Μελέτη του ρόλου της καταλάσης στις ρίζες ψυχανθών, κατά τον αποικισμό με συμβιωτικά βακτήρια και σε συνθήκες καταπόνησης

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ Μελέτη του ρόλου της καταλάσης στις ρίζες ψυχανθών, κατά τον αποικισμό με συμβιωτικά βακτήρια και σε συνθήκες καταπόνησης Μεταπτυχιακή διατριβή Αναγνωστόπουλου Νικολάου Γεωπόνου Επιβλέπων καθηγητής Πολύδωρος Αλέξιος Επίκουρος Καθηγητής Θεσσαλονίκη 2012

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ Μελέτη του ρόλου της καταλάσης στις ρίζες ψυχανθών, κατά τον αποικισμό με συμβιωτικά βακτήρια και σε συνθήκες καταπόνησης Μεταπτυχιακή διατριβή Αναγνωστόπουλου Νικολάου, Γεωπόνου Εξεταστική Επιτροπή Πολύδωρος Αλέξιος, Επίκουρος Καθηγητής Νιάνιου- Ομπεϊντάτ Ειρήνη, Επίκουρη Καθηγήτρια Μυλωνά Φωτεινή, Ερευνήτρια ΕΛ.Γ.Ο.- Δήμητρα Θεσσαλονίκη 2012

3 Περιεχόμενα ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...5 ABSTRACT...7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ...8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ.9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Oι Ενεργές Μορφές Οξυγόνου και ο Αντιοξειδωτικός Μηχανισμός Ενεργές Μορφές Οξυγόνου (ROS) Ο Αντιοξειδωτικός Μηχανισμός Οι Καταλάσες Ο ρόλος της Μedicago truncatula στη μελέτη των καταπονήσεων H συμβίωση της Medicago truncatula με το Sinorhizobium meliloti Οι Ενεργές Μορφές Οξυγόνου και ο ρόλος τους στη συμβίωση Η συμβολή της τεχνικής του RNAi στη βελτίωση των φυτών 33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχεδιασμός εκκινητών και πολλαπλασιασμός αλληλουχιών DNA Ενσωμάτωση αλληλουχιών στο φορέα phannibal και εισαγωγή σε δεκτικά κύτταρα DH5α Eνσωμάτωση της κασσέτας στο δυαδικό φορέα part27, για την κατασκευή φορέα έκφρασης Μεταμόρφωση βακτηρίων Αgrobacterium rhizogenes Φυτικό υλικό Απολύμανση σπόρων και σπορά Γενετική τροποποίηση των ριζιδίων με μεταμορφωμένα Αgrobacterium rhizogenes Μεταφύτευση και σκληραγώγηση φυταρίων Εμβολιασμός ριζών με αζωτοδεσμευτικά βακτήρια Καταπόνηση φυτών και προσδιορισμός δραστικότητας καταλάσης.58 1

4 3.11. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων 60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έλεγχος ενσωμάτωσης φορέα έκφρασης Μέτρηση του αριθμού των φυματίων Μέτρηση ενεργότητας καταλάσης Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου...73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 76 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 83 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 84 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 91 2

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΒΑ: abscisic acid (αμπσισικό οξύ) ΑΡΧ: ascorbate peroxidase (ασκορβική υπεροξειδάση) ΑΤΡ: adenosine triphosphate (τριφωσφορική αδενοσίνη) CAT: catalase (καταλάση) CbLCV: cabbage leaf curl virus (ιός του καρουλιάσματος των φύλλων του λαχάνου) CCaMK: calcium-and calmodulin-dependent kinase (εξαρτώμενη από το ασβέστιο και την καλμοδουλίνη κινάση) cdna: complementary DNA (συμπληρωματικό DNA) DHAR: dehydroascorbate reductase (αφυδροασκορβική αναγωγάση) DNA: deoxyribonucleic acid (δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ) dsrna: double-stranded RNA (RNA διπλής έλικας) ENOD: Early Nodulation proteins (πρώϊμες ΝΟD πρωτεϊνες) enod: early nodulation genes (γονίδια πρώϊμης φυματινοποίησης) EST: expressed sequence tag (δείκτης εκφραζόμενης αλληλουχίας) GOGAT: Glutamine oxoglutarate aminotransferase (γλουταμική συνθάση) GR: glutathione reductase (αναγωγάση της γλουταθειόνης) GS: Glutamine synthetase (γλουταμινική συνθετάση) GSH : γ-glutamylcysteinylglycine (ανηγμένη μορφή γλουταθειόνης) GST: glutathione S-transferases (γλουταθειόνες S-τρανσφεράσες) GuPX: guaiacol peroxidase (υπεροξειδάση) hprna: hairpin RNA (RNA δομής φουρκέτας) HR: hypersensitive reaction (αντίδραση υπερευαισθησίας) ΗSP: heat shock protein (θερμοπληξιακές πρωτεϊνες) LSD: least significant difference (ελάχιστη σημαντική διαφορά) MDHAR: monodehydroascorbate reductase (μονοαφυδροασκορβική υπεροξειδάση) mirna: microrna (μικρο-rna) NADH: reduced nicotinamide adenine dinucleotide (ανηγμένη μορφή του δινουκλεοτιδίου της νικοτιναμιδικής αδενίνης) NADPH: reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (ανηγμένη μορφή του φωσφορικού δινουκλεοτιδίου της νικοτιναμιδικής αδενίνης) nif-γονίδια: nitrogen fixation genes (αζωτοδεσμευτικά γονίδια) ΝΟ: nitric oxide (μονοξείδιο του αζώτου) 3

6 ΟΝΟΟ - : peroxynitrite (ρίζα του υπεροξυνιτρώδους) PCD: programmed cell death (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) PCR: polymerase chain reaction (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) pdk : pyruvate orthophosphate dikinase (πυροσταφυλική αποκαρβοξυλική κινάση) PDS: phytoene desaturase (αποκορεσμάση του φυτοενίου) PRP: proline rich proteins (πρωτεϊνες πλούσιες σε προλίνη) PTGS: Post-Transcriptional Gene Silencing (Μετα-μεταγραφική γονιδιακή σίγηση) RdDM: RNA directed DNA methylation (RNA-εξαρτώμενη μεθυλίωση DNA) RdRP: RNA- directed RNA Polymerase (RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση) RISC: RNA-induced Silencing Complex (RNA επαγόμενο σύμπλεγμα σίγησης) RNAi: RNA Interference (RNA παρεμβολής) RNS: Reactive Nitrogen Species (Ενεργές μορφές αζώτου) ROS : reactive oxygen species (ενεργές μορφές οξυγόνου) SAR: systemic acquired resistance (επαγόμενη συστημική ανοχή) sirna: small interference RNA (μικρό RNA παρεμβολής) SOD: superoxide dismutase (υπεροξειδική δισμουτάση) SVISS: satellite-virus-induced silencing system (δορυφορικό, ιογενώς επαγόμενο σύστημα σίγησης) TMV: tobacco mosaic virus (ιός του μωσαϊκού του καπνού) UTR: untranslated region (αμετάφραστη περιοχή) VCPG: viral coat protein genes (γονίδια πρωτεϊνών ιικού περιβλήματος) VIGS: virus induced gene silencing (ιογενώς επαγόμενη γονιδιακή σίγηση) 4

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην εγκαθίδρυση της συμβιωτικής αζωτοδέσμευσης, μεταξύ φυτού-βακτηρίου, σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS). Ο έλεγχος των επιπέδων των ROS στα κύτταρα των ριζικών τριχιδίων γίνεται από διάφορα αντιοξειδωτικά ένζυμα και μόρια τόσο του φυτού όσο και του βακτηρίου, μεταξύ των οποίων ιδιαίτερο ρόλο παίζει η καταλάση. Ενώ ο ρόλος της βακτηριακής καταλάσης έχει μελετηθεί εκτεταμένα, δεν συμβαίνει το ίδιο για την καταλάση του φυτού. Σκοπός της παρούσης διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου της καταλάσης του φυτούμοντέλου των ψυχανθών Medicago truncatula, στην εγκαθίδρυση της συμβιωτικής σχέσης με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Sinorhizobium meliloti. Για το σκοπό αυτό έγινε σίγηση του γονιδίου Cat1 της M.truncatula με την εφαρμογή τεχνικών παρεμβατικού RNA, και μελέτη της επίδρασης της σίγησης στην αποίκηση των γενετικά τροποποιημένων ριζών με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο S. meliloti, τόσο σε κανονικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης. Για τη διεξαγωγή του πειράματος αρχικά πολλαπλασιάστηκε με PCR τμήμα αλληλουχίας του cdnα της καταλάσης Cat1 της M. truncatula. Στη συνέχεια έγινε εισαγωγή της αλληλουχίας τόσο με κωδικό όσο και με αντικωδικό προσανατολισμό και σχηματισμός κασσέτας έκφρασης στον ενδιάμεσο φορέα phannibal, ώστε η έκφραση του ενσωματωμένου τμήματος να οδηγήσει στην παραγωγή δίκλωνου RNA. Η κασσέτα κλωνοποιήθηκε στον δυαδικό φορέα part27, με αποτέλεσμα την κατασκευή φορέα έκφρασης, με τον οποίον πραγματοποιήθηκε μεταμόρφωση βακτηρίων Agrobacterium rhizogenes και γενετική τροποποίηση φυτικών κυττάρων. Η μεταμόρφωση των φυτών έγινε με εμβάπτιση ριζών σε εναιώρημα τροποποιημένων βακτηρίων Agrobacterium rhizogenes ώστε να είναι παροδική και περιορισμένη στη ρίζα. Έγιναν μετρήσεις της δραστικότητας της καταλάσης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά και φυτά-μάρτυρες μετά από ωσμωτική καταπόνηση με μαννιτόλη, και μετρήσεις του αριθμού των σχηματισθέντων φυματίων, μετά από ενοφθαλμισμό των ριζών με S.meliloti. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα της καταλάσης παρουσίασε μια τάση μείωσης μετά από εφαρμογή ωσμωτικής καταπόνησης με μαννιτόλη στα διαγονιδιακά φυτά, που ερμηνεύθηκε σαν αποτέλεσμα πιο αποτελεσματικής σίγησης του γονιδίου της καταλάσης στις συνθήκες 5

8 αυτές, ενώ στις ίδιες ομάδες διαγονιδιακών φυτών ο αριθμός των φυματίων ήταν στατιστικά σημαντικά μικρότερος, σε σχέση με τους μάρτυρες. Συμπερασματικά, η μείωση της έκφρασης του γονιδίου της καταλάσης επηρέασε την αποίκηση των ριζοβίων. Ο ρόλος της φυτικής καταλάσης στην εγκαθίδρυση επιτυχούς συμβίωσης φαίνεται ότι είναι σημαντικός, και επηρεάζεται από αβιοτικές καταπονήσεις όπως η ωσμωτική καταπόνηση. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι πιθανόν η φυτική καταλάση να παίζει σημαντικό ρόλο στην επιτυχία αποικισμού των ριζών των ψυχανθών με ριζόβια και μπορεί να αποτελέσει στόχο βελτίωσης ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που είναι δύσκολη η εγκατάσταση των αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων στις καλλιεργούμενες ποικιλίες ψυχανθών φυτών. 6

9 ABSTRACT Reactive oxygen species (ROS) play a crucial role for the establishment of legumerhizobium nitrogen-fixing symbiosis. Several antioxidant genes and especially catalase, from both the plant and the rhizobia, play a desicive role in order to control concentration levels of ROS in root hair cells. While the function of bacterial catalase has been studied thoroughly, the role of plant catalase during symbiosis remains unclear. The aim of this study was to examine the role of catalase of the modellegume Medicago truncatula, for the establishment of nitrogen-fixing relationship between the plant and its microbial partner Sinorhizobium meliloti. For this purpose, the Cat1 gene of M. truncatula was silenced, by using RNA interference (RNAi) techniques. The effects of silencing on the mechanisms engaged in the establishment of symbiosis were measured under normal conditions and under osmotic stress. For the conduction of the experiment, a s pecific cdna sequence of Cat1 M. truncatula was designed and reproduced by PCR techniques. The sequence was then introduced into an intermediate phannibal vector, in both sense and antisense orientation, in order to create a cassette, able to encode for a dsrna molecule. The cassette was cloned into the binary vector part27, resulting in the construction of an expression vector, able to transform bacteria of the Agrobacterium rhizogenes species and genetically modify plant cells. Gene silencing of catalase was achieved by using the RNAi technique, conducting hairy root transformation with Α.rhizogenes, aiming to transform exclusively and transiently root cells. The number of nodules in transiently transgenic and wild type plants, used as controls, was measured. Catalase specific activity, under mannitol-caused osmotic stress, was also measured. The results of this study showed that catalase activity was in lower levels, after treatment of transiently transgenic plants with mannitol. The levels of catalase activity could be explained, as a result of a more efficient silencing of catalase gene, under the given conditions of osmotic stress, while in the same transgenic plants, the number of nodules was significantly lower, in comparison with the negative and the wild type controls. In conclusion, the results show that the role of plant catalase for the establishment of a successful nitrogen-fixing relationship seems to be of major importance and could be used as a breeding goal, especially when there is difficulty in inoculating rhizobia to cultivated legumes. 7

10 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστώ θερμά τον επίκουρο καθηγητή κ. Αλέξιο Πολύδωρο, επιβλέποντα της διατριβής μου, για την ανάθεση του θέματος, την εμπιστοσύνη, την υπομονή, την πολύτιμη και πολύπλευρη βοήθεια και καθοδήγηση σε όλα τα στάδια της διατριβής. Την ερευνήτρια του ΕΛΓΟ-Δήμητρα, κ. Φωτεινή Μυλωνά, για την ουσιαστική συμβολή της στην επιτυχή έκβαση του πειράματος, καθώς και για τις συμβουλές της. Την επίκουρη καθηγήτρια κ. Ειρήνη Νιάνιου-Ομπεϊντάτ, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και διορθώσεις του κειμένου. Επιπλέον, τον ερευνητή του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας κ. Παναγιώτη Μαδέση, για την πολύ καθοριστική συμβολή του στην ολοκλήρωση του μοριακού σκέλους του πειράματος. Τον καθηγητή Ζιζανιολογίας κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό ευχαριστώ θερμά, για τις συμβουλές, την ηθική συμπαράσταση και το αμείωτο ενδιαφέρον του. Τον καθηγητή Ανθοκομίας κ. Αθανάσιο Οικονόμου, για την ευγενή παραχώρηση των εγκαταστάσεων του Εργαστηρίου Ανθοκομίας, για τον εγκλιματισμό του φυτικού υλικού. Επιπλέον, τον ομότιμο καθηγητή Γενετικής κ. Απόστολο Φασούλα, την καθηγήτρια κ. Μεταξία Κούτσικα-Σωτηρίου, τον καθηγητή κ. Δημήτριο Ρουπακιά και την καθηγήτρια κ. Ελένη-Ίσιδα Κωνσταντινίδου, για τις γνώσεις που μου μετέδωσαν και για το ενδιαφέρον τους. Τον ΙΔΑΧ Στέφανο Κώστα, για την προθυμία και τη βοήθειά του, κατά το χρόνο παραμονής των φυτών στο θερμοκήπιο της Ανθοκομίας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα, τους γονείς και τον αδερφό μου, για την υπομονή, την κατανόηση, τη θερμή στήριξη και το κουράγιο τους. Το γεωπόνο και συνάδελφο Ευστάθιο Καπούλα, για τη συμμετοχή του σε κρίσιμα στάδια του πειράματος, καθώς και για την αλληλεγγύη και τη βοήθειά του στις δύσκολες στιγμές του μεταπτυχιακού. Τον γεωπόνο ΜSc Ευστάθιο Ευθυμιάδη, για τις χρήσιμες συμβουλές, τις γόνιμες συζητήσεις και τη συμπαράστασή του. Τον γεωπόνο ΜSc και υποψήφιο διδάκτορα του Πανεπιστημίου του Wageningen Χρήστο Κισσούδη, για τη σημαντική βοήθειά του, κατά τη φάση προσαρμογής στο μεταπτυχιακό. Τον γεωπόνο και υποψήφιο διδάκτορα Ζιζανιολογίας Αριστείδη Παπαπαναγιώτου, για το ειλικρινές και συνεχές ενδιαφέρον του. Τη φιλόλογο και MSc του Πανεπιστημίου Paul Valéry του Montpellier Λουΐζα Χριστοδούλου, για την υπομονή και τη συμπαράστασή της. Τέλος, όλους τους φίλους και συναδέλφους, για την αλληλεγγύη και την αισιοδοξία τους, κατά τις δύσκολες εποχές που διανύουμε. 8

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ραγδαία αύξηση του πληθυσμού της γης οδήγησε τους επιστήμονες της Γενετικής Βελτίωσης Φυτών απέναντι στην πρόκληση της δημιουργίας παραγωγικότερων και ταυτόχρονα ποιοτικών ποικιλιών. Ωστόσο, η παραγωγή αυτή συνεπάγεται την αύξηση των εισροών. Μια από τις σημαντικότερες εισροές στη σύγχρονη γεωργία είναι η εφαρμογή λιπασμάτων και ειδικότερα αζωτούχων. Σημαντικές καλλιέργειες, όπως τα σιτηρά, το βαμβάκι και η τομάτα χαρακτηρίζονται από αυξημένες απαιτήσεις σε άζωτο, σε όλα τα στάδια της ανάπτυξής τους. Η μονοκαλλιέργεια και η εγκατάλειψη της αγρανάπαυσης, δεν επιτρέπουν την αναπλήρωση του αζώτου που αφαιρείται κατά τη συγκομιδή του προϊόντος, με αποτέλεσμα να καθίσταται αναγκαία η προσθήκη στο έδαφος μεγάλων ποσοτήτων του θρεπτικού αυτού στοιχείου, με τη μορφή αμμωνιακών ή νιτρικών λιπασμάτων. Σε αντίθεση με τα περισσότερα καλλιεργούμενα είδη, μια ομάδα φυτών, τα ψυχανθή, ανέπτυξε κατά τη διάρκεια της εξελικτικής της πορείας, συμβιωτική σχέση με βακτήρια του εδάφους που έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν άζωτο από την ατμόσφαιρα. Στα πλαίσια της αμοιβαία ωφέλιμης αυτής σχέσης, παρέχεται άζωτο στο φυτό και φωτοσυνθετικά προϊόντα, κυρίως σάκχαρα, στο βακτήριο. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της σχέσης αυτής είναι ο σχηματισμός ενός διακριτού οργάνου, που ονομάζεται φυμάτιο. Το φαινόμενο της συμβίωσης χαρακτηρίζεται από εξαιρετική πολυπλοκότητα. Στην εγκαθίδρυση της συμβιωτικής αυτής σχέσης εμπλέκεται ένας μεγάλος αριθμός μοριακών μηχανισμών, όπου κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζουν οι ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species: ROS). Το φυτό αντιλαμβάνεται αρχικά το βακτήριο ως πιθανό εισβολέα και για το σκοπό αυτό υπερσυσσωρεύει ROS στα κύτταρα των ριζών. Ωστόσο, το βακτήριο, με την ενεργοποίηση των δικών του μηχανισμών, επιτυγχάνει την αδρανοποίηση των αμυντικών μηχανισμών του ξενιστή. Παράλληλα, ένα πολύπλοκο σύστημα αλληλεπιδράσεων φυτού-βακτηρίου, περιορίζει 9

12 τα επίπεδα συγκέντρωσης των ROS με τρόπο, ώστε να αναπτυχθεί τελικά επιτυχής συμβιωτική σχέση. Καθοριστικό ρόλο στον έλεγχο των επιπέδων των ROS στα κύτταρα των φυματίων παίζουν τα διάφορα αντιοξειδωτικά ένζυμα που διαθέτουν, τόσο το φυτό, όσο και το βακτήριο. Ειδικότερα, η καταλάση εκκαθαρίζει την περίσσεια του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), χωρίς τη χρήση αναγωγικού μέσου, ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό τη συγκέντρωσή του στα κύτταρα. Η αντιοξειδωτική δράση της καταλάσης επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, μεταξύ των οποίων και οι αβιοτικές καταπονήσεις. Για την πληρέστερη κατανόηση του ρόλου της καταλάσης, αξιοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια τεχνικές αντίστροφης γενετικής (Reverse Genetics), κατά τις οποίες επιτυγχάνεται παρεμβολή στην έκφραση του γονιδίου και στη συνέχεια καταγράφονται οι αντιδράσεις και οι προσαρμογές του φυτού στη μεταβολή αυτή. Μια από τις πιο διαδεδομένες τεχνικές είναι η χρήση του παρεμβατικού RNA (RNA Interference, RNAi), κατά την οποία προκαλείται σίγηση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας, μέσω της εισαγωγής στο γονιδίωμα, ενός μορίου δίκλωνου RNA, το οποίο έχει την ικανότητα να αναγνωρίζεται από ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών RISC και να οδηγείται στο mrna του γονιδίου-στόχου, το οποίο αποικοδομείται, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο τη μετάφρασή του. Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου της καταλάσης του φυτού Medicago truncatula στη συμβιωτική διαδικασία. Πιο συγκεκριμένα, με την εφαρμογή τεχνικών παρεμβατικού RNA, επιτεύχθηκε σίγηση της καταλάσης και μελετήθηκε η επίδραση της σίγησης στην εγκαθίδρυση συμβιωτικής σχέσης με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Sinorhizobium meliloti, σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης. 10

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 2.1.Oι Ενεργές Μορφές Οξυγόνου και ο Αντιοξειδωτικός Μηχανισμός Ενεργές Μορφές Οξυγόνου Τα φυτά, όπως όλοι οι αερόβιοι οργανισμοί, χρησιμοποιούν το μοριακό οξυγόνο στις διάφορες μεταβολικές διεργασίες που αποσκοπούν στην παραγωγή ενέργειας. Για την πλήρη αναγωγή του, το οξυγόνο απαιτεί συνολικά 4 ηλεκτρόνια, τα οποία ωστόσο δεν μπορεί να προσλάβει ταυτόχρονα, αλλά ένα τη φορά, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενδιάμεσων, ενεργών μορφών οξυγόνου, σύμφωνα με την αντίδραση: 1 O 2 UV, hv e - e - e - e - e - O 2 Ο 2 - H 2 O 2 HO - + OH 2H 2 O 2H + 2H + Η πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδίου (Ο 2 - ), η οποία με πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου σχηματίζει το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και τέλος η πρόσληψη ενός ακόμη e - οδηγεί στην παραγωγή της υδροξυλικής ρίζας (ΗΟ ) (Mittler, 2002; Scandalios, 2005). Ο σχηματισμός των ενεργών μορφών οξυγόνου οφείλεται τόσο σε ενδογενείς, όσο και σε εξωγενείς παράγοντες. Οι ενδογενείς παράγοντες είναι διεργασίες, οι οποίες συμβαίνουν φυσιολογικά στα φυτικά κύτταρα (Glyan ko και Vasil eva, 2010). Η ρίζα του υπεροξειδίου παράγεται στα μιτοχόνδρια, κατά τη λειτουργία της αναπνοής, ως αποτέλεσμα της ροής ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου προκύπτει κατά την πρόσληψη ενός νέου ηλεκτρονίου, ενώ πρόσθετες ποσότητές του παράγονται σε ενζυμικές καταβολικές αντιδράσεις, στη διάσπαση των λιπαρών οξέων στα υπεροξεισωμάτια, καθώς και στις αντιδράσεις της φωτοαναπνοής. Τέλος, η υδροξυλική ρίζα παράγεται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου, σύμφωνα με την 11

14 αντίδραση Fenton: Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + HO + OH -. Η ατελής αναγωγή του οξυγόνου στους χλωροπλάστες και η φυσιολογική γήρανση συγκαταλέγονται επίσης στους ενδογενείς παράγοντες που συμβάλλουν στη συσσώρευση ROS στα κύτταρα (Scandalios, 2005; Bartels και Sunkar, 2005; Parida και Das, 2005; Jithesh κ.ά., 2006). Στους εξωγενείς παράγοντες ανήκουν η υπεριώδης ακτινοβολία, τα βαρέα μέταλλα (Mylona κ.ά., 1998; Xu κ.ά., 2010), η ξηρασία (Zahran, 1999; Wang κ.ά., 2009), η αλατότητα (Bartels και Sunkar, 2005; Parida και Das, 2005; Jithesh κ.ά., 2006), οι ατμοσφαιρικοί ρύποι, όπως το Ο 3 (Kangasjärvi κ.ά., 1994; Sharma and Davis, 1997; Puckette κ.ά., 2007; Puckette κ.ά., 2009) και οι ξενοβιοτικές ουσίες (Mylona κ.ά., 2007) στην επίδραση των οποίων εκτίθενται τα φυτά. Οι εξωγενείς παράγοντες φαίνεται ότι υποκαθιστούν τη φυσιολογική μεταφορά σημάτων, μέσω των οξειδοαναγωγικών διαταραχών που προκαλούν σε διάφορους μοριακούς στόχους (Scandalios, 1997b; Scandalios, 2005). Συσσώρευση ROS στα φυτικά κύτταρα παρατηρείται στις μυκόρριζες, καθώς και στα φυμάτια, κατά τη διάρκεια της συμβίωσης φυτού-ριζοβίου, ως αντίδραση του ξενιστή στον εισβολέα (Cook κ.ά., 1995; Jamet κ.ά., 2007; Larrainzar κ.ά., 2007; Chang κ.ά., 2009). Kατά την ανάπτυξη συμβιωτικής σχέσης μεταξύ του καπνού (Nicotiana tabaccum) και του μύκητα Glomus mosseae, η πρώτη αντίδραση του φυτού στην εισβολή του μικροοργανισμού περιλαμβάνει την ενεργοποίηση αμυντικών μηχανισμών και την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση αντιοξειδωτικών ενζύμων (Blilou, 2000). Ωστόσο οι ενεργές μορφές οξυγόνου και ειδικότερα το H 2 O 2 και το Ο 2 - ενδέχεται να μην σχετίζονται αποκλειστικά με την άμυνα του φυτού απέναντι στο συμβιωτικό βακτήριο, αλλά να εμπλέκονται σε διάφορα στάδια της φυματιοποίησης (Jamet κ.ά., 2007; Chang κ.ά., 2009). Το τελικό αποτέλεσμα της επίδρασης των προαναφερθέντων ενδογενών και εξωγενών παραγόντων στα κύτταρα είναι η επαγωγή οξειδωτικής καταπόνησης, η οποία ορίζεται ως το σύνολο των βλαβών που προκαλούνται στη δομή και τη λειτουργία του κυττάρου, λόγω υπερσυσσώρευσης ενεργών μορφών οξυγόνου (Mittler, 2002;Vinocur και Altman, 2005). Οι ROS είναι ισχυρά οξειδωτικές και προκαλούν μια σειρά από σοβαρές βλάβες, προσβάλλοντας λιπίδια, φαινόλες, σάκχαρα, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Η υπεροξείδωση των ακόρεστων λιπιδίων, που αποτελούν βασικά δομικά στοιχεία των κυτταρικών μεμβρανών, έχει ως αποτέλεσμα τη διάρρηξη των μεμβρανών και τον κυτταρικό θάνατο, λόγω εκροής 12

15 συστατικών του κυττάρου. Οι βλάβες που προκαλούνται από τις ROS σε ένζυμα και πρωτεΐνες οδηγούν σε διάσπαση χρωστικών, σε μείωση της φωτοσυνθετικής και αναπνευστικής ικανότητας και στη γήρανση. Επιπλέον, η συνεχής και έντονη οξειδωτική καταπόνηση του κυττάρου έχει ως αποτέλεσμα την αποδόμηση των αζωτούχων βάσεων του DNA, λόγω ρήξης των φωσφοδιεστερικών δεσμών, γεγονός που επιφέρει την πρόκληση μεταλλάξεων στο γενετικό υλικό (Mittler, 2002) Ο Αντιοξειδωτικός Μηχανισμός Για την εξουδετέρωση των ROS και την αντιμετώπιση των προαναφερθεισών δυσμενών επιπτώσεων στη φυσιολογική λειτουργία τους, τα φυτά έχουν αναπτύξει ένα σύνθετο αντιοξειδωτικό αμυντικό μηχανισμό, στον οποίον περιλαμβάνονται μη ενζυμικά μόρια, καθώς και διάφορα ένζυμα. Στον μη ενζυμικό αντιοξειδωτικό μηχανισμό ανήκουν η ανηγμένη μορφή της γλουταθειόνης (GSH), η οποία είναι ένα τριπεπτίδιο αποτελούμενο από γλουταμικό οξύ, γλυκίνη και κυστεΐνη, το ασκορβικό οξύ (Βιταμίνη C), η a-τοκοφερόλη (Βιταμίνη Ε), οι πολυαμίνες, τα φλαβονοειδή, τα καροτενοειδή, καθώς και άλλα προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού. Τα σημαντικότερα ένζυμα που διαθέτουν αντιοξειδωτική δράση είναι η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση (CAT), η υπεροξειδάση (GuPX), η ασκορβική υπεροξειδάση (ΑΡΧ), η μονοαφυδροασκορβική αναγωγάση (MDHAR), η αφυδροασκορβική αναγωγάση (DHAR), η αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR) και οι γλουταθειόνες S-τρανσφεράσες (GST). Στον παρακάτω Πίνακα 2.1, φαίνεται η θέση των ενζύμων μέσα στο κύτταρο και ο επίσημος κωδικός αριθμός (EC), με τον οποίο συμβολίζονται διεθνώς. 13

16 Ένζυμο Κωδικός Ενδοκυτταρική θέση Ασκορβική υπεροξειδάση (APX) Υπεροξειδάσες (μη-ειδικές) (POX) Καταλάση (CAT) Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Αφυδροασκορβική αναγωγάση (DHAR) Αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR) Μονοαφυδροασκορβική αναγωγάση (MDHAR) Γλουταθειόνες S-τρανσφεράσες (GST) Πλαστιδικό στρώμα,μεμβράνες Κυτταροδιάλυμα, Κυττ.τοίχωμα Γλυοξυσωμάτια,υπεροξεισωμάτια,μιτοχόνδρια,κυτταροδιάλυμα Κυτταροδιάλυμα (Cu/ZnSOD) Πλαστίδια (Cu/ZnSOD,FeSOD) Mιτοχόνδρια (MnSOD),υπεροξεισωμάτια, Βακτηριοειδή (κυρίως Cu/ZnSOD και MnSOD) Κυτταροδιάλυμα, πλαστίδια Μιτοχόνδρια, κυτταροδιάλυμα, Πλαστίδια Πλαστιδικό στρώμα Κυτταροδιάλυμα, μικροσωμάτια Πίνακας 2.1. Αντιοξειδωτικά ένζυμα, κωδικός αριθμός (ΕC) και ενδοκυτταρική θέση Οι Καταλάσες Η καταλάση (CAT ; H 2 O 2 : H 2 O 2 οξειδοαναγωγάση ; EC ) είναι ένα ένζυμο, το οποίο απαντάται σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς (Zámocký και Koller, 1999). Στα φυτικά κύτταρα αποτελείται από 4 όμοιες υπομονάδες, με μοριακή μάζα 240 kd (Matamoros κ.ά., 2003; Scandalios, 2005). Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια πορφυρινική προσθετική ομάδα, την αίμη, η οποία έχει την ικανότητα να δεσμεύει το O 2. Η καταλάση σε χαμηλές συγκεντρώσεις H 2 O 2 οξειδώνει ουσίες, όπως το ασκορβικό οξύ και η αιθανόλη, με δράση παρόμοια με αυτήν της υπεροξειδάσης (Zámocký και Koller, 1999; Scandalios, 2005). Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου, σύμφωνα με την ακόλουθη αντίδραση : H 2 O 2 + H 2 O 2 2 Η 2 Ο + Ο 2. Παρά τη χαμηλή συγγένεια της προς το υπεροξείδιο του υδρογόνου και την παρουσία της σχεδόν αποκλειστικά εντός των μικροσωματίων, η καταλάση αποτελεί ζωτικής σημασίας αντιοξειδωτικό ένζυμο, καθώς, όταν βρίσκει μεγάλες 14

17 συγκεντρώσεις H 2 O 2 το διασπά με μεγάλη ταχύτητα, χωρίς να απαιτείται η συμμετοχή κάποιου αναγωγικού μέσου (Scandalios κ.ά., 1997b; Mittler, 2002; Minchin κ.ά., 2008). Με τον τρόπο αυτό, μπορεί πολύ γρήγορα να αποικοδομήσει μεγάλες ποσότητες H 2 O 2, αποτοξινώνοντας το κύτταρο. Με τη σειρά του, το κύτταρο εξοικονομεί ενέργεια, την οποία αξιοποιεί σε άλλες αντιδράσεις του μεταβολισμού, απαραίτητες για την αντιμετώπιση των διαφόρων καταπονήσεων, ενώ παράλληλα διατηρεί την οξειδοαναγωγική ισορροπία του, κατά τη διάρκεια της οξειδωτικής καταπόνησης (Willekens κ.ά., 1997; Scandalios, 2005). Στους ζωϊκούς οργανισμούς, απαντάται συνήθως μια ισομορφή καταλάσης, η οποία βιοσυντίθεται στα υπεροξεισωμάτια όλων των κυττάρων. Υψηλότερη συγκέντρωση παρατηρείται στο ήπαρ και τους νεφρούς, ενώ έχει εντοπιστεί και στα μιτοχόνδρια της καρδιάς (Zámocký και Koller, 1999). Αντίθετα, στα φυτά, διαπιστώνεται η ύπαρξη περισσοτέρων ισομορφών, οι οποίες κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και κατά κανόνα εντοπίζονται στα υπεροξεισωμάτια των φύλλων και στα γλυοξυσωμάτια των βλαστανόντων σπόρων, ενώ σχεδόν απουσιάζουν από τους χλωροπλάστες (Guan και Scandalios, 1996; Mittler, 2002). Στο ψυχανθές Medicago truncatula πιθανόν ανιχνεύονται δύο ισομορφές του ενζύμου (Polidoros κ.ά., 2003). Στη ρετσινολαδιά (Ricinus communis ) απαντώνται δύο ισοένζυμα, τα οποία παράγονται κατά την έκφραση των γονιδίων cat1 και cat2 (Suzuki κ.ά., 1994). Στο καλαμπόκι (Zea mays), αλλά και στα είδη Nicotiana tabaccum και Nicotiana plumbaginifolia, η έκφραση τριών ασύνδετων γονιδίων, cat1, cat2 και cat3 είναι υπεύθυνη για την παραγωγή των ισοενζύμων CAT1, CAT2 και CAT3 αντίστοιχα. Τα τρία ισοένζυμα παρουσιάζουν εξειδίκευση ως προς τη θέση τους εντός των ιστών και ως προς το στάδιο ανάπτυξης του φυτού (Roupakias κ.ά., 1980; Scandalios, 1983; Willekens κ.ά., 1994; Polidoros και Scandalios, 1999). Στην περίπτωση του καλαμποκιού, η CAT1 παρουσιάζει ομοιότητες με τις βακτηριακές καταλάσες και παράγεται στο σπόρο, κατά τα πρώτα στάδια της βλάστησής του, ενώ η βιοσύνθεση της CAT2 πραγματοποιείται στο ασπίδιο (κοτυληδόνα) και αυξάνεται δύο ημέρες μετά την έναρξη απορρόφησης του ενδοσπερμίου. Όσον αφορά στην CAT3, παρατηρείται σε μικρές ποσότητες, κυρίως στο βλαστό (Guan και Scandalios, 1996; Scandalios κ.ά., 2000; Mylona κ.ά., 2007). Τέλος, στο φυτό Arabidopsis thaliana εντοπίζονται 3 ώριμα μόρια, η βιοσύνθεση των οποίων ελέγχεται από 3 διαφορετικά γονίδια (Robertson McClung, 1997; Jithesh κ.ά., 2006). 15

18 Τα διάφορα είδη των καταπονήσεων επάγουν την αυξημένη έκφραση των γονιδίων των καταλασών. Σε μεταλλάγματα καλαμποκιού παρατηρείται υπερέκφραση των γονιδίων cat1 και cat2 σε αυξημένες συγκεντρώσεις H 2 O 2 (Guan κ.ά., 1996; Polidoros και Scandalios, 1999). Σε έμβρυα σπόρων και σε φύλλα μεταλλαγμάτων καλαμποκιού, η έκφραση των γονιδίων cat1, cat2 και cat3 αυξάνεται παρουσία αρσενικού (Mylona κ.ά., 1998). Σε φυτά μηδικής (Medicago sativa), κατά την έκθεσή τους σε συνθήκες αλατότητας και ξηρασίας, διαπιστώνεται αυξημένη παραγωγή καταλάσης, καθώς και άλλων ενζύμων με αντιοξειδωτική δράση (Wang κ.ά., 2009).Ο Ashraf κ.ά. (2009) αναφέρει ότι, σε διαγονιδιακά φυτά καπνού (Nicotiana tabaccum), η εισαγωγή του βακτηριακού γονιδίου kate οδηγεί σε υπερπαραγωγή της καταλάσης, με αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη αντοχή του μεταφραστικού μηχανισμού του χλωροπλάστη σε καταπόνηση από άλατα. Στο σιτάρι παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας της καταλάσης, τόσο σε ανθεκτικά όσο και σε ευαίσθητα στην αλατότητα φυτά (Ashraf κ.ά., 2009). Αντίθετα, σε αλόφυτα που ανήκουν στα γένη Crithmum, Avicennia και Bruguiera παρατηρείται μείωση της ενεργότητας των καταλασών, κατά τη διάρκεια καταπόνησης από υπερσυγκέντρωση αλάτων (Parida κ.ά., 2004; Jithesh κ.ά., 2006). Επιπλέον, στην τομάτα διαπιστώνεται μειωμένη δράση του ενζύμου σε φυτά ανθεκτικά στην αλατότητα (Ashraf κ.ά., 2009). Oι φυτικές καταλάσες, με βάση τη φυλογενετική τους προέλευση, κατατάσσονται σε τρεις ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει καταλάσες τόσο των μονοκοτυληδόνων, όσο και των δικοτυληδόνων, οι οποίες εμπλέκονται στη φωτοαναπνοή και σε λειτουργίες των γλυοξυσωματίων (Scandalios κ.ά., 1997a). Στη δεύτερη ομάδα ανήκουν καταλάσες που βιοσυντίθενται ως επί το πλείστον σε δικοτυλήδονα φυτά και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίδραση των φυτών σε οξειδωτικό stress που οφείλεται σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις (Willekens κ.ά., 1994; Jithesh κ.ά., 2006). Τέλος, η τρίτη ομάδα αποτελείται από καταλάσες που απαντώνται στα μονοκοτυλήδονα. Φυλογενετικές αναλύσεις δείχνουν ότι τα ένζυμα της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν την Cat1 του ρυζιού, την Cat2 του κριθαριού και την Cat3 του καλαμποκιού (Scandalios κ.ά., 1997a). Εκτός από τους φυτικούς οργανισμούς, ισοενζυμικές μορφές της καταλάσης, ελεγχόμενες από διαφορετικά γονίδια, βιοσυνθέτουν και τα συμβιωτικά βακτήρια (Hérouart κ.ά., 1996; Jamet κ.ά., 2007). Οι βακτηριακές καταλάσες έχουν δομή παρόμοια με αυτές των φυτών, αλλά μικρότερη μοριακή μάζα (63 kd) (Μatamoros κ.ά., 2003). Στο Sinorhizobium meliloti, απαντώνται τα γονίδια kata, katb και katc, 16

19 τα οποία κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση των καταλασών KatA, KatB και KatC αντίστοιχα (Hérouart κ.ά., 1996; Sigaud κ.ά., 1999; Chang κ.ά., 2009). Κατά τη διάρκεια της συμβίωσης, τα γονίδια των καταλασών εκφράζονται σε μεγαλύτερο βαθμό, από ό,τι στην περίπτωση, κατά την οποία τα βακτήρια αναπτύσσονται ελεύθερα στο έδαφος, όπως διαπιστώνεται στα είδη Rhizobium leguminosarum ssp. phaseoli, Rhizobium japonicum (Hérouart κ.ά., 1996; del Carmen Vargas κ.ά., 2003). Οι καταλάσες, διαδραματίζουν προστατευτικό ρόλο στα σχηματιζόμενα βακτηριοειδή και εξασφαλίζουν τη διατήρηση της αζωτοδεσμευτικής ικανότητας των φυματίων (Sigaud κ.ά., 1999) Ο ρόλος της Μedicago truncatula στη μελέτη των καταπονήσεων Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αυξημένο ενδιαφέρον των ερευνητών ανά τον κόσμο για τη μελέτη της αντοχής των φυτών στις διάφορες αβιοτικές καταπονήσεις και καταβάλλονται σημαντικές προσπάθειες για τον εντοπισμό των γονιδίων που σχετίζονται με αυτήν (Bartels και Sunkar, 2005). Η έκθεση των φυτών σε συνθήκες καταπόνησης, όπως η αλατότητα και η ξηρασία οδηγεί σε σημαντική μείωση της παραγωγικότητας, που αποτελεί ένα μείζον πρόβλημα των καλλιεργειών (Zahran, 1999; Vinocur και Altman, 2005; Jithesh κ.ά., 2006; Merchan κ.ά., 2007; FAO, 2009). Οι γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που ενεργοποιούνται σε πολλά φυτικά είδη κατά τη διάρκεια των καταπονήσεων αυτών είναι σε μεγάλο βαθμό περιορισμένες. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι, σε αντίθεση με την αντίδραση των φυτών σε προσβολές από παθογόνα, στις αβιοτικές καταπονήσεις, οι μηχανισμοί με τους οποίους προσπαθούν να τις αντιμετωπίσουν είναι σύνθετοι και ελέγχονται από πολλά γονίδια, γεγονός που καθιστά δύσκολη τη μελέτη τους (Vinocur και Altman, 2005). Για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών αυτών, χρησιμοποιούνται φυτάπρότυπα, τα οποία διευκολύνουν τη μελέτη τους. Το είδος Mesembryanthemum crystallinum, ένα C 3 /CAM αλόφυτο, χρησιμοποιείται ως φυτό-μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης της αλατότητας στα φυτά (Vinocur και Altman, 2005). Η μελέτη του γλυκοφύτου Arabidopsis thaliana, το οποίο δεν είναι προσαρμοσμένο σε συνθήκες αλατότητας και ξηρασίας, βρίσκει πολλές εφαρμογές στην κατανόηση των 17

20 μηχανισμών αντίδρασης των φυτών αυτής της ομάδας, σε μοριακό επίπεδο (Vinocur και Altman, 2005). Η Μedicago truncatula είναι ένα ετήσιο, διπλοειδές αυτογονιμοποιούμενο (>95%) ψυχανθές, το οποίο ανήκει στην υποοικογένεια των Galegoids και παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την τετραπλοειδή μηδική (Medicago sativa). Ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του λοβού, διακρίνεται σε τρία υποείδη, τα ssp. truncatula, ssp. tricycla και ssp. longeaculata (Bataillon και Ronfort, 2006). Είναι αυτοφυές φυτό της Μεσογείου (Akritidis κ.ά., 2009), αν και σχετικά πρόσφατα μεταφέρθηκε στην Αυστραλία, όπου και καλλιεργείται συστηματικά. Χρησιμοποιείται ως κτηνοτροφικό φυτό, ενώ επίσης αξιοποιείται στη βελτίωση της ποιότητας και της δομής του εδάφους, στην αποτροπή της διάβρωσης σε επικλινή εδάφη, καθώς και στον έλεγχο των ζιζανίων (Nair κ.ά., 2006). Η Μedicago truncatula διαθέτει ένα σχετικά μικρό γένωμα (2n=2x=16), το οποίο αποτελείται από εκατομμύρια ζεύγη βάσεων και είναι πλούσιο σε ευχρωματίνη. Κατά την παχυταινία, η ετεροχρωματίνη εμφανίζεται σε χωριστές περιοχές με αποτέλεσμα να καθίσταται ευκολότερη η μελέτη και η αλληλούχηση του γενώματός της (Franssen και Geurts, 2007), μια διαδικασία που ξεκίνησε το 2002 (Young κ.ά., 2005 ; Young και Udvardi, 2009). Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του φυτού είναι η γενωμική συντήρηση, η οποία παρέχει τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για τη συμπεριφορά και των υπολοίπων ψυχανθών, των οποίων η σπουδαιότητα όσον αφορά στην αζωτοδεσμευτική τους ικανότητα και στην υψηλή διατροφική τους αξία, είναι γενικώς αναγνωρισμένη (Cook, 1999; Choi κ.ά., 2004). Σημαντικό πλεονέκτημα για τη μελέτη των αντιοξειδωτικών μηχανισμών αποτελεί η ικανότητα της Μedicago truncatula να συμβιώνει τόσο με μύκητες, όσο και με βακτήρια. Συγκεκριμένα, αναπτύσσει μυκόρριζες με το Glomus mosseae και το Glomus intraradices, καθώς επίσης και φυμάτια με το είδος Sinorhizobium meliloti (Rawsthorne κ.ά., 1980; Αrmager, 2001). H ανάπτυξη συμβιωτικών μυκορριζών και φυματίων προάγει την ανθεκτικότητα του φυτού σε ποικίλες καταπονήσεις (Sigaud κ.ά., 1999; Gianinazzi-Pearson κ.ά., 2006), προσφέρει αντοχή στο ωσμωτικό stress που προκαλείται από την έλλειψη νερού (Ruiz-Lozano, 2003) και επάγει τη δράση διαφόρων αντιοξειδωτικών ενζύμων, μεταξύ των οποίων και της καταλάσης (Hause και Fester, 2005). Όσον αφορά στη συμπεριφορά της σε συνθήκες καταπόνησης, η Μedicago truncatula θεωρείται σχετικά ανθεκτική στην ξηρασία και μετρίως ανθεκτική στην 18

21 αλατότητα, σε αντίθεση με άλλα ψυχανθή όπως το μπιζέλι και η σόγια (González κ.ά., 1998; Gálvez κ.ά., 2005). Αντίθετα, σε συνθήκες ψύχους δεν εμφανίζει αντοχή (Brandsaeter κ.ά., 2002). Οι μηχανισμοί που συνδέονται με την αντίδρασή της δεν έχουν διαλευκανθεί πλήρως μέχρι σήμερα (Merchan κ.ά., 2007; González κ.ά., 2007). Η εκτενής μελέτη της συμπεριφοράς της Μedicago truncatula κάτω από διάφορες συνθήκες καταπόνησης αναμένεται να προσφέρει σημαντικές πληροφορίες για τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας και των υπόλοιπων ψυχανθών (Rispail κ.ά., 2009). Σε αντίθεση με τις καταλάσες του συμβιωτικού βακτηρίου Sinorhizobium meliloti, οι ισομορφές της καταλάσης στη Μedicago truncatula δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς (Hérouart κ.ά., 1996; Sigaud κ.ά., 1999; Polidoros κ.ά., 2003; Chang κ.ά., 2009). Πληροφορίες για το cdna της καταλάσης της M.truncatula αντλήθηκαν από τη βάση δεδομένων TIGR Plant Transcript Assemblies ( plantta.jcvi.org/), στην οποία βρίσκονται καταχωρημένοι κλώνοι του cdna διαφόρων ενζύμων και μεταγραφόμενων αλληλουχιών. Από τους υπάρχοντες κλώνους, μόνο ένα EST (Expressed Sequence Tag) αντιστοιχούσε στο πλήρες μήκος του cdna της καταλάσης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) Η συμβίωση της Medicago truncatula με το Sinorhizobium meliloti Παρά το γεγονός ότι η ατμόσφαιρα περιέχει μεγάλα αποθέματα αζώτου (78% περιεκτικότητα κατ όγκο), στα περισσότερα οικοσυστήματα η αύξηση των φυτών είναι περιορισμένη, λόγω της χαμηλής διαθεσιμότητας των προσλήψιμων μορφών Ν και δεδομένης της αδυναμίας τους να προσλαμβάνουν μοριακό άζωτο απευθείας από την ατμόσφαιρα. Την ικανότητα πρόσληψης ατμοσφαιρικού Ν διαθέτει μια μικρή μόνον ομάδα προκαρυωτικών οργανισμών, στην οποία ανήκουν είδη βακτηρίων, ακτινομυκήτων και κυανοπράσινων φυκών, πολλά από τα οποία αναπτύσσουν συμβιωτικές σχέσεις με φυτά. Μια οικογένεια αρνητικών κατά Gram αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων, που ονομάζονται ριζόβια, έχουν την ικανότητα, σε εδάφη με χαμηλή διαθεσιμότητα αζώτου, να συμβιώνουν με ψυχανθή (Sprent, 2008; Graham, 2008). Ειδικότερα το γένος Sinorhizobium συμβιώνει εκλεκτικά με ορισμένα είδη ψυχανθών όπως Medicago, Melilotus κ.ά. (Πίνακας 2.2). Η σχέση αυτή ευνοείται από τη παρουσία μυκορριζών (Chalk κ.ά., 2006), στοιχείων όπως Co, Mg, Mo, Ca, Fe και παρουσιάζει μεγάλη εξειδίκευση, γεγονός που οδηγεί στο 19

22 συμπέρασμα ότι είναι εξελικτικά μεταγενέστερη της συμβίωσης του φυτού με μύκητα (Sprent, 2008; Poole κ.ά., 2008). Αποτέλεσμα της συμβίωσης αυτής είναι ο σχηματισμός ενός διακριτού οργάνου, του φυματίου, το οποίο παρατηρήθηκε και περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1675 από τον Malpighi (Patriarca κ.ά., 2004). Τα φυμάτια αναπτύσσονται κατά κανόνα στο χώρο της ριζόσφαιρας, όπου πραγματοποιείται και η δέσμευση του αζώτου. Εξαίρεση αποτελεί το σπάνιο ψυχανθές των τροπικών κλιμάτων Sesbania rostrata, του οποίου η συμβίωση με το ριζόβιο Αzorhizobium caulinodans οδηγεί στο σχηματισμό φυματίων στο βλαστό (Dreyfus κ.ά., 1988). Η Medicago truncatula σχηματίζει φυμάτια αποκλειστικά κατά τη συμβίωσή της με το είδος Sinorhizobium meliloti (Εικόνα 2.1) το οποίο χαρακτηρίζεται ως ριζόβιο ταχείας ανάπτυξης φυματίων (Rawsthorne κ.ά., 1980; Αrmager, 2001). Η πρώτη περιγραφή του είδους αυτού έγινε το 1926 από τον Dangeart (Graham, 2008). H διαδικασία σχηματισμού φυματίων ακολουθεί μια, κοινή για τα ψυχανθή, πορεία (Hopkins, 1995; Caetano-Anollés, 1997; Sprent, 2008), περιλαμβάνοντας τα εξής στάδια : 1) αποικισμός των ριζοβίων και προσκόλλησή τους στα ριζικά τριχίδια, 2) ανταπόκριση των ριζικών τριχιδίων, 3) είσοδος των ριζοβίων (μόλυνση) και ανάπτυξη των ινών προσβολής, 4) ανάπτυξη των φυματίων, ελευθέρωση των ριζοβίων και μόλυνση των κυττάρων του φυματίου. ΕΙΔΟΣ ΡΙΖΟΒΙΟΥ ΠΡΟΤΙΜΩΜΕΝΟΣ ΞΕΝΙΣΤΗΣ Sinorhizobium meliloti Medicago, Melilotus, Trigonella S. fredii Glycine max S. medicae Medicago Πίνακας 2.2. Είδη του γένους Sinorhizobium και τα κυριότερα ψυχανθή με τα οποία αναπτύσσουν αποτελεσματική συμβίωση ( Armager, 2001). H έναρξη της συμβίωσης πραγματοποιείται με την ανταλλαγή χημικών σημάτων μεταξύ του φυτού και του ριζόβιου, με τη μεσολάβηση διαφόρων σηματοδοτικών μορίων. Η επιδεκτικότητα της Medicago truncatula, όπως και άλλων φυτικών ειδών, στη μόλυνση από συγκεκριμένα είδη βακτηρίων οφείλεται στην ύπαρξη αυτών των βιομορίων. Στα σηματοδοτικά μόρια περιλαμβάνονται διάφορες κατηγορίες βιομορίων όπως οι σύνθετοι πολυσακχαρίτες, ρυθμιστές ανάπτυξης, αμινοξέα, οργανικά οξέα, λεκτίνες καθώς επίσης και δευτερογενείς μεταβολίτες, όπως φλαβονοειδή και μπεταΐνες (Kosslak, 1987; Patriarca κ.ά., 2004; Oldroyd, 2007; 20

23 Oldroyd και Downie, 2008; Poole κ.ά., 2008; Kobayashi και Broughton, 2008; Schliemann κ.ά., 2008; Oldroyd κ.ά., 2009; Zhang κ.ά., 2009). Εικόνα 2.1. Φυμάτια συμβίωσης Medicago truncatula-sinorhizobium meliloti Όλες οι προαναφερθείσες κατηγορίες βιομορίων δρουν παράλληλα και ως επαγωγείς της έκφρασης του βακτηριακού γονιδίου nodd (Patriarca κ.ά., 2004; Kobayashi και Broughton, 2008), υπεύθυνου για τον σχηματισμό της ΝodD πρωτεΐνης που λειτουργεί με τη σειρά της ως γενικός επαγωγέας της έκφρασης των υπολοίπων nod βακτηριακών γονιδίων. Οι Νod πρωτεΐνες είναι ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις βιοσύνθεσης ειδικών λιποχιτοολιγοσακχαριτών ή παραγόντων Νod όπως ονομάζονται και παρουσιάζουν διαφορές ανάμεσα στα είδη των ριζοβίων, τόσο ως προς την εξειδίκευσή τους, όσο και ως προς τη δομή τους (Ardourel κ.ά., 1995; Schultze και Kondorosi, 1996b; Patriarca κ.ά., 2004). Οι λιποχιτοολιγοσακχαρίτες, είναι ειδικά μόρια σηματοδότησης, απαραίτητα για την οργανογένεση των φυματίων (Bueno κ.ά., 2001), αν και ορισμένα ριζόβια χρησιμοποιούν για το σκοπό αυτό παράγωγα πουρίνης (Giraud κ.ά., 2007). Παρά το γεγονός ότι οι ακριβείς μηχανισμοί αναγνώρισης των παραγόντων Nod από το φυτό δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί, έχει ωστόσο παρατηρηθεί ότι, λίγα λεπτά μετά την επαφή των βακτηρίων με τα επιδερμικά κύτταρα του φυτού και συγκεκριμένα μετά τη σύνδεση τους στους εξειδικευμένους υποδοχείς NFR1 και NFR5, οι κυτταρικές μεμβράνες των ριζικών τριχιδίων αποπολώνονται, αυξάνεται η συγκέντρωση του ασβεστίου και αναδιατάσσεται ο κυτταροσκελετός (Endre κ.ά., 2002; Radutoiu κ.ά., 2003; Oldroyd και Downie, 2004; Oldroyd και Downie, 2006; Oldroyd κ.ά., 2009). Νεότερες έρευνες σε φυτά μπιζελιού, κοινού φασολιού και M. truncatula έδειξαν ότι οι Nod 21

24 παράγοντες προκαλούν εισροή ιόντων Ca 2+ στα κύτταρα των ριζικών τριχιδίων, ενώ παράλληλα παρατηρείται εκροή ιόντων Cl - και K + και αύξηση της τιμής του ph του κυτοπλάσματος (Becana κ.ά., 2010). Ακολουθεί έκφραση των γονιδίων enod του φυτού και βιοσύνθεση των πρώϊμων ΝΟD πρωτεϊνών (ENOD), ενώ παράλληλα εκφράζονται τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των πρωτεϊνών PRP (proline rich proteins) και της υπεροξειδάσης. Στο στάδιο αυτό φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και διάφορες φυτικές αλλά και βακτηριακές ορμόνες, οι οποίες προκαλούν περαιτέρω αλλαγές στο μεταβολισμό, αύξηση του αριθμού των ριζικών τριχιδίων και παραγωγή λεπτότερων και βραχύτερων ριζών (Patriarca κ.ά., 2004; Oldroyd, 2007; Murray κ.ά., 2007; Van Noorden, κ.ά., 2007; Oldroyd και Downie, 2008; Frugier κ.ά., 2008; Poole κ.ά., 2008; Oldroyd κ.ά., 2009). Εντός είκοσι ωρών, τα ριζικά τριχίδια παραμορφώνονται, εγκλωβίζοντας τα βακτήρια και σχηματίζουν το πρωτογενές μερίστωμα του φυματίου. Οι γνώσεις μας για το στάδιο, κατά το οποίο τα ριζόβια μολύνουν τα ριζικά τριχίδια και αναπτύσσονται οι χαρακτηριστικές ίνες προσβολής, είναι περιορισμένες (Stacey κ.ά., 2006). Κάθε ίνα σχηματίζεται από επανειλημμένες κυτταροδιαιρέσεις, και καταλήγει σε κλάδους που εισχωρούν στα φυτικά κύτταρα (Gage και Margolin, 2000; Patriarca κ.ά., 2004). Όπως προκύπτει από πειραματικές μελέτες διαφόρων ερευνητών, στην περιοχή των ινών προσβολής ανιχνεύονται διάφορα υδρολυτικά ένζυμα, κυρίως πεπτινάσες και αμυλάσες, που εκλύονται από τα ριζόβια (Mellor, 1989; Vincent και Brewin, 2000). Η δράση των ενζύμων αυτών σχετίζεται πιθανώς με την προσπάθεια των βακτηρίων να εισχωρήσουν στα κύτταρα του ξενιστή, αποικοδομώντας το κυτταρικό τους τοίχωμα. Η απελευθέρωση των ριζοβίων στο εσωτερικό των φυτικών κυττάρων σηματοδοτεί την ολοκλήρωση του τρίτου σταδίου (Gage και Margolin, 2000). Μετά τη ρήξη της μεμβράνης της ίνας προσβολής και την εισβολή των ριζοβίων, αρχίζει το τέταρτο στάδιο συμβίωσης κατά το οποίο στο εσωτερικό των φυτικών κυττάρων σχηματίζονται μικρές κυψελίδες. Οι κυψελίδες αυτές αποτελούνται από 1-2 ριζόβια, τα οποία περιβάλλονται από τμήμα της μεμβράνης της ίνας προσβολής. Μέσα στις κυψελίδες, τα βακτήρια πολλαπλασιάζονται και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε βακτηριοειδή, που έχουν την αποκλειστική ικανότητα να ανάγουν το ατμοσφαιρικό άζωτο σε αμμωνιακά ιόντα (Poole κ.ά., 2008). Αξίζει να σημειωθεί ότι από το σύνολο των κυττάρων των φυματίων που σχηματίζονται στη 22

25 ριζόσφαιρα ενός φυτού, μόνο το 20-50% είναι μολυσμένα με ριζόβια και πραγματοποιούν την αζωτοδέσμευση, σύμφωνα με την αντίδραση : N H + +8e - +16MgATP 2NH H MgADP + 16Pi Συνολικά, για την παραγωγή δύο αμμωνιακών ιόντων, απαιτούνται 8 ηλεκτρόνια, δότης των οποίων είναι το NADH+H +, καθώς και 16 μόρια ΑΤΡ, που παράγονται στα βακτηριοειδή με την οξείδωση μέρους των φωτοσυνθετικών προϊόντων τα οποία προσλαμβάνουν από τα φυτά. Από τα ηλεκτρόνια, τα έξι χρησιμοποιούνται για την αναγωγή του ατμοσφαιρικού αζώτου και τα υπόλοιπα δύο για την παραγωγή του H 2, ο σχηματισμός του οποίου θεωρείται ανεπιθύμητος για το φυμάτιο (Vance, 2008). Συνολικά, για την αναγωγή 1 γραμμαρίου Ν, το φυτό δαπανά 6-7 γραμμάρια C (Poole κ.ά., 2008; Vance, 2008). H αντίδραση καταλύεται από το ενζυμικό σύμπλοκο νιτρογενάση, που είναι κοινό και στα ελεύθερα βακτήρια και αποτελείται από δύο διακριτά ένζυμα, τη δινιτρογενάση και την αναγωγάση της δινιτρογενάσης. Η ιδιαίτερα μεγάλη ευαισθησία της νιτρογενάσης απέναντι στο οξυγόνο αναγκάζει το φυτό να παράγει την ψυχανθαιμοσφαιρίνη (leghaemoglobin), που δεσμεύει ελεύθερο Ο 2 και εξασφαλίζει χαμηλή συγκέντρωση Ο 2, ώστε να μην αναστέλλεται η δράση του ενζυμικού συμπλόκου των βακτηρίων. Η πρωτεΐνη αυτή βρίσκεται διάχυτη στο κυτόπλασμα των κυττάρων του φυματίου και έχει την ικανότητα να δεσμεύει το οξυγόνο παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο προστασία στη νιτρογενάση. Η ψυχανθαιμοσφαιρίνη έχει ως προσθετική ομάδα την αίμη, που ανήκει στην ομάδα των πορφυρινών και προσδίδει στα φυμάτια το χαρακτηριστικό τους ερυθρό χρώμα. Ο βαθμός χρωματισμού του φυματίου από την πρωτεΐνη αποτελεί κριτήριο της αζωτοδεσμευτικής ικανότητάς του, εφόσον η απουσία χρώματος συνεπάγεται αδυναμία δέσμευσης του Ν 2. Έως πρόσφατα, επικρατούσε η άποψη ότι η βιοσύνθεση της σφαιρίνης γινόταν στο φυτό και η παραγωγή της αίμης στο βακτήριο, ωστόσο πρόσφατα ερευνητικά αποτελέσματα συμφωνούν με τα αντίστοιχα παλαιοτέρων μελετών που τεκμηρίωναν την εξ ολοκλήρου κωδικοποίηση της ψυχανθαιμοσφαιρίνης από γονίδια του φυτού (Dilworth κ.ά., 1969; Patriarca κ.ά., 2004; Poole κ.ά., 2008; Vance, 2008; Bonfante και Anca, 2009). 23

26 ΠΡΩΤΕÏΝΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΟΣΟΣΤΟ % Σηματοδότηση και Ορμονικός μεταβολισμός 7 Μεταφορά ιόντων και βιομορίων 2 Μεταβολισμός αμινοξέων 12 Οργάνωση κυτταρικού τοιχώματος 5 Μεταβολισμός CHO 3 Γλυκόλυση και κύκλος του Krebs 12 Διαχείριση μεταλλικών ιόντων 2 Μεταβολισμός νουκλεϊκών οξέων 3 Πρωτεϊνοσύνθεση και καταβολισμός 13 Αντιμετώπιση καταπονήσεων και ενεργών μορφών O 2 12 Ρύθμιση RNA 2 Δευτερογενής μεταβολισμός 3 Μονοπάτι οξειδωτικής πεντόζης 2 Άγνωστη 22 Πίνακας 2.3. Λειτουργική ταξινόμηση και κατανομή των αναγνωρισμένων με τη μέθοδο 2D-LC/ MS/ MS πρωτεϊνών που ανιχνεύονται σε φυμάτια της Medicago truncatula (τροποποιημένο από Larrainzar κ.ά., 2007). Τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση του συμπλόκου της νιτρογενάσης αλλά και όλων των απαραίτητων για τη δέσμευση του αζώτου μοριακών συμπλόκων, ονομάζονται nif-γονίδια (nitrogen fixation genes). Μέχρι σήμερα, έχουν εντοπιστεί 17 γονίδια συγκεντρωμένα σε ένα μεγάλο πλασμίδιο του βακτηριακού κυττάρου, ενώ συγχρόνως έχει αποσαφηνιστεί και ο ρόλος των πρωτεϊνών που βιοσυνθέτουν. Ειδικότερα, η πρωτεΐνη ΝifA επάγει τη μεταγραφή όλων των γονιδίων nif εκτός από το δικό της, σε συνεργασία με την ειδική πρωτεΐνη έναρξης της μεταγραφής σ 54. Η NifL αντίθετα, διαδραματίζει αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο, καθώς, παρουσία οξυγόνου ή ανηγμένου αζώτου, λειτουργεί ως ανταγωνιστής της ΝifA και εμποδίζει τη μεταγραφή του συνόλου των nif- γονιδίων. Συνολικά, από τα περίπου γονίδια της Medicago truncatula, μόνο ένα ποσοστό της τάξεως του 1% είναι υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση πρωτεϊνών, σχετικών με την οργανογένεση και τη λειτουργία των φυματίων (Jones κ.ά., 2008). Η λειτουργία των πρωτεϊνών αυτών καθώς και η κατανομή τους στα κύτταρα των φυματίων καταγράφονται στον Πίνακα 2.3. Το ανηγμένο άζωτο που παράγεται από τα βακτηριοειδή ενσωματώνεται στη συνέχεια σε οργανικά μόρια, με σκοπό τη βιοσύνθεση γλουταμίνης και γλουταμικού οξέος. Για το σκοπό αυτό, το φυτό διαθέτει τα ένζυμα γλουταμινική συνθετάση (GS) και γλουταμική συνθάση (GOGAT), των οποίων οι συγκεντρώσεις στο κυτταροδιάλυμα αυξάνονται σημαντικά (Vance κ.ά., 1994). Όταν ανασταλεί η δράση 24

27 της γλουταμινικής συνθετάσης, το φυμάτιο μπορεί να ακολουθήσει εναλλακτικά μονοπάτια για τη δέσμευση και την αφομοίωση του αζώτου, μέσω της ασπαραγινικής συνθετάσης (Carvalho κ.ά., 2003; Barsch κ.ά., 2006). Στη συνέχεια, η GOGAT καταλύει την αντίδραση μεταξύ ενός μορίου γλουταμίνης και ενός α- κετογλουταρικού οξέος, παρουσία NADH ή ανηγμένης φερρεδοξίνης, για τη σύνθεση δύο μορίων γλουταμικού οξέος (Cordovilla κ.ά., 2000). Οι απαιτούμενες ποσότητες ΑΤΡ και NADH, παρέχονται από το φυτό και παράγονται στον κύκλο των τρικαρβοξυλικών οξέων ή κύκλο του Κrebs (Rawsthorne κ.ά., 1980; Vance, 2008). Τέλος, τα φυτά, μέσω της γλυκόλυσης προσφέρουν στα φυμάτια σακχαρόζη, η οποία μετατρέπεται στη συνέχεια σε διάφορα τρικαρβοξυλικά οξέα (Rawsthorne κ.ά., 1980; Vance, 2008; Bonfante και Anca, 2009). Μετά την ολοκλήρωση της βιοσύνθεσης της γλουταμίνης και του γλουταμικού οξέος, μέρος της γλουταμίνης αξιοποιείται για την παραγωγή άλλων ουσιών, όπως η ασπαραγίνη και τα δύο αμινοξέα εγκαταλείπουν το φυμάτιο μετακινούμενα σε άλλα φυτικά κύτταρα. Για την ανταλλαγή των διαφόρων βιομορίων, μεταξύ φυματίων και υπόλοιπων φυτικών κυττάρων, καθοριστικό ρόλο παίζουν διάφορες πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην περιβακτηριοειδή μεμβράνη. Στις πρωτεΐνες αυτές ανήκουν η Ν- 26-υδατοπορίνη, διάφορες γλυκοπρωτεΐνες πλούσιες σε υδροξυπρολίνη, καθώς και η GmSAT1 που ταυτοποιήθηκε πρόσφατα και αποτελεί κανάλι μεταφοράς των αμμωνιακών ιόντων (Frueauf κ.ά., 2000). Η ποικιλία και η πολυπλοκότητα των μηχανισμών που αναπτύσσονται στο φυμάτιο, καθιστούν το όργανο αυτό ευαίσθητο σε διάφορες αλλαγές του περιβάλλοντος χώρου. Η παρουσία ΝΟ - 3, όπως και η κατάκλυση του εδάφους με νερό αδρανοποιούν το σύμπλοκο της νιτρογενάσης. Η μείωση του ph στο χώρο της ριζόσφαιρας σε τιμές κάτω του 5, οδηγεί στο θάνατο των ριζοβίων. Γενικά σε συνθήκες χαμηλού ph, τα φυμάτια αναπτύσσουν, ως ένα βαθμό, μηχανισμούς ανοχής που ελέγχονται από 20 περίπου γονίδια, για τους οποίους ωστόσο οι πληροφορίες είναι ελάχιστες (Glenn και Dilworth, 1994). Κατά την έκθεση του φυματίου σε συνθήκες αλατότητας και ξηρασίας, παρατηρείται μείωση της διαπερατότητας της περιβακτηριοειδούς μεμβράνης και ταυτόχρονα περιορισμός της βιομάζας. Παράλληλα, διαπιστώνεται αύξηση της περιεκτικότητας του οργάνου σε αμπσισικό οξύ (ΑΒΑ), συσσώρρευση σουκρόζης που αναστέλλει τη δράση υδρολυτικών ενζύμων και προκαλεί ελάττωση του διαθέσιμου C, καθώς και μείωση ως και αναστολή της δράσης της νιτρογενάσης, λόγω αύξησης της συγκέντρωσης του οξυγόνου (Aydi κ.ά., 2004). Η καταπόνηση 25

28 από υπερσυγκέντρωση αλάτων προκαλεί επίσης συσσώρευση ενός μη αναγωγικού δισακχαρίτη, της τρεχαλόζης, που οφείλεται στη μείωση της δράσης του υδρολυτικού ενζύμου τρεχαλάση, με αποτέλεσμα τη διαταραχή του μεταβολισμού του C (López κ.ά., 2009). Σε γενικές γραμμές, κατά τη διάρκεια μιας καταπόνησης παρατηρείται στα φυμάτια έκφραση γονιδίων, παρόμοιων με τα κύτταρα άλλων φυτικών ιστών, όπως του γονιδίου της γλουταθειόνης S-τρανσφεράσης (GST) και των θερμοπληξιακών πρωτεϊνών ΗSP. Παρά την εκτεταμένη και συστηματική έρευνα του φαινομένου, όπως και στην περίπτωση των μυκορριζών, πολλοί μηχανισμοί της φυματιοποίησης παραμένουν άγνωστοι ή αδιευκρίνιστοι. Κενά υπάρχουν στις γνώσεις που σχετίζονται ειδικότερα με το στάδιο ανάπτυξης της ίνας προσβολής και της εισβολής των βακτηρίων (Stacey κ.ά., 2006) ενώ παράλληλα, δεν έχουν ταυτοποιηθεί οι παράγοντες που προκαλούν την ανοχή του φυτού στην παρουσία των βακτηρίων. Διάφορες πειραματικές μελέτες καταλήγουν στο πιθανό συμπέρασμα ότι οι πολυσακχαρίτες της επιφάνειας των βακτηρίων καταστέλλουν τους αμυντικούς μηχανισμούς του φυτού. Ωστόσο, παραμένει άγνωστος ο τρόπος με τον οποίο ο ξενιστής ελέγχει τη διαίρεση των βακτηριοειδών, καθώς και τον αριθμό των ριζοβίων που τελικά εισβάλλουν στα κύτταρα των ριζών (Patriarca κ.ά., 2004) Οι Ενεργές Μορφές Οξυγόνου και ο ρόλος τους στη συμβίωση Η συμβίωση αποτελεί ένα ιδιαίτερα πολύπλοκο φαινόμενο, καθώς για την πραγματοποίησή του συμμετέχουν δύο εντελώς διαφορετικοί οργανισμοί, το φυτό και το βακτήριο. Για την εγκαθίδρυση και την επιτυχή έκβαση της αμοιβαία ωφέλιμης αυτής σχέσης, εμπλέκονται πολυάριθμοι μηχανισμοί, στους οποίους σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι ενεργές μορφές οξυγόνου (D Haeze κ.ά., 2003; Jamet κ.ά., 2007; Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Kατά την έναρξη της αλληλεπίδρασης φυτού-βακτηρίου, η παρουσία των μικροβίων στην περιοχή της ριζόσφαιρας εκλαμβάνεται από το φυτό ως εισβολή φυτοπαθογόνου μικροοργανισμού. Πρόκειται για την ενεργοποίηση ενός καθολικού στα φυτά μηχανισμού, κατά τον οποίο προκαλείται υπερσυσσώρευση ROS στα κύτταρα που βρίσκονται πλησιέστερα στα βακτήρια. Οι ROS και ιδιαίτερα το H 2 O 2 26

29 προκαλούν αντίδραση υπερευαισθησίας (hypersensitive response, HR), κατά την οποία ενεργοποιούνται μηχανισμοί που οδηγούν σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (programmed cell death, PCD), με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός φυσικού εμποδίου μεταξύ φυτού-βακτηρίου (Chamnongpol κ.ά., 1996). Η συσσώρευση ROS διαρκεί 2-3 λεπτά από την προσβολή και η συγκέντρωσή τους στα φυτικά κύτταρα αρχίζει να μειώνεται μετά από λεπτά (Polidoros κ.ά., 2001). Η διαδικασία αυτή φαίνεται ότι ελέγχεται από διάφορους ρυθμιστές αύξησης, όπως το σαλικυλικό οξύ, το οποίο δεσμεύει τις καταλάσες και τις υπεροξειδάσες, προκαλώντας ραγδαία αύξηση στη συγκέντρωση των ROS (Minchin κ.ά., 2008). Παράλληλα, τα γειτονικά κύτταρα ενεργοποιούν τους μηχανισμούς της επαγόμενης συστημικής αντοχής (systemic acquired resistance, SAR), στην οποία ωστόσο δεν φαίνεται να εμπλέκεται άμεσα το H 2 O 2 (Santos κ.ά., 2001; Jamet κ.ά., 2007). Ο ίδιος μηχανισμός λαμβάνει χώρα και κατά τα αρχικά στάδια εγκαθίδρυσης συμβίωσης, κατά τα οποία, αποτέλεσμα της αντίδρασης υπερευαισθησίας, είναι ο περιορισμός της έκτασης της προσβολής των ριζικών κυττάρων από τα βακτήρια, όπως έχει αποδειχθεί σε πειράματα με φυτά μηδικής, όπου το 90% των ινών προσβολής που σχηματίστηκαν, σταμάτησε την ανάπτυξή του και καταστράφηκε, μέσω των μηχανισμών της HR (Glyan ko και Vasil eva, 2010). Το H 2 O 2 που υπερσυσσωρεύεται στα φυτικά κύτταρα παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τη δομική ενίσχυσή τους (Santos κ.ά., 2001; Jamet κ.ά., 2007). Συγκεκριμένα, λειτουργεί ως υπόστρωμα της αντίδρασης με την οποία το ένζυμο υπεροξειδάση καταλύει τη σύνθεση λιγνίνης και καλλόζης, ενισχύοντας τα κυτταρικά τοιχώματα του φυτού. Επιπλέον, η παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων H 2 O 2 επάγει την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μια εξειδικευμένη ομάδα πρωτεϊνών, τις υδροξυπρολίνες, οι οποίες συντελούν και αυτές στην ενίσχυση του κυτταρικού τοιχώματος (Chamnongpol κ.ά., 1996). Παράλληλα, η παρατηρούμενη αύξηση της συγκέντρωσης της υπεροξειδάσης στα υπόλοιπα κύτταρα, αποσκοπεί στον περιορισμό της εισβολής σε ορισμένες μόνο περιοχές (Santos κ.ά., 2001; Glyan ko και Vasil eva, 2010). Μειωμένη δράση του προαναφερθέντος ενζύμου έχει ως αποτέλεσμα την είσοδο του συμβιωτικού βακτηρίου στα ριζικά τριχίδια. Η παρατηρούμενη υπερσυσσώρευση ROS και ιδιαίτερα H 2 O 2 φαίνεται ωστόσο ότι ελέγχεται με τρόπο, ώστε να μην απορριφθεί το συμβιωτικό βακτήριο (Santos κ.ά., 2001; Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Είναι αναγκαία η διατήρηση 27

30 ισορροπίας στην παρουσία των ROS, καθώς υπερβολική αύξηση στη συγκέντρωσή τους θα απέβαινε μοιραία για το ριζόβιο (Jones κ.ά., 2007). Την απαιτούμενη ισορροπία επιτυγχάνει το βακτήριο, μέσω της παραγωγής των παραγόντων Nod, με τους οποίους καταστέλλει το αμυντικό σύστημα του φυτού (González κ.ά., 1996; Mithöfer, 2002). Σε μεταλλάγματα nodc του βακτηρίου Sinorhizobium meliloti με αδυναμία παραγωγής παράγοντα NodC, παρατηρήθηκε συσσώρευση H 2 O 2 και ενεργοποίηση από πλευράς φυτού αμυντικών μηχανισμών, τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό τους σε ρίζες μηδικής, με αποτέλεσμα να αποτύχει η διαδικασία σχηματισμού ινών προσβολής (Βueno κ.ά., 2001). Πειράματα των Shaw κ.ά. (2003) έδειξαν ότι οι παράγοντες Nod, αρχικά, επάγουν την ταχεία μείωση του παραγόμενου από το φυτό H 2 O 2, ενώ στη συνέχεια διατηρούν τη συγκέντρωσή του σε σταθερά επίπεδα (Ramu κ.ά., 2002). Συνεπώς, οι παράγοντες Nod φαίνεται ότι ρυθμίζουν την παραγωγή ROS, κατά τη διάρκεια της πρώτης φάσης αλληλεπίδρασης φυτούριζοβίου (Albus κ.ά., 2001). H ταχεία μείωση της συγκέντρωσης του H 2 O 2, με τη ρυθμιστική δράση των παραγόντων Nod, πιθανώς σχετίζεται με τη μορφοποίηση των ριζικών τριχιδίων, δηλαδή τη συστροφή τους και την εγκόλπωση των ριζοβίων (Oldroyd και Downie, 2004). Μετά τον περιορισμό των υψηλών συγκεντρώσεων των ROS, οι παραμένουσες ελεγχόμενες ποσότητες παίζουν σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση μηχανισμών που σχετίζονται με τα επόμενα στάδια της συμβίωσης και ιδιαίτερα με τη διαδικασία σχηματισμού της ίνας προσβολής και της οργανογένεσης του φυματίου (Oldroyd και Downie, 2004; Oldroyd, 2007; Jones κ.ά., 2007; Oldroyd και Downie, 2008). Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι το H 2 O 2 προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+ στο άκρο του ριζικού τριχιδίου, τα οποία στη συνέχεια μετακινούνται προς τον πυρήνα του κυττάρου, ενεργοποιώντας μια, εξαρτώμενη από το ασβέστιο και την καλμοδουλίνη, πρωτεϊνική κινάση, την CCaMK (Calcium-and Calmodulindependent kinase Oldroyd και Downie, 2004; Lévy κ.ά., 2004; Oldroyd και Downie, 2006; Gleason κ.ά., 2006; Tirichine κ.ά., 2006; Oldroyd κ.ά., 2009). H CCaMK στη συνέχεια, ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες NSP1 και NSP2, οι οποίες ανήκουν στην ομάδα μεταγραφικών παραγόντων GRAS και επάγουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται πιθανώς με τη μορφοποίηση του ριζικού τριχιδίου, ενώ παράλληλα αυξάνουν την έκκριση της κυτοκινίνης (Smit κ.ά., 2005; Frugier κ.ά., 2008). Ο ρόλος της κυτοκινίνης είναι ιδιαίτερα σημαντικός στο στάδιο αυτό, καθώς ελέγχει την έκφραση του γονιδίου ΝΙΝ, το οποίο σχετίζεται με την αυξημένη ευαισθησία του 28

31 ριζικού τριχιδίου στην εισβολή (Frugier κ.ά., 2006; Murray κ.ά., 2007; Tirichine κ.ά., 2007; Oldroyd, 2007). Επιπλέον, η κυτοκινίνη προσδένεται στον εξειδικευμένο υποδοχέα LHK1, ο οποίος βρίσκεται στη μεμβράνη των γειτονικών παρεγχυματικών κυττάρων, ενεργοποιώντας και σε αυτά τον μεταγραφικό παράγοντα NSP2. Στα παρεγχυματικά κύτταρα, η δράση του προαναφερθέντος παράγοντα επάγει την έκφραση των γονιδίων ENOD (Early Nodulation Genes), σηματοδοτώντας την έναρξη του σχηματισμού της ίνας προσβολής και των κυτταροδιαιρέσεων του πρωτογενούς μεριστώματος του φυματίου. Ταυτόχρονα, παρατηρείται αυξημένη βιοσύνθεση ορμονών, όπως οι γιββερελλίνες, η αυξίνη και τα μπρασσινοστεροειδή, οι οποίες εμπλέκονται στη μεταφορά ερεθισμάτων και στην επαγωγή της ανάπτυξης του μεριστώματος των φυματίων (Oldroyd, 2007; Oldroyd και Downie, 2008). Η συνολική διαδικασία απεικονίζεται στην Εικόνα 2.2. Κατά την πορεία σχηματισμού της ίνας προσβολής, παρατηρείται περιμετρικά υψηλή συγκέντρωση ROS και ιδιαιτέρως H 2 O 2 (Becana κ.ά., 2010), το οποίο διαπιστώθηκε ότι είναι φυτικής προέλευσης (Jamet κ.ά., 2007). Για να αντιμετωπίσει τις ROS, το Sinorhizobium meliloti διαθέτει έναν πλούσιο ενζυμικό αντιοξειδωτικό μηχανισμό, στον οποίο κυρίαρχο ρόλο παίζουν δύο υπεροξειδικές δισμουτάσες, η SodA και η SodC και τρεις καταλάσες, οι KatA, KatB και KatC (Jamet κ.ά., 2003; Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Σε μεταλλάγματα του είδους Sinorhizobium meliloti, με αδυναμία έκφρασης μιας οποιασδήποτε από τις τρεις καταλάσες ή μιας από τις δύο δισμουτάσες, παρατηρήθηκε αυξημένη ευαισθησία του βακτηρίου στις ROS, αλλά όχι και αποτροπή της συμβίωσης (Jones κ.ά., 2007; Minchin κ.ά., 2008). Αντιθέτως, σε μεταλλάγματα katb/katc και kata/katc, τα ριζόβια σε αυτήν την περίπτωση έχαναν την ικανότητά τους να αποικίσουν τα ριζικά τριχίδια (Jones κ.ά., 2007). Η συμπεριφορά μεταλλαγμάτων με αδυναμία σύνθεσης της SodC (Smc 00911) ή της προσφάτως εντοπισμένης Smc 01944, με δράση χλωροϋπεροξειδάσης, δεν έχει μελετηθεί ακόμη επαρκώς (Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). 29

32 Εικόνα 2.2. Διαδικασία αναγνώρισης φυτού-βακτηρίου, σχηματισμού ίνας προσβολής και φυματιογένεσης (τροποποιημένο από Oldroyd, 2007). Η συγκέντρωση του H 2 O 2 στην ίνα προσβολής πιθανώς ελέγχεται από τη δράση των ισοενζύμων καταλάσης των βακτηριοειδών (Jamet κ.ά., 2007; Becana κ.ά., 2010). Ιδιαίτερα η KatB φαίνεται ότι αποτοξινώνει τα βακτηριακά κύτταρα που βρίσκονται στην ίνα προσβολής από το πλεονάζον H 2 O 2 και περιορίζει τη συγκέντρωσή του σε αυτά (Jamet κ.ά., 2007). Επιπλέον, προστατεύει την ίνα προσβολής από τον κίνδυνο τροποποίησης του σχήματός της, λόγω της δυσμενούς επίδρασης των ROS (Gibson κ.ά., 2008 ). Ο περιορισμός της συγκέντρωσης των ROS στην ίνα προσβολής από το βακτηριακό αντιοξειδωτικό μηχανισμό, παρέχει τη δυνατότητα στα ριζόβια να τις αξιοποιήσουν προς όφελός τους (Jones κ.ά., 2007). Αντίθετα, η υπερέκφραση του γονιδίου της KatB καταλάσης σε μια φυλή S.meliloti και η εκτεταμένη εκκαθάριση των ROS, είχε ως αποτέλεσμα τον ατελή σχηματισμό της ίνας προσβολής και την αδυναμία εγκαθίδρυσης επιτυχούς συμβιωτικής σχέσης, καταδεικνύοντας το ρυθμιστικό ρόλο 30

33 του H 2 O 2 στη διαδικασία (Jamet κ.ά., 2007; Jones κ.ά., 2007). Κατά την πειραματική ανάπτυξη φυματίων σε φυτά μηδικής και μπιζελιού διαπιστώθηκε παραγωγή H 2 O 2 στα εσωτερικά τοιχώματα της ίνας και συγκεκριμένα στη ζώνη προσβολής, αλλά όχι και στη ζώνη αζωτοδέσμευσης, γεγονός που ενδεχομένως συνδέεται με διεργασίες απαραίτητες για τη δομική ενίσχυση της ίνας προσβολής και των κυτταρικών τοιχωμάτων των βακτηρίων (Santos κ.ά., 2001; Rubio κ.ά., 2004; Becana κ.ά., 2010). Οι Cook κ.ά. (1995), κατά τη συμβίωση του S.meliloti με τη M. truncatula, παρατήρησαν την επαγωγή του γονιδίου Rip1, υπεύθυνου για τη βιοσύνθεση της βακτηριακής υπεροξειδάσης Rip1. Παράλληλα, οι DenHerder κ.ά. (2007), κατά τη συμβίωση του Αzorhizobium caulinodans με το τροπικό ψυχανθές Sesbania rostrata, διαπίστωσαν την επαγωγή του γονιδίου Sprx1, το οποίο επάγει τη βιοσύνθεση μιας παρόμοιας υπεροξειδάσης. Τα ανωτέρω ευρήματα ενισχύουν την άποψη ότι το H 2 O 2 συμβάλλει στη δομική ενίσχυση τόσο της ίνας προσβολής και των κυτταρικών τοιχωμάτων των βακτηρίων, όσο και των κυτταρικών τοιχωμάτων του φυτού (Gibson κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Μετά την ανάπτυξη της ίνας προσβολής, την απελευθέρωση των βακτηρίων στα φυτικά κύτταρα και τη διαφοροποίησή τους σε αζωτοδεσμευτικά βακτηριοειδή, παράγονται ROS, οι οποίες προκύπτουν από : α) τα υψηλά επίπεδα αναπνοής, που απαιτούνται για την ενεργειακή υποστήριξη της δέσμευσης του ατμοσφαιρικού αζώτου, β) την αφθονία ιόντων σιδήρου της αίμης, γ) το σχετικά όξινο ph του κυτταροδιαλύματος των βακτηριοειδών, δ) τις ισχυρά αναγωγικές συνθήκες που επικρατούν στη ζώνη προσβολής και ε) την οξείδωση πρωτεϊνών με υψηλό αναγωγικό δυναμικό, όπως η ψυχανθαιμοσφαιρίνη, η νιτρογενάση, η φερρεδοξίνη και η υδρογονάση (Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Ιδιαίτερα η ψυχανθαιμοσφαιρίνη, λόγω της ιδιότητάς της να μεταφέρει οξυγόνο, υπόκειται εύκολα σε αυτοοξείδωση, με αποτέλεσμα να σχηματίζονται ROS, όπως το H 2 O 2 και να προκαλείται οξειδωτική καταπόνηση (Puppo κ.ά., 1981; Mathieu κ.ά., 1998). Παράλληλα με την παρουσία ROS στο φυμάτιο, κατά τη διάρκεια της συμβιωτικής αζωτοδέσμευσης παράγονται ενεργές μορφές αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS) και κυρίως μονοξειδίου του αζώτου (Minchin κ.ά., 2008; Glyan ko και Vasil eva, 2010). Το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) είναι ένα λιπόφιλο μόριο, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αύξησης και της ανάπτυξης των φυτών και ιδιαίτερα στο κλείσιμο των στοματίων, την επιμήκυνση των κυττάρων, τη βλάστηση του σπόρου, την αύξηση των ριζών και την άνθηση (Minchin κ.ά., 2008). Στα 31

34 φυμάτια, οι κύριες πηγές ΝΟ διακρίνονται: α) σε ενζυμικές, στις οποίες υπάγονται η δράση της νιτρικής αναγωγάσης και της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου και β) σε μη ενζυμικές, στις οποίες εντάσσεται η αναγωγή των νιτρωδών από το ασκορβικό οξύ, κάτω από συνθήκες όξινου ph (Minchin κ.ά., 2008). Σε υψηλές συγκεντρώσεις, το ΝΟ αλληλεπιδρά με τη ρίζα του υπεροξειδίου, παράγοντας την ιδιαίτερα τοξική ρίζα του υπεροξυνιτρώδους (ΟΝΟΟ - ). Ωστόσο, σε χαμηλές συγκεντρώσεις δεν έχει δυσμενείς επιπτώσεις στα φυμάτια και λειτουργεί ως σηματοδοτικό μόριο, παίζοντας σημαντικό ρόλο στη μεταφορά Ο 2 στα βακτηριοειδή, διαδικασία, η οποία ενισχύεται από τη λιποφιλικότητά του που επιτρέπει την εύκολη διάχυσή του, διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών (Glyan ko και Vasil eva, 2010). H συγκέντρωση του ΝΟ στα φυμάτια παραμένει χαμηλή, χάρη στην ψυχανθαιμοσφαιρίνη και τη μη συμβιωτική αιμοσφαιρίνη, με τις οποίες σχηματίζει σύμπλοκες ενώσεις (Minchin κ.ά., 2008). Ένας άλλος πιθανός ρυθμιστικός ρόλος του ΝΟ σχετίζεται με την εμπλοκή του σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (Sνιτροσυλιώσεις, S-σουλφενυλιώσεις, S-γλουταθειονυλιώσεις), όπως έδειξαν τα αποτελέσματα της πειραματικής συμβίωσης M.truncatula και S.meliloti, κατά την οποία διαπιστώθηκε η ύπαρξη 80 S-νιτροσυλιωμένων πρωτεϊνών (Glyan ko και Vasil eva, 2010; Meilhoc κ.ά., 2011). Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του φυματίου, η παρουσία των αντιοξειδωτικών ενζύμων για την αντιμετώπιση της αυξημένης παραγωγής ROS και RNS είναι σημαντικότερη από ό,τι σε άλλα όργανα του φυτού (Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Κυρίαρχο ρόλο στον έλεγχο των ενεργών αυτών μορφών διαδραματίζει η μεταβολική οδός ασκορβικού-γλουταθειόνης (Halliwell-Asada Pathway), η οποία σχετίζεται άμεσα με την αποτελεσματικότητα της φυματιοποίησης (Becana κ.ά., 2010). Στην οδό αυτή συμμετέχουν ένζυμα, όπως η ασκορβική υπεροξειδάση (APX), η μονοαφυδροασκορβική υπεροξειδάση (MDHAR), η αφυδροασκορβική αναγωγάση (DHAR) και η αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR), τα οποία εμπλέκονται σε μια σειρά αντιδράσεων διάσπασης του H 2 O 2 που εξαρτάται απόλυτα από το NADPH, ως αναγωγική δύναμη (Becana κ.ά., 2010). Εκτός από τα προαναφερθέντα ένζυμα, αντιοξειδωτικό ρόλο διαδραματίζουν: 1) ισομορφές της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης, της θειορεδοξίνης, της υπεροξυρεδοξίνης και των GSTs, 2) μηχανισμοί για την απομάκρυνση των μεταλλικών ιόντων που παράγονται κατά την αντίδραση Fenton, στους οποίους συμμετέχουν διάφορες φυτοχηλατίνες και μεταλλοθειονίνες και 3) συμβιωτικές και μη συμβιωτικές αιμοσφαιρίνες, οι οποίες 32

35 ελέγχουν τη δραστικότητα των ROS και RNS (Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010). Παράλληλα και στο στάδιο αυτό, εξακολουθεί να είναι σημαντική η δράση των διαφόρων ισομορφών υπεροξειδικής δισμουτάσης και καταλάσης (Jamet κ.ά., 2003). H συγκέντρωση των ROS αρχίζει να αυξάνεται, κατά τη σταδιακή γήρανση του φυματίου (Rubio κ.ά., 2004; Puppo κ.ά., 2005). Στα φυμάτια συνεχούς ανάπτυξης, όπως σε αυτά που αναπτύσσονται κατά τη συμβίωση της M.truncatula με το S.meliloti, η γήρανση είναι ολική και πραγματοποιείται ταυτόχρονα σε όλον τον πληθυσμό των βακτηριοειδών (Vasse κ.ά., 1990; Van de Velde κ.ά., 2006; Maunoury κ.ά., 2008). Η διαδικασία της πρωτεόλυσης περιορίζει τη δράση των ενζυμικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών, με αποτέλεσμα την έξαρση των ROS, η οποία προκαλεί οξειδωτική καταπόνηση και οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο (Becana και Klucas, 1992; Gogorcena, 1999; Matamoros, 1999). Συμπερασματικά, οι ROS και οι RNS, σε μεγάλες συγκεντρώσεις προκαλούν βλάβες στα κύτταρα και αποτρέπουν την επιτυχή ανάπτυξη συμβιωτικής σχέσης, ενώ αντίθετα, σε μικρές, ελεγχόμενες συγκεντρώσεις, δρουν θετικά ως σηματοδοτικά μόρια (Becana κ.ά., 2010). Ωστόσο, τα όρια ανοχής των ριζοβίων στις ROS παραμένουν άγνωστα (Jones κ.ά., 2007). Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τη πλήρη διευκρίνιση του τρόπου, με τον οποίο οι ROS, οι πρωτεΐνες του φυτού και τα δομικά συστατικά των κυτταρικών τοιχωμάτων φυτού και βακτηρίου, αλληλεπιδρούν με τους εξωπολυσακχαρίτες ή άλλα προϊόντα που εκκρίνονται από τα βακτήρια κατά τη διαδικασία της συμβίωσης, προκειμένου να αναπτυχθεί η ίνα προσβολής (Jones κ.ά., 2007; Minchin κ.ά., 2008; Becana κ.ά., 2010) Η συμβολή της τεχνικής του RNAi στη βελτίωση των φυτών Η ολοκλήρωση της αλληλούχησης φυτικών γονιδιωμάτων, όπως της Arabidopsis thaliana, του ρυζιού και της λεύκας, καθώς και η μερική αλληλούχηση πολλών άλλων, μεταξύ των οποίων και της Medicago truncatula, είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ενός μεγάλου όγκου δεδομένων, αναφορικά με τον αριθμό γονιδίων που υπάρχουν σε κάθε είδος. Παράλληλα, το επιστημονικό ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στην αποκρυπτογράφηση του ρόλου των επιμέρους γονιδίων. Αυτό πραγματοποιήθηκε με την ανάπτυξη τεχνικών αντίστροφης γενετικής (Reverse 33

36 Genetics), κατά τις οποίες επιτυγχάνεται παρεμβολή με κάποιον τρόπο στην έκφραση ενός γονιδίου και στη συνέχεια καταγράφονται οι αντιδράσεις και οι προσαρμογές του φυτού στη μεταβολή αυτή, με άλλα λόγια περιγράφεται ο φαινότυπος της μετάλλαξης. Σημαντική ήταν προς αυτήν την κατεύθυνση η συμβολή μεθόδων, όπως η συγκαταστολή (co-suppression), η σίγηση δηλαδή ενός ενδογενούς γονιδίου, λόγω της παρουσίας ενός ομόλογου διαγονιδίου ή ιού καθώς και η μηκωδική τεχνολογία (antisense technology), στην οποία ένα μονόκλωνο μόριο DNA ή RNA υβριδίζεται, λόγω συμπληρωματικότητας σε ένα μόριο mrna, προκαλώντας διακοπή της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Αμφότερες οι τεχνικές παρεμβαίνουν στο μεταγραφικό ή μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Οι προαναφερθείσες τεχνικές, παρότι δεν αξιοποιήθηκαν σε ευρεία κλίμακα, στηρίζονται, όπως εκ των υστέρων αποδείχθηκε, στον μηχανισμό του παρεμβατικού RNA, ο οποίος τα τελευταία χρόνια έδωσε τη δυνατότητα ανάπτυξης μιας πιο αξιόπιστης μεθόδου μελέτης του ρόλου των γονιδίων (Kusaba, 2004; Waterhouse και Helliwell, 2003; Nusrat κ.ά., 2010; Jagtap κ.ά., 2011). Στην ανακάλυψη του RNAi οδηγήθηκαν στα τέλη της δεκαετίας του 1980, όταν, σε πειράματα με διαγονιδιακά φυτά, οι ερευνητές διαπίστωναν την αναστολή της έκφρασης του διαγονιδίου, με αποτέλεσμα να μην παράγεται η αναμενόμενη πρωτεΐνη. Συγκεκριμένα, το 1990, ο Jorgensen και οι συνεργάτες του εισήγαγαν το γονίδιο της συνθετάσης της χαλκόνης (chsa) σε φυτά του είδους Petunia hybrida L. και παρά το γεγονός ότι η έκφραση του γονιδίου ελεγχόταν από τον ισχυρό υποκινητή 35S CaMV, δεν παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασής του. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η μεταγραφή πραγματοποιούνταν με κανονικούς ρυθμούς, ωστόσο στη συνέχεια τα επίπεδα του ώριμου mrna μειώνονταν κατά πολύ (Napoli κ.ά., 1990). Επιπλέον, καταγράφηκαν περιπτώσεις, κατά τις οποίες το διαγονίδιο προκαλούσε διακοπή της έκφρασης ενός κανονικού ομοιολόγου γονιδίου του φυτού. Παρατηρήθηκε επίσης ότι η εισαγωγή, σε φυτικούς οργανισμούς, γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη βιοσύνθεση προστατευτικών πρωτεϊνών του ιικού περιβλήματος, προάγει την ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο ιό (Auer και Frederick, 2009). Tα φαινόμενα αυτά χαρακτηρίστηκαν ως κατάπαυση (quelling) στους μύκητες, ως μετα-μεταγραφική γονιδιακή σίγηση στα φυτά (Post-transcriptional Gene Silencing PTGS) και ως παρεμβατικό RNA στα ζώα (RNA interference RNAi). Λίγα χρόνια μετά την ανακάλυψη αυτή, οι Guo και Kemphues (1995) παρατήρησαν ότι η εισαγωγή κωδικού και μη κωδικού RNA για ένα ορισμένο γονίδιο στον οργανισμό- 34

37 στόχο είναι δυνατό να καταστείλει τη γονιδιακή έκφραση, με τρόπο που εξαρτάται από το είδος της αλληλουχίας που αποτελεί το στόχο. Αργότερα, άλλοι ερευνητές διαπίστωσαν ότι η πραγματική αιτία της σίγησης ενός γονιδίου ήταν η ύπαρξη μορίων δίκλωνου RNA (double-stranded RNA dsrna), τα οποία δεν επιδρούν στα εσώνια, γι αυτό και το RNAi θεωρείται ως μετα-μεταγραφικό φαινόμενο (Tabara κ.ά., 1995; Montgomery κ.ά., 1998; Kusaba, 2004). Παράλληλα, οι Hamilton και Baulcombe εντόπισαν την παρουσία ενός μικρού μορίου RNA μήκους περίπου 25 νουκλεοτιδίων, ομόλογο προς το γονίδιο-στόχο του PTGS και λίγο αργότερα τα μόρια αυτά εντοπίστηκαν και στη Drosophila, σε in vitro συνθήκες (Baulcombe, 2004). ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΤΟΣ ΕΙΔΟΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ PTGS 1986 Φυτό Kusaba, 2004 Συγκαταστολή (Cosuppression) 1990 Φυτό Napoli κ.ά mirna 1993 Ζώο Baulcombe, 2004 VIGS 1995 Φυτό Guo και Kemphues, η περιγραφή RNAi 1998 Ζώο Fire κ.ά., 1998 hprna διαγονίδιο 1998 Φυτό Waterhouse κ.ά., 1998 sirna 1999 Φυτό Hamilton και Baulcombe, 1999 RdRP 1999 Φυτό Κusaba, 2004 RISC 2000 Ζώο Hammond κ.ά., 2000 Dicer 2001 Ζώο Bernstein κ.ά., 2001 Πίνακας 2.4. Χρονολογικός πίνακας, που απεικονίζει τις ανακαλύψεις που έγιναν, σχετικά με τα RNAi φαινόμενα. Τροποποιημένος από Kusaba (2004). H πρώτη περιγραφή του μηχανισμού RNAi έγινε το 1998 στο νηματώδη Caenorhabditis elegans και ως το 2001 είχε αποκαλυφθεί ουσιαστικά το σύνολο της διαδικασίας, που φαίνεται στον Πίνακα 2.4 (Fire κ.ά., 1998; Kusaba, 2004). Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, ο μηχανισμός του RNAi ενεργοποιείται, όταν στο κύτταρο και ειδικότερα στον πυρήνα υπάρχουν μόρια dsrna. Τα μόρια αυτά είναι είτε ενδογενούς προέλευσης και προέρχονται κατά κανόνα από τη μεταγραφή μεταθετών στοιχείων (transposons) και αλληλουχιών επαναληπτικού DNA, είτε εξωγενούς προέλευσης, και περιλαμβάνουν τα διάφορα διαγονίδια που εισάγονται τεχνητώς σε συνθήκες in vitro, καθώς και το γενετικό υλικό διαφόρων ιών. Τα μόρια dsrna 35

38 μπορούν να καταταγούν σε τρεις διακριτές μορφές : 1) δίκλωνα μόρια RNA, τα οποία προέρχονται από επαναληπτικές αλληλουχίες και σχηματίζουν δομή φουρκέτας (hairpin RNA hprna), 2) δίκλωνα μόρια RNA που προκύπτουν από μονόκλωνο RNA, με τη δράση της RNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (RNA- directed RNA Polymerase RdRP) και 3) RNA ιογενούς προέλευσης. Το δίκλωνο RNA αναγνωρίζεται ως ξένης προέλευσης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της διαδικασίας διάσπασής του, στην οποία σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν εξειδικευμένες ενδονουκλεάσες, που εδράζονται στον πυρήνα και είναι γνωστές ως dicers. Το όνομα των ενδονουκλεασών προέρχεται από το γονίδιο dicer που ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στο έντομο Drosophila melanogaster (Wesley κ.ά., 2001; Price και Gatehouse, 2008; Auer και Frederick, 2009). Τα ένζυμα αυτά ανήκουν στην ομάδα της RNΑάσης ΙΙΙ και έχουν την ικανότητα να διασπούν το dsrna σε μικρότερα κομμάτια, με μια διαδικασία που εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα ΑΤΡ. Τα προϊόντα της διάσπασης διακρίνονται σε μικρά παρεμβατικά RNA (small interfering RNA sirna) και σε μικροrna (microrna mirna). Το sirna αποτελεί συστατικό των κυττάρων, έχει μήκος ζεύγη βάσεων και πιθανώς στοχεύει στη σίγηση επαναληπτικών γονιδίων, μεταθετών στοιχείων και ιών, ενώ κάποια μόριά του παρεμποδίζουν, είτε τη μετάφραση, είτε και τη μεταγραφή (Bonetta, 2004; Kusaba, 2004). Στο φυτό Arabidopsis thaliana, όπου έχουν εντοπιστεί ως τώρα περίπου 2 εκατομμύρια μικρά μόρια RNA (Auer και Frederick, 2009), απαντώνται τρία είδη ενδογενούς sirna : 1) sirna σχετιζόμενα με τη χρωματίνη, όπου η σίγηση επιτυγχάνεται μέσω της μεθυλίωσης των ιστονών, του DNA και της χρωματίνης, 2) μη-κωδικά μεταγραφόμενα μόρια sirna, τα οποία προκύπτουν από cis-ενεργά μη-κωδικά μετάγραφα και 3) trans- ενεργά μόρια sirna, τα οποία προέρχονται από μη-κωδικά μετάγραφα που αποτελούν στόχους του mirna (Mao κ.ά., 2009). Τα mirna είναι μόρια με μήκος ζεύγη βάσεων και πιθανώς προκύπτουν από πρόδρομα μόρια RNA, τα οποία μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ (Kusaba, 2004). Μετά την κατάτμηση του dsrna από τα ένζυμα της ομάδας των dicers, τα mirna και sirna μόρια που προκύπτουν, εγκαταλείπουν τον πυρήνα και προωθούνται στο κυτόπλασμα, όπου αναγνωρίζονται από το RNA Επαγόμενο Σύμπλεγμα Σίγησης (RNA-induced Silencing Complex RISC). Πρόκειται για ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα, στο οποίο κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζει η πρωτεΐνη Αργοναύτης (Argonaute AGO). Τα δίκλωνα μόρια RNA αποδιατάσσονται, με αποτέλεσμα η μη- 36

39 κωδική αλυσίδα να ενσωματώνεται στο RISC, ενεργοποιώντας το σύμπλεγμα αυτό, ενώ αντίθετα η κωδική να αποβάλλεται ή να διασπάται. Το φαινόμενο αυτό πιθανώς σχετίζεται με τη θερμοδυναμική αστάθεια του 5 άκρου της μη-κωδικής αλυσίδας, που έχει ως συνέπεια την ταχεία πρόσδεσή της στο RISC, ενώ το 5 άκρο της κωδικής, λόγω μεγαλύτερης θερμοδυναμικής σταθερότητας δεν ενσωματώνεται σε κάποια άλλη δομή. Το 3 άκρο της μη-κωδικής, αν και έχει μεγαλύτερη ανάγκη συμμετοχής σε σταθερές δομές, φαίνεται τελικώς ότι δεν είναι απαραίτητο στη διαδικασία (Bonetta, 2004). Στη συνέχεια, η μη-κωδική αλυσίδα καθοδηγεί το RISC προς ένα ομόλογο, σύμφωνα με τους κανόνες της συμπληρωματικότητας, mrna, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της διαδικασίας ενδονουκλεολυτικής αποικοδόμησης του mrna- στόχου. Οι στόχοι του RNAi είναι δυνατόν να περιλαμβάνουν, εκτός από τις κωδικές περιοχές του mrna και σημεία της 3 αμετάφραστης περιοχής (3 untranslated region UTR Kusaba, 2004). Στην περίπτωση που η μη-κωδική αλυσίδα είναι sirna, για την επίτευξη σίγησης απαιτείται κατά κανόνα πλήρης συμπληρωματικότητα με το mrna-στόχο, καθώς, ελλείψει αυτής, μειώνεται η αποτελεσματικότητα κατάτμησης του στόχου. Ωστόσο, στα φυτά διαπιστώνεται ότι η ύπαρξη μικρών διαφορών είναι ανεκτή, με την προϋπόθεση ότι δεν αφορά σε νουκλεοτίδια που βρίσκονται στο κέντρο του sirna (Kusaba, 2004). Αντιθέτως, στην περίπτωση που η μη-κωδική αλυσίδα προέρχεται από mirna, η ύπαρξη απόλυτης συμπληρωματικότητας με το mrna-στόχο οδηγεί σε κατάτμηση του δευτέρου, ενώ η έλλειψη πλήρους συμπληρωματικότητας απλώς παρεμποδίζει τη μετάφραση. Η σίγηση επιτυγχάνεται κατά μέσο όρο εντός ωρών (Kusaba, 2004). Το σύνολο της διαδικασίας απεικονίζεται στην Εικόνα 2.3. Πρόσφατα, στα φυτά και τους νηματώδεις διαπιστώθηκε η ύπαρξη ενός μηχανισμού που επιτρέπει τη διασυστηματική εξάπλωση της γονιδιακής σίγησης και τη διατήρησή της σε όλα τα στάδια ανάπτυξης (Price και Gatehouse, 2008). Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό, το ένζυμο RdRP, αλληλεπιδρώντας με το RISC, ανασυνθέτει μόρια dsrna, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την αλληλουχία του mrna-στόχου και ως εκκινητές τα μόρια του sirna. To dsrna που παράγεται, γίνεται εκ νέου στόχος των ενζύμων dicers, με αποτέλεσμα την επανάληψη της διαδικασίας κατάτμησής του. Με τον τρόπο αυτό, διατηρούνται σταθερά τα επίπεδα των μορίων αυτών, σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του οργανισμού (Αuer και Frederick, 2009). Στη συνέχεια, τα μόρια του sirna ή του mirna μεταφέρονται και εκτός του κυττάρου, μέσω των πλασμοδεσμών. Αυτός ο τρόπος διακυτταρικής εξάπλωσης του RNAi περιορίζεται 37

40 στα γειτονικά κύτταρα (Mao κ.ά., 2009). Η μεταφορά του RNAi σε διασυστηματικό Εικόνα 2.3. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας παρεμβατικού RNA στο κυτόπλασμα, μετά την κατάτμηση του dsrna από τα ένζυμα dicers.τροποποιημένο από Chiu και Rana (2003). 38

41 επίπεδο εξασφαλίζεται μέσω του φλοιώματος (Yoo κ.ά, 2004; Price και Gatehouse, 2008). Στα έντομα και τα σπονδυλωτά, τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη βιοσύνθεση της RdRP φαίνεται ότι απουσιάζουν (Gordon και Waterhouse, 2007; Price και Gatehouse, 2008; Gatehouse, 2008). Με την ενεργοποίηση του μηχανισμού του RNAi, ο οργανισμός επιτυγχάνει α) τη μείωση ή διακοπή της έκφρασης των γονιδίων, και την κατάτμηση των mrnaστόχων, β) τη μείωση ή διακοπή της γονιδιακής έκφρασης, παρεμβαίνοντας στη μετάφραση, γ) την, κατευθυνόμενη από μικρά μόρια RNA, μεθυλίωση του DNA (RNA directed DNA methylation RdDM), σε περιοχές του DNA, ομόλογες προς τα μικρά μόρια RNA. Επιπλέον, το φαινόμενο του RNAi συσχετίζεται με την καταστολή της δραστηριότητας διαφόρων μεταθετών στοιχείων, την αντοχή σε ιολογικές προσβολές και την επιγενετική ρύθμιση της δομής της χρωματίνης (Dykxhoorn κ.ά., 2003). Σε αρκετές περιπτώσεις, κατά τη διαδικασία της μεταγραφής, παράγονται μόρια RNA, τα οποία αποτελούνται από συμπληρωματικά μεταξύ τους ριβονουκλεοτιδικά τμήματα (Auer και Frederick, 2009). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, τα τμήματα να σχηματίζουν ένα δίκλωνο μόριο hprna, στο ένα άκρο του οποίου διαμορφώνεται μια δομή φουρκέτας, που προκύπτει από ριβονουκλεοτίδια, τα οποία δεν σχημάτισαν δεσμούς, λόγω μη συμπληρωματικότητας. Το μόριο αυτό αποτελεί στόχο του μηχανισμού του παρεμβατικού RNA. Το γεγονός αυτό αξιοποιείται ευρέως τα τελευταία χρόνια από τους ερευνητές στη βελτίωση των φυτών και ιδιαίτερα στην ανάλυση της λειτουργίας των γονιδίων, καθώς είναι δυνατό να σχεδιαστούν στο εργαστήριο διαγονίδια, τα οποία, όταν εισαχθούν στον ιστό ή οργανισμό-στόχο, κωδικοποιούν για ένα μόριο hprna. Συγκεκριμένα, το διαγονίδιο κλωνοποιείται ως ανεστραμμένο αντίγραφο, στο μέσον του οποίου παρεμβάλλεται μια μη σχετική με το γονίδιο αλληλουχία, που συνήθως κωδικοποιεί για ένα λειτουργικό εσώνιο. Η έκφραση του διαγονιδίου ελέγχεται από έναν ισχυρό υποκινητή, όπως ο 35 S CaMV για τα δικοτυλήδονα φυτά και ο υποκινητής της ουμπικιτίνης 1 του καλαμποκιού για τα μονοκοτυλήδονα. Το εσώνιο είναι απαραίτητο για την εξασφάλιση της σταθερότητας του ανεστραμμένου αντιγράφου, εντός των βακτηρίων στα οποία εισάγεται, αυξάνοντας κατά πολύ το ποσοστό επιτυχίας της σίγησης. Ωστόσο, ο ακριβής του ρόλος στη διαδικασία παραμένει αδιευκρίνιστος (Waterhouse και Helliwell, 2003; Kusaba, 2004). 39

42 Η τεχνική αυτή αξιοποιείται για τη γενετική τροποποίηση φυτών με διαγονίδια, τα οποία κωδικοποιούν για hprna ή ιογενές RNA, καθώς και για την παροδική (transient) τροποποίηση που πραγματοποιείται α) με βομβαρδισμό φυτικών κυττάρων με μικροσφαιρίδια χρυσού, καλυπτόμενα από νουκλεϊκά οξέα, β) με εμβάπτιση φυτικών κυττάρων σε διάλυμα αγροβακτηρίων που φέρουν το διαγονίδιο. Η παραγωγή μεγάλου αριθμού μόνιμα γενετικώς τροποποιημένων φυτών είναι ιδιαίτερα εύκολη, καθώς το hprna είναι γενετικώς κυρίαρχο, επομένως δεν απαιτείται η παραγωγή ομοζύγωτων σειρών και τα μεταμορφωμένα φυτά μπορούν να επιλεγούν με βάση το φαινότυπο (Wesley κ.ά., 2001). Η μέθοδος κρίνεται αποτελεσματική και για πολυπλοειδή φυτά και πολυγονιδιακές οικογένειες, καθώς επιτρέπει τη στοχευμένη σίγηση ενός γονιδίου, αποφεύγοντας τις ανεπιθύμητες μεταλλάξεις (Stoutjesdijk κ.ά., 2002). Στις επόμενες γενιές, η κληρονόμηση φαίνεται ότι είναι ασταθής, ωστόσο έχει αναφερθεί ότι μπορεί να διατηρηθεί τουλάχιστον ως και την Τ 5 γενιά, όπως έδειξαν πειράματα σε φυτά Arabidopsis thaliana (Kusaba κ.ά., 2003; Kusaba, 2004 ). Τα τελευταία χρόνια, αναπτύχθηκε μια νέα τεχνική, η οποία δεν απαιτεί τη χρήση των κλασικών και χρονοβόρων διαδικασιών γενετικής τροποποίησης. Πρόκειται για την Ιογενή Γονιδιακή Σίγηση (Virus-Induced Gene Silencing VIGS), κατά την οποία ενσωματώνεται μια εξωγενής αλληλουχία σε συγκεκριμένη τοποθεσία του γενώματος του ιού, χωρίς να διαταράσσεται η ικανότητά του να προσβάλλει το φυτό. Όταν για την προσβολή του φυτού χρησιμοποιούνται τα μετάγραφα του ιού, οι ξένες αλληλουχίες επάγουν την αντίδραση του μηχανισμού RNAi του φυτού-ξενιστή (Kumagai κ.ά., 1995; Baulcombe, 1999). Κατά κανόνα, η εξωγενής αλληλουχία που εισάγεται στο γένωμα του ιού έχει μήκος νουκλεοτιδίων, ωστόσο αλληλουχίες μήκους νουκλεοτιδίων είναι εξίσου αποτελεσματικές. Η τεχνική VIGS εφαρμόστηκε για πρώτη φορά από τους Kumagai κ.ά. (1995), όταν τμήμα του ενδογενούς φυτικού γονιδίου της αποκορεσμάσης του φυτοενίου (phytoene desaturase, PDS), η οποία κωδικοποιεί για ένα ένζυμο της μεταβολικής βιοσυνθετικής οδού των καροτενοειδών, εισήχθη σε έναν παθογόνο κλώνο του ιού του μωσαϊκού του καπνού (TMV), ώστε ο ιός να είναι σε θέση να παράγει, τόσο την κωδική, όσο και τη μη κωδική αλυσίδα RNA του PDS. Στη συνέχεια, αξιοποιήθηκαν και άλλοι ιοί, όπως ο CbLCV (Cabbage Leaf Curl Virus), o οποίος είναι ιδιαίτερα χρήσιμος, καθώς ένα σύστημα VIGS βασισμένο σε αυτόν, έχει αποδειχθεί ότι επάγει το μηχανισμό του παρεμβατικού RNA σε φυτά Arabidopsis thaliana (Turnage κ.ά., 40

43 2001). Επιπλέον, ορισμένοι ιοί της ομάδας των geminivirus πιθανώς παράγουν dsrna και με αυτόν τον τρόπο εμπλέκονται στο μηχανισμό του RNAi (Kjemtrup κ.ά., 1998; Turnage κ.ά., 2001; Waterhouse και Helliwell, 2003). Παράλληλα με το VIGS, αναπτύχθηκε πρόσφατα και η τεχνική του Ιογενώς Επαγόμενου Δορυφορικού Συστήματος Σίγησης (Satellite-virus-induced Silencing System SVISS), σύμφωνα με το οποίο η αλληλουχία-στόχος ενσωματώνεται στο δορυφορικό RNA και στη συνέχεια εισάγεται μέσω αυτού στο φυτό. Η τεχνική αυτή έδωσε καλά αποτελέσματα σε γονίδια, όπως το PDS και CESA (cellulose synthase A), χρησιμοποιώντας δορυφορικό RNA μιας φυλής U2 του TMV (Angell και Baulcombe, 1997). Τα οφέλη από την εφαρμογή της τεχνολογίας RNAi στη βελτίωση των καλλιεργούμενων φυτών είναι : 1) η επίτευξη αρρενοστειρότητας, 2) η τροποποίηση ποιοτικών χαρακτηριστικών, όπως η απάλειψη αλλεργιογόνων ουσιών και η μείωση της συγκέντρωσης τοξικών ενώσεων, 3) η παραγωγή ποικιλιών ανθεκτικών σε ιούς, νηματώδεις, βακτήρια, μύκητες και έντομα και 4) η γενετική ανάλυση, με σκοπό την κατανόηση της λειτουργίας των γονιδίων (Kusaba, 2004; Price και Gatehouse, 2008; Auer και Frederick, 2009; Nusrat κ.ά., 2010; Jagtap κ.ά., 2011). Tο 1992, η δημιουργία της τομάτας Flavr Savr επετεύχθη με σίγηση του γονιδίου της πολυγαλακτουρονάσης, υπεύθυνης για την ταχεία ωρίμανση του καρπού (Auer και Frederick, 2009). H πρώτη εμπορικά αξιοποιημένη ποικιλία, στην οποία χρησιμοποιήθηκε ασυνείδητα ο μηχανισμός του παρεμβατικού RNA, ήταν το μετάλλαγμα ρυζιού LGC-1 (Low Glutelin Content-1). Πρόκειται για μια κυρίαρχη μετάλλαξη, κατά την οποία παράγεται hprna από ένα ανεστραμμένο επαναλαμβανόμενο τμήμα του γονιδίου glutelin, που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή της αποταμιευτικής πρωτεΐνης γλουτελίνης. Τα πειράματα ξεκίνησαν τη δεκαετία του 1970, όταν απομονώθηκε το μετάλλαγμα και οδήγησαν στην παραγωγή μιας ποικιλίας χρήσιμης σε νεφροπαθείς, με περιορισμένη ικανότητα λήψης της γλουτελίνης. Από τότε, το τροποποιημένο γνώρισμα εμφανίζεται σταθερά επί 20 γενιές (Kusaba, 2004). Οι σημαντικότερες εφαρμογές του παρεμβατικού RNA στη βελτίωση των φυτών αφορούν στην προστασία των ποικιλιών από διάφορα παθογόνα αίτια, ιούς, βακτήρια, νηματώδεις και έντομα (Jagtap κ.ά., 2011). Ειδικότερα στους ιούς, ο στόχος του παρεμβατικού RNA είναι η σίγηση γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες του ιικού καψιδίου (Viral Coat Protein Genes VCPG). Ωστόσο, παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε διάφορες κατηγορίες ιών, δεν κατέστη ως τώρα 41

44 δυνατή η επίτευξη ανθεκτικότητας σε ιούς της ομάδας των geminivirus, των οποίων το γενετικό υλικό είναι μονόκλωνο RNA (Auer και Frederick, 2009). Στα βακτήρια, η σίγηση των γονιδίων iaam και ipt μείωσε το σχηματισμό καρκινικών όγκων σε φυτά προσβεβλημένα από τροποποιημένα Agrobacterium tumefaciens, ενώ στους νηματώδεις, η παραγωγή δίκλωνων μορίων RNA, με στόχο το 16D10, γονίδιο που σχετίζεται με την αλληλεπίδραση φυτού-παρασίτου, απέτρεψε το σχηματισμό όγκων στις ρίζες φυτών Arabidopsis thaliana και μείωσε την απόθεση αυγών (Auer και Frederick, 2009). Η τροποποίηση των νηματωδών είναι ιδιαίτερα εύκολη, καθώς επιτυγχάνεται με απλή εμβάπτισή τους σε διάλυμα που περιέχει dsrna ή με χορήγηση τροποποιημένων βακτηρίων, μέσω της τροφής τους (Fraser κ.ά., 2000; Maeda κ.ά., 2001). Όσον αφορά στα έντομα, διαγονιδιακά φυτά καλαμποκιού με dsrna, συμπληρωματικό προς το mrna της ΑΤΡάσης Α, που παράγεται στα κύτταρα του μεσοστομάχου των εντόμων, όταν χορηγήθηκαν σε προνύμφες των ειδών Diabrotica virgifera virgifera και Leptinotarsa decemlineata, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα θνησιμότητας. Παράλληλα, σίγηση του γονιδίου CYP6AE14, υπεύθυνου για τη βιοσύνθεση της μονοξυγενάσης του cytp450, ενζύμου που μεταβολίζει το τοξικό τερπενοειδές γκοσσυπόλη, είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη θνησιμότητα προνυμφών τoυ είδους Helicoverpa armigera (Price και Gatehouse, 2008; Auer και Frederick, 2009). Παρά την αδιαμφισβήτητη χρησιμότητα του μηχανισμού του παρεμβατικού RNA στη βελτίωση των φυτών, πρέπει να αναφερθεί και η ύπαρξη κινδύνων που σχετίζονται με την επίδρασή του σε ωφέλιμους οργανισμούς. Συγκεκριμένα, είναι δυνατό να υπάρχει ομολογία μικρών μορίων RNA του τροποποιημένου φυτού με το mrna ωφέλιμων οργανισμών, ειδικότερα όταν οι τελευταίοι ανήκουν σε συγγενικά με το στόχο είδη. Επιπλέον, κατά την εφαρμογή της τεχνολογίας RNAi στα φυτά, παρατηρήθηκε και απροσδόκητη θνησιμότητα γύρης (Auer και Frederick, 2009). Είναι συνεπώς φανερό, ότι απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για την ανάπτυξη μεθόδων αποτροπής των ανεπιθύμητων παρενεργειών και για την ανεύρεση κατάλληλων δικλείδων ασφαλείας, οι οποίες θα ελαχιστοποιήσουν τις δυσμενείς επιπτώσεις της γενετικής βελτίωσης των φυτών στο περιβάλλον. Η προαναφερθείσα τεχνική του RNAi που μειώνει την έκφραση ενός γονιδίου, καθώς και οι τεχνικές υπερέκφρασης των γονιδίων, μπορούν να δώσουν απαντήσεις στα διάφορα ερωτήματα που σχετίζονται με το ρόλο της φυτικής καταλάσης στη συμβίωση. Με τις τεχνικές αυτές μπορεί να ελεγχθεί η επίδρασή της στην 42

45 εγκαθίδρυση της φυματιοποίησης, την αποτελεσματικότητα της αζωτοδέσμευσης και την ανταπόκριση στις αβιοτικές καταπονήσεις. Στην παρούσα διατριβή, πραγματοποιήθηκε σίγηση του γονιδίου της καταλάσης του φυτού-μοντέλου των ψυχανθών Medicago truncatula, με την εφαρμογή παρεμβατικού RNA, καθώς και μελέτη της επίδρασης της σίγησης στους μηχανισμούς εγκαθίδρυσης συμβιωτικής σχέσης με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Sinorhizobium meliloti, σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης. 43

46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Σχεδιασμός εκκινητών και πολλαπλασιασμός αλληλουχιών DNA. Για την ενεργοποίηση του μηχανισμού της παρεμβολής RNA, πολλαπλασιάστηκε, με τη βοήθεια της τεχνικής της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), ένα τμήμα της κωδικής αλληλουχίας του cdna (Εικόνα 3.1) του γονιδίου της καταλάσης της Medicago truncatula. Οι σχετικές πληροφορίες για το cdna αυτό αντλήθηκαν από τη βάση δεδομένων TIGR Plant Transcript Assemblies ( plantta.jcvi.org/) To cdna της καταλάσης ήταν ενσωματωμένο στο DNA ενός πλασμιδίου και χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο στην PCR. Η αλληλουχία Cat-Mtr είχε μήκος 417 ζεύγη βάσεων. Οι κατάλληλες αλληλουχίες που αποτελούν θέσεις αναγνώρισης περιοριστικών ενζύμων, ενσωματώθηκαν στο τμήμα Cat-Mtr, μέσω των εκκινητών. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Για το Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό : Cat-xhokpn5 5 - GGC CCG CTC GAG CCA ACC CCA 3 Cat-xhokpn3 5 - GGC CGG GGT ACC CAG GCC AAG 3 Για το Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό : Cat-xbacla5 5 - GGC CCG ATC GAT CAG GCC AAG TC- 3 Cat-xbacla3 5 - GGC GGG TCT AGA CCA ACC CCA AG- 3 Η αλληλουχία στο 3 άκρο κάθε εκκινητή χρησίμευσε για την πρόσδεσή του στο cdna και επισημαίνεται με πράσινο χρώμα. Οι 6 βάσεις που απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα, αποτελούσαν τις θέσεις αναγνώρισης του ειδικού περιοριστικού ενζύμου, ενώ κάθε εκκινητής διέθετε 6 επιπλέον νουκλεοτίδια στο 5 άκρο, τα οποία επισημαίνονται με γαλάζιο χρώμα και διευκολύνουν την πέψη με τα κατάλληλα περιοριστικά ένζυμα. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 20 μl, όπου περιέχονταν 1 μl DNA, 2,1 μl PCR Buffer, 1,68 μl dntps, 0,63 μl ανοδικού εκκινητή, 0,63 μl 44

47 καθοδικού εκκινητή, 0,53 μl KAPA Taq πολυμεράσης (KAPA Biosystems, Massachusetts, USA) και 13,43 μl dd H 2 O. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν : α) αρχική αποδιάταξη του DNA στους 94 O C για 2 min, β) 40 κύκλοι, όπου επαναλαμβάνονταν οι εξής διαδοχικές διαδικασίες : αποδιάταξη DNA στους 94 O C για 20 s, υβριδισμός εκκινητών στους 52 O C για 1 min και επιμήκυνση της σχηματιζόμενης αλληλουχίας στους 72 O C για 40 s. Μετά το πέρας του σταδίου των 40 κύκλων ακολούθησε ένα επιπλέον στάδιο τελικής επιμήκυνσης στους 72 O C για 10 min και ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%, εμβαπτισμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα 1xΤΑΕ. CAT 1 GTGTTATTTA TATATGAGGC tgataagact CGCGATTATC agcacgaaat WGTTTTGTCA 61 ATTTCTTAAT CTCTATCCAT TTCTTCTTCT CCACCGTCCT CATCCTTTCT CTCTACCATT 121 ACCAACCATG GATCCATACA AGCACCGTCC GTCCAGCGCT TACAATTCTC CTTTCTGGAC 181 TACAAATTCT GGCGCACCTG TTTGGAATAA CAACTCATCC CTAACCGTTG GATCCAGAGG 241 TCCAATTCTC TTGGAAGATT ATCATCTTGT GGAAAAGCTT GCCCAATTTG ATAGGGAACG 301 GATCCCAGAA CGTGTTGTCC ATGCCAGGGG AGCAAGTGCA AAGGGTTTCT TTGAAGTCAC 361 ACATGATATT TCGCACCTGA CTTGTGCAGA TTTCCTACGA GCTCCTGGAG TTCAGACACC 421 CGTCATTGTG CGTTTCTCCA CTGTCATTCA TGAACGTGGT AGCCCTGAAA CCTTGAGAGA 481 CCCTCGAGGT TTTGCTGTGA AATTTTACAC CAGAGAGGGT AACTTTGACC TTGTTGGAAA 541 CAACTTTCCT GTCTTCTTCG TTCACGACGG GATGAATTTT CCAGATATGG TCCATGCTCT 601 TAAACCCAAC CCCAAGTCCC ACATTCAGGA GAATTGGAGA ATCCTTGACT TCTTTTCTCA 661 CTTTCCAGAA AGCCTTCACA TGTTCTCCTT CCTATTTGAT GATGKGGGTG TCCCACAAGA 721 TTATAGGCAC ATGGATGGTT TTGGAGTTAA CACATATTCC CTGATCAACA AGGCTGGGAA 781 AGCAGTGTAC GTGAAATTTC ACTGGAAGCC CACATGTGGT GTGAAGTGTC TGTTAGAGGA 841 AGAGGCCATT AAGGTGGGAG GAGcCAACCA CAGCCATGCT ACTCAAGACC TgTATGATTC 901 AATTGCTGCT GGTAAcTATC CTGaGTGGAA AcTGTTTGTT CAAACAATAG ATCCTGCTCA 961 CGAAGATAAA TTTGATTTTG ACCCACTTGA TGTAACTAAG ACTTGGCCTG AGGACATTAT 1021 ACCCCTTCAG CCCGTAGGTC GCCTGGTCTT GAACAAGAAC ATAGACAATT TCTTTGCTGA 1081 GAATGAACAA CTTGCATTTT GTCCTGCCAT TATTGTGCCT GGTGTATATT ACTCGGATGA 1141 TAAGATGCTT CAAACCAGGA TTTTCTCTTA TGCTGATTCA CAGAGGCACA GGCTTGGGCC 1201 AAACTATCTG CAACTTCCtG CTAAtGCTCC CAAGTGTGCT CACCACAACA ATCACCAtGA 1261 GGGtTTCaTG AATTTCATTC ACAGGGATGA AGAGGTcAAT TACTTCCCtt CaAGGCaTGA 1321 TCCTGTTCGT CATGCAGAAA AGGTTCCCAT TCCTACTGCT AATTTCTCTG CATGCCGTGA 1381 AAAGTGCAAT ATTCCAAAGC AGAACAACTT CAAGCAGCCT GGAGAGCGAT ACCGATCTTG 1441 GGCACCCGAC AGGCAAGATA GATTTCTCCG CAGATGGGTG GATGCTTTAT CCGATCCACG 1501 CGTCACCCAT GAAATCCGCA GCATCTGGAT CTCATACTGG TCTCAGGCTG ATCGTTCTCT 1561 TGGACAAAAG ATTGCATCTC ATCTGAACAT GAGGCCTAGC ATTTAAGGTT GTTGCGAAAC 1621 ATTGAATTAT CGCCAGAGTT GCAGATGTTG AAATTGTATG ATAAAGGATG TTTGTTTGGA 1681 TAATTTAAAG GACTCTTATT TTTCTTGCAA TATTATATCG TGAATGTATA CAATAAACTC 1741 CATGTACGTG ACTCGTTGAG CTGTTACAAT AAATGTCGTT TGTATTATTT ACAAAAAAAA 1801 AAAAAAAAAA AACKCGAGGG GGGGCCCGGT ACCCAATTSG CCCTATAGTG AGTCGTATTA 1861 CAATTMACTG GCCGTCGTTT TTTTKNGWCG T Εικόνα 3.1. Πλήρης αλληλουχία του cdna της καταλάσης της Medicago truncatula. Με κίτρινο χρώμα επισημαίνονται οι θέσεις των εκκινητών και με γαλάζιο το τμήμα του cdna που πολλαπλασιάστηκε με PCR. 45

48 3.2. Ενσωμάτωση αλληλουχιών στο φορέα phannibal και εισαγωγή σε δεκτικά κύτταρα DH5α. Η αλληλουχία Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό διαθέτει στα άκρα της θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων XhoI και KpnI και η αλληλουχία Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό αντίστοιχα στα άκρα της θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων XbaI και ClaI. Οι θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων απεικονίζονται στον Πίνακα 3.1. Οι θέσεις αυτές υπάρχουν στο πλασμίδιο phannibal, εκατέρωθεν του, μήκους 745 ζευγών βάσεων, εσωνίου της πυροσταφυλικής αποκαρβοξυλικής κινάσης (pdk), όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.2. Περιοριστικό ένζυμο XhoI KpnI Θέση αναγνώρισης 5 - C TCGAG GAGCT C GGTAC C-3 3 -C CATGG-5 XbaI 5 -T CTAGA AGATCT T-5 ClaI 5 -AT CGAT-3 3 -TAGC TA-5 Πίνακας 3.1. Περιοριστικά ένζυμα και θέσεις αναγνώρισης στο DNA. Το phannibal είναι ένα τεχνητό πλασμίδιο, που έχει την ικανότητα να δέχεται εύκολα διάφορες αλληλουχίες DNA, μεγέθους άνω των 300 ζευγών βάσεων (Wesley κ.ά., 2001). Τα προϊόντα της PCR κλωνοποιούνται στον phannibal με τέτοιο τρόπο, ώστε η κωδική και μη κωδική αλληλουχία να είναι τοποθετημένες εκατέρωθεν του pdk, με αντίθετο προσανατολισμό. 46

49 Εικόνα 3.2. Χάρτης του πλασμιδίου phannibal (από CSIRO Plant Industry, Canberra, Australia). Για την ενσωμάτωση της αλληλουχίας Cat-Mtr με άκρα XhoI/ KpnI στον phannibal, τόσο το CDNA, όσο και το πλασμίδιο, κόπηκαν ταυτόχρονα με τα περιοριστικά ένζυμα XhoI και KpnI, στους 37 O C, όλη τη νύχτα. Σε τελικό όγκο 10 μl, περιέχονταν 5 μl DNA, 1 μl XhoI, 1μl KpnI, 1,4 μl ρυθμιστικό διάλυμα NΕΒ 1 (New England Biolabs Inc., Massachusetts, USA), 0,2 μl Bovine serum albumine (BSA) και 1,4 μl dd H 2 O. Στη συνέχεια, τα δείγματα απαλλάχθηκαν από περιττά νουκλεοτίδια, υπολείμματα εκκινητών, ενζύμων και αλάτων, με τη βοήθεια του DNA Purification Kit της Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany). Την κοπή με περιοριστικά ένζυμα, ακολούθησε αποφωσφορυλίωση, κατά την οποία αφαιρούνται οι φωσφορικές ομάδες από τα 5 άκρα του πλασμιδιακού DNA, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η επανασύνδεση των κομμένων άκρων του πλασμιδίου και να αυξάνονται οι πιθανότητες λήψης ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Η αποφωσφορυλίωση πραγματοποιήθηκε με επαναδιάλυση ποσότητας του κομμένου πλασμιδίου σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ, στο οποίο προστέθηκαν 0,5 μονάδες του ενζύμου αλκαλική φωσφατάση CIP (calf intestinal phosphatase) ανά μg πλασμιδίου. Για την κλωνοποίηση της αλληλουχίας Cat-Mtr XhoI/ KpnI στον phannibal, χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο KAPA Rapid Ligation, κατά το οποίο αναμίχθηκαν 50 ng κομμένου πλασμιδίου και 150 ng κομμένης αλληλουχίας cdna, συνολικού όγκου 10 μl, με 10 μl 2x KAPA ρυθμιστικό διάλυμα Rapid Ligation και 1 μl ενζύμου KAPA T4 DNA Ligase. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για λίγα δευτερόλεπτα και 47

50 παρέμεινε για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Αμέσως μετά, 2 μl (περίπου 5 ng) του μίγματος χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό 50 μl DH5α competent cells, με βάση το πρωτόκολλο KAPA Basic Transformation. Το μίγμα, μαζί με τα βακτήρια, επωάστηκε στον πάγο επί 30 min, υπέστη θερμικό σοκ για 2 min στους 42 Ο C και επανατοποθετήθηκε ευθύς αμέσως στον πάγο για 5 min. Ακολούθησε προσθήκη και ανάμιξη 950 μl θρεπτικού μέσου SOC (2% bactotryptone, 0,5% yeast extract, 2,5 mm KCl, 10 mm NaCl, 10 mm MgSO 4, 10 mm MgCl 2, 20 mm γλυκόζη) και παραμονή στους 37 Ο C επί 1h. Από το εναιώρημα των βακτηρίων, 100 μl τοποθετήθηκαν σε τριβλία Petri που περιείχαν στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB agar, με μέσο επιλογής το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (50 μg/ ml). Τα τριβλία παρέμειναν στους 37 O C για όλη τη νύχτα, με σκοπό τη λήψη μεμονωμένων αποικιών. Μετά τη λήψη μεμονωμένων αποικιών, ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με τη βοήθεια του QIAprep Spin Miniprep Kit της Qiagen, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή και έλεγχος με PCR, με σκοπό την πιστοποίηση της ενσωμάτωσης της αλληλουχίας Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό, στον ενδιάμεσο φορέα. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν : α) αρχική αποδιάταξη του DNA στους 95 O C για 3 min, β) 35 κύκλοι, όπου επαναλαμβάνονταν οι εξής διαδοχικές διαδικασίες : αποδιάταξη DNA στους 95 O C για 30 s, υβριδισμός εκκινητών στους 46 O C για 20 s και επιμήκυνση της σχηματιζόμενης αλληλουχίας στους 72 O C για 30 s. Μετά το πέρας του σταδίου των 35 κύκλων ακολούθησε ένα επιπλέον στάδιο τελικής επιμήκυνσης στους 72 O C για 1 min και ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%, εμβαπτισμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα 1xΤΑΕ. Ως ανοδικός εκκινητής χρησιμοποιήθηκε ο 35 S και ως καθοδικός ο cat-xhokpn3. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον πίνακα 3.2. ΕΚΚΙΝΗΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ 35 S 5 -ATT CAA GAT CTC TCT GCC GAC AGT G-3 Cat-xhokpn3 5 -GGC CGG GGT ACC CAG GCC AAG-3 PdkF 5 -TTA GTC GAA CAT GAA TAA ACA AGG TAA CAT-3 PhantermR 5 - TTC ATT AGA ATG AAC CGA AAC CGG-3 Πίνακας 3.2. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στους ελέγχους ενσωμάτωσης των αλληλουχιών, κατά την κατασκευή του φορέα έκφρασης. 48

51 Στη συνέχεια, η διαδικασία της κλωνοποίησης επαναλήφθηκε κατά τον ίδιο τρόπο για την αλληλουχία Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό, με τη διαφορά ότι πραγματοποιήθηκε κοπή της αλληλουχίας και του ήδη τροποποιημένου πλασμιδίου με τα περιοριστικά ένζυμα XbaI και ClaI και ότι η αλληλουχία ενσωματώθηκε ξανά, με αντίθετο προσανατολισμό. Ο έλεγχος των αποικιών που προέκυψαν από την ανωτέρω διαδικασία πραγματοποιήθηκε με PCR. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν : α) αρχική αποδιάταξη του DNA στους 95 O C για 3 min, β) 35 κύκλοι, όπου επαναλαμβάνονταν οι εξής διαδοχικές διαδικασίες : αποδιάταξη DNA στους 95 O C για 30 s, υβριδισμός εκκινητών στους 60 O C για 30 s και επιμήκυνση της σχηματιζόμενης αλληλουχίας στους 72 O C για 40 s. Μετά το πέρας του σταδίου των 35 κύκλων ακολούθησε ένα επιπλέον στάδιο τελικής επιμήκυνσης στους 72 O C για 2 min και ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%, εμβαπτισμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα 1xΤΑΕ. Ως ανοδικός εκκινητής χρησιμοποιήθηκε ο pdkf και ως καθοδικός ο phantermr (πίνακας 3.2). Ο έλεγχος της ενσωμάτωσης του δευτέρου ενθέματος με το σωστό προσανατολισμό, πραγματοποιήθηκε με PCR, σύμφωνα με τις ακόλουθες συνθήκες : α) αρχική αποδιάταξη του DNA στους 95 O C για 2 min, β) 35 κύκλοι, όπου επαναλαμβάνονταν οι εξής διαδοχικές διαδικασίες : αποδιάταξη DNA στους 95 O C για 30 s, υβριδισμός εκκινητών στους 45 O C για 20 s και επιμήκυνση της σχηματιζόμενης αλληλουχίας στους 72 O C για 40 s. Μετά το πέρας του σταδίου των 35 κύκλων ακολούθησε ένα επιπλέον στάδιο τελικής επιμήκυνσης στους 72 O C για 1 min και ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%, εμβαπτισμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα 1xΤΑΕ. Ως ανοδικός εκκινητής χρησιμοποιήθηκε ο pdkf και ως καθοδικός ο phantermr (πίνακας 3.2). Μετά το πέρας της διαδικασίας κλωνοποίησης των δύο αλληλουχιών, προέκυψε ένα μετασχηματισμένο πλασμίδιο phannibal, το οποίο έφερε τον ισχυρό υποκινητή CaMV 35 S, την αλληλουχία Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό, το εσώνιο pdk, την αλληλουχία Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό και την περιοχή του τερματιστή OCS. Ολόκληρη η περιοχή μεταξύ του υποκινητή και του τερματιστή ονομάζεται κασσέτα (cassette) και φέρει στα άκρα της θέσεις αναγνώρισης του περιοριστικού ενζύμου NotI. 49

52 3.3. Ενσωμάτωση της κασσέτας στο δυαδικό φορέα part27, για την κατασκευή φορέα έκφρασης Ο phannibal αξιοποιείται αποκλειστικά για την κλωνοποίηση των επιθυμητών αλληλουχιών, επειδή δεν έχει τη δυνατότητα να εισαχθεί σε φυτικά κύτταρα. Για το λόγο αυτό, η κασσέτα ενσωματώνεται στο φορέα part27 (Εικόνα 3.3), ο οποίος εισάγεται στο Agrobacterium rhizogenes. Η μεταφορά της κασσέτας επιτυγχάνεται, λόγω της ύπαρξης στον part27 μιας θέσης αναγνώρισης από το περιοριστικό ένζυμο NotI, όπως φαίνεται και από την Εικόνα 3.4. Προηγείται κοπή των δύο πλασμιδίων με το ένζυμο NotI και ακολουθεί κλωνοποίηση με τη βοήθεια του DNA Εικόνα 3.3. Χάρτης του πλασμιδίου part27 (10,9 kb). Διακρίνεται η θέση αναγνώρισης από το περιοριστικό ένζυμο NotI, στην περιοχή του οπερονίου της λακτόζης, lacz. H περιοχή Tn7 προσδίδει αντοχή στα αντιβιοτικά σπεκτινομυκίνη και στρεπτομυκίνη, ενώ η περιοχή nptii στο αντιβιοτικό καναμυκίνη (από Gleave, 1992). 50

53 Ligation Kit- Mighty Mix της TAKARA BIO Inc., California, USA, όπου σε 5-10 μl συνολικού όγκου DNA (αναλογία πλασμιδιακού DNA: κασσέτας 1:1 με 1:5), προστίθενται 5-10 ml Ligation Mix, αναμιγνύονται και επωάζονται για 30 min σε θερμοκρασία 16 0 C. Στη συνέχεια, 10 μl του μίγματος χρησιμοποιούνται για το μετασχηματισμό 100 μl E. coli DH5α competent cells.ο χάρτης της αλληλουχίας έκφρασης που σχηματίστηκε, απεικονίζεται στην Εικόνα 3.5. Εικόνα 3.4. Σχηματική απεικόνιση της κασσέτας που περιέχεται στο πλασμίδιο phannibal και θέση ενσωμάτωσής της στον φορέα part27. Οι όροι sense και antisense αναφέρονται στον προσανατολισμό, με τον οποίο εισήχθη η αλληλουχία Μεταμόρφωση βακτηρίων Αgrobacterium rhizogenes. Για την εισαγωγή του δυαδικού φορέα που περιέχει την κασσέτα στο Agrobacterium rhizogenes, χρησιμοποιήθηκαν μεμονωμένες αποικίες από 48ωρη καλλιέργεια βακτηρίων της φυλής ARqua 1 σε θρεπτικό διάλυμα YEP, σε θερμοκρασία 28 O C, ανακίνηση σε 190 rpm και μέσο επιλογής στρεπτομυκίνη (100 μg/ ml). Συγκεκριμένα, 10 μl του τροποποιημένου δυαδικού φορέα part27 (0.1μg/ μl) αναμίχθηκαν με 200 μl εναιωρήματος βακτηρίων. Στη συνέχεια, το μίγμα πάγωσε σε υγρό άζωτο για 15 s και ακολούθησε θερμικό σοκ στους 37 O C για 5 min. Τα βακτήρια επιστρώθηκαν σε στερεό υπόστρωμα YEP agar, με μέσα επιλογής την στρεπτομυκίνη (100 μg/ ml) για τα βακτήρια και την σπεκτινομυκίνη για το 51

54 κατασκεύασμα (100 μg/ ml). Η διαδικασία επαναλήφθηκε με τον ίδιο ακριβώς τρόπο και για τον μετασχηματισμό βακτηρίων ARqua 1, με το δυαδικό φορέα part27, χωρίς την προσθήκη του κατασκευάσματος. Τα βακτήρια της δεύτερης ομάδας χρησιμοποιήθηκαν για τη μεταμόρφωση ριζών στα φυτά-μάρτυρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος, ώστε να διαπιστωθεί η παρουσία του κατασκευάσματος στα αγροβακτήρια. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA, με τη βοήθεια του QIAprep Spin Miniprep Kit της Qiagen, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, κοπή με περιοριστικά ένζυμα (XhoI/KpnI, XbaI/ClaI) και έλεγχος με ηλεκτροφόρηση, σε πηκτή αγαρόζης 1,5%. 52

55 Εικόνα 3.4. Χάρτης του φορέα έκφρασης. 53

56 3.5. Φυτικό υλικό. Χρησιμοποιήθηκαν σπόροι της ποικιλίας Α17 Jemalong του φυτού Medicago truncatula. Πρόκειται για πρώιμη, παραγωγική ποικιλία, η οποία δημιουργήθηκε στην Αυστραλία το 1955 (Νair κ.ά., 2006). Ευδοκιμεί σε αμμοϊλυώδη έως αμμοπηλώδη εδάφη, με άριστο ph 6,5 και σε περιοχές με ετήσιο βροχομετρικό ύψος άνω των 350 mm. Ανθεί 110 ημέρες από τη σπορά και παράγει λοβούς μήκους 7-9,5 mm, καθένας από τους οποίους φέρει 8-11 σπόρους. Η ποικιλία είναι παραγωγική, ωστόσο χαρακτηρίζεται από ευαισθησία στην προσβολή από μπλε αφίδα (Τherioaphis trifolii) και στην τοξικότητα βορίου. Η ποικιλία διακρίνεται για το υψηλό ποσοστό σκληρών σπόρων (80-90%), οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την παρουσία υδρόφοβων ενώσεων στο περίβλημά τους που παρεμποδίζουν την ομοιόμορφη βλάστησή τους. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος, εφαρμόστηκε μηχανικό σκαριφάρισμα (mechanical scarification), δηλαδή τριβή του περιβλήματος των σπόρων με γυαλόχαρτο (Garcia κ.ά., 2006). Για τη διεξαγωγή του πειράματος παρήχθησαν παροδικά γενετικώς τροποποιημένα φυτά με ενσωματωμένο το φορέα έκφρασης (ΓΤ), παροδικά γενετικώς τροποποιημένα φυτά με τον φορέα part27, ως αρνητικοί μάρτυρες (AM) και μη τροποποιημένα φυτά ως μάρτυρες (Μ). Η μέτρηση του αριθμού των φυματίων έγινε σε φυτά ΓΤ, ΑΜ και Μ, ενώ η μέτρηση της δραστικότητας της καταλάσης έγινε σε φυτά ΓΤ και Μ. 54

57 3.6. Απολύμανση σπόρων και σπορά. Η απολύμανση των σπόρων πραγματοποιήθηκε σε σωλήνες 14ml της Greiner, ακολουθώντας την εξής διαδικασία (Garcia κ.ά., 2006) : Α) Προσθήκη διαλύματος 3% υποχλωριώδους νατρίου (NaOCl) και ελαφρά ανακίνηση για s Β) Ξέπλυμα έξι (6) φορές με αποστειρωμένο νερό Γ) Στέγνωμα σε αποστειρωμένο διηθητικό χαρτί Οι σπόροι τοποθετήθηκαν μετά το πέρας της διαδικασίας απολύμανσης σε τριβλία Petri, τα οποία περιείχαν 0,8% άγαρ ως στερεό υπόστρωμα. Τα τριβλία καλύφθηκαν με αλουμινόχαρτο και τοποθετήθηκαν ανεστραμμένα σε θάλαμο ανάπτυξης (25 O C, 16h φως 100 μεm -2 s -1, 8h σκοτάδι) Γενετική τροποποίηση των ριζιδίων με μεταμορφωμένα Agrobacterium rhizogenes. Η τροποποίηση των ριζιδίων έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Trinh κ.ά. (2001). Περίπου 30 ώρες μετά τη σπορά, οι σπόροι είχαν βλαστήσει και κάθε φυτάριο διέθετε ριζίδιο μήκους περίπου 1cm. Τα φυτάρια μεταφέρθηκαν σε τριβλία με αποστειρωμένο νερό, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος αφυδάτωσής τους. Στη συνέχεια, σε συνθήκες ασηψίας, πραγματοποιήθηκε τομή περίπου 3 mm από το άκρο του ριζιδίου και εμβάπτιση των φυταρίων για 30 s σε καλλιέργεια βακτηρίων ARqua 1 (Quandt κ.ά., 1993), που έφεραν τον φορέα έκφρασης. Τα βακτήρια προέρχονταν από 48ωρη υγρή καλλιέργεια μεμονωμένων αποικιών σε θρεπτικό διάλυμα TY, με μέσα επιλογής τα αντιβιοτικά καναμυκίνη (20 mg/ L ) και σπεκτινομυκίνη (100 mg/ L). Έπειτα, τα φυτάρια μεταφέρθηκαν σε τετράγωνα τριβλία (Εικόνα 3.5), τα οποία ήταν συμπληρωμένα με στερεό υπόστρωμα Modified Fahraeus (Trinh κ.ά., 2006). Ως μέσο επιλογής χρησιμοποιήθηκε το αντιβιοτικό καναμυκίνη, σε συγκέντρωση 25 mg/ L, το οποίο προστέθηκε μετά την αποστείρωση του υποστρώματος για 20 min σε αυτόκαυστο κλίβανο, σε θερμοκρασία 121 O C και πίεση 1,2 bar. Τα φυτάρια τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια του υποστρώματος έτσι, ώστε να αποφευχθεί η έκθεσή τους σε υψηλή και άρα τοξική για την επιβίωσή τους συγκέντρωση αντιβιοτικού και για να εξασφαλιστεί πιο ομοιόμορφη μορφολογικά 55

58 A B Εικόνα 3.5. Γενετικώς τροποποιημένα φυτά Medicago truncatula αμέσως μετά την εμβάπτισή τους σε διάλυμα αγροβακτηρίων (Α) και μετά την ανάπτυξη μεταμορφωμένων ριζιδίων (Β). 56

59 ανάπτυξή τους. Χρησιμοποιήθηκαν μάρτυρες χωρίς εμβάπτιση σε ARqua 1, ώστε να πιστοποιηθεί ότι η ριζοβόληση των μη γενετικώς τροποποιημένων φυτών ανεστάλη από την παρουσία του αντιβιοτικού. Το σύνολο της διαδικασίας πραγματοποιήθηκε εντός τράπεζας νηματικής ροής. Μετά το πέρας της διαδικασίας, τα τετράγωνα τριβλία τοποθετήθηκαν υπό γωνία 45 Ο για 2-3 ημέρες και στη συνέχεια σε κάθετη θέση για 2-3 εβδομάδες, σε θάλαμο ανάπτυξης (25 O C, 16h φως 100 μεm -2 s -1, 8h σκοτάδι). Τυχόν ρίζες που αναπτύσσονταν στον αέρα, μετακινούνταν απαλά έτσι, ώστε να έλθουν σε επαφή με το θρεπτικό υπόστρωμα και ταυτόχρονα να απορροφήσουν επαρκή ποσότητα αντιβιοτικού Μεταφύτευση και σκληραγώγηση φυταρίων. Γενετικώς τροποποιημένα και φυτά αγρίου τύπου (μάρτυρες) μεταφέρθηκαν μετά το πέρας τριών εβδομάδων από το θάλαμο ανάπτυξης σε φυτοδοχεία 2 L, τα οποία περιείχαν μίγμα τύρφης-περλίτη σε αναλογία 3:4. Για τον καλύτερο εγκλιματισμό τους στο περιβάλλον, τα φυτά τοποθετήθηκαν σε θάλαμο υδρονέφωσης, όπου και παρέμειναν για 2 εβδομάδες σε συνθήκες υψηλής σχετικής υγρασίας. Στη συνέχεια, μεταφέρθηκαν στην τελική τους θέση, στο θερμοκήπιο του Εργαστηρίου Γενετικής και Βελτίωσης, σε θερμοκρασίες ημέρας O C και νύχτας O C, όπως ορίζει η διεθνής βιβλιογραφία (Barker κ.ά., 2006). Τα φυτά ποτίζονταν ανά 3 ημέρες. Όσον αφορά στη λίπανση, πραγματοποιήθηκε την πρώτη φορά ριζοπότισμα με Modified Fahraeus (Trinh κ.ά., 2006), 2 ημέρες μετά την εγκατάσταση στην τελική τους θέση. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε υδρολίπανση κάθε 9 ημέρες με διάλυμα περιορισμένου αζώτου (Nitrogen-limited solution, ISV Journet κ.ά., 2006) Εμβολιασμός ριζών με αζωτοδεσμευτικά βακτήρια. Δύο εβδομάδες μετά την εγκατάστασή τους στην οριστική τους θέση, τα φυτά ποτίστηκαν με έναν σχετικά μεγάλο όγκο (150 ml/ L υποστρώματος) εναιωρήματος συμβιωτικών αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων Sinorrhizobium meliloti 2011 (INRA, Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes, Auzeville, France), οπτικής πυκνότητας O.D. 600 = 10-3, ώστε να πραγματοποιηθεί ο εμβολιασμός των ριζών με τα 57

60 ριζόβια και ακολούθως να σχηματιστούν φυμάτια. Το χρονικό διάστημα των 14 ημερών επιλέχθηκε έτσι, ώστε τα φυτά να μπορέσουν να εγκλιματιστούν και να αναπτύξουν εκτεταμένο ριζικό σύστημα. Η λίπανση με άζωτο διεκόπη 10 ημέρες πριν τον εμβολιασμό και αντικαταστάθηκε από διάλυμα περιορισμένου αζώτου. Τρεις εβδομάδες από τον εμβολιασμό των φυτών με τα αζωτοδεσμευτικά βακτήρια, πραγματοποιήθηκε εκρίζωση των φυτών. Οι ρίζες εκπλύθηκαν με νερό και στη συνέχεια μετρήθηκε ο αριθμός των φυματίων κάθε φυτού. Στη συνέχεια, τα φυτά επανατοποθετήθηκαν στα φυτοδοχεία και ποτίστηκαν με άφθονο νερό Καταπόνηση φυτών και προσδιορισμός ενεργότητας καταλάσης Μετά το πέρας 3 ημερών, που απαιτούνταν για την επανάκαμψή τους, πραγματοποιήθηκε καταπόνηση διάρκειας 24 ωρών, κατά την οποία τα φυτά ποτίστηκαν με ισοτονικό διάλυμα μαννιτόλης, συγκέντρωσης 565 mm. H μαννιτόλη είναι μια μη-τοξική για τα φυτά ουσία, η οποία, σε υψηλές συγκεντρώσεις, επάγει ωσμωτική καταπόνηση και ξηρασία (Machado Neto κ.ά., 2004). Ακολούθησε συλλογή δειγμάτων ριζών, βάρους mg, τα οποία λειοτριβήθηκαν και ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,05 Μ φωσφορικού καλίου ph 7,0, με τη χρήση παγωμένου γουδιού. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε ψυχόμενη φυγόκεντρο για 5 min, στις rpm και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε στον προσδιορισμό των ολικών πρωτεϊνών, ακολουθώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Bradford (1976), κατά την οποία μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα των δειγμάτων φωτομετρικά, στα 595 nm. H μέθοδος βασίζεται στην πρόσδεση της χρωστικής Coomassie Blue G-250 στα μόρια της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα, το μέγιστο της απορρόφησής της, να μετατοπίζεται από τα 465 nm στα 595 nm. Για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς, παρασκευάστηκε πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης ορού του βοδιού (Bovine Serum Albumine, BSA), με ανάμιξη 100 μl BSA και 3,9 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris 10 mm, ph 7,6 που περιέχει 0,1 Μ ΝaCl. Στη συνέχεια, μl υπερκειμένου κάθε δείγματος προστέθηκαν σε 1,5 ml αποστειρωμένου νερού και μl διαλύματος εργασίας της χρωστικής, ανακινήθηκαν και μετρήθηκε η απορρόφησή τους στα 595 nm. Ο προσδιορισμός των ισοενζύμων της καταλάσης πραγματοποιήθηκε σε δείγμα του υπερκειμένου με μη-αποδιατακτική κάθετη ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου 9% 58

61 (PAGE), σε διάλυμα 0,38 Μ Tris-HCl, ph 8,8 και πηκτή σταθεροποίησης (stacking gel) 3,5%, στα 750 V h και σε θερμοκρασία 4 Ο C. Για την παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης αναμίχθηκαν 250 mm γλυκίνης, 25 mm Tris-HCl, ενώ το ph ρυθμίστηκε στο 8,3. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας ηλεκτροφόρησης, η πηκτή πολυακρυλαμιδίου εμβαπτίστηκε σε διάλυμα H 2 O 2 0,015% για 30 min. Ακολούθησαν 2 εκπλύσεις με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια προστέθηκαν 50 ml διαλύματος χρώσης (1% FeCl 3 και 1% K 3 [Fe(CN) 6 ] σε απεσταγμένο H 2 O ). Η διαδικασία της χρώσης ολοκληρώθηκε σε 5-10 min. H ενεργότητα της καταλάσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τους Beers και Sizer (1952), με καταγραφή της μείωσης απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο, στα 240 nm, σε θερμοκρασία δωματίου και για 1 min. Για το σκοπό αυτό, προστέθηκε 1 ml διαλύματος H 2 O 2 30%, σε 300 ml διαλύματος 0,05 Μ φωσφορικού καλίου. Στη συνέχεια, 3 ml του μίγματος τοποθετήθηκαν σε κυβέττα φασματοφωτομέτρησης και προστέθηκαν 30 μl υπερκειμένου κάθε δείγματος και ακολούθησε φασματοφωτομέτρηση. Οι τιμές που προέκυψαν από τις μετρήσεις υπολογίζονται σε μμ H 2 O 2 min -1. Οι μονάδες ενζύμου ανά ml διαλύματος (Units/ml, U/ml) υπολογίζονται από τον εξής τύπο: Mονάδες Καταλάσης= ΔΑx 34,4x df, όπου ΔΑ είναι η μείωση της απορρόφησης και df είναι ο συντελεστής διαλυτότητας, ο οποίος προκύπτει από τη διαίρεση του αριθμού 2 με τα ml του εκχυλίσματος του δείγματος που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης. Η ειδική ενεργότητα καταλάσης (Catalase Specific Activity) προσδιορίζεται από την εξής σχέση: Ειδική Ενεργότητας Καταλάσης= Ενεργότητα Καταλάσης (U/ml)/ολικές πρωτεΐνες (mg/ml). 59

62 3.11. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων. Οι μετρήσεις του αριθμού των φυματίων, ακολούθησαν το πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο με 1 παράγοντα (γενότυπος), ενώ ο έλεγχος για στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων όρων πραγματοποιήθηκε με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (LSD) ή το κριτήριο Duncan, για επίπεδο σημαντικότητας Ρ 0,05. Όσον αφορά στη δραστικότητα της καταλάσης, εφαρμόστηκε το πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο με 3 παράγοντες (2 γενότυποι x 2 επίπεδα φυματιοποίησης x 2 επίπεδα καταπόνησης με μαννιτόλη) και ο έλεγχος για στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων όρων πραγματοποιήθηκε με το κριτήριο της LSD ή το κριτήριο του Duncan, για επίπεδο σημαντικότητας Ρ 0,05. Η στατιστική επεξεργασία των δεδομένων, έγινε σύμφωνα με το πρόγραμμα XLSTAT, version 2009 (Addinsoft, Paris, France). 60

63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Έλεγχος ενσωμάτωσης φορέα έκφρασης Κατά την πρώτη φάση δημιουργίας του κατασκευάσματος, το πρώτο ένθεμα (αλληλουχία Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό) κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο phannibal και στη συνέχεια εισήχθη στα βακτήρια E.coli DH5α. Από τη διαδικασία αυτή, προέκυψαν 20 αποικίες, ανθεκτικές στην αμπικιλλίνη. Ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως εκμαγείο (template), για την πραγματοποίηση PCR, με ανοδικό εκκινητή στον 35S και καθοδικό εκκινητή cat-xhokpn3 προκειμένου να ελεγχθεί αν το ένθεμα ήταν ενσωματωμένο σε αυτό. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μήκους περίπου 450 bp, το οποίο περιλαμβάνει τον υποκινητή 35S και την αλληλουχία Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό. Μόνο 3 αποικίες έδωσαν τις επιθυμητές ζώνες, από τις οποίες 2 (οι αποικίες 10 και 17) είχαν το σωστό μέγεθος (Εικόνα 4.1). Στη συνέχεια, πλασμιδιακό DNA από τις αποικίες 10 και 17 κόπηκε με περιοριστικά ένζυμα XhoI και BamHI, ώστε να επιβεβαιωθεί ότι φέρουν το ένθεμα. Από την ηλεκτροφόρηση διαπιστώθηκε ότι μόνο η αποικία 17 έφερε την αλληλουχία Cat-Mtr με κωδικό προσανατολισμό (Εικόνα 4.2). Ακολούθησε κοπή πλασμιδιακού DNA της αποικίας 17 α) με XhoΙ-BamHI, β) με XhoI-KpnI και γ) με PvuII και τα τμήματα που παρήχθησαν από την κοπή αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%. Τα τμήματα είχαν τα αναμενόμενα μοριακά βάρη, σύμφωνα με το χάρτη του κατασκευάσματος (Εικόνα 3.4), πιστοποιώντας την παρουσία της επιθυμητής αλληλουχίας σε αυτό (Εικόνα 4.3). 61

64 ~450 bp Εικόνα 4.1. Έλεγχος μετασχηματισμού, μέσω PCR, 20 αποικιών E.coli DH5α. Τα λευκά βέλη υποδεικνύουν τις αποικίες που έδωσαν ζώνες με το επιθυμητό μέγεθος. Ανοδικός εκκινητής στον 35S, καθοδικός εκκινητής cat-xhokpn3. 1= δείκτης μοριακού βάρους 2 log, 2-21= προϊόντα PCR 20 πιθανώς μετασχηματισμένων αποικιών E.coli. MW Α10 Α17 ~4000 bp ~800 bp ~700 bp Εικόνα 4.2. Ηλεκτροφόρηση πλασμιδιακού DNA των αποικιών 10 και 17, μετά από κοπή με περιοριστικά ένζυμα XhoI και BamHI. MW= Δείκτης Μοριακού Βάρους 2 log, Α10= αποικία 10, Α17= αποικία

65 MW Π A B Γ ~5000 bp ~2000 bp ~1500 bp ~800 bp ~700 bp ~500 bp Εικόνα 4.3. Ηλεκτροφόρηση πλασμιδιακού DNA της αποικίας 17, μετά από κοπή με περιοριστικά ένζυμα MW= Δείκτης Μοριακού Βάρους 2 log, Π= άκοπο πλασμίδιο, Α= XhoΙ-BamHI, Β= XhoI-KpnI και Γ= PvuII. Η διαδικασία της κλωνοποίησης επαναλήφθηκε κατά τον ίδιο τρόπο για το δεύτερο ένθεμα (αλληλουχία Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό), με τη διαφορά ότι πραγματοποιήθηκε κοπή της αλληλουχίας και του πλασμιδίου με τα περιοριστικά ένζυμα XbaI και ClaI και ότι η αλληλουχία ενσωματώθηκε με αντίθετο προσανατολισμό. Κατά τον ίδιο τρόπο, ακολούθησε PCR, με τον pdkf ως ανοδικό εκκινητή και τον phantermr ως καθοδικό, προκειμένου να πιστοποιηθεί η παρουσία του ενθέματος στον phannibal (Εικόνα 4.4) και η επιτυχής ενσωμάτωσή του με το σωστό προσανατολισμό (Εικόνα 4.5). Οι συγκεκριμένοι εκκινητές πολλαπλασιάζουν ένα τμήμα μήκους περίπου 600 bp, το οποίο περιλαμβάνει την αλληλουχία Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό και μέρος του τερματιστή OCS. Τα αποτελέσματα της PCR ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1,5%. 63

66 ~600 bp Εικόνα 4.4. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR, προκειμένου να διαπιστωθεί η ενσωμάτωση της αλληλουχίας Cat-Mtr με αντικωδικό προσανατολισμό στον phannibal. Το βέλος υποδεικνύει το μέγεθος της αναμενόμενης ζώνης. Ανοδικός εκκινητής pdkf, καθοδικός phantermr. 1= Δείκτης μοριακού βάρους 2 log, 2-23= προϊόντα PCR 22 μετασχηματισμένων αποικιών E.coli ~500 bp Εικόνα 4.5. Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR, προκειμένου να διαπιστωθεί η ενσωμάτωση της αλληλουχίας Cat-Mtr με το σωστό προσανατολισμό στον phannibal. Το βέλος υποδεικνύει τις επιθυμητές ζώνες.1= Δείκτης μοριακού βάρους 2 log, 2-9= προϊόντα PCR 8 πιθανώς μετασχηματισμένων αποικιών E.coli. 64

67 Ακολούθως, ο φορέας επιλογής (Σχήμα 4.1) ενσωματώθηκε στα αγροβακτήρια A.rhizogenes, με τα οποία επιμολύνθηκαν οι ρίζες των πειραματικών φυτών. Επτά ημέρες αργότερα, εμφανίστηκαν οι πρώτες μεταμορφωμένες ρίζες (Εικόνα 4.6), ενώ το τελικό ποσοστό των μεταμορφωμένων φυταρίων κυμάνθηκε μεταξύ %. Το ποσοστό αυτό συμφωνεί με τα αντίστοιχα της διεθνούς βιβλιογραφίας (Trinh κ.ά., 2006). Εικόνα 4.6. Ρίζες γενετικώς τροποποιημένων φυτών M.truncatula, επτά ημέρες μετά τη διατομή και εμβάπτισή τους σε διάλυμα A.rhizogenes, με ενσωματωμένο το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Πενήντα ημέρες μετά την τροποποίηση, έγινε εμβολιασμός αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων και 3 εβδομάδες αργότερα μετρήθηκε ο αριθμός των φυματίων που σχηματίστηκαν σε 55 φυτά του γενοτύπου ΓΤ, 11 φυτά του γενοτύπου ΑΜ και 48 φυτά του γενοτύπου Μ. Επίσης, ελέγχθηκε η ενεργότητα της καταλάσης των φυτών ΓΤ και Μ στο σχηματισμό φυματίων και σε συνθήκες καταπόνησης με μαννιτόλη. 65

68 Σχήμα 4.1. Χάρτης απεικόνισης του φορέα phannibal, στον οποίον έχει ενσωματωθεί η κασσέτα. Κασσέττα= υποκινητής 35 S, Cat seq, εσώνιο pdk, Cat seq, τερματιστής OCS. 66

69 4.2. Μέτρηση του αριθμού των φυματίων. Στην ομάδα των ΓΤ μετρήθηκαν κατά μέσο όρο 29,25 φυμάτια, στην ομάδα των μαρτύρων ΑΜ 92,18 φυμάτια και στην ομάδα των μαρτύρων Μ 106,12 φυμάτια. Οι τιμές των ΓΤ διέφεραν στατιστικώς σημαντικά από τους δύο μάρτυρες, ενώ οι μάρτυρες δεν διέφεραν μεταξύ τους, για επίπεδο σημαντικότητας Ρ 0,05, όπως φαίνεται και από το Σχήμα 4.2. Αριθμός φυματίων a a b ΓΤ ΑΜ Μ Γενότυπος Σχήμα 4.2. Μέσος όρος του αριθμού των φυματίων των γενετικώς τροποποιημένων φυτών (ΓΤ), των αρνητικών μαρτύρων (ΑΜ) και των μαρτύρων (Μ). Μέσοι όροι που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, για Ρ 0,05. Κατά τη μέτρηση του αριθμού των φυματίων παρατηρήθηκαν φαινοτυπικές διαφορές στο βαθμό ανάπτυξης των φυτών ΓΤ, βάσει των οποίων διαχωρίστηκαν σε τρεις κατηγορίες, τα μικρά (ΓΤ Μικρά), τα μεσαία (ΓΤ Μεσαία) και τα μεγάλα (ΓΤ Μεγάλα), όπως φαίνεται στις Εικόνες 4.7 και

70 Α Β Εικόνα 4.7. Γενετικώς τροποποιημένα φυτά M.truncatula Α) ΓΤ μικρού και μεσαίου μεγέθους, Β) ΓΤ μεσαίου και μεγάλου μεγέθους. Στις κατηγορίες των μαρτύρων δεν παρατηρήθηκαν τέτοιου είδους διαφορές. Ο μέσος όρος των σχηματισθέντων φυματίων στην ομάδα ΓΤ Μικρά ήταν 6,17, στην ομάδα ΓΤ Μεσαία ήταν 21,67 και στην ομάδα ΓΤ Μεγάλα ήταν 48,73. Τα ΓΤ Μικρά διέφεραν στατιστικά σημαντικά από τα ΓΤ Μεγάλα (Σχήμα 4.2) και από τους δύο 68

71 μάρτυρες, για επίπεδο σημαντικότητας Ρ 0,05, ενώ δεν διέφεραν από τα ΓΤ Μεσαία. Τα ΓΤ Μεσαία διέφεραν στατιστικά σημαντικά από τα ΓΤ Μεγάλα και από τους δύο μάρτυρες. Η διαφορά ανάμεσα στα ΓΤ Μεγάλα και στους δύο μάρτυρες ήταν επίσης στατιστικά σημαντική. Τέλος, οι δύο μάρτυρες δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους, ως προς τον αριθμό των σχηματισθέντων φυματίων. Αριθμός φυματίων a a b c c ΓΤ Μικρά ΓΤ Μεσαία ΓΤ Μεγάλα ΑΜ Μ Γενότυπος Σχήμα 4.3. Μέσος όρος του αριθμού των φυματίων κάθε κατηγορίας. ΓΤ= Γενετικώς τροποποιημένα, ΑΜ= Αρνητικοί μάρτυρες και Μ= Μάρτυρες. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά, για Ρ 0,05. 69

72 ΓΤ Μεγάλα ΓΤ Μικρά ΓΤ Μεσαία Εικόνα 4.8. Γενετικώς τροποποιημένα φυτά M.truncatula, ΓΤ μεγάλου (ΓΤ Μεγάλα), μεσαίου (ΓΤ Μεσαία) και μικρού μεγέθους (ΓΤ Μικρά). 70

73 Α Β Γ Εικόνα 4.9. Ανάπτυξη και σχηματισμός φυματίων, 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με ριζόβια, σε φυτά Μ.truncatula. Α) τροποποιημένος μάρτυρας ΑΜ, Β) μη τροποποιημένος μάρτυρας Μ και Γ) ΓΤ μικρού μεγέθους. 71

74 4.3.Μέτρηση ενεργότητας καταλάσης Η ενεργότητα της καταλάσης μετρήθηκε σε φυτά ΓΤ, και μάρτυρες Μ. Οι δύο γενότυποι χωρίστηκαν ανάλογα με την ύπαρξη ή απουσία φυματίων και την υποβολή ή όχι σε καταπόνηση με μαννιτόλη. Οι μέσοι όροι των τιμών της ενεργότητας της καταλάσης απεικονίζονται στον Πίνακα mm Μαννιτόλης 565 mm Μαννιτόλης ΓΤ Με Φυμάτια 1498,5 ± 469,1 958,9 ± 622,7 ΓΤ Χωρίς Φυμάτια 1024,5 ± 222,3 729,9 ± 328,2 Μ Με Φυμάτια 1912,2 ± 273,4 1500,2 ± 236,1 Μ Χωρίς Φυμάτια 665,9 ± 214,5 1792,4 ± 904,6 Πίνακας 4.2. Μέσοι όροι της ενεργότητας της καταλάσης (U/mg πρωτεΐνης). ΓΤ= γενετικώς τροποποιημένα φυτά, Μ= μη τροποποιημένα φυτά. Όπως προκύπτει από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων, δεν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ενεργότητα του ενζύμου στις ρίζες όλων των φυτών, για επίπεδο σημαντικότητας Ρ 0,05. Παρά το γεγονός ότι δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές, σε όλες τις μεταχειρίσεις των φυτών, η ενεργότητα της καταλάσης ήταν μικρότερη στα ΓΤ, σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες Μ. Αντίθετα, στα φυτά Μ, στα οποία δεν έγινε εμβολιασμός ριζοβίων και δεν εφαρμόστηκε μαννιτόλη, η ενεργότητα της καταλάσης ήταν μικρότερη, σε σχέση με τα ΓΤ φυτά, χωρίς ριζόβια και χωρίς μαννιτόλη (Σχήμα 4.4). 72

75 Con Man Ενεργότητα καταλάσης (U/mg) ΓΤ ΜΦ ΓΤ ΧΦ Μ ΜΦ Μ ΧΦ Γενότυπος Σχήμα 4.4. Μέσοι όροι της ενεργότητας της καταλάσης. ΓΤ ΜΦ= τροποποιημένα φυτά με φυμάτια, ΓΤ ΧΦ= τροποποιημένα φυτά χωρίς φυμάτια, Μ ΜΦ= μη τροποποιημένοι μάρτυρες με φυμάτια, Μ ΧΦ= μη τροποποιημένοι μάρτυρες χωρίς φυμάτια. Con= 0 mm μαννιτόλης, Man= 565 mm μαννιτόλης Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιήθηκε σε εκχύλισμα ριζών όλων των κατηγοριών των πειραματικών φυτών. Τα δείγματα που φορτώθηκαν περιείχαν ίση ποσότητα πρωτεϊνών. Οι ζώνες που σχηματίστηκαν μετά την εμβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα Η 2 Ο 2 και τη χρώση της δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές ως προς τη φωτεινότητά τους, στοιχείο που επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που αφορούν στην ενεργότητα της καταλάσης. Στην Εικόνα 4.10 απεικονίζονται οι ζώνες ενεργότητας της καταλάσης σε φυτά ΓΤ και Μ, που δεν υπέστησαν καταπόνηση με μαννιτόλη καθώς και σε αντίστοιχα μετά την προσθήκη μαννιτόλης. Στα προαναφερθέντα φυτά δεν έγινε εμβολιασμός ριζοβίων. 73

76 Μ C1 ΓΤ C1 Μ M1 ΓΤ M1 Μ C2 ΓΤ C2 Μ M2 ΓΤ M2 - + Μ C3 Μ M3 ΓΤ C3 ΓΤ M3 Μ C4 Μ M4 ΓΤ C4 ΓΤ M4 - + Εικόνα Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Ζώνες ενεργότητας της καταλάσης σε γενετικώς τροποποιημένα φυτά ΓΤ και φυτά μαρτύρων Μ χωρίς εμβολιασμό ριζοβίων. ΜC1- MC4 = φυτά Μ χωρίς την προσθήκη μαννιτόλης, ΓΤC1- ΓΤC4 = φυτά ΓΤ χωρίς την προσθήκη μαννιτόλης, Στην Εικόνα 4.11 απεικονίζονται οι ζώνες ενεργότητας της καταλάσης σε φυτά Μ και ΑΜ που δεν υπέστησαν καταπόνηση με μαννιτόλη καθώς και σε αντίστοιχα μετά την προσθήκη μαννιτόλης. Σε όλα τα φυτά των ομάδων αυτών προηγήθηκε εμβολιασμός ριζοβίων. 74

77 ΑΜ C ΑΜ M ΜM MΦ1 ΜC MΦ1 ΜM MΦ2 _ Εικόνα Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Ζώνες ενεργότητας της καταλάσης σε φυτά αρνητικών μαρτύρων ΑΜ και μαρτύρων Μ στα οποία προηγήθηκε εμβολιασμός ριζοβίων. ΑΜ C= φυτά ΑΜ χωρίς τη δράση μαννιτόλης, ΑΜ M= φυτά ΑΜ μετά από επίδραση μαννιτόλης, ΜM ΜΦ=φυτά Μ μετά από επίδραση μαννιτόλης, ΜC ΜΦ= φυτά Μ χωρίς τη δράση μαννιτόλης. + 75