ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΜΙΚΡΟΚΑΡΠΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΤΟΜΑΤΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΜΙΚΡΟΚΑΡΠΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΤΟΜΑΤΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΛΙΔΟΥ ΙΦΙΓΕΝΕΙΑ Γεωπόνος ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Σ. ΣΙΩΜΟΣ, Αναπληρωτής καθηγητής ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2007

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΜΙΚΡΟΚΑΡΠΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΤΟΜΑΤΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΛΙΔΟΥ ΙΦΙΓΕΝΕΙΑ Γεωπόνος ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΣΙΩΜΟΣ, Αναπληρωτής καθηγητής ΜΙΛΤΙΑΔΗΣ ΒΑΣΙΛΑΚΑΚΗΣ, Καθηγητής ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΓΕΡΑΣΟΠΟΥΛΟΣ, Επίκουρος καθηγητής ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ,

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Αισθάνομαι την υποχρέωση να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου στον αναπληρωτή καθηγητή Λαχανοκομίας κ. Αναστάσιο Σ. Σιώμο για την ανάθεση του θέματος, την καθοδήγηση και την ουσιαστική του συμπαράσταση κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής της παρούσας διατριβής και της συγγραφής της. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου στον επίκουρο καθηγητή κ. Δημήτριο Γερασόπουλο για τη συμβολή του στο σχεδιασμό, τη διεξαγωγή του ερευνητικού μέρους της διατριβής και τη συγγραφή της, καθώς και στον καθηγητή Δενδροκομίας Μιλτιάδη Βασιλακάκη για την κριτική ανάγνωση και τις υποδείξεις τους, με σκοπό την καλύτερη παρουσίαση της παρούσας διατριβής. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τους συναδέλφους μου κ. Κωσταντίνο Ρουμελιώτη (μεταπτυχιακό φοιτητή του Εργαστηρίου Λαχανοκομίας), τον κ. Παύλο Τσουβαλτζή (υποψήφιο διδάκτορα του Εργαστηρίου Λαχανοκομίας) και τον κ. Αθανάσιο Κουκουνάρα (υποψήφιο διδάκτορα του Εργαστηρίου της Δενδροκομίας) για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφεραν κατά την διάρκεια του πειραματικού μέρους της διατριβής. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ...5 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ...6 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...22 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ...28 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...55 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...56 ABSTRACT.. 58 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...59 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ωρίμανση των καρπών της τομάτας αποτελεί μια πολύπλοκη, γενετικά προγραμματισμένη διαδικασία, η οποία έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές αλλαγές τόσο στην εμφάνιση όσο και στη σύσταση, που επηρεάζουν άμεσα το χρώμα, την υφή, τη γεύση, το άρωμα και τη διατροφική αξία τους. Λόγω της οικονομικής σημασίας της καλλιέργειας της τομάτας, η διαδικασία της ωρίμανσης των καρπών τόσο πάνω στο φυτό (πριν τη συγκομιδή), όσο και εκτός φυτού (μετασυλλεκτικά) έχει μελετηθεί και συνεχίζει να μελετάται εκτενώς, σε φυσιολογικό, βιοχημικό και γενετικό επίπεδο (Alexander and Grierson, 2002). Ωστόσο, εξαιρετικά περιορισμένες είναι οι πληροφορίες για τη φυσιολογία της υπερωρίμανσης των καρπών πάνω στο φυτό. Σύμφωνα με το FAOSTAT (2007), η τομάτα αποτελεί το δεύτερο πιο διαδεδομένο καλλιεργούμενο λαχανοκομικό είδος στον κόσμο, ως προς την έκταση αλλά και την παραγωγή, μετά την πατάτα. Η προσαρμοστικότητα της τομάτας σε διαφορετικά περιβάλλοντα, μεθόδους καλλιέργειας και χρήσεις των καρπών είναι αποτέλεσμα της πλούσιας γενετικής παραλλακτικότητας που υπάρχει στο είδος αυτό (Tigchelaar, 1986). Στη Χώρα μας, οι μικρόκαρπες τομάτες Σαντορίνης, Χίου και Λήμνου παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τα νησιά του Αιγαίου, στα οποία καλλιεργούνται εκατοντάδες χρόνια και αποτελούν ένα πλούσιο γενετικό υλικό εγχώριων πληθυσμών χωρίς καμμία γενετική αξιολόγιση, επιλογή και βελτίωση. Οι καρποί των ποικιλιών αυτών συνήθως συγκομίζονται σε πιο προχωριμένο στάδιο ωριμότητας, σε σχέση με τις μεγαλόκαρπες καλλιεργούμενες ποικιλίες και τις περισσότερες φορές συγκομίζονται υπερώριμες. Ωστόσο, στις ποικιλίες αυτές δεν έχει μελετηθεί η φυσιολογία της ωρίμανσης και της υπερωρίμανσης των καρπών πάνω στο φυτό. Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη της φυσιολογίας της ωρίμανσης των καρπών των ποικιλιών αυτών, με ιδιαίτερη έμφαση στις μεταβολές κατά την υπερωρίμανση. 5

6 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Με τον όρο ωρίμανση εννοούμε το σύνολο των φυσιολογικών, βιοχημικών και μοριακών διεργασιών που λαμβάνουν χώρα στους καρπούς σε μια ορισμένη στιγμή της ανάπτυξης τους και τους καθιστά κατάλληλους για συγκεκριμένη χρήση (Giovannoni, 2001). Γενικά, ανάλογα με τη φυσιολογία ωρίμανσης των καρπών, αυτοί κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες, τους κλιμακτηρικούς και μη-κλιμακτηρικούς (Biale and Young, 1981; Giovannoni, 2001). Παραδοσιακά, κριτήριο για την κατάταξη αυτή ήταν η αύξηση της αναπνοής κατά την έναρξη της ωρίμανσης (Biale and Young, 1981). Ερευνητικά αποτελέσματα βασισμένα α) σε εφαρμογή χημικών παρεμποδιστών της βιοσύνθεσης του αιθυλενίου (Abeles et al., 1992; Solomos, 1988), β) στην εξερεύνηση μεταλλάξεων που είχαν σαν αποτέλεσμα τη μειωμένη ή μηδενική παραγωγή του αιθυλενίου και γ) στην παραγωγή διαγονιδιακών φυτών με τροποποιημένη ικανότητα παραγωγής του αιθυλενίου (Kanellis et al., 1997; Pech et al., 2002) δείχνουν ότι το κύριο χαρακτηριστικό των κλιμακτηρικών ειδών είναι η ικανότητα τους να παράγουν αιθυλένιο, το οποίο στη συνέχεια προκαλεί, συντονίζει και ολοκληρώνει την ωρίμανση σε βραχύ χρονικό διάστημα (Giovannoni, 2001; Pech et al., 2002). Στην κατηγορία αυτή υπάγονται η τομάτα, το πεπόνι, το μήλο, το αχλάδι, η μπανάνα, το αβοκάντο κ.α (Biale and Young, 1981). Αντίθετα, οι μη-κλιμακτηρικοί καρποί, όπως είναι τα εσπεριδοειδή, η φράουλα, το σταφύλι, το αγγούρι κ.α, χαρακτηρίζονται από βραδεία ωρίμανση λόγω μη παραγωγής αιθυλενίου και κλιμακτηρικής αύξησης της αναπνοής (Biale and Young, 1981; Tucker and Grierson, 1987). Θα πρέπει να τονιστεί ότι πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι αναπτυξιακοί μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι προηγούνται της βιοσύνθεσης του αιθυλενίου πρέπει να παίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και πραγματοποίηση της ωρίμανσης τόσο στους κλιμακτηρικούς όσο και στους μη-κλιμακτηρικούς καρπούς (Giovannoni, 2001; Vrebalov et al., 2002). Η ωρίμανση του καρπού της τομάτας περιλαμβάνει σημαντικές αλλαγές τόσο στην εμφάνιση όσο και στη σύστασή του. Οι αλλαγές αυτές διακρίνονται σε φυσικές και μεταβολικές. Με τον όρο "φυσικές" εννοούμε τις αλλαγές που παρατηρούνται στο χρώμα (αποδόμηση χλωροφύλλης, αύξηση καροτενοειδών), στην υφή (αλλαγή στη σύσταση των κυτταρικών τοιχωμάτων, μαλάκωμα καρπών, διαλυτοποίηση πηκτινών και 6

7 κυτταρίνης), στη γεύση (αύξηση σακχάρων, αυξο-μείωση οξέων) και στο άρωμα (βιοσύνθεση πτητικών ενώσεων που προσδίδουν άρωμα, όπως διάφορες αλκοόλες, αλδεΰδες και εστέρες). Από την άλλη πλευρά, στην κατηγορία των μεταβολικών αλλαγών υπάγονται οι φυσιολογικές λειτουργίες όπως η αύξηση της αναπνοής, η παραγωγή του αιθυλενίου κ.λ.π., οι βιοχημικές διεργασίες όπως ο μεταβολισμός υδατανθράκων (αμύλου, σακχάρων κ.λ.π.) και οργανικών οξέων και γενικά οι αλλαγές στον έλεγχο, ως προς την κατεύθυνση και τη λειτουργία των βιοχημικών μονοπατιών. Τέλος, παρατηρούνται αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που συγκεκριμενοποιούνται με την εξαφάνιση ορισμένων αγγελιοφόρων RNA (mrna) και πρωτεϊνών και την εμφάνιση νέων, χαρακτηριστικών της ωρίμανσης, mrna, τα οποία κωδικοποιούν τη σύνθεση νέων ενζύμων που καταλύουν τις διεργασίες της ωρίμανσης (Κανελλής και Γερασόπουλος, 2003). Ορισμένες από τις σημαντικότερες αλλαγές που λαμβάνουν χώρα κατά την ωρίμανση του καρπού της τομάτας συνοψίζονται στον πίνακα 1. Πολλές από αυτές μπορούν να συμβούν και όταν ο ώριμος πράσινος καρπός αποκόπτεται από το φυτό και ωριμάζει μετασυλλεκτικά. Αυτό συνεπάγεται ότι ορισμένες διαδικασίες της ωρίμανσης εξαρτώνται από το μεταβολισμό των συστατικών που προϋπάρχουν στον καρπό. Οι διάφορες λειτουργίες της ωρίμανσης συντονίζονται και ρυθμίζονται από φυτικές ορμόνες, αλλά τροποποιούνται πιθανόν και από γενετικούς, αλλά και περιβαντολλογικούς παράγοντες (Grierson and Kader, 1986). Οι αλλαγές αυτές είναι γνωστό ότι λαμβάνουν μέρος σε διαφορετικά μέρη του κυττάρου και πως οφείλονται σε μεταβολές στη δραστηριότητα συγκεκριμένων ενζύμων ή βιοχημικών μονοπατιών (Tucker and Grierson, 1987). Πίνακας 1. Οι σημαντικότερες αλλαγές στη σύσταση καρπών τομάτας κατά την ωρίμανσή τους. Αποικοδόμηση αμύλου και παραγωγή γλυκόζης και φρουκτόζης Απώλεια χλωροφύλλης Σύνθεση χρωστικών όπως β-καροτένιο και λυκοπένιο Αύξηση διαλυτών πηκτινών ως αποτέλεσμα του μαλακώματος και της αποικοδόμησης του κυτταρικού τοιχώματος Βιοσύνθεση πτητικών ενώσεων Αύξηση της αναλογίας κιτρικού οξέος / μηλικού οξέος Αύξηση γλουταμικού οξέος Διάσπαση του τοξικού αλκαλοειδούς α-τοματίνη Πηγή: Grierson and Kader,

8 Στάδια ωρίμανσης Το χρώμα του καρπού της τομάτας αποτελεί έναν καλό δείκτη ωρίμανσης. Σύμφωνα με το Υπουργείο Γεωργίας των Η.Π.Α (USDA, 1976), τα στάδια ωρίμανσης του καρπού της τομάτας είναι έξι και συνοψίζονται στον πίνακα 2. Μετά το κόκκινο στάδιο, οι καρποί χαρακτηρίζονται ως υπερώριμοι. Πίνακας 2. Στάδια ωρίμανσης του καρπού της τομάτας σύμφωνα με το Υπουργείο Γεωργίας των Η.Π.Α. Όλα τα ποσοστά αναφέρονται τόσο στην κατανομή του χρώματος, όσο και στην έντασή του. Στάδιο ωρίμανσης Ώριμο πράσινο Έναρξη αλλαγής χρώματος Αλλαγή χρώματος Περιγραφή* Ανοιχτό με σκούρο πράσινο χρώμα στο σύνολο του καρπού, αλλά φυσιολογικά ώριμος Πρώτη εμφάνιση ρόδινου,κόκκινου ή κίτρινου χρώματος, σε ποσοστό <10% του συνόλου Ποσοστό >10% και <30% ρόδινου,κόκκινου ή κίτρινου χρώματος Ρόδινο Ελαφρά κόκκινο Ποσοστό >30% και <60% ρόδινου ή κόκκινου χρώματος Ποσοστό >60% και <90% κόκκινου χρώματος Κόκκινο Πηγή: Grierson and Kader, 1986; USDA, 1976 Ποσοστό >90% κόκκινου χρώματος Μηχανισμός της ωρίμανσης Γενετικές, μοριακές και βιοχημικές εργασίες έδειξαν ότι απαιτείται κυρίως η έκφραση ορισμένων γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων (ένζυμα) είναι οι κυριότεροι παράγοντες που προκαλούν και πραγματοποιούν την ωρίμανση (Seymour et al. 1993). Δηλαδή, η ωρίμανση είναι μια άμεση διαδικασία η οποία εμπεριέχει συνθετικά και καταβολικά φαινόμενα. Τέτοια καταβολικά φαινόμενα μπορούν να αναφερθούν 1) η αποδόμηση των συστατικών των χλωροπλαστών και η αντικατάσταση τους με άλλα ούτως ώστε να σχηματιστούν οι χρωμοπλάστες και 2) η μερική διαλυτοποίηση των πηκτινών των μεσοκυτταρίων χώρων. Σε αντιδιαστολή, όμως, η πλασματική μεμβράνη παραμένει ακέραιη και λειτουργική, ενώ η μιτοχονδριακή δραστηριότητα (αναπνοή) είναι ενεργός μέχρι τα τελευταία στάδια της ωρίμανσης και του γηρασμού των ιστών του καρπού (Solomos, 1988). Συνεπώς, το φαινόμενο της ωρίμανσης είναι ένα σύνολο διεργασιών που απαιτεί μεταβολικό έλεγχο, επικοινωνία μεταξύ κυτταρικών οργανιδίων, ορμονική 8

9 δράση, καταβολισμό, και τέλος, αναπτυξιακή ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Θα πρέπει ωστόσο να τονισθεί ο κεντρικός ρόλος του αιθυλενίου, της ορμόνης της ωρίμανσης, στην έναρξη, το συντονισμό και τη χρονική εξέλιξη της ωρίμανσης. Αρχικά, βιοχημικές ερευνητικές εργασίες στις οποίες είχαν χρησιμοποιηθεί παρεμποδιστές της σύνθεσης (Yang and Hoffman, 1984) και δράσης του αιθυλενίου (Brady, 1987), είχαν προτείνει τον καταλυτικό ρόλο του αιθυλενίου στο φαινόμενο της ωρίμανσης. Ωστόσο, ακλόνητη απόδειξη του ρόλου αυτού του αιθυλενίου προήλθε από γενετικές, μοριακές και βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις (Ciardi and Klee, 2001; Giovannoni, 2001; Kanellis et al., 1997, 1999; Pech et al., 2002). Σε ότι αφορά στην τομάτα, που ανήκει στους κλιμακτηρικούς καρπούς, η αύξηση της παραγωγής του αιθυλενίου είναι απαραίτητη για την κανονική ωρίμανση του καρπού, όπως φαίνεται από πειράματα επιβράδυνσης ή παρεμπόδισης της ωρίμανσης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά με καταστολή της παραγωγής αιθυλενίου (Oeller et al., 1991; Theologis et al., 1993; Picton et al., 1993). Επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι το αιθυλένιο επηρεάζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων που σχετίζονται με την ωρίμανση (Gray et al., 1994; Giovannoni, 2001). Ωστόσο, παρόλο που το αιθυλένιο αποτελεί το κυρίαρχο ερέθισμα για την ωρίμανση στους κλιμακτηρικούς καρπούς, έχει προταθεί και η άποψη ότι τόσο τα μονοπάτια που ρυθμίζονται από γονίδια που εξαρτώνται από το αιθυλένιο, όσο και αυτά που δεν εξαρτώνται από αυτό, συνυπάρχουν και συνεργάζονται στη διαδικασία της ωρίμανσης τόσο στους κλιμακτηρικούς όσο και στους μη κλιμακτηρικούς καρπούς (Lelievre et al., 1997). Όσον αφορά τη βιοσύνθεση του αιθυλενίου, γενετικά τροποποιημένα φυτά τομάτας στα οποία παρεμποδιζόταν η γονιδιακή έκφραση και, συνεπώς, η βιοσύνθεση των δύο κυριοτέρων ενζύμων που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση του έδειξαν τον κεντρικό ρόλο του αιθυλενίου στην ωρίμανση in vivo (Theologis, 1992). Αυτά τα ένζυμα είναι η συνθάση του 1-αμινο-κυκλοπροπάνιο-1-καρβοξυλικού οξέος (ΑCC) (Oeller et al., 1991) και η οξειδάση του ACC (Hamilton et al., 1990, 1991). Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά παρήγαγαν καρπούς οι οποίοι δεν ωρίμαζαν ή ωρίμαζαν πολύ αργά (Τheologis, 1992; Hobson and Grierson, 1993). Έκθεση των καρπών αυτών σε ατμόσφαιρα αιθυλενίου είχε σαν αποτέλεσμα την κανονική ωρίμανση. Άρα, οι καρποί αυτοί είχαν χάσει την ικανότητα να βιοσυνθέτουν αιθυλένιο και συνεπώς την αυτο-ωρίμανση τους, ωστόσο διατηρούσαν ανέπαφους τους μηχανισμούς αφενός της αίσθησης του αιθυλενίου και αφετέρου των διεργασιών της ωρίμανσης. Πρόδρομος ουσία του αιθυλενίου αποτελεί το αμινοξύ μεθειονίνη, από το οποίο 9

10 παράγεται το 1-αμινο-κυκλοπροπάνιο-1-καρβοξυλικό οξύ (ACC) δια μέσου της S- αδενοσύλ-μεθειονίνης (SAM). Η φύση των διεργασιών που προκαλούν την αρχική σύνθεση του αιθυλενίου είναι άγνωστη. Πιστεύεται ότι είναι κάτω από τον έλεγχο αναπτυξιακών μεταγραφικών παραγόντων (Giοvannoni 2001, Vrebalov et al., 2002). Ακολουθεί η σύνθεση ή/και η ενεργοποίηση των υποδοχέων του αιθυλενίου και συνεπώς η μεταβίβαση του σήματος στον πυρήνα. Η αίσθηση της παρουσίας αιθυλενίου από τον ιστό προκαλεί αλυσιδωτές αντιδράσεις σε μοριακό και βιοχημικό επίπεδο. Έτσι, παρατηρείται παύση της έκφρασης μερικών γονιδίων (μετατροπή χλωροπλαστών σε χρωμοπλάστες), ενεργοποίηση βιοχημικών μονοπατιών (π.χ. αύξηση αναπνοής) και επαγωγή νέων γονιδίων τα προϊόντα των οποίων προκαλούν αυξημένη σύνθεση αιθυλενίου (αυτοκαταλυτική σύνθεση αιθυλενίου), διαλυτοποίηση κυτταρικών τοιχωμάτων (αλλαγή υφής) και βιοσύνθεση νέων χρωστικών και πτητικών ενώσεων. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι το αιθυλένιο δεν προκαλεί όλες τις αλλαγές που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης, όπως π.χ. η αύξηση των σακχάρων και η μείωση των οργανικών οξέων στην τομάτα (Hobson and Grierson, 1993). Ωστόσο, όπως τονίστηκε παραπάνω, οι αλλαγές που δεν ελέγχονται από το αιθυλένιο στους κλιμακτηρικούς καρπούς, αλλά και η διαδικασία της ωρίμανσης στους μη-κλιμακτηρικούς καρπούς φαίνεται να είναι υπό τον έλεγχο αναπτυξιακών μεταγραφικών παραγόντων (Giovannoni, 2001; Vrebalov et al., 2002). Στους κλιμακτηρικούς καρπούς, όπως η τομάτα, έχουν προταθεί δυο συστήματα ρύθμισης του αιθυλενίου. Το πρώτο σύστημα λειτουργεί κατά τη διάρκεια της κανονικής βλαστικής ανάπτυξης, όπου η παραγωγή του αιθυλενίου αυτοπαρεμποδίζεται και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή κανονικών επιπέδων αιθυλενίου που εντοπίζονται σε όλους τους ιστούς, περιλαμβανομένων και αυτών των μη κλιμακτηρικών καρπών. Το δεύτερο σύστημα λειτουργεί κατά την ωρίμανση των κλιμακτηρικών καρπών, αλλά και κατά το γηρασμό των πετάλων, όταν η παραγωγή του αιθυλενίου είναι αυτοκαταλυτική. Η ωρίμανση συνήθως ξεκινά από μια περιοχή του καρπού, εξαπλώνεται στις γειτονικές περιοχές καθώς το αιθυλένιο διαχέεται ελεύθερα από κύτταρο σε κύτταρο κι έτσι ολοκληρώνεται η διαδικασία της ωρίμανσης σε ολόκληρο τον καρπό (Alexander and Grierson, 2002). Αλλαγές που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης Όσο η ωρίμανση προχωρά, το χρώμα του καρπού μετατρέπεται από πράσινο σε 10

11 κόκκινο με τη μετατροπή των χλωροπλαστών σε χρωμοπλάστες, η χλωροφύλλη αποικοδομείται και συσσωρεύονται καροτενοειδή. Το μαλάκωμα των καρπών και οι αλλαγές στην υφή οφείλονται στο γεγονός ότι τα κυτταρικά τοιχώματα των καρπών τροποποιούνται και μερικώς αποσυναρμολογούνται από διάφορα ένζυμα, ενώ το άρωμα και η γεύση των ώριμων καρπών αναπτύσσεται καθώς η συγκέντρωση των πτητικών ενώσεων αυξάνεται και η αναλογία σακχάρων-οξέων μεταβάλλεται. Έχουν εντοπιστεί πολλά συστατικά βιοσυνθετικών μονοπατιών που εμπλέκονται στο σχηματισμό του χρώματος, τον μεταβολισμό των κυτταρικών τοιχωμάτων, τον μεταβολισμό των υδατανθράκων και τη βιοσύνθεση του αιθυλενίου δια μέσω της αλλαγής της έκφρασής τους σε γενετικά τροποποιημένα φυτά (Gray et al., 1994; Giovannoni, 2001). Αλλαγές στο χρώμα Οι κυρίαρχες χρωστικές των πράσινων καρπών είναι ένα μίγμα χλωροφύλλης α και b (Edwards and Reuter, 1967). Η ολική χλωροφύλλη σε αυτό το στάδιο ωρίμανσης είναι περίπου 13 μg/g νωπού βάρους και ο λόγος χλωροφύλλης α/b είναι μεγαλύτερος από τη μονάδα (Watada et al., 1976). Τα καροτενοειδή υπάρχουν σε μικρές ποσότητες. Στο ανώριμο πράσινο στάδιο το χρώμα των καρπών συνίστανται κυρίως από ξανθοφύλλες, αλλά το ποσοστό αυτών μειώνεται όσο προχωρά η ωρίμανση (Rabinowitch et al., 1975), ενώ υπάρχουν και μικρές ποσότητες α- και β- καροτενίου (Meredith and Purcell, 1966). Ο χαρακτηριστικός χρωματισμός που αποκτούν οι ώριμοι κόκκινοι καρποί οφείλεται στο λυκοπένιο, το κυρίαρχο καροτενοειδές που υπάρχει στην τομάτα, αλλά και στο β- καροτένιο, το οποίο σχετίζεται με την αλλαγή του χρώματος από πράσινο σε κόκκινο, καθώς οι χλωροπλάστες μετατρέπονται σε χρωμοπλάστες. Κατά την ωρίμανση του καρπού, το α- και β-καροτένιο βρίσκονται στη υψηλότερη συγκέντρωση κατά το στάδιο της έναρξης αλλαγής χρώματος και κατά το ελαφρά κόκκινο στάδιο (Meredith and Purcell, 1966). Το πορτοκαλί χρώμα ενός ημιώριμου καρπού αποδίδεται στην αύξηση της περιεκτικότητας σε β-καροτένιο, ενώ το κόκκινο χρώμα ενός ώριμου καρπού οφείλεται στην επακόλουθη ραγδαία συσσώρευση λυκοπενίου, του οποίου η περιεκτικότητα φθάνει στο μg/g νωπού βάρους, ανάλογα με την ποικιλία και υπολογίζεται ότι αποτελεί το 50-76% των ολικών χρωστικών (Davies and Hobson, 1981). Το λυκοπένιο αρχίζει να συσσωρεύεται στο στάδιο της έναρξης αλλαγής του χρώματος και η συγκέντρωσή του αυξάνεται σταδιακά κατά την ωρίμανση του καρπού της τομάτας (Fraser et al., 1994). Άλλες χρωστικές που 11

12 συσσωρεύονται στον ώριμο καρπό είναι το ζ- και γ- καροτένιο, καθώς επίσης και οι άχρωμες πρόδρομες ουσίες τους φυτοένη και φυτοφλουένη (Goodwin, 1980). Βρέθηκαν πολυάριθμες άλλες δευτερεύουσες χρωστικές, οι οποίες ωστόσο δε συνεισφέρουν σημαντικά στο τελικό χρώμα. Το λυκοπένιο αποτελεί ενδιάμεσο προϊόν της βιοσύνθεσης του β-καροτενίου. Η διαπίστωση ότι η σύνθεση του λυκοπενίου, αλλά όχι του β-καροτενίου, παρεμποδίζεται σε θερμοκρασίες o C, ενισχύει τη θεωρεία ύπαρξης δύο ενζυμικών συστημάτων για την παραγωγή των δυο αυτών ουσιών (Goodwin and Jamikorn, 1952). Έχει προταθεί η άποψη ότι σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 35 o C επάγεται η μετατροπή του λυκοπενίου σε β-καροτένιο (Dumas et al., 2003). Παρατηρείται μεγάλη ποικιλομορφία ως προς το χρώμα, αλλά και την ομοιομορφία του ανάμεσα στις διάφορες ποικιλίες και αυτές οι παραλλαγές υπόκεινται στο γενετικό έλεγχο. Η διασαφήνιση του μονοπατιού βιοσύνθεσης των καροτενοειδών έδωσε τη δυνατότητα στους ερευνητές να ρυθμίσουν τη δράση ορισμένων γονιδίων και να δημιουργήσουν τροποποιημένα φυτά που παράγουν καρπούς με μοναδικό χρώμα και ασυνήθιστη περιεκτικότητα σε καροτενοειδή. Αλλαγές στη Γεύση και το Άρωμα Η γεύση και το άρωμα των νωπών οπωροκηπευτικών εξαρτώνται από την πολύπλοκη αλληλοεπίδραση σακχάρων, οργανικών οξέων και αρωματικών πτητικών ουσιών (Tucker, 1993). Τα σάκχαρα και τα οργανικά οξέα των καρπών είναι προϊόντα της φωτοσυνθετικής λειτουργίας των φύλλων. Σε σχέση με άλλες ουσίες των καρπών, αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό της ξηρής ουσίας της τομάτας (Siomos et al., 2005). Τα σάκχαρα στην τομάτα είναι κυρίως τα αναγωγικά (φρουκτόζη και γλυκόζη) και ίχνη σακχαρόζης (μη αναγωγικό) (Islam et al., 1996), ενώ τα κυριότερα οργανικά οξέα είναι το κιτρικό και το μηλικό (το κιτρικό υπάρχει σε μεγαλύτερη συγκέντρωση) (Stevens, 1972; Islam et al., 1996). Έχει διαπιστωθεί ότι η περιεκτικότητα των καρπών τομάτας σε αναγωγικά σάκχαρα σχετίζεται θετικά με την περιεκτικότητα σε στερεά διαλυτά συστατικά (Kader et al., 1977; Stevens et al., 1977; Malundo et al., 1995), ενώ η περιεκτικότητα σε οργανικά οξέα με την ογκομετρούμενη οξύτητα (Malundo et al., 1995). Στην τομάτα, το σύνολο των υδατανθράκων συσσωρεύεται πριν την ωρίμανση και αποθηκεύονται υπό τη μορφή σακχάρων. Οι καρποί της δύνανται να συγκομισθούν πριν 12

13 την ωρίμανση και να ωριμάσουν μετασυλλεκτικά ( off-the-vine ) αποκτώντας ικανοποιητική γεύση και άρωμα (Κανελλής και Γερασόπουλος, 2003). Γενικά, τα επίπεδα των οξέων μειώνονται (πιθανώς χρησιμοποιούνται σαν υποστρώματα αναπνοής), ενώ των σακχάρων αυξάνονται κατά την ωρίμανση. Έχει παρατηρηθεί ότι η συγκέντρωση του κιτρικού οξέος αυξάνει έως το ώριμο πράσινο στάδιο και παραμένει σταθερή κατά την ωρίμανση, ενώ η συγκέντρωση του μηλικού οξέος μειώνεται. Συνεπώς, η αναλογία μηλικού οξέος / κιτρικό οξύ μειώνεται από 1,3 στο 0,6 στο σύνολο του καρπού κατά την ωρίμανση και ποσοστό >50% της ολικής οξύτητας του ώριμου καρπού αποδίδεται στο κιτρικό οξύ (Davies and Hobson, 1981). Υπάρχουν ωστόσο ποικιλίες οι οποίες διαφέρουν ως προς την αναλογία των δυο αυτών οξέων (Davies, 1965). Το άρωμα της τομάτας εξαρτάται από τη σύνθεση και παρουσία χαρακτηριστικών πτητικών ενώσεων κατά την ωρίμανση. Αν και αρκετές από τις ουσίες αυτές είναι πολύπλοκες, εν τούτοις, το χαρακτηριστικό άρωμα οφείλεται κύρια σε απλά οργανικά μόρια, η συγκέντρωση των οποίων δεν υπερβαίνει το επίπεδο των ppm. Προηγούμενες έρευνες έχουν δείξει ότι οι διαφορές στο άρωμα μεταξύ διαφορετικών ποικιλιών τομάτας οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, στις παραλλαγές στην παραγωγή πτητικών ουσιών (Brauss et al., 1998). Στη τομάτα έχουν εντοπιστεί περισσότερες από 400 τέτοιες ενώσεις (Hobson and Grierson, 1993), οι κυριότερες των οποίων είναι η cis-3-εξανάλη, η cis-3- εξανόλη και η 3-μεθυλ-βουτανάλη (Carrari et al., 2006). Αλλαγές στην υφή Το μαλάκωμα του καρπού της τομάτας οφείλεται κυρίως στην αποδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων (Tucker, 1993). Συστατικά των κυτταρικών τοιχωµάτων είναι υδατάνθρακες (90-95%), αντιπρόσωποι των οποίων είναι η κυτταρίνη, ηµι-κυτταρίνες και πηκτίνες (Tucker and Grierson, 1987). Το υπόλοιπο 5-10% αποτελείται από δοµικές πρωτεΐνες πλούσιες σε υδροξυ-προλίνη (Tucker, 1993). Με τη βοήθεια του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, οι Crookes και Grierson (1983) παρατήρησαν τις αλλαγές στη δομή των κυτταρικών τοιχωμάτων σε καρπούς τομάτας. Οι αλλαγές αυτές επικεντρώνονται στον πλούσιο σε πηκτίνες µεσοκυττάριο χώρο. Επιπλέον, οι αλλαγές αυτές στις πηκτίνες έχουν παρατηρηθεί και σε βιοχηµικό επίπεδο. Στα πλαίσια αυτά ανιχνεύθηκε µείωση των ουδέτερων σακχάρων (γαλακτόζης και αραβινόζης κλπ), αύξηση στη διαλυτότητα και µείωση του πολυµερισµού των όξινων 13

14 πολυπηκτινών (ραµνογαλακτουρονών) και µείωση του βαθµού εστεροποίησης τους (Tucker and Grierson, 1987). Πιστεύεται ότι οι αλλαγές αυτές στα κυτταρικά τοιχώµατα και εποµένως στην υφή των καρπών προκαλούνται από τη δράση υδρολυτικών ενζύµων. Από τα ένζυµα αυτά, η πηκτινομεθυλεστεράση (ΡΜΕ), η πολυγαλακτουρονάση (PG), η κυτταρινάση (γλουκανάση) και οι β-γαλακτοσιδάσες έχουν µελετηθεί περισσότερο (Tucker, 1993). Έχει διαπιστωθεί ότι η κατά την ωρίμανση του καρπού της τομάτας, αυξάνεται τόσο η PME, όσο και η PG (Hobson and Grierson, 1993). Επίσης, έχει ανιχνευθεί και αύξηση των ενδο-(1>4)β-d-γλουκανασών (Fischer and Bennett, 1991). Τελευταία, οι εξπανσίνες, πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώµατος, οι οποίες απαντώνται σε µεγάλο αριθµό ιστών και αναπτυξιακών σταδίων που διέρχονται ταχείες αλλαγές σε σχήµα και µέγεθος (Cosgrove, 2000), φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στις αλλαγές στην υφή των κυτταρικών τοιχωµάτων των νωπών καρπών (Giovannoni, 2001). Παρά τη συσσώρευση σηµαντικής πληροφόρησης τα τελευταία χρόνια σχετικά µε τη ρύθµιση της σύνθεσης των παραπάνω ενζύµων σε βιοχηµικό και µοριακό επίπεδο (Fischer and Bennett, 1991; Grierson and Schuch, 1993; Brummel and Harpster, 2001), εν τούτοις ο µηχανισµός της αλλαγής της υφής (µαλάκωµα καρπών) κατά την ωρίµανση δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Ενώ, για παράδειγμα, πριν µερικά χρόνια πιστεύονταν ότι η PG ήταν το κύριο ένζυµο υπεύθυνο για το µαλάκωµα της τοµάτας (Tucker and Grierson, 1987), νεότερες µελέτες έδειξαν ότι το µαλάκωµα εξελισσόταν κανονικά σε καρπούς τοµάτας που προέρχονταν από γενετικά µεταλλαγμένα φυτά τοµάτας, στα οποία η σύνθεση της PG παρεµποδίζονταν κατά 99% κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης (Smith et al., 1988, 1990). Συνεπώς, η PG δεν είναι ο πρωταρχικός παράγοντας που προκαλεί την αλλαγή της υφής σε µερικά είδη οπωροκηπευτικών, αλλά µάλλον είναι µέρος ενός πολύπλοκου µηχανισµού όπου η δράση των διαφόρων υδρολυτικών ενζύµων, σε συνδυασµό µε τις παρατηρούµενες φυσικοχηµικές αλλαγές των κυτταρικών τοιχωµάτων και της παρουσίας ή µη διαφόρων ιόντων και κατιόντων, όπως Ca 2+ προκαλούν το επιθυµητό αποτέλεσµα. Νέα δεδοµένα σε διαγονιδιακά φυτά τοµάτας, στις οποίες η ενζυµατική δραστηριότητα των εξπανσινών τροποποιήθηκε µε γενετική µηχανική, υποστηρίζουν ότι οι πρωτεΐνες αυτές µπορεί να παίζουν σηµαντικό ρόλο στη μείωση της συνεκτικότητας των καρπών κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης (Civello et al., 1999, Rose et al., 1997). Η εφαρµογή των τεχνικών της µοριακής βιολογίας σε συνδυασµό µε την πλήρη εξερεύνηση της δοµής των κυτταρικών τοιχωµάτων των 14

15 νωπών καρπών πιστεύεται ότι θα οδηγήσει σύντοµα στην κατανόηση του µηχανισµού της αλλαγής της υφής των καρπών κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης. Η κατανόηση αυτή σε βιοχηµικό, µοριακό και δοµικό επίπεδο θα οδηγήσει προφανώς και στον έλεγχο του µαλακώµατος κατά τη διάρκεια της µετασυλλεκτικής ζωής των οπωροκηπευτικών και θα έχει σαν αποτέλεσµα αφενός τη βελτίωση της ποιότητας και αφετέρου τη µείωση των απωλειών µεταξύ συγκοµιδής και κατανάλωσης. Αντιοξειδωτικά Τα τελευταία χρόνια έχει διαπιστωθεί ότι η κατανάλωση λαχανικών έχει ευεργετική δράση στην πρόληψη ορισμένων χρόνιων ασθενειών, όπως είναι μερικές μορφές καρκίνου (Giovannucci, 1999). Η ευεργετική αυτή δράση έχει αποδοθεί στα αντιοξειδωτικά που περιέχονται στα λαχανικά (Block et al., 1992). Ως αντιοξειδωτικό ορίζεται χημικά κάθε ουσία που όταν βρίσκεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε σχέση με το υπόστρωμα το οποίο πρόκειται να οξειδωθεί, καθυστερεί σημαντικά ή εμποδίζει την οξείδωση του υποστρώματος (Klein and Kurillich, 2000). Επίσης, ως αντιοξειδωτικό ορίζεται κάθε ουσία των τροφών που μειώνει την αρνητική επίδραση των ενεργών μορφών οξυγόνου, των ενεργών μορφών αζώτου ή και των δυο μορφών, στη φυσιολογική λειτουργία του ανθρώπινου οργανισμού (Food and Nutrition Board of the National Academy of Science, 1998). Οι άνθρωποι που καταναλώνουν μεγάλες ποσότητες λαχανικών έχουν κατά 50% μικρότερη πιθανότητα να εμφανίσουν καρκίνο, αλλά και χαμηλότερη θνησιμότητα από αυτόν (Steinmetz and Potter, 1991). Οι καρκίνοι που έχουν συσχετισθεί με τα αντιοξειδωτικά είναι ο καρκίνος των πνευμόνων, του οισοφάγου, του στομάχου, του παγκρέατος, του εντέρου, του αυχένα (Vegetarian Nutrition, 2001) και του μαστού (Trichopoulou et al., 1995). Η συσχέτιση συγκεκριμένων ασθενειών με τα επιμέρους αντιοξειδωτικά είναι αρκετά δύσκολη. Έτσι, γίνονται συστάσεις για αύξηση της ημερήσιας κατανάλωσης λαχανικών, και όχι των επιμέρους αντιοξειδωτικών, ως συμπληρώματα διατροφής, εξαιτίας της πιθανής συνεργιστικής δράσης μεταξύ των βιταμινών, των ανόργανων στοιχείων και άλλων ουσιών με αντιοξειδωτική δράση (Klein and Kurillich, 2000). Ο Οργανισμός για την Ανθρώπινη Υγεία (World Health Organization) συνιστά τη κατανάλωση τουλάχιστον 400 g φρούτων και λαχανικών την ημέρα για καλή υγεία (Diet, nutrition and the prevention of chronic diseases, 1991). 15

16 Έχει αναγνωρισθεί ότι διάφορα φρούτα και λαχανικά παρέχουν προστασία από τον καρκίνο σε συγκεκριμένα όργανα. Ειδικότερα, η κατανάλωση τομάτας φαίνεται ότι προστατεύει από το καρκίνο του προστάτη, λόγω της αυξημένης περιεκτικότητας σε λυκοπένιο (Giovannucci et al., 1995). Ασκορβικό οξύ Το ασκορβικό οξύ ή αλλιώς βιταμίνη C αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα θρεπτικά στοιχεία στην ανθρώπινη διατροφή. Επιδεικνύει προστατευτικό ρόλο ενάντια σε διάφορες χρόνιες ασθένειες, όπως στα καρδιαγγειακά νοσήματα, στον καρκίνο και στην καταρακτογένεση (Halliwell, 1996), αν και άμεση σχέση μεταξύ του ασκορβικού οξέος και των ασθενειών αυτών δεν έχει ακόμα αποδειχθεί (Naidu, 2003). Σύμφωνα με το U.S. Food and Nutrition Board (2000) η ημερήσια συνιστώμενη χορήγηση (Recommended Daily Allowance) βιταμίνης C είναι mg για τους άντρες και 75 mg για τις γυναίκες με βάση την πιθανότητα πρόληψης από χρόνιες ασθένειες. Σύμφωνα με τους πίνακες σύστασης τροφίμων της Νέας Ζηλανδίας (New Zealand Food Composition Tables), η περιεκτικότητα σε ασκορβικό οξύ της τομάτας είναι 23,7 mg/100 g νωπού βάρους (Burlingame et al., 1993), ενώ σύμφωνα με το USDA (United States Department of Agriculture data base), 20 mg/100 g νωπού βάρους (USDA, 2001). Ωστόσο, υπάρχουν αναφορές για υψηλότερη περιεκτικότητα σε ασκορβικό οξύ (Oliver, 1976; 25 mg/100 g νωπού βάρους), καθώς και για χαμηλότερη (Davey et al., 2000; 16 mg/100 g νωπού βάρους; Abushita et al., 2000; mg/100 g νωπού βάρους). Το ασκορβικό οξύ αποτελεί ένα υδατοδιαλυτό αντιοξειδωτικό. Δομικά, είναι μια από τις απλούστερες βιταμίνες και σχετίζεται με τα C 6 σάκχαρα (Davey et al., 2000). Υπάρχει σε δυο μορφές: L-ασκορβικό οξύ (ΑΑ) και L-διυδροασκορβικό οξύ (DHA). Το ΑΑ είναι η κυρίαρχη βιολογικά ενεργή μορφή, όμως το DHA, που αποτελεί προϊόν οξείδωσης του ΑΑ, επιδεικνύει επίσης βιολογική δράση. Το ΑΑ οξειδώνεται εύκολα, ειδικά σε υδατικά διαλύματα, ενώ ευνοείται και από τη παρουσία οξυγόνου, βαρέων μετάλλων (κυρίως Cu 2+, Ag + και Fe 3+ ), αλκαλικού ph και υψηλών θερμοκρασιών. Επειδή το DHA μετατρέπεται εύκολα σε ΑΑ μέσα στο ανθρώπινο σώμα, είναι σημαντικό να μετριούνται και οι δυο μορφές για τον προσδιορισμό της βιταμίνης C (Lee and Kader, 2000). Η αντιοξειδωτική ικανότητα του ασκορβικού οξέος οφείλεται στην ευκολία απώλειας ηλεκτρονίων (Klein and Kurillich, 2000). Οι κυριότεροι τύποι βιολογικής δράσης που επιδεικνύει το ασκορβικό οξύ στα φυτά 16

17 είναι οι ακόλουθοι: ως ενζυμικός συμπαράγοντας, παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία από το φως, την αντίδραση σε τραυματισμό και προσβολή από παθογόνα, ως εκκαθαριστής ενεργών ριζών, αποτελεί ένα πολύ σημαντικό αντιοξειδωτικό στην αποτοξίνωση από ενεργές μορφές οξυγόνου, ενώ ως ο ρόλος του ως δότης / δέκτης ηλεκτρονίων είναι πολύ σημαντικός κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων, είτε στην πλασματική μεμβράνη, είτε στους χλωροπλάστες (Davey et al., 2000). Επιπρόσθετα στα φυτά, το ανηγμένο ασκορβικό οξύ αποτελεί υπόστρωμα για τη βιοσύνθεση οξαλικού και τρυγικού οξέος, τουλάχιστον σε ορισμένα είδη (Diplock et al., 1998; Foyer et al., 1991). Το στάδιο ωρίμανσης στο οποίο συγκομίζονται τα λαχανικά είναι ένας από του κυριότερους παράγοντες που καθορίζουν την περιεκτικότητα σε ασκορβικό οξύ (Dumas et al., 2003). Καρποί τομάτας που συγκομίστηκαν στο πράσινο στάδιο και ωρίμασαν στους 20 ο C είχαν λιγότερο ασκορβικό οξύ, σε σχέση με καρπούς που συγκομίστηκαν στο ώριμο στάδιο (Kader et al., 1977). Γενικά, οι καρποί συσσωρεύουν βιταμίνη C κατά την ωρίμανση πάνω στο φυτό ή και αφού συγκομισθούν, όμως η αύξηση είναι μεγαλύτερη στους καρπούς που ωριμάζουν πάνω στο φυτό (Lee and Kader, 2000). Στην τομάτα, έχει αναφερθεί ότι η περιεκτικότητα σε ασκορβικό οξύ φθάνει στο μέγιστο κατά το ελαφρά κόκκινο στάδιο, πριν αναπτυχθεί πλήρως το κόκκινο χρώμα (Lee and Kader, 2000; Yahia et al., 2001), ενώ υπάρχουν και αναφορές ότι συνεχίζει να αυξάνει ελαφρά και κατά την υπερωρίμανση (Hammer et al., 1945). Η μείωση που έχει παρατηρηθεί μετά το ελαφρά κόκκινο στάδιο πιθανόν οφείλεται στις αντιοξειδωτικές ικανότητες του ασκορβικού οξέος, αφού τα κύτταρα απορροφούν μεγάλες ποσότητες οξυγόνου καθώς ο ρυθμός κυτταρικής αναπνοής αυξάνει (Abushita et al., 1997). Αν και η περιεκτικότητα των καρπών τομάτας σε ασκορβικό οξύ δεν είναι τόσο υψηλή σε σχέση με αυτή άλλων φρούτων και λαχανικών, εντούτοις η συνεισφορά της τομάτας στην ανθρώπινη διατροφή είναι πολύ σημαντική, εξαιτίας της μεγάλης κατανάλωσής της (Klein and Perry, 1982). Αξίζει τέλος να σημειωθεί ότι ο φλοιός του καρπού της τομάτας συγκεντρώνει τα υψηλότερα επίπεδα ασκορβικού οξέος σε σχέση με τη σάρκα και τους σπόρους (George et al., 2004; Toor and Savage, 2005). Καροτενοειδή Τα καροτενοειδή είναι λιποδιαλυτές χρωστικές ουσίες που συντίθενται στα φυτά και σε μικροοργανισμούς και βρίσκονται σε πολλές τροφές, κυρίως στα λαχανικά και στα φρούτα (El-Agamey et al., 2004). Στη φύση έχουν αναγνωριστεί περισσότερα από

18 καροτενοειδή, από τα οποία μόνο τα 50 έχουν δράση προβιταμίνης Α (Boileau et al., 1999). Τα καροτενοειδή είναι τερπένια που προέρχονται από το βιοχηµικό µονοπάτι πλαστιδιακής προέλευσης που πρόσφατα ανακαλύφθηκε και έχει ως πρόδροµες ουσίες το πυροσταφυλικό οξύ και η φωσφογλυκεριναλδεύδη (PGAL) (Lichtenthaler, 1999, 2000). Το β-καροτένιο επιδεικνύει τη μεγαλύτερη δράση ως προβιταμίνη Α και ακολουθούν το α-καροτένιο και η β-κρυπτοξανθίνη (Parker, 1996). Τα σημαντικότερα για την ανθρώπινη διατροφή είναι: α- και β-καροτένιο, λυκοπένιο, λουτεΐνη και κρυπτοξανθίνη (Mangels et al., 1993). Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες των καροτενοειδών έχουν συσχετισθεί με την ιδιότητά τους να εκκαθαρίζουν ελεύθερες ρίζες (Hill et al., 1995), αλλά και με την εξαιρετική ικανότητά τους να απομακρύνουν το ελεύθερο οξυγόνο (DiMascio et al., 1989). Η αποτελεσματικότητά τους εξαρτάται άμεσα από την αλληλεπίδρασή τους με άλλα αντιοξειδωτικά, κυρίως με τις βιταμίνες E και C (Young and Lowe, 2001). Ανάμεσα στα καροτενοειδή, το λυκοπένιο φαίνεται ότι έχει τη μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα και ακολουθούν το α-καροτένιο, β-καροτένιο, λουτεΐνη και κρυπτοξανθίνη (DiMascio et al., 1989). Στην ανθρώπινη διατροφή, η τομάτα αποτελεί την κυρίαρχη πηγή λυκοπενίου (Abushita et al., 2000), το οποίο συσχετίζεται με προστασία από τον καρκίνο του προστάτη (Giovannucci et al., 1995), ενώ περιέχει επίσης σημαντικές ποσότητες β- καροτενίου και λουτεΐνης, τα οποία έχουν συσχετισθεί με την προστασία από καρκίνο των πνευμόνων (Sies, 1991). Σύμφωνα με την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Harvard, συνίσταται η κατανάλωση 1000 g προϊόντων τομάτας ανά εβδομάδα, ώστε να μειωθεί η επικινδυνότητα προσβολής από καρκίνο του προστάτη (Giovannucci et al., 1995). Εξαιτίας των ευεργετικών αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του λυκοπενίου, πολλοί ερευνητές έχουν προσπαθήσει να αυξήσουν την περιεκτικότητά του σε καρπούς τομάτας. Πρόσφατα, οι Fraser et al. (2002), χρησιμοποιώντας βιοτεχνολογικές μεθόδους, κατάφεραν να αυξήσουν κατά 1,8 και 2,2 φορές τη περιεκτικότητα καρπών τομάτας σε λυκοπένιο και β-καροτένιο, αντίστοιχα. Η επίδραση της ωρίμανσης στην περιεκτικότητα των καροτενοειδών εξαρτάται από το είδος του λαχανικού. Σε καρπούς, όπως η τομάτα και η πιπεριά, που περιέχουν μεγάλες ποσότητες καροτενοειδών, η ωρίμανση συνοδεύεται από αύξηση της βιοσύνθεσής τους (Rodriguez-Amaya, 1997). Το λυκοπένιο και οι άχρωμες πρόδρομες ενώσεις του, φυτοένη και φυτοφλουένη, αρχίζουν να συσσωρεύονται μετά το στάδιο έναρξης αλλαγής 18

19 χρώματος του καρπού της τομάτας. Στο ώριμο κόκκινο στάδιο, αποτελεί το 95% όλων των χρωστικών καροτενοειδών και το 73% των ολικών (Dumas et al., 2003). Έχει αναφερθεί ότι η σύνθεση του β-καροτενίου σταματά όταν το χρώμα του καρπού της τομάτας αλλάζει από πορτοκαλί σε κόκκινο (Koskitato and Ormrod, 1972). Έχει διαπιστωθεί ότι τα υψηλότερα επίπεδα λυκοπενίου εντοπίζονται στο φλοιό του καρπού της τομάτας, σε σχέση με τη σάρκα και τους σπόρους (Al-Wandawi et al., 1985; George et al., 2004; Toor and Savage, 2005). Φαινολικές ενώσεις Οι φαινολικές ενώσεις είναι δευτερογενείς μεταβολίτες, φέρουν στο μόριο τους έναν αρωματικό δακτύλιο και ένα ή περισσότερα ΟΗ -, παράγονται από τη φαινυλαλανίνη μέσω της μεταβολικής οδού του σικιμικού οξέος και των φαινυλπροπανοειδών και έχουν μεγάλη ποικιλία δομών και λειτουργιών. Δεν απαντώνται ελεύθερες, αλλά βρίσκονται ενωμένες με σάκχαρα, θειικές ή οξικές ρίζες (Robards et al., 1999). Οι φαινολικές ενώσεις συγκεντρώνονται κυρίως σε εξωτερικούς ιστούς (επιδερμίδα και υποεπιδερμικά στρώματα), παρά σε εσωτερικούς (μεσοκάρπιο και σάρκα) (Bengoechea et al., 1997; George et al., 2004; Toor and Savage, 2005). Ειδικότερα τα φλαβονοειδή φαίνεται ότι συγκεντρώνονται στο φλοιό της τομάτας σε ποσοστό 95-98% (Krause and Galensa, 1992). Σε μια άλλη έρευνα έχει διαπιστωθεί ότι οι σπόροι περιέχουν αξιόλογα επίπεδα φλαβονοειδών σε σχέση με τη σάρκα (Toor and Savage, 2005). Στα φυτικά είδη έχουν ανιχνευθεί περισσότερες από 8000 φαινολικές ουσίες (Luthria et al., 2006). Οι κατηγορίες των φαινολών στα φυτά είναι οι εξής: φαινολικά οξέα (ομάδες υδροξυβενζοϊκού και υδροξυκινναμικού οξέος), φλαβονοειδή (φλαβονόλες, φλαβόνες, φλαβανόνες, φλαβανόλες ή κατεχίνες, ισοφλαβόνες, φλαβανονόλες και ανθοκυάνες) και λιγνίνες (Robards et al., 1999). Τα φλαβονοειδή αποτελούν μια σημαντική κατηγορία αντιοξειδωτικών, που προστατεύουν τα φυτά από οξειδωτικές καταπονήσεις και κυρίως προλαμβάνουν τη φωτοοξείδωση των χλωροφυλλών (Merzlyak and Chivkunova, 2000). Σε μοριακό επίπεδο, έχει διαπιστωθεί ότι έχουν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα, σε σχέση με τις βιταμίνες Ε και C in vitro (Rice-Evans et al., 1996), ενώ μεταξύ τους παρουσιάζουν επίσης πολύ σημαντικές διαφορές. Έχει υπολογιστεί ότι η ημερήσια κατανάλωση φλαβονών και φλαβονολών στις 19

20 Η.Π.Α. ξεπερνά τα 100 mg (Kűhnau, 1976). Ωστόσο, σύμφωνα με μια πιο πρόσφατη έρευνα, που αφορούσε ηλικιωμένους ασθενείς από την Ολλανδία, έχει προταθεί η κατανάλωση 25 mg ημερησίως (Hertog et al., 1993). Η τομάτα αποτελεί ένα λαχανικό πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις (66-70 ισοδύναμα κατεχίνης/100g f.w.) (Κaur and Kapoor, 2002). Πολλές ποικιλίες περιέχουν υψηλά επίπεδα φλαβονολών και κυρίως κερκετίνης (Crozier et al., 1997). Ωστόσο, έχει αναφερθει ότι στις μικρόκαρπες ποικιλίες τα κυρίαρχα φλαβονοειδή είναι η χαλκοναριγκενίνη και η ρουτίνη (Davies and Hobson, 1981; Slimestad and Verheul, 2005), ενώ το κυρίαρχο φαινολικό οξύ είναι το καφεϊκό (Luthria et al., 2006). Το στάδιο ωρίμανσης επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα των φαινολών στους φυτικούς ιστούς (Parr and Bolwell, 2000; Howard et al., 2003). Στην τομάτα, οι ολικές φαινόλες τείνουν να αυξάνουν μέχρι ένα μεσαίο στάδιο ωρίμανσης και μετά μειώνονται κατά την πλήρη ωρίμανση του καρπού (Senter et al., 1988). Αλλαγές που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της υπερωρίμανσης Στη διάρκεια της υπερωρίμανσης οι σημαντικότερες μεταβολές που έχουν αναφερθεί αφορούν στο μαλάκωμα της σάρκας των καρπών, καθώς και στο χρώμα, το οποίο μετατρέπεται προοδευτικά από κόκκινο σε βαθύ κόκκινο. Επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι το λυκοπένιο αυξάνει σημαντικά κατά την υπερωρίμανση (Brandt et al., 2006). Ωστόσο, οι πληροφορίες για τη φυσιολογία της υπερωρίμανσης των καρπών πάνω στο φυτό είναι εξαιρετικά περιορισμένες. Μικρόκαρπες και μεγαλόκαρπες ποικιλίες Οι μικρόκαρπες ποικιλίες τομάτας αποτελούν έναν από του σημαντικότερους τύπους νωπής τομάτας σε διάφορες χώρες και κυρίως στην Ιταλία (25% της συνολικής κατανάλωσης νωπής τομάτας) (Raffo et al., 2002), αλλά και στην Ισπανία. Γενικά, οι μικρόκαρπες ποικιλίες τομάτας χαρακτηρίζονται από υψηλότερα επίπεδα ξηρής ουσίας και στερεών διαλυτών συστατικών, σε σχέση με τις μεγαλόκαρπες ποικιλίες. Οι διαφορές αυτές οφείλονται στην υψηλότερη περιεκτικότητα σε σάκχαρα (φρουκτόζη και γλυκόζη) και οργανικά οξέα (κιτρικό και μηλικό), τα οποία με τη σειρά τους αποτελούν τους κυριότερους παράγοντες που προσδίδουν στους καρπούς των μικρόκαρπων ποικιλιών εντονότερη γεύση και άρωμα (Stevens et al., 1977; Kader et al., 1977; Picha, 1986). 20

21 Σε προηγούμενες έρευνες έχει διαπιστωθεί ότι οι μικρόκαρπες τομάτες περιέχουν υψηλότερα επίπεδα αντιοξειδωτικών και κυρίως καροτενοειδών, φλαβονοειδών και ασκορβικού οξέος, σε σχέση με τις μεγαλόκαρπες τομάτες (Leonardi et al., 2000; George et al., 2004; Siomos et al., 2005; Slimestad and Verheul, 2005; Lenucci et al., 2006). Οι ποικιλίες μικρόκαρπης τομάτας που καλλιεργούνται στη χώρα μας είναι οι ποικιλίες Σαντορίνης, Χίου και Λήμνου και είναι άνυδρου τύπου. Καρποί της ποικιλίας Σαντορίνης χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα γλυκιά γεύση, λεπτό άρωμα και υψηλής περιεκτικότητας τοματοπολτό. Η ποικιλία αυτή είναι προσαρμοσμένη στα ηφαιστιογενή εδάφη της Θηραϊκής γης και υποστήριξε την παραδοσιακή γεωργία και το σύστημα καλλιέργειας χαμηλών εισροών (απευθείας σπορά στον αγρό, άνυδρη και χωρίς χημικά καλλιέργεια, χλωρή λίπανση με φακή κ.α.) για εκατοντάδες χρόνια. Είναι κατάλληλη τόσο για νωπή κατανάλωση, όσο και για βιομηχανική επεξεργασία (τοματοπολτός, λιαστή κ.α.). Οι καρποί της ποικιλίας της Χίου καταναλώνονται νωποί ή λιαστοί, ενώ από τους καρπούς της Λήμνου παρασκευάζεται το παραδοσιακό γλυκό κουταλιού (Traka-Maurona et al., 2005). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι καρποί των εγχώριων αυτών ποικιλιών συγκομίζονται συνήθως σε πιο προχωριμένο στάδιο ωριμότητας, σε σχέση με τις μεγαλόκαρπες καλλιεργούμενες ποικιλίες και τις περισσότερες φορές συγκομίζονται υπερώριμες. Και οι τρεις εγχώριες ποικιλίες έχουν εκτοπιστεί από τη συστηματική καλλιέργεια και κινδυνεύουν να χαθούν από γενετική διάβρωση (Stauropoulos, 1998). Σήμερα, διατηρούνται και αναπαράγονται από λίγους αγρότες στα τρία νησιά. Ο σκοπός της εργασίας Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη της φυσιολογίας της ωρίμανσης των καρπών των εγχώριων μικρόκαρπων ποικιλιών τομάτας Σαντορίνης, Χίου και Λήμνου με ίδιαίτερη έμφαση στις μεταβολές κατά την υπερωρίμανση, σε σχέση με μια τυπική μικρόκαρπη ποικιλία που καλλιεργείται διεθνώς ( Ailsa Craig ), καθώς και με μια βιομηχανική ποικιλία ( Rio Grande ). Ειδικότερα, προσδιορίσθηκαν το χρώμα, η εσωτερική συγκέντρωση αιθυλενίου και διοξειδίου του άνθρακα, η ξηρή ουσία, τα στερεά διαλυτά συστατικά, το ph, η ογκομετρούμενη οξύτητα, τα ολικά αντιοξειδωτικά, το ασκορβικό οξύ, οι ολικές διαλυτές φαινόλες, το λυκοπένιο και τα νιτρικά. 21

22 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Oι μικρόκαρπες τομάτες Σαντορίνης, Χίου, Λήμνου, Ailsa Craig και Rio Grande καλλιεργήθηκαν στο Αγρόκτημα του Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης την περίοδο Ιουλίου-Οκτωβρίου 2004, χρησιμοποιώντας συνήθεις τεχνικές καλλιέργειας. Η ποικιλία Ailsa Craig αποτελεί μια τυπική μικρόκαρπη ποικιλία τομάτας, ενώ η ποικιλία Rio Grande είναι μια βιομηχανική ποικιλία. Οι ποικιλίες αυτές χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, δεδομένο ότι καλλιεργούνται διεθνώς σε μεγάλες εκτάσεις και η πορεία της ωρίμανσής τους έχει μελετηθεί εκτενώς. Καρποί των πέντε αυτών ποικιλιών συγκομίστηκαν από 4 έως 8 Οκτωβρίου και διαχωρίστηκαν σε 8 στάδια ωρίμανσης με βάση το χρώμα (Πιν. 2) σύμφωνα με το USDA [ώριμο πράσινο, έναρξη αλλαγής χρώματος, αλλαγή χρώματος, ρόδινο, ελαφρά κόκκινο, κόκκινο, υπερώριμο-1 (1 εβδομάδα αφότου ο καρπός φθάσει στο κόκκινο στάδιο ωρίμανσης) και υπερώριμο-2 (2 εβδομάδες αφότου ο καρπός φθάσει στο κόκκινο στάδιο ωρίμανσης)]. Επιλέχθηκαν μόνο οι καρποί με ομοιόμορφο σχήμα και μέγεθος. Σε κάθε ποικιλία και στάδιο ωρίμανσης χρησιμοποιήθηκαν τρεις επαναλήψεις, με 5 καρπούς ανά επανάληψη. Αμέσως μετά τη συγκομιδή, οι καρποί πλύθηκαν, ζυγίστηκαν (Πιν. 3) και έγινε ο προσδιορισμός του χρώματος αλλά και της εσωτερικής συγκέντρωσης του αιθυλενίου και του διοξειδίου του άνθρακα. Κατόπιν διατηρήθηκαν στους -20 ο C μέχρι τον προσδιορισμό της ξηρής ουσίας, των διαλυτών στερεών συστατικών, των νιτρικών, του ph, της ογκομετρούμενης οξύτητας, των ολικών αντιοξειδωτικών, του ασκορβικού οξέος, των ολικών διαλυτών φαινολών και του λυκοπενίου. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν μετά από πολτοποίηση των κατεψυγμένων καρπών κάθε επανάληψης σε blender. Οι παραπάνω προσδιορισμοί έγιναν με τις ακόλουθες μεθόδους. Χρώμα Ο προσδιορισμός του χρώματος έγινε με χρωματόμετρο Minolta CR-200 (Minolta, Osaka, Japan), εξοπλισμένο με κεφαλή 8 mm και μέσο φωτισμού C (6774 K). Το όργανο ρυθμιζόταν με το εργοστασιακό πρότυπο λευκό χρώμα (Υ = 93,9, Χ = 0,313 και y = 0,3209 ή L* = 94,11, a* = -0,99 και b* = 0,89). Οι μετρήσεις γίνονταν σε δύο αντιδιαμετρικά σημεία στην ισημερινή περιοχή των καρπών. Από τις ενδείξεις του οργάνου L*, a*, b*, το χρώμα εκφράστηκε με τις τιμές L* (φωτεινό, σκοτεινό) και hue 22

23 angle (h o = tan -1 b*/a* και h o = 180 o + tan -1 b*/a*, όταν a*<0 και b*>0) (πράσινο, κόκκινο) (Lancaster et al., 1997). Εσωτερική συγκέντρωση αιθυλενίου και διοξειδίου του άνθρακα Μετά τον προσδιορισμό του χρώματος, δείγματα αερίων 1 ml από το εσωτερικό των καρπών πάρθηκαν μετά από εμβάπτισή τους σε νερό και τη δημιουργία κενού, σύμφωνα με τους Beyer και Morgan (1970). To διοξείδιο του άνθρακα μετρήθηκε σε αναλυτή CO 2 Combo (μοντέλο 280, David Bishop Instruments, U.K.) σύμφωνα με τους Saltveit και Strike (1989), ενώ το αιθυλένιο μετρήθηκε με αέριο χρωματογράφο Varian (μοντέλο 3300, Varian Instruments, Walnut Creek, CA) εξοπλισμένο με ανιχνευτή φλόγας. Ξηρή ουσία Η ξηρή ουσία προσδιορίστηκε μετά από ξήρανση ποσότητας 70g πολτοποιημένου δείγματος καρπών στους 70 o C, για τουλάχιστον 72 ώρες. Στερεά διαλυτά συστατικά Τα στερεά διαλυτά συστατικά προσδιορίστηκαν με ηλεκτρονικό διαθλασίμετρο Atago PR-1 (Atago Co Ltd., Tokyo, Japan) σε εκχύλισμα που προέκυψε μετά από διήθηση μικρής ποσότητας πολτοποιημένου δείγματος καρπών μέσω φίλτρου Whatman No 1. ph και ογκομετρούμενη οξύτητα Το ph και ογκομετρούμενη οξύτητα προσδιορίστηκαν σε 50 ml φιλτραρισμένου εκχυλίσματος που προέκυψε από την ανάμειξη σε blender 10g πολτοποιημένου δείγματος καρπών με 100 ml απεσταγμένο νερό. Το εκχύλισμα τιτλοδοτήθηκε με 0,01Ν NaOH μέχρι ph 8,2 και η ογκομετρούμενη οξύτητα εκφράστηκε ως % κιτρικού οξέος. 23

24 Πίνακας 3. Μέσο βάρος καρπών (g) των ποικιλιών Σαντορίνης, Χίου, Λήμνου, Ailsa Craig και Rio Grande στα 8 στάδια ωρίμανσης. Κάθε τιμή είναι μέσος όρος ± Τ.Σ τριών επαναλήψεων, με 5 καρπούς ανά επανάληψη. Ποικιλία Στάδιο ωρίμανσης Νωπό βάρος (g) Σαντορίνης Ώριμο πράσινο 40,57 ± 1,75 Έναρξη αλλαγής χρώματος 33,88 ± 2,24 Αλλαγή χρώματος 50,04 ± 1,85 Ρόδινο 50,55 ± 3,27 Ελαφρά κόκκινο 52,90 ± 4,51 Κόκκινο 55,48 ± 5,24 Υπερώριμο-1 44,95 ± 0,79 Υπερώριμο-2 43,10 ± 7,88 Χίου Ώριμο πράσινο 44,47 ± 5,00 Έναρξη αλλαγής χρώματος 44,99 ± 2,55 Αλλαγή χρώματος 45,64 ± 0,53 Ρόδινο 50,68 ± 1,40 Ελαφρά κόκκινο 47,86 ± 3,27 Κόκκινο 47,31 ± 0,98 Υπερώριμο-1 41,28 ± 1,97 Υπερώριμο-2 35,47 ± 2,67 Λήμνου Ώριμο πράσινο 43,41 ± 4,02 Έναρξη αλλαγής χρώματος 46,81 ± 1,41 Αλλαγή χρώματος 53,08 ± 0,70 Ρόδινο 54,84 ± 1,05 Ελαφρά κόκκινο 53,79 ± 3,18 Κόκκινο 50,35 ± 1,79 Υπερώριμο-1 52,68 ± 1,70 Υπερώριμο-2 48,30 ± 0,57 Ailsa Craig Ώριμο πράσινο 46,66 ± 1,17 Έναρξη αλλαγής χρώματος 44,03 ± 3,75 Αλλαγή χρώματος 44,98 ± 3,67 Ρόδινο 45,01 ± 1,65 Ελαφρά κόκκινο 47,40 ± 2,00 Κόκκινο 48,44 ± 5,10 Υπερώριμο-1 47,97 ± 5,86 Υπερώριμο-2 40,06 ± 7,00 Rio Grande Ώριμο πράσινο 71,36 ± 1,39 Έναρξη αλλαγής χρώματος 74,82 ± 3,20 Αλλαγή χρώματος 61,18 ± 3,39 Ρόδινο 67,02 ± 3,05 Ελαφρά κόκκινο 76,18 ± 3,89 Κόκκινο 80,12 ± 3,65 Υπερώριμο-1 81,70 ± 4,04 Υπερώριμο-2 81,82 ± 3,79 24

25 Ολικά αντιοξειδωτικά Η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα προσδιορίστηκε χρωματομετρικά με τη χρήση της μεθόδου των Brand-Williams κ.ά. (1995). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στo γεγονός ότι το DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) αποτελεί μια ελεύθερη ρίζα με έντονο βιολετί χρώμα που μετατρέπεται σε άχρωμη ουσία όταν τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια συνδέονται με τα αντιοξειδωτικά. Ποσότητα 5g πολτοποιημένου δείγματος, που είχε διατηρηθεί στους -20 o C, ομογενοποιήθηκε με 25 ml μεθανόλης 95% σε πάγο, με χρήση ομογενοποιητή Polytron (Kinematika GmbH) και φυγοκεντρήθηκε σε 5000 g για 10 λεπτά. Ακολούθησε διήθηση του υπερκείμενου μέσω φίλτρου Whatman No 1 και συμπλήρωση με μεθανόλη 95% μέχρι τελικού όγκου 25 ml. Ποσότητα 50 μl από το εκχύλισμα προστέθηκε σε 2950 μl διαλύματος 100μM DPPH σε μεθανόλη 95%. Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και ακριβώς 30 λεπτά μετά από την προσθήκη του εκχυλίσματος, μετρήθηκε η μείωση της απορρόφησης του διαλύματος DPPH στα 517 nm. Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς έγινε με μέτρηση της μείωσης της απορρόφησης διαλύματος DPPH μετά από προσθήκη γνωστής συγκέντρωσης ασκορβικού οξέος (0-0,2 mg/ml). Η αντιοξειδωτική ικανότητα του εκχυλίσματος εκφράστηκε σε mg ασκορβικού οξέος (AEAC) ανά 100 g ιστού με βάση το νωπό βάρος των καρπών. Ασκορβικό οξύ Για την εκχύλιση του ασκορβικού οξέος, 30g πολτοποιημένου δείγματος καρπών ομογενοποιήθηκαν με 50 ml διαλύματος 1% οξαλικού οξέος σε blender για 1 λεπτό. Ο προσδιορισμός της ανηγμένης μορφής ασκορβικού οξέος στο εκχύλισμα που προέκυψε μετά από διήθηση, έγινε με το ρεφλεκτόμετρο Rqflex (Merk, Darmstadt, Germany). Ολικές διαλυτές φαινόλες Ποσότητα 10g πολτοποιημένου δείγματος καρπών διατηρήθηκε στους 20 o C. Για την εκχύλιση των ολικών διαλυτών φαινολών, τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με 20 ml αιθανόλη 95% και φυγοκεντρήθηκαν στα 5000 x g για 20 λεπτά. Το ίζημα εκχειλίστηκε για δεύτερη φορά με αιθανόλη 95% και στη συνέχεια για τρίτη φορά με αιθανόλη 5% (Cheng and Breen, 1991). Στο σύνολο των τριών υπερκείμενων φάσεων, αφού αυτό συμπληρώθηκε μέχρι τελικού όγκου 100 ml, έγινε ο προσδιορισμός των ολικών διαλυτών φαινολών χρωματομετρικά, με τη μέθοδο των Scalbert et al. (1989) ως εξής: 25

26 Ποσότητα 2,5 ml από το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (αραιωμένο κατά 10 φορές με απεσταγμένο νερό) και 2 ml διαλύματος Na 2 CO 3 (75 g/l) προστέθηκαν σε 0,5 ml του δείγματος. Η προσθήκη του Na 2 CO 3 έγινε μέσα στο χρονικό διάστημα των 30 sec ως 8 min από την προσθήκη του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο στους 50 o C για 5 λεπτά και μετά από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20 o C), μετρήθηκε η απορρόφηση του διαλύματος στα 760 nm με σπεκτροφωτόμετρο HITACHI Τα δεδομένα των μετρήσεων εκφράστηκαν ως mg γαλλικού οξέος (GAE)/g νωπού βάρους. Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς έγινε με μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης γαλλικού οξέος (8-80 μg/ml), που προέκυψαν από αραιώσεις πυκνού διαλύματος (80mg/100ml). Λυκοπένιο Ποσότητα 1g πολτοποιημένου δείγματος καρπών διατηρήθηκε στους 20 o C. Για την εκχύλιση του λυκοπενίου, τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης με 25 ml ακετόνης. Οι σωλήνες ανακινήθηκαν για 1 ώρα στις 150 στροφές / λεπτό σε σκοτάδι, ώστε να εμποδιστεί η φωτο-επαγωγική οξείδωση του λυκοπενίου. Το υπερκείμενο διάλυμα μεταφέρθηκε σε ογκομετρική φιάλη και συμπληρώθηκε με ακετόνη μέχρι τελικού όγκου 25 ml. Η απορρόφηση του εκχυλίσματος μετρήθηκε με σπεκτροφωτόμετρο Hitachi στα 503 nm και η περιεκτικότητα σε λυκοπένιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον συντελεστή μοριακής απόσβεσης 17,2x10 4 mol.cm -1 και εκφράστηκε σε mg/100g νωπού βάρους (Mencarelli and Saltveit, 1988). Νιτρικά Για την εκχύλιση των νιτρικών, 10g πολτοποιημένου δείγματος καρπών ομογενοποιήθηκαν με 50 ml απεσταγμένο νερό σε blender. Ο προσδιορισμός των νιτρικών στο εκχύλισμα έγινε με τη μέθοδο του σαλικυλικού οξέος (Cataldo et al., 1975), ως εξής: Ποσότητα 0,2 ml από το εκχύλισμα μεταφέρθηκε σε σωλήνες 250x25 mm και προστέθηκαν 0,8 ml αντιδραστηρίου 5% (βάρος / όγκο) σαλικυλικού οξέος σε πυκνό θειικό οξύ με ταυτόχρονη ανάδευση σε Vortex. Μετά από 20 λεπτά, προστέθηκαν 19 ml διαλύματος 2Ν NaOH και μετά από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου μετρήθηκε η απορρόφηση του διαλύματος σε σπεκτροφωτόμετρο Spectronic 20D, σε μήκος κύματος 26