Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Χ-φυλοσύνδετη σιδηροβλαστική αναιμία ευαίσθητη στην πυριδοξίνη: η πρώτη μελέτη περίπτωσης Δήμητρα-Μαρκέλλα Πιτροπάκη-Παυλάντου Μοριακή Βιολόγος Πάτρα,

2 Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας, [Δήμητρα-Μαρκέλλα Πιτροπάκη-Παυλάντου] [2017] Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος 2

3 Interdepartmental postgraduate program Medicinal Chemistry: Drug discovery and Design MSc THESIS X-linked sideroblastic anemia sensitive to pyridoxine: the first case study Dimitra-Markella Pitropaki-Pavlantou Molecular Biologist Patras,

4 University of Patras, Department of Chemistry, [Dimitra-Markella Pitropaki-Pavlantou] [2017] All rights reserved 4

5 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Πατρινός Γεώργιος, Επιβλέπων Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Πάιρας Γεώργιος, Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Φουστέρης Μανώλης, Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Επίκουρος Καθηγητής, Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 5

6 EVALUATION COMITTEE 1. Patrinos George, Supervisor Professor Associate Professor, Laboratory of Molecular Biology and Immunology, Department of Pharmacy, University of Patras 2. Pairas George, Co- examiner Professor Associate Professor, Laboratory of Medicinal Chemistry, Department of Pharmacy, University of Patras 3. Fousteris Manolis, Co- examiner Professor Assistant Professor, Laboratory of Medicinal Chemistry, Department of Pharmacy, University of Patras 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του ΔΜΠΣ Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων, κατά το ακαδημαϊκό έτος , υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιου Πατρινού. Για την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας ήταν καθοριστική η συμβολή και η βοήθεια συγκεκριμένων προσώπων που με στήριξαν καθ όλη τη διάρκεια της προσπάθειάς μου. Ευχαριστώ θερμά τον κ. Γεώργιο Πατρινό, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε να εκπονήσω τη μεταπτυχιακή μου εργασία στο εργαστήριό του, την υποστήριξη και τη βοήθεια που μου προσέφερε. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω, τον κ. Πάιρα, Αναπληρωτή Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής και τον κ. Φουστέρη, Επίκουρο Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής, για τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή, καθώς και για τη συνεργασία τους. Ένα μεγάλο και ειλικρινές ευχαριστώ οφείλω στη μεταδιδάκτορα Δρ. Θεοδώρα Κατσίλα για την πολύτιμη καθοδήγηση στο ερευνητικό μέρος της εργασίας. Η συμβολή της στην καλλιέργεια ερευνητικού τρόπου σκέψης ήταν ανεκτίμητη. Οι υποδείξεις της θα είναι για μένα ένας σημαντικός οδηγός και πολύτιμος «συνεργάτης». Ξεχωριστά θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Κωνσταντίνα Χαλικιοπούλου. Την ευχαριστώ για την άψογη συνεργασία μας, για τις ώρες που πάντα πρόθυμα μου αφιέρωνε, συμβουλεύοντάς με στις προκύπτουσες δυσκολίες, για όλες τις όμορφες στιγμές που μοιραστήκαμε. Ολοκληρώνοντας, δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω όλα τα υπόλοιπα μέλη της ομάδας του εργαστήριου για το πολύ όμορφο καθημερινό κλίμα στο εργαστήριο. 7

8 8

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι σιδηροβλαστικές αναιμίες αποτελούν μία ετερογενή ομάδα κληρονομικών και επίκτητων διαταραχών της βιοσύνθεσης της αίμης. Η πιο συχνή από τις κληρονομικές μορφές σιδηροβλαστικής αναιμίας είναι η Χ-συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία. Η νόσος χαρακτηρίζεται από μικρά, υπόχρωμα ερυθρά κύτταρα, μη- αιμολυτική αναιμία και παρουσία σημαντικού αριθμού δακτυλιοειδών σιδηροβλαστών στο μυελό των οστών. Οι εν λόγω σιδηροβλάστες εμφανίζουν περίσσεια σιδήρου στα μιτοχόνδρια, με δακτυλιοειδή κατανομή. Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία, έχει συσχετιστεί με γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2, το οποίο κωδικοποιεί το ένζυμο συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος. Η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος καταλύει το πρώτο βήμα του μονοπατιού βιοσύνθεσης της αίμης και η καταλυτική της ενεργότητα εξαρτάται από την 5- φωσφορική πυριδοξάλη, η οποία δρα ως συμπαράγοντας του ενζύμου. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 90 τέτοιες γενωμικές παραλλαγές, οι περισσότερες από τις οποίες είναι παρερμηνεύσιμες. Οι εν λόγω παραλλαγές εντοπίζονται σε εξώνια τα οποία κωδικοποιούν την καταλυτική επικράτεια της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος, γεγονός που διαταράσσει την εύρυθμη λειτουργία του μονοπατιού βιοσύνθεσης της αίμης, δυσχεραίνοντας τον ομαλό σχηματισμό της και μειώνοντας την παραγωγή της. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή αιμοσφαιρίνης. Οι παραλλαγές επιδρούν στη δευτεροταγή δομή του ενζύμου, με αποτέλεσμα τη μη σωστή αναδίπλωσή του και τη μειωμένη συγγένειά του ως προς τον συμπαράγοντα 5- φωσφορική πυριδοξάλη. Η χορήγηση πυριδοξίνης, η οποία μεταβολίζεται σε 5- φωσφορική πυριδοξάλη, μπορεί να αντισταθμίσει τη μειωμένη συγγένεια του ενζύμου συμβάλλοντας στην αύξηση των επιπέδων της αίμης και κατ επέκταση της αιμοσφαιρίνης. Ωστόσο, στις περισσότερες περιπτώσεις ασθενών, τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης αν και αυξάνονται, δεν επιστρέφουν στις φυσιολογικές τιμές, ενώ παρατηρείται ότι τα μη φυσιολογικά ευθροκύτταρα, όπως και οι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες, δεν εξαλείφονται πλήρως. Οι ασθενείς με Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία παρουσιάζουν ανομοιομορφία ως προς τον τρόπο με τον οποίο ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Πλήθος δεδομένων υποδεικνύει τον σχετικό ρόλο των γενωμικών παραλλαγών στο γονίδιο ALAS2. Επιπρόσθετα στο γεγονός αυτό, εκτός από τις γενωμικές παραλλαγές στο 9

10 γονίδιο ALAS2, επιδρούν και άλλοι γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως είναι η ηλικία και το φύλο. Η Χ-συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία συνήθως εκδηλώνεται μέχρι την ηλικία των 30 ετών, ωστόσο έχουν περιγραφεί αρκετές περιπτώσεις εκδήλωσης της νόσου σε ηλικίες πάνω από 60 ετών. Οι κλινικά σιωπηλές γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2 θα μπορούσαν να γίνουν εμφανείς αργότερα στη ζωή εάν αναπτυχθεί ανεπάρκεια πυριδοξίνης, λόγω διάφορων φαινομένων σχετιζόμενα με τη γήρανση όπως διαταραχές στη λειτουργία του μεταβολισμού ή απενεργοποίηση Χ χρωμοσωμάτων στις γυναίκες. Στην παρούσα εργασία, ύστερα από βιβλιογραφική ανασκόπηση και εκτεταμένη χρήση βάσεων γενωμικών δεδομένων, επιλέχθηκαν να μελετηθούν 13 μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, ώστε να διερευνηθεί η συσχέτισή τους με την ανταπόκριση στην πυριδοξίνη Έλληνα ασθενούς με Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία, προχωρημένης ηλικίας. Στόχος αυτής της διερεύνησης είναι ο προσδιορισμός της ύπαρξης γενωμικών παραλλαγών στο υπό μελέτη δείγμα, γεγονός που επιβεβαιώνει τη συσχέτιση της γενετικής βάσης της νόσου με την ανταπόκριση στη συμπλήρωση με πυριδοξίνη. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για την ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος DNA που πιθανά φέρει την παραλλαγή και αλληλούχιση του τμήματος αυτού, ώστε να προσδιοριστεί ο γονότυπος του ασθενούς. Τα ευρήματα αυτή της διερεύνησης συνηγορούν πως ο ανταποκρινόμενος στη θεραπεία με πυριδοξίνη ασθενής, δε φέρει στο γονιδίωμά του κάποιον από τους υπό μελέτη μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς. Το γεγονός αυτό, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο ασθενής πιθανά φέρει στο γονιδίωμά του κάποια de novo γενωμική παραλλαγή, η οποία δικαιολογεί τόσο την εμφάνιση της νόσου όσο και την ανταπόκριση που παρουσιάζει στη θεραπεία. Το σενάριο αυτό, είναι ιδιαίτερα πιθανό, καθώς περίπου οι μισές από το σύνολο προηγούμενων μελετών για περιπτώσεις ασθενών με X- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία ανταποκρινόμενοι στη θεραπεία με πυριδοξίνη, αφορούν de novo γενωμικές παραλλαγές. Λέξεις κλειδιά: Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία, δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες, συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος, πυριδοξίνη, μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός, ιατρική ακριβείας 10

11 ABSTRACT Sideroblastic anemias are a heterogeneous group of hereditary and acquired of heme biosynthesis disorders. The most common form of hereditary sideroblastic anemia, is X- linked sideroblastic anemia. The disease is characterized by small, hypochromic red cells, non-haemolytic anemia, and the presence of a significant number of sideroblastic rings in the bone marrow. These sideroblastic rings are iron- loaded in the mitochondria. X-linked sideroblastic anemia has been associated with genomic variants in the ALAS2 gene, which encodes the δ- aminolevulinate synthase. δ- aminolevulinate synthase catalyses the first step of the heme biosynthesis pathway and its catalytic activity is dependent on pyridoxal 5-phosphate, which acts as cofactor of the enzyme. To date, about 90 genomic variants, most of which are missense, have been identified. These variants are localized to exons coding for the catalytic domain of δ- aminolevulinate synthase, which disrupts the fuction of the heme biosynthesis pathway. The variations affect the secondary structure of the enzyme, resulting in its inappropriate folding and its reduced affinity for cofactor pyridoxal-5-phosphate. Administration of pyridoxine, which is metabolised to pyridoxal-5-phosphate, could compensate for the decreased affinity of the enzyme to increase hemoglobin levels. However, in most cases of patients, hemoglobin levels, although increased, do not return to normal values, while abnormal red cells and sideroblastic anemias are not completely eliminated. Patients with X-linked sideroblastic anemia are heterogeneous in the way they respond to pyridoxine therapy. Numerous data indicate the relative role of genomic variants in the ALAS2 gene. In addition, other genetic and environmental factors such as age and gender contribute to this. X- linked sideroblastic anemia usually appears until the age of 30, however, several cases have been described in over 60 years of age. Clinically silent genomic variants in the ALAS2 gene could become apparent later in life, if pyridoxine deficiency develops due to various age-related phenomena such as metabolic disorders and inactivation of chromosome X in women. In the present study, following a bibliographic review and extensive use of genomic databases, 13 mononucleotide polymorphisms were chosen to investigate their 11

12 association with the response of pyridoxine in a Greek patient with X-linked sideroblastic anemia. The aim of this study is to determine the existence of genomic variants in the studied sample, which confirms the genetic basis of the disease by the response to pyridoxine supplementation. For this purpose, the polymerase chain reaction method to amplify the desired DNA fragment and sequencing of PCR product were used, to determine the patient's genotype. These findings suggest that the pyridoxine-responsive patient does not carry any of the mononucleotide polymorphisms studied in his genome. This leads to the conclusion that the patient may have a de novo genomic variant in his genome, which justifies both the onset of the disease and the response to the treatment. This scenario is particularly likely, as the majority of previous studies of patients with X-linked iron-deficient anemia responding to pyridoxine therapy are related to de novo genomic variants. Key words: X- linked sideroblastic anemia, sideroblastic rings, δ- aminolevulinate synthase, pyridoxine, single nucleotide polymorphisms, medical precision 12

13 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΟΙ ALAS: aminolevulinate synthase συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος ddntps: διδεοξυνουκλεοτίδια dntps: δεοξυνουκλεοτίδια MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration- μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης MCV: mean corpuscular volume- μέσος όγκος ερυθρών κυττάρων PCP: polymerase chain reaction- αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PLP: pyridoxal phosphate- 5 φωσφορική πυριδοξάλη RARS: refractory anaemia with ring sideroblasts- ανθεκτική αναιμία με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες RBC: red blood cells- ερυθροκύτταρα scoa: ηλέκτρυλο συνένζυμο Α SNPs: single nucleotide polymorphisms μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί XLSA: X-linked sideroblastic anemia- Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία 13

14 14

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT...11 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΟΙ Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υπόχρωμες μικροκυττταρικές αναιμίες Σιδηροβλαστικές αναιμίες Ταξινόμηση σιδηροβλαστικών αναιμιών Η X- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία (XLSA) Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία με καθυστέρηση στην έναρξη Η μοριακή βάση της Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας Η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος Η δομή της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος Η 5- φωσφορική πυριδοξάλη Σύμπλοκο της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος και του συμπαράγοντα 5- φωσφορική πυριδοξάλη Το γονίδιο ALAS Διάγνωση Θεραπεία Φαρμακογονιδιωματική

16 1.12. Μονονουκλεοτιδικοί Πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) Βιβλιογραφικά δεδομένα και στοιχεία γενωμικών βάσεων δεδομένων Σκοπός ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Απομόνωση DNA από ολικό περιφερικό αίμα Έλεγχος ποιότητας και προσδιορισμός της συγκέντρωσης απομονωθέντος δείγματος Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν Σχεδιασμός ζεύγους εκκινητών Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymarase Chain Reaction- PCR) Αρχή της μεθόδου Τα στάδια της αντίδρασης PCR Τα αντιδραστήρια της PCR Βαθμιδωτή PCR PCR τύπου touchdown Πρωτόκολλα και αντιδραστήρια της PCR που χρησιμοποιήθηκαν Ηλεκτροφόρηση Αρχή της μεθόδου Αντιδραστήρια για την προετοιμασία του πηκτώματος αγαρόζης Πρωτόκολλο προετοιμασία του πηκτώματος αγαρόζης Καθαρισμός προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Πρωτόκολλο καθαρισμού προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

17 2.8. Αλληλούχιση DNA (Sanger Sequencing) Αρχή της μεθόδου..74 ΙΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πηκτώματα αγαρόζης Χρωματογραφήματα Γονότυπος ασθενούς. 86 ΙV. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ V. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

18 18

19 I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Υπόχρωμες μικροκυττταρικές αναιμίες Ως αναιμία ορίζεται η μείωση της συγκέντρωσης της αιμοσφαιρίνης περισσότερο από δύο σταθερές αποκλίσεις από το μέσο όρο για την ηλικία του ατόμου. Η ταξινόμηση των αναιμιών λαμβάνει χώρα στη βάση: 1. του μέσου όγκου ερυθροκυττάρων για την ηλικία του ατόμου (MCV) 2. της τιμής της μέσης συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης ανά ερυθροκύτταρο (MCHC) 3. της παθογένειας Πιο συγκεκριμένα ανάλογα με το αν ο μέσος όγκος ερυθροκυττάρων για την ηλικία ενός ατόμου είναι φυσιολογικός, αυξημένος, ή μειωμένος, η αναιμία διακρίνεται σε ορθοκυτταρική, μακροκυτταρική ή μικροκυτταρική αντίστοιχα (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003). Σύμφωνα με την τιμή της μέσης συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης ανά ερυθροκύτταρο, οι αναιμίες διακρίνονται σε υπέρχρωμες, ορθόχρωμες και υπόχρωμες (Γαρδίκας, 1989). Η υπόχρωμη, μικροκυτταρική αναιμία χαρακτηρίζεται από MCHC και MCV τιμές χαμηλότερες από τις φυσιολογικές. Οι φυσιολογικές τιμές για τo MCV κυμαίνονται μεταξύ fl και για το MCHC μεταξύ g/dl. Με βάση την παθογένεια, οι υπόχρωμες, μικροκυτταρικές αναιμίες διακρίνονται σε: 1. Μικροκυτταρικές αναιμίες Οφείλονται σε διαταραχές του μεταβολισμού του σιδήρου, οι οποίες μπορούν να διακριθούν σε: Σιδηροπενική αναιμία Είναι η πιο συχνή μικροκυτταρική αναιμία και ιδιαίτερα σε ηλικίες 1 έως 3 χρονών, καθώς επίσης και η συχνότερη στερητική αναιμία παγκοσμίως. Χαρακτηρίζεται από χαμηλή αιμοσφαιρίνη, χαμηλές τιμές MCV, μειωμένη ποσότητα σιδήρου και φερριτίνης (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003). Αναιμία χρόνιας νόσου Πρόκειται για αναιμία η οποία συνοδεύει χρόνιες λοιμώξεις, φλεγμονώδεις διαταραχές ή νεοπλασίες. Η εμφάνισή της σχετίζεται με τη μειωμένη διάρκεια ζωής των ερυθροκυττάρων, την ανεπαρκή παραγωγή ερυθροποιητίνης από τους νεφρούς και διαταραχές στο μεταβολισμό του σιδήρου (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003). 19

20 2. Σιδηροβλαστικές αναιμίες Αποτελούν μια ετερογενή ομάδα από υπόχρωμες, μικροκυτταρικές αναιμίες οι οποίες μπορεί να είναι κληρονομικές ή επίκτητες. Σε όλες τις σιδηροβλαστικές αναιμίες, η βιοσύνθεση της αίμης δυσλειτουργεί, παρά την κανονική παροχή σιδήρου στα μιτοχόνδρια, ενώ ο μη χρησιμοποιούμενος σίδηρος συσσωρεύεται σε αυτά τα οργανίδια με τη μορφή αλάτων σιδήρου (Cox et al., 1994). 3. Μεσογειακά Σύνδρομα Αποτελούν κληρονομικές διαταραχές της σύνθεσης των α και β αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης. Υπάρχουν διάφοροι τύποι μεσογειακής αναιμίας ανάλογα με την πολυπεπτιδική αλυσίδα, της οποίας η παραγωγή είναι μειωμένη (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003) Σιδηροβλαστικές αναιμίες Οι σιδηροβλαστικές αναιμίες χαρακτηρίζονται από ελλιπή βιοσύνθεση της αίμης. Συγκεκριμένα, παρατηρείται αδυναμία μετατροπής της πρωτοπορφυρίνης ΙΧ σε αίμη στο μιτοχόνδριο, η οποία εν συνεχεία θα ενωθεί με τη σφαιρίνη οδηγώντας στον σχηματισμό της αιμοσφαιρίνης (Cotter et al., 1995). Παρατηρείται ακόμη αδυναμία δέσμευσης σιδήρου στη πρωτοπορφυρίνη ΙΧ με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του σιδήρου στα μιτοχόνδρια των ερυθροβλαστών. Φυσιολογικά, ο σίδηρος στο αίμα είναι συνδεδεμένος με την τρανσφερρίνη. Εισέρχεται με ενεργό τρόπο στο κύτταρο απελευθερούμενος από την τρανσφερρίνη, γεγονός που ελέγχει την εισροή του στο κύτταρο. Ο σίδηρος στον ερυθροβλάστη εισέρχεται στα μιτοχόνδρια και ενσωματώνεται στις πορφυρίνες για το σχηματισμό της αίμης. Στα μιτοχόνδρια, με τη συμβολή διαφόρων ενζύμων σύνθεσης πορφυρινών, όπως η συνθετάση της αίμης, παρέχεται η ενέργεια για τις απαραίτητες αντιδράσεις. Η αίμη ρυθμίζει την πρόσληψη σιδήρου εμποδίζοντας ταυτόχρονα την είσοδο περίσσειας σιδήρου. Σε διαταραχές σύνθεσης της αίμης αυτός ο μηχανισμός ανάδρασης δεν υφίσταται και αυξημένη ποσότητα σιδήρου εισέρχεται στο κύτταρο και στα μιτοχόνδρια (Μελέτης και Κωνσταντόπουλος, 2010) γεγονός που τους προσδίδει τη χαρακτηριστική εικόνα των «δακτυλιοειδών σιδηροβλαστών» (Εικόνα 1). 20

21 Η Διεθνής Ομάδα Εργασίας για τη Μορφολογία του Μυελοδυσπλαστικού Συνδρόμου, (IWGM-MDS) σημειώνει ότι οι σιδηροβλαστικοί δακτύλιοι μπορούν να οριστούν ως ερυθροβλάστες στους οποίους υπάρχουν τουλάχιστον πέντε κοίλοι κόκκοι, οι οποίοι καλύπτουν τουλάχιστον το ένα τρίτο της περιφέρειας του πυρήνα (Cazzola et al., 2011). Εικόνα 1: Αντιπροσωπευτικό επίχρισμα περιφερικού αίματος και μυελού των οστών από ασθενή με Χ-συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία. Α. Επιφανειακό επίχρισμα αίματος που εμφανίζει πολλά υπόχρωμα και μικροκυτταρικά κύτταρα. Β. Μυελός των οστών που παρουσιάζει ερυθροειδή υπερπλασία. Οι ερυθροβλάστες είναι μικροί με ανώμαλη συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης και οδοντωτό κυτταρόπλασμα. C. Μυελός των οστών που παρουσιάζει ερυθροβλάστες με ελαττωμένη αιμοσφαιρίνη (αριστερά) και ερυθροβλάστες που περιέχουν πολλαπλά σωματίδια Pappenheimer (δεξιά). D. Κηλίδωση μυελού των οστών. Η χρώση Perls δείχνει ότι οι περισσότεροι ερυθροβλάστες είναι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες με τουλάχιστον πέντε θετικούς κόκκους διατεταγμένους σε ένα δακτύλιο που περιβάλλει το ένα τρίτο ή περισσότερο της περιφέρειας του πυρήνα (Cazzola et al., 2011). Οι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες ανιχνεύονται με μπλε χρώση (αντίδραση του Perl) ως περιπυρηνικοί δακτύλιοι μπλε κοκκίων γύρω από τον πυρήνα (May et al., 1998). Φυσιολογικά τα μιτοχόνδρια λαμβάνουν ενεργό ρόλο στη σύνθεση αιμοσφαιρίνης από τους ερυθροβλάστες. Έχουν αρχικά περιπυρηνική θέση. Όσο τα κύτταρα ωριμάζουν ο πυρήνας γίνεται πυκνωτός και τα μιτοχόνδρια πηγαίνουν στην περιφέρεια του κυττάρου. Αυτή η μετακίνηση των μιτοχονδρίων δε συμβαίνει στη σιδηροβλαστική 21

22 αναιμία. Τα μιτοχόνδρια καθηλώνονται περιπυρηνικά και στην ουσία είναι αδρανή αφού τα ένζυμά τους έχουν καταστραφεί από τα αδιάλυτα αθροίσματα σιδήρου (Μελέτης και Κωνσταντόπουλος, 2010). Οι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες εντοπίζονται αποκλειστικά σε παθολογικές περιπτώσεις και δε σχετίζονται με τους σιδηροβλάστες φερριτίνης, οι οποίοι υπάρχουν φυσιολογικά στον μυελό των οστών (Cazzola et al., 2011). Παθολογικοί ερυθροβλάστες με άφθονα κοκκία σιδήρου κατά μικρές αθροίσεις τυχαία κατανεμημένες στο κυτταρόπλασμα μπορεί να βρεθούν σε δυσερυθροποιήσεις, στη μεσογειακή αναιμία ή στη μεγαλοβλαστική αναιμία Ταξινόμηση σιδηροβλαστικών αναιμιών Οι κληρονομικοί τύποι της σιδηροβλαστικής αναιμίας είναι φυλοσύνδετοι ή αυτοσωμικοί και οι επίκτητες μορφές της είναι ιδιοπαθείς ή δευτεροπαθείς. Οι ασθενείς σε αυτές τις ταξινομήσεις μπορούν να υποδιαιρεθούν περαιτέρω σε εκείνους που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη και εκείνους που είναι ανθεκτικοί σε αυτή (Cotter et al., 1992). Η κληρονομική σιδηροβλαστική αναιμία μπορεί να εμφανιστεί ως μεμονωμένη συγγενής διαταραχή (πιθανά λόγω νέας γενωμικής παραλλαγής) ή ως αυτοσωμικό ελάττωμα. Στις περισσότερες περιπτώσεις ακολουθεί ένα πρότυπο κληρονομικότητας που συνδέεται με το χρωμόσωμα Χ (Cox et al., 1994). 1. Κληρονομικές Όπως και σε όλες τις σιδηροβλαστικές αναιμίες, οι κληρονομικές σιδηροβλαστικές αναιμίες χαρακτηρίζονται από την παρουσία υπόχρωμων μικροκυτταρικών ερυθρών αιμοσφαιρίων στο αίμα, και μιτοχόνδρια με κοκκία σιδήρου που είναι διατεταγμένα σε περιπυρηνικό δακτύλιο στους ερυθροβλάστες (Bottomley et al., 1995). Υπάρχει μειωμένη σύνθεση της αίμης και αναποτελεσματική ερυθροποίηση (Edgar et al., 1998). Οι δύο συνηθέστερες μορφές συγγενούς σιδηροβλαστικής αναιμίας είναι η συνδεδεμένη με το χρωμόσωμα Χ μορφή, η οποία οφείλεται σε γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2 και η αυτοσωμική υπολειπόμενη μορφή, η οποία οφείλεται σε γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο SLC25A38. Ακόμη, αυτοσωμική μορφή σιδηροβλαστικής αναιμίας μπορεί να προκληθεί ύστερα από ανεπάρκεια του γονιδίου 22

23 GLRX5. Οι μορφές αυτές σιδηροβλαστικής αναιμίας έχουν παρόμοιες αιματολογικές εικόνες, αλλά εντελώς διαφορετικές κλινικές σειρές (Cazzola et al., 2011). Κατά το φυλοσύνδετο τύπο κληρονομικότητας. Πρόκειται για τη Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία, η οποία προκαλείται από γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2. Εμφανίζεται συνήθως σε παιδιά ή σε νεαρούς ενήλικες. Η αναιμία είναι συνήθως σοβαρή και στη μορφολογία των ερυθρών κυττάρων υπάρχει ανισοκυττάρωση, ελλειποκυττάρωση και βασεόφιλη στίξη μαζί με φυσιολογικά ερυθρά κύτταρα προσδίδοντας την εικόνα δίμορφου πληθυσμού (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003). Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία είναι μια διαταραχή, στην οποία τουλάχιστον το 50% των ασθενών ανταποκρίνεται στη θεραπεία με πυριδοξίνη βελτιώνοντας σημαντικά τα συμπτώματα της αναιμίας (Cox et al., 1994). Η πρόληψη και η θεραπεία της υπερφόρτωσης σιδήρου είναι επίσης σημαντική και μπορεί να επιτευχθεί γενικά μέσω της φλεβοτομής (Cazzola et al., 2011). Κατά τον αυτοσωμικό τύπο κληρονομικότητας. Μελέτες σε άτομα με οικογενή ή σποραδική συγγενή σιδηροβλαστική αναιμία χωρίς γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2 έδειξαν πολλαπλές πρόσθετες γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο SLC25A38. Το SLC25A38 κωδικοποιεί για την ερυθροειδή ειδική πρωτεΐνη του μιτοχονδριακού φορέα μέσω της οποίας ο σίδηρος εισάγεται στα μιτοχόνδρια και η οποία είναι σημαντική για τη βιοσύνθεση της αίμης σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Cazzola et al., 2015). Ακόμη, η ανεπάρκεια στο γονίδιο GLRX5 μπορεί να προκαλέσει αυτοσωμική σιδηροβλαστική αναιμία, καθώς οδηγεί σε μείωση της βιοσύνθεση της αίμης. Οι ασθενείς με αυτοσωμική σιδηροβλαστική αναιμία σπάνια ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη (Cazzola et al., 2011). 2. Επίκτητες. Διακρίνονται σε ιδιοπαθείς και δευτεροπαθείς. Οι ασθενείς με την επίκτητη διαταραχή σπάνια ανταποκρίνονται σε συμπληρώματα πυριδοξίνης (Cox et al., 1994). Ιδιοπαθείς Ως ιδιοπαθής επίκτητη σιδηροβλαστική αναιμία αναφέρεται η επίκτητη αναιμία η οποία εμφανίζεται συνήθως χωρίς γνωστή αιτία προδιάθεσης ως κλωνική διαταραχή στη μετέπειτα ζωή (Cox et al., 1994). 23

24 Δευτεροπαθείς Η δευτεροπαθής μορφή σιδηροβλαστικής αναιμίας μπορεί να οφείλεται σε αιματολογικές παθήσεις (λευχαιμία), σε νεοπλάσματα (λέμφωμα), σε νόσους του συνδετικού ιστού (οζώδη πολυαρτηρίτιδα) (Αθανασίου- Μεταξά και συν., 2003) ή ακόμη μπορεί να εμφανιστεί μετά από μακροχρόνια λήψη αντιφυματικών φαρμάκων, όπως κυκλοσερίνης, πυραζιναμίδης και ιδιαίτερα της ισονιαζίδης, η οποία ανταγωνίζεται την πυριδοξίνη. Στην τελευταία περίπτωση, η αναιμία αναστρέφεται μετά από διακοπή του φαρμάκου, ενώ κατά τη χορήγησή του, συνίσταται η λήψη υψηλών δόσεων πυριδοξίνης (Μελέτης και Κωνσταντόπουλος, 2010) Η X- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία (XLSA) Η Χ-συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία είναι η πιο συχνή από τις κληρονομικές μορφές της σιδηροβλαστικής αναιμίας (Cotter et al., 1999). Αποτελεί μία σοβαρή διαταραχή η οποία χαρακτηρίζεται από τον ανεπαρκή σχηματισμό αίμης και τη συσσώρευση σιδήρου στους ερυθροβλάστες των μιτοχονδρίων (Astner et al., 2005). Η νόσος περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1945 από τον Thomas Cooley, ο οποίος ανέφερε τα κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά δύο αδελφών από μια μεγάλη οικογένεια, η οποία σε πολλές προηγούμενες γενιές είχε βιώσει πρόωρους θανάτους σε πάσχοντες. Η ανταποκρινόμενη στη θεραπεία με πυριδοξίνη XLSA, περιγράφηκε πρώτη φορά το 1956 από τους Harris και Cooley, ενώ ακολούθησαν πολλές ακόμη μελέτες αντίστοιχων περιπτώσεων (Cotter et al., 1992, Cotter et al., 1994, Cox et al., 1994, Prades et al., 1995, Cotter et al., 1995, Edgar et al., 1997, Edgar et al., 1998, Futuyama et al., 1998, Cotter et al., 1999, Harigae et al., 1999, Cazzola et al., 2000, Futuyama et al., 2003, Rollon et al., 2015, Mendez et al., 2016 ). Η χαρακτηριστική υπόχρωμη, μικροκυτταρική αναιμία εμφανίζεται συνήθως στις πρώτες τρεις δεκαετίες της ζωής (Cotter et al., 1995) και προκαλείται από σημειακές γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2, οι οποίες οδηγούν σε ανεπάρκεια της συνθετάσης του δ-αμινολεβουλινικού οξέος. Το ένζυμο αυτό, καταλύει το πρώτο βήμα στο μονοπάτι της βιοσύνθεσης της αίμης. Μέχρι σήμερα έχουν αναφερθεί 90 γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος και οι περισσότερες από αυτές είναι 24

25 παρερμηνεύσιμες (Mendez et al., 2016). Αυτές οι γενωμικές παραλλαγές είναι διασκορπισμένες στην περιοχή του γονιδίου που κωδικοποιεί για την καταλυτική επικράτεια και σε αρκετές περιπτώσεις επηρεάζουν κατάλοιπα τα οποία είναι συντηρημένα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης (May et al., 1998). Χαρακτηριστικά συντηρημένα κατάλοιπα, τα οποία αντικαθίστανται σε περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία είναι το κατάλοιπο Phe165 (Cotter et al., 1994), τα κατάλοιπα Tyr199, Arg452, Arg411 (Cotter et al., 1999), το κατάλοιπο Gly148 (Prades et al., 1995), το κατάλοιπο Thr388 (Cox et al., 1994), το κατάλοιπο Ile476 (Cotter et al., 1992), το κατάλοιπο His524 (Edgar et al., 1998), το κατάλοιπο R452 (Edgar et al., 1997), το κατάλοιπο Lys248 (Astner et al., 2005). Οι γενωμικές παραλλαγές βρέθηκαν να παρεμποδίζουν τη δέσμευση του υποστρώματος, να διαταράσσουν την επιφάνεια του διμερούς ή να παρεμποδίζουν τη σωστή αναδίπλωση του (Harigae et al., 2003). Ακόμη έχει παρατηρηθεί αστάθεια λόγω έλλειψης του συμπαράγοντα 5- φωσφορική πυριδοξάλη, ή λόγω μειωμένης συγγένειας μεταξύ του συμπαράγοντα και του ενζύμου (May et al., 1998). Η φαινοτυπική έκφραση της Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας ποικίλλει σημαντικά στα αρσενικά άτομα και σχετίζεται εν μέρει με τον τύπο της γενωμικής παραλλαγής στο γονίδιο ALAS2 (Cazzola et al., 2002). Τα ασθενή αρσενικά άτομα μπορεί να εμφανίσουν συμπτώματα αναιμίας κατά τις δύο πρώτες δεκαετίες της ζωής τους ή στη μέση ηλικία με εκδηλώσεις δευτερογενούς υπερφόρτωσης σιδήρου (Cazzola et al., 2015). Τα θηλυκά ετερόζυγα άτομα στην πλειοψηφία τους δεν εμφανίζουν κλινικές ενδείξεις επειδή τα ανώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) που εκφράζουν τη φυσιολογική συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος, είναι επαρκή για να διατηρήσουν ένα φυσιολογικό επίπεδο παραγωγής RBCs (Cazzola et al., 2000). Οι γυναίκες φορείς της Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας εμφανίζουν έναν δίμορφο πληθυσμό φυσιολογικών και μη, ερυθροκυττάρων (Cotter et al., 1995). Λιγότερα συχνά εμφανίζουν φυσιολογικό ερυθροκυτταρικό προφίλ και μόνο σπάνια παρουσιάζουν αναιμία με την αδρανοποίηση του παραλλαγμένου ή του φυσιολογικού αλληλόμορφου (Bottomley et al., 1995). 25

26 Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία με καθυστέρηση στην έναρξη Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία εμφανίζεται συνήθως έως την τρίτη με τέταρτη δεκαετία της ζωής, ωστόσο, υπάρχουν περιπτώσεις που μπορεί να εκδηλωθεί μεταγενέστερα. Η XLSA με καθυστέρηση στην έναρξη αξίζει ιδιαίτερη αναφορά καθώς είναι εξαιρετικά σπάνια, αλλά και επειδή στις περιπτώσεις που έχουν αναφερθεί δεν υπήρξε άμεση ένδειξη ότι οι γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2 είχαν ως αποτέλεσμα την ασθένεια (Furuyama et al., 2003). Σε συγκεκριμένη μελέτη ασθενούς από τον Furuyama K. και τους συνεργάτες του το 2003, αναφέρεται ασθενής με XLSA με καθυστέρηση εκδήλωσης, ο οποίος ανέπτυξε την ασθένεια μετά από αιμοκάθαρση. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με μοριακή ανάλυση του γονιδίου ALAS2. Παρόλο που η αναιμία ήταν σοβαρή, αυτή η διαταραχή θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως ήπια, λόγω του ότι ήταν εξαιρετικά θεραπεύσιμη με πυριδοξίνη. Η θεραπεία με πυριδοξίνη απέκλεισε τους δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες από τον μυελό των οστών και είχε ως αποτέλεσμα τη μη ανάγκη πραγματοποίησης μεταγγίσεων (Futuyama et al., 2003). Μειωμένα επίπεδα πυριδοξίνης στο πλάσμα εμφανίζονται σε ηλικιωμένα άτομα λόγω μειωμένης πρόσληψης πυριδοξίνης και σχετιζόμενης με την ηλικία αλλοίωσης του μεταβολισμού της πυριδοξίνης (May et al.,1998). Ακόμη, η ανεπάρκεια της πυριδοξίνης μπορεί να προκαλέσει σιδηροβλαστική αναιμία, και ιδιαίτερα σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χρόνια αιμοκάθαρση (Furuyama et al., 2003). Οι κλινικά σιωπηλές γενωμικές παραλλαγές στο γονίδιο ALAS2 θα μπορούσαν να γίνουν εμφανείς αργότερα στη ζωή εάν αναπτυχθεί ανεπάρκεια της ενεργής μορφής της πυριδοξίνης- PLP λόγω διατροφικών συνηθειών ή εάν εμφανιστεί μια παρέμβαση όπως η αιμοκάθαρση (Furuyama et al., 2003). Άλλα φαινόμενα σχετιζόμενα με τη γήρανση, όπως η μειωμένη αναπνοή που οδηγεί σε μειωμένη ικανότητα μεταφοράς και συναρμολόγησης του ενζύμου συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος και η αύξηση της εξάπλωσης της απενεργοποίησης χρωμοσωμάτων Χ στις γυναίκες, μπορούν επίσης να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην εμφάνιση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας. Αυτές οι διαταραχές, ποικίλης σοβαρότητας, υπογραμμίζουν τη συμμετοχή και άλλων παραγόντων εκτός από τη γενωμική παραλλαγή, όπως είναι το φύλο και η ηλικία (May et al., 1998). Διαφορετικοί γενετικοί και επίκτητοι παράγοντες μπορεί να οδηγήσουν σε ένα μη φυσιολογικό πρότυπο απενεργοποίησης χρωμοσωμάτων Χ στις γυναίκες. Όπως σε 26

27 οποιαδήποτε διαταραχή που συνδέεται με το χρωμόσωμα Χ ο κλινικός φαινότυπος των θηλυκών φορέων μπορεί να επηρεάζεται από το μοτίβο απενεργοποίησης χρωμοσωμάτων Χ. Το γεγονός αυτό αποτελεί μία ακόμη περίπτωση καθυστερημένης εμφάνισης XLSA σε ετερόζυγα θηλυκά άτομα (Cazzola et al.,2002). Τέλος, σε ορισμένες περιπτώσεις έχει εμφανιστεί σύγχυση στη διάγνωση μεταξύ XLSA και συνδρόμου RARS. Το RARS είναι μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από αναιμία, ερυθροειδή δυσπλασία, λιγότερο από 5% βλάστες και 15% ή και περισσότερο εμφάνιση δακτυλιοειδών σιδηροβλαστών στον μυελό των οστών. Πρόκειται για διαταραχή που εντοπίζεται κυρίως σε ηλικιωμένα άτομα. Ασθενείς με RARS τυπικά δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Η μοριακή ανάλυση καθίσταται αναγκαία υποδεικνύοντας ότι ορισμένες περιπτώσεις που διαγνώστηκαν ως RARS έχουν στην πραγματικότητα μορφή XLSA με καθυστερημένη έναρξη (Cotter et al., 1995) Η μοριακή βάση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας Η σιδηροβλαστική αναιμία ταξινομείται ως διαταραχή της σύνθεσης της αίμης. Η αίμη ανήκει στις τετραπυρόλλες και είναι μία από τις σημαντικότερες χρωστικές ουσίες στη βιόσφαιρα (Frankenberg et al., 2003). Αποτελεί φορέα του οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη και συμμετέχει σε πολλές ενζυμικές αντιδράσεις, όπως στη μεταφορά των ηλεκτρονίων (Dailey, 1997). Η βιοσύνθεση της αίμης αποτελεί καθοριστική προϋπόθεση για τη σύνθεση αιμοσφαιρίνης. Για την παραγωγή αιμοσφαιρίνης μέσω της συνεχούς διαδικασίας της ερυθροειδούς διαφοροποίησης απαιτείται μια ποσότητα περίπου 24 mg σιδήρου στα πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα κάθε μέρα. Μία αντίστοιχη ποσότητα πρωτοπορφυρίνης ΙΧ χρειάζεται να είναι διαθέσιμη για την ενσωμάτωση του σιδήρου και τον σχηματισμό αίμης μέσα στους μιτοχονδριακούς ερυθροβλάστες. Αυτό επιτυγχάνεται, κατά τη διαφοροποίηση, από έναν ειδικό ερυθροβλάστη- ρυθμιστή των ενζύμων που συμμετέχει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της αίμης (Εικόνα 2), (May et al., 1998). 27

28 Εικόνα 2: Μονοπάτι βιοσύνθεσης της αίμης. Η σύνθεση της αίμης αρχίζει στα μιτοχόνδρια, συνεχίζεται στο κυτταρόπλασμα και ολοκληρώνεται πάλι μέσα στα μιτοχόνδρια. Καθώς το ηλέκτρυλο- CoA σχηματίζεται μόνο μέσω των μιτοχονδρίων η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος μετατοπίζεται στη μιτοχονδριακή μήτρα, πιθανόν συνδεδεμένη με το εσωτερικό της μεμβράνης. ( %81%CE%AC%CE%B3%CF%89%CE%B3%CE%B1_%CE%B1%CE%BC%CE%B9%CE% BD%CE%BF%CE%BE%CE%AD%CF%89%CE%BD_%CE%91%CE%AF%CE%BC%CE% B7_2015.pdf) Στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της αίμης, το ένζυμο το οποίο καταλύει το πρώτο βήμα της αντίδρασης, είναι η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος (Kreuziger et al., 2011), 28

29 η οποία ανακαλύφθηκε από τον Shemin (Shemin and Kikuchi, 1958) και Neuberger (Gibson, 1958). Το ένζυμο αυτό καταλύει την αποκαρβοξυλιωτική συμπύκνωση της γλυκίνης και του ηλέκτρυλο- συνένζυμου Α (scoa) αποδίδοντας δ- αμινολεβουλινικό οξύ (ALA), συνένζυμο Α και διοξείδιο του άνθρακα- CO2 (Εικόνα 3) (Kreuziger et al., 2011). Το δ- αμινολεβουλινικό οξύ αποτελεί τον πρώτο κοινό πρόγονο των τετραπυρολλών (Astner et al., 2005). Εικόνα 3: Το πρώτο βήμα του μονοπατιού βιοσύνθεσης της αίμης ( Η ελαττωματική δραστικότητα αυτού του ενζύμου σε ερυθροβλάστες μυελού των οστών σε ασθενείς με XLSA μειώνει τον ρυθμό βιοσύνθεσης της αίμης, καθώς οδηγεί σε ανεπαρκή παραγωγή πρωτοπορφυρίνης IX (Takaku et al., 1971). Η μειωμένη παραγωγή πρωτοπορφυρίνης ΙΧ έχει ως αποτέλεσμα την αδυναμία δέσμευσης του διαθέσιμου σιδήρου προκαλώντας αναποτελεσματική ερυθροποίηση, και αυξημένη απορρόφηση σιδήρου (Peto et al., 1983). Η επακόλουθη προοδευτική τοξική συσσώρευση σιδήρου συμβαίνει στους περισσότερους ιστούς και είναι ιδιαίτερα βλαπτική για το ήπαρ, την καρδιά, το πάγκρεας και την υπόφυση. Αν δεν θεραπευτεί, η συνεχής εναπόθεση σιδήρου οδηγεί σε σημάδια αρθρίτιδας, ενδοκρινικές διαταραχές (συμπεριλαμβανομένης της καθυστερημένης ανάπτυξης, στειρότητα και διαβήτη), κίρρωση του ήπατος και καρδιακή ανεπάρκεια (Cotter et al., 1999). 29

30 1.5. Η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος Η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος συμμετέχει στη βιοσύνθεση της αίμης στον άνθρωπο, στα ζώα, στα α- πρωτοβακτήρια και σε άλλους μη φυτικούς ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Astner et al., 2005). Το ένζυμο αυτό, αφού κωδικοποιηθεί στον πυρήνα του κυττάρου, εισάγεται στη μιτοχονδριακή μήτρα, όπου και αποτελεί τον τόπο δράσης της (Bottomley et al., 1995). Η καταλυτική επικράτεια της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος εδράζεται στην υπομονάδα επιφάνειας και η καταλυτική ενεργότητά της εξαρτάται από την 5- φωσφορική πυριδοξάλη η οποία δρα ως συμπαράγοντας του ενζύμου (May et al., 1998). Ο άνθρωπος, όπως και άλλα θηλαστικά, παράγουν δύο ισομορφές του ενζύμου ALAS. Η πρώτη είναι η h-alas (housekeeping) μορφή, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ALAS1 και η δεύτερη η e-alas (ερυθροειδική), η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ALAS2. Η halas εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα, ενώ η ealas εκφράζεται αποκλειστικά στα αναπτυσσόμενα ερυθροκύτταρα (Riddle et al., 1989) και είναι υπεύθυνη για την παραγωγή του 90% του συνόλου της αίμης στο σώμα. Η συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος, είναι συντηρημένη σε ποσοστό που κυμαίνεται μεταξύ 40% - 80% ανάμεσα στα α- πρωτεοβακτήρια και τον άνθρωπο (Astner et al., 2005). Συγκεκριμένα, η ομολογία μεταξύ των αλληλουχιών του ενζύμου ALAS μεταξύ του ροδοβακτήριου και του ανθρώπου είναι 49%. Σε σύγκριση με το ένζυμο ALAS του ροδοβακτήριου (ALASRc), το ανθρώπινο ealas φέρει προσθήκη δύο καταλοίπων και μία έλλειψη ενός καταλοίπου στα πρώτα 40 κατάλοιπα της αμινοξικής του αλληλουχίας, τα οποία συγκροτούν το λιγότερο συντηρημένο τμήμα του ενζύμου. Ο υψηλός βαθμός συντήρησης μεταξύ του ALASRc και του ανθρώπινου ealas ενζύμου, καθώς και το γεγονός ότι η ενζυμική δραστικότητα του ανθρώπινου ealas είναι παρόμοια με εκείνη του ALASRc, επιτρέπει τη διαμόρφωση ενός έγκυρου μοντέλου για τη δομή του ανθρώπινου ealas, διευκρινίζοντας τις δομικές και λειτουργικές επιπτώσεις των γενωμικών παραλλαγών που προκαλούν φυσιολογικά XLSA (Astner et al., 2005). 30

31 Η δομή της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος Η δομή της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος (Εικόνα 4), όπως προέκυψε ύστερα από μελέτη στο βακτήριο Rhodobacter capsulatus, αναδεικνύει ότι πρόκειται για ένα ένζυμο το οποίο ανήκει στην ομάδα τύπου Ι των εξαρτώμενων από την 5- φωσφορική πυριδοξάλη ενζύμων (Cellini et al., 2013). Το ένζυμο ALASRc είναι ένα στενά συνδεδεμένο ομοδιμερές. Ένα μόριο συμπαράγοντα PLP, δεσμεύεται σε κάθε υπομονάδα του ενζύμου στο κατάλοιπο Lys248 μέσω σχηματισμού μίας βάσης Schiff. Το κάθε μονομερές αποτελείται από τρεις περιοχές: 1. Ν-τελική επικράτεια. Αποτελείται από μια α-έλικα, απομακρυσμένη από το υπόλοιπο του μονομερούς, και ένα τριπλό, αντιπαράλληλο β-φύλλο. 2. Κεντρική καταλυτική επικράτεια. Συνεισφέρει το μεγαλύτερο μέρος της διμερούς διασύνδεσης. Φέρει ένα επτάκλωνο, παράλληλο β-φύλλο, το οποίο καλύπτεται από κάθε πλευρά από εννέα α-έλικες σε επαναλαμβανόμενα μοτίβα β / α. 3. C-τελική επικράτεια. Περιλαμβάνει ένα τριπλό αντιπαράλληλο β-φύλλο που έρχεται σε επαφή τόσο με τις Ν-τελικές όσο και με τις καταλυτικές επικράτειες του ίδιου μονομερούς και τριών α-ελίκων, οι οποίες έρχονται σε επαφή με την Ν-τελική επικράτεια. (Astner et al., 2005) 31

32 Εικόνα 4: Η δομή του ομοδιμερούς ALAS από το R. capsulatus (ALASRc) σε αναπαράσταση κορδέλας. Η Ν- τελική επικράτεια αποδίδεται με κίτρινο χρώμα, η καταλυτική επικράτεια με πορτοκαλί χρώμα και η C-τελική επικράτεια με κόκκινο χρώμα. Ο συμπαράγοντας PLP απεικονίζεται με πράσινο χρώμα σε απεικόνιση σφαιρών και ράβδων. Το μοντέλο αυτό σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PYMOL (DeLano, 2002) Η 5- φωσφορική πυριδοξάλη Η βιολογικά ενεργή μορφή της πυριδοξίνης είναι η 5- φωσφορική πυριδοξάλη (PLP) η οποία αποτελεί συμπαράγοντα του ενζύμου συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος. Συμμετέχει σε πολλές, διαφορετικές ενζυμικές δραστηριότητες, όπως στη σύνθεση των αμινοξέων, στην ανασύσταση των μονάδων ενός άνθρακα, στη σύνθεση των βιογενών αμινών, στη σύνθεση των τετραπυρρολικών ενώσεων, στον μεταβολισμό των αμινο-σακχάρων. Γενωμικές παραλλαγές σε γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα εξαρτώμενα από την 5- φωσφορική πυριδοξάλη είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση σημαντικών, σπάνιων, κληρονομικών ασθενειών (Cellini et al., 2013). 32

33 Ο άνθρωπος, όπως και άλλα θηλαστικά, αδυνατεί να συνθέσει 5- φωσφορική πυριδοξάλη. Δεν είναι τυχαίο το γεγονός ότι η 5- φωσφορική πυριδοξάλη εμπεριέχεται σε μία μεγάλη ποικιλία τροφίμων, όπως είναι το κρέας, τα γαλακτοκομικά προϊόντα, οι πατάτες, τα φασόλια και ορισμένα φρούτα και λαχανικά. Οι μορφές PLP και PMP (Εικόνα 5) εντοπίζονται κυρίως σε προϊόντα ζωικής προέλευσης, ενώ η μορφή PNP σε φυτικής προέλευσης (Cellini et al., 2013). Εικόνα 5: Δομή Β-6 βιταμερών (Cellini et al., 2013) Περίπου το 60% των βιταμερών εντοπίζεται στο αίμα με τη μορφή PLP συνδεδεμένη με λευκωματίνη. Τα βιταμερή για να μπορέσουν να εισέλθουν στα κύτταρα και να περάσουν τον αιματο- εγκεφαλικό φραγμό, θα πρέπει να είναι αποφωσφορυλιωμένα. Για το λόγο αυτό, η 5- φωσφορική πυριδοξάλη (PLP) μετατρέπεται σε PL από μία μεμβρανική, μη ιστοειδική, αλκαλική φωσφατάση (di Salvo et al., 2011). Η 5- φωσφορική πυριδοξάλη έχει δύο βασικές ιδιότητες: 1. Συνδέεται μέσω της αλδευδομάδας της σε ένα κατάλοιπο λυσίνης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. 2. Συμβάλλει στην αποδέσμευση ηλεκτρονίων από το υπόστρωμα. (Cellini et al., 2013) 33

34 1.7. Σύμπλοκο της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος και του συμπαράγοντα 5- φωσφορική πυριδοξάλη Η σύνδεση της 5- φωσφορικής πυριδοξάλης με το ένζυμο είναι ζωτικής σημασίας για τη σταθερότητά του, διατηρώντας τη βέλτιστη διαμόρφωση για τη σύνδεση του υποστρώματος και την απελευθέρωση του προϊόντος, καθώς και για την καταλυτική δραστικότητα του ενζύμου. Η μειωμένη ικανότητα δέσμευσης του συμπαράγοντα PLP μπορεί να έχει επίδραση σε όλες αυτές τις λειτουργίες, κατά τρόπο αναστρέψιμο στο βαθμό που το ένζυμο μπορεί τελικά να κορεστεί και πάλι, ώστε να ανακτήσει την ενεργή του διαμόρφωση και να πραγματοποιήσει την καταλυτική του αντίδραση (May et al, 1998). Ένα διμερές ένζυμο ALASRc συνδέεται συμμετρικά με ένα μόριο συμπαράγοντα PLP σε κάθε υπομονάδα του. Υπό απουσία υποστρώματος, ο συμπαράγοντας PLP είναι προσδεδεμένος ομοιοπολικά ως αμίνη σχηματίζοντας μία βάση Schiff, στην ε- αμινομάδα του καταλοίπου Lys248 της υπομονάδας του ενζύμου, σχηματίζοντας μία δομή γνωστή ως εσωτερική αλδιμίνη (Cellini et al., 2013). Αυτή η λυσίνη, η οποία είναι συντηρημένη σε όλα τα ένζυμα ALAS, βρίσκεται στην καταλυτική περιοχή (Astner et al., 2005). Το σύμπλοκο συμπαράγοντα και ενζύμου σταθεροποιείται μέσω σχηματισμού ενός δεσμού υδρογόνου και μίας γέφυρας άλατος. Ο δεσμός υδρογόνου σχηματίζεται μεταξύ του Νε2 του καταλοίπου His217 του ενζύμου και του O3 του συμπαράγοντα PLP. Η γέφυρα άλατος σχηματίζεται μεταξύ του Oδ2 του καταλοίπου Asp214 του ενζύμου και του Νδ2 του συμπαράγοντα PLP (Astner et al., 2005). Η τελευταία αλληλεπίδραση, η οποία εμφανίζεται στα περισσότερα ένζυμα που εξαρτώνται από την 5- φωσφορική πυριδοξάλη, αυξάνει το δυναμικό αποσύρσεως ηλεκτρονίων του δακτυλίου πυριδινίου του συμπαράγοντα PLP. Η στενή δέσμευση επιτρέπει στον συμπαράγοντα να παραμείνει δεσμευμένος κατά τη διάρκεια της κατάλυσης, παρά την απώλεια του ομοιοπολικού δεσμού του με το κατάλοιπο Lys248, μετά την πρόσδεση του υποστρώματος (Astner et al., 2005). Μετά την πρώτη δέσμευση του υποστρώματος της γλικίνης, με βάση το μοντέλο Michaelis, στο ολοένζυμο, σχηματίζεται μία νέα δομή γνωστή ως εξωτερική αλδιμίνη. Η δομή αυτή σχηματίζεται μεταξύ του 4 C του συμπαράγοντα PLP και της α- αμινοομάδας του υποστρώματος και υποκαθιστά τη σύνδεση μεταξύ της ε-αμινο- ομάδας της λυσίνης του ενζύμου και του συμπαράγοντα PLP (Cellini et al., 2013). 34

35 Ακολουθεί η αφαίρεση πρωτονίων και ο σχηματισμός της κουινόνης, ενός ενδιάμεσου νουκλεόφιλου. Η κουινόνη στη συνέχεια δεσμεύεται στο δεύτερο υπόστρωμα, το συνένζυμο Α, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση CoA και την αποκαρβοξυλίωση που οδηγούν στο σχηματισμό του δ- αμινολεβουλινικού οξέος. Το τελευταίο αυτό βήμα του μονοπατιού είναι βραδύτερο σε σύγκριση με τα υπόλοιπα (Cheltsov et al., 2003). Κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της ειδικότητας του ενζύμου της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος για τη δέσμευσή του με το υπόστρωμα της γλυκίνης είναι το κατάλοιπο Thr83 (Thr508 σε ανθρώπινο ealas). Παράλληλα με κάθε μόριο συμπαράγοντα PLP, τόσο οι καταλυτικές περιοχές όσο και η C-τελική επικράτεια κάθε μονομερούς του ενζύμου οριοθετούν τον θύλακα δέσμευσης του υποστρώματος. Αυτός ο θύλακας σχηματίζεται στην επιφάνεια του ενζύμου. Η καρβοξυλική ομάδα του scoa αναγνωρίζεται από το κατάλοιπο Arg21 του ενζύμου. Η σύνδεση του scoa είναι μη ομοιοπολική. Τα υδρόφιλα άτομα του scoa (OP1, NP1, OS1) σταθεροποιούνται με δεσμούς υδρογόνου με το ένζυμο, ενώ τα υπόλοιπα αλειφατικά τμήματα σταθεροποιούνται με αλληλεπιδράσεις van der Waals. Τα δύο υποστρώματα (γλυκίνη και scoa) μπορούν ταυτόχρονα να τοποθετηθούν εντός της ενεργού θέσης (Astner et al., 2005). 35

36 Εικόνα 6: Λεπτομερείς προβολές του συμπαράγοντα PLP και των υποστρωμάτων σε συνδυασμό με τις πυκνότητες ηλεκτρονίων τους. Α. Ηλεκτρονική πυκνότητα της εσωτερικής αλδιμίνης. Εμφανίζονται μόνο κατάλοιπα που έρχονται σε επαφή με τον συμπαράγοντα PLP. Β. Ηλεκτρονική πυκνότητα ενδιάμεσου PLP-γλυκίνης. C. Η σύνδεση του scoa με την ALAS.Δ. Τα τμήματα αδενίνης και ριβόζης του scoa δεσμεύονται σε μια υδρόφοβη (λευκή) θήκη. Ε. Η πυκνότητα ηλεκτρονίων είναι σαφώς καθορισμένη για το τμήμα 3 -φωσφορικού ADP και για την καρβοξυλική ομάδα του scoa, υποδεικνύοντας ότι η κεντρική επικράτεια δε συνδέεται άκαμπτα απουσία του δεύτερου υποστρώματος γλυκίνης (Astner et al., 2005) Το γονίδιο ALAS2 Η ανακάλυψη του γονιδίου ALAS2, το οποίο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα Χ και εκφράζεται μόνο σε ερυθροειδή κύτταρα, υποστηρίζει την πρόταση ότι η παραλλαγή που είναι υπεύθυνη για τη Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία βρίσκεται στο γονίδιο για το ερυθροειδές ισοένζυμο συνθετάση του δ-αμινολεβουλινικού οξέος (Cox et al., 1994). Τα ανθρώπινα γονίδια που κωδικοποιούν τις δύο ισομορφές του ενζύμου ALAS απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν. Αν και τα δύο γονίδια κωδικοποιούν ένζυμα με υψηλή ομολογία αμινοξέων, χαρτογραφούνται σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Το 36

37 γονίδιο ALAS1 εδράζεται στο χρωμόσωμα 3 και συγκεκριμένα στη θέση 3ρ2Ι, ενώ το ALAS2 γονίδιο εδράζεται στο χρωμόσωμα Χ (Cotter et al., 1992). Το γονίδιο ALAS2 εδράζεται στο χρωμόσωμα Χ και συγκεκριμένα στη θέση X: 55,009,055-55,031,064 (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Θέση εντοπισμού γονιδίου ALAS2 στο Χ χρωμόσωμα. ( ) Τα δύο ισοένζυμα ALAS1, ALAS2 είναι 72% όμοια ως προς τα αμινοξέα και είναι δομικά παρόμοια. Και τα δύο είναι διμερή τα οποία αποτελούνται από δύο ταυτόσημες υπομονάδες που καταλύουν τη σύνθεση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος (May et al., 1998). Το ALAS1 εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε όλους τους ιστούς και είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της παραγωγής αίμης κυρίως για τα κυτοχρώματα και άλλες αιμοπρωτεΐνες. Αντίθετα, το ALAS2 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα μόνο στο ήπαρ του εμβρύου και στο ενήλικο μυελό των οστών (Cotter et al., 1992). Μοριακές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η έκφραση του γονιδίου ALAS2 εμφανίζεται μόνο σε ερυθροειδή κύτταρα και ρυθμίζεται τόσο σε μεταγραφικά όσο και σε μετάμεταγραφικά επίπεδα. Το γονίδιο ενεργοποιείται μεταγραφικά από την ερυθροποιητίνη σε συνδυασμό με τα γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα της βιοσυνθετικής οδού της αίμης και με τα γονίδια που ρυθμίζουν την ενδοκυτταρική ποσότητα του σιδήρου μέσω ενός στοιχείου ανταπόκρισης στο σίδηρο το οποίο εντοπίζεται στην 5 αμετάφραστη περιοχή, συνδέοντας με τον τρόπο αυτό, τη διαθεσιμότητα σιδήρου με την παραγωγή πρωτοπορφυρίνης ΙΧ και τον σχηματισμό αίμης, συνεπώς με τη σύνθεση αιμοσφαιρίνης (Surinya et al., 1998). Το ανθρώπινο γονίδιο ALAS2 αποτελείται από 11 εξώνια μεγέθους 22kb. Όπως και τα περισσότερα γονίδια βιοσύνθεσης της αίμης, ενεργοποιείται και ρυθμίζεται μεταγραφικά από ορισμένους ερυθροειδικούς παράγοντες οι οποίοι λειτουργούν ως 37

38 στοιχεία του υποκινητή (May et al., 1998). Τα cis-ενεργά αυτά στοιχεία, τα οποία εντοπίζονται και σε άλλους ερυθρο-ειδικούς υποκινητές, είναι τα GATA-1, CACCC και NF-E2 και δεν περιέχονται στα γονίδια που ελέγχουν μη ερυθροειδείς ιστούς, όπως είναι το ALAS1 (Bottomley et al., 1995). Τα εξώνια 5 έως 11 κωδικοποιούν για την καταλυτική περιοχή του ενζύμου ALAS. Αυτή η περιοχή διατηρείται τόσο σε ανθρώπινα ένζυμα ALAS όσο και σε όλα τα είδη, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριακών ενζύμων ALAS. Τα εξώνια 3 και 4 κωδικοποιούν για την υπόλοιπη Ν-τελική περιοχή του ενζύμου, η οποία απουσιάζει από βακτηριακές ένζυμα ALAS (Bottomley et al., 1995) Διάγνωση Η XLSA αντιπροσωπεύει την πιο κοινή μορφή μεταξύ των κληρονομικών διαταραχών σιδηροβλαστικής αναιμίας, ενώ δεν αναγνωρίζεται εύκολα στην κλινική πράξη. Διαγνωστικό στοιχείο αποτελεί, όπως και σε όλες τις σιδηροβλαστικές αναιμίες, η παρουσία δακτυλιοειδών σιδηροβλαστών στον μυελό των οστών (Bottomley et al., 1995). Διακριτά επίσης εργαστηριακά χαρακτηριστικά της XLSA είναι η μικροκυτταρική αναιμία με υπόχρωμα ερυθρά αιμοσφαίρια, αυξημένο πλάτος κατανομής ερυθροκυττάρων (Cazzola et al., 2011), ενώ δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο μοτίβο για τη συμμετοχή λευκών αιμοσφαιρίων και αιμοπετάλιων. Αυτά τα χαρακτηριστικά υποδηλώνουν μια τοπική ανωμαλία στην παραγωγή της αίμης με το σίδηρο που λαμβάνεται από τους ερυθροβλάστες να συσσωρεύεται στo μιτοχόνδριο και να αποτυγχάνεται η δυνατότητα σύνδεσης με την πρωτοπορφυρίνη ΙΧ (May et al., 1998). Ωστόσο για μια οριστική διάγνωση απαιτείται αναγνώριση της γενωμικής παραλλαγής στο γονίδιο ALAS2 (Cazzola et al., 2011). Η ανίχνευση γενωμικών παραλλαγών επιτρέπει την έγκαιρη διάγνωση της νόσου, τη στοχοθετημένη εκπαίδευση των οικογενειών, την έγκαιρη θεραπεία με πυριδοξίνη και την πρόληψη της υπερφόρτωσης με σίδηρο (Cotter et al, 1999). Επιτρέπει επίσης το διαχωρισμό μεταξύ της όψιμης έναρξης της νόσου και του συνδρόμου RARS (May et al., 1998). 38

39 1.10. Θεραπεία Οι περισσότεροι ασθενείς με XLSA, σε κάποιο βαθμό, ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη (Εικόνα 8), η οποία μεταβολίζεται σε 5-φωσφορική πυριδοξάλη (PLP), τον συμπαράγοντα για το ενζυμο ALAS (Cotter et al., 1999). Εικόνα 8: Μοριακή δομή μορίου πυριδοξίνης ( Η πυριδοξίνη χορηγείται από το στόμα σε δοσολογία 5 έως 500 mg / ημέρα. Tο χαμηλό επίπεδο δραστικότητας της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος στον μυελό των οστών ασθενών με αυτόν τον τύπο αναιμίας μπορεί να ενισχυθεί ή να αποκατασταθεί με την προσθήκη 5- φωσφορικής πυριδοξάλης in vitro ή με συμπλήρωση με πυριδοξίνη ίη νίνο (Cox et al., 1994). Μεγαλύτερα από τα φυσιολογικά επίπεδα 5'-φωσφορικής πυριδοξάλης μπορούν να αντισταθμίσουν μια μειωμένη συγγένεια του μη φυσιολογικού ενζύμου για τον συμπαράγοντα, να ενισχύσουν τη σταθερότητά του ή να διευκολύνουν τη σωστή του αναδίπλωση κατά τη διάρκεια της σύνθεσης διατηρώντας έτσι επαρκή επίπεδα ενζύμων για να μειώσουν το έλλειμμα της αίμης στο αναπτυσσόμενο ερυθροειδές κύτταρο (Bottomley et al, 1995). Η επιτυχία της θεραπείας ποικίλλει κυρίως λόγω της διαφοροποιημένης ανταπόκρισης των ασθενών στην πυριδοξίνη (Astner et al., 2005). Οι κλινικές μελέτες δείχνουν ότι οι 39

40 ασθενείς που πάσχουν από Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία σε ποσοστό μεγαλύτερο από 50%, ανταποκρίνονται στην από του στόματος χορήγηση δόσεων πυριδοξίνης, καθώς έπειτα εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης (Harigae et al., 2010). Παρόλα αυτά σπάνια επιστρέφουν σε φυσιολογικά επίπεδα, ενώ τα υπόχρωμα μικροκυτταρικά ερυθροκύτταρα παραμένουν (Cotter et al., 1994). Η έλλειψη αποτελεσματικής ερυθροποίησης, αν και συχνά δίνονται μεταγγίσεις για την αποκατάσταση της σοβαρής αναιμίας, συνήθως οδηγεί σε υπερφόρτωση σιδήρου, απαιτώντας θεραπεία χηλίωσης και ενδεχομένως παρέμβαση στα οφέλη της θεραπείας με πυριδοξίνη διαταράσσοντας τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Η υπερφόρτωση σιδήρου μπορεί να καταστέλλει την ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Οι ασθενείς που παρουσιάζουν υπερφόρτωση σιδήρου δεν θα πρέπει να θεωρούνται ανθεκτικοί στη θεραπεία με πυριδοξίνη έως ότου τα αποθέματα σιδήρου να κανονικοποιηθούν. Η φλεβοτομή είναι αρκετή για να αντιστρέψει την υπερφόρτωση σιδήρου μέτριας κλίμακας και να συμβάλλει στην αύξηση των επιπέδων της αιμοσφαιρίνης των ασθενών σε συνδυασμό με συμπλήρωση με πυριδοξίνη (Cotter et al. 1999). Η ανταπόκριση στη θεραπεία με πυριδοξίνη που παρατηρείται σε ορισμένες περιπτώσεις πιθανά σχετίζεται με τον τύπο της γενωμικής παραλλαγής και την αλλαγή που αυτή προκαλεί στην αμινοξική αλληλουχία του ενζύμου. Σε περίπτωση ανερμηνεύσιμης γενωμικής παραλλαγής (R204Ter), η οποία οδηγεί σε πλήρη έλλειψη του ενζύμου, δεν παρατηρήθηκε ανταπόκριση του ασθενούς στη συμπλήρωση πυριδοξίνης (May et al, 1998). Η κλινική διαχείριση της XLSA απαιτεί παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου, πρόληψη και θεραπεία της υπερφόρτωσης σιδήρου, γενετική συμβουλευτική στην οικογένεια για ταυτοποίηση επιπρόσθετου ρίσκου στους συγγενείς. Σήμερα, σε αντίθεση με το παρελθόν όπου πολλοί ασθενείς κατέληγαν νωρίς εξαιτίας της σοβαρότητας της νόσου, δίνεται η δυνατότητα ακριβούς διάγνωσης και καλύτερης κλινικής διαχείρισης. Η αιτία θανάτου πλέον είναι περισσότερο συχνή λόγω των τοξικών επιδράσεων της συνεχούς συσσώρευσης σιδήρου που προκαλείται από παρατεταμένη απορρόφηση σιδήρου ή και λόγω μεταγγίσεων αίματος που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της νόσου (Cotter et al., 1999). 40

41 1.11. Φαρμακογονιδιωματική Η Φαρμακογονιδιωματική αποτελεί την επιστήμη, η οποία μελετά τον τρόπο με τον οποίο το σύνολο του γονιδιώματος ενός ατόμου, μπορεί να επηρεάσει την ανταπόκριση του σε κάποιο φάρμακο. Συνδυάζει την επιστήμη της φαρμακολογίας και της γονιδιωματικής (μελέτη των γονιδίων και των λειτουργιών τους) για την ανάπτυξη αποτελεσματικών, ασφαλών φαρμάκων και δοσολογιών που θα προσαρμόζονται στη γενετική σύνθεση ενός ατόμου ( Πολλά γονίδια μπορούν να διαδραματίσουν κάποιο ρόλο στην ανταπόκριση και την τοξικότητα του φαρμάκου. Η Φαρμακογονιδιωματική στοχεύει στην αναγνώριση των παραλλαγμένων γονιδίων που επηρεάζουν την ανταπόκριση μεμονωμένων ασθενών σε φάρμακα. Επιπλέον, η Φαρμακογονιδιωματική ανάλυση μπορεί να εντοπίσει γονίδια ευαισθησίας σε ασθένειες που αντιπροσωπεύουν πιθανούς νέους στόχους φαρμάκων. Τα παραπάνω μπορούν να συμβάλλουν στην ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για την ανακάλυψη φαρμάκων, για την πρόληψη ασθενειών, για την εξατομικευμένη εφαρμογή φαρμακευτικής θεραπείας ρυθμίζοντας για παράδειγμα τη δοσολογία ή επιλέγοντας ένα διαφορετικό φάρμακο, μεταξύ ασθενών, οι οποίοι, αν και επιδεικνύουν τον ίδιο φαινότυπο της νόσου, χαρακτηρίζονται από διαφορετικά γενετικά προφίλ (Mancinelli et al., 2000) Μονονουκλεοτιδικοί Πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) Ένας μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός αποτελεί μια παραλλαγή ενός νουκλεοτιδίου σε μία αλληλουχία DNA, η οποία επηρεάζει μόνο ένα από τα βασικά δομικά στοιχεία - αδενίνη (Α), γουανίνη (G), θυμίνη (Τ) ή κυτοσίνη (C) (Εικόνα 9). Εάν περισσότερο από το 1% ενός πληθυσμού δε φέρει το ίδιο νουκλεοτίδιο σε μια συγκεκριμένη θέση στην αλληλουχία DNA, τότε αυτή η παραλλαγή μπορεί να ταξινομηθεί ως SNP ( Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί αποτελούν τον συχνότερο τύπο γενετικής ποικιλομορφίας μεταξύ των ανθρώπων και εμφανίζονται κατά μέσο όρο μία φορά σε 41

42 κάθε 300 νουκλεοτίδια, γεγονός που σημαίνει ότι υπάρχουν περίπου 10 εκατομμύρια SNPs στο ανθρώπινο γονιδίωμα ( Μεταξύ των ανθρωπίνων πληθυσμών, τα SNPs εμφανίζονται με διαφοροποιήσεις, με αποτέλεσμα, ένα SNP που είναι συνηθισμένο σε μια γεωγραφική ή εθνική ομάδα πιθανά να είναι πολύ σπανιότερο σε μία άλλη. Τα SNPs μπορεί να εντοπίζονται στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου, στις ρυθμιστικές αλληλουχίες του ή σε ιντρόνια. Επίσης, μπορούν να σχετίζονται με συγκεκριμένες ασθένειες, οπότε η μελέτη και η ανίχνευσή τους κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική ( Εικόνα 9: Παράδειγμα απεικόνισης μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού ( Βιβλιογραφικά δεδομένα και στοιχεία γενωμικών βάσεων δεδομένων Η Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία είναι μία σπάνια νόσος που προκαλείται από γενωμικές παραλλαγές οι οποίες εντοπίζονται στο γονίδιο ALAS2. Η θεραπευτική προσέγγιση της νόσου στοχεύει στην αύξηση των επιπέδων αιμοσφαιρίνης των ασθενών. Για τον σκοπό αυτό, οι ασθενείς που πάσχουν από XLSA υποβάλλονται σε θεραπεία συμπλήρωσης με πυριδοξίνη. Η χορήγηση πυριδοξίνης μπορεί να συμβάλλει 42

43 στην αποκατάσταση παραγωγής της αίμης, η οποία εμφανίζεται μειωμένη σε περιπτώσεις εκδήλωσης της νόσου. Περισσότερο από το 50% των ασθενών ανταποκρίνονται στη θεραπεία αυτή, γεγονός το οποίο σχετίζεται με το είδος της αλλαγής που προκαλεί η γενωμική παραλλαγή στην αμινοξική αλληλουχία του ενζύμου συνθετάση του δ- αμινολεβουλινικού οξέος, το οποίο καταλύει το πρώτο βήμα στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της αίμης. Ωστόσο, ορισμένοι ασθενείς δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία, όπως για παράδειγμα σε περιπτώσεις όπου η γενωμική παραλλαγή προκαλεί εμφάνιση κωδικονίου λήξης στην αλληλουχία, οδηγώντας σε μη λειτουργικό ένζυμο. Στη συγκεκριμένη εργασία, μελετήθηκαν πολυμορφισμοί οι οποίοι σε προηγούμενες μελέτες, έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας. Από το σύνολο των πολυμορφισμών, επιλέχθηκαν δεκατρείς μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, οι οποίοι εντοπίζονται σε έξι εξώνια του γονιδίου ALAS2. Κριτήριο με βάση το οποίο έγινε η επιλογή αποτέλεσε το εάν οι περιπτώσεις των ασθενών είχαν παρουσιάσει ανταπόκριση στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Για την επιλογή των πολυμορφισμών αυτών πραγματοποιήθηκε βιβλιογραφική διερεύνηση και εκτεταμένη χρήση βάσεων γενωμικών δεδομένων όπως των PubMed, OMIM, NCBI, ClinVar, Ensembl, dbsnp. Παρακάτω παρατίθενται οι συγκεκριμένοι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί. ΕΞΩΝΙΟ 5 1. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης γουανίνης (G) από θυμίνη (T). Ως αποτέλεσμα η φαινυλαλανίνη (Phe165) αντικαθίσταται από λευκίνη (Leu). Η συγκεκριμένη γενωμική παραλλαγή προκαλεί αλλαγή στη δευτεροταγή δομή του ενζύμου προκαλώντας αντικατάσταση ενός β- φύλλου από μία α- έλικα. Το γεγονός αυτό πιθανόν να διαταράσσει τη συνολική διαμόρφωση του ενζύμου μειώνοντας τη σταθερότητα του και μειώνοντας τη συγγένειά του για τον συμπαράγοντα PLP. Ακόμη, η φαινυλαλανίνη που υπάρχει φυσιολογικά και είναι συντηρημένη σταθεροποιεί δομικά τη γειτονική της αργινίνη (Arg163), η οποία συμβάλλει στην αναγνώριση της καρβοξυλικής ομάδας του υποστρώματος scoa μέσω υδρόφοβων 43

44 αλληλεπιδράσεων. Η αντικατάσταση αυτή επομένως, αποσταθεροποιεί το κατάλοιπο Arg163, μειώνοντας την εξειδίκευση της δέσμευσης για το scoa (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Cotter και τους συνεργάτες του το 1994 σε απογόνους τριών γενεών μετά, της αρχικής οικογένειας που μελετήθηκε από τον Cooley τo Συγκεκριμένα μελετήθηκαν δύο αδέρφια ασθενείς εκ γενετής αρσενικού φύλου ηλικίας 32 και 31 ετών. Οι ασθενείς ανταποκρίθηκαν μερικώς στη θεραπεία με πυριδοξίνη, καθώς ενώ παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων αιμοσφαιρίνης, δεν παρατηρήθηκε απαλοιφή των μικροκυτταρικών, υπόχρωμων ερυθροκυττάρων. Η μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης του συμπαράγοντα εξηγεί τη μέτρια αύξηση της αιμοσφαιρίνης μετά τη συμπλήρωση με πυριδοξίνης (Cotter et al., 1994). 2. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης κυτοσίνης (C) από θυμίνη (T), η οποία οδηγεί σε αντικατάσταση της αλανίνης (Ala172) από την θρεονίνη. Ως αποτέλεσμα η δραστικότητα της συνθετάσης του δ- αμινολεβουλινικού οξέος στον μελό των οστών εμφανίζει σημαντική μείωση (Cotter et al., 1995). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε πρώτη φορά από τον Cotter και τους συνεργάτες του το 1995 σε γυναίκα ηλικίας 81 ετών. Πρόκειται για Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία με καθυστέρηση στην έναρξη. Η ανταπόκριση στη θεραπεία με πυριδοξίνη ήταν πλήρης καθώς οι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες εξαφανίστηκαν από τον μυελό των οστών. Προκλήθηκε ύστερα από de novo γενωμική παραλλαγή (Cotter et al., 1995). 3. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από σημειακή παραλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση του ασπαρτικού οξέος (Asp159) από την ασπαραγίνη (Asn) (Furuyama et al., 2003). Λόγω της αντικατάστασης του ασπαρτικού οξέος, εμφανίζεται απώλεια της γέφυρας άλατος στο κατάλοιπο Arg511 της C-τελική περιοχής, η οποία εμπλέκεται στη σταθεροποίηση της κλειστής διαμόρφωσης της ενεργού θέσης του ενζύμου ALAS (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε πρώτη φορά από τον Furuyama και τους συνεργάτες του το 2003 σε άντρα ασθενή ηλικίας 81 ετών. Πρόκειται για Χ- συνδεδεμένη 44

45 σιδηροβλαστική αναιμία με καθυστέρηση στην έναρξη και προκλήθηκε από μία de novo γενωμική παραλλαγή. Ο συγκεκριμένος ασθενής, εμφάνισε τη νόσο ύστερα από αιμοκάθαρση. Το γεγονός αυτό, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τόσο οι διατροφικές ανεπάρκειες που προκαλούνται είτε από διατροφικές ανωμαλίες στους ηλικιωμένους είτε, όπως συμβαίνει στην περίπτωση αυτή, από τη θεραπεία αιμοκάθαρσης, μπορούν να προκαλέσουν να προκαλέσουν μεταβολές στη φυσιολογική λειτουργία των ενζύμων. Ο ασθενής ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη, καθώς οι δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες εξαφανίστηκαν από τον μυελό των οστών (Futuyama et al., 2003). 4. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης αδενίνης (Α) από γουανίνη (G). Ως αποτέλεσμα η τυροσίνη (Tyr) αντικαθίσταται από ιστιδίνη (His). Φυσιολογικά, το κατάλοιπο Tyr199 σταθεροποιεί τα κατάλοιπα Lys248 και Asn54, τα οποία εμπλέκονται στη σύνδεση της γλυκίνης στον συμπαράγοντα PLP. Η αντικατάσταση της τυροσίνης από την ιστιδίνη φαίνεται να αποσταθεροποιεί επαρκώς τη σύνδεση μεταξύ συμπαράγοντα και γλυκίνης, με αποτέλεσμα τα αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα του συμπαράγοντα να αντισταθμίζουν μόνο εν μέρει αυτή την δυσλειτουργία (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή χαρακτηρίστηκε πρώτη φορά από τον Cotter και τους συνεργάτες του το 1999 σε άντρα ηλικίας 31 ετών ο οποίος σε ηλικία 16 ετών εμφάνισε σημάδια υπόχρωμης μικροκυτταρικής αναιμίας. Ο ασθενής μετά την αφαίρεση ποσότητας σιδήρου με φλεβοτομή ώστε να μειωθεί η φερριτίνη σε φυσιολογικά επίπεδα και να αρχίσει να μειώνεται ο κορεσμός της τρανσφερίνης, ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη εμφανίζοντας αυξήσεις των Hb, MCV και MCH τιμών. Πρόκειται για de novo γενωμική παραλλαγή που αφορά ένα εξαιρετικά συντηρημένο κατάλοιπο (Tyr 199) (Cotter et al., 1999). ΕΞΩΝΙΟ 7 1. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης κυτοσίνης (C) από θυμίνη (T). Αυτή η σημειακή παραλλαγή τροποποιεί ένα εξαιρετικά διατηρημένο κατάλοιπο (Gly148), το οποίο αντικαθίσταται από σερίνη (Ser) και μειώνει τη δραστικότητα του μη φυσιολογικού ενζύμου σε 45

46 λιγότερο από 10% από εκείνη του φυσιολογικού (Prades et al., 1995). Η αντικατάσταση της γλυκίνης από τη σερίνη διαταράσσει τον συνδετικό θύλακα του τμήματος scoaαδενίνης, μειώνοντας τη συγγένεια για το scoa. Επιπλέον, το κατάλοιπο Gly148 εμπλέκεται στη δέσμευση του συμπαράγοντα στο ένζυμο. Ως αποτέλεσμα, αυτή η παραλλαγή μπορεί να αντιμετωπιστεί με την αύξηση των επιπέδων του συμπαράγοντα PLP (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε πρώτη φορά από τον Prades και τους συνεργάτες του το 1995 σε άντρα με συμπτώματα αναιμίας εκ γενετής, ηλικίας 57 ετών. Ο ασθενής ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Η ίδια γενωμική παραλλαγή ανιχνεύθηκε σε 3 ακόμη άντρες συγγενείς, οι οποίοι εμφάνιζαν σε διαφορετικό βαθμό τα κλινικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της νόσου. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι εκτός από τη γενωμική παραλλαγή και άλλοι γενετικοί ή περιβαλλοντικοί παράγοντες συμβάλλουν στη διαμόρφωση του φαινοτύπου (Prades et al., 1995). 2. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης θυμίνης (T) από γουανίνη (G). Αυτή η σημειακή αλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της λυσίνης (Lys156) από την γλουταμίνη (Gln). Η αντικατάσταση της λυσίνης με γλουταμίνη προκαλεί την απώλεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ του ενζύμου και του scoa μειώνοντας έτσι τη συγγένεια σύνδεσης τους. Οι ασθενείς με αυτή την παραλλαγή έχουν αναφερθεί ότι ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη καθώς η σύνδεση του συμπαράγοντα στο ένζυμο δεν επηρεάζεται. Η επίδραση της συμπλήρωσης της πυριδοξίνης μπορεί να είναι έμμεση (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Cotterκαι τους συνεργάτες του τo 1995 σε άντρα ηλικίας 77 χρονών. Πρόκειται για Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία με καθυστέρηση στην έναρξη. Ο ασθενής ανταποκρίθηκε πλήρως στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Πρόκειται για de novo γενωμική παραλλαγή (Cotter et al., 1995). ΕΞΩΝΙΟ 8 1. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης γουανίνης (G) από κυτοσίνη (C). Αυτή η σημειακή αλλαγή 46

47 οδηγεί σε αντικατάσταση της θρεονίνης (Thr388) από την σερίνη (Ser). Το κατάλοιπο Thr388 είναι μέρος του συντηρημένου προτύπου αναγνώρισης του συμπαράγοντα. (Cox et al., 1994). Η αντικατάσταση της θρεονίνης με σερίνη επιτρέπει μεγαλύτερη ελευθερία περιστροφής της σερίνης, μειώνοντας σημαντικά τη συγγένεια του ενζύμου για τον συμπαράγοντα PLP. Μια χαμηλότερη συγγένεια για τον συμπαράγοντα μπορεί να αντισταθμιστεί αυξάνοντας τη συγκέντρωσή του. Οι ασθενείς ανταποκρίνονται ευνοϊκά στη θεραπεία με πυριδοξίνη (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Cox και τους συνεργάτες του το 1994 σε άντρα ασθενή ηλικίας 55 χρονών. Ο ασθενής με εμφάνιση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας με καθυστέρηση στην έναρξη, ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη και απαιτούσε μια μικρή δόση μόνο πυριδοξίνης (4 mg ημερησίως) για να συμπληρώσει την αναγκαία ημερήσια πρόσληψη. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι οι μεταβολές των διατροφικών συνηθειών σε συνδυασμό με την ηλικία μπορούν να επηρεάσουν τον μεταβολισμό της πυριδοξίνης (Cox et al., 1994). ΕΞΩΝΙΟ 9 1. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης αδενίνης (Α) από θυμίνη (Τ). Αυτή η σημειακή παραλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της ισολευκίνης (Ile476) από την ασπαραγίνη (Asn). Το κατάλοιπο Ile476 σταθεροποιεί το κατάλοιπο His360, το οποίο εμπλέκεται στη δέσμευση του συμπαράγοντα PLP και το κατάλοιποarg517, το οποίο απαιτείται για την αναγνώριση της γλυκίνης. Η αντικατάσταση αυτού του αμινοξέος με ασπαραγίνη διακόπτει την προβλεπόμενη δευτερογενή δομή μιας εξαιρετικά διατηρημένης υδρόφοβη περιοχής του ενζύμου επηρεάζοντας επομένως τόσο τη σύνδεση του συμπαράγοντα PLP όσο και της γλυκίνης. Οι ασθενείς με αυτή την αλλαγή ανταποκρίνονται επομένως στη θεραπεία με πυριδοξίνη (Cotter et al., 1992). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Cotter και τους συνεργάτες του το 1992, σε άντρα ηλικίας 30 ετών ο οποίος εμφάνισε συμπτώματα αναιμίας σε ηλικία 16 ετών. Ο ασθενής ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Πρόκειται για de novo γενωμική παραλλαγή (Cotter et al., 1992). 47

48 2. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης γουανίνης (G) από αδενίνη (Α). Αυτή η σημειακή παραλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της αργινίνης (Arg) από την κυστείνη (Cys). Η αλλαγή αυτή οδηγεί στην κωδικοποίηση ενζύμου με σημαντικά μειωμένη καταλυτική δραστικότητα (Futuyama et al., 1998 ). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Futuyama και τους συνεργάτες του το 1998 σε αγόρι ηλικίας 15 ετών, ο οποίος ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Πρόκειται για de novo γενωμική παραλλαγή (Futuyama et al., 1998) που αφορά ένα εξαιρετικά συντηρημένο κατάλοιπο (Arg 411) (Cotter et al., 1999). 3. rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης κυτοσίνης (C) από θυμίνη (T). Αυτή η σημειακή αλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της κυστεΐνη (Cys) από την τυροσίνη (Tyr). Η αντικατάσταση της κυστεΐνης (Cys395) από τυροσίνη θα επηρεάσει δυσμενώς τη δέσμευση του συμπαράγοντα PLP. Η θέση 395 είναι πολύ κοντά στη λυσίνη στη θέση 391, η οποία σχηματίζει τη βάση Schiff με την ομάδα της αλδεΰδης του συμπαράγοντα. Η σημειακή γενωμική παραλλαγή μπορεί επομένως να παρεμβαίνει στη σύνδεση του συμπαράγοντα ή στην ίδια την καταλυτική αντίδραση (Cazzola et al., 2000). Αντίστοιχα, η δραστικότητα αυτού του παραλλαγμένου ενζύμου μπορεί να εξισορροπηθεί με υψηλότερες συγκεντρώσεις PLP συμπαράγοντα (Astner et al., 2005). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε πρώτη φορά από τον Cazzola και τους συνεργάτες το 2000 σε ηλικιωμένη γυναίκα, η οποία ήταν ετερόζυγη για αυτή την παρερμηνεύσιμη γενωμική παραλλαγή. Η ασθενής ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη επιτυχώς. Πρόκειται για περίπτωση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας με καθυστέρηση στην έναρξη παρόλο που η ασθενής έφερε τη γενωμική παραλλαγή εκ γενετής. Το στοιχείο αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ένας επιπρόσθετος παράγοντας εκτός από τη γενωμική παραλλαγή οδήγησε στην κυριαρχία αιμοποιητικών κυττάρων που εκφράζουν το Χ χρωμόσωμα με το μη φυσιολογικό γονίδιο. Η πιο πιθανή εξήγηση των παραπάνω ευρημάτων είναι ότι η ασθενής κατάφερε να παράγει κανονικές ποσότητες RBCs για τις πρώτες 6 δεκαετίες της ζωής της. Στην 48

49 έβδομη δεκαετία ανέπτυξε απενεργοποίηση του χρωμοσώματος Χ, όπως και το ένα τρίτο των ηλικιωμένων γυναικών, με το φυσιολογικό γονίδιο (Cazzola et al., 2000). 4. rs ( Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης γουανίνης (G) από θυμίνη (T) ή αδενίνη (Α). Αυτή η σημειακή παραλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της αργινίνης (Arg) από την κυστεΐνη (Cys). Η αντικατάσταση αυτή μπορεί να επάγει Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία αναστέλλοντας την αλληλεπίδραση του ενζύμου με τη συνθετάση του scoa (Cotter et al., 1999). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Cotter και τους συνεργάτες του το 1999 σε άντρα ασθενή ηλικίας 30 ετών ο οποίος εμφάνισε σημάδια αναιμίας από την παιδική ηλικία. Ο ασθενής ανταποκρίθηκε μερικώς στη θεραπεία με πυριδοξίνη ύστερα από φλεβοτομή για την αποφυγή υπερφόρτωση σιδήρου. Πρόκειται για μία de novo γενωμική παραλλαγή (Cotter et al., 1999). ΕΞΩΝΙΟ rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης γουανίνης (G) από κυτοσίνη (C). Αυτή η σημειακή παραλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της ιστιδίνης (His524) από το ασπαραγινικό οξύ (Asp). Το κατάλοιπο ιστιδίνης διατηρείται τόσο σε συνθετάσες της ερυθροειδούς σειράς όσο και σε άλλες συνθετάσες που έχουν την 5-φωσφορική πυριδοξάλη ως συμπαράγοντα στα σπονδυλωτά. Αυτή η ιστιδίνη βρίσκεται σε έναν βρόχο, που προηγείται μιας μακράς περιοχής από ά-έλικες κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο του ενζύμου. Το γεγονός ότι το κατάλοιπο αυτό είναι εξαιρετικά συντηρημένο υποδηλώνει ότι μια παραλλαγή σε αυτό το κατάλοιπο επηρεάζει τη λειτουργία του ενζύμου (Edgar et al., 1998). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Edgar και τους συνεργάτες του το 1998 σε ασθενή, ο οποίος ήταν αναιμικός εκ γενετής. Σε ηλικία 14 ετών διαγνώσθηκε με Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία και ανταποκρίθηκε στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Η μελέτη των μελών της οικογένειας αποκάλυψε ότι τόσο η μητέρα όσο και η κόρη του ασθενούς ήταν φορείς αυτής της γενωμικής παραλλαγής (Edgar et al., 1998). 49

50 ΕΞΩΝΙΟ rs Ο πολυμορφισμός αυτός εδράζεται στη θέση X: και προκύπτει ύστερα από αντικατάσταση της βάσης θυμίνης (Τ) από κυτοσίνη (C). Αυτή η σημειακή αλλαγή οδηγεί σε αντικατάσταση της σερίνης (Ser) από τη γλυκίνη (Gly). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή η παραλλαγή βρίσκεται έξω από το εξώνιο 9 το οποίο περικλείει την περιοχή πρόσδεσης του συμπαράγοντα PLP, αλλά η δραστηριότητα του παραλλαγμένου ενζύμου παρατηρήθηκε ότι αυξάνεται εν μέρει με τη συμπλήρωση συμπαράγοντα PLP in vitro. Ορισμένες άλλες παραλλαγές που βρίσκονται έξω από το εξώνιο 9 επίσης επηρεάζουν τη δέσμευση συμπαράγοντα PLP (May et al., 1998). Έτσι, είναι πιθανό ότι η μεταβολή της διαμόρφωσης που επάγεται από την αντικατάσταση, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την υποκατάσταση της σερίνης με γλυκίνη, μπορεί επίσης να μεταβάλλει την πρόσδεση του PLP συμπαράγοντα στο ένζυμο (Harigae et al., 1999). Η περίπτωση αυτή μελετήθηκε από τον Harigae και τους συνεργάτες του το 1999 σε άντρα ασθενή ηλικίας 18 ετών. Τα ευρήματά της μελέτης προβλέπουν ότι η θεραπεία με πυριδοξίνη από το στόμα μπορούσε να βελτιώσει την αναιμία του ασθενούς, ωστόσο, δεν αναλήφθηκε διότι ο ασθενής δε χρειάστηκε θεραπεία για την αναιμία του. Πρόκειται για de novo γενωμική παραλλαγή (Harigae, et al., 1999). 50

51 1.13. Σκοπός Ένας σημαντικός αριθμός γενετικών παραγόντων έχει αναφερθεί ότι επηρεάζουν τη σύνθεση της αίμης, η οποία διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης. Σε αυτούς τους γενετικούς παράγοντες περιλαμβάνονται μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί οι οποίοι εντοπίζονται στο γονίδιο ALAS2. Συγκεκριμένα, οι γενωμικές αυτές παραλλαγές διαταράσσουν το πρώτο βήμα του βιοσυνθετικού μονοπατιού της αίμης, οδηγώντας σε μειωμένη παραγωγή της τελευταίας. Σε προηγούμενες μελέτες ασθενών με Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία έχουν ταυτοποιηθεί συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί, οι οποίοι συσχετίζονται με την ανταπόκριση ασθενών στη θεραπεία με πυριδοξίνη (Cotter et al., 1992, Cotter et al., 1994, Cox et al., 1994, Prades et al., 1995, Cotter et al., 1995, Edgar et al., 1997, Edgar et al., 1998, Futuyama et al., 1998, Cotter et al., 1999, Harigae et al., 1999, Cazzola et al., 2000, Futuyama et al., 2003, Rollon et al., 2015, Mendez et al., 2016 ). Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε βιβλιογραφική ανασκόπηση και εκτεταμένη χρήση βάσεων γενωμικών δεδομένων για τον προσδιορισμό των γενωμικών παραλλαγών που οδηγούν στην εμφάνιση Χ- συνδεδεμένης σιδηροβλαστικής αναιμίας. Επιλέχθηκαν 13 μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, οι οποίοι εντοπίζονται σε έξι εξώνια του γονιδίου ALAS2, με κριτήριο εάν οι περιπτώσεις ασθενών που μελετήθηκαν παρουσίασαν ανταπόκριση στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι 13 αυτοί μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που έχουν ήδη συσχετιστεί με την ανταπόκριση στη θεραπεία σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες, στο υπό μελέτη δείγμα DNA Έλληνα ασθενούς αρσενικού φύλου και προχωρημένης ηλικίας με Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία, ανταποκρινόμενος στη συμπλήρωση με πυριδοξίνη. Στόχος αυτής της διερεύνησης είναι ο προσδιορισμός της ύπαρξης γενωμικών παραλλαγών στο υπό μελέτη δείγμα ώστε να επιβεβαιωθεί η συσχέτιση της ανταπόκρισης του ασθενούς με την πιθανή παραλλαγή που μπορεί να εμφανίσει. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για την ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος DNA που πιθανά φέρει την παραλλαγή και αλληλούχιση του τμήματος αυτού ώστε να προσδιοριστεί ο γονότυπος του ασθενούς. 51

52 ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε το DNA ασθενούς που πάσχει από Χ- συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία. Το δείγμα αίματος του ασθενούς προέρχεται από τον ελληνικό πληθυσμό και ελήφθη από το Αιματολογικό Τμήμα Παθολογικής Κλινικής του Γενικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, σε συνεργασία με τον Καθηγητή του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Συμεωνίδη Ανάργυρο Απομόνωση DNA από ολικό περιφερικό αίμα Η απομόνωση του γενωμικού DNA από ολικό περιφερικό αίμα πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο απομόνωσης με διάλυμα φαινόλης- χλωροφορμίου. Για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκαν 3 ml ολικού, περιφερικού αίματος. Πρωτόκολλο Απομόνωσης DNA 1. Μεταφορά του αίματος σε πλαστικό σωλήνα φυγοκέντρου των 1.5 ml. 2. Προσθήκη 6 ml RBC lysis solution στο σωλήνα φυγοκέντρου και καλή ανακίνηση (τουλάχιστον πέντε φορές) 3. Επώαση για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ανακίνηση τουλάχιστον 5 φορές ακόμη 4. Φυγοκέντρηση στα 2000 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 5. Προσεκτική απόρριψη του υπερκείμενου, στο οποίο εμπεριέχονται οι πρωτεΐνες του πλάσματος 6. Προσθήκη 10 ml RBC lysis solution, ανακίνηση και φυγοκέντρηση στα 2000 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 7. Προσεκτική απόρριψη υπερκείμενου και προσθήκη 1 ml NaCl solution συγκέντρωσης 1 Μ, έντονη ανάδευση για την επανεναιώρηση των λευκών αιμοσφαιρίων 8. Προσθήκη 6 ml Cell lysis solution στο falcon και 50 μl RNase A solution στον σωλήνα 9. Ήπια ανάδευση. Επώαση στους 37 ο C για τουλάχιστον 60 λεπτά μέχρι την πλήρη λύση των λευκών αιμοσφαιρίων και την αποδιάταξη του RNA 52

53 10. Προσθήκη 1 ml sodium acetate solution συγκέντρωσης 3 Μ σε κάθε σωλήνα και σύντομη ανάδευση 11. Προσθήκη 1 ml phenol:chloroform:isoamyllcohol 25:24:1 σε κάθε δείγμα και έντονη ανάδευση για τουλάχιστον 10 sec 12. Φυγοκέντρηση στα 1500 g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να διαχωριστούν οι δυο φάσεις 13. Μεταφορά υπερκείμενου σε σωλήνα φυγόκεντρου 15 ml, ο οποίος περιέχει 5 ml ισοπροπανόλης 100% 14. Αργή ανακίνηση για 25 φορές προκειμένου να συμπυκνωθεί το DNA και φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 15. Προσεκτική απόρριψη υπερκείμενου και προσθήκη 10 ml 70% αιθανόλης στο δείγμα, ανακίνηση αρκετές φορές για την έκπλυση του ιζήματος 16. Φυγοκέντρηση στα 2000 g για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 17. Προσεκτική απόρριψη αιθανόλης και στέγνωμα (air- dry) του ιζήματος για λεπτά 18. Προσθήκη 300 μl TE Buffer στο falcon και ήπια ανάδευση με για 5-10 λεπτά 19. Επώαση δείγματος για 18 ώρες στους 37 ο C ώστε να διαλυθεί πλήρως το ίζημα και ήπια ανάδευση 20. Ποσοτικοποίηση και αποθήκευση του δείγματος στους -20 ο C 2.2. Έλεγχος ποιότητας και προσδιορισμός της συγκέντρωσης απομονωθέντος δείγματος Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του δείγματος που απομονώθηκε πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας. Η μέθοδος αυτή, βασίζεται στην ιδιότητα των μορίων να απορροφούν εκλεκτικά μέρος της ακτινοβολίας του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται η συσκευή φωτομέτρησης NanoDrop (Εικόνα 10). Πρόκειται για συσκευή φασματοφωτομέτρησης πλήρους φάσματος που έχει τη δυνατότητα μέτρησης της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. Λειτουργεί με βάση ειδικά συστήματα συγκράτησης του δείγματος ανάμεσα σε δύο επιφάνειες, χωρίς τη χρήση κυψελίδων. Η απαιτούμενη ποσότητα δείγματος είναι πολύ μικρή (1-2 μl) και το δείγμα χρησιμοποιείται χωρίς καμία προηγούμενη αραίωση (Παπανικολάου και συν., 2015) 53

54 Εικόνα 10: Ενδεικτική συσκευή φωτομέτρησης NanoDrop ( Αρχικά, και για τη σωστή χρήση της συσκευής, πραγματοποιείται μηδενισμός της συσκευής με τη χρήση αποσταγμένου νερού (ddh2o). Στη συνέχεια, έχοντας ανοιχτό τον βραχίονα της συσκευής, τοποθετείται στην ειδική βάση μία σταγόνα DNA δείγματος όγκου 1 μl. Κλείνοντας τον βραχίονα, το δείγμα σχηματίζει στήλη, επιτρέποντας τον υπολογισμός της συγκέντρωσης του δείγματος με τη βοήθεια οπτικών ινών. Πραγματοποιείται άμεση καταγραφή των αποτελεσμάτων της μέτρησης του δείγματος. Μετά την ολοκλήρωση της μέτρησης η βάση καθαρίζεται χρησιμοποιώντας καθαρό χαρτί. Η φωτομέτρηση για τα νουκλεϊκά οξέα γίνεται σε μήκος κύματος 260 nm, τιμή στην οποία τα νουκλεϊκά οξέα εμφανίζουν το μέγιστο απορρόφησης τους. Παράλληλα, φωτομέτρηση πραγματοποιείται σε μήκος κύματος 280 nm για τον έλεγχο τυχόν παρουσίας πρωτεϊνών στο δείγμα και σε μήκος κύματος 230 nm για τον έλεγχο οργανικών προσμίξεων. Ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260 nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280 nm (O.D.260nm/O.D.280nm) προσδιορίζει την καθαρότητα του δείγματος DNA ή RNA. 54

55 Ο.D.260nm/O.D.280nm < 1.7 Ύπαρξη προσμίξεων (πρωτεϊνών ή φαινόλης) Ο.D.260nm/O.D.280nm > 1.9 Πρόσμιξη RNA Τέλος, υπολογίζεται ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260 nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 230 nm (O.D.260nm/O.D.230nm), ο οποίος επίσης είναι ενδεικτικός της ύπαρξης προσμίξεων. O.D.260nm/O.D.230nm < 2 Ύπαρξη προσμίξεων O.D.260nm/O.D.230nm > 2 Ενδεικτική τιμή δειγμάτων καθαρών νουκλεϊκών οξέων Η διαδικασία αυτή ακολουθήθηκε για τρία δείγματα (AL1a, AL1b, AL1c), τα οποία αντιστοιχούν σε τρεις διαφορετικές γενικές αίματος του ίδιου ασθενούς. Από τα τρία δείγματα επιλέχθηκε το AL1c, το οποίο βάσει των αποτελεσμάτων της φωτομέτρησης εμφανίζει Ο.D.260nm/O.D.280nm = 1.75 και O.D.260nm/O.D.230nm = Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν Στη συγκεκριμένη εργασία, μελετήθηκαν ως γενετικοί δείκτες μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs), οι οποίοι εντοπίζονται στα εξώνια 5, 7, 8, 9, 10 και 11 του γονιδίου ALAS2, το οποίο εδράζεται στο χρωμόσωμα Χ. Η επιλογή των συγκεκριμένων εξωνίων/πολυμορφισμών βασίζεται σε βιβλιογραφικά δεδομένα (Cotter et al., 1992, Cotter et al., 1994, Cox et al., 1994, Prades et al., 1995, Cotter et al., 1995, Edgar et al., 1997, Edgar et al., 1998, Futuyama et al., 1998, Cotter et al., 1999, Harigae et al., 1999, Cazzola et al., 2000, Futuyama et al., 2003, Rollon et al., 2015, Mendez et al., 2016), σύμφωνα με τα οποία ασθενείς που πάσχουν από Χ συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία και ανταποκρίνονται στη θεραπεία με πυριδοξίνη, εμφανίζουν συγκεκριμένες γενωμικές παραλλαγές οι οποίες εδράζονται στα εξώνια αυτά. Η βιβλιογραφική αναζήτηση πραγματοποιήθηκε χρήσει των βάσεων δεδομένων PubMed, OMIM, NCBI, ClinVar, Ensembl, dbsnp. 55

56 Πίνακας 1: Συγκεντρωτικά στοιχεία πολυμορφισμών που μελετήθηκαν ΕΞΩΝΙΟ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΑΛΛΑΓΗ ΘΕΣΗ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗ ΑΛΛΑΓΗ PMID 5 rs G>T X: F165L rs C>T X: A172T rs C>A,T X: D159N rs A>G X: Y199H rs C>T X: G291S rs T>G X: K299Q rs G>C X: T388S rs A>T X: I471N rs G>A X: R411C rs C>T X: C395Y rs G>A,T X: R452C rs G>C X: H524D rs T>C X: S568G

57 2.4. Σχεδιασμός ζεύγους εκκινητών Ο σχεδιασμός του ζεύγους των εκκινητών είναι το βήμα το οποίο έχει ιδιαίτερη σημασία για τον πολυμερισμό του DNA και την απόδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και πιο σημαντικά, την ακρίβεια και την ειδικότητα της μεθοδολογίας. Οι εκκινητές είναι μικρά συνθετικά τμήματα DNA, συμπληρωματικά και εκλεκτικά ως προς την περιοχή στόχο του DNA. Ο σχεδιασμός τους επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης προγραμμάτων βιοπληροφορικής και βάσεων γενωμικών δεδομένων. Ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: 1. Αρχικά, χρησιμοποιείται η βάση δεδομένων Ensembl ( με σκοπό τον προσδιορισμό της θέσης του υπό μελέτη μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (SNP) στο γονιδίωμα καθώς και της αλληλουχίας που τον περιβάλλει (flanking sequence). 2. Στη συνέχεια, ο σχεδιασμός των εκκινητών πραγματοποιείται στο πρόγραμμα Primer3. Στο πρόγραμμα, εισάγεται η αλληλουχία που περιβάλλει τον πολυμορφισμό (flanking sequence) αποκλείοντας χρήσει ανισοτήτων τις περιοχές αυτές που θεωρούνται ακατάλληλες για τον σχεδιασμό των εκκινητών. Το πρόγραμμα προτείνει συνήθως πέντε πιθανά ζεύγη εκκινητών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν. Για την επιλογή του καταλληλότερου ζεύγους ελέγχονται ορισμένες παράμετροι, όπως οι θερμοκρασίες υβριδοποίησης (Tm) των εκκινητών, οι οποίες θα πρέπει να είναι παραπλήσιες και μεταξύ των τιμών ο C, το μήκος των εκκινητών (17-20 νουκλεοτίδια) και η περιεκτικότητα σε GC, η οποία πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60%, καθώς υψηλό ποσοστό περιεκτικότητας σε GC επιβραδύνει τον πολυμερισμό. 3. Πραγματοποιείται έλεγχος της ειδικότητας των εκκινητών μέσω του προγράμματος BLAST/BLAT της βάσης Ensembl. Επιλέγονται οι εκκινητές που είναι ειδικοί μόνο για την υπό μελέτη αλληλουχία στόχο. Η ομολογία των εκκινητών με περισσότερες αλληλουχίες, αυξάνει την πιθανότητα εμφάνισης μη ειδικών προϊόντων, μειώνοντας την απόδοση της PCR. 57

58 4. Πραγματοποιείται έλεγχος του τμήματος που έχει πολυμεριστεί για την πιθανή εμφάνιση δευτεροταγών δομών χρήσει του προγράμματος DINAMELT. Είναι σημαντικό, στις περιοχές πρόσδεσης των εκκινητών να μην εμφανίζονται βρόγχοι και αναδιπλώσεις οι οποίες παρεμποδίζουν την εξέλιξη της PCR αντίδρασης. Στη συγκεκριμένη μελέτη σχεδιάστηκαν, βάσει των παραπάνω, έξι διαφορετικά ζεύγη εκκινητών. Κάθε ζεύγος εκκινητών αντιστοιχεί και σε διαφορετικό από τα έξι υπό μελέτη εξώνια. Στον παρακάτω πίνακα παρατίθενται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη γονοτύπηση των πολυμορφισμών του κάθε εξωνίου. Πίνακας 2: Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για το κάθε εξώνιο ΕΞΩΝΙΟ ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ Tm ΜΕΓΕΘΟΣ PCR ΠΡΟΙΟΝΤΟΣ 5 Forward: TGACCAGTTTTTCAGGGACA ο C 197 bp Reverse: CTTGCAAGACCTGAGGGTGT ο C 7 Forward: TTTACTCAGACGCAGGCAAC ο C 149 bp Reverse: AAAGGCCACAATTTTGGGTA ο C 8 Forward: GTGGGGACCTTTAGCTGGAT ο C 592 bp Reverse: CCAACCCAAAGTAGGCATGT ο C 58

59 ΕΞΩΝΙΟ ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ Tm ΜΕΓΕΘΟΣ PCR ΠΡΟΙΟΝΤΟΣ 9 Forward: AGGGAAACAAAGCTGGCAAT ο C 497 bp Reverse: CACCCCCTTGTGTTATCTGG ο C 10 Forward: TCTATGTGCAGGCCATCAAC ο C 127 bp Reverse: GGCACCCATGTTGAGAACTT ο C 11 Forward: ATCCTAGGCAGCTGGCTTCT ο C 284 bp Reverse: AGGGTTGAGGGGGATCAATA ο C 2.5. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymarase Chain Reaction- PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) ανακαλύφθηκε το 1983 από τον βιοχημικό Karry Mullis και αποτελεί μία ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο της μοριακής βιολογίας, με εφαρμογές τόσο σε ερευνητικό όσο και σε διαγνωστικό επίπεδο (Παπανικολάου και συν., 2015) Αρχή της μεθόδου PCR Η PCR είναι μια ενζυμική μέθοδος ενίσχυσης συγκεκριμένων τμημάτων γενετικού υλικού in vitro. Κατά τη διάρκεια μιας τυπικής αντίδρασης PCR το επιθυμητό τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιάζεται μέχρι και ένα τρισεκατομμύριο φορές, γεγονός που 59

60 είναι απαραίτητο για μετέπειτα χειρισμούς, όπως η ηλεκτροφόρηση, η πέψη με ένζυμα περιορισμού, η ανάγνωση της αλληλουχίας βάσεων. Η PCR βασίζεται στον εκθετικό πολλαπλασιασμό των μορίων DNA από μια θερμοσταθερή πολυμεράση, όπως αυτή του Thermus aquaticus (Taq). Κατά την PCR χρησιμοποιείται ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών, καθένας από τους οποίους υβριδοποιείται σε έναν κλώνο ενός δίκλωνου μορίου DNA. Οι υβριδοποιημένοι εκκινητές λειτουργούν ως υπόστρωμα για την DNA πολυμεράση κι έτσι για κάθε αλυσίδα του υποστρώματος δημιουργείται ένας συμπληρωματικός κλώνος DNA μέσω της διαδοχικής προσθήκης ελεύθερων δεοξυνουκλεοτιδίων (Παπανικολάου και συν., 2015) Τα στάδια της αντίδρασης PCR Η PCR πραγματοποιείται σε τρία διαδοχικά στάδια (Εικόνα 11) τα οποία επαναλαμβάνονται από 25 έως 35 φορές. Η PCR εκτελείται στον θερμικό κυκλοποιητή (Thermal cycler), μία προγραμματιζόμενη συσκευή που φέρει θερμαινόμενη πλάκα που μπορεί να εναλλάσσει θερμοκρασίες με ταχύτητα και ακρίβεια. Τα στάδια αυτά είναι τα εξής: 1. Αποδιάταξη Οι δύο αλυσίδες του DNA διαχωρίζονται (αποδιατάσσονται) με θέρμανση σε θερμοκρασία C για περίπου 30 δευτερόλεπτα έως 1 λεπτό. 2. Υβριδισμός εκκινητών Με μείωση της θερμοκρασίας στους C για περίπου 30 δευτερόλεπτα έως 1 λεπτό, οι εκκινητές υβριδοποιούνται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στο εκμαγείο DNA. 3. Επιμήκυνση Για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας αυξάνουμε τη θερμοκρασία στους 72 C, τη βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της Taq πολυμεράσης. Η πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές εισάγοντας τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλληλουχία DNA ως εκμαγείο. Η ταχύτητα σύνθεσης της νέας αλυσίδας είναι της τάξης των 1000 bp ανά λεπτό. (Παπανικολάου και συν., 2015) 60

61 Εικόνα 11: Σχηματική απεικόνιση των τριών σταδίων της PCR (Παπανικολάου και συν., 2015) Τα αντιδραστήρια της PCR Τα βασικά αντιδραστήρια για την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR είναι: 1. DNA πολυμεράση 2. Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές 3. Γενετικό υλικό αλληλουχία στόχος 4. Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και Mg Νουκλεοτίδια (dntps) Βαθμιδωτή PCR Η συγκεκριμένη PCR (διαβάθμισης θερμοκρασίας υβριδισμού) επιτρέπει την επιλογή της καταλληλότερης θερμοκρασίας ως θερμοκρασίας υβριδισμού (Tm) των εκκινητών (primer annealing temperature) για ένα συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών. Το εύρος των θερμοκρασιών καθορίζεται βάσει των Tm των εκκινητών. Χρησιμοποιώντας έναν κυκλοποιητή με δυνατότητα κλίσης θερμοκρασιών, μπορούμε να ταυτοποιήσουμε τη θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών της αντίδρασης, η οποία θα παρέχει αποδοτική και ειδική ενίσχυση προϊόντων, εφόσον οι υπόλοιποι παράγοντες που καθορίζουν την απόδοση της αντίδρασης παραμένουν σταθεροί. 61

62 Κατάλληλη θερμοκρασία θεωρείται εκείνη στην οποία η ζώνη στο αναμενόμενο μοριακό βάρος είναι έντονη και με σαφή όρια (χωρίς smear). Ακόμη, όταν δεν παρατηρείται τυχόν ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων και σχηματισμού διμερών εκκινητών PCR τύπου touchdown Μέθοδος η οποία στοχεύει στην αύξηση της ειδικότητας των PCR προϊόντων. Χρησιμοποιεί κυκλικό πρόγραμμα, στο οποίο η θερμοκρασία αποδιάταξης σταδιακά μειώνεται. Η αρχική θερμοκρασία είναι κάποιους βαθμούς πάνω από την Tm των εκκινητών και συνεχίζεται κανονικά ο πολλαπλασιασμός Πρωτόκολλα και αντιδραστήρια της PCR που χρησιμοποιήθηκαν Για την πραγματοποίηση όλων των PCR, χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix από την εταιρία KAPA BIOSYSTEMS. Το σύστημα αυτό βελτιώνει το χρόνο αντίδρασης κατά 20-70% σε σχέση με τις συμβατικές PCR και παρέχει αντιδράσεις υψηλών αποδόσεων. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία -20 ο C και περιλαμβάνει: Taq KAPA2G Fast Hot Start DNA πολυμεράση Ρυθμιστικό διάλυμα KAPA2G Fast Hot Start PCR (Buffer) MgCl2 συγκέντρωσης 1.5 mm, για την ενίσχυση της δράσης της πολυμεράσης και την υβριδοποίηση των εκκινητών dntps συγκέντρωσης 0.2 mm Οι εκκινητές και το DNA προστίθενται ξεχωριστά. Η προετοιμασία των αντιδράσεων της PCR πραγματοποιήθηκε σε εργαστηριακό πάγκο, ο οποίος χρησιμοποιείται αποκλειστικά για το σκοπό αυτό. Σημαντική προϋπόθεση για την ελαχιστοποίηση της πιθανότητας εμφάνισης επιμολύνσεων αποτελεί το καθάρισμα τόσο του πάγκου όσο και των πιπετών με αιθανόλη 70%. Ακόμη, οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε πάγο για την διατήρηση των αντιδραστηρίων και των DNA 62

63 δειγμάτων. Για την προετοιμασία της PCR χρησιμοποιήθηκαν σωληνάκια (PCR tubes) χωρητικότητας 200 μl και ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) για την αποφυγή επιμολύνσεων. 1. Για το εξώνιο 5 Πίνακας 3: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 5 Αντιδραστήριο KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση Πρόσθιος εκκινητής Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0.5 μμ μμ 0.5 μμ 1.25 ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 4: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Touchdown PCR στους 60 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 5 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 65 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 63

64 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 3 φορές 6. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 7. Υβριδοποίηση 64 ο C για 15 δευτερόλεπτα 8. Επιμήκυνση 72 0 C για 1 δευτερόλεπτο 9. Επανάληψη σταδίων 6-8 για 3 φορές 10. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 11. Υβριδοποίηση 63 ο C για 15 δευτερόλεπτα 12. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 13. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 14. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 15. Υβριδοποίηση 62 ο C για 15 δευτερόλεπτα 16. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 17. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 18. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 19. Υβριδοποίηση 61 ο C για 15 δευτερόλεπτα 20. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 21. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 22. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 23. Υβριδοποίηση 60 ο C για 15 δευτερόλεπτα 24. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 25. Επανάληψη σταδίων για 25 φορές 26. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 27. Συντήρηση 4 ο C 64

65 2. Για το εξώνιο 7 Πίνακας 5: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 7 Αντιδραστήριο KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Πρόσθιος εκκινητής Αντίστροφος εκκινητής Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Όγκος (μl) μμ 0.5 μμ μμ 0.5 μμ 1.25 ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 6: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Απλή PCR στους 59 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 7 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 59 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 39 φορές 6. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 7. Συντήρηση 4 ο C 65

66 3. Για το εξώνιο 8 Πίνακας 7: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 8 Αντιδραστήριο KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση Πρόσθιος εκκινητής Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0.5 μμ μμ 0.5 μμ 1.25 ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 8: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Απλή PCR στους 60 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 9 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 60 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 39 φορές 6. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 7. Συντήρηση 4 ο C 66

67 4. Για το εξώνιο 9 Πίνακας 9: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 9 Αντιδραστήριο KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση Πρόσθιος εκκινητής Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0.5 μμ μμ 0.5 μμ 1.25 ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 10: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Απλή PCR στους 62 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 9 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 62 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 39 φορές 6. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 7. Συντήρηση 4 ο C 67

68 5. Για το εξώνιο 10 Πίνακας 11: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 10 Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Πρόσθιος 10 μμ 0.5 μμ 1.25 εκκινητής Αντίστροφος 10 μμ 0.5 μμ 1.25 εκκινητής ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 12: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Touchdown PCR στους 60 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 10 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 65 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 3 φορές 6. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 7. Υβριδοποίηση 64 ο C για 15 δευτερόλεπτα 8. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 9. Επανάληψη σταδίων 6-8 για 3 φορές 68

69 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 10. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 11. Υβριδοποίηση 63 ο C για 15 δευτερόλεπτα 12. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 13. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 14. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 15. Υβριδοποίηση 62 ο C για 15 δευτερόλεπτα 16. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 17. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 18. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 19. Υβριδοποίηση 61 ο C για 15 δευτερόλεπτα 20. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 21. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 22. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 23. Υβριδοποίηση 60 ο C για 15 δευτερόλεπτα 24. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 25. Επανάληψη σταδίων για 25 φορές 26. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 27. Συντήρηση 4 ο C 6. Για το εξώνιο 11 Πίνακας 13: Αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του εξωνίου 11 Αντιδραστήριο KAPA2G Fast Hot Start Ready Mix Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση

70 Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση Πρόσθιος εκκινητής Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0.5 μμ μμ 0.5 μμ 1.25 ddh2o DNA- στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος Πίνακας 14: Συνθήκες PCR (Μέθοδος: Touchdown PCR στους 60 ο C) για τη μελέτη του εξωνίου 11 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 1. Ενεργοποίηση 95 ο C για 2 λεπτά ενζύμου 2. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση 65 ο C για 15 δευτερόλεπτα 4. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 5. Επανάληψη σταδίων 2-4 για 3 φορές 6. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 7. Υβριδοποίηση 64 ο C για 15 δευτερόλεπτα 8. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 9. Επανάληψη σταδίων 6-8 για 3 φορές 10. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 11. Υβριδοποίηση 63 ο C για 15 δευτερόλεπτα 12. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 70

71 Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος 13. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 14. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 15. Υβριδοποίηση 62 ο C για 15 δευτερόλεπτα 16. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 17. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 18. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 19. Υβριδοποίηση 61 ο C για 15 δευτερόλεπτα 20. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 21. Επανάληψη σταδίων για 3 φορές 22. Αποδιάταξη 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα 23. Υβριδοποίηση 60 ο C για 15 δευτερόλεπτα 24. Επιμήκυνση 72 ο C για 1 δευτερόλεπτο 25. Επανάληψη σταδίων για 25 φορές 26. Τελική επιμήκυνση 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα 27. Συντήρηση 4 ο C 2.6. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (gel) αγαρόζης Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση είναι μια ευρέως διαδεδομένη τεχνική για την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών. Βασίζεται στον διαχωρισμό φορτισμένων μορίων (π.χ. DNA) κατά μήκος ενός στερεού πορώδους υποστρώματος στα άκρα του οποίου εφαρμόζεται ηλεκτρική τάση. Τα φορτισμένα μόρια κινούνται μέσα στο υπόστρωμα και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους. Η πιο συχνή μορφή ηλεκτροφόρησης, είναι η ηλεκτροφόρηση μορίων DNA σε πήκτωμα αγαρόζης. Η μέθοδος είναι απλή και αποτελεσματική και επιτρέπει τον διαχωρισμό μορίων DNA μεγέθους από 500 bp έως 25 kb. Χρησιμοποιείται ευρύτατα 71

72 στις βιολογικές επιστήμες, σε τομείς όπως η μοριακή βιολογία, η ιατροδικαστική και η έρευνα. Καθώς τα μόρια DNA μετακινούνται, σχηματίζουν ζώνες πάνω στο πήκτωμα σε διαφορετικές περιοχές ανάλογα με το μέγεθός τους. Στο πήκτωμα προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο έχει την ιδιότητα να ενσωματώνεται στις αύλακες του δίκλωνου DNA και να φθορίζει ύστερα από διέγερση με UV. Με τον τρόπο αυτό, οι ζώνες καθίστανται ορατές. Η κινητικότητα των μορίων DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης εξαρτάται από: 1. Το μέγεθος. Τα μικρότερα μόρια DNA κινούνται ταχύτερα, καθώς συναντούν μικρότερη αντίσταση στους πόρους του πηκτώματος σε αντίθεση με τα μεγαλύτερα. Επομένως τα μικρότερα μόρια εντοπίζονται πιο χαμηλά στο πήκτωμα. Εκτός από τα δείγματα, στο πήκτωμα προστίθεται και ένας μάρτυρας γνωστού μοριακού βάρους ώστε να μπορεί να υπολογιστεί το μέγεθος του τμήματος DNA που ηλεκτροφορείται. 2. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. 3. Τη διαμόρφωση του DNA. Παρατηρείται διαφορετική κινητικότητα των μορίων μεταξύ υπερελικωμένων, ανοιχτών κυκλικών, ευθύγραμμων μορίων DNA. 4. Το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Το ρυθμιστικό διάλυμα διατηρεί σταθερό το ph και περιέχει τα απαραίτητα ιόντα για την αύξηση της ηλεκτρικής αγωγιμότητας. 5. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου που εφαρμόζεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Αντιδραστήρια για την προετοιμασία του πηκτώματος αγαρόζης. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης είναι: Αγαρόζη Ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x Σύσταση TAE 50 : 242 g Tris, 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) και ddh2o μέχρι τελικό όγκο 1000 ml. Αποσταγμένο H2O (dd H2O) έως τελικού όγκου 1000 ml 72

73 Βρωμιούχο αιθίδιο Πρωτόκολλο προετοιμασίας του πηκτώματος αγαρόζης 1. Μέτρηση επιθυμητής ποσότητας αγαρόζης στον ζυγό ακριβείας και υπολογισμός ποσότητας TAE 1x σε ογκομετρικό σωλήνα 2. Ανάμειξη αγαρόζης και TAE 1x σε κωνική φιάλη 3. Θέρμανση διακόπτοντας και αναδεύοντας ανά διαστήματα, έως ότου η αγαρόζη διαλυθεί πλήρως και το διάλυμα γίνει διάφανο 4. Προσεκτική μεταφορά φιάλης στον απαγωγό και προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου 5. Μεταφορά διαλύματος στην ηλεκτροφορητική συσκευή και αναμονή μέχρι τη σταθεροποίησή του Η περιεκτικότητα του πηκτώματος σε αγαρόζη καθορίζεται από το μέγεθος του PCR προϊόντος. Με κριτήριο αυτό, στο συγκεκριμένο πείραμα, η σύσταση του πηκτώματος σε αγαρόζη είναι 1.5% ή 2% w/v Καθαρισμός προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Μετά την ολοκλήρωση της PCR αντίδρασης, πραγματοποιείται καθαρισμός των PCR προϊόντων που πρόκειται να αλληλουχηθούν προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα εκκινητών, δεοξυριβονουκλεοτιδίων, αλάτων και ενζύμων. Το προτυποποιημένο σύστημα που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό είναι το Nucleo Spin Gel and PCR Clean-up Kit από τη MACHEREY-NAGEL Πρωτόκολλο καθαρισμού προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης 1. Προσθήκη διαλύματος πρόσδεσης NTI Buffer σε ποσότητα διπλάσια από αυτή του PCR προϊόντος 2. Μεταφορά διαλύματος σε στήλη (spin column) 3. Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα και απόρριψη του υπερκείμενου 4. Προσθήκη 500 μl διαλύματος πλύσης ΝΤ3 Buffer στη στήλη 73

74 5. Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα και απόρριψη του υπερκείμενου 6. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g 7. Μεταφορά της στήλης σε eppendorf tube χωρητικότητας 1.5 ml και επώαση για 2 λεπτά στους 70 C 8. Προσθήκη 20 μl διαλύματος έκλουσης ΝΕ Buffer στη στήλη και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία 70 C 9. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό 10. Προσθήκη 20 μl διαλύματος έκλουσης (ΝΕ Buffer) στη στήλη και επώαση για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου 11. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα g 12. Παραλαβή του καθαρού προϊόντος και αποθήκευσή του στους -20 ο C 2.8. Αλληλούχιση DNA (Sanger Sequencing) Η αλληλούχιση αποτελεί μία ενζυμική μέθοδο προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός μορίου DNA. Ανακαλύφθηκε το 1977 από τον βιοχημικό Frederick Sanger και την ομάδα του. Είναι σημαντικό εργαλείο στην προσπάθεια ανάλυσης του ανθρώπινου γονιδιώματος Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα των τριφωσφορικών διδεοξυριβονουκλεοτιδίων (ddntps), να σταματούν την επιμήκυνση ενός κλώνου DNA. Τα διδεοξυριβονουκλεοτίδια αποτελούν παράγωγα των τριφωσφωρικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων από τα οποία απουσιάζει η 3 υδροξυλομάδα (Εικόνα 12). 74

75 Εικόνα 12: Μοριακή δομή ενός μορίου διδεοξυριβονουκλεοτιδίου (ddntp) και ενός μορίου δεοξυριβονουκλεοτιδίου (dntp) ( genomics-17/whole-genome-sequencing-121/strategies-used-in-sequencing-projects /) Τα μόρια αυτά, κατά την αντιγραφή του DNA ενσωματώνονται τυχαία και φυσιολογικά στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα. Στην περίπτωση αυτή, η αλυσίδα δε διαθέτει πλέον 3'- ΟΗ, οπότε αναστέλλεται η προσθήκη του επόμενου νουκλεοτιδίου και η δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού με αποτέλεσμα η αλυσίδα του DNA να διακόπτεται στο σημείο αυτό. Για κάθε πείραμα αλληλούχισης τέσσερα διαφορετικά τριφωσφορικά διδεοξυριβονουκλεοτίδια (ddatp, ddctp, ddgtp και ddττρ) χρησιμοποιούνται σε τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις σύνθεσης αντιγράφων του ίδιου μονόκλωνου DNA εκμαγείου. Σε κάθε αντίδραση περιέχονται δεοξυνουκλεοτίδια, DNA πολυμεράση, ένας εκκινητής και κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Κάθε αντίδραση παράγει μια ομάδα μορίων DNA που σταματούν σε διαφορετικά σημεία της αλληλουχίας. Τα προϊόντα αυτών των τεσσάρων αντιδράσεων διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε τέσσερις παράλληλες στήλες μιας πηκτής πολυακρυλαμίδης. Τα νεοσυντεθέμενα κλάσματα ανιχνεύονται από έναν δείκτη (ραδιενεργό ή φθορίζοντα) που έχει 75

76 ενσωματωθεί είτε στον εκκινητή, είτε σ' ένα από τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται στην επέκταση της αλυσίδας του DNA. Η αλληλουχία του νεοσυντειθέμενου κλώνου μπορεί να καθορισθεί με ανάγνωση των ζωνών, αρχίζοντας από το κάτω άκρο της πηκτής. Σήμερα, η διαδικασία της αλληλούχισης έχει αυτοματοποιηθεί, καθιστώντας δυνατή την πραγματοποίηση μιας μόνο αντίδρασης, στην οποία περιέχονται και τα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με διαφορετική χρωστική. Τα τμήματα του DNA που συντίθενται διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση. Στο κάτω μέρος του πηκτώματος υπάρχει μια συσκευή laser που διεγείρει τις φθορίζουσες χρωστικές και εν συνεχεία, καταγράφεται η ακτινοβολία που εκπέμπουν. Το αποτέλεσμα αποδίδεται γραφικά ως μια σειρά έγχρωμων κορυφών που αντιστοιχούν στα διαδοχικά νουκλεοτίδια της υπό μελέτη αλληλουχίας (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Χαρακτηριστική απεικόνιση χρωματογραφήματος ( Στην παρούσα εργασία, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημίου των Ηνωμένων Αραβικών Εμιράτων σε συνεργασία με την κυρία Anne John και τον Καθηγητή Μοριακής και Γενετικής Ιατρικής Bassam R. Ali. 76

77 III. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκαν μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, οι οποίοι εντοπίζονται σε 6 εξώνια του γονιδίου ALAS2, προκειμένου να διερευνηθεί η συσχέτιση τους με την ανταπόκριση του ασθενή που πάσχει από Χ-συνδεδεμένη σιδηροβλαστική αναιμία στη θεραπεία με πυριδοξίνη. Μελετήθηκε το δείγμα ενός ασθενούς, ο οποίος προέρχεται από τον ελληνικό πληθυσμό. Οι πολυμορφισμοί μελετήθηκαν εφαρμόζοντας την αλληλούχιση κατά Sanger. Ακολουθούν οι ηλεκτροφορήσεις των PCR προϊόντων. Το Μ αντιστοιχεί στον δείκτη μοριακών μεγεθών βήματος 100 bp και το Τ στον αρνητικό μάρτυρα για την αντίδραση. Τα PCR προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης σύστασης 2% w/v στα 90V για 40 λεπτά Πηκτώματα αγαρόζης 1. ΕΞΩΝΙΟ 5 (μέγεθος PCR προϊόντος 197 bp) Μ 5 Τ Εικόνα 14: Πήκτωμα αγαρόζης PCR προϊόντος για το εξώνιο 5 77

78 2. ΕΞΩΝΙΑ 7 (μέγεθος PCR προϊόντος 149 bp), 8 (μέγεθος PCR προϊόντος 592 bp), 9 (μέγεθος PCR προϊόντος 497 bp) Τ Μ Εικόνα 15: Πήκτωμα αγαρόζης PCR προϊόντων για τα εξώνια 7, 8, 9 3. ΕΞΩΝΙΟ 10 (μέγεθος PCR προϊόντος 127 bp) Μ Τ 10 Εικόνα 16: Πήκτωμα αγαρόζης PCR προϊόντος για το εξώνιο 10 78

79 4. ΕΞΩΝΙΟ 11 (μέγεθος PCR προϊόντος 284 bp) Μ T 11 Εικόνα 17: Πήκτωμα αγαρόζης PCR προϊόντος για το εξώνιο Χρωματογραφήματα 1. Εξώνιο 5 rs Εικόνα 18: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 79

80 rs Εικόνα 19: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα rs Εικόνα 20: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 80

81 rs Εικόνα 21: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 2. Εξώνιο 7 rs Εικόνα 22: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 81

82 rs Εικόνα 23: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 3. Εξώνιο 8 rs Εικόνα 24: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 82

83 4. Εξώνιο 9 rs Εικόνα 25: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα rs Εικόνα 26: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 83

84 rs Εικόνα 27: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα rs Εικόνα 28: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 84

85 5. Εξώνιο 10 rs Εικόνα 29: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 6. Εξώνιο 11 rs Εικόνα 30: Απεικόνιση πολυμορφισμού rs στο χρωματογράφημα 85