστρωσης απαιτεί μεγαλύτερο χρόνο εκχύλισης, επειδή η διάχυση είναι αργή μέσα στην φάση εκχύλισης του πολυμερούς. Συνεπώς είναι σημαντικό να χρησιμοποιούμε την κατάλληλη επικάλυψη ανάλογα με τις απαιτήσεις. Η χημική φύση του αναλύτη καθορίζει τον τύπου του πολυμερούς που θα χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση. Υπάρχουν πολλά διαφορετικά επικαλυπτικά στρώματα όπως: polydimethylsiloxane (PDMS), polyacrylate (PA), PDMSdivinylbenzene (DVB) και CW-επικαλυμμένη ρητίνη (templated resin, TR). Η επιλογή του υλικού επικάλυψης βασίζεται κυρίως στην πολικότητα και στην πολικότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης. Το πιο κοινό υλικό επικάλυψης υγρού τύπου είναι το πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS), ωστόσο μπορούν να χρησιμοποιηθούν στερεές προσροφητικές ουσίες [66, 68]. 43

44 4.3 Αρχές της μικροεκχύλισης στερεής φάσης με εμβάπτιση (SPME) και από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME) Υπάρχουν δύο διαδικασίες εκχύλισης που μπορούν να πραγματοποιηθούν χρησιμοποιώντας την SPME. Η μικροεκχύλιση στερεής φάσης με εμβάπτιση και η μικροεκχύλιση στερεής φάσης από υπερκείμενη αέρια φάση. Το σχήμα 4.3 απεικονίζει τις διαφορές μεταξύ αυτών των δύο τρόπων. Στην άμεση εκχύλιση (Σχήμα 4.4β), η επικαλυμμένη ίνα εισάγεται μέσα στο δείγμα και οι αναλύτες μεταφέρονται απευθείας στη φάση εκχύλισης. Για να επιτευχθεί ταχεία εκχύλιση και για την ενίσχυση της μεταφοράς των αναλυτών από τον κύριο όγκο του διαλύματος κοντά στην περιοχή της ίνας, απαιτείται ανάδευση. Στα υδατικά υποστρώματα, απαιτούνται πιο αποδοτικές τεχνικές ανάδευσης, όπως γρήγορη ροή του δείγματος, ταχεία ίνα ή κίνηση του φιαλιδίου, ανάδευση ή κατεργασία με υπερήχους. Στην μικροεκχύλιση στερεής φάσης από υπερκείμενη αέρια φάση (Σχήμα 4.4 οι αναλύτες θα πρέπει να μεταφερθούν μέσω ενός στρώματος αέρα πριν φτάσουν στην επικάλυψη. Αυτό χρησιμεύει πρωτίστως στο να προστατευτεί η επίστρωση της ίνας από ζημία, λόγω του υψηλού μοριακού βάρους των ειδών ή λόγω της παρουσίας μη πτητικών ουσιών σε υγρά υποστρώματα, όπως χουμικά υλικά ή πρωτεΐνες. Αυτή η διαδικασία επίσης επιτρέπει την τροποποίηση του υποστρώματος, όπως αλλαγή στο ph χωρίς να καταστραφεί η ίνα. Η ποσότητα του αναλύτη που εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας SPME ή υπερκείμενη αέρια φάση είναι ίδια, εφόσον ο όγκος του δείγματος και της υπερκείμενης αέριας φάσης είναι ίδιος. Έτσι αποδεικνύεται ότι η συγκέντρωση ισορροπίας είναι ανεξάρτητη από τη θέση της ίνας στο δείγμα ή στην υπερκείμενη αέρια φάση. Η επιλογή του τρόπου δειγματοληψίας έχει σημαντική επίδραση στην κινητική της εκχύλισης. Όταν η επίστρωση της ίνας είναι στην υπερκείμενη αέρια φάση, οι αναλύτες απομακρύνονται πρώτα από την υπερκείμενη αέρια φάση και στην συνέχεια ακολουθεί έμμεση εκχύλιση από το υπόστρωμα [66, 69]. 44

45 β) Ίνα Διάλυμα δείγματος Σχήμα 4.3: Μικροεκχύλιση στερεής φάσης από υπερκείμενη αέρια φάση (HS- SPME), β) Μικροεκχύλιση στερεής φάσης με εμβάπτιση, (LP-SPME) [66]. Εκχύλιση- HS-SPME Εκρόφηση της διαλυτής ουσίας σε GC Βελόνα τρυπήματος septum Ανιχνευτής Δείγμα Θέρμανση/Ανάδ ευση Τρύπημα του Έκθεση της septum από την ίνας/εκχύλιση βελόνα Απομάκρυνση της ίνας Εκχύλιση-DI-SPME β) Δείγμα Θέρμανση/Ανάδε υση Τρύπημα του septum από την βελόνα Έκθεση της ίνας/εκχύλιση Απομάκρυνση της ίνας Σχήμα 4.4: Μικροεκχύλισης στερεής φάσης από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME) β) Μικροεκχύλισης στερεής φάσης με εμβάπτιση (SPME) [71]. 45

46 4.4 Τα στάδια της μικροεκχύλισης στερεής φάσης με εμβάπτιση (SPME) και από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME) Τα βασικά στάδια της Μικροεκχύλισης Στερεής Φάσης (SPME) είναι η εκχύλιση, η μεταφορά και η εκρόφηση (Σχήμα 4.5). Στην εκχύλιση το στρώμα της επίστρωσης εκτίθεται σε ένα δείγμα σε υγρή ή αέρια φάση. Οι ποσότητες των διαλυμένων ουσιών στο στρώμα της SPME φτάνουν σταδιακά σε ένα επίπεδο ισορροπίας, το οποία αντιπροσωπεύει τις μέγιστες ποσότητες των διαλυμένων ουσιών που μπορούν να απορροφηθούν και να αποσυρθούν κάτω από δεδομένες συνθήκες δειγματοληψίας. Η ποσότητα της διαλυμένης ουσίας (Ι) στο στρώμα της SPME στην ισορροπία (M i, SPME) μπορεί να προσεγγιστεί από την εξίσωση: M I, SPME ~ K I,SPME V SPME C I [1] όπου K I,SPME είναι η συνολική σταθερά κατανομής της διαλυμένης ουσίας μεταξύ του προσροφητικού στρώματος της SPME και του δείγματος, V SPME είναι ο όγκος του στρώματος της SPME και C I είναι η συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας στο δείγμα πριν από την δειγματοληψία SPME. Η εξίσωση [1] υποθέτει ότι ο όγκος του δείγματος είναι πολύ μεγαλύτερος από τον όγκο του στρώματος της SPME. Οι επιστρώσεις SPME έχουν χαρακτηριστικά πάχη περίπου 1-1 μm. Επίδραση της υπερκείμενης αέριας φάσης: Η παρουσία της υπερκείμενης αέριας φάσης πάνω από ένα υγρό δείγμα έχει ως αποτέλεσμα ένα μέρος της διαλυμένης ουσίας να διαχωριστεί στην υπερκείμενη αέρια φάση με τη διαδικασία της εκχύλισης μέσα στο προσροφητικό υλικό της SPME. Η μάζα της διαλυμένης ουσίας που εκχυλίζεται εξαρτάται από τους σχετικούς όγκους υγρού και υπερκείμενης αέριας φάσης. Καθίσταται έτσι σημαντικό να διατηρηθούν σταθεροί οι όγκοι των δειγμάτων και της υπερκείμενης αέρια φάσης. Χρόνος ισορροπίας: Ένα πεπερασμένο χρονικό διάστημα απαιτείται για να φτάσει σε ισορροπία μεταξύ της διαλυμένης ουσίας ενός δείγματος και του προσροφητικού υλικού της SPME. Τα μόρια της διαλυμένης ουσίας μεταφέρονται από το δείγμα στο υλικό της SPME, τα πρόσθετα μόρια της διαλυμένης ουσία πρέπει να διαχυθούν στην διεπιφάνεια SPME-δείγματος. Η διαδικασία της απορρόφησης περιορίζεται από τον ρυθμό με τον οποίο τα μόρια της διαλυμένης ουσίας μπορούν να ξαναγεμίσουν το 46

47 στρώμα μετάβασης κοντά στην SPME. Η ανάδευση της υγρής φάσης βοηθά στη μείωση του χρόνου με τη μεγιστοποίηση της έκθεσης του στρώματος της SPME στο δείγμα και τη μείωση της επίδρασης του ποσοστού του υγρού διάχυσης της διαλυμένης ουσίας επάνω στην SPME. Όταν γίνεται δειγματοληψία από την υπερκείμενη αέρια φάση του αερίου αντί του υγρού σε ένα σύστημα δειγμάτων δύο φάσεων, η διαλυμένη ουσία πρέπει πρώτα να διασχίσει τη διεπιφάνεια υγρού-αερίου πριν το στρώμα της SPME. Ενδιαφέρον προκαλεί η μικρή διαφορά στα τελευταία ποσά της διαλυμένης ουσίας στην ισορροπία στο στρώμα της SPME εάν το δείγμα λαμβάνεται από το υγρό ή το αέριο. Ο χρόνος που απαιτείται για να επιτευχθεί η ισορροπία μπορεί να επηρεαστεί πολύ από την φάση της δειγματοληψίας. Οι μη πολικές και πτητικές ουσίες που ευνοούνται στην υπερκείμενη αέρια φάση θα έρθουν στην ισορροπία γρηγορότερα εάν το στρώμα της SPME εκτίθεται στο υπερκείμενο και οι διαλυμένες και λιγότερο πτητικές ουσίες που ευνοούνται στην υγρή φάση θα εξισορροπήσουν γρηγορότερα στην υγρή φάση. Ο αναλύτης θα πρέπει να βελτιστοποιήσει τους χρόνους ισορροπίας για κάθε διαλυτή ουσία. Η ιοντική ισχύ, η θερμοκρασία και άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τους συντελεστές κατανομής, μεταξύ των υγρών δειγμάτων και της υπερκείμενης αέριας φάσης και μεταξύ του στρώματος της SPME και του υγρού, πρέπει επίσης να κρατηθούν υπό προσεκτικό έλεγχο για τη σταθερή απόδοση από δείγμα σε δείγμα. Στην εκχύλιση σημαντικός παράγοντας είναι η χημεία του προσροφητικού στρώματος της SPME και θα πρέπει να υπάρχει κατάλληλη συμβατότητα. Το επόμενο βήμα μετά από την προσρόφηση είναι να μεταφερθεί το στρώμα της SPME και ο προσροφημένος αναλύτης μακριά από την έκθεση δειγμάτων και σε συνθήκες ικανές για την εκρόφηφη στην κινητή φάση χρωματογραφίας. Το ποσοστό φυσικής εκρόφησης είναι αρκετά χαμηλό για πολλές διαλυμένες ουσίες, αλλά τα πτητικά μόρια έχουν σημαντικές απώλειες. Σε μια εργαστηριακή κατάσταση, ο χρόνος μεταφοράς από το φιαλίδιο δειγμάτων στο όργανο μπορεί να είναι αρκετά σύντομος με αποτέλεσμα οι απώλειες να είναι σημαντικές. Οι απώλειες μπορούν να ελαχιστοποιηθούν κατά τη διάρκεια της μεταφοράς και της αποθήκευσης με τη σφράγιση του στρώματος της SPME σε δοχείο. Εκτός από τις πτητικές απώλειες δειγμάτων, ένα στρώμα της SPME μπορεί εύκολα να πάρει συστατικά από τον περιβάλλοντα αέρα, ειδικά κατά τη διάρκεια της εκτεταμένης μεταφοράς σε/και από τις μακρινές περιοχές. Το στρώμα της SPME το οποίο έχει εσωκλειστεί θα αποτρέψει 47

48 επίσης την εισροή αυτών των μολυσματικών παραγόντων. Οι εμπορικά διαθέσιμες συσκευές της SPME ενσωματώνουν τα συστήματα σφράγισης. Το τελευταίο στάδιο της SPME είναι η εκρόφηση. Θα πρέπει όλες οι προσροφημένες διαλυτές ουσίες να εκροφηθούν με αποτελεσματικότητα απόδοσης 1% και σε έναν χρόνο που είναι αρκετά σύντομος να είναι συμβατός με τον τρόπο χρωματογραφίας που χρησιμοποιείται. Η θέρμανση της θύρας είναι απαραίτητα για την ανάλυση αέριας χρωματογραφίας. Οι υψηλές θερμοκρασίες εισόδου μπορούν να προκαλέσουν τη θερμική αποσύνθεση και να εισάγουν μερικούς μολυσματικούς παράγοντες στη στήλη και από το ίδιο το SPME στρώμα. Κατά τη διάρκεια της εκρόφησης δειγμάτων από μια ίνα SPME σε ένα σύστημα εισόδου με ή χωρίς διαχωρισμό ροής, η είσοδος με διαχωρισμό ροής πρέπει να κλεισθεί έτσι ώστε οι διαλυμένες ουσίες να μπορούν να εισαχθούν στη στήλη χωρίς διαχωρισμό. Ομοίως για την υγρή χρωματογραφία υπάρχουν διατάξεις που εκπλέουν το εξωτερικό στρώμα της SPME με την κινητή φάση και περνούν τις εκροφημένες διαλυμένες ουσίες στο βρόχο εγχύσεων LC είναι διαθέσιμες για την εκρόφηση LC και την ανάλυση [67]. Διάταξη SPME Δείγμα Πέψη του δείγματος Προσρόφηση Εκρόφηση-Εισαγωγή στο GC Σχήμα 4.5: Αρχή της μικροεκχύλισης στερεής φάσης από την υπερκείμενη αέρια φάση (HS-SPME) [7]. 48

49 4.5 Παράμετροι που επηρεάζουν την Μικροεκχύλιση Στερεής Φάσης (SPME) Οι παράμετροι που επηρεάζουν την μικροεκχύλιση στερεής φάσης είναι: Το επικαλυπτικό στρώμα της ίνας. Υπάρχουν πολλά διαφορετικά επικαλυπτικά στρώματα όπως: polydimethylsiloxane (PDMS), polyacrylate (PA), PDMSdivinylbenzene (DVB) και CW-επικαλυμμένη ρητίνη (templated resin, TR). Το επικαλυπτικό στρώμα επιλέγεται σύμφωνα με την ένωση που πρόκειται να προσδιοριστεί. Το επικαλυπτικό στρώμα polyacrylate (PA), χρησιμοποιείται για πολικές ενώσεις, όπως οι φαινόλες. Σε αυτήν την περίπτωση ο συντελεστής διάχυσης είναι μικρότερος από ότι με επικάλυψη ίνας με PDMS και έτσι ο χρόνος εκχύλισης είναι μεγαλύτερος [68, 72,73]. β) Οι συνθήκες εκχύλισης. Στις συνθήκες εκχύλισης περιλαμβάνεται το ph, ο χρόνος και η θερμοκρασία εκχύλισης. Το ph αποτελεί σημαντική παράμετρο και επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης [74]. Ρυθμίζοντας το ph μπορούμε να αυξήσουμε την ποσότητα των αναλυτών που συγκρατούνται πάνω στην ίνα. Όσον αφορά τον χρόνο, η SPME είναι µία διαδικασία ισορροπίας, στην οποία µας ενδιαφέρει η κατανομή της προσδιοριζόμενης ένωσης μεταξύ του υποστρώματος του δείγματος και της επίστρωσης. Η ανάκτηση της προσδιοριζόμενης ένωσης αυξάνεται με το χρόνο της εκχύλισης, μέχρι να φτάσει σε ισορροπία. Ο χρόνος εκχύλισης που επιλέγεται είναι εκείνος που είναι ο καλύτερος συμβιβασμός ανάμεσα σε μία καλή κορυφή και σε ένα αποδεκτό χρόνο ανάλυσης. Η θερμοκρασία επιδρά με δύο διαφορετικούς τρόπους στην SPME. Αυξάνοντας την θερμοκρασία ενισχύεται ο συντελεστής διάχυσης των συστατικών. Καθώς όμως η προσρόφηση είναι μία εξώθερμη διεργασία, αυξάνοντας τη θερμοκρασία μειώνεται η σταθερά κατανομής των συστατικών. Επίσης στην διαδικασία της HS-SPME η θερμοκρασία βοηθά στην μεταφορά του αναλύτη στην υπερκείμενη αέρια φάση [73]. γ) Η μέθοδος της εκρόφησης. Μετά την εμβάπτιση της ίνας στο διάλυμα για συγκεκριμένο χρόνο που έχει επιλεγεί ως βέλτιστος και μετά από μελέτη βελτιστοποίησης, η ίνα εισάγεται στην SPME και οδηγείται στην GC ή HPLC για εκρόφηση. 49

50 4.6 Πλεονεκτήματα Μικροεκχύλισης Στερεής Φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) Ένα μεγάλο φάσμα αναλυτών μπορούν αν αναλυθούν με την SPME, αφού δίνει την δυνατότητα ανάλυσης πτητικών, ημι-πτητικών και μη πτητικών οργανικών και ανόργανων ουσιών [69]. Τα πλεονεκτήματα της SPME είναι η απλότητα, η ευκολία της χρήσης της και η μειωμένη ή ανύπαρκτη κατανάλωση διαλυτών. Επίσης μπορεί να απομονωθεί η δειγματοληψία από το υπόστρωμα του δείγματος, το οποίο θα μπορούσε να επηρεάσει τον χρωματογραφικό διαχωρισμό. Ο συνδυασμός αυτών των χαρακτηριστικών καθιστούν την SPME ως μία ελκυστική εναλλακτική λύση σε σύγκριση με την κλασική δειγματοληψία, τη θερμική εκρόφηση, την εκχύλιση στερεής φάσης και την κλασική εκχύλιση υγρού-υγρού. Η SPME προσφέρεται επίσης για τον χειρισμό δύσκολων υποστρωμάτων δειγμάτων και παρουσιάζει τα οφέλη του χαμηλού κόστους και της απλότητας, καθώς δεν απαιτεί περίτεχνα και ακριβά εξαρτήματα. Φαίνεται να είναι ιδανική και παρέχει καλά αποτελέσματα. Η SPME απαιτεί προσεκτική βελτιστοποίηση και σταθερές συνθήκες λειτουργίας [67, 75]. Η SPME έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην βιομηχανία τροφίμων, σε κλινικές και ιατροδικαστικές εφαρμογές και σε περιβαλλοντικές αναλύσεις [69]. 5

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ Για να πραγματοποιηθεί μια αρχαιολογική ανάλυση, είναι αναγκαίος τόσο ο προσδιορισμός της χημικής σύστασης του υλικού, όσο και της μικροδομής αυτού. Επομένως, οι αναλυτικές τεχνικές διακρίνονται σε τεχνικές παρατήρησης (για την μελέτη του δείγματος υπό υψηλή μεγέθυνση) και σε αναλυτικές τεχνικές για τον προσδιορισμό της χημικής σύστασής του. Οι τεχνικές παρατήρησης χρησιμοποιούνται σε μικρότερο βαθμό και είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), η συμβατική οπτική μικροσκοπία (OM), η ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης (TEM) και η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (AFM). Όσον αφορά τις αναλυτικές τεχνικής, που χρησιμοποιούνται συχνότερα στον προσδιορισμό της χημικής σύστασης των γυαλιών είναι η φασματοσκοπία ακτίνων Χ διασποράς ενέργειας (energy dispersive X-ray, EDX), η φασματοσκοπία φθορισμού ακτίνων Χ (Χ-ray fluorescene, XRF), το επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα (inductively coupled plasma, ICP), η εκπομπή ακτίνων Χ μέσω διέγερσης με πρωτόνια (proton induced X-ray emission, PIXE), η φασματοσκοπία ακτίων Χ διασποράς μήκος κύματος (wavelength dispersion, WDS) καθώς και η ενόργανη ανάλυση ενεργοποίησης με νετρόνια (instrumental neutron activation analysis, ΙΝΑΑ). Είναι σημαντικό να σημειώσουμε ότι οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται είναι μη καταστρεπτικές ή μερικώς καταστρεπτικές. Ωστόσο, στην προσπάθεια να επιτευχθούν χαμηλά όρια ανίχνευσης, να προσδιοριστούν συστατικά σε πολύ μικρές αναλογίες ή να βελτιωθεί η ακρίβεια των αναλύσεων, χρησιμοποιούνται και καταστρεπτικές τεχνικές, όπως η ICP-AES/MS [76]. Η ανάλυση σε υλικά μεταλλουργίας πραγματοποιήθηκε από την Anne-Marie Desaulty και τους συνεργάτες της (28), χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS). Η παρούσα μελέτη στόχευε στην κατανόηση της συμπεριφοράς των ιχνοστοιχείων στις δύο διαδικασίες παραγωγής σιδήρου και στην ανίχνευση σημαντικών στοιχείων για τον χαρακτηρισμό του χυτοσίδηρου από διάφορες περιοχές. Η δυνατότητα να διακρίνει τις περιοχές προέλευσης άνοιξε νέες προοπτικές στην μελέτη των αρχαιολογικών σιδηρούχων υλικών, έτσι ώστε να κατανοήσουν τις εμπορικές διαδρομές σε διαφορετικές χρονικές περιόδους. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ ICP-MS με την μέθοδο σταθερής 51

52 προσθήκης και της ενόργανης ανάλυσης ενεργοποίησης με νετρόνια (Instrumental Neutron Activation Analyses, INAA) απέδειξε ότι περιεχόμενα Sc, Co, Ni, Rb, Cs, Ba, La, Ce, Sm, Eu, Yb, Hf, Th, U σε μεταλλεύματα και σκουριές, καθώς και περιεχόμενα Co και Ni στον χυτοσίδηρο μπορούν να προσδιοριστούν με μεγάλη επιτυχία μετά από υγρή πέψη. Η ICP-MS θεωρείται εξαιρετική τεχνική στην ανάλυση αρχαιολογικών δειγμάτων, καθώς παρέχει την δυνατότητα ταχείας πολυστοιχειακής ανάλυσης, χαμηλά όρια ανίχνευσης, καλή ευαισθησία και μεγάλη ακρίβεια [77]. Η φασματομετρία εκπομπής και η φασματομετρία ατομικής απορρόφησης έχουν χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό Al 2 O 3, CaO, Fe 2 O 3, K 2 O, MgO, MnO, Na 2 O και TiO 2 ως κύρια συστατικά και Cu, Cr, Ni, Pb και Zn ως ήσσονος σημασίας σε θραύσματα λυχναριών από τον R. García Giménez και τους συνεργάτες του (25). Φυσικές, ορυκτολογικές και μορφολογικές αναλύσεις έγιναν με την μέτρηση της διαστολής με σταθερό ρυθμό θέρμανσης για την θερμική συμπεριφορά, η φασματομετρία περίθλασης ακτινων-χ χρησιμοποιήθηκε για την ορυκτολογική σύνθεση και η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης και η πολωτική πετρογραφική μικροσκοπία για την παρατήρηση λεπτών στρωμάτων και την ταυτοποίηση ορυκτών. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων επιτρέπουν την σύγκριση και την δημιουργία συμπερασμάτων σχετικά με την κατασκευή, την προέλευση των πρώτων υλών και την προέλευση των λυχναριών (τοπικά ή εισαγόμεν [78]. Η φασματοσκοπία πλάσματος επαγομένου με laser (LIBS), η φασματοσκοπία υπερύθρου-μετασχηματισμού Fourier (FT-IR), και η πυρόλυση σε συνδυασμό με αέρια χρωματογραφία με φασματόμετρο μάζας (PY-GC-MS) έχουν χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό της στοιχειακής και μοριακής σύνθεσης του υλικού που είναι κατασκευασμένο το αγγείο, καθώς και του οργανικού περιεχομένου του, από τον S. Legnaioli και τους συνεργάτες του (212). Αυτή η πολύ-τεχνική ανάλυση συνδυάστηκε με την μορφολογική και υφολογική εξέταση του αγγείου, η οποία επιτρέπει την πιθανή χρονολόγησή του. Με την μελέτη της θερμοφωταύγειας δόθηκε οριστική απάντηση για την γνησιότητα και την χρονολόγηση του αγγείου [79]. Η αέρια χρωματογραφία σε σύζευξη με το φασματόμετρο μάζας (GC-MS) μετά από αλκαλική υδρόλυση, εκχύλιση διαλύτη και τριμεθυλπυριτικοποίηση και αναλυτική πυρόλυση χρησιμοποιώντας εξαμεθυλοδισιλαζάνη (HMDS) για in situ παραγωγοποίηση ακολουθούμενη από αέρια χρωματογραφία σε σύζευξη με 52

53 φασματόμετρο μάζας (πυρόλυση-σιλανοποίηση-gcms) χρησιμοποιήθηκαν από την Erika Ribechini και τους συνεργάτες της (211) για την διερεύνηση υδρολυόμενων και διαλυτών συστατικών σε αρχαιολογικά αποξηραμένα σύκα καθώς και σε σύγχρονα. Ο κύριος στόχος ήταν να μελετηθούν οι μεταβολές στην σύνθεση που μπορούν να υποστούν οι ιστοί των αποξηραμένων φρούτων σε ένα συγκεκριμένο αρχαιολογικό περιβάλλον. Τα αποξηραμένα σύκα βρέθηκαν σε ένα δοχείο και καλύπτονταν από μια στρώση ενός μίγματος από κίτρινη βαφή και γύψο. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων με GC-MS μεταξύ σύγχρονων και αρχαιολογικών δειγμάτων αποκάλυψε ότι έλαβαν χώρα αντιδράσεις αποικοδόμησης, οι οποίες οδήγησαν στην εξαφάνιση/μείωση των δραστικών (ακόρεστα λιπαρά οξέ και ευαίσθητων ενώσεων (φυτοστερόλες και τριτερπένι. Τα στοιχεία από την πυρόλυση-σιλανοποίηση-gc- MS παρέχουν σημαντικές ενδείξεις για την αποικοδόμηση των σακχαριτών και των λιπιδίων στους ιστούς των αποξηραμένων φρούτων από ένα εμπλουτισμένο υπόλειμμα με πολυφαινόλες και πολυεστέρες [8]. Η ανάλυση ειδικών ισοτοπικών ενώσεων (CSIA) λιπαρών οξέων είναι μία σχετικά νέα αναλυτική μέθοδος. Ωστόσο η CSIA των λιπαρών οξέων έχει καταστεί ως η μέθοδος επιλογής σε περιοχές όπου η ακρίβεια και η ακριβή γνώση της ισοτοπικής σύνθεσης σε φυσικό επίπεδο αφθονίας είναι σημαντική. Η CSIA των λιπαρών οξέων σε επίπεδο φυσικής αφθονίας παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη βιογενετική και γεωγραφική προέλευση των λιπιδίων και των ελαίων τα οποία είναι ανεκτίμητης αξίας για την αρχαιολογική έρευνα [81]. Για την μελέτη των διατροφικών συνηθειών ο Jorge E. Spangenberg και οι συνεργάτες του (25) μελέτησαν την κατανομή των λιπαρών οξέων και των σταθερών αναλογίας στα οργανικά υπολείμματα, χρησιμοποιώντας 3 θραύσματα αγγείων από την Νεότερη Νεολιθική εποχή ( π.χ.). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με σύγχρονα αντίστοιχα ζωικά και φυτικά λίπη. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν η GC-MS. Η συνολική σύνθεση του λίπους και η σταθερά ισοτοπικής σύνθεσης του παλμιτικού, στεατικού και ελαϊκού οξέος των οργανικών υπολειμμάτων που μελετήθηκαν, έδειξε ότι περιέχουν υπολείμματα φυτικής και ζωικής προέλευσης πιθανότητα μηρυκαστικών ζώων (βοοειδή και πρόβατ. Η παρουσία γάλακτος σε πολλά αγγεία αποδεικνύει την παραγωγή γάλακτος κατά τη διάρκεια της Νεότερης Νεολιθικής εποχής στην κεντρική Ευρώπη [82]. 53

54 Το 29 ο Dvory Namdar και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν οργανικά υπολείμματα, τα οποία προέρχονται από κεραμικά μαγειρικά αγγεία και πετρώματα χλωρίτη από την αρχαία πόλη του Merv. Σημαντικές ποσότητες των οργανικών υπολειμμάτων απορροφώνται από τα σκεύη χλωρίτη. Η πειραματική εργασία έδειξε ότι το πορώδες του χλωρίτη αυξάνεται κατόπιν θέρμανσης, ακόμη και σε χαμηλή θερμοκρασία μαγειρέματος. Αυτό επιτρέπει την απορρόφηση και την διατήρηση των οργανικών υπολειμμάτων σε δοχεία χλωρίτη. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε GC-MS. Η περίθλαση ακτίνων-χ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ορυκτολογία της πέτρας των μαγειρικών σκευών. Η μέτρηση του πορώδους χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν ποσοτικά οι διαφορές στο πορώδες μεταξύ των θερμαινόμενων και μη θερμαινόμενων προτύπων δειγμάτων [83]. Η GC και η GC-MS χρησιμοποιήθηκε από τους P. W. Blinkhorn και V. Denham (1995) για την ανίχνευση λιπιδίων σε κεραμικά δοχεία. Η ανάλυση των κεραμικών δοχείων έδειξε ότι περιείχαν δύο εντελώς διαφορετικούς τύπους λιπιδίων, δηλαδή ζωικό λίπος και κερί μέλισσας. Η μεγάλη αφθονία των κορεσμένων λιπαρών οξέων και των λιπαρών ακυλ ομάδων και οι αναλογίες τους C 18: προς C 16: επιβεβαιώνουν την παρουσία των λιπαρών οξέων. Η παρουσία τους, επιβεβαιώθηκε και από την παρουσία της χοληστερόλης. Με βάση τις πληροφορίες της κεραμικής, όπως η μορφή του δοχείου, η απανθράκωσή του, και η χρήση του βοηθούν στην αξιολόγηση των χημικών δεδομένων [84]. Αρκετές έρευνες έχουν γίνει για την μελέτη της αποικοδόμησης των λιπαρών οξέων ως αποτέλεσμα του μαγειρέματος και της μακροχρόνιας αποσύνθεσης και έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι ταυτοποίησης [85]. Ωστόσο η αέρια χρωματογραφία είναι μια αποτελεσματική και αποδοτική μέθοδος εξέτασης των λιπαρών οξέων με τη μορφή παραγώγων μεθυλεστέρα. Η οργανολογία είναι ευρέως διαθέσιμη και σχετικά φθηνή τόσο στην απόκτηση της όσο και στην λειτουργία της. Η αέρια χρωματογραφία έχει χρησιμοποιηθεί αρκετά για τον καθορισμό της σύνθεσης των λιπαρών οξέων σε αρχαιολογικά υπολείμματα. Ενώ η ταυτοποίηση δεν είναι απόλυτα δυνατή, ένα ευρύ φάσμα αρχαιολογικών υπολειμμάτων μπορούν να χαρακτηριστούν γρήγορα. Μίγματα λιπαρών οξέων από μαγειρικά υπολείμματα μεταβάλλονται με την πάροδο του χρόνου [13]. 54

55 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΟΡΓΑΝΑ-ΔΕΙΓΜΑΤΑ 6.1 Όργανα Για τον προσδιορισμό των οργανικών καταλοίπων με την τεχνική της αέριας χρωματογραφίας σε συνδυασμό με το φασματόμετρο μάζας χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο του αέριου χρωματογράφου 6873K της εταιρίας Agilent και του φασματόμετρου μάζας 5973 της εταιρίας Agilent. Ο διαχωρισμός των συστατικών στα μίγματα που χρησιμοποιήθηκαν με την GC-MS επιτυγχάνεται με βάση το χρόνο. Το όργανο του αέριου χρωματογράφου σε συνδυασμό με το φασματόμετρο μάζας αποτελείται από ένα θερμαινόμενο στόμιο εισαγωγής δείγματος, μία τριχοειδή ή πεπληρωμένη στήλη και τον ανιχνευτή. Αρχικά το δείγμα εισάγεται στον αέριο χρωματογράφο, από ένα θερμαινόμενο στόμιο εισαγωγής δείγματος, όπου το μίγμα των συστατικών εξαερώνεται. Η εισαγωγή γίνεται με μία μικροσύριγγα, διαμέσου ενός ελαστικού διαφράγματος, (septum). Τα συστατικά κινούνται μέσα στην στήλη, η οποία περιέχει ένα επίστρωμα στατικής φάσης. Η κίνηση των συστατικών μέσα στην στήλη γίνεται με διαφορετικές ταχύτητες, που εξαρτώνται από τις τάσεις ατμών των συστατικών και τις αλληλεπιδράσεις τους με την στατική φάση. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η DB-5MS με μήκος 3 m, εσωτερική διάμετρο 25 μm και επίστρωση στατικής φάσης,25 μm, με όρια θερμοκρασίας από -6 ο C μέχρι 325 ο C. Η στατική φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν poly(dimethlysiloxy) poly (1,4-bis(dimethylsiloxy)-phenylensiloxane. Λόγω του μεγάλου εύρους των ενώσεων που αναλύονται στα αρχαιολογικά δείγματα, η θέρμανση της στήλης γίνεται με προγραμματισμό της θερμοκρασίας, δηλαδή με σταθερή γραμμική αύξηση της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται ο διαχωρισμός των πτητικών συστατικών και η εμφάνιση μη διευρυμένων κορυφών για τις μεγαλομοριακές ενώσεις. Το φέρον αέριο διοχετεύεται στον αέριο χρωματογράφο μέσω κατάλληλων ρυθμιστών ροής και με μεγάλη πίεση. 55

56 Με τον ανιχνευτή γίνεται φανερή η παρουσία καθενός από τα συστατικά του δείγματος που εκλούονται στην στήλη. Ο ανιχνευτής καταγράφει τη μεταβολή μιας συγκεκριμένης φυσικής ιδιότητας δίνοντας κάποιο ηλεκτρικό σήμα ανάλογο της συγκέντρωσης ή της ταχύτητας ροής της ουσίας στο μίγμα. Τα αέρια μόρια που εξέρχονται από τον αέριο χρωματογράφο, εισέρχονται στην πηγή ιονισμού, όπου βομβαρδίζονται με μια δέσμη ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας. Η ενέργεια αυτή είναι ικανή να προκαλέσει την απώλεια ενός ηλεκτρονίου από το μόριο και να οδηγήσει στη διάσπαση συγκεκριμένων χημικών δεσμών. Ο ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι το φασματόμετρο μάζας με τετραπολικό αναλυτή μάζας. Αποτελείται από τέσσερις παράλληλες ράβδους, στις οποίες εφαρμόζεται συνεχή (dc) και εναλλασσόμενη (rf) τάση. Τα ιόντα που δημιουργούνται στην πηγή του φασματόμετρου εστιάζονται και διοχετεύονται στο χώρο μεταξύ των ράβδων του τετράπολου. Η κίνησή τους εξαρτάται από το ηλεκτρικό πεδίο που υπάρχει μεταξύ των ράβδων και τελικά οδηγούνται στον ανιχνευτή τα ιόντα που με λόγο m/z συντονίζονται με την τιμή του υπάρχοντος πεδίου. Η rf τάση μεταβάλλεται για να μεταφερθούν τα ιόντα με διαφορετικό λόγο m/z, να εστιαστούν και να δώσουν έτσι το φάσμα μαζών. Τα ιόντα διασχίζουν την περιοχή κατά μήκος του κεντρικού άξονα των ράβδων με ταλαντώσεις κατά την πορεία τους. Αυτές οι ταλαντώσεις έχουν σαν αποτέλεσμα τα ιόντα να κινούνται σε πολύπλοκες τροχιές ανάλογες με το λόγο m/z. Για να ολοκληρωθεί ανάλυση γίνεται διαδοχική σάρωση τιμών δυναμικού για την περιοχή m/z: 6 έως 7, που διαρκεί 1 min. Τέλος, οι χειρισμοί του οργάνου, οι διάφορες συνθήκες λειτουργίας και οι παράμετροι καθορίζονται με την βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή με κατάλληλο λογισμικό. Για την προκατεργασία των δειγμάτων και την εκχύλιση των προσδιοριζόμενων ουσιών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροεκχύλισης στερεής φάσης από την υπερκείμενη φάση (HS-SPME). Χρησιμοποιήθηκε SPME holder από την SUPELCO τύπου U (χειροκίνητο). Επίσης ίνα τύπου U (κόκκινη) 1μm PDMS (for Merlin Microseal). 56

57 Σχήμα 6.1: Προκατεργασία του δείγματος με την τεχνική της Μικροεκχύλισης Στερεής φάσης από την υπερκείμενη φάση (HS-SPME). 6.2 Δείγματα Το αρχαιολογικό δείγμα που χρησιμοποιήθηκε, προέρχεται από αρχαιολογική ανασκαφή στην περιοχή του Έβρου και χρονολογείται από την Ρωμαϊκή εποχή. Πρόκειται για ένα γυάλινο αγγείο (Σχήμα 6.2), το οποίο περιείχε εσωτερικά μια υπόλευκη ουσία. Σχήμα 6.2: Γυάλινο αγγείο το περιεχόμενο του οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των οργανικών υπολειμμάτων. Δείγμα υπόλευκης ουσία συλλέχθηκε από πέντε διαφορετικά σημεία (Α, Β, C, Z και Η) όπως φαίνεται και στο παραπάνω σχήμα. Για την ταυτοποίηση των οργανικών υπολειμμάτων χρησιμοποιήθηκαν σύγχρονα δείγματα. Τα δείγματα που 57

58 χρησιμοποιήθηκαν ήταν κερί (σκούρου και ανοικτού χρώματος και παραφίνης), γάλα, μέλι (συσκευασμένο εμπορικό και σπιτικό), καλαμποκέλαιο, ελαιόλαδο, φυτικό βούτυρο, ζωικό λίπος (σπιτικό), και ζωικό βούτυρο (βιομηχανίας). Πίνακας 6.1: Συγκεντρωτικός πίνακας των αρχαιολογικών υποδειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν. Αρχαιολογικά υποδείγματα Περιγραφή Αρχαιολογικό υποδείγμα Α Μικρή Δοξιπάρα 22, Ταφικός Τύμβος, Σημείο S- Καύση Α, Θραύσματα γυάλινου αγγείου Α1 Αρχαιολογικό υποδείγμα Β Μικρή Δοξιπάρα 22, Ταφικός Τύμβος, Σημείο S- Καύση Α, Θραύσματα γυάλινου αγγείου Α1 Αρχαιολογικό υποδείγμα C Μικρή Δοξιπάρα 22, Ταφικός Τύμβος, Σημείο S- Καύση Α, Θραύσματα γυάλινου αγγείου Α1 Αρχαιολογικό υποδείγμα Ζ Αρχαιολογικό υποδείγμα Η Δείγμα , Μικρή Δοξιπάρα 22, Γυάλινο αγγείο Α1 Δείγμα , Μικρή Δοξιπάρα 22, Γυάλινο αγγείο Α1 β) Σχήμα 6.3: Δείγματα Σύγχρονα δείγματα, κερί ανοικτού χρώματος, κερί σκούρου χρώματος, κερί παραφίνης, γάλα, συσκευασμένο εμπορικό μέλι, μέλι σπιτικό, καλαμποκέλαιο, ελαιόλαδο, φυτικό βούτυρο, ζωικό λίπος (σπιτικό) και ζωικό βούτυρο (βιομηχανίας), β) Αρχαιολογικά υποδείγματα Α, Β, C, Z και Η. 58

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ ΑΠΟ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΗ ΑΕΡΙΑ ΦΑΣΗ (HS-SPME) 7. 1 Εισαγωγή Η HS-SPME είναι μία διαδικασία ισορροπίας που περιλαμβάνει τον διαμερισμό των αναλυτών από την υδατική φάση στην αέρια φάση. Οι κρίσιμοι παράγοντες που επηρεάζουν την απόδοση της εκχύλισης είναι ο όγκος της υπερκείμενης φάσης, ο χρόνος της εκχύλισης, η θερμοκρασία, η ιοντική ισχύ του δείγματος και η ταχύτητα ανάδευσης [86]. Οι παράγοντες που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν ο χρόνος της HS-SPME, δηλαδή ο χρόνος που διαρκεί η προσρόφηση των διάφορων οργανικών ενώσεων πάνω στην ίνα, η θερμοκρασία που ορίζεται κατά την διάρκεια της προσρόφησης και η μάζα του δείγματος. Ο χρόνος εκχύλισης εκφράζει το διάστημα που απαιτείται ώστε η κατανομή των ουσιών ανάμεσα στις δύο φάσεις να φτάσει σε ισορροπία [86, 87]. Η αποδοτικότητα της εκχύλισης μπορεί να βελτιστοποιηθεί με την μεταβολή των συνθηκών του δείγματος, όπως η θερμοκρασία. Η αύξηση της θερμοκρασίας μπορεί να βελτιώσει την απόδοση σε καταστάσεις μη ισορροπίας αλλά μπορεί επίσης να ελαττώσει και τον συντελεστή κατανομής [86]. 7.2 Βελτιστοποίηση του χρόνου εκχύλισης HS-SPME Για την βελτιστοποίηση της HS-PME χρησιμοποιήθηκε το ίδιο δείγμα (αρχαιολογικό υποδείγμα C) και η ίδια ποσότητα δείγματος (,25 g) σε τρεις διαφορετικούς χρόνους έκθεσης της ίνας (1 min, 15 min και 2 min) αντίστοιχα, σε θερμοκρασία 6 ο C. Το δείγμα τοποθετήθηκε σε ειδικό δοχείο των 4 ml το οποίο έχει πώμα με ελαστικό διάφραγμα (septum) από PTFE. Η ίνα του SPME διαπερνά το ελαστικό διάφραγμα από PTFE και γίνεται η δειγματοληψία υπερκείμενης αέριας φάσης για 1, 15 και 2 λεπτά στους 6 ο C. Στον αέριο χρωματογράφο χρησιμοποιήθηκαν οι συνθήκες παροχή ηλίου 2 ml/min, διατήρηση της στήλης στους 6 ο C για 2 min και ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας (ramp) 15 ο C/min μέχρι τους 3 ο C για 1 min. Στο φασματόμετρο χρησιμοποιήθηκε ολική σάρωση των ιόντων. Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Στον παρακάτω 59

60 πίνακα (Πίνακας 7.1) φαίνονται συγκεντρωτικά οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν για την βελτιστοποίηση του χρόνου εκχύλισης της HS-SPME. Στα σχήματα 7.1 έως 7.3 φαίνονται τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται για κάθε περίπτωση, στο σχήμα 7.4 γίνεται σύγκριση των τριών χρωματογραφημάτων, ενώ στο σχήμα 7.5 δίνονται τα αντίστοιχα διαγράμματα ελέγχου για τρεις ενώσεις (εικοσανοϊκό οξύ, n- δεκαεπτανοϊκό οξύ και δεκαπεντανοϊκό οξύ). Πίνακας 7.1: Συγκεντρωτικός πίνακας συνθηκών για την βελτιστοποίηση του χρόνου εκχύλισης της HS-SPME. Δείγμα Μάζα (g) Χρόνος (min) Θερμοκρασία ( ο C) 1. Αρχαιολογικό υποδείγμα C, Αρχαιολογικό υποδείγμα C, Αρχαιολογικό υποδείγμα C, T IC: C 1 M IN 7 D E G.D 4 e e 7 3 e e 7 2 e e 7 1 e 7 Δεκαπεντανοϊκό οξύ n-δεκαεπτανοϊκό οξύ 5 Εικοσανοϊκό οξύ T ime --> Σχήμα 7.1: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα C (,25 g, 1 min, 6 ο C. 6

61 T IC: C 1 5 M IN 7 D E G.D 4 e e 7 3 e e 7 2 e e 7 Δεκαπεντανοϊκό οξύ n-δεκαεπτανοϊκό οξύ Εικοσανοϊκό οξύ 1 e 7 5 T im e --> Σχήμα 7.2: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα C (,25 g, 15 min, 6 ο C). T IC : C 2 M IN 7 D E G.D 4.5 e 7 4 e e 7 3 e 7 n-δεκαεπτανοϊκό οξύ 2.5 e 7 2 e e 7 Δεκαπεντανοϊκό οξύ Εικοσανοϊκό οξύ 1 e 7 5 T im e --> Σχήμα 7.3: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα C (,25 g, 2 min, 6 ο C). 61

62 ΑΦΘΟΝΙΑ ΑΦΘΟΝΙΑ Δεκαπεντανοϊκό οξύ 4 e e 7 T IC: C 1 M IN 7 D E G.D T IC: C 1 5 M IN 7 D E G.D (*) T IC: C 2 M IN 7 D E G.D (*) 3 e 7 n-δεκαεπτανοϊκό οξύ 2.5 e 7 2 e e 7 Εικοσανοϊκό οξύ 1 e 7 5 T ime --> Σχήμα 7.4: Σύγκριση των τριών χρωματογραφημάτων για 1, 15 και 2 min Εικοσανοϊκό οξύ ΧΡΟΝΟΣ HS-SPME (min) n-δεκαεπτανοϊκό οξύ ΧΡΟΝΟΣ HS-SPME (min) 62

63 ΑΦΘΟΝΙΑ Δεκαπεντανοϊκό οξύ ΧΡΟΝΟΣ HS-SPME (min) Σχήμα 7.5: Διαγράμματα ελέγχου της επίδρασης του χρόνου εκχύλισης HS-SPME για τρεις ενώσεις στο αρχαιολογικό υποδείγμα C (εικοσανοϊκό οξύ, n-δεκαεπτανοϊκό οξύ και δεκαπεντανοϊκό οξύ). Μελετήθηκαν οι χρόνοι των 1 min, 15 min και 2 min και η αποτίμηση τους έδειξε ως βέλτιστο χρόνο εκχύλισης HS-SPME τα 2 min. 7.3 Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας εκχύλισης HS-SPME Για την βελτιστοποίηση της HS-PME χρησιμοποιήθηκε το ίδιο δείγμα (αρχαιολογικό υποδείγμα Α) και η θέρμανση έγινε σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (35 ο C, 5 ο C και 6 ο C). Ο χρόνος έκθεσης της ίνας ήταν ίδιος και στα τρία δείγματα (15 min). Τοποθετήθηκαν τα δείγματα σε ειδικά δοχεία των 4 ml τα οποία έχουν πώμα με ελαστικό διάφραγμα (septum) από PTFE. Η ίνα του SPME διαπερνά το ελαστικό διάφραγμα από PTFE και γίνεται η δειγματοληψία υπερκείμενης αέριας φάσης στους 35 ο C, 5 ο C και 6 ο C για 15 λεπτά. Στον αέριο χρωματογράφο χρησιμοποιήθηκαν οι συνθήκες παροχή ηλίου 2 ml/min, διατήρηση της στήλης στους 6 ο C για 2 min και ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας (ramp) 15 ο C/min μέχρι τους 3 ο C για 1 min. Στο φασματόμετρο χρησιμοποιήθηκε ολική σάρωση των ιόντων. Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 7.2) φαίνονται συγκεντρωτικά οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν για την βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας εκχύλισης της HS-SPME. Στα σχήματα 7.6 έως 7.8 φαίνονται τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται για κάθε περίπτωση, ενώ στο σχήμα 7.9 δίνονται τα αντίστοιχα διαγράμματα ελέγχου για τρεις ενώσεις (εννεανοϊκό οξύ, διαιθυλο φθαλικό και δεκαεπτανοϊκό οξύ). 63

64 Δεκαπεντανοϊκό οξύ Εννεανοϊκό οξύ Διαιθυλοφθαλικό Δεκαεπτανοϊκό οξύ Πίνακας 7.2: Συγκεντρωτικός πίνακας συνθηκών για την βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας εκχύλισης της HS-SPME. Δείγματα Μάζα (g) Χρόνος (min) Θερμοκρασία ( ο C) 1. Αρχαιολογικό υποδείγμα Α, Αρχαιολογικό υποδείγμα Α, Αρχαιολογικό υποδείγμα Α, e 7 T IC : A,B,Z 1 5 M IN 4 D E G.D 4 e e 7 3 e e 7 2 e e 7 1 e 7 5 T im e --> Σχήμα 7.6: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα Α (,11 g, 15 min, 35 ο C). T IC: C 1 5 M IN 7 D E G.D 4 e e 7 3 e e 7 Διαιθυλοφθαλικό 2 e 7 Εννεανοϊκό οξύ 1.5 e 7 1 e T im e --> Σχήμα 7.7: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα Α (,12 g, 15 min, 5 ο C). 64

65 ΑΦΘΟΝΙΑ ΑΦΘΟΝΙΑ Δεκαεπτανοϊκό οξύ Abundanc e TIC: ARCHAIOLOGIKO C.D 2.5e7 2e7 Διαιθυλοφθαλικό 1.5e7 1e7 Εννεανοϊκό οξύ 5 Time--> Σχήμα 7.8: Χρωματογράφημα για το αρχαιολογικό υποδείγμα Α (,25 g, 15 min, 6 ο C) Εννεανοϊκό οξύ 35 oc 5 oc 6 oc ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ HS-SPME ( o C) Διαιθυλοφθαλικό 35 oc 5 oc 6 oc ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ HS-SPME ( o C) 65

66 ΑΦΘΟΝΙΑ Δεκαεπτανοϊκό οξύ oc 5 oc 6 oc ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ HS-SPME ( o C) Σχήμα 7.9: Διαγράμματα ελέγχου της επίδρασης της θερμοκρασίας εκχύλισης HS- SPME για τρεις ενώσεις στο αρχαιολογικό υποδείγμα Α (εννεανοϊκό οξύ, διαιθυλοφθαλικό και δεκαεπτανοϊκό οξύ ). Μελετήθηκαν οι θερμοκρασίες των 35 ο C, 5 ο C και 6 ο C και η αποτίμησή τους έδειξε ως βέλτιστη θερμοκρασία εκχύλισης HS-SPME τους 6 ο C. 7.4 Βελτιστοποίηση της μάζας του δείγματος στην εκχύλιση (HS-SPME) Για την βελτιστοποίηση της HS-PME χρησιμοποιήθηκε το ίδιο δείγμα (φυτικό βούτυρο) με διαφορετική ποσότητα, στην ίδια θερμοκρασία (5 ο C) και στο ίδιο χρόνο έκθεσης της ίνας (1 min). Τοποθετήθηκαν τα δείγματα σε ειδικά δοχεία των 4 ml τα οποία έχουν πώμα με ελαστικό διάφραγμα (septum) από PTFE. Η ίνα του SPME διαπερνά το ελαστικό διάφραγμα από PTFE και γίνεται η δειγματοληψία υπερκείμενης αέριας φάσης στους 5 ο C για 1 λεπτά. Στον αέριο χρωματογράφο χρησιμοποιήθηκαν οι συνθήκες παροχή ηλίου 2 ml/min, διατήρηση της στήλης στους 6 ο C για 2 min και ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας (ramp) 15 ο C/min μέχρι τους 3 ο C για 1 min. Στο φασματόμετρο χρησιμοποιήθηκε ολική σάρωση των ιόντων. Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 7.3) φαίνονται συγκεντρωτικά οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν για την βελτιστοποίηση της μάζας του δείγματος στην εκχύλιση της HS-SPME. Στα σχήματα 7.1 και 7.11 φαίνονται τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται για κάθε περίπτωση, ενώ στο σχήμα 7.12 δίνονται τα αντίστοιχα διαγράμματα ελέγχου για τρεις ενώσεις (2-ενδεκενάλη, 2,4-δεκαδιενάλη και 4- οξοεννεανάλη). 66

67 2-ενδεκενάλη Πίνακας 7.3: Συγκεντρωτικός πίνακας συνθηκών για την βελτιστοποίηση της μάζας του δείγματος στην εκχύλισης (HS-SPME). Δείγμα Μάζα (g) Χρόνος (min) Θερμοκρασία ( ο C) 1. Φυτικό βούτυρο, Φυτικό βούτυρο,5 1 5 T IC: FY T IK O B O Y T Y R O 1 5 M G.D ,4-δεκαδιενάλη 4-οξοεννεανάλη T ime --> Σχήμα 7.1: Χρωματογράφημα για το φυτικό βούτυρο (,15 g, 1 min, 5 ο C). 9 T IC: FY T IK O B O Y T Y R O 5 M G.D 2-ενδεκενάλη 2,4-δεκαδιενάλη οξοεννεανάλη T ime --> Σχήμα 7.11 Χρωματογράφημα για το φυτικό βούτυρο (,5 g, 1 min, 5 ο C). 67

68 ΑΦΘΟΝΙΑ ΑΦΘΟΝΙΑ ΑΦΘΟΝΙΑ ενδεκενάλη 15 5 ΜΑΖΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ (mg) 12 2,4-δεκαδιενάλη ΜΑΖΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ (mg) 6 4-οξοεννεανάλη ΜΑΖΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ (mg) Σχήμα 7.12: Διαγράμματα ελέγχου της επίδρασης της μάζας του δείγματος στην εκχύλιση HS-SPME για τρεις ενώσεις σε σύγχρονο δείγμα, φυτικό βούτυρο (2- ενδεκενάλη, 2,4-δεκαδιενάλη και 4-οξοεννεανάλη). Μελετήθηκαν οι μάζες των 15 mg και 5 mg και η αποτίμησή τους έδειξε ως βέλτιστη μάζα δείγματος στην εκχύλιση HS-SPME τα 5 mg. 68

69 7.5 Συμπεράσματα επί της βελτιστοποίησης της HS-SPME Από την παραπάνω μελέτη βελτιστοποίησης της HS-SPME προέκυψαν τα ακόλουθα συμπεράσματα: σχετικά με το χρόνο της εκχύλισης παρατηρήθηκε ότι καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται σε χρόνο 2 λεπτών, β) όσον αφορά στη θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιείται η HS-SPME, τα καλύτερα αποτελέσματα λήφθηκαν σε θερμοκρασία 6 ο C και γ) όσον αφορά την μάζα του δείγματος που χρησιμοποιείται στην HS-SPME, τα καλύτερα αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μάζα δείγματος 5 mg. Πίνακας 7.4: Συγκεντρωτικός πίνακας βέλτιστων συνθηκών της HS-SPME. Παράμετρος Περιοχή τιμών Βέλτιστη τιμή Χρόνος της HS-SPME 1 min, 15 min, 2 min 2 min Θερμοκρασία της HS-SPMΕ 35 o C, 5 o C, 6 o C 6 o C Μάζα δείγματος HS-SPM 15 mg, 5 mg 5 mg 69

70 Βουτανοϊκό οξύ Επτανάλη Οκτανάλη Εννεανάλη Οκτανοϊκό οξύ Εννεανοϊκό οξύ Δεκατετρανοϊκό οξύ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο ΑΝΑΛΥΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ GC-MS 8.1 Ανάλυση χρωματογραφημάτων GC-MS από αρχαιολογικά υποδείγματα και ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων Σε κάθε φιαλίδιο που φέρει πώμα με ελαστικό διάφραγμα από PTFE τοποθετήθηκαν περίπου,5 g από κάθε αρχαιολογικό υποδείγμα και ακολούθησε η τεχνική της HS-SPME για 2 λεπτά, σε θερμοκρασία 6 o C. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε στον αέριο χρωματογράφο συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) και η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε αυτήν την περίπτωση φαίνονται στα σχήματα 8.1 έως 8.5 που ακολουθούν. T IC: A R CH A IO L O G IK O A.D 1.8 e e e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ Εικοσανοϊκό οξύ 1 e 7 Δεκαεπτανοϊκό οξύ 8 C 9 H 18 O 2 Δεκαοκτανοϊκό οξύ 6 4 C 6 H 1 O 4 C 16 H 22 O 4 2 T ime --> Σχήμα 8.1: Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση του αρχαιολογικού υποδείγματος Α και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. 7

71 C 12 H 18 N 2 O C 7 H 14 O C 8 H 16 O C 9 H 18 O Οκτανοϊκό οξύ C 1 H 2 O 2-οκτανοϊκό οξύ C 11 H 22 O n-δεκανοϊκό οξύ Δωδεκανάλη C 13 H 26 O C 14 H 18 O C 15 H 2 O Πεντανοϊκό οξύ Εξανόλη Επτανάλη Εννεανάλη Επτανοϊκό οξύ Οκτανοϊκό οξύ Δεκανάλη 2-δεκανόνη Ενδεκανάλη Δωδεκανάλη Εικοσανοϊκό οξύ T IC : A R C H A IO L O G IK O B.D 2.6 e e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ Δεκαοκτανοϊκό οξύ 2 e 7 Δεκαεπτανοϊκό οξύ 1.8 e e e 7 C 9 H 16 O 2 C 24 H 38 O e 7 1 e C 3 H 7 NO 3 C 8 H 18 C 3 H T im e --> Σχήμα 8.2: Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση του αρχαιολογικού υποδείγματος Β και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Abundanc e TIC: ARCHAIOLOGIKO C.D 2.5e7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ Δεκαοκτανοϊκό οξύ 2e7 C 12 H 14 O 4 Εννεανοϊκό οξύ 1.5e7 Δεκαεπτανοϊκό οξύ 1e7 C 19 H 24 N 2 5 Εικοσανοϊκό οξύ Time--> C 12 H 22 O 2 Σχήμα 8.3: Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση του αρχαιολογικού υποδείγματος C και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. 71

72 επτανοϊκό οξύ 2-δεκανόνη οκτανοϊκό οξύ Επτανάλη Επτανοϊκό οξύ Ενδεκανάλη Εννεαννικό οξύ Ενδεκανοϊκό οξύ Δεκατριενάλη Δεκατετρανάλη Δεκαπεντανάλη Δεκατετρανοϊκό οξύ Δεκαπεντανοϊκό οξύ Abundanc e TIC: ARCHAIOLOGIKO Z.D 2.5e7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ 2e7 1.5e7 1e7 5 Εννεανάλη C 19 H 24 N 2 C 7 H 12 O 2 Δεκανάλη C 9 H 16 O 2 Δεκαοκτανοϊκό οξύ Δεκαεπτανοϊκό οξύ Εικοσανοϊκό οξύ Time--> Σχήμα 8.4: Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση του αρχαιολογικού υποδείγματος Z και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. T I C : A R C H A I O L O G I K O H. D 3 e e e e e 7 2 e e e e e 7 1 e Δεκαοκτανοϊκό οξύ ή στεατικό οξύ n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ Εννεανάλη C 9 H 16 O 2 Δεκαοκτανοίκό οξύ ή ελαϊκό οξύ T im e --> Σχήμα 8.5: Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση του αρχαιολογικού υποδείγματος H και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Στα σχήματα 8.6 έως 8.34 δίνονται τα φάσματα MS, καθώς και η βάση φασμάτων μάζας NIST για την κάθε ένωση που αποτελεί συστατικό των αρχαιολογικών υποδειγμάτων. 72

73 Abundanc e Sc an 354 (2.631 min): ARCHAIOLOGIKO A.D (-345) (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.6: Φάσμα MS της ένωσης βουτανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 2,633 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 8,8 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n 3 6 ( m in ): A R C H A IO L O G IK O B.D ( ) (-) m / z-->

74 β) Σχήμα 8.7: Φάσμα MS της ένωσης πεντανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 2,674 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 66,9 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e 1 Sc an 893 (6.516 min): AR CH AIOLOGIKO Z.D m/ z--> β) Σχήμα 8.8: Φάσμα MS της ένωσης επτανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 6,55 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 8,2 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 74

75 S c a n 1 9 ( min ): A R CH A IO L O G IK O A.D ( ) (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.9: Φάσμα MS της ένωσης οκτανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 7,364 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 86,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A IO L O G IK O Z.D ( ) (-) m / z -->

76 β) Σχήμα 8.1: Φάσμα MS της ένωσης εννεανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 8,462 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 91,6 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ) : A R C H A I O L O G I K O C. D ( ) ( - ) m / z - - > β) Σχήμα 8.11: Φάσμα MS της ένωσης n-δεκανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 9,177 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 85,6 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 76

77 S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O Z. D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.12: Φάσμα MS της ένωσης ενδεκανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 1,27 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 69, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O Z. D ( ) (-) m / z -->

78 β) Σχήμα 8.13: Φάσμα MS της ένωσης δωδεκανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 1,281 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 55,7 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A IO L O G IK O Z.D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.14: Φάσμα MS της ένωσης δεκατετρανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 12,295 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 89, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 78

79 S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O Z. D ( ) ( - ) β) m / z - -> Σχήμα 8.15: Φάσμα MS της ένωσης δεκαπεντανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 12,912 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 92, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O Z. D ( ) (-) m / z -->

80 β) Σχήμα 8.16: Φάσμα MS της ένωσης n-δεκαεξανοϊκό οξύ (παλμιτικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,41 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 8,5 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e Sc an 21 ( min): AR CH AIOLOGIKO Z.D (-22) (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.17: Φάσμα MS της ένωσης δεκαεπτανοϊκό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 14,53 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 8

81 91,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e 22 Sc an 281 (15.81 min): AR CH AIOLOGIKO Z.D m/ z--> β) Σχήμα 8.18: Φάσμα MS της ένωσης δεκαοκτανοϊκό οξύ (στεατικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 15,51 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 8,2 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O Z. D ( ) (-) m / z -->

82 β) Σχήμα 8.19: Φάσμα MS της ένωσης εικοσανοϊκό οξύ (αραχιδικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 16,35 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 87,5 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e Sc an 373 (2.768 min): AR CH AIOLOGIKO B.D (-37) (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.2: Φάσμα MS της ένωσης εξανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 2,763 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 68,9 %, 82

83 δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n 5 4 ( m in ): A R C H A IO L O G IK O B.D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.21: Φάσμα MS της ένωσης επτανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 3,961 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 79,1 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O A. D (-7 7 ) (-) m / z -->

84 β) Σχήμα 8.22: Φάσμα MS της ένωσης οκτανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 5,223 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 93,1 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n (6.4 8 m in ): A R C H A IO L O G IK O A.D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.23: Φάσμα MS της ένωσης εννεανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 6,428 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 88, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 84

85 S c a n (7.4 9 min ): A R CH A IO L O G IK O B.D ( ) (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.24: Φάσμα MS της ένωσης δεκανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 7,485 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 72, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A IO L O G IK O B.D ( ) (-) m / z -->

86 β) Σχήμα 8.25: Φάσμα MS της ένωσης ενδεκανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 8,477 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 68,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O B. D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.26: Φάσμα MS της ένωσης δωδεκανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 9,41 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 51, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 86

87 S c a n ( m in ): A R C H A I O L O G I K O C. D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα 8.27: Φάσμα MS της ένωσης δεκατριενάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 1,265 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 54,3 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A R C H A IO L O G IK O Z.D ( ) (-) m / z--> 87

88 β) Σχήμα 8.28: Φάσμα MS της ένωσης δεκατετρανάλη. Η ανίχνευση έγινε στα 11,82 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 38,8 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. β) Abundanc e Sc an 18 (7.346 min): AR CH AIOLOGIKO B.D (-11) (-) m/ z--> Σχήμα 8.29: Φάσμα MS της ένωσης 2-δεκανόνη. Η ανίχνευση έγινε στα 7,342 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 83,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 88

89 S c a n ( m in ): A R C H A IO L O G IK O Z.D ( ) (-) β) m / z --> Σχήμα 8.3: Φάσμα MS της ένωσης 2-δεκαπεντανόνη. Η ανίχνευση έγινε στα 11,753 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 93,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e Sc an 2376 (17.27 min): A,B,Z 15 M IN 4D EG.D m/ z-->

90 β) Σχήμα 8.31: Φάσμα MS της ένωσης δεκαεξανοϊκό οξύ, 1-(υδροξυμεθυλ)-1,2- αιθανεδιυλεστέρας. Η ανίχνευση έγινε στα 17,27 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 49,6 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ) : A, B, Z 1 5 M I N 4 D E G. D m / z - - > β) Σχήμα 8.32: Φάσμα MS της ένωσης δεκαεξανοϊκό οξύ, δωδεκυλεστέρας. Η ανίχνευση έγινε στα 19,67 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 9

91 MS της NIST ήταν 62, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. A bundanc e 14 S c an 249 (18.29 min ): A,B,Z 1 5 M IN 4 D E G.D... (-) m/ z--> β) Σχήμα 8.33: Φάσμα MS της ένωσης δεκαεξανοϊκό οξύ, βουτυλεστέρας. Η ανίχνευση έγινε στα 18,29 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 19,9 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): A, B, Z 1 5 M I N 4 D E G. D... (-) m / z -->

92 β) Σχήμα 8.34: Φάσμα MS της ένωσης δεκαεξανοϊκό οξύ, τετραδεκυλεστέρας. Η ανίχνευση έγινε στα 2,436 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 24,9 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Στον πίνακα 8.1 φαίνονται συγκεντρωτικά κάποιες από τις οργανικές ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στα αρχαιολογικά υποδείγματα. 92

93 Πίνακας 8.1: Οργανικές ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στα αρχαιολογικά υποδείγματα. Συστατικά Σημείο δειγματοληψίας επί του υλικού RT (min) A B C Z H ΟΞΕΑ C 4 H 8 O 2 ή βουτανοϊκό οξύ 2,633 C 5 H 1 O 2 ή βαλερικό οξύ 2,674 C 7 H 14 O 2 ή ενανθικό οξύ 6,55 C 8 H 16 O 2 ή καπριλικό οξύ 7,364 C 9 H 18 O 2 ή πελαργονικό οξύ 8,462 C 1 H 2 O 2 ή καπρικό οξύ 9,177 C 11 H 22 O 2 ή εδεκανοϊκό οξύ 1,23 C 12 H 24 O 2, λαουρικό οξύ 1,281 C 14 H 28 O 2 ή μυριστικό οξύ 12,295 C 15 H 3 O, δεκαπεντανοϊκό οξύ 12,912 C 16 H 32 O 2, παλμιτικό οξύ 14,41 C 17 H 34 O 2 ή μαργαρικό οξύ 14,538 C 18 H 36 O 2 ή στεατικό οξύ 15,51 C 2 H 4 O 2 ή αραχιδικό οξύ 16,35 ΑΛΔΕΫΔΕΣ C 6 H 12 O (εξανάλη) 2,763 C 7 H 14 O (επτανάλη) 3,961 C 8 H 16 O (οκτανάλη) 5,223 C 9 H 18 O (εννεανάλη) 6,428 C 1 H 2 O (δεκανάλη) 7,485 93

94 C 11 H 22 O (ενδεκανάλη) 8,477 C 12 H 24 O (δωδεκανάλη) 9,41 C 13 H 26 O (δεκατριανάλη) 1,265 C 14 H 28 O (δεκατετρανάλη) 11,82 ΚΕΤΟΝΕΣ C 1 H 2 O (δεκανόνη) 7,342 C 15 H 3 O (δεκαπεντανόνη) 11,753 ΕΣΤΕΡΕΣ C 35 H 68 O 5 17,27 C 2 H 4 O 2 18,29 C 28 H 56 O 2 19,67 C 3 H 6 O 2 2,436 Ανιχνεύτηκαν σε όλα τα υποδείγματα μια σειρά από κορεσμένα λιπαρά οξέα περιλαμβάνοντας οξέα με μικρή αλυσίδα ατόμων άνθρακα, ενώ ανιχνεύθηκε ένα οξύ με μακριά αλυσίδα, το εικοσανοϊκό οξύ. Η απουσία άλλων οξέων αποδίδεται σε μικροβιακή δράση ή στην διαλυτοποίηση και απομάκρυνση τους από τα υπόγεια νερά. Δεν ανιχνεύθηκαν ακόρεστα οξέα, εκτός από το υπόδειγμα Η, στο οποίο βρέθηκε ελαϊκό οξύ, που σημαίνει ότι έχουν κορεστεί. Από τα οξέα με μικρή αλυσίδα ατόμων άνθρακα ξεχωρίζουν το παλμιτικό (C 16: ) και το στεατικό οξύ (C 18: ), τα οποία είναι κύρια συστατικά ελαιωδών και λιπαρών ουσιών. Όπως παρατηρείται από τα παραπάνω χρωματογραφημάτα το εμβαδόν της κορυφής του παλμιτικού οξέος είναι πολύ μεγαλύτερο από το εμβαδόν της κορυφής του στεατικού οξέος για όλα τα υποδείγματα εκτός από το Α. Η μεγάλη αναλογία του παλμιτικού οξέος σε σχέση με το στεατικό οξύ στα τέσσερα αυτά υποδείγματα ενισχύει την άποψη της παρουσίας ουσίας φυτικής προέλευσης. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία η παρουσία των οξέων C 8:, C 9:, C 1:, C 12: μαζί με την ταυτόχρονη παρουσία των C 14: και C 18: αποτελεί ένδειξη παρουσίας γάλακτος η οποία όμως μπορεί να επιβεβαιωθεί μόνο με ανάλυση του δείγματος με την τεχνική της αέριας χρωματογραφίας φασματομετρίας μαζών 94

95 ισοτοπικής αναλογίας με ενδιάμεση καύση. Ωστόσο, τα ζωικά λιπαρά κατάλοιπα που περιέχουν χαρακτηριστικά μικρότερης αλυσίδας λιπαρά οξέα, σπάνια ανιχνεύονται. Πιθανή εξήγηση για αυτό είναι ότι είτε τα γαλακτοκομικά προϊόντα δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε μεγάλο βαθμό, είτε έχουν τροποποιηθεί λόγω της αποσύνθεσης και έχουν καταστεί δυσδιάκριτα. Δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα από τα πέντε υποδείγματα n-αλκάνια. Η απουσία των n-αλκανίων χαμηλού μοριακού βάρους πιθανότητα οφείλεται στην εξάχνωσή τους (λόγω του χαμηλού σ.τ.) με το πέρασμα του χρόνου ή κατά τη θέρμανση. Επίσης ανιχνευθήκαν εστέρες, οι οποίοι πιθανόν να οφείλονται στην παρουσία κεριού. Η βασική κορυφή που εμφανίζουν οι εστέρες κηρών μέλισσας σε m/z 257 αντιστοιχεί στο ιόν [C 15 H 31 CO 2 H 2 ], το οποίο προκύπτει με διπλή μετάθεση υδρογόνου από την εστερική πλευρά του καρβοξυλίου και απώλεια της αντίστοιχης ρίζας αλκυλίου. Η ταυτοποίηση όμως του κεριού μέλισσας στα αρχαιολογικά ευρήματα βασίζεται γενικά στην παρουσία μίγματος αλκυλοενώσεων μακριάς αλυσίδας περιλαμβάνοντας εστέρες κηρών, αλκοόλες μακριάς αλυσίδας, καθώς και n-αλκάνια. Από την συγκεκριμένη ανάλυση δεν προέκυψαν αλκοόλες μακριάς αλυσίδας, ούτε n-αλκάνια όποτε πιθανόν η αρχική ένωση να μην είναι κερί μέλισσας. Τέλος η παρουσία αλδεΰδών, κετονών και εστέρων είναι ένδειξη ότι το δείγμα δεν έχει οξειδωθεί, αλλά αντίθετα έχει αναχθεί. 8.2 Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε σύγχρονα δείγματα Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα μελιού Σε κάθε φιαλίδιο που φέρει πώμα με ελαστικό διάφραγμα από PTFE τοποθετήθηκαν,5 g μελιού και ακολούθησε η τεχνική της HS-SPME για 2 λεπτά, σε θερμοκρασία 6 o C. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε στον αέριο χρωματογράφο συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) και η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε αυτήν την περίπτωση φαίνονται στα σχήματα και που ακολουθούν. 95

96 C 16 H 32 O Ολεϊκό οξύ C 12 H 18 N 2 O 1-δεκαπεντάνιο Εικοσιτετράνιο n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή πλαμιτικό οξύ C 18 H 33 ClN 2 O 5 S Δωδεκανοϊκό οξύ C 9 H 18 Cl 3 O 4 P T IC : M E L I A T T IK H.D 4.5 e 7 4 e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ 3 e e 7 2 e e 7 1 e 7 5 C 8 H 8 O C 12 H 18 N 2 O C 6 H 8 O 4 Δεκατετρανοϊκό οξύ C 16 H 22 O 4 C 18 H 35 NO 4 C 19 H 4 Εικοσιδυάνιο Ολεϊκό οξύ Εικοσιτριάνιο C 24 H 38 O 4 Εικοσιπεντάνιο C 3 H 5 T im e --> Εικοσιεπτάνιο C C Εικοσάνιο 21 H 19 H 2 O 4 44 C18 H 26 O 6 Δεκαοκτανοϊκό οξύ Εικοσιεξάνιο Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος συσκευασμένου εμπορικού μελιού και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. T IC : M E L I S P IT IK O.D 4.5 e 7 4 e e 7 C 12 H 14 O 4 3 e e 7 2 e e 7 1 e 7 C 6 H 6 O 3 C 1 H 2 O C 6 H 6 O 4 C 8 H 8 O 2 C 9 H 1 O 4 2-δεκαπεντανόνη Δεκαπεντανοϊκό οξύ Δεκατετρανοϊκό οξύ 6-δεκαοκτανοϊκό οξύ Δεκαοκτανοϊκό οξύ Εικοσιεξάνιο C 6 H 8 O 4 C 3 H 5 5 C 29 H 6 T im e --> C 9 H 18 Cl 3 O 4 P Δωδεκανάλη Εικοσιεπτάνιο Δωδεκανοϊκό οξύ C 24 H 38 O Δεκατριενάλη 4 Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος σε σπιτικό μέλι και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Στο σχήμα γίνεται σύγκριση των χρωματογραφημάτων που προκύπτουν από τα δύο δείγματα μελιού που χρησιμοποιήθηκαν. Παρατηρείται ότι και για τα δύο δείγματα λαμβάνονται πανομοιότυπα χρωματογραφήματα, ωστόσο στο χρωματόγράφημα που αντιστοιχεί στο σπιτικό μέλι λαμβάνονται υψηλότερες κορυφές για τα λιπαρά οξέα που ανιχνεύτηκαν. 96

97 2-δεκαπεντανόνη Δεκαοκτανοϊκό οξύ ή ελαϊκό οξύ Δεκαοκτανοϊκό οξύ ή στεατικό οξύ Εικοσιτετράνιο Εικοσιεξάνιο Εικοσιεπτάνιο Abundanc e 1.6e7 T IC: M ELI SPIT IKO.D T IC: M ELI AT T IKH.D (*) 1.4e7 1.2e7 1,2-βενζολοδικαρβοξυλικό οξύ, διισοκτυλο εστέρας 1e7 8 Δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ υδροξυμεθυλο-2-φουρανοκαρβοξαλδεΰδη Βενζοοξικό οξύ 2 T ime--> Εικοσιπεντάνιο Εικοσιτριάνιο Δεκατετρανοϊκό οξύ ή μυριστικό οξύ Σχήμα : Σύγκριση των χρωματογραφημάτων για τα δείγματα μελιού (συσκευασμένο εμπορικό και σπιτικό). Στα σχήματα έως δίνονται μερικά από τα φάσματα MS, καθώς και η βάση φασμάτων μάζας NIST για την κάθε ένωση που αποτελεί συστατικό του εκχυλίσματος μελιού. S c a n ( m in ): M E L I S P I T I K O. D m / z -->

98 β) Σχήμα : Φάσμα MS της 5-υδροξυμεθυλο-2-φουρανοκαρβοξαλδεΰδη. Η ανίχνευση έγινε στα 7,663 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 82,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 1 1 S c a n ( m in ): M E L I S P IT IK O.D m / z--> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης n-δεκαεξανοϊκό οξύ (παλμιτικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 13,596 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 98

99 MS της NIST ήταν 84,7 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): M E L I S P IT IK O.D (-2 2 ) (-) m / z--> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δεκαοκτανοϊκό οξύ (ελαϊκό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,67 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 22,6 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): M E L I A T T IK H.D m / z --> 99

100 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δεκαοκτανοϊκό οξύ (στεατικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,662 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 72, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 8.2) φαίνονται συγκεντρωτικά όλες οι ενώσεις που ανιχνεύτηκαν σε δείγματα μελιού, ο χρόνος συγκράτησής τους, καθώς και το ποσοστό στο οποίο περιέχονται. 1

101 Πίνακας 8.2: Ενώσεις που ανιχνεύτηκαν σε συσκευασμένο εμπορικό μέλι και στο σπιτικό, ο χρόνος συγκράτησής τους και το ποσοστό στο οποίο περιέχονται. Ενώσεις που ανιχνεύθηκαν σε συσκευασμένο εμπορικό μέλι Ενώσεις που ανιχνεύθηκαν στο σπιτικό μέλι Ενώσεις Χρόνος συγκράτησης (min) Πιθανότητα (%) Χρόνος συγκράτησης (min) Πιθανότητα (%) 4H-πυραν-4-όνη,2,3-διϋδρο-3,5-διυδροξυ-6-μεθυλο- 6,834 94,5 6,87 96,1 4H-πυραν-4-όνη,3,5-διυδρυ-2-μεθυλο- 7,295 74,5 2-υδροξυμεθυλο-2-φουρανοκαρβοξαλδεΰδη 7,562 79,3 7,663 82,4 Βενζοοξικό οξύ 7,886 48,9 Βενζολιοαλκεταλδεΰδη (benzeneacetaldehyde) 5,72 48,5 Βενζαλδεΰδη, 4-υδροξυ-3,5-διμεθοξυ 11,447 78,5 Δεκανάλη 7,468 37,2 Δεκανοϊκό οξύ, δεκυλεστέρας 11,318 21,5 Ενδεκανοϊκό οξύ 13,69 11,4 Ισοπροτουρόν 4,952 88,3 9,674 83,3 Δωδεκανοϊκό οξύ (dodecanoic acid) 1,64 9,6 1,647 88,9 Δωδεκανάλη 9,38 48,5 Δεκατετρανοϊκό οξύ 12,147 85,4 12,154 88,5 Δεκατριενάλη 1,251 47,1 Δεκατετρανάλη 11,73 24,7 Φαινόλη 2,4-δις (1,1-διμεθυλαιθυλ) - 1,287 27,1 Δεκαπεντανοϊκό οξύ 12,853 7,3 1-δεκαπεντένιο 1,17 25,5 2-δεκαπεντανόνη 11,721 8,5 Οξιράνιο, τετραδεκυλο 11, n-δεκαεξανοϊκό οξύ 13,574 82,5 13,596 84,7 Δεκαεννεάνιο 13,141 28,3 Εικοσάνιο 13,79 43,6 Ελαϊκό οξύ 14,662 21,4 14,67 22,6 Δεκαοκτανοϊκό οξύ (octadecanoic acid) 14,792 72, 14,792 75,7 Εικοσιενάνιο (heneicosane) 14,417 44,1 Εικοδιδυάνιο (docosane) 15,16 35,2

102 Εικοσιτριάνιο 15,592 42,3 15,67 48,9 Εικοσιτετράνιο 16,148 41, Εικοσιπεντάνιο 16,674 22,4 Εικοσιεξάνιο 17,186 44,8 17,186 32,4 Εικοσιεπτάνιο 17,676 37,5 17,674 38,5 Εικοσιεννεάνιο 18,671 37,9 2-προπανόλη, 1-χλωρο-, φωσφορικό (3:1) 12,471 56,3 12,478 53,3 1,2-βενζολοδικαρβοξυλικό οξύ, διοκτυλεστέρας 16,962 34,9 1,2-βενζολοδικαρβοξυλικό οξύ, δις (2-μεθυλοπροπυλ) εστέρας 12,932 13,7 Βενζυλοβούτυλο φθαλικό 15,938 83, 2-προπενοϊκό οξύ, 2-μεθυλ, 2-αιθυλο-2 13,963 96,3 Το μέλι, από χημική άποψη, αποτελείται από σάκχαρα, νερό, οργανικά οξέα, ένζυμα, ανόργανα συστατικά, πρωτεΐνες, ελεύθερα αμινοξέα, λιπίδια και βιταμίνες. Η HMF (5-υδροξυμεθυλο-2-φουρανοκαρβοξαλδεΰδη), είναι η σημαντικότερη και αφθονότερη ουσία από αυτές που ανήκουν στα παράγωγα του φουρανίου και που υπάρχουν στο μέλι. Οι ουσίες αυτές παράγονται κατά τη θέρμανση των σακχάρων του μελιού ή από την επίδραση της παρατεταμένης αποθήκευσης αυτού. Οι ουσίες αυτές σχηματίζονται θερμαίνοντας το μέλι ακόμη και στους 5 o C. Οι παράγοντες που καθορίζουν το σχηματισμό της HMF στο μέλι είναι η θερμοκρασία και ο χρόνος έκθεσής του σε αυτό, οι συνθήκες αποθήκευσης, η επαφή του με μεταλλικά σκεύη και τέλος οι φυσικοχημικές του ιδιότητες. Είναι γνωστό εδώ και πολλά χρόνια ότι η θέρμανση και η παρατεταμένη αποθήκευση του μελιού έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της περιεκτικότητας σε HMF. Κάθε μέλι έχει το δικό του άρωμα. Το χαρακτηριστικό αυτό συνδέεται με πτητικά και ημιπτητικά συστατικά, των οποίων η χημική δομή ποικίλλει. Τα συστατικά αυτά μπορεί να είναι αλκοόλες, αλδεΰδες, κετόνες, εστέρες, υδρογονάνθρακες και ετεροκυκλικές ενώσεις. Στο μέλι έχουν βρεθεί επίσης ελεύθερα λιπαρά οξέα, όπως το στεατικό και το παλμιτικό οξύ, τριγλυκερίδια καθώς επίσης και στεροειδείς αλκοόλες με τη μορφή της ελεύθερης χοληστερόλης και των εστέρων της. Από την ανάλυση των χρωματογραφημάτων ανιχνεύτηκαν αλκάνια μακριάς αλυσίδας (C 2 -C 29 ) και για τα δύο δείγματα μελιού (Σχήματα Π 4-Π 6). Επίσης ανιχνεύτηκαν τα 12

103 Δεκατετρανοϊκό οξύ Δεκαοκτάνιο Δεκαοκτανοϊκό οξύ λιπαρά οξέα λαουρικό (C 12: ), μυριστικό (C 14: ) (Σχήματα Π 2 και Π 3), παλμιτικό (C 16: ), στεατικό (C 18: ) και ελαϊκό (C 18:1 ) που σύμφωνα με την βιβλιογραφία είναι χαρακτηριστικές ενώσεις του μελιού. Η μεγάλη αναλογία του παλμιτικού οξέος σε σχέση με το στεατικό οξύ είναι χαρακτηριστική της παρουσίας φυτικού λίπους. Τέλος, χαρακτηριστική είναι η παρουσία της ένωσης 5-υδροξυμεθυλο-2- φουρανοκαρβοξαλδεΰδη, η οποία βρέθηκε και στα δύο δείγματα Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα κεριού Σε κάθε φιαλίδιο που φέρει πώμα με ελαστικό διάφραγμα από PTFE τοποθετήθηκαν,5 g κεριού και ακολούθησε η τεχνική της HS-SPME για 2 λεπτά, σε θερμοκρασία 6 o C. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε στον αέριο χρωματογράφο συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) και η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε αυτήν την περίπτωση φαίνονται στα σχήματα έως που ακολουθούν e e e e 7 2 e e 7 T I C : K O N T O K E R I. D n-δεκαεξανοϊκό οξύ C 21 H e e e 7 C 23 H e e 7 C 25 H e e e 7 1 e 7 C 12 H 14 O 4 C 34 H 67 NO ,4-δεκαδιεναάλη Δωδεκανάλη C 26 H Ενδεκανάλη C 28 H T im e --> n-δεκανοϊκό οξύ Δωδεκανοϊκό οξύ C 22 H 46 Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος σε κερί. σκούρου χρώματος και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. 13

104 Εννεανοϊκό οξύ 2-ενδεκανόνη n-δεκανοϊκό οξύ 2-δωδεκανόνη Ενδεκανοϊκό οξύ 2-δεκαντριενόνη Δωδεκανοϊκό οξύ Δεκατριενικό οξύ Δεκατετρανοϊκό οξύ Δεκαοκτάνιο C 8 H 14 O 2,4-επταδιενάλη Ενδεκανάλη Δεκατετρανάλη Δεκατετρανοϊκό οξύ Οκταδεκάνιο Εικοσιοκτάνιο 2,4-δεκαδιενάλη Δεκατετράνιο Δωδεκανάλη Δωδεκανοϊκό οξύ Οκταδεκανάλη Δεκαεννεάνιο Εικοσιτριάνιο Εικοσιτετράνιο Εικοσιπεντάνιο Εικοσιεπτάνιο T I C : M A K R Y K E R I. D 2. 4 e e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ Εικοσιδυάνιο 2. 1 e 7 2 e e e 7 Δεκαοκτανοϊκό οξύ 1. 7 e e e e 7 Δεκανάλη 1. 3 e e e 7 1 e 7 9 C 12 H 14 O 2 C 29 H Οκτανάλη C 8 H 16 O 2 1 T im e --> Δεκαεπτάνιο C 21 H 44 C 6 H 1 O 2 2-δεκανάλη Δεκαπεντάνιο 2-ενδεκανάλη Πεντανοϊκό οξύ Εννεανάλη Δεκατριενάλη Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος σε κερί ανοιχτού χρώματος και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. T I C : K E R I P A R A F I N H. D 2. 2 e e 7 2 e e 7 C 19 H 38 O C 23 H 48 C 24 H e e e e e 7 Εικοσάνιο C 25 H 52 C 26 H e e e 7 2-δεκανόνη C 27 H 56 1 e Οκτανοϊκό οξύ 7 C 28 H 58 6 C 9 H 18 O 5 Επτανοϊκό οξύ T im e --> δεκαπεντανόνη C 22 H 46 Δεκαπεντανοϊκό οξύ Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος σε κερί παραφίνης και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Στα σχήματα έως δίνονται μερικά από τα φάσματα MS, καθώς και η βάση φασμάτων μάζας NIST για την κάθε ένωση που αποτελεί συστατικό του εκχυλίσματος κεριού. 14

105 S c a n ( m in ): M A K R Y K E R I.D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης n-δεκαεξανοϊκό οξύ (παλμιτικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 12,976 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 79,3 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): M A K R Y K E R I. D ( ) (-) m / z -->

106 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης 9-δεκαοκτανοϊκό οξύ (ελαϊκό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 13,68 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 21, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): M A K R Y K E R I.D m / z --> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δεκαοκτανοϊκό οξύ (στεατικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 13,769 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 16

107 MS της NIST ήταν 78,7 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): M A K R Y K E R I.D ( ) (-) m / z --> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης εικοσιδυάνιο. Η ανίχνευση έγινε στα 13,862 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 51,2 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. 2 4 S c a n ( m in ): M A K R Y K E R I.D m / z -->

108 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης εικοσιεπτάνιο. Η ανίχνευση έγινε στα 16,868 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 31,9 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 8.3) φαίνονται συγκεντρωτικά όλες οι ενώσεις που ανιχνεύτηκαν σε δείγματα κεριού, ο χρόνος συγκράτησής τους, καθώς και το ποσοστό στο οποίο περιέχονται. 18

109 Πίνακας 8.3: Ενώσεις που ανιχνεύτηκαν σε κεριά (σκούρου χρώματος, ανοικτού χρώματος και παραφίνης), ο χρόνος συγκράτησής τους και το ποσοστό στο οποίο περιέχονται. Ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στο κερί σκούρου χρώματος Ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στο κερί ανοιχτού χρώματος Ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στο κερί παραφίνης Ενώσεις Χρόνος συγκράτησ ης (min) Πιθανότητα (%) Χρόνος συγκράτησης (min) Πιθανότητα (%) Χρόνος συγκράτησης (min) Πιθανότητα (%) 2(3Η)-φουρανόνη, 5-αιθυλοδιυδρο- 6,761 54,1 Επτανοϊκό οξύ 7,64 88,1 2,4 επταδιενάλη (Ε,Ε) 6,351 7,2 Οκτανάλη 6,278 77,9 2-οκτενάλη (Ε)- 6,826 59,1 Οκτανόνη 5,139 48,5 Οκτανοϊκό οξύ 7,872 96,1 Εννεανάλη 7,266 86,5 2-εννεανάλη 7,735 4, 2-εννεανόνη 7,136 95,9 2(3Η)-φουρανόνη, διυδρο-5-πεντυλ- 6,754 13,4 Εννεανικό οξύ 8,614 91,9 Δεκανάλη 8,117 74,4 2-δεκανάλη (Z) 8,542 5,1 2-δεκανόνη 7,987 95,1 2-δεκεν-1-ολη (Ε)- 18,174 1,8 2,4-δεκαδιενάλη (Ε,Ε) 8,938 73,5 8,946 73,1 n-δεκανοϊκό οξύ 9,299 9,9 9,27 75,1 Ενδεκανάλη 8,859 46,7 8,874 64,6 2-ενδεκενάλη 9,277 56,6 2-ενδεκανόνη 8,758 96, Ενδεκανοϊκό οξύ 9,919 91,9

110 Δωδεκανάλη 9,566 62, 9,573 63,3 Δωδεκανοϊκό οξύ 1,589 9,9 1,582 8,4 1,539 92,5 2-δωδεκανόνη 9,458 87, Διαιθυλοφθλικό 1,762 81,5 1,755 65, Δεκατριενάλη 1,222 54,4 2-δεκατριενόλη 1,121 81,5 Δεκατριενικό οξύ 11,116 92,9 Δεκατετράνιο 9,515 52,3 Δεκατετρανάλη 1,842 46,2 Δεκατετρανοϊκό οξύ 11,7 89,4 11,77 93,6 11,664 88,9 Δεκαπεντάνιο 1,157 51,7 2-δεκαπεντανόνη 11,325 68,5 Δεκαπεντανοϊκό 12,19 91,9 n-δεκαεξανοϊκό οξύ 12,889 83,6 12,976 79,3 9-δεκαεξανοϊκό οξύ 12,11 15,7 Δεκαεπτάνιο 11,339 28,9 Δεκαεπτανοϊκό οξύ ή μαργαρικό 13,271 17,6 Δεκαοκτάνιο 11,894 53,4 11,887 49,9 11,88 42,7 Δεκαοκτανάλη 11,981 13,8 Δεκαοκτανοϊκό οξύ ή στεατικό οξύ 13,74 78,2 13,769 78,7 9-δεκαοκτανοϊκό οξύ ή ελαϊκό οξύ 13,68 21, Δεκαεννεάνιο 12,413 47,3 2-δεκαεννιανόνη 13,41 77,2 Εικοσάνιο 12,93 58,7 Εικοσιενάνιο 13,394 51, 13,48 43,5 Εικοδιδυάνιο 13,841 37,9 13,862 51,2 13,848 32,8 Εικοσιτριάνιο 14,295 49,6 14,316 48,5 14,39 42,1 Εικοσιτετράνιο 14,814 4,7 14,814 34,1 11

111 Εικοσιπεντάνιο 15,354 65, 15,383 21,6 15,376 21,2 Εικοσιεξάνιο 16,3 63,7 16,18 43,5 Εικοσιεπτάνιο 16,868 31,9 16,789 39,4 Εικοσιοκτάνιο 17,741 4, 17,813 43,5 17,784 45,8 Εικοσιεννεάνιο 19,29 4, Παλμιτοϋλο κηραμίδια 13,639 7, 17-τριανταπεντένιο 15,549 23,8 Όπως προκύπτει από την βιβλιογραφία τα σύγχρονα κεριά αποτελούνται από ένα ευρύ φάσμα χημικών συστατικών συμπεριλαμβανομένων κορεσμένα και ακόρεστα n- αλκάνια, μακριάς αλυσίδας μονοεστέρες, διεστέρες, υδροξυεστέρες, λιπαρά οξέα και άλλα δευτερεύοντα συστατικά, όπως τα φλαβονοειδή. Οι κορεσμένοι μονοεστέρες είναι οι πιο σημαντικές ενώσεις που βρίσκονται σε κερί μέλισσας και αυτές αποτελούνται από μακριάς αλυσίδας αλκοόλες, με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα από 24 έως 36 εστεροποιημένα με παλμιτικό οξύ. Άλλα σημαντικά συστατικά όπως μονοεστέρες με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα που προέρχονται από το παλμιτελαϊκό (F 16:1, cis-9-δεκαεξανοϊκό οξύ) και ελαϊκό (F 18:1, cis-9-δεκαοκτανοϊκό οξύ) οξύ και υδρόξυλ μονοεστέρες που προέρχονται από το 15-υδροξυπαλμιτικό οξύ βρίσκονται σε κερί μέλισσας. Ωστόσο η χημική σύσταση του κεριού μέλισσας μεταβάλλεται με το πέρασμα του χρόνου. Οι εστέρες υδρολύονται μερικώς σε παλμιτικό οξύ και αλκοόλες μακριάς αλυσίδας, ενώ τα αλκάνια μπορούν να εξαχνωθούν είτε λόγω του ξηρού και θερμού περιβάλλοντος, είτε εξαιτίας της προκατεργασίας που υπόκεινται πριν την χρήση. Τα φλαβονοειδή με χημική αποικοδόμηση μετατρέπονται σε φαινολικά παράγωγα. Η αποικοδόμηση και η αλλοίωση του κεριού είναι μικρότερη σε αρχαιολογικά ευρήματα σε σχέση με αυτή που υπόκεινται τα ζωικά λίπη και έλαια. Από την ανάλυση των χρωματογραφημάτων ανιχνεύτηκαν n-αλκάνια μακριάς αλυσίδας (C 2 -C 29 ) (Σχήματα Π 15- Π 21) και για τα τρία δείγματα κεριού. Από τους υδρογονάνθρακες ο επικρατέστερος είναι αυτός που έχει 27 άτομα άνθρακα και ανιχνεύτηκε στο μακρύ κερί και στο κερί παραφίνης. Επίσης ανιχνεύτηκαν τα λιπαρά οξέα λαουρικό (C 12: ), μυριστικό (C 14: ) (Σχήματα Π 12 και Π 14), δεκαπεντανοϊκό 111

112 Δεκανάλη Δεκατετρανοϊκό οξύ Δεκαοκτάνιο (C 15: ), παλμιτικό (C 16: ), παλμιτελαϊκό (C 16:1 ), μαργαρικό (C 17: ), στεατικό (C 18: ) και ελαϊκό (C 18:1 ) Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα γάλακτος Σε κάθε φιαλίδιο που φέρει πώμα με ελαστικό διάφραγμα από PTFE τοποθετήθηκαν,5 g γάλακτος και ακολούθησε η τεχνική της HS-SPME για 2 λεπτά, σε θερμοκρασία 6 o C. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε στον αέριο χρωματογράφο συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) και η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Το χρωματογράφημα που λαμβάνεται σε αυτήν την περίπτωση φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί. T I C : G A L A. D 2. 6 e e e e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ 2. 1 e 7 2 e e e e e e e e e e 7 1 e Μαλτόλη Επτανοϊκό οξύ Εννεανάλη 1 Οκτανοϊκό οξύ Δεκατριενάλη C 12 H 14 O 4 C 12 H 24 O 2 6-Δεκαοκτανοϊκό οξύ Εικοσάνιο C 21 H 44 C 22 H 46 Εικοσιτριάνιο Εικοσιτετράνιο Δωδεκανάλη Εικοσιπεντάνιο Δεκαοκτανοϊκό οξύ Δεκατετράνιο Δεκαπεντάνιο Εικοσιεξάνιο Εικοσιεπτάνιο Εικοσιοκτάνιο C 3 H 5 C 29 H 6 T im e - - > n-δεκανοϊκό οξύ Ενδεκανοϊκό οξύ C 1 H 18 O 2 C 14 H 22 O Δεκατετρανάλη Εννεανάλη Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος γάλατος και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Στα σχήματα έως δίνονται μερικά από τα φάσματα MS, καθώς και η βάση φασμάτων μάζας NIST για την κάθε ένωση που αποτελεί συστατικό του εκχυλίσματος γάλακτος. 112

113 S c a n ( m in ): G A L A.D m / z--> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης οκτανοϊκό οξύ (καπριλικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 7,843 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 94,7 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): G A L A. D ( ) (-) m / z -->

114 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης n-δεκανοϊκό οξύ (καπρικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 9,278 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 89,1 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): G A L A.D m / z --> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δωδεκανοϊκό οξύ (λαουρικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 1,546 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 114

115 MS της NIST ήταν 88,1 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Τα κυριότερα συστατικά του γάλακτος είναι το νερό, το λίπος, οι πρωτεΐνες, η λακτόζη, τα διάφορα άλατα κ.α. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία οι λιπαρές ουσίες του γάλακτος διαφέρουν από τα λίπη ως προς την σύνθεση των οξέων, καθώς παρατηρούνται ακόρεστα λιπαρά οξέα μικρότερης αλυσίδας. Το λίπος του γάλακτος αποτελείται από μεγάλη ποσότητα κορεσμένων λιπαρών οξέων. Η παρουσία των οξέων C 8:, C 9:, C 1:, C 12: μαζί με την ταυτόχρονη παρουσία των C 14: και C 18: αποτελεί ένδειξη παρουσίας γάλακτος. Ωστόσο, τα ζωικά λιπαρά κατάλοιπα που περιέχουν μικρότερης αλυσίδας λιπαρά οξέα, σπάνια ανιχνεύονται. Από την ανάλυση του χρωματογραφήματος ανιχνεύτηκαν τα λιπαρά οξέα δεκανοϊκό (καπρικό οξύ), ενδεκανοϊκό, δωδεκανοϊκό (λαουρικό οξύ), δεκατετρανοϊκό (μυριστικό οξύ), δεκαεξανοϊκό (παλμιτικό οξύ) και δεκαοκτανοϊκό (ελαϊκό και στεατικό οξύ) (Σχήματα Π 24-Π 28). Η μεγάλη αναλογία του παλμιτικού οξέος σε σχέση με το στεατικό οξύ είναι χαρακτηριστική της παρουσίας φυτικού λίπους. Επίσης αλδεΰδες (Σχήματα Π 29-Π 33) και αλκάνια μακριάς αλυσίδας (C 22 -C 29 ) (Σχήματα Π 34-Π 48) Ταυτοποίηση των οργανικών ενώσεων σε εκχύλισμα βουτύρου Σε κάθε φιαλίδιο που φέρει πώμα με ελαστικό διάφραγμα από PTFE τοποθετήθηκαν,5 g βουτύρου και ακολούθησε η τεχνική της HS-SPME για 2 λεπτά, σε θερμοκρασία 6 o C. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε στον αέριο χρωματογράφο συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας (GC-MS) και η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε με τη βοήθεια της βάσης φασμάτων μάζας NIST. Τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε αυτήν την περίπτωση φαίνονται στα σχήματα και που ακολουθούν. 115

116 Μαλτόλη Εννεανοϊκό οξύ 2-ενδεκανάλη Δεκατριενάλη C 14 H 22 O 2-δεκαπεντανόνη C 16 H 32 O Δεκατετρανοϊκό οξύ Εικοσιπεντάνιο 2-ενδεκανάλη C 9 H 18 O C 1 H 14 O trans-2-ενδεκανοϊκό οξύ Δωδεκανοϊκό οξύ C 9 H 14 O 2,4-επταδιενάλη C 6 H 8 O 2 ή Σορβικό οξύ C 1 H 16 O 6-οκταδεκανοϊκό οξύ C 7 H 12 O T IC: FY T IK O B O Y T Y R O.D 1.8 e e e 7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ C 16 H 22 O e 7 1 e C 3 H 5 2 T ime --> Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος φυτικού βουτύρου και ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. 5 5 T IC : Z W IK O B O Y T Y R O.D n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ C 18 H 34 O 2 Δεκαοκτανοϊκό οξύ C 16 H 3 O 2 C 24 H 38 O Εικοσιεξάνιο 1 5 C 6 H 6 O T im e --> Εικοσιεπτάνιο Εικοσιτριάνιο Εικοσιτετράνιο Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος ζωικού βουτύρου και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. 116

117 Επτανάλη Οκτανοϊκό οξύ Δεκανάλη Δωδεκανάλη 2-ενδεκανάλη Δεκατριενάλη Δωδεκανοϊκό οξύ Οκτενάλη Εννεανάλη Δεκατετρανάλη Δεκατετρανοϊκό οξύ 2-δεκανάλη Abundanc e 1.6e7 T IC: Z W IKO LIPOS.D 1.4e7 6-Δεκαοκτανοϊκό οξύ 1.2e7 n-δεκαεξανοϊκό οξύ ή παλμιτικό οξύ C 16 H 3 O 2 1e7 C 31 H 6 O 5 8 Δεκαοκτανοϊκό οξύ C 35 H 68 O 5 6 C 27 H 46 O 4 2 C 33 H 62 O 6 T ime--> C 8 H 14 O C 9 H 16 O C 18 H 34 O 2 Επτανοϊκό οξύ Σχήμα : Χρωματογράφημα GC-MS για την ανάλυση δείγματος ζωικού λίπους και την ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Στα σχήματα έως δίνονται μερικά από τα φάσματα MS, καθώς και η βάση φασμάτων μάζας NIST για την κάθε ένωση που αποτελεί συστατικό του εκχυλίσματος βουτύρου. S c a n ( m in ): F Y T IK O B O Y T Y R O.D m / z -->

118 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης σορβικό οξύ. Η ανίχνευση έγινε στα 6,185 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 75, %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): Z W IK O L IP O S.D m / z --> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης n-δεκαεξανοϊκό οξύ (παλμιτικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 13,588 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 118

119 MS της NIST ήταν 81,8 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Abundanc e Sc an 1997 ( min): Z W IKO LIPOS.D (-199) (-) m/ z--> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης cis-9-δεκαεξανοϊκό οξύ (παλμιτελαϊκό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,475 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 71,4 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): Z W I K O L I P O S. D m / z -->

120 β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης 6-δεκαοκτανοϊκό οξύ (ελαϊκό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,698 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 24,3 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST S c a n ( m in ): Z W IK O L IP O S.D m / z--> β) Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δεκαοκτανοϊκό οξύ (στεατικό οξύ). Η ανίχνευση έγινε στα 14,821 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων 12

121 MS της NIST ήταν 77,7 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. S c a n ( m in ): Z W I K O L I P O S. D ( ) (-) β) m / z --> Σχήμα : Φάσμα MS της ένωσης δεκανοϊκό οξύ, 1,2,3- προπανετριυλεστέρας. Η ανίχνευση έγινε στα 24,661 min και η πιθανότητα που έδωσε η βιβλιοθήκη φασμάτων MS της NIST ήταν 5,5 %, δίνοντάς την ως πρώτη προτεινόμενη και β) Βάση φασμάτων μάζας NIST. Από την ανάλυση των χρωματογραφημάτων ανιχνεύτηκαν κορεσμένα λιπαρά οξέα σορβικό, επτανοϊκό, οκτανοϊκό, εννεανοϊκό, δωδεκανοϊκό (λαουρικό οξύ), δεκατετρανοϊκό (μυριστικό οξύ), δεκαεξανοϊκό (παλμιτικό οξύ) και δεκαοκτανοϊκό (στεατικό οξύ). Τα ακόρεστα λιπαρά οξέα, ελαϊκό και το παλμιτελαϊκό ανιχνεύθηκαν μόνο στο ζωικό λίπος. Στο φυτικό βούτυρο ο λόγος του παλμιτικού οξέος σε σχέση με το στεατικό ήταν μεγαλύτερος, ενώ στο ζωικό λίπος και στο ζωικό βούτυρο ο 121