«Ποσοτικοποίηση και βιοχημική σημασία των πρωτεϊνικών θειολών στους οργανισμούς»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ «Ποσοτικοποίηση και βιοχημική σημασία των πρωτεϊνικών θειολών στους οργανισμούς» Συντιχάκη Ευαγγελία Βιολόγος ΠΑΤΡΑ 2010

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ EΙΣΑΓΩΓΗ 1 Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες Ελεύθερες ρίζες - Ορισμός Σχηματισμός και αντιδράσεις ελευθέρων ριζών Δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) Οι συνέπειες της παραγωγής των ελευθέρων ριζών στους οργανισμούς- Οξειδωτικό στρες Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση Ορισμός Δομή της γλουταθειόνης (GSH) Περιοχές του κυττάρου όπου εντοπίζεται η γλουταθειόνη Ρόλοι της γλουταθειόνης Πρωτεϊνικές θειόλες Πρωτεϊνικά δισουλφίδια Μεικτά πρωτεϊνικά δισουλφίδια Το οξειδοαναγωγικό ζεύγος GSSG / 2GSH Ρόλος των πρωτεϊνικών σουλφυδρυλομάδων στο κυτταρικό οξειδοαναγωγικό περιβάλλον Κυστεΐνη (CSH) και κυστίνη (CSSC) Στοιχεία για τις βιολογικές βλάβες που προκαλούν οι ρίζες RS Μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας Στόχος της παρούσας μελέτης...26 Αντιδραστήρια αναγωγής των δισουλφιδίων...29 Αντιδραστήρια-ανιχνευτές SH ομάδων...33 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά και μέθοδοι Φωτομετρική μέθοδος προσδιορισμού της ΓΘΟΚ- Μέθοδος BH-DTNB Υλικά Πορεία Τροποποίηση της φωτομετρικής μεθόδου Κατασκευή πρότυπων καμπύλων κυστεΐνης και γλουταθειόνης Έλεγχος συντελεστή απόσβεσης για BSA και Lysozyme Αναγωγή των πρότυπων πρωτεϊνών BSA και Lysozyme

3 2. GTRS assay. Nέα φωτομετρική μέθοδος εκτίμησης της ΓΘΟΚ Υλικά Πορεία Κατασκευή πρότυπων καμπύλων κυστεΐνης και γλουταθειόνης για τη μέθοδο TBP-DPS Έλεγχοι που πραγματοποιήθηκαν για την υλοποίηση της μεθόδου Έλεγχος αναδιάλυσης / ανάκτησης πρωτεΐνης (BSA, Lysozyme) μετά από 5% TCA precipitation Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών με την τροποποιημένη μέθοδο Coomassie Brilliant Blue Έλεγχος για φθορισμό και απορρόφηση του φορμαμιδίου Έλεγχος καταβύθισης και αναδιάλυσης πρωτεΐνης σε διαφορετικά ph Έλεγχος ανάκτησης πρωτεΐνης στο φορμαμίδιο με Bradford σε ph 2,3 και 4, Έλεγχος ph στα επιμέρους βήματα των κλασμάτων της μεθόδου Έλεγχος για καταβύθιση στο φορμαμίδιο χαμηλών συγκεντρώσεων πρωτεΐνης Έλεγχος καταβύθισης BSA σε διαφορετικές συγκεντρώσεις TCA Αναγωγή πρότυπων πρωτεϊνών BSA και λυσοζύμης με την μέθοδο TBP- DPS Αναγωγή BSA και λυσοζύμης με διαφορετικές συγκεντρώσεις TBP...58 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α. Έλεγχος ιδιοτήτων των αναγωγικών παραγόντων TCEP και TBP Αναγωγικός παράγοντας TCEP και αλληλεπίδραση με αντιδραστήριο DPS Εύρεση κατάλληλου οργανικού διαλύτη για τη διάλυση του TBP Απομάκρυνση TBP με οργανικούς διαλύτες Χρονική και ποιοτική σταθερότητα αναγωγικού παράγοντα ΤΒΡ Έλεγχος κατάλληλης τελικής συγκέντρωσης TBP για μέγιστη απόδοση αναγωγής...64 Β. Έλεγχος του ph της αντίδρασης για την επίτευξη μέγιστης απόδοσης αναγωγής αλλά και μέγιστης απόδοσης ανίχνευσης -SH ομάδων...65 Γ. Μέγιστη συγκέντρωση φορμαμιδίου για την καταβύθιση με TCA και ελάχιστη συγκέντρωση φορμαμιδίου που μπορεί να δεχτεί τη μέγιστη συγκέντρωση πρωτεΐνης...66 Δ. Καταβύθιση πρωτεΐνης με διαφορετικές συγκεντρώσεις TCA...67 ΠΡΟΤΥΠΕΣ ΚΑΜΠΥΛΕΣ 1. Πρότυπη καμπύλη πρωτεϊνικών θειολών Αναγωγή BSA με ΒΗ και ανίχνευση SH με το αντιδραστήριο DNTB Αναγωγή λυσοζύμης με BH και ανίχνευση SH με το αντιδραστήριο DTNB Αναγωγή BSA με TBP και ανίχνευση SH με το αντιδραστήριο DPS Αναγωγή λυσοζύμης με TBP και ανίχνευση SH με το αντιδραστήριο DPS...70 ΣΥΝΟΨΗ...71 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

4 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ BH: Τετραϋδροβορικό νάτριο (sodium borohydride) CSH: Κυστεΐνη (cysteine) CoA, CoASH, ή HSCoA: Συνένζυμο Α (coenzyme A) DTT: Διθειοθρεϊτόλη (dithiothreitol) DMF: διμεθυλoφορμαμίδιο (dimethylformamide) EDTA: Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Ethylenediaminetetraacetic acid) GSH: Γλουταθειόνη (glutathione) GSSG: Δισουλφίδιο της γλουταθειόνης (glutathione disulfide) MDA: Μαλονδιαλδεΰδη (malodialdehyde) NPSH: Μη πρωτεϊνικές θειόλες (non-protein thiols) NPSSC: Μη πρωτεϊνικά δισουλφίδια κυστεΐνης (non-protein disulfides of cysteine) NPSSR: Μη πρωτεϊνικά δισουλφίδια (non-protein disulfides) PMSF: Φαινυλομεθυλοσουλφόνυλο φθόριο (phenylmethylsulfonyl fluoride) PSH: Πρωτεϊνικές θειόλες (protein thiols) PSSC: Μεικτά δισουλφίδια κυστεΐνης (mixed disulfides of cysteine) PSSP: Πρωτεϊνικά δισουλφίδια (protein disulfides) PSSR: Μεικτά δισουλφίδια (mixed disulfides) RNS: Δραστικές μορφές αζώτου (reactive nitrogen species) ROS: Δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species) TRS: Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (thiol redox state) ΔΜΟ: Δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) (Γ)ΘΟΚ: (Γενική) Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση 4

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5

6 1. Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες Από το 1954 είχε προταθεί ότι οι τοξικές επιδράσεις του Ο 2 σε συνδυασμό δράσης με την ιονίζουσα ακτινοβολία μπορούσαν να αποδοθούν στο σχηματισμό ελευθέρων ριζών (free radicals) οξυγόνου (Halliwell and Gutteridge, 1999). Από τότε, η διαρκής έρευνα στο νέο αυτό πεδίο της βιοχημείας, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη της απαραίτητης τεχνολογίας λόγω της παράλληλης προόδου των επιστημών χημείας, φυσικής και μαθηματικών, απέδειξε μια εξαιρετικά σύνθετη συμμετοχή των ελευθέρων ριζών στο μεταβολισμό των αερόβιων οργανισμών. Η αναπόφευκτη παρουσία των δραστικών αυτών μορίων στη ζωή των οργανισμών συνδέθηκε με φυσιολογικές βιοχημικές πορείες και δράσεις όπως η μετάδοση δευτερογενών κυτταρικών σημάτων, οι βιολογικές αντιδράσεις πολυμερισμού, η διαστολή και συστολή των αγγείων, η απόπτωση, αλλά και με πλήθος ασθενειών όπως η αθηροσκλήρωση, η υπέρταση, ο διαβήτης, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η κυστική ίνωση, ο καρκίνος, πολλές νευροεκφυλιστικές και άλλες ασθένειες (Halliwell and Gutteridge, 1999) Ελεύθερες ρίζες - Ορισμός. Ως ελεύθερη ρίζα (free radical) ορίζεται κάθε είδος ατόμου ή μορίου που περιέχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Ασύζευκτο ηλεκτρόνιο καλείται αυτό που καταλαμβάνει μόνο του ένα ατομικό ή μοριακό τροχιακό και παριστάνεται συνήθως με μία τελεία πάνω και δεξιά ή αριστερά από το χημικό τύπο της ελεύθερης ρίζας. Η πιο απλή ελεύθερη ρίζα είναι το άτομο του υδρογόνου που φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 1) μαζί με άλλα παραδείγματα ελευθέρων ριζών. 6

7 Πίνακας 1: Παραδείγματα ελεύθερων ριζών Όνομα Μοριακός Τύπος Σχόλια/Παραδείγματα Άτομο υδρογόνου H Η πιο απλή ελεύθερη ρίζα. Trichloromethyl radical (ρίζα τριχλωρομεθυλίου) CCl 3 Αποτέλεσμα του μεταβολισμού του CCl 4. Superoxide radical (ρίζα υπεροξειδίου) - O 2 Ρίζα με κεντρικό άτομο το οξυγόνο. Hydroxyl radical (Ρίζα OH Πολύ δραστική, αντιδρά με υδροξυλίου) Thiyl/perthiyl radical (θειυλικές/υπερθειυλικές ρίζες) Peroxyl (υπεροξυλικές ρίζες), alkoxyl (αλκοξυλικές ρίζες) radicals όλα τα βιομόρια. RS /RSS Ρίζες με κεντρικό άτομο το θείο. RO 2, Δημιουργούνται κατά τη RO διάσπαση οργανικών υπεροξειδίων και από αντιδράσεις ριζών άνθρακα με O 2. Οξείδια αζώτου NO, NO 2 Το NO παράγεται in vivo από L-αργινίνη, το NO 2 από την αντίδραση NO με O 2. Στοιχεία μεταπτώσεως Fe, Cu, κ.α. Ισχυροί καταλύτες αντιδράσεων ελευθέρων ριζών χάρη στην ιδιότητά τους να αλλάζουν αριθμό οξείδωσης Σχηματισμός και αντιδράσεις ελευθέρων ριζών. Η δραστικότητα των ελευθέρων ριζών εξαρτάται από τα μόρια ή τις άλλες ρίζες στο περιβάλλον, καθώς και από τη φύση (π.χ. πολικότητα) του περιβάλλοντος μέσου. Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να σχηματιστούν με τους παρακάτω τρόπους: 1. Απόσπαση ενός ηλεκτρονίου από ένα μόριο ή άτομο: Χ e - + X + 2. Λήψη ενός ηλεκτρονίου από ένα μόριο ή άτομο: Y + e - Y - 3. Ομολυτική σχάση ομοιοπολικού δεσμού: Α:Β Α + Β Δύο πολύ σημαντικές αντιδράσεις στη βιοχημεία των ελευθέρων ριζών οδηγούν στην παραγωγή της πολύ δραστικής ελεύθερης ρίζας υδροξυλίου είναι: που 1. Αντίδραση Fenton: Fe(II) + H 2 O 2 Fe(III) + OH + OH - 7

8 2. Αντίδραση Haber-Weiss: O H2 O 2 O 2 + OH + OH - Το O 2 - μπορεί επίσης να ανάγει τον τρισθενή σίδηρο σε δισθενή βοηθώντας ουσιαστικά να εξελιχθεί η αντίδραση Fenton (superoxide-assisted Fenton reaction). Fe(III) + O 2 - O2 + Fe(II) Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να αντιδράσουν με μόρια ή άτομα με τους εξής τρόπους: 1. Προσθετικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα συνδέεται με ένα μόριο ή άτομο (π.χ. προσθήκη της ρίζας ΟΗ στη βάση γουανίνη του DNA): Χ +Υ [Χ-Υ] 2. Αναγωγικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως αναγωγικός παράγοντας, παραχωρώντας το ασύζευκτό της ηλεκτρόνιο σε ένα μόριο ή άτομο: Χ +Υ Χ + + Y - 3. Οξειδωτικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως οξειδωτικός παράγοντας, δεχόμενη ένα ηλεκτρόνιο από ένα μόριο ή άτομο : X + Y X - + Y + 4. Αφαιρετικώς, όταν η ελεύθερη ρίζα αποσπά ένα άτομο υδρογόνου από τον ανθρακικό σκελετό μιας οργανικής ένωσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιας αντίδρασης είναι η προσβολή των πλευρικών αλυσίδων λιπαρών οξέων από την ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου, με την οποία αρχίζει η σειρά αντιδράσεων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, που είναι ο κύριος μηχανισμός πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών σε βιολογικές μεμβράνες (Halliwell and Gutteridge, 1999): C H + OH C + H 2 O 8

9 1.3. Δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ). Το μόριο του οξυγόνου στη βασική του (μη διεγερμένη) κατάσταση (groundstate O 2 ) εμπίπτει στον ορισμό της ελεύθερης ρίζας αφού διαθέτει δύο μονήρη (ή ασύζευκτα) ηλεκτρόνια με ιδίας κατεύθυνσης στροφορμές (spin), που καταλαμβάνουν το καθένα ένα διαφορετικό μοριακό τροχιακό (Εικ. 1β). Η κατανομή αυτή προσδίδει στην όλη δομή υψηλού βαθμού χημική σταθερότητα, αφού προκειμένου το Ο 2 να αντιδράσει απευθείας με κάποια ένωση, θα πρέπει η ένωση αυτή να διαθέτει επίσης δύο μονήρη ηλεκτρόνια με στροφορμή αντίθετη ως προς αυτή των ασύζευκτων ηλεκτρονίων του Ο 2. Ο περιορισμός αυτός (spin restriction), που εξηγεί την αδυναμία του οξυγόνου να προσβάλλει απευθείας τα διάφορα βιολογικά μόρια και γενικότερα ενώσεις που δεν είναι ελεύθερες ρίζες, μπορεί να αρθεί με το σχηματισμό δραστικότερων παραγώγων Ο 2 με τους εξής δύο τρόπους (Εικ. 1 α και β): α) Με πρόσληψη ενέργειας από το Ο 2 βασικής κατάστασης, το οποίο έτσι μεταπίπτει στη διεγερμένη κατάσταση του μονήρους οξυγόνου (singlet oxygen). H απορροφούμενη ενέργεια σε πρώτη φάση αντιστρέφει τη στροφορμή του ενός ασύζευκτου ηλεκτρονίου (ενδιάμεση μορφή μονήρους οξυγόνου, 1 Σg + O 2 ). Αμέσως μετά, τα δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια, έχοντας πλέον αντίθετες στροφορμές και κατάλληλη ενέργεια, καταλήγουν σε κοινό τροχιακό, δίνοντας την τελική μορφή μονήρους οξυγόνου ( 1 ΔgO 2 ) που είναι ένας ιδιαίτερα δραστικός οξειδωτικός παράγοντας (Εικ. 1 β). Η μετάπτωση του μοριακού οξυγόνου από τη βασική στη μονήρη κατάσταση είναι κατά κανόνα συζευγμένη με την αποδιέγερση κάποιου κατάλληλου μορίου, το οποίο είχε προηγουμένως διεγερθεί με την απορρόφηση φωτεινής ή άλλης ακτινοβολίας υψηλης ενέργειας. Το συνολικό φαινόμενο καλείται αντίδραση φωτοευαισθητοποίησης (photosensitization reaction) και μπορεί να λάβει χώρα in vivo με τη μεσολάβηση διαφόρων μορίων όπως φλαβινομάδες (FMN, FAD, ριβοφλαβίνη), πορφυρίνες, χολερυθρίνη κ.α. β) Με διαδοχική αναγωγή του μοριακού οξυγόνου με πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου τη φορά. Η σταδιακή αυτή μονοσθενής αναγωγή μπορεί να συνεχισθεί μέχρι την προσθήκη τεσσάρων συνολικά ηλεκτρονίων και καταλήγει στη μετατροπή ενός μορίου O 2 σε δύο μόρια Η 2 Ο, με το σχηματισμό ενδιάμεσων, μερικώς ανηγμένων, δραστικών μορφών Ο 2. Οι μορφές αυτές είναι, σε σειρά σχηματισμού, η 9

10 - ρίζα υπεροξειδίου O 2 (superoxide radical), το υπεροξείδιο του υδρογόνου H 2 O 2 (hydrogen peroxide) και η ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου OH (hydroxyl radical) (Εικ. 1 α). Τα δραστικά αυτά παράγωγα του οξυγόνου σχηματίζονται αναπόφευκτα στο πλαίσιο του αερόβιου μεταβολισμού (σε ποσότητες βέβαια που ποικίλουν ανάλογα με τα επίπεδα του οξυγόνου και την όλη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων) και αποτελούν το πρωταρχικό αίτιο εκδήλωσης του φαινομένου του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα. Το μονήρες οξυγόνο στη σταθερή του μορφή ( 1 ΔgO 2 ) και το 2- υπεροξειδικό ανιόν (Ο 2 ) δεν έχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια και έτσι δεν αποτελούν ελεύθερες ρίζες αλλά εντάσσονται σε μία ευρεία ομάδα παραγώγων του οξυγόνου με την γενική ονομασία δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ), ο οποίος περιλαμβάνει όχι μόνο τα πρωτογενή δραστικά παράγωγα του οξυγόνου αλλά και όλα εκείνα (ρίζες ή μη) που προκύπτουν δευτερογενώς κατά τις διάφορες χημικές αλληλεπιδράσεις με τα στοιχεία του κυτταρικού περιβάλλοντος (π.χ. οι περόξυλ, RCOO, και οι αλκόξυλ, RCO, ρίζες ενδιάμεσα προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων) (Thannickal and Fanburg, 2000). Στον παρακάτω πίνακα φαίνεται η κατάταξη των δραστικών μορφών οξυγόνου σε ρίζες και μη ρίζες (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Δραστικές μορφές οξυγόνου Ελεύθερες Ρίζες (Free Radicals) Μη-ρίζες (Non-radicals) Ρίζα σουπεροξειδίου Υπεροξείδιο του υδρογόνου (O - 2, superoxide radical) (Η 2 Ο 2, hydrogen peroxide) Ρίζα υδροξυλίου Υποχλωριώδες οξύ (ΟΗ, hydroxyl radical) (HOCl α, hypochlorous acid) Περόξυλ ρίζα Όζον (RO 2, peroxyl radical) (O 3 ) Αλκόξυλ ρίζα Μονήρες οξυγόνο (RO, alcoxyl radical) ( 1 Δg, singlet oxygen). Υδροπερόξυλ ρίζα Υπεροξυνιτρώδες (ΗO 2, hydroperoxyl radical) (ONOO -β, peroxynitrite) α Mπορεί να χαρακτηριστεί και ως δραστική μορφή χλωρίου (reactive chlorinating species, RClS) β Mπορεί να χαρακτηριστεί και ως δραστική μορφή αζώτου (reactive nitrogen species, RNS) 10

11 α. 4H + O2 2H2O O2 1 2H + hv ή άλλη ενέργεια O2 O2 ρίζα υπεροξειδίου H2O2 H + e - H2O OH H + e - H2O e - e - υπεροξείδιο του υδρογόνου ρίζα υδροξυλίου Εικόνα 1. α. Προϊόντα αναγωγής και διέγερσης του μοριακού οξυγόνου (Wlodek, 2002). β. Ηλεκτρονιακή κατανομή του μοριακού οξυγόνου βασικής κατάστασης και των παραγώγων του (Halliwell and Gutteridge, 1999). β Οι συνέπειες της παραγωγής των ελευθέρων ριζών στους οργανισμούς - Οξειδωτικό στρες. Όπως συνάγεται από τις αντιδράσεις τους, οι ελεύθερες ρίζες και κυρίως οι πολύ δραστικές όπως η ρίζα υδροξυλίου μπορούν να προσβάλλουν μεγάλη ποικιλία μορίων όπως σάκχαρα, αμινοξέα, φωσφολιπίδια και γενικά λιπίδια, βάσεις DNA και οργανικά οξέα. Οι λιγότερο δραστικές ελεύθερες ρίζες μπορούν να οδηγήσουν στην παραγωγή δραστικότερων καταλήγοντας τελικά στο ίδιο αποτέλεσμα. Γενικότερα, η διαταραχή της ισορροπίας προ-οξειδωτών και αντιοξειδωτών προς όφελος των πρώτων, καταλήγοντας σε οξειδωτικές βλάβες (oxidative damage), ονομάζεται οξειδωτικό στρες (oxidative stress) (Sies, 1999). Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι βλάβες και οι επιπτώσεις που προκαλούνται από τις ΔΜΟ εις βάρος του DNA και των λιπιδίων. παραδείγματα των οξειδωτικών βλαβών (Πίνακας 3). 11

12 Πίνακας 3. Οι επιπτώσεις των δραστικών μορφών οξυγόνου στο DNA και στα λιπίδια. Οξειδωτικές Στόχοι Είδος βλαβών Επιπτώσεις βλάβες Πυρηνικό, μιτοχονδριακό και DNA εγκοπές, DNA χλωροπλαστών DNA σπασίματα Βάσεις πουρίνης Βάσεις πυριμιδίνης Xημικές τροποποιήσεις: 8 υδρόξυ-γουανίνη, 5- υδρόξυ-6-υδροθυμίνη Mεταλλαξιγένεση, DNA Σχηματισμός ομοιοπολικών ενώσεων DNA-πρωτεϊνών κυτταρική δυσλειτουργία, (DNA-protein καρκινογένεση διασυνδέσεις), ομοιοπολική Πρωτεΐνες DNA δέσμευση και διμερισμός μεταξύ γειτονικών διπυριμιδινών (pyrimidine dimers) από ακτινοβολία UV. Υπεροξείδωση λιπιδίων: σχηματισμός ριζών άνθρακα (R ), παραγωγή Καταστροφικά Φωσφολιπιδική οργανικών αποτελέσματα για τη Λιπίδια (Hou et al.,1996) διπλοστοιβάδα κυτταροπλασματικής και ενδοκυττάριων μεμβρανών υδροϋπεροξειδίων (ROOH). Αποικοδόμηση λιπιδικών υπεροξειδίων σε τοξικά προϊόντα (κετόνες, δομική και λειτουργική ακεραιότητα των μεμβρανών. Βιοφυσικές και (υδρόφοβο τμήμα) εποξείδια, μαλονική βιοχημικές διαταραχές διαλδεϋδη, 4- στο κύτταρο. υδροξυνονενάλη, ισοπροστάνες κ.α.) Οξειδωτικές βλάβες στις πρωτεΐνες. Σε αντίθεση με ότι συμβαίνει στα λιπίδια, ο σχηματισμός υπεροξειδίων είτε στον πεπτιδικό κορμό είτε στις πλευρικές αλυσίδες ορισμένων αμινοξέων αποτελεί έναν μόνο από τους πολλούς τύπους οξειδωτικών 12

13 βλαβών που έχουν παρατηρηθεί στις πρωτεΐνες. Παρ όλα αυτά, ο όρος υπεροξείδωση πρωτεϊνών έχει προσλάβει μια ευρύτερη έννοια και δηλώνει όλα τα είδη ομοιοπολικών τροποποιήσεων που προκαλούνται στις πρωτεΐνες από τα διάφορα είδη ΔΜΟ (ΟΗ, ΟΝΟΟ -, HClO, 1 O 2 ) ή άλλα παραπροϊόντα του οξειδωτικού στρες (π.χ. από προϊόντα της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, όπως οι αλδεΰδες MDA και ΗΝΕ). Οι χημικές μεταβολές που επέρχονται στις πρωτεΐνες ως συνέπεια του οξειδωτικού στρες ποικίλουν ανάλογα με το προσβαλλόμενο σε κάθε περίπτωση αμινοξύ αλλά και το είδος του δραστικού μορίου που επιφέρει τη βλάβη. Στον πίνακα 4 παρατίθενται τα κυριότερα είδη οξειδωτικών τροποποιήσεων που παρατηρούνται στις πρωτεΐνες, Στον πίνακα 5 φαίνονται τα πλέον επιρρεπή στην οξείδωση αμινοξέα με τα συνήθη προϊόντα τους και στον πίνακα 6 αναφέρονται οι πιθανές βιοχημικές συνέπειες της οξειδωτικής βλάβης διαφόρων πρωτεϊνικών (Stadtman, 2006). Οι περισσότερες οξειδωτικές επιδράσεις οδηγούν στη δυσλειτουργία πολλών πρωτεϊνών, η οποία μπορεί να οφείλεται σε αυτή την άμεση μεταβολή/αλλαγή αμινοξέων που βρίσκονται σε μια λειτουργική περιοχή για την πρωτεΐνη ή σε μερική αποδιάταξή της (Εικ. 2). Αν οι πρωτεΐνες δεν αποδομηθούν εγκαίρως σ αυτό το στάδιο, τείνουν να δημιουργούν συσσωματώματα τα οποία μακροπρόθεσμα σχηματίζουν ομοιοπολικές ενώσεις (cross links) μεταξύ τους και με τη συσσώρευσή τους, μπορούν να οδηγήσουν ακόμα και στον κυτταρικό θάνατο (Jung et al., 2007). Πίνακας 4. Γενικοί τύποι οξειδωτικής τροποποίησης πρωτεϊνών. Οξείδωση θειολικών ομάδων Σχηματισμός πρωτεϊνικών καρβονυλίων Σχηματισμός διτυροσινών, χλωρινίωση, νιτροσυλίωση, υδροξυλίωση Τροποποιήσεις της τρυπτοφάνης Υδρο(υπερό)ξυ παράγωγα αλειφατικών αμινοξέων Σχηματισμός χλωραμινών, οξειδωτική απαμίνωση Διαμετατροπές αμινοξέων (π.χ. His σε Asn, Pro σε OH-Pro) Προσθήκη προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων (MDA, HNE) Προσθήκη προϊόντων οξείδωσης (π.χ. p-hydroxyphenylacetaldehyde) Αντιδράσεις γλυκίωσης και γλυκοξειδίωσης ( π.χ. Maillard browning) Cross-links, συμπλοκοποίηση, διάσπαση πεπτιδικών δεσμών 13

14 Πίνακας 5. Οξειδωτικώς ευάλωτα αμινοξέα και προϊόντα οξείδωσής τους. Αμινοξύ Κυστεΐνη Μεθειονίνη Τυροσίνη Τρυπτοφάνη Φαινυλαλανίνη Βαλίνη, Λευκίνη Ιστιδίνη Γλουταμίνη Προλίνη Θρεονίνη Αργινίνη Λυσίνη Προϊόν οξείδωσης Δισουλφίδια, Μεικτά δισουλφίδια Σουλφοξείδιο μεθειονίνης Διτυροσίνη, νιτροτυροσίνη Υδροξυ- και νιτρο-τρυπτοφάνη Υδροξυφαινυλαλανίνη Υδρο(υπερο)ξείδια 2-οξοϊστιδίνη, ασπαραγίνη, ΗΝΕ-His Οξαλικό, Πυροσταφυλικό οξύ Υδροξυπρολίνη, πυρολιδόνη 2-άμινο-3-κετοβουτυρικό οξύ Γλουταμική ημιαλδεϋδη, χλωροαμίνες ΜDA-Lys, HNE-Lys Πίνακας 6. Βιοχημικές συνέπειες οξειδωτικής τροποποίησης πρωτεϊνών. 1. Μείωση ή αύξηση ενζυμικής δραστικότητας 2. Απώλεια λειτουργικότητας (π.χ. fibrinogen/fibrin clotting) 3. Απώλεια ενεργότητας αναστολέα πρωτεασών (π.χ. a-1-antitrypsin, a-2-macroglobulin) 4. Συμπλοκοποίηση (π.χ. IgG, LDL, a-synuclein, amyloid protein, prion protein) 5. Αυξημένη (π.χ. του πρωτεϊνικού μεταγραφικού ρυθμιστή IRP-2) ή μειωμένη ευαισθησία σε πρωτεόλυση 6. Μη φυσιολογική πρόσληψη ουσιών από τα κύτταρα (π.χ. LDL) 7. Τροποποιημένη μεταγραφή γονιδίων (π.χ. SoxR, IkB) 8. Αυξημένη ανοσογονικότητα (π.χ. ovalbumin, HNE- ή acrolein-ldl) Φυσική πρωτεΐνη Ελαφρώς οξειδωμένη Ελαφρώς οξειδωμένη και αναδιπλωμένη Έντονα οξειδωμένη και διασυνδεδεμένη με άλλες πρωτεΐνες Εικόνα 2. Το οξειδωτικό στρες και οι επιπτώσεις του στην πρωτεϊνική δομή. (Jung et al., 2007) 14

15 2. Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση 2.1. Ορισμός Η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ) των κυττάρων χαρακτηρίζεται από τα επίπεδα ορισμένων πρωτεϊνικών (P), μη πρωτεϊνικών (NP ή R) και μεικτών μορίων [(NP ή R)P] που περιέχουν θειολικές (thiol, SH) και δισουλφιδικές (disulfide, SS) ομάδες. Είναι μια σημαντική παράμετρος του γενικότερου οξειδοαναγωγικού περιβάλλοντος των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων και σχετίζεται με πολλές σημαντικές βιολογικές διαδικασίες, καθώς και με το οξειδωτικό στρες. Στη ΘΟΚ περιλαμβάνονται τα παρακάτω μόρια: α) η μη πρωτεϊνική θειόλη γλουταθειόνη (GSH), το δισουλφίδιό της (GSSG) και τα μεικτά δισουλφιδικά της παράγωγα (PSSG), β) η μη πρωτεϊνική θειόλη κυστεΐνη (CSH), το δισουλφίδιό της (CSSG) και τα μη πρωτεϊνικά (NPSSC) και μεικτά (PSSC) δισουλφιδικά της παράγωγα, γ) οι πρωτεϊνικές θειόλες (PSH) και τα δισουλφίδιά τους (PSSP), δ) άλλες μη πρωτεϊνικές θειόλες που μαζί με την GSH και την CSH αποτελούν το σύνολο των μη πρωτεϊνικών θειολών (NPSH), ε) άλλα δισουλφιδικά μη πρωτεϊνικά μόρια που μαζί με το GSSG και το NPSSC αποτελούν το σύνολο των μη πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (NPSSR), στ) άλλα μεικτά δισουλφιδικά μόρια που μαζί με το PSSG και το PSSC αποτελούν το σύνολο των μεικτών δισουλφιδίων (PSSR) (Patsoukis and Georgiou, 2004). Από τα παραπάνω μόρια, η γλουταθειόνη (GSH) και το οξειδοαναγωγικό ζεύγος που σχηματίζει με το δισουλφίδιό της (GSSG) μπορεί να αποτελούν συνήθεις δείκτες του οξειδωτικού στρες και να θεωρούνται οι σημαντικότεροι από τους παράγοντες της ΘΟΚ αλλά δεν την καθορίζουν Δομή της γλουταθειόνης (GSH) Το τριπεπτίδιο, L-γ-γλουτάμυλο-L-κυστεΐνυλο-γλυκίνη (L-γ-glutamyl-Lcysteinyl-glycine) ή GSH (Εικ. 2) με μοριακό βάρος 307 είναι η σπουδαιότερη μικρομοριακή θειόλη που έχει βρεθεί σε φυτικά, ζωικά κύτταρα, αερόβια βακτήρια (π.χ. στο E. coli) σε συγκεντρώσεις της τάξης των mm, καθώς επίσης σπανιότερα και σε αναερόβια βακτήρια. Με το μόριο αυτό δεν παρατηρούνται τα φαινόμενα τοξικότητας που έχουν αναφερθεί ότι προκαλεί από μόνο του το αμινοξύ κυστεΐνη (Puka-Sundvall et al., 1995) και έτσι έχει επιλεγεί στη φύση ως το πλέον κατάλληλο 15

16 μόριο για να διευθετήσει τη θειολική οξειδοαναγωγική ισορροπία που χαρακτηρίζεται από την αναλογία των θειολών προς τα δισουλφίδια. Η παρουσία γ- πεπτιδικού δεσμού στο μόριο το καθιστά ανθεκτικό στην αποικοδόμηση μέσω αμινοπεπτιδασών. Το δισουλφίδιο της γλουταθειόνης GSSG (Εικ. 3), συχνά αναφερόμενο και ως οξειδωμένη γλουταθειόνη, προκύπτει ύστερα από οξείδωση και σχηματισμό δισουλφιδικής γέφυρας μεταξύ δύο μορίων γλουταθειόνης. Εκτός όμως από την οξείδωση με τον εαυτό του, το μόριο της γλουταθειόνης μπορεί να σχηματίσει δισουλφιδική γέφυρα και με άλλα μικρού μοριακού βάρους μόρια όπως ελεύθερη κυστεΐνη, συνένζυμο Α, καθώς και με θειολικές ομάδες πρωτεϊνών (Sies, 1999). Εικόνα 3. Η δομή της γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της γλουταθειόνης. Η GSH είναι ένα απλό τριπεπτίδιο (γλουταμινικό οξύκυστεϊνη-γλυκίνη). Στο GSSG δύο μόρια GSH συνδέονται με δισουλφιδική γέφυρα μέσω των SH ομάδων των κυστεϊνών Περιοχές του κυττάρου όπου εντοπίζεται η γλουταθειόνη. Το μεγαλύτερο ποσοστό της γλουταθειόνης του κυττάρου εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και μόνο το 10% βρίσκεται στα μιτοχόνδρια. Τα μιτοχόνδρια στερούνται ενζύμων σύνθεσης GSH και γι αυτό πρέπει να την προσλάβουν από το κυτταρόπλασμα. Επιπρόσθετα, ένα μέρος της GSH βρίσκεται και στον πυρήνα (Halliwell and Gutteridge, 1999) H γλουταθειόνη είναι ο σπουδαιότερος θειολικός οξειδοαναγωγικός ρυθμιστής του κυττάρου. Η συγκέντρωση της GSH στο κύτταρο είναι μεταξύ 1-15 mm, τιμή πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τη συγκέντρωση άλλων οξειδοαναγωγικών ζευγών (Hou et al., 1996). Πολλοί ερευνητές εστιάζουν μόνο στο λόγο [GSH]/[GSSG] για να χαρακτηρίσουν τη ΘΟΚ, όμως σε αντίθεση με άλλα 16

17 οξειδοαναγωγικά συστήματα, σε αυτήν την περίπτωση η γνώση και των απόλυτων συγκεντρώσεων έχει πολύ μεγάλη σημασία (Schafer et al., 2001) Ρόλοι της γλουταθειόνης 1. Η GSH είναι ευρέως διαδεδομένη σε κατώτερους και ανώτερους οργανισμούς και θεωρείται ως ο σημαντικότερος ρυθμιστής της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής κατάστασης και συμμετέχει στις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις μέσω της αντιστρεπτής οξείδωσης της ενεργής της θειολικής ομάδας (Mendoza-Cozatl et al., 2005). 2. In vitro η GSH αντιδρά άμεσα και εξουδετερώνει τη ρίζα υδροξυλίου, το υποχλωριώδες οξύ, το υπεροξυνιτρώδες (peroxynitrite), υπεροξυλικές και αλκοξυλικές ρίζες, ελεύθερες ρίζες με κέντρο το άτομο του άνθρακα και το μονήρες οξυγόνο (Halliwell and Gutteridge 1999). 3. Ανάγει άμεσα το οξειδωμένο ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C) ή μέσω της αναγωγάσης του διϋδροασκορβικού (May et al., 2003). Ο κύκλος γλουταθειόνηςασκορβικού οξέος στους χλωροπλάστες των φυτικών κυττάρων είναι γνωστός ως κύκλος Foyer-Halliwell-Asada (Halliwell and Gutteridge 1999). 4. Υπάρχουν πολλές ενδείξεις ότι συμμετέχει στην ανακύκλωση της βιταμίνης Ε σε ορισμένα μεμβρανικά συστήματα (Halliwell and Gutteridge 1999). 5. Εμποδίζει την οξείδωση των -SH ομάδων στις πρωτεΐνες. Έχει βρεθεί ότι η GSH αναστέλλει την καταλάση (Sun et al., 1989), ενώ εμπλέκεται και σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες, όπως στη μεταγωγή κυτταρικών σημάτων, στην έκφραση γονιδίων και στην απόπτωση (Sies, 1999). 6. Σε πολλές περιπτώσεις έχει βρεθεί ότι η έκφραση γονιδίων βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο της ΘΟΚ (Sies, 1999). Μερικά παραδείγματα μεταγραφικών παραγόντων η λειτουργία των οποίων επηρεάζεται από τη ΘΟΚ λόγω της παρουσίας κυστεϊνών στο μόριο τους είναι οι παράγοντες NF-κΒ, AP-1, HSF-1, p53, NF-1, USF, E2F, IIIC, κu, Egr-1, vets, Sp1, PB2/CBF, που μπορεί να χάσουν την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA, καθώς επίσης έχει βρεθεί ότι επηρεάζονται και οι υποδοχείς των γλυκοκορτικοειδών και των οιστρογόνων (Sies, 1999). 7. Η γλουταθειόνη, σχηματίζοντας S-νιτρωδογλουταθειόνη (S-nitrosoglutathione, GSNO), χρησιμεύει ως αποθήκη και μεταφορέας ΝΟ και εμπλέκεται επίσης στη 17

18 μεταφορά του χαλκού στο εσωτερικό του κυττάρου καθώς τον δεσμεύει και εμποδίζει ταυτόχρονα την αντίδρασή του με ελεύθερες ρίζες. 8. Αποτελεί ραδιοπροστατευτικό παράγοντα και επιπλέον δρα ως συμπαράγοντας στη λειτουργία των γλυοξυλασών και των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση των λευκοτριενίων. 9. Έχει βρεθεί επίσης ότι το κοιλεντερωτό Hydra αναγνωρίζει το τραυματισμένο θήραμα του από την απελευθέρωση GSH από τα τραυματισμένα κύτταρα, καθώς η GSH δεσμεύεται σε εξειδικευμένους υποδοχείς (Halliwell and Gutteridge, 1999). 10. Ένας πολύ σημαντικός ρόλος της γλουταθειόνης, είναι ότι αποτελεί υπόστρωμα σημαντικών αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως οι υπεροξειδάσες και τρανσφεράσες της GSH, καθώς και η αναγωγάση του GSSG Πρωτεϊνικές θειόλες Διάφορες πρωτεϊνικές θειόλες εντοπίζονται στις μεμβράνες, στο κυτταρόπλασμα καθώς και στο εσωτερικό των υποκυτταρικών οργανιδίων. Η συνεισφορά τους στη διαμόρφωση της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης είναι πολύ σημαντική, διότι πολλά ένζυμα και μεμβρανικοί υποδοχείς περιέχουν σουλφυδρυλομάδες στο μόριό τους (Sies, 1999). Το 30% περίπου της σύστασης σε αμινοξέα των μεταλλοθειονινών από διάφορους οργανισμούς είναι κυστεΐνη (Halliwell and Gutteridge, 1999). Επιπλέον, η παρουσία SH ομάδων σε κομβικά ένζυμα μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων (π.χ. φωσφατάσες τυροσίνης), καθώς και σε μεταγραφικούς παράγοντες μαρτυρούν το πόσο σημαντικές μπορεί να είναι οι αλλαγές στη λειτουργία των κυττάρων στις περιπτώσεις μεταβολής της ΘΟΚ (Chen, Thomas and Keaney, 2003). Από τα παραπάνω διαφαίνεται ότι οι αλλαγές στη θειολική κατάσταση του κυττάρου μπορεί να επιφέρουν καθοριστικές μεταβολές στη λειτουργία του (Stamler et al., 1996) Πρωτεϊνικά δισουλφίδια Ο σχηματισμός των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων μπορεί να προκύψει είτε μέσω ενζυμικής κατάλυσης, είτε με μη ενζυμική διαδικασία (Wetlaufer, 1984). Υπάρχουν δύο κατηγορίες: τα ενδομοριακά δισουλφίδια, αυτά που ο δισουλφιδικός δεσμός 18

19 σχηματίζεται μεταξύ κυστεϊνών του ίδιου μορίου και τα διαμοριακά δισουλφίδια, όπου ο δισουλφιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ διαφορετικών μορίων. Τα τελευταία οδηγούν στο σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων (protein aggregates), τα οποία χαρακτηρίζουν περιπτώσεις παθολογικών καταστάσεων σε ζωικά κύτταρα και σε φυτά που αναπτύσσονται σε συνθήκες στρες (Levitt, 1972; Gilbert, 1995). Τα δια-pssp και ενδο-pssp αποτελούν σημαντικούς δείκτες ΘΟΚ, καθώς εμπλέκονται σε απενεργοποιήσεις ενζύμων, μεταφορασών και μεταγραφικών παραγόντων σε συνθήκες οξειδωτικής πίεσης (Gilbert, 1995). O σχηματισμός δισουλφιδίων είναι χαρακτηριστικό πολλών εξωκυττάριων πρωτεϊνών όπως ορμόνες, τοξίνες, ένζυμα αποικοδόμησης, ανοσοσφαιρίνες και άλλες πρωτεΐνες του πλάσματος (π.χ. αλβουμίνη) και του συνδετικού ιστού, χωρίς βέβαια αυτό να σημαίνει ότι δεν υπάρχουν πολλά πρωτεϊνικά δισουλφίδια και στο εσωτερικό του κυττάρου, όπου συγκεκριμένα βρίσκονται συνήθως στην επιφάνεια του κυττάρου και σπανιότερα στο κυτταρόπλασμα (Freedman, 1990). Λίγα είναι γενικά γνωστά για τους in vivo μηχανισμούς του σχηματισμού των δισουλφιδικών γεφυρών στις πρωτεΐνες. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο σχηματισμός τους λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια ή και αμέσως μετά τη δημιουργία της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης και το οξειδοαναγωγικό περιβάλλον του κυττάρου παίζουν σημαντικό ρόλο για τον καθορισμό των κυστεϊνικών μορίων που θα σχηματίσουν τη δισουλφιδική γέφυρα και επηρεάζουν τη σταθερότητά της. Από τη στιγμή που θα σχηματιστεί η δισουλφιδική γέφυρα, η ίδια ευνοεί τη σταθεροποίηση της διάταξης της πρωτεΐνης που οδήγησε στο σχηματισμό της και έτσι η διάταξη της πρωτεΐνης και η σταθερότητα του δισουλφιδικού δεσμού είναι παράγοντες αλληλοεπηρεαζόμενοι Μεικτά πρωτεϊνικά δισουλφίδια Όταν οι θειολικές ομάδες των πρωτεϊνών αντιδρούν με GSH με αντιδράσεις πρωτεϊνικής-s-θειολίωσης (protein-s-thiolation), τότε παράγονται τα μεικτά δισουλφίδια PSSG (Halliwell and Gutteridge, 1999). Εκτός όμως από την γλουταθειόνη, οι πρωτεΐνες μπορούν να δεσμεύσουν και κυστεΐνη (PSSC), ομοκυστεΐνη, γ-γλουταμυλοκυστεΐνη, και άλλες θειόλες. Η GSH είναι ο πιο πιθανός δότης ηλεκτρονίων μιας και βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση στα κύτταρα των 19

20 περισσότερων οργανισμών, σχηματίζοντας αντιστρεπτά μεικτά δισουλφίδια GSHπρωτεϊνών, διαδικασία γνωστή και ως S-γλουταθειονυλίωση (S-glutathionylation) (Dalle-Donne, 2005). Πρόκειται για μια δυναμική διαδικασία που πιστεύεται ότι εμπλέκεται στη μεταγωγή σήματος στα κύτταρα, αλλά επίσης χρησιμεύει στην προσωρινή αποθήκευση διαθέσιμων μορίων GSH αποτρέποντας τη μη αντιστρεπτή οξείδωσή τους προς σουλφονικά. Ο μηχανισμός σχηματισμού των PSSR παραμένει άγνωστος και πιστεύεται ότι δεν γίνεται ενζυμικά, αλλά μέσω της ταχείας αντίδρασης των μη πρωτεϊνικών δισουλφιδικών-s-οξειδίων (disulfide-s-oxides) με πρωτεϊνικές θειόλες (Giles, 2001). Οι χημικές αντιδράσεις με άλλες θειόλες και δισουλφίδια καλούνται αντιδράσεις ανταλλαγής θειολών-δισουλφιδίων (Thiol-Disulfide Exchange reactions, TDE) και είναι οι εξής: GSH + PSSP PSSG + PSH GSH + PSSG GSSG + PSH Οι αντιδράσεις αυτές ευνοούνται σε αλκαλικό ph (επειδή το θειολικό ανιόν είναι αυτό το οποίο στην ουσία αντιδρά) και η ταχύτητά τους εξαρτάται από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων, την ιοντική ισχύ, τη θερμοκρασία, το ph, κ.ά. (Creighton, 1984). Η ιδιότητα των πρωτεϊνών να σχηματίζουν με αντιστρεπτό τρόπο μεικτά δισουλφίδια με θειόλες μικρού μοριακού βάρους (ιδιαίτερα GSH) πιστεύεται ότι ευνοεί την προστασία των πρωτεϊνικών θειολών σε καταστάσεις υψηλού οξειδωτικού στρες πιθανώς εμποδίζοντας τη μη αντιστρεπτή οξείδωση των θειολικών τους ομάδων (Van Der Vliet et al., 1995). Επίσης, είναι γνωστό ότι τα μικτά δισουλφίδια μπορεί να παίξουν το ρόλο μεταγωγικών σημάτων έπειτα από αλλαγές στην κυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση (Stamler, 1996) Το οξειδοαναγωγικό ζεύγος GSSG / 2GSH Ο λόγος [GSH]/[GSSG] χαρακτηρίζει τη ΘΟΚ σύμφωνα με πολλούς ερευνητές, όμως σε αντίθεση με άλλα οξειδοαναγωγικά συστήματα, σε αυτήν την περίπτωση η γνώση και των απόλυτων συγκεντρώσεων έχει πολύ μεγάλη σημασία (Schafer, 2001). Η αντίδραση του ζεύγους είναι η εξής: GSSG + 2H + +2e 2GSH 20

21 Το δυναμικό που αναπτύσσεται στο οξειδοαναγωγικό αυτό ζεύγος με βάση την εξίσωση Nernst είναι: Ε = (59.1 / 2) log ([GSH] 2 /[GSSG]) mv στους 25 o C, ph 7,0 Παρατηρείται ότι ο παράγοντας [GSH] είναι υψωμένος στο τετράγωνο. Αυτό σημαίνει ότι το υπολογιζόμενο οξειδοαναγωγικό δυναμικό δεν εξαρτάται μόνο από το λόγο, αλλά και από την απόλυτη συγκέντρωση GSH. Έτσι για παράδειγμα ένα κύτταρο με συγκέντρωση 10 mm GSH παρουσιάζει μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε αλλαγές του οξειδοαναγωγικού δυναμικού από ένα κύτταρο με συγκέντρωση 1 mm GSH Ρόλος των πρωτεϊνικών σουλφυδρυλομάδων στο κυτταρικό οξειδοαναγωγικό περιβάλλον Είναι γεγονός ότι η συγκέντρωση των PSH στο κύτταρο είναι πολύ μεγαλύτερη από της GSH. Οι ομάδες αυτές μπορεί να υπάρχουν υπό την ελεύθερη μορφή τους (-SH), ως δισουλφίδια (PSSP), ή ως μεικτά δισουλφίδια (PSSG, όταν έχει δεσμευτεί GSH σε μια πρωτεϊνική σουλφυδρυλομάδα). Η αντίδραση σχηματισμού των PSSG ή γενικά των PSSR, όπου R είναι μια οποιαδήποτε μη πρωτεϊνική θειόλη καλείται S- θειολίωση (S-thiolation) και το αντίστροφο φαινόμενο S-αποθειολίωση (Sdethiolation). Οι αντιδράσεις είναι μέρος μιας δυναμικής κατάστασης που συμβαίνει φυσιολογικά στο κύτταρο, είναι αντιστρεπτές και ο ρυθμός με τον οποίο εξελίσσονται εξαρτάται από τη φύση των σουλφυδρυλομάδων στις πρωτεΐνες. Η δημιουργία συγκεκριμένα των PSSG θεωρείται μια πρώιμη κυτταρική απόκριση στο οξειδωτικό στρες. Τα PSSG μπορεί να παραχθούν σύμφωνα με τις παρακάτω αντιδράσεις που δείχνουν τον τρόπο με τον οποίο τα PSH μπορούν να επηρεάσουν το οξειδοαναγωγικό περιβάλλον του κυττάρου (Schafer, 2001). PSOH (σουλφενικό οξύ) + GSH PSSG + H 2 O PS + GS O 2 PSSG + O 2 PS - + GS - + O 2 PSSG + O 2 PSH + P SSG PSSG + P SH 21

22 PSH + GSSG PSSG + GSH P SH + PSSG P SSP + GSH Οι δύο τελευταίες αντιδράσεις αποκαθιστούν την GSH στα κύτταρα και μάλιστα η προτελευταία από αυτές απομακρύνει και το GSSG, ώστε να μην χρειάζεται να εκκριθεί από το κύτταρο, πράγμα που θα σήμαινε απώλεια GSH. Με την επόμενη αντίδραση είναι δυνατή η επιστροφή των PSH στο κυτταρικό θειολικό απόθεμα: PSSG + GSH PSH + GSSG H προηγούμενη αντίδραση γίνεται και από ορισμένα ένζυμα όπως η θειολμεταφοράση, η ισομεράση των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων και η αναγωγάση της θειορεδοξίνης. Στη συνέχεια η αναγωγάση του GSSG αναλαμβάνει να μετατρέψει το GSSG σε GSH. Oι σουλφυδρυλομάδες των πρωτεϊνών παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο ως ρυθμιστές της σουλφυδρυλικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης και της διατήρησης του οξειδοαναγωγικού δυναμικού του ζεύγους GSSG/2GSH. Τα υψηλά αποθέματα σε PSH μπορούν να διατηρήσουν τη δυνατότητα του συστήματος της GSH να αντιμετωπίσει καταστάσεις έντονου οξειδωτικού στρες Κυστεΐνη (CSH) και κυστίνη (CSSC) H CSH είναι ως γνωστόν ένα αμινοξύ που φέρει μια σουλφυδρυλομάδα στην πλευρική ομάδα του ( CH 2 SH). Η οξείδωση δύο μορίων CSH με σχηματισμό θειογέφυρας οδηγεί στο σχηματισμό της CSSC. H CSH αποτελεί πρόδρομο μόριο της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης (Halliwell and Gutteridge, 1999), έχει όμως ενοχοποιηθεί και για τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα, όπως για παράδειγμα νευροτοξικότητα (Puka-Sundvall, 1995) και γι αυτό προτιμάται εναλλακτικά η χορήγηση AcCSH που απορροφάται από τα κύτταρα ευκολότερα και δεν έχει τοξική - επίδραση σε αυτά. Η CSH ως μια μη πρωτεϊνική θειόλη αντιδρά με O 2, H2 O 2, NO, με μέταλλα μετάπτωσης (transition metals), άλλες ελεύθερες ρίζες (Halliwell and Gutteridge, 1999; Winterbourn and Metodiewa, 1999). 22

23 Η συσσώρευση όμως των ενδιάμεσων προϊόντων των αντιδράσεων, οι ελεύθερες ρίζες CS -, μπορεί να έχουν τοξική επίδραση στα κύτταρα (Halliwell and Gutteridge, 1999). Έχει βρεθεί ακόμα ότι η CSH αναστέλλει την καταλάση, όπως και η GSH (Sun and Oberley, 1989). Η CSH αυτοοξειδώνεται πολύ εύκολα και είναι ιδιαίτερα ασταθής σε αλκαλικό ph και υψηλή θερμοκρασία. Επιπλέον, η CSH εμπλέκεται μέσω σχηματισμού CSH- DOPA στη βιοσύνθεση των ευμελανινών (eumelanins) που απαντώνται σε μαλλιά κόκκινου χρώματος (Halliwell and Gutteridge, 1999). Επιπρόσθετα, η CSH αποτελεί υπόστρωμα για τις υπεροξυρεδοξίνες, συμμετέχοντας έτσι στην ενζυμική απομάκρυνση H 2 O 2 και οργανικών υπεροξειδίων (Forman, 2005). Η οξειδωμένη της μορφή, CSSC, αποτελεί υπόστρωμα της θειολμεταφοράσης μέσω της οποίας ανάγεται σε CSH (Bick, 1998) Στοιχεία για τις βιολογικές βλάβες που προκαλούν οι ρίζες RS Οι θειυλικές ρίζες (thiyl radicals, RS ) παράγονται ως ενδιάμεσα ενζυμικών ή χημικών αντιδράσεων, αλλά η δυνατότητα επίδρασής τους στο κυτταρικό περιβάλλον είναι σημαντικά υποτιμημένη (Wlodek, 2002; Ferreri et al., 2005). Οι βιολογικές θειόλες (biothiols) είναι εξαιρετικής σημασίας αντιοξειδωτικά μόρια, προστατεύοντας τα κύτταρα από τις βλαβερές επιδράσεις των ελευθέρων ριζών λόγω της δυνατότητάς τους να αντιδρούν με τις τελευταίες. Τα θειολικά μόρια προσελκύουν το ενδιαφέρον σχεδόν αποκλειστικά λόγω των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων. Έτσι, πολύ λιγότερη προσοχή έχει δοθεί στο σχηματισμό RS που προκύπτουν από αυτές τις αντιδράσεις. Οι προστατευτικές ιδιότητες των θειολών εξαρτώνται όχι μόνο από την ικανότητα αντίδρασής τους με ελεύθερες ρίζες, αλλά και από την αντιδραστικότητα των σχηματιζόμενων θειυλικών ριζών. Η αντιοξειδωτική δράση των θειολικών μορίων καθορίζεται τόσο από το βαθμό αντιδραστικότητάς τους με ελεύθερες ρίζες, όσο και από το βαθμό αδρανοποίησης των ταυτοχρόνως παραγόμενων RS. Σημαντική βιολογική λειτουργία των θειολών αποτελεί η συμμετοχή τους σε οξειδώσεις και αναγωγές κατά τις οποίες το στοιχείο θείο των θειολικών τους ομάδων αλλάζει αριθμό οξείδωσης. Κύρια προϊόντα της οξείδωσης των θειολών είναι οι ρίζες RS, τα σουλφεν- σουλφιν- και σουλφονικά οξέα και οι αντίστοιχες ρίζες τους. Η 23

24 οξείδωση προς τα τελευταία είναι μη αντιστρεπτή διαδικασία που καταλήγει συνήθως σε απώλεια βιολογικής ενεργότητας (Wlodek, 2002). Οι τρέχουσες μελέτες σχετικά με την παραγωγή και τη δραστικότητα των ριζών RS εστιάζονται κυρίως σε μη πρωτεϊνικές, χαμηλού μοριακού βάρους θειόλες. Στο μέλλον φαίνεται ότι είναι απαραίτητο να επεκταθούν οι μελέτες και σε πρωτεϊνικές, υψηλού μοριακού βάρους θειόλες και στις αντίστοιχες πρωτεϊνικές θειυλικές ρίζες τους (protein thiyl radicals, P-S ) (Wlodek, 2002). Εκτός από τις βλάβες που προκαλούν στα ακόρεστα λιπίδια μέσω της προσθήκής τους σε διπλούς δεσμούς (Wlodek, 2002), οι ρίζες RS μπορούν να αντιδράσουν με πρωτεΐνες και DNA, ιδιαίτερα κάτω από ανεξέλεγκτες συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για παράδειγμα, αντιδρώντας με κυστεϊνικά κατάλοιπα πρωτεϊνών, οι ρίζες RS μπορούν να παράγουν δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης αμινοξέων, που αποτελούν σημεία εκκίνησης πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης και κατάτμησης (Nauser, 2005). Επιπρόσθετα, έχει παρατηρηθεί ενδομοριακή προσθήκη κυστεϊνυλικών ριζών (cysteine thiyl radicals) σε κατάλοιπα φαινυλαλανίνης σε πεπτίδια (Nauser, 2005). Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί σημαντικές επιδράσεις ορισμένων θειολών όπως η GSH, το διϋδρολιποϊκό οξύ, η CSH, η N-ακετυλοκυστεΐνη, και η εργοθειονίνη, καθώς και ορισμένων δισουλφιδίων έναντι διαφόρων οξειδοαναγωγικών καταστάσεων της μυοσφαιρίνης (Romero et al., 1992). Οι προκαλούμενες από ελεύθερες ρίζες βλάβες στο DNA είναι ένα πολύ σημαντικό βιολογικό φαινόμενο που επηρεάζει τους ιστούς κάτω από συνθήκες έντονου οξειδωτικού στρες. Οι θειόλες μπορούν να εξουδετερώσουν ελεύθερες ρίζες που προσβάλλουν το DNA, αλλά οι παραγόμενες ρίζες RS μπορεί να προκαλέσουν σημαντικές βλάβες σε αυτό. Για παράδειγμα, μπορούν να προκαλέσουν απόσπαση πρωτονίων από τη βάση θυμίνη (Nauser et al., 2005) και επίσης έχει παρατηρηθεί (με ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης) η πρόκληση κοψιμάτων στη μία έλικα του DNA όταν αυτό επωάζεται με μείγμα NO/GSH, NO/CSH, DNA (Kikugawa et al., 2005). 24

25 2.12. Μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας Οι ελεύθερες ρίζες είναι πολύ τοξικές για τα κύτταρα, οι οργανισμοί, όμως, διαθέτουν σταθμισμένους τρόπους μεταφοράς και τροφοδότησης των ιστών με οξυγόνο, ώστε τα επίπεδα αυτών να παραμένουν χαμηλά. Επιπλέον, έχουν αναπτυχθεί στα κύτταρα μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας πολύ εξειδικευμένοι, οι οποίοι αντισταθμίζουν άμεσα την παραγωγή ελευθέρων ριζών. Ως αντιοξειδωτές χαρακτηρίζονται εκείνες οι ουσίες που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση σε σχέση με τα ευαίσθητα στην οξείδωση μόρια, και καθυστερούν ή εμποδίζουν σε μεγάλο βαθμό την οξείδωση των ευαίσθητων αυτών των μορίων. Σημαντικούς μηχανισμούς αντιοξειδωτικής άμυνας, συνιστούν παράγοντες που απομακρύνουν καταλυτικά τις ελεύθερες ρίζες και τις δραστικές μη-ρίζες, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε παραγωγή ελευθέρων ριζών (προ-οξειδωτές). Τέτοιοι παράγοντες είναι διάφορα ένζυμα όπως η δισμουτάση της ρίζας του υπεροξειδίου (SOD), η καταλάση, οι υπεροξειδάσες καθώς και κάποια ένζυμα που ρυθμίζουν τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου και έχουν ως υπόστρωμα, κυρίως, το μόριο της γλουταθειόνης. Μάλιστα, πρόσφατα έχει επιβεβαιωθεί ότι οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GPx) (Brigelius-Flohe, 1999) και πιθανώς και οι υπεροξυρεδοξίνες (Peroxiredoxins) αποτελούν τα πιο σημαντικά συστήματα απομάκρυνσης του Η2Ο2 στον εγκέφαλο (Rhee et al, 2005, Halliwell, 2006). Άλλα ένζυμα που συμμετέχουν στην αντιοξειδωτική άμυνα ανήκουν στην κατηγορία των αναγωγασών, οι οποίες επαναφέρουν στην ανηγμένη τους μορφή παράγοντες που οξειδώνονται (π.χ. η αναγωγάση του GSSG και της θειορεδοξίνης (TrxR), οι αναγωγάσες του ημιδιϋδροασκορβικού και του διϋδροασκορβικού). Η διατήρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας του κυττάρου εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τη δράση των ενζύμων αυτών καθώς συμβάλλουν στην ανακύκλωση αντιοξειδωτικών ουσιών. Άλλους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς συνιστούν πρωτεΐνες (μεταλλοθειονίνες), οι οποίες έμμεσα εμποδίζουν την παραγωγή των ελευθέρων ριζών, ελαχιστοποιώντας τη διαθεσιμότητα των ιόντων σιδήρου ή χαλκού (τρανσφερίνη και σερουλοπλασμίνη αντίστοιχα), πρωτεΐνες που προστατεύουν τα βιομόρια από οξειδωτικές βλάβες με άλλους μηχανισμούς [όπως θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (heat shock proteins) και πρωτεΐνες ουμπικουιτίνης (ubiquitin proteins)], 25

26 χαμηλού μοριακού βάρους μόρια που αντιδρούν με δραστικές μορφές οξυγόνου και αζώτου, δρώντας ως εκκαθαριστές (scavengers) ελευθέρων ριζών [γλουταθειόνη, ορμόνες του φύλου (οιστραδιόλη), χολερυθρίνη, ουρικό οξύ, α-κετο-οξέα, μελατονίνη, λιποϊκό οξύ, συνένζυμo Q, μελανίνες, α-τοκοφερόλη (βιταμίνη Ε), ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), καροτενοειδή, φυτικές φαινόλες]. 3. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Στην παρούσα εργασία επιδιώχθηκε η βελτίωση προηγούμενων μεθόδων (Patsoukis and Georgiou, 2004; Patsoukis, and Georgiou, 2005) προσδιορισμού της γενικής θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης (ΓΘΟΚ) των οργανισμών, χρησιμοποιώντας νέα αντιδραστήρια και νέες πειραματικές συνθήκες. Έτσι αναπτύχθηκε μια νέα φωτομετρική μέθοδος εκτίμησης της ΘΟΚ, η οποία συγκρίθηκε με τις ήδη δημοσιευμένες από το εργαστήριό μας μεθόδους (Patsoukis and Georgiou, 2004, 2005). Γενικά, ως δείκτης της ΘΟΚ χρησιμοποιούνταν ως σήμερα είτε το συνολικό κυτταρικό θειολικό περιεχόμενο (Tager, et al., 2000) ή τα συστατικά του GSH και GSSG (Akerboom and Sies H. 1981; David L.L. and Shearer T.R. 1984; Tietze, F. 1969). Όμως, εκτός από τη γλουταθειόνη, στη ΘΟΚ περιλαμβάνονται όλοι οι πρωτεϊνικοί (P), μη πρωτεϊνικοί (NP) και μεικτοί παράγοντες [(NP ή R)-P] που περιέχουν θειολικές (thiol, -SH) και δισουλφιδικές (disulfide, -SS-) ομάδες. Με τη φωτομετρική μέθοδο Patsoukis and Georgiou (2004) που χρησιμοποιεί το αντιδραστήριο του Ellman, ποσοτικοποιούνται τα παρακάτω μόρια: α) η μη πρωτεϊνική θειόλη γλουταθειόνη (GSH), β) η μη πρωτεϊνική θειόλη κυστεΐνη (CSH) και τα μη πρωτεϊνικά (NPSSC) και μεικτά (PSSC) δισουλφιδικά της παράγωγα, γ) οι πρωτεϊνικές θειόλες (PSH) και τα δισουλφίδιά τους (PSSP), δ) το σύνολο των μη πρωτεϊνικών θειολών (NPSH) που εκτός από την GSH και την CSH περιλαμβάνει και άλλες μη πρωτεϊνικές θειόλες, ε) το σύνολο των μη πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (NPSSNP) που εκτός από το GSSG και τα NPSSC περιλαμβάνει και άλλα δισουλφιδικά μη πρωτεϊνικά μόρια, στ) το σύνολο των μεικτών δισουλφιδίων (PSSNP), στα οποία περιλαμβάνονται τα μεικτά δισουλφίδια της γλουταθειόνης (PSSG) και της κυστεΐνης (PSSC). 26

27 Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στον προσδιορισμό μόνο των εξής μορίων: α) πρωτεϊνικές θειόλες (PSH) και τα δισουλφίδιά τους (PSSP), β) άλλα μεικτά πρωτεϊνικά δισουλφιδικά μόρια, όπως τα πρωτεϊνικά-μη πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSNP). Η ανάπτυξη της μεθόδου βασίστηκε σε δύο πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια, την πρωτεΐνη αλβουμίνη ορού βοός BSA (bovine serum albumin) και τη λυσοζύμη (chicken egg white lysozyme). Η BSA περιέχει 1 ελεύθερη SH ομάδα (Cys 34) και 17 SS- ομάδες (Foster, 1977; Peters, 1996). Άρα στην αναγμένη της μορφή θα έχει 35 -SH συνολικά (Εικ. 4Α). Η λυσοζύμη περιέχει 4 -SS- ομάδες (Acharya and Taniuchi, 1977; Canfield and Liu, 1965), άρα στην αναγμένη της μορφή θα έχει 8 - SH συνολικά (Εικ. 4B). A. B. Εικόνα 4. Α. Δομή της λυσοζύμης με εμφανείς τις θέσεις των 4 δισουλφιδικών δεσμών, Β. Δομή της BSA, τρεις περιοχές με εμφανείς τους 17 -SS-. Η πλειοψηφία των εκκρινόμενων πρωτεϊνών εξαρτάται από την ύπαρξη δισουλφιδικών δεσμών για τη σταθερότητα και τη χωροδιάταξή τους. Για το λόγο αυτό, ο αριθμός των δισουλφιδικών δεσμών και των ελεύθερων θειολικών ομάδων αποτελούν σημαντικές παραμέτρους για τη μελέτη τέτοιων πρωτεϊνών τόσο in vivo όσο και in vitro (Weber and Osborn, 1969). Με την πάροδο των χρόνων, διάφορες ευαίσθητες μέθοδοι αναπτύχθηκαν για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση σε βιολογικά δείγματα χαμηλού μοριακού βάρους θειολών και δισουλφιδίων, όπως η 27

28 γλουταθειόνη και το δισουλφίδιό της. Το GSSG υπολογιζόταν με ενζυμικές μεθόδους (Akerboom M.P.T., Sies H. 1981) ενώ η GSH ήταν υπερεκτιμημένη από τις φωτομετρικές μεθόδους που χρησιμοποιούσαν το αντιδραστήριο του Ellman (Ellman, L.G. 1959), οι οποίες ήταν και μη-ειδικές αφού δεν διαχωρίζουν την GSH από την CSH (Redegeld et al., 1990). Επίσης, μη ειδικές, μη ευαίσθητες και σύνθετες λόγω παρεμβολών είναι και οι φθορισμομετρικές τεχνικές για το ζεύγος GSH/GSSG (Hissin and Hilf, 1976). Άλλες τεχνικές βασίζονταν στη χρήση ενός θειολ-ειδικού φθορίζοντος στοιχείου, όπως το monobromobimane ή N-(1-pyrenyl)maleimide, όπου στη συνέχεια ακολουθούσε διαχωρισμός και ανίχνευση με χρωματογραφία HPLC. Ωστόσο, μέθοδοι σαν κι αυτές αποδείχτηκαν ακατάλληλες για την ποσοτικοποίηση θειολών διότι το προφίλ έκλουσης εξαρτιόταν από την αλληλεπίδραση των διάφορων πρωτεϊνών με το υλικό της στήλης (Weber and Osborn, 1969; Diezel et al., 1972). Μπορεί τα PSH να προσδιορίζονται με εύκολο τρόπο μέσω της αντίδρασης Ellman (Riener et al., 2002), αλλά μέχρι σήμερα δεν υπάρχει μια γενική συγκεντρωτική μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των CSH, NPSSC, PSSR, NPSSR, and PSSC. Όσον αφορά τους αναγωγικούς παράγοντες που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία τα τελευταία χρόνια, δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες για τις κατάλληλες πειραματικές συνθήκες στις οποίες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται έτσι ώστε να επιφέρουν το επιθυμητό αποτέλεσμα, δηλαδή την πλήρη αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών. Η διατήρηση των σουλφυδρυλομάδων σε αναγμένη μορφή είναι σημαντική για τη λειτουργία πολλών πρωτεϊνών. Τα πιο κοινά αναγωγικά μέσα είναι οι ίδιες οι θειόλες (Jocelyn P.C., 1987). Ο μηχανισμός αναγωγής δισουλφιδίων από θειόλες φαίνεται στις παρακάτω αντιδράσεις, όπου έχουμε ανταλλαγή του θειολικού ανιόντος (XS - ): XS - + RSSR RSSX + RS - XS - + RSSX XSSX + RS - Κάποιοι από τους γνωστούς αναγωγείς είναι η 2-μερκαπτοαιθανόλη, το DTT (διθειοθρεϊτόλη), το BH (NaBH 4 ) το TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine] και το 28

29 TBP (tributyl phosphine) (Getz et al., 1999). Οι δυο τελευταίοι ανήκουν στην κατηγορία των τριαλκυλφοσφινών (trialkylphosphines). Στο σχεδιασμό πειραμάτων αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών και ανίχνευσης - SH ομάδων, πρέπει το πρώτο βήμα να είναι η επιλογή του κατάλληλου αναγωγικού παράγοντα και δεύτερον η απομάκρυνση της περίσσειας του τελευταίου, αν αυτός λόγω παρουσίας -SH ομάδων στη δομή του, αλληλεπιδρά με το αντιδραστήριο ανίχνευσης των ελεύθερων -SH ομάδων. Το επιθυμητό θα ήταν η ταυτόχρονη χρήση αναγωγικού παράγοντα και αντιδραστηρίου-ανιχνευτή για να μειωθούν και οι πειραματικοί χρόνοι αλλά και τα προβλήματα που προκύπτουν από την απομάκρυνση του αναγωγικού παράγοντα που μπορεί να οδηγήσει και σε εσφαλμένες μετρήσεις. Παρακάτω αναφέρονται τα κυριότερα χαρακτηριστικά των αναγωγικών παραγόντων που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως τα τελευταία χρόνια. Αντιδραστήρια αναγωγής των δισουλφιδίων DTT: Είναι ένα μικρό μόριο, γνωστό ως αντιδραστήριο του Cleland (Cleland, 1964) (Εικόνα 5Α). Χρησιμοποιείται συχνά στην αναγωγή δισουλφιδίων και γενικότερα στην παρεμπόδιση διαμοριακών και ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ κυστεϊνικών υπολοίπων. Παρόλα αυτά, το DTT δεν εφαρμόζεται για την αναγωγή -SS- δεσμών που βρίσκονται "θαμμένοι" μέσα σε πολύπλοκες πρωτεϊνικές δομές, γι αυτό και ταυτόχρονα χρησιμοποιούνται ισχυρές συνθήκες αποδιάταξης (υψηλές θερμοκρασίες, αποδιατατακτικά διαλύματα κ.α.). Η εικόνα 5Β απεικονίζει την αντίδραση αναγωγής ενός τυπικού δισουλφιδικού δεσμού που γίνεται σε ph > 7. Το ενδιάμεσο προϊόν είναι ασταθές γιατί η δεύτερη θειολική μορφή του DTT τείνει να κλείσει τον δακτύλιο σχηματίζοντας οξειδωμένο DTT και οδηγώντας στην αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού (Ruegg and Rudinger, 1977). 29

30 Α. Εικόνα 5. Α. Χημικός τύπος του DTT, B. Η αναγωγή ενός δισουλφιδικού δεσμού από το DTT, μέσω δυο διαδοχικών αντιδράσεων ανταλλαγής θειολών-δισουλφιδίων. Β. Στα μειονεκτήματα της αναγωγής με τη μέθοδο DTT συγκαταλέγονται οι επιβλαβείς επιπτώσεις που μπορεί να έχει στην πρωτοταγή πρωτεϊνική δομή σε σχέση με άλλους αναγωγείς (Kirley, 1989). Επίσης, δεν διατηρείται στην αναγμένη του μορφή για μεγάλο χρονικό διάστημα, θεωρείται ασταθές και χάνει την αποτελεσματικότητά του σε χαμηλά ph (Subramonia and Klee, 1973; Getz et al., 1999). Μειονεκτεί λόγω μεγάλου χρόνου επώασης σχεδόν μια ώρα- για την ολοκλήρωση της αναγωγής και της επακόλουθης διαδικασίας απομάκρυνσής του πριν από την ποσοτικοποίησηση των θειολών με gel filtration (Hansen et al, 2007). Η χαμηλή ταχύτητα αντίδρασης (rate of reaction) καθιστά λοιπόν χρονοβόρα τη μέθοδο DTT. Επιπροσθέτως, λόγω της δομής του, που περιέχει -SH ομάδες, απαιτείται απομάκρυνσή του από την αντίδραση πριν την ποσοτικοποίηση των θειολών, διότι αλληλεπιδρά με τα αντιδραστήρια-ανιχνευτές -SH ομάδων (όπως π.χ. το ABD-F) σχηματίζοντας συμπλέγματα (abducts) και δίνοντας κατά αυτό το τρόπο παρεμβολές στις μετρήσεις φθορισμού και απορρόφησης (Kirley, 1989; Getz et al., 1999; Hansen et al., 2007). BH: Το τετραϋδοβορικό νάτριο (NaBH 4 ) χρησιμοποιήθηκε ευρέως στην βιβλιογραφία ως ο καταλληλότερος αναγωγέας των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (Brown, 1960; Calvallini et al., 1966). Το BH έχει το πλεονέκτημα ότι 30

31 απομακρύνεται εύκολα από την αντίδραση με την προσθήκη μόνο ακετόνης ή οξέος επιτρέποντας κατά αυτό τον τρόπο την ταυτόχρονη αντίδραση αναγωγής και ποσοτικοποίησης θειολών στον ίδιο πειραματικό σωλήνα. Όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με το αντιδραστήριο DPS για την ποσοτικοποίηση των θειολών, αποτελεί μια γρήγορη και ευαίσθητη εναλλακτική λύση στα προβλήματα που παρουσιαζόταν με τη μέθοδο DTT-DTNB (Hansen et al., 2007). Όμως, έχει δειχθεί ότι το ποσοστό αναγωγής του BH δεν είναι 100% για όλα τα δισουλφίδια. Πιο συγκεκριμένα, το πρόβλημα παρουσιάζεται στην κυστίνη όπου το ποσοστό αναγωγής της από το BH είναι μόλις 20% (Patsoukis and Georgiou, 2005). TBP: Οι τριαλκυλφοσφίνες ανάγουν τα οργανικά δισουλφίδια σε θειόλες, όπως φαίνεται στην παρακάτω αντίδραση: R 3 P + RSSR + H 2 O R 3 P=O + 2RSH Σε αυτή την ομάδα αναγωγικών παραγόντων συγκαταλέγεται και το tributylphosphine (TBP). Ο χημικός τύπος του TBP φαίνεται στην εικόνα 6 (Krijt et al., 2001). Λόγω της έλλειψης -SH ομάδων στην δομή τους, οι τριαλκυλφοσφίνες δεν αλληλεπιδρούν με άλλα αντιδραστήρια κι έτσι προσφέρονται ως ισχυροί αναγωγικοί παράγοντες. Δεν χρησιμοποιούνται όμως ευρέως διότι είναι τοξικές, χαρακτηρίζονται από δυσάρεστη οσμή, χαμηλή διαλυτότητα σε υδατικά διαλύματα και έντονη πτητικότητα (Ruegg and Rudinger, 1977; Kirley, 1989; Chin and Wold, 1993). Εικόνα 6. Η δομή του TBP. TCEP: Ανήκει και αυτό στις τριαλκυλφοσφίνες (Εικόνα 7A) και προσφέρεται στην θέση του TBP, το οποίο παρουσίαζε τα προβλήματα που προαναφέρθηκαν. Είναι ένας αναγωγικός παράγοντας άοσμος, ισχυρός, υδρόφιλος και πιο ανθεκτικός στην αποθήκευσή του σε σχέση με το TBP που είναι επιρρεπές στην οξείδωση όταν δεν φυλάσσεται σε κατάλληλες συνθήκες (Ruegg and Rudinger, 1977; Krijt et al., 2001). 31