ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

Transcript

1 ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Σκοπός της άσκησης Η εισαγωγή των φοιτητών στη χρήση και λειτουργία του αεριοχρωµατογράφου Η εξοικείωση τους µε τις έννοιες του χρόνου ανάσχεσης, t R, του νεκρού χρόνου, t M, του ανηγµένου χρόνου ανάσχεσης, t R, του ανηγµένου όγκου ανάσχεσης,v R (προσδιορισµός ταυτότητας ουσιών), του δείκτη κατακράτησης (Kovats), όπως και του αριθµού θεωρητικών πλακών, N, και του ΥΙΘΠ (αποδοτικότητα στήλης) Η κατανόηση του διαχωρισµού σύµφωνα µε την πτητικότητα και την πολικότητα των ενώσεων Η χρήση του εσωτερικού προτύπου στην ποσοτική ανάλυση µε GC Ο προσδιορισµός κ-πεντανίου και κ-οκτανίου σε άγνωστο δείγµα, µε χρήση του κ-επτανίου ως εσωτερικό πρότυπο Τι θα πρέπει να έχουµε µελετήσει πριν έρθουµε στο εργαστήριο Η θεωρία των χρωµατογραφικών διαχωρισµών βρίσκεται στο κεφάλαιο 26 του βιβλίου «Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης» των Skoog - Holler - Nieman (Μτφ Μ. Καραγιάννης, Κ. Ευσταθίου, Ν. Χανιωτάκης), ενώ η αντίστοιχη θεωρία της αεριοχρωµατογραφίας στο κεφάλαιο 27, σελ Αν και τα κεφάλαια είναι ιδιαίτερα µεγάλα, θα πρέπει να µελετηθούν τα εξής σηµεία: Περιγραφή της χρωµατογραφίας (σελ ) Χρόνος κατακράτησης ή ανάσχεσης (σελ. 790) ιεύρυνση ζώνης και αποδοτικότητα στήλης (σελ ) ιαχωριστική ικανότητα στήλης (σελ. 801) Εφαρµογές χρωµατογραφίας (σελ ) Οργανολογία αεριοχρωµατογραφίας (σελ ), ιδιαίτερα τα: Φέρον αέριο (σελ. 819) Σύστηµα έκχυσης δείγµατος (σελ. 820) Ανιχνευτή θερµικής αγωγιµότητας (σελ. 823) Στήλες αεριοχρωµατογραφίας (σελ ) είκτης κατακράτησης Kovats (σελ.835) Τις σηµειώσεις της 1 ης διάλεξης που είναι διαθέσιµες στην ιστοσελίδα του µαθήµατος: ( 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η αεριοχρωµατογραφία (gas chromatography, GC) είναι η τεχνική, η οποία χρησιµοποιείται περισσότερο από οποιαδήποτε άλλη γνωστή τεχνική στην ανάλυση µιγµάτων πτητικών οργανικών ενώσεων. Έχει χρησιµοποιηθεί για διαχωρισµό, ταυτοποίηση και ανάλυση όλων σχεδόν των αερίων και πτητικών υγρών µιγµάτων σε δείγµατα φαρµάκων, βενζίνης, περιβαλλοντικών δειγµάτων αέρα και υδάτων, κ.α. Η γρήγορη ανάπτυξη της αεριοχρωµατογραφίας, από τη στιγµή της εµφάνισής της στις αρχές της δεκαετίας του '50, δείχνει ότι είναι σχετικά απλή και χαµηλού κόστους τεχνική. Στην αεριοχρωµατογραφία το δείγµα ενίεται στον εισαγωγέα, όπου εξατµίζεται ταχύτατα και εγχέεται στην κεφαλή µιας χρωµατογραφικής στήλης (στατική φάση) καθώς παρασύρεται από κινούµενο αδρανές αέριο. Η έκλουση των ουσιών του δείγµατος πραγµατοποιείται µε τη ροή αυτού του αδρανούς αερίου, το οποίο ονοµάζεται φέρον αέριο και αποτελεί την κινητή φάση. Σε αντίθεση µε την υγροχρωµατογραφία, η κινητή φάση δεν αλληλεπιδρά µε τα µόρια του αναλύτη. Ο µόνος της ρόλος είναι η διακίνηση του κατά µήκος της στήλης. Στη συντριπτική πλειονότητα των εφαρµογών, ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται µε κατανοµή του αναλύτη µεταξύ της αέριας κινητής και µιας υγρής φάσης, η οποία είναι ακινητοποιηµένη σε επιφάνεια αδρανούς στερεού υποστρώµατος (χρωµατογραφία αερίου-υγρού). 1

2 2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Με τη χρήση πακεταρισµένης στήλης πληρωµένης µε κονιοποιηµένο υλικό στήριξης, το οποίο είναι καλυµµένο µε ένα λεπτό στρώµα στατικής φάσης (πολυδιµεθυλοσιλοξάνιο ή πολυαιθυλενογλυκόλη) πετυχαίνουµε διαχωρισµούς πτητικών οργανικών ενώσεων, όπως οι κορεσµένοι υδρογονάνθρακες ή ενώσεις διαφορετικής πολικότητας, όπως οι αλκοόλες και οι κετόνες. Με βάση τις τιµές των χρόνων ανάσχεσης των προτύπων ουσιών πετυχαίνουµε την ταυτοποίηση των ουσιών αυτών σε άγνωστα µίγµατα. Επίσης µελετούµε τον διαχωρισµό και τη σειρά έκλουσής τους µε βάση το σηµείο ζέσης τους, το µοριακό τους βάρος και την πολικότητας τους. Εφόσον η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης διατηρείται σταθερή κατά τη διάρκεια των χρωµατογραφη- µάτων, ο χρόνος ανάσχεσης, t R (min), αποτελεί κριτήριο ταυτοποίησης των ουσιών και το δε εµβαδόν της κορυφής το µέτρο του ποσοτικού προσδιορισµού της ουσίας. Επίσης, για τον ποιοτικό προσδιορισµό οργανικών πτητικών ενώσεων, βαθµονοµούµε τον αεριοχρωµατογράφο µε κανονικά αλκάνια, κατάσκευάζοντας το διάγραµµα του δείκτη κατακράτησης κατά Kovats. Τέλος, προσδιορίζουµε ποσοτικά κ-πεντάνιο και κ-οκτάνιο σε άγνωστο δείγµα, µε χρήση του κ-επτανίου ως εσωτερικό πρότυπο. 3. ΟΡΓΑΝΑ Αεριοχρωµατογράφος GOW MAC (Model ) µε ανιχνευτή θερµικής αγωγιµότητας (Σχήµα 1). Το επάνω τµήµα του χρωµατογράφου, όπως φαίνεται στο σχήµα, περιέχει τα βασικά µέρη του συστήµατος: το φούρνο µε δύο στήλες (Σχήµα 2), τους χώρους εισαγωγής του δείγµατος (injectors) και τον ανιχνευτή (detector). Σχήµα 1. Αεριοχρωµατογράφος GOW MAC (Model ) 2

3 Σχήµα 2. Φούρνος αεριοχρωµατογράφου µε τις δύο στήλες και τον ανιχνευτή θερµικής αγωγιµότητας Ο χώρος εισαγωγής του δείγµατος συνδέεται µε την οβίδα του φέροντος αερίου (της κινητής φάσης). Στην συγκεκριµένη περίπτωση η µέγιστη θερµοκρασία λειτουργίας του χώρου αυτού είναι 280 ο C και το δείγµα εισάγεται κατευθείαν στο στόµιο της στήλης (on column injection). Ο φούρνος που περιέχει τις στήλες έχει µέγιστη θερµοκρασία λειτουργίας τους 250 ο C. Η θερµοκρασία του φούρνου διαβιβάζεται µε τη βοήθεια ενός ρυθµιζόµενου θερµοµέτρου. Η θερµοκρασία του φούρνου και κατά συνέπεια και των στηλών είναι 30 ο C µικρότερη από εκείνη του χώρου εισαγωγής του δείγµατος. Η ρύθµιση της θερµοκρασίας του φούρνου γίνεται µε το TEMP. CONTROL που βρίσκεται στο κάτω µέρος του χρωµατογράφου. Οι δύο στήλες που περιέχουν τη στατική φάση, είναι πακεταρισµένες στήλες (packed columns). Η στήλη που βρίσκεται στο κανάλι Α είναι µια πολική στήλη (CARBOWAX 20Μ), ενώ η στήλη που βρίσκεται στο κανάλι Β είναι µη πολική (DC200) (Πίνακας 1). Ο ανιχνευτής αυτού του οργάνου είναι ένας ανιχνευτής θερµικής αγωγιµότητας (Thermal Conductivity Detector, TCD). Η αρχή λειτουργίας του βασίζεται στη διαφοροποίηση της θερµικής αγωγιµότητα του αερίου που περιβάλλει µια αντίσταση της οποίας η τιµή εξαρτάται σηµαντικά από τη θερµοκρασία. Η διαφοροποίηση της θερµικής αγωγιµότητας οφείλεται σε µικροµεταβολές της σύνθεσης του αερίου που εξέρχεται από τη χρωµατογραφική στήλη (έκλουσµα). Στο Σχήµα 3α απεικονίζεται ένας από τους αισθητήρες θερµοκρασίας του συστήµατος TCD. Το αισθητήριο στοιχείο (λεπτό σύρµα λευκοχρύσου, χρυσού, βολφραµίου ή θερµίστορ) θερµαίνεται λόγω της διέλευσης ηλεκτρικού ρεύµατος µέχρι µια θερµοκρασία ισορροπίας, η οποία εξαρτάται από τη θερµική αγωγιµότητα και την ταχύτητα ροής του περιβάλλοντος αερίου. Η παρουσία µικρής ποσότητας ατµών προσµίξεων στο έκλουσµα της χρωµατογραφικής στήλης, µεταβάλλει ελάχιστα της θερµική αγωγιµότητα του αερίου µε αποτέλεσµα µια αντίστοιχη µικρή µεταβολή της θερµοκρασίας του αισθητήριου στοιχείου και εποµένως της τιµής της αντίστασής του. 3

4 Σχήµα 3. Αρχή λειτουργίας ανιχνευτή θερµικής αγωγιµότητας. (α) Τυπική µορφή αισθητήρα θερµικής αγωγιµότητας αεριοχρωµατογραφου. (β) Γέφυρα αντιστάσεων µε δύο αισθητήρες θερµικής αγωγιµότητας: έναν αναφοράς (R θ,r ) πριν από τη χρωµατογραφική στήλη και έναν δείγµατος (R θ,s ) µετά την έξοδο της στηλης. (από το βιβλίο: Κ. Ευσταθίου Χηµική Οργανολογία Μικροϋπολογιστές. Εισαγωγικά µαθήµατα ). ύο επακριβώς ίδιοι αισθητήρες συνδέονται σε µια γέφυρα αντιστάσεων (Σχήµα 3β). Ο ένας είναι ο αισθητήρας αναφοράς (η αντίσταση R θ,r ) και τοποθετείται στη ροή του φέροντος αερίου (He) πριν από τη στήλη (οπότε πάντοτε περιβάλλεται από καθαρό He) και ο άλλος είναι ο αισθητήρας δείγµατος (η αντίσταση R θ,s ) που τοποθετείται µετά την έξοδο της στήλης. Μετά τη θερµική εξισορρόπηση του ανιχνευτή µε ροή καθαρού φέροντος αερίου, ρυθµίζεται η µεταβλητή αντίσταση R µ, ώστε να µηδενισθεί η διαφορά δυναµικού µεταξύ των σηµείων A και Β της γέφυρας αντιστάσεων (θα ισχύει αυτό όταν R θ,r /R στ = R θ,s /R µ ). Κατά τη λήψη χρωµατογραφήµατος, κάθε φορά που εξέρχεται από τη στήλη ένα από τα διαχωριζόµενα συστατικά αλλοιώνεται η θερµική αγωγιµότητα του αερίου που περιβάλλει την αντίσταση R θ,s, οπότε διαφοροποιείται η θερµοκρασία της σε σχέση τη θερµοκρασία της αντίσταση R θ,r. Η διαφοροποίηση αυτή µεταβάλλει ελάχιστα την τιµή της R θ,r µε αποτέλεσµα την ανάπτυξη µιας µικρής διαφοράς δυνα- µικού µεταξύ των κόµβων Α και Β της γέφυρας η οποία αποτελεί και το σήµα εξόδου που καταγράφεται και αποτελεί το λαµβανόµενο χρωµατογράφηµα. Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά στηλών Πολική στήλη Carbowax 20M Πολύ(αιθυλενογλυκόλη) (ΜΒ ) Μη πολική στήλη DC-200 Πολυδιµεθυλοσιλοξάνιο Η(-ΟCH 2 CH 2 -) n OH 2. Οβίδα αερίου ηλίου, η οποία συνδέεται µε τον αεριοχρωµατογράφο µέσω βαλβίδας µείωσης της πίεσης (µειωτήρας) που φέρει µανόµετρο. 3. Μικροσύριγγα Hamilton, 10 µl. 4. Γυάλινο ροόµετρο µε σαπωνοδιάλυµα. 5. Καταγραφέας Sargent Model XKR πολλών ταχυτήτων. 4

5 3.1 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ 1. Όλοι οι διακόπτες που βρίσκονται πάνω στο χρωµατογράφο θα πρέπει αρχικά να βρίσκονται στο off (Παρατήρηση 1). 2. Ανοίγουµε τη στρόφιγγα της οβίδας του ηλίου και ρυθµίζουµε την πίεση του ηλίου µέσω της βαλβίδας στην επιθυµητή τιµή (περίπου 2 psi). 3. Μετρούµε τη ροή του φέροντος αερίου µε ροόµετρο σαπωνοδιαλύµατος, το οποίο συνδέεται κατάλληλα στο σωλήνα εξόδου του αερίου (Παρατήρηση 2). Παρατήρηση 1: Στο τέλος της άσκησης κλείνονται όλοι οι διακόπτες εκτός από την στρόφιγγα της οβίδας του ηλίου. Το αέριο θα πρέπει να περνάει από τις στήλες έως η θερµοκρασία να κατέβει κάτω από τους 90 ο C. Παρατήρηση 2: Η ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου δεν είναι απαραίτητο να έχει µια ορισµένη τιµή ακριβώς, η ακριβής τιµή αυτής όµως (διαφορετική σε κάθε στήλη) πρέπει να αναγράφεται στην έκθεση των αποτελεσµάτων. 4. Ανοίγουµε το γενικό διακόπτη (POWER SWITCH) και ρυθµίζουµε τη θερµοκρασία της στήλης (δηλ. του φούρνου) στους 80 C. 5. Στρέφουµε το CURRENT SWITCH στην επιθυµητή ένδειξη (200 ma). 6. Ο διακόπτης POLARITY SWITCH πρέπει να είναι στη θέση [+]. 7. Στρέφουµε το διακόπτη ATTENUATOR SWITCH στην κατάλληλη ένδειξη (συνήθως 4) ώστε η κάθε κορυφή του χρωµατογραφήµατος να βρίσκεται µέσα στην κλίµακα του χαρτιού του καταγραφέα. 8. Ανοίγουµε το διακόπτη του καταγραφέα και διαλέγεται η ταχύτητα προώθησης του χαρτιού (στην ποιοτική ανάλυση η ταχύτητα είναι 2 cm/min, ενώ στην ποσοτική ανάλυση ρυθµίζουµε την ταχύτητα στα 5 cm/min). 9. Αφήνουµε να περάσει ένα µικρό χρονικό διάστηµα για να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία. Παράλληλα ελέγχουµε τη σταθερότητα της γραµµής βάσης (για διάφορες τιµές του ATTENUATOR και ειδικά στην τιµή 1). 10. Μηδενίζουµε τον καταγραφέα (ZERO). Το σύστηµα είναι έτοιµο για την εισαγωγή του δείγµατος. (Παρατήρηση 3). Παρατήρηση 3: Είναι απαραίτητο για κάθε χρωµατογράφηµα να καταγράψουµε: την ροή του φέροντος αερίου, την ένδειξη του ATTENUATOR SWITCH, τη θερµοκρασία της στήλης, την ταχύτητα κίνησης χαρτιού στον καταγραφέα, την ποσότητα του δείγµατος (µε µl) και το είδος της στήλης. 4. ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (1 ο και 2 ο µέρος της άσκησης) 1 ο µέρος της άσκησης: Επίδραση της διαφορετικής πολικότητας και διαφορετικών σηµείων ζέσης των ενώσεων στη σειρά και στην ταχύτητα έκλουσης τους σε στήλες διαφορετικής πολικότητας. Σκοπός του πειράµατος αυτού είναι η εξοικείωση µας µε τις χρωµατογραφικές παραµέτρους του χρόνου ανάσχεσης, t R, του νεκρού χρόνου, t M, του ανηγµένου χρόνου ανάσχεσης, t R, του ανηγµένου όγκου ανάσχεσης,v R (προσδιορισµός ταυτότητας ουσιών), όπως και του αριθµού θεωρητικών πλακών, N, και του ΥΙΘΠ (αποδοτικότητα στήλης). Επίσης σκοπός του πειράµατος είναι η κατανόηση του µηχανισµού διαχωρισµού των ενώσεων στην αεριοχρωµατογραφία µε βάση το σηµείο ζέσης (κυρίαρχος µηχανισµός) και την πολικότητα των ενώσεων. Αντιδραστήρια 1. κ-επτάνιο 2. Βουτανόνη 3. κ-προπανόλη 5

6 Προετοιµασία του οργάνου 1. Στήλη: η ανάλυση θα γίνει µόνο στη στήλη Β (µη πολική στήλη). 2. Θερµοκρασία στήλης: 80 o C. 3. Ροή φέροντος αερίου, F: περίπου 60 ml/min (έλεγχος και καταγραφή ροής). 4. Ρεύµα ανιχνευτή: 200 ma. 5. ATTENUATOR SWITCH: 4 (για κάθε ένωση ξεχωριστά) και 2 (για το µίγµα) (Παρατήρηση 4). 6. Ταχύτητα κίνησης χαρτιού στον καταγραφέα: 2 cm/min. Παρατήρηση 4: Το ATTENUATION, δηλαδή η µεταβολή της ευαισθησίας καταγραφής (µείωση ή αύξηση του ύψους) της κάθε κορυφής στο χρωµατογράφηµα µπορεί να ρυθµιστεί ανάλογα µε τις συνθήκες του πειράµατος. Πορεία εκτέλεσης 1. Αφού εκπλύνουµε καλά τη µικροσύριγγα µε επανειλληµένες αναρροφήσεις και εµβολισµούς ακετόνης και µετά κάθε ένωσης αντίστοιχα, λαµβάνουµε 3 µl δείγµατος (κ-επτάνιο) και τουλάχιστον 9 µl αέρα (η ποσότητα του αέρα δεν χρειάζεται να είναι γνωστή). 2. Το δείγµα εισάγεται στη στήλη B ακαριαία, ενώ ταυτόχρονα σηµειώνεται η αρχή του χρωµατογραφή- µατος στο χαρτί του καταγραφέα. Εµφανίζεται πρώτα στο χρωµατογράφηµα η κορυφή του αέρα, ενώ η καταγραφή διακόπτεται µετά την εµφάνιση της κορυφής του κ-επτανίου. Χρωµατογράφηµα είναι το κάθε καταγράφηµα, που λαµβάνεται µετά από κάθε ένεση προτύπου διαλύµατος ή δείγµατος (σχήµα 4). Στον άξονα x είναι ο χρόνος σε min και στον άξονα y είναι το σήµα. 3. Επαναλαµβάνουµε τα στάδια 1 και 2 µε τα υπόλοιπα αντιδραστήρια (βουτανόνη και κ-προπανόλη), ενώ στο τέλος γίνεται εισαγωγή στη στήλη Β δείγµατος που είναι µίγµα των παραπάνω τριών αντιδραστηρίων σε ίσες περίπου ποσότητες. 4. Η καταγραφή σταµατάει µετά την εµφάνιση των 3 κορυφών των συστατικών του µίγµατος (σχήµα 4). 5. Από τα χρωµατογραφήµατα των καθαρών ουσιών µετρούµε τους χρόνους ανάκτησης, t R και το νεκρό χρόνο, t Μ, σε min για κάθε στήλη: x t R = U καταγραφεα όπου, x: η διανυθείσα απόσταση σε cm και U καταγραφέα : η ταχύτητα καταγραφέα (2 cm / min). Βάσει αυτών υπολογίζουµε τους ανηγµένους χρόνους ανάσχεσης, t R και τους ανηγµένους όγκους ανάσχεσης, V R. Αναγνωρίζουµε τις κορυφές των ενώσεων στο χρωµατογράφηµα του µίγµατος (Σχήµα 4 - κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε µια ορισµένη ένωση). 6. Υπολογίζεται ο αριθµός των θεωρητικών πλακών και το Υ.Ι.Θ.Π. κάθε ένωσης. ίνεται ότι το µήκος της στήλης είναι 1,219 m. Σχολιάζουµε τη σειρά έκλουσης των ουσιών και το ΥΙΘΠ κάθε ουσίας σε σχέση µε τις φυσικοχηµικές ιδιότητες τους: µοριακό βάρος (ΜΒ), σηµείο ζέσης (σ.ζ.) και πολικότητα (ε) (Πίνακας 2). Πίνακας 2. Φυσικοχηµικές ιδιότητες αναλυτών ΜΒ Σ.ζ. ε κ-προπανoλη 60,11 97,4 20,1 ΒΟΥΤΑΝΟΝΗ 72,11 79,6 18,5 κ-επτανιο 100,2 98,4 1,92 6

7 Σχήµα 4. Χρωµατογράφηµα µίγµατος ουσιών διαφορετικής πτητικότητας και πολικότητας σε µη πολική στήλη. 2 ο µέρος της άσκησης: Έκλουση οµόλογων ενώσεων και συσχέτιση του V R µε τον αριθµό ατόµων άνθρακα και το σηµείο ζέσης. Σκοπός του πειράµατος αυτού είναι η κατασκευή διαγράµµατος δείκτη κατακράτησης κατά Kovats (logv R σε συνάρτηση µε τον αριθµό των ατόµων άνθρακα, z) και η χρήση του στην ποιοτική ανάλυση πτητικών οργανικών ενώσεων µε αεριοχρωµατογραφία (βλ. και Skoog et al, σελ.835). Αντιδραστήρια 1. κ-πεντάνιο 2. κ-εξάνιο 3. κ-επτάνιο 4. κ-οκτάνιο Προετοιµασία οργάνου 1. Στήλη: Β 2. Θερµοκρασία στήλης: 80 ο C 3. Ένταση ρεύµατος στον ανιχνευτή: 200 ma 5. Ροή ηλίου, F: 60 ml/min (µετρείται και σηµειώνεται επ ακριβώς) 6. Ταχύτητα κίνησης χαρτιού στον καταγραφέα: 5 cm/min 7. ιακόπτης ATTENUATOR: 4 (για κάθε ένωση) και 2 (για το µίγµα) (Παρατήρηση 4) 7

8 Πορεία εκτέλεσης 1. Αφού εκπλύνουµε καλά τη µικροσύριγγα, λαµβάνουµε 3 µl πεντανίου και τουλάχιστον 9 µl αέρα και ενίουµε το δείγµα ακαριαία στο στόµιο εισαγωγής της στήλης Β, ενώ ταυτόχρονα τίθεται σε κίνηση το χαρτί στον καταγραφέα. Η καταγραφή διακόπτεται µετά την εµφάνιση της κορυφής του πεντανίου. 2. Το ίδιο γίνεται και για τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. 3. Παρασκευάζουµε µίγµα µε ανάµιξη ίσων όγκων των παραπάνω ενώσεων. 4. Λαµβάνουµε µε τη µικροσύριγγα 6 µl δείγµατος και τουλάχιστον 9 µl αέρα και εισάγουµε το δείγµα ακαριαία στη στήλη Β. Η καταγραφή διακόπτεται µετά την εµφάνιση των τεσσάρων κορυφών του µίγ- µατος (Σχήµα 5). 5. Υπολογίζουµε τους χρόνους t R για τους 4 υδρογονάνθρακες και από αυτούς υπολογίζουµε τους ανηγ- µένους όγκους ανάσχεσης, V R. Κατασκευάζουµε το διάγραµµα του logv R συναρτήσει του αριθµού ατόµων άνθρακα κάθε υδρογονάνθρακα χωρίς να χρησιµοποιηθεί η τιµή του logv R του κ-οκτανίου. Από το διάγραµµα αυτό υπολογίζεται ο ανηγµένος όγκος ανάσχεσης του κ-οκτανίου και συγκρίνεται µε την πειραµατικά ευρεθείσα τιµή. 6. Τέλος, αποτυπώνεται διάγραµµα logv R συναρτήσει του σηµείου ζέσης κάθε υδρογονάνθρακα. Σχήµα 5. Χρωµατογράφηµα του µίγµατος κ-πεντανίου (2), κ-εξανίου (3), κ-επτανίου (4), και κ-οκτανίου (5) στη στήλη Β. Ο αέρας είναι η κορυφή (1). Ροή φέροντος αερίου: 60 ml/min, Attenuation = 4, Ένταση ρεύµατος ανιχνευτή = 200 ma, Θερµοκρασία στήλης = 80 ο C, Ταχύτητα καταγραφέα = 5 cm/min, Ποσότητα δείγµατος = 6,0 µl, Στήλη (Β): DC ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (3 ο µέρος της άσκησης) Σκοπός του 3 ου πειράµατος είναι η εξοικείωση µας µε τη µέθοδο του εσωτερικού προτύπου και ο προσδιορισµός της περιεκτικότητας του κ-πεντανίου και του κ-οκτανίου µε χρήση του κ-επτανίου, ως εσωτερικό πρότυπο, σε άγνωστο µίγµα των τριών ενώσεων. Αντιδραστήρια 1. κ-πεντάνιο 2. κ-επτάνιο 3. κ-οκτάνιο 4. Μίγµα των τριών ενώσεων (1V:1V:1V) 5. Άγνωστο δείγµα 8

9 Προετοιµασία του οργάνου 1. Στήλη: Β 2. Θερµοκρασία: 80 ο C 3. Ροή φέροντος αερίου: 60 ml/min 4. Ταχύτητα καταγραφέα: 5 cm/min 5. ATTENUATION: 4 Πορεία εκτέλεσης 1. Λαµβάνουµε µε τη µικροσύριγγα 3,0 µl µίγµατος και εισάγονται στη στήλη ακαριαία. (Παρατήρηση 5). Παρατήρηση 5: Στην ποσοτική ανάλυση, δεν χρειάζεται αέρας µαζί µε το δείγµα. 1. Ταυτόχρονα τίθεται σε κίνηση το χαρτί του καταγραφέα. 2. Μετά την εµφάνιση των τριών κορυφών στο χρωµατογράφηµα διακόπτεται η καταγραφή (Σχήµα 6). 3. Η ίδια ακριβώς πορεία ακολουθείται και για το άγνωστο δείγµα. 4. Μετρώντας το ύψος κάθε κορυφής, h και το πλάτος της κορυφής στο ½ του ύψους, w 1/2 υπολογίζεται η επιφάνεια, Α κάθε κορυφής (Παρατήρηση 6): Α (cm 2 ) = h (cm) w 1/2 (cm) Παρατήρηση 6: Είναι δυνατό να συσχετιστεί η συγκέντρωση ενός συστατικού σε ένα µίγµα µε την επιφάνεια της κορυφής του στο χρωµατογράφηµα. Αρχικά, µετρώντας το ύψος της κάθε κορυφής και πολλαπλασιάζοντας µε το πλάτος στο 1/2 του ύψους προσδιορίζεται η επιφάνεια για κάθε κορυφή και στη συνέχεια µε πρόσθεση όλων των επιφανειών υπολογίζεται η συνολική επιφάνεια. Η % επιφάνεια βρίσκεται διαιρώντας την συνολική επιφάνεια µε τις επιµέρους επιφάνειες. Αυτή η % επιφάνεια εξαρτάται από τη συγκέντρωση του συστατικού στο µίγµα αλλά δεν είναι ακριβώς ανάλογη µε τη συγκέντρωση. Αυτό θα απαιτούσε η θερµική αγωγιµότητα όλων των συστατικών να είναι η ίδια, δηλαδή η απόκριση του ανιχνευτή πρέπει να είναι η ίδια για όλες τις ενώσεις. Αλλά κάτι τέτοιο δεν ισχύει. Για να χρησιµοποιήσει κανείς τις επιφάνειες για την ποσοτική ανάλυση πρέπει να προσδιοριστεί ένας συντελεστής (συντελεστής απόκρισης, response factor) για κάθε συστατικό, ο οποίος αν πολλαπλασιαστεί µε την επιφάνεια δίνει την ακριβή ποσότητα του συστατικού στο µίγµα, όταν όλες οι συνθήκες κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των προτύπων και των αγνώστων δειγµάτων παραµένουν απόλυτα σταθερές. 6. Υπολογίζεται ο Συντελεστής Απόκρισης, Σ.Α. για κάθε συστατικό του µίγµατος και ο Σχετικός Συντελεστής Απόκρισης (Σ.Σ.Α.) ως προς κ-επτάνιο: Σ.Α. = m (g) / A (cm 2 ) = d (g/cm 3 ) V (cm 3 ) / A (cm 2 ) και ΣΣΑ = ΣΑ / ΣΑ κ-εππτανίου 7. Ακολουθώντας την ίδια πορεία και για το χρωµατογράφηµα του αγνώστου µίγµατος και γνωρίζοντας αυτή τη φορά το σχετικό συντελεστή απόκρισης της κάθε ένωσης υπολογίζεται η ποσότητα της ουσίας στο µίγµα και από αυτή η % σύσταση του µίγµατος. (Παρατήρηση 7). Παρατήρηση 7: Αν κριθεί απαραίτητη η αλλαγή του attenuation κατά τη διάρκεια της ποσοτικής ανάλυσης τότε η επιφάνεια της κορυφής υπολογίζεται ως εξής: Α (cm 2 ) = h (cm) w 1/2 (cm) Attenuation Πριν φύγουµε από το εργαστήριο 1. Καθαρίζουµε τη µικροσύριγγα. 2. Ζητούµε από τον επιβλέποντα τον όγκο του κ-επτανίου (εσωτερικό πρότυπο) στο άγνωστο δείγµα, την πυκνότητα των ενώσεων του άγνωστου δείγµατος, τυχόν διευκρινήσεις για τη συγγραφή της έκθεσης και τις ερωτήσεις αυτοαξιολόγησης. 9

10 Οδηγίες για τη συγγραφή της έκθεσης 1. Θα περιγράψουµε συνοπτικά την αρχή του αεριοχρωµατογραφικού διαχωρισµού. Θα περιγράψουµε συνοπτικά την οργανολογία που χρησιµοποιήσαµε. 2. Θα παραθέσουµε τα χρωµατογραφήµατα σε κάθε τµήµα της άσκησης, στα οποία θα δίνονται οι συνθήκες εκτέλεσης του πειράµατος. Ειδικά θα αναφέρονται σε κάθε χρωµατογράφηµα: η ένωση που προσδιορίζεται, η κλίµακα του Attenuation, η ταχύτητα του καταγραφέα και ο ενιόµενος όγκος σε µl. 3. Οι υπολογισµοί θα γίνονται µε ευκρίνεια. Ιδιαίτερη σηµασία δίνεται στα σηµαντικά ψηφία. 4. Κατά τη συνοπτική παρουσίαση των αποτελεσµάτων, ποιοτικών και ποσοτικών, θα πρέπει να αναφέρουµε συγκεντρωτικά τα χαρακτηριστικά στοιχεία του δείγµατος, την ηµεροµηνία, τον χρόνος εκτέλεσης, τις µονάδες αποτελεσµάτων και τυχόν πειραµατικές δυσκολίες και ασυνήθιστα ή απρόβλεπτα προβλήµατα που παρουσιάστηκαν κατά την εκτέλεση της ανάλυσης. Σχήµα 6. Χρωµατογράφηµα του µίγµατος κ-πεντανίου, κ-επτανίου και κ-οκτανίου (κατά σειρά έκλουσης) στη στήλη Β. Σηµειώνεται ο τρόπος υπολογισµού του εµβαδού της κορυφής του κ-επτανίου. Ροή φέροντος αερίου: 60 ml/min, Attenuation = 4, Ένταση ρεύµατος ανιχνευτή = 200 ma, Θερµοκρασία στήλης = 80 ο C, Ταχύτητα καταγραφέα = 5 cm/min, Ποσότητα δείγµατος = 3,0 µl, Στήλη (Β): DC ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΥΤΟΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ 1. Περιγράψτε την αρχή της χρωµατογραφίας αερίου-υγρού. 2. Πώς λειτουργεί το ροόµετρο σαπωνοδιαλύµατος; 3. Περιγράψτε την αρχή λειτουργίας του ανιχνευτή θερµικής αγωγιµότητας. Ποια είναι τα πλεονεκτήµατα και ποιοι οι περιορισµοί του; 4. Ποιο είναι το πληρωτικό υλικό της πακεταρισµένης στήλης που χρησιµοποιήσατε; Σχολιάστε την πολικότητα της και τον µηχανισµό διαχωρισµού των ενώσεων του µίγµατος κ-προπανόλης, κ-βουτανόλης και κ-επτανίου. 5. Λαµβάνεται το αεριοχρωµατογράφηµα της κ-βουτανόλης (πολική ένωση) στους 80 C, πρώτα µε µια στήλη DC-200 (µη πολική) και µετά µε µια στήλη Carbowax 20M (πολική). Σε ποια στήλη ο χρόνος ανάσχεσης της βουτανόνης θα είναι µεγαλύτερος και γιατί; 6. Τι είδους σφάλµα (θετικό, αρνητικό ή κανένα) θα προκληθεί κατά τον ποσοτικό προσδιορισµό του κ- οκτανίου µε GC, αν εισάγεται ποσότητα προτύπου 1,5 µl, ενώ αγνώστου 1,2 µl. 10