Μελέτη της δράσης πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της πλειοτροπίνης σε βιολογικές της δράσεις

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Μελέτη της δράσης πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της πλειοτροπίνης σε βιολογικές της δράσεις ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΦΑΕΛΟΥ ΕΥΑΝΘΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΠΑΤΡΑ 2010

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Παπαδημητρίου Ευαγγελία, η οποία μου έδωσε την ευκαιρία να δουλέψω στην ερευνητική της ομάδα και με καθοδήγησε με τις συμβουλές της και τις παρατηρήσεις της καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Παύλο Κορδοπάτη και τον Καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο που δέχτηκαν να αποτελέσουν μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής μου Επιτροπής και με βοήθησαν με τις παρατηρήσεις τους. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου για τη διαρκή συμπαράσταση τους καθώς και σε όλους τους φίλους που απέκτησα στο εργαστήριο, με τους οποίους πάντα φροντίζαμε να αντισταθμίζουμε τις συχνά κοπιαστικές μέρες των πειραμάτων με πολύ κέφι και γέλιο. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους μου κ.κωνσταντίνο-μάριο Μικέλη, κ.λάμπρου Μαργαρίτα και κ.κουτσιούμπα Μαρίνα για τη συνεργασία τους και την πολύτιμη βοήθεια τους.

3 Περιεχόμενα ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. Αγγειογένεση Γενικά Νεοαγγειογένεση Αγγειογένεση Συντονισμός ενζυμικών συστημάτων για την προώθηση της 8 αγγειογένεσης 2. Μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) Γενικά Η βιοχημεία των ΜΜΡs Μέλη της οικογένειας των μεταλλοπρωτεϊνασών Κατανομή στους ιστούς Ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡs και αγειογένεση Ζελατινάσες Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη Γενικά Δομή του γονιδίου της ΡΤΝ, ρύθμιση του & γονιδιακή έκφραση Πρωτεϊνική δομή της πλειοτροπίνης Μόρια που αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ Υποδοχείς της ΡΤΝ Ν-Συνδεκάνη Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ 32 (RPTPβ/ζ) Ιντεγκρίνη α ν β Σχέση δομής βιολογικής δράσης Πλειοτροπίνη και αγγειογένεση / καρκίνος 38 ΣΚΟΠΟΣ 41

4 ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου 45 λώρου ανθρώπου 2. Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα HUVEC Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα C6, U87MG και 49 MO59K 4. Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Ανακαλλιέργεια κυττάρων Κατάψυξη κυττάρων HUVEC, MO59K, U87MG και C Απόψυξη κυττάρων HUVEC, MO59K, U87MG και C Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των 58 κυττάρων MO59K, U87MG και C6 9. Έλεγχος της επίδρασης του πεπτιδίου, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της πλειοτροπίνης, στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων C6 κατόπιν κατεργασίας με τρυψίνη 10. Πείραμα μελέτης του χημειοτακτισμού των κυττάρων HUVEC και 62 ΜΟ59Κ (transwell) 11. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα 66 (Μέθοδος Bradford) 13. Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 71 πολυακρυλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) 15. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη 78 (stripping) 17. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 79 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 81 Α. Μελέτη της επίδρασης συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές της ΡΤΝ στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος Α.1. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1-5 της ΡΤΝ (ΡΤΝ 1-5 ) στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος MO59K, U87MG και C6 Α.2. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος MO59K, U87MG και C

5 Α.3. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος MO59K, U87MG και C6 Α.4. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος MO59K, U87MG και C6 Β. Μελέτη της επίδρασης της ΡΤΝ και του πεπτιδίου ΡΤΝ στη μετανάστευση κυττάρων γλοιοβλαστώματος ΜΟ59Κ Γ. Μελέτη της επίδρασης των πεπτιδίων ΡΤΝ 1-5, ΡΤΝ και ΡΤΝ στη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος Δ. Η επίδραση του πεπτιδίου ΡΤΝ στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ιντεγκρίνη α ν β 3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Ε. Η επίδραση των πεπτιδίων ΡΤΝ και ΡΤΝ στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και σε κύτταρα γλοιώματος ΜΟ59Κ ΣΤ. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αλληλεπιδρούν άμεσα 93 με την ΡΤΝ σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος ΜΟ59Κ Ζ. Οι ζελατινάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αλληλεπιδρούν άμεσα με την ΡΤΝ 95 αλλά όχι με τη midkine σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Η. Επίδραση των πεπτιδίων ΡΤΝ 16-24, ΡΤΝ και ΡΤΝ στην 97 αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις ΜΜΡ-2 & ΜΜΡ-9 Θ. Η ΜΜΡ-2 δεν αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ 98 Ι. Διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της μεταλλοπρωτεϊνάσης 99 ΜΜΡ-2 και της ιντεγκρίνης α ν β 3 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 107 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 125 SUMMARY 126 ΣYNΤΜΗΣΕΙΣ 127

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

7 Εισαγωγή 1. Αγγειογένεση 1.1 Γενικά Αγγειογένεση ονομάζεται η διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων από προϋπάρχοντα. Μέσω των αιμοφόρων αγγείων μεταφέρονται θρεπτικά συστατικά, οξυγόνο και άλλα μόρια, όπως κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σε ολόκληρο τον οργανισμό (Folkman, 2001; Jain and Carmeliet, 2001). H αγγειογένεση εμπλέκεται τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Οι φυσιολογικές καταστάσεις, στις οποίες συναντάμε την αγγειογένεση είναι η ανάπτυξη του εμβρύου, η επούλωση των πληγών και ο έμμηνος κύκλος κατά τον επανασχηματισμό του ενδομητρίου. Παρ όλα αυτά υπάρχουν πολλές ασθένειες που οφείλονται στη συνεχή, ανεξέλεγκτη αγγειογένεση. Τέτοιες παθήσεις είναι η αρθρίτιδα, ο διαβήτης αλλά και η οφθαλμική νεοαγγειογένεση, που αποτελεί την πιο κοινή αιτία τύφλωσης και κυριαρχεί σε περισσότερες από είκοσι ασθένειες του οφθαλμού (Folkman, 2007). Άλλες παθολογικές καταστάσεις που παρατηρείται σχηματισμός νέων αγγείων είναι η ψωρίαση, η αθηροσκλήρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα κ.α. (Jain, 2003). Εξαρτημένες από την αγγειογένεση είναι επίσης, η αύξηση των όγκων και η μετάσταση (Folkman, 2007). Τα φυσιολογικά κύτταρα χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά για την επιβίωση και αύξηση τους, γι αυτό και βρίσκονται σε απόσταση μm από τα αγγεία του αίματος. Χωρίς την παρουσία αιμοφόρων αγγείων, ακόμα και ένας καρκινικός όγκος δεν μπορεί να αναπτυχθεί πέρα από ένα κρίσιμο μέγεθος ή να δημιουργήσει μεταστάσεις. Το 1971 ο Folkman πρότεινε ότι η ανάπτυξη ενός όγκου και η μετάσταση εξαρτώνται από την αγγειογένεση, οπότε και προτάθηκε για πρώτη φορά η προοπτική για τη θεραπεία όγκων με αντι-αγγειογενετική θεραπευτική τακτική. Το 1976 επιπλέον, ο Gullino έδειξε ότι κύτταρα σε προκαρκινικό ιστό αποκτούν αγγιογενετική ικανότητα, καθώς μετατρέπονται σε καρκινικά. Σήμερα, είναι αποδεκτό ότι τα κύτταρα διαθέτουν έναν αγγειογενετικό διακόπτη, ο οποίος ρυθμίζεται από την ισορροπία ανάμεσα στους επαγωγείς και 1

8 Εισαγωγή τους αναστολείς της αγγειογένεσης (Πίνακας E.1). Ο αγγειογενετικός διακόπτης ενεργοποιείται από διάφορα σήματα, όπως είναι το μεταβολικό στρες (π.χ. χαμηλή τάση Ο 2, χαμηλό ph, υπογλυκαιμία κλπ), μηχανικό στρες που προκαλεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ανοσολογικές αντιδράσεις και γενετικές ματαλλάξεις, που ενεργοποιούν ογκογονίδια ή εξαλείφουν ογκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία ελέγχουν την παραγωγή ρυθμιστικών μορίων της αγγειογένεσης (Carmeliet and Jain, 2000). Πίνακας E.1: Ρυθμιστές της αγγειογένεσης Αγγειογενετικοί παράγοντες Αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες VEGF Αρρεστίνη FGF-1, FGF-2 Ρετινοϊκό οξύ PTN Τμήματα κολλαγόνου PDGF ΕFC-XV HGF/SF Ενδορεπελλίνη TGF-α, TGF-β Ενδοστατίνη EGF Τμήματα ινονεκτίνης IGF-1 Φιμπουλίνη TNF-α Θρομβοσπονδίνη-1 & -2 IL-8, IL-3 Ιντερλευκίνες Προσταγλανδίνη Ε1, Ε2 Ιντερφερόνες COX-2 PEDF Αγγειογενίνη Παράγοντας αιμοπεταλίων-4 Οιστρογόνα Αγγειοστατίνη Προλιφερίνη Αντιθρομβίνη ΙΙΙ Τμήματα υαλουρονικού οξέος 2-Μεθοξυοιστραδιόλη Ολιγοσακχαρίτες ΡΕΧ Ερυθροποιητίνη Προλακτίνη G-CSF, GM-CSF ΤΙΜΡs VCAM-1 Τροπονίνη 1 E-σελεκτίνη Βασοστατίνη NO Plasminogen kringle 5 Αγγειοποιητίνη-1 2

9 Εισαγωγή Όπως προαναφέρθηκε, η ισορροπία μεταξύ των πρωτεϊνών που επάγουν ή αναστέλλουν την αγγειογένεση καθορίζει το εάν ένας όγκος θα επάξει την αγγειογένεση και το αν θα υπάρξει τελικά αγγειογένεση φαίνεται να οφείλεται κυρίως σε μείωση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών που την καταστέλλουν (Liekens et al., 2001). Στο μέλλον, ίσως γίνει χρήση μορίων που συμμετέχουν στην αγγειογένεση ως δείκτες για τον έλεγχο της έκβασης διαφόρων τύπων καρκίνου αλλά και μη νεοπλασματικών ασθενειών, οι οποίες εξαρτώνται από την αγγειογένεση (Folkman, 2007). Υπάρχουν ενδείξεις ότι διαφορετικοί τύποι καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιούν ξεχωριστούς τρόπους ενεργοποίησης της αγγειογένεσης. Επιπλέον, η καρκινική αγγειογένεση μεταβάλλεται ανάλογα με τον τύπο του καρκινικού όγκου, τη θέση που αναπτύσσεται, καθώς και με τα αγγειο- και αντιαγγειογενετικά μόρια που παράγουν τόσο τα ίδια τα κύτταρα του όγκου, όσο και τα κύτταρα του στρώματος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και η εξωκυττάρια ύλη (Fukumura et al., 1998). Η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος αποτελεί μια πολύπλοκη βιολογική διαδικασία, που απαιτεί τον ακριβή συντονισμό κυτταρικών διαδικασιών, όπως του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της μετανάστευσης, της προσκόλλησης σε υπόστρωμα και της διακυτταρικής μεταγωγής σήματος κατά τη μορφογένεση του ιστού (Αdams and Alitalo, 2007). Όλες αυτές οι διαδικασίες ρυθμίζονται από μια λεπτή ισορροπία μιας ποικιλίας μορίων, αγωνιστών και ανταγωνιστών (Εικόνα Ε.1). Η διαδικασία δημιουργίας του αγγειακού συστήματος ξεκινάει με τη νεοαγγειογένεση (vasculogenesis), που πραγματοποιείται κατά την εμβρυϊκή ζωή και περιλαμβάνει το σχηματισμό του πρωτογενούς αγγειακού πλέγματος από τα μεσοδερμικά προγεννητικά κύτταρα (Risau, 1997) και συνεχίζεται μετά την εμβρυϊκή και κατά την ενήλικη ζωή με τη διαδικασία της αγγειογένεσης. 3

10 Εισαγωγή Εικόνα Ε.1: Η αγγειογένεση σχετίζεται με την αποικοδόμηση και τον ανασχηματισμό της αγγειακής βασικής μεμβράνης. α) Σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και στις μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs), η βασική μεμβράνη υφίσταται αποικοδόμηση και δομικές αλλαγές, που επάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυξητικοί παράγοντες, όπως ο αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF), ο βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (bfgf) και ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από τα αιμοπετάλια (PDGF), απελευθερώνονται από τη βασική μεμβράνη, όπως επίσης και από τα ίδια τα κύτταρα του όγκου, τους ινοβλάστες και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. β) Έτσι, επάγεται ο σχηματισμός μιας ενδιάμεσης και κατόπιν μιας νέας (ώριμης) βασικής μεμβράνης. Μαζί με τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και τα περικύτταρα, η βασική μεμβράνη διαμεσολαβεί το σχηματισμό ενός νέου αιμοφόρου αγγείου. Η αποικοδομημένη βασική μεμβράνη κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρυθμιζόμενη αγγειογένεση (η εικόνα με τροποποιήσεις προέρχεται από: Kalluri, Nature Reviews Cancer, 2003; 3, ). 4

11 Εισαγωγή 1.2 Νεοαγγειογένεση Τα αιμοφόρα αγγεία σχηματίζονται από τα πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κυττάρων, τους αγγειοβλάστες. Η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης λαμβάνει χώρα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Οι αγγειοβλάστες προέρχονται από το μεσόδερμα. Τα πρόδρομα αυτά κύτταρα μεταναστεύουν, διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται σε έναν ιστό σχηματίζοντας ένα αγγειακό πλέγμα. Στη συνέχεια, σχηματίζουν κανάλια που παίρνουν την ακριβή θέση των μελλοντικών αγγείων. Από τη στιγμή που έχει διαμορφωθεί αυτός ο σχηματισμός, το ενδοθήλιο περιβάλλεται από βασική μεμβράνη, λεία μυϊκά κύτταρα και περικύτταρα αποκτώντας έτσι τη μορφή ώριμου αγγείου. Η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης ελέγχεται από την οικογένεια του αυξητικού παράγοντα VEGF και των υποδοχέων του (Carmeliet et al., 1996). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι νεοαγγειογένεση επιτελείται και σε ενήλικα άτομα, στα οποία εντοπίστηκαν πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αρχικά βρέθηκε ότι ο VEGF επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών στην κυκλοφορία του αίματος πειραματοζώων, υποδεικνύοντας ότι η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης λαμβάνει χώρα και στο ενήλικο άτομο (Asahara et al., 1999). Φαίνεται ότι στα ενήλικα άτομα εκτός από το μηχανισμό της αγγειογένεσης παρατηρείται ο σχηματισμός αγγειακών δομών από πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών (Ruger et al., 2008). Σε ασθενείς με χρόνια αρτηριακή απόφραξη μελετάται ως πιθανός μηχανισμός επιδιόρθωσης των αγγείων η επιστράτευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων και η διαφοροποίηση τους σε κύτταρα αγγείων (Matsuo et al., 2008). Τέλος, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η μεταμόσχευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων σε ισχαιμικούς ιστούς συμβάλλει στην αναδόμηση του κατεστραμμένου ιστού μέσω της διαδικασίας της νεοαγγειογένεσης (Sepulveda et al., 2007). 5

12 Εισαγωγή 1.3 Αγγειογένεση Ο σχηματισμός αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα επιτελείται με τη διαδικασία της αγγειογένεσης και πραγματοποιείται και στο έμβρυο αλλά και στον ενήλικα. Στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, ορισμένα όργανα αγγειώνονται με το μηχανισμό της αγγειογένεσης πέρα της νεοαγγειογένεσης, όπως είναι οι νεφροί και ο εγκέφαλος. Συγκεκριμένα, στον εγκέφαλο ο πολλαπλασιασμός των νευροεπιθηλιακών κυττάρων προκαλεί πάχυνση του νευρικού σωλήνα, ο οποίος προκειμένου να συνεχίσει να αναπτύσσεται δέχεται την είσοδο τριχοειδών αγγείων που προέρχονται από το περινευρικό αγγειακό πλέγμα. Στον ενήλικα, όπως προαναφέρθηκε αγγειογένεση παρατηρείται τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Τα νέα αγγεία στο ενήλικο άτομο σχηματίζονται με εκβλάστηση (sprouting), με δημιουργία γεφυρών ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (bridging) και με διχοτόμηση ή ενδίπλωση (intussuseption). Ο μηχανισμός που έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα είναι η αγγειογένεση με εκβλάστηση, η οποία ρυθμίζεται από ειδικούς αγγειακούς αυξητικούς παράγοντες, όπως ο VEGF, οι αγγειοποιητίνες Ang-1 και Ang-2 και οι ephrin-b1/b2 (Ferrara et al., 2002; Maisonpierre et al., 1997; Kuijper et al., 2007). Το πρώτο βήμα κατά τη διαδικασία της αγγειογένεσης περιλαμβάνει τη χάλαση των προϋπαρχόντων αγγείων, την αυξημένη διαπερατότητα και την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης. Η χάλαση των αγγείων οφείλεται κυρίως στο ΝΟ, το οποίο προάγει επιπλέον και τη μεταγραφή του VEGF (Kimura et al., 2000). Ακολουθεί έξοδος πρωτεϊνών του πλάσματος από τα αγγεία με αποτέλεσμα τη δημιουργία προσωρινών δομών που επιτρέπουν στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν (εκβλάστηση). Επειδή όμως η αυξημένη διαπερατότητα μπορεί να οδηγήσει σε ρήξη των αγγείων η διαπερατότητα ελέγχεται μέσω της Ang-1, η οποία δεσμεύεται στον Tie2 και παρέχει προστασία αφού αποτελεί φυσικό φραγμό κατά της διαρροής πλάσματος (Thurston et al., 2000). Στον έλεγχο της διαδικασίας συμμετέχει και η πρωτεΐνη Ang-2, η οποία αναστέλλει τη σηματοδότηση του Tie2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα και αποτελεί φυσικό ανταγωνιστή της Ang-1. Η Ang-2, που εμφανίζεται σε καταστάσεις αγγειογένεσης σχετίζεται με την αποκόλληση λείων μυϊκών 6

13 Εισαγωγή κυττάρων και την απώλεια της θεμέλιας ουσίας, προωθώντας έτσι τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού χαλαρώνουν οι συνδέσεις μεταξύ τους (Gale et al., 1999; Maisonpierre et al., 1997). Η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης πραγματοποιείται μέσω πλήθους πρωτεϊνασών και έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων, όπως οι bfgf, VEGF και IGF-1. Το επόμενο βήμα στην αγγειογενετική διαδικασία αποτελεί ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε αυτό το στάδιο σημαντικές είναι οι αλληλεπιδράσεις των VEGF, αγγειοποιητινών, PDGF και FGF με τους υποδοχείς τους. Στην επιφάνεια των αγγείων υπάρχουν μόρια προσκόλλησης, τα οποία συμμετέχουν και διευκολύνουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγεται από παράγοντες που διεγείρουν την αγγειογενετική διαδικασία και διευκολύνουν τη μετανάστευση και προσκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην εξωκυττάρια ύλη. Μετά τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, οι αγγειοποιητίνες δεσμεύονται στους υποδοχείς τους Tie1 και Tie2, που εκφράζονται αποκλειστικά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και σταθεροποιούν τη δομή των νεοσχηματισμένων πρώιμων αγγείων, ενεργοποιώντας την αλληλεπίδραση ενδοθηλιακών και περιενδοθηλιακών κυττάρων (Klagsbrun et al., 1999). Τα πρώιμα αγγεία αναδιαρθρώνονται με την προσέλκυση μεσεγχυματικών κυττάρων, τα οποία με την επίδραση του PDGF, τον οποίο εκφράζουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα, διαφοροποιούνται σε περικύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα που επενδύουν εξωτερικά τον αγγειακό αυλό, προστατεύοντας τα αγγεία από μεταβολές στην παροχή οξυγόνου. Η διατήρηση των νέων αγγείων εξαρτάται από την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία σε φυσιολογικές συνθήκες μπορούν να επιβιώσουν για αρκετά χρόνια (Carmeliet et al., 2000). 7

14 Εισαγωγή 1.4 Συντονισμός ενζυμικών συστημάτων για την προώθηση της αγγειογένεσης Κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης, δυο ενζυμικά συστήματα είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση μορίων του εξωκυττάριου υλικού. Οι πρωτεϊνάσες σερίνης, όπως οι ενεργοποιητές πλασμινογόνου και η πλασμίνη, και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs). Οι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη, η οποία μπορεί να αποικοδομεί πολλά συστατικά της εξωκυττάριας ύλης, να ενεργοποιεί αρκετές ΜΜΡs και να ενεργοποιεί ή να απελευθερώνει αυξητικούς παράγοντες. Τα δυο ενζυμικά συστήματα δρουν συντονισμένα προκειμένου να προωθήσουν την αγγειογένεση (Carmeliet and Collen, 1998). Μερικές ΜΜΡs ωστόσο, είναι δραστικές ως πρωτεϊνάσες του ινώδους μέσω ενός μονοπατιού ανεξάρτητου από ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (Hiraoka et al., 1998), αποδεικνύοντας ότι οι δυο οικογένειες πρωτεϊνασών, σε αντίθεση με ότι ήταν παλαιότερα αποδεκτό, αλληλεπικαλύπτονται λειτουργικά. Η δράση των MMPs στην αγγειογένεση αλλά και η γενικότερη λειτουργία τους αναλύονται παρακάτω. 2. Μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) 2.1 Γενικά Τα μακρομόρια της εξωκυττάριας ύλης είναι σημαντικά για τη δημιουργία του κατάλληλου κυτταρικού περιβάλλοντος που απαιτείται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της μορφογένεσης. Ο κόσμος των πρωτεολυτικών ενζύμων αριθμείται από πολλές οικογένειες εξω- και ενδο-πεπτιδασών, ανάμεσα στις οποίες ανήκουν οι πρωτεϊνάσες σερίνης, κυστεΐνης, ασπαρτικού και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (Tonti et al., 2009). Αυτή η τελευταία τάξη ενζύμων παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον μια και από την ανακάλυψη ακόμη του πρώτου μέλους της, εδώ και σαράντα χρόνια, συσσωρεύονται δεδομένα που αποδεικνύουν τη βιολογική σημασία αυτής της ολοένα αυξανόμενης οικογένειας ενζύμων (Tonti et al., 2009). 8

15 Εισαγωγή Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) δεν έχουν μόνο χαρακτηριστεί στα σπονδυλωτά (κυρίως στον άνθρωπο), αλλά επίσης έχουν ταυτοποιηθεί και σε αρκετούς ασπόνδυλους οργανισμούς (Manello et al., 2005), όπως είναι το έμβρυο του θαλάσσιου αχινού (Lepage and Gache, 1990), η Drosophila (Llano et al., 2000) και η ύδρα (Leontovich et al., 2000). Ένα ακόμη αξιοθαύμαστο στοιχείο στην εξελικτική ιστορία των MMPs, οι οποίες αρχικά υπήρχαν σαν πρωτεΐνες μιας-δομής, αποτελεί το γεγονός ότι είχαν υποστεί διαδικασίες σύντηξης γονιδίων, που δημιούργησαν τελικά τα πολύ-δομικά ένζυμα (Manello et al., 2005). Στον άνθρωπο έχουν ταυτοποιηθεί 23 διαφορετικές MMPs (24 στα ποντίκια), από τις οποίες τις περισσότερες παράγουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι ΜΜΡs αποτελούν μια οικογένεια ενδοπεπτιδασών, που περιέχουν ψευδάργυρο στο μόριο τους και μοιράζονται δομικές ομοιότητες μεταξύ τους. Διαφέρουν ωστόσο, στο προφίλ έκφρασης τους και στην επιλογή υποστρώματος. Όλες οι MMPs διαθέτουν τα εξής χαρακτηριστικά: Αποικοδομούν τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης και του συνδετικού ιστού Περιέχουν ψευδάργυρο στο ενεργό τους κέντρο Απαιτούν ασβέστιο για τη χημική σταθερότητα τους Λειτουργούν μόνο σε ουδέτερο ph Με εξαίρεση τις MMPs μεμβρανικού τύπου (ΜΤ-ΜΜΡs), όλες οι ΜΜΡs εκκρίνονται σε ανενεργή προ-μορφή, η οποία ενεργοποιείται στον εξωκυττάριο χώρο (Nagase and Woessner, 1999). Η κύρια λειτουργία αυτών των ενζύμων είναι η αναδιάρθρωση και η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, η οποία αποτελείται από ένα σύμπλεγμα αδιάλυτων μορίων, όπως τα κολλαγόνα, οι λαμινίνες, οι ινονεκτίνες και οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης. Αυτή η ιδιότητα τους κάνει τις ΜΜΡs ισχυρούς ρυθμιστές και τροποποιητές της κατάστασης του εξωκυττάριου περιβάλλοντος (Mott and Werb, 2004; Cauwe et al., 2007 συμμετέχοντας σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες που απαιτούν αποικοδόμηση και τροποποίηση της εξωκυττάριας ύλης, όπως είναι η κυτταρική μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός, η μορφογένεση και η απόπτωση (Vu and Werb, 2000; 9

16 Εισαγωγή Manello et al., 2005; Page-McCaw et al., 2007). Απ την άλλη, συμμετέχουν ενεργά σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η καρκινική ανάπτυξη, η μετάσταση και η διεισδυτικότητα (Egebland and Werb, 2002; Manello et al., 2005; Corbitt et al., 2007). Οι ΜΜΡs επιπλέον, επηρεάζουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες με πολλούς διαφορετικούς τρόπους, όπως με το να στοχεύουν σε πρωτεΐνες που δεν ανήκουν αποκλειστικά στην εξωκυττάρια ύλη. Τέτοια μόρια είναι άλλες πρωτεϊνάσες, αναστολείς πρωτεϊνασών, παράγοντες πήξης, χημειοτακτικά μόρια, πρόδρομες ανενεργές μορφές αυξητικών παραγόντων, πρωτεΐνες που δεσμεύονται σε αυξητικούς παράγοντες, υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και μόρια προσκόλλησης (McQuibban et al., 2000; McCawley and Matrisian, 2001; Zhang et al., 2006). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι δράσεις των ΜΜΡs ρυθμίζονται στο επίπεδο της μεταγραφής, της ενεργοποίησης πρόδρομων ζυμογόνων και της αλληλεπίδρασης με ειδικά στοιχεία της εξωκυττάριας ύλης. Οι ενδογενείς ιστικοί αναστολείς των ΜΜΡs (TIMPs) διασφαλίζουν έναν εξισορροπιστικό μηχανισμό προκειμένου να αποφευχθεί η εκτεταμένη αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού (Raffetto and Khalil, 2008). 2.2 Η βιοχημεία των ΜΜPs Οι MMPs αποτελούνται από ένα προ-πεπτίδιο, μια καταλυτική δομή, μια εύκαμπτη περιοχή και μια δομή αιμοπεξίνης (hemopexin) (Εικόνα Ε.2). Οι ΜΜΡs διαθέτουν τρία μοριακά γνωρίσματα: Ομολογία αλληλουχίας με την κολλαγενάση-1 (ΜΜΡ-1). Χαρακτηριστικό μοτίβο κυστεΐνης PRCGXPD (cysteine switch motif) στο προ-πεπτίδιο, το οποίο διατηρεί τις ΜΜΡs στην προ-ενεργή ζυμογόνο μορφή τους. Η συντηρημένη κυστεΐνη σχηματίζει χηλικό σύμπλοκο με την ενεργή θέση Zn. Η ΜΜΡ-23 αποτελεί εξαίρεση μια και δεν διαθέτει το κυστεϊνικό μοτίβο. 10

17 Εισαγωγή Το μοτίβο δέσμευσης Zn συνδεδεμένο με τρία μόρια ιστιδίνης με τη συντηρημένη αλληλουχία HEXGHXXGXXH βρίσκεται στην καταλυτική περιοχή (Raffetto and Khalil, 2008). Εικόνα Ε.2: Δομή των ΜΜΡs. Η MMP αποτελείται από ένα προ-πεπτίδιο, μια καταλυτική δομή, μια εύκαμπτη περιοχή και μια δομή αιμοπεξίνης. Στην καταλυτική περιοχή συναντάται η θέση δέσμευσης του Zn 2+ και μια θέση δέσμευσης του ειδικού υποστρώματος. Στο προ-πεπτίδιο υπάρχει επίσης και το κυστεϊνικό μοτίβο PRCGXPD (Η εικόνα με τροποποιήσεις προέρχεται από: Raffetto and Khalil, 2008). 2.3 Μέλη της οικογένειας των μεταλλοπρωτεϊνασών Όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί, οι MMPs ταξινομούνται σε έξι ομάδες ανάλογα μάλιστα και από τα υποστρώματα στα οποία δρουν, από τα οποία παίρνουν και τα εναλλακτικά τους ονόματα (Πίνακας Ε.2). 11

18 Εισαγωγή Πίνακας Ε.2: Οι MMPs και τα εναλλακτικά τους ονόματα Τάξη ΜΜΡs Εναλλακτικά ονόματα Κολλαγενάσες ΜΜΡ-1 Κολλαγενάση-1 ΜΜΡ-8 Κολλαγενάση ουδετερόφιλων ΜΜΡ-13 Κολλαγενάση-3 ΜΜΡ-18 Κολλαγενάση-4 Ζελατινάσες ΜΜΡ-2 Ζελατινάση-Α ΜΜΡ-9 Ζελατινάση-Β Στρωμελυσίνες MMΡ-3 Στρωμελυσίνη-1 ΜΜΡ-10 Στρωμελυσίνη-2 ΜΜΡ-11 Στρωμελυσίνη-3 ΜΜΡ % ομολογία με στρωμελυσίνη-2 Ματριλυσίνες ΜΜΡ-7 Ματριλυσίνη PU MP ΜΜΡ-26 Ματριλυσίνη-2 Μεμβρανικού τύπου (ΜΤ-ΜΜΡs) ΜΜΡ-14 ΜΤ1-ΜΜΡ ΜΜΡ-15 ΜΤ2-ΜΜΡ ΜΜΡ-16 ΜΤ3-ΜΜΡ ΜΜΡ-17 ΜΤ4-ΜΜΡ ΜΜΡ-24 ΜΤ5-ΜΜΡ ΜΜΡ-25 ΜΤ6-ΜΜΡ ΜΜΡ-12 Μεταλλοελαστάση μακροφάγων ΜΜΡ-19 RASI 1 Άλλα ένζυμα ΜΜΡ-20 ΜΜΡ-21 ΜΜΡ-22 ΜΜΡ-23 ΜΜΡ-28 ΜΜΡ-29 Εναμελυσίνη Ταυτοποιήθηκε στο χρωμόσωμα 1 Ταυτοποιήθηκε στο χρωμόσωμα 1 Από cdna ανθρώπινης ωοθήκης Επιλυσίνη Χωρίς όνομα 12

19 Εισαγωγή 2.4 Κατανομή στους ιστούς Οι ΜΜΡs παράγονται από πολλούς ιστούς και κυτταρικούς τύπους συμπεριλαμβανομένων των αγγειακών κυττάρων και είτε εκκρίνονται από το κύτταρο είτε βρίσκονται στην πλασματική μεμβράνη. Οι MMPs συχνά δεσμεύονται σε γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής ηπαρίνης στην κυτταρική επιφάνεια. Η ΜΜΡ-12 εκφράζεται κυρίως στα μακροφάγα και είναι σημαντική για τη μετανάστευση τους (Shapiro et al., 1993). Η ΜΜΡ-19 απ την άλλη, ταυτοποιήθηκε σε cdna ήπατος και ως αυτοαντιγόνο που προέρχεται από Τ- κύτταρα ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (Pendas et al., 1997). 2.5 Ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών Οι ΜΜΡs γίνονται καταλυτικά ενεργές όταν το προ-πεπτίδιο αποικοδομείται είτε όταν διαρρηγνύεται η διαμόρφωση του. Όπως φαίνεται και στην εικόνα Ε.3 στο ανενεργό μόριο, το ιόν ψευδαργύρου βρίσκεται συνδεδεμένο με το κυστεϊνικό κατάλοιπο του μοτίβου PRCGXPD και μπλοκάρει την είσοδο ενός μορίου νερού στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Όλοι οι μηχανισμοί ενεργοποίησης των ΜΜΡs διαρρηγνύουν ακριβώς αυτή την αλληλεπίδραση μεταξύ της κυστεΐνης και του Zn 2+. Το γεγονός αυτό επιτρέπει την είσοδο ενός μορίου νερού στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός ενεργού καταλυτικά κέντρου (van Wart and Birkedal-Hansen, 1990). 13

20 Εισαγωγή Εικόνα Ε.3: Η αρχιτεκτονική της καταλυτικής περιοχής των ΜΜΡs. Ένα μόριο θειόλης είναι συνδεδεμένο με την κυστεΐνη της αλληλουχίας PRCGXPD στο προπεπτίδιο και με το ιόν ψευδαργύρου του καταλυτικού κέντρου στο προ-ένζυμο. Κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των ΜΜΡs ένα μόριο νερού αντικαθιστά τη θειόλη με συνέπεια το σχηματισμό ενός καταλυτικά ενεργού ενζύμου (Η εικόνα με τροποποιήσεις προέρχεται από:bjorklund and Koivunen, 2005). Η ενεργοποίηση των προ-μορφών των ΜΜΡs απαιτεί άλλες MMPs ή άλλες τάξεις πρωτεϊνασών. Η ΜΜΡ-3 ενεργοποιεί έναν αριθμό προ-μμρs: εμπλέκεται για παράδειγμα στη μετατροπή της προ-μμρ-1 σε πλήρως ενεργό μόριο (Suzuki et al., 1990). Η ενεργοποίηση της προ-μμρ-2 λαμβάνει χώρα στην κυτταρική επιφάνεια και διαμεσολαβείται από τις περισσότερες ΜΤ-ΜΜΡs, εκτός από την ΜΤ4-ΜΜΡ (Heagerty et al., 1993). H διαμεσολαβούμενη από την ΜΤ1- ΜΜΡ ενεργοποίηση της προ-μμρ-2 απαιτεί τον ενδογενή αναστολέα ΤΙΜΡ-2 (Βutler et al., 1998; Wang et al., 2000). Η προ-μμρ-2 σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με τον ΤΙΜΡ-2 μέσω των καρβοξυτελικών τους περιοχών, επιτρέποντας έτσι στην άμινο-τελική ανασταλτική περιοχή του ΤΙΜΡ-2 να δεσμευτεί στην ΜΤ1-ΜΜΡ πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου. Η προ-μμρ-2 που βρίσκεται συνδεδεμένη στην κυτταρική μεμβράνη, με τη σειρά της ενεργοποιείται από την ΜΤ1-ΜΜΡ, που είναι ελεύθερη από τον ΤΙΜΡ-2. Εναλλακτικά, η ΜΤ1-ΜΜΡ που έχει ανασταλεί από τον ΤΙΜΡ-2 μπορεί να δράσει ως υποδοχέας της προ-μμρ-2. Το σύμπλοκο ΜΤ1-ΜΜΡ/ΤΙΜΡ-2/προ-ΜΜΡ-2 κατόπιν, παρουσιάζεται σε μια 14

21 Εισαγωγή παρακείμενη ελεύθερη ΜΤ1-ΜΜΡ για ενεργοποίηση. Συμπλέγματα της ΜΤ1- ΜΜΡ στην κυτταρική επιφάνεια που σχηματίζονται μέσω αλληλεπίδρασης της με τη δομή αιμοπεξίνης διευκολύνουν τη διαδικασία ενεργοποίησης (Itoh et al., 2001). Οι ΜΜΡs μπορούν να ενεργοποιηθούν μετά από κατεργασία με θέρμανση και χαμηλό ph. Ενεργοποιούνται επίσης, από θειολοτροποποιητικούς παράγοντες, όπως είναι το 4-αμινοφαινυλυδραργυρικό άλας οξικού οξέος και το χλωρίδιο υδραργύρου, από χαοτροπικούς παράγοντες και ενεργές μορφές οξυγόνου. Αυτοί οι παράγοντες δρουν με το μηχανισμό που αναφέρθηκε παραπάνω, δηλαδή τη διάσπαση της αλληλεπίδρασης του Zn 2+ με το κυστεϊνικό κατάλοιπο (Chen et al., 1993). Το ΝΟ, ίσως ενεργοποιεί την προ-μμρ-9 κατά τη διάρκεια εγκεφαλικής ισχαιμίας δρώντας στο μόριο θειόλης (Εικόνα Ε.3) και σχηματίζοντας ένα S-νιτροζυλιωμένο παράγωγο προτείνοντας ότι η χημική ενεργοποίηση των προ-μμρs συμβαίνει in vivo (Gu et al., 2002). 2.6 ΜΜΡs και αγγειογένεση Η πρώτη ένδειξη πως οι MMPs εμπλέκονται στη διαδικασία της αγγειογένεσης προέκυψε από το γεγονός ότι οι ΤΙΜΡs και οι συνθετικοί αναστολείς των ΜΜΡs μπορούν να μειώσουν σημαντικά τον in vitro σχηματισμό αυλών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Schnaper et al., 1993). Ενδοθηλιακά κύτταρα σε ηρεμία παράγουν ελάχιστες έως καθόλου ενεργές MMPs, αλλά αυτές επάγονται και κατ επέκταση ενεργοποιούνται σε κύτταρα αποφυάδων τριχοειδών κατά τη διάρκεια επούλωσης πληγών, φλεγμονών και ανάπτυξης όγκων (Egeblad and Werb, 2002; Handsley and Edwards, 2005) αλλά και σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro (Hanemaaijer et al., 1993). Οι δράσεις των ΜΜΡs ελέγχονται από μια ομάδα ενδογενών αναστολέων τους, γνωστοί σαν ΤΙΜΡs και από τους αναστολείς RECK (Handsley and Edwards, 2005; Noda et al., 2003). Επιπλέον, μελέτες με αναστολείς των ΜΜΡs έχουν φανερώσει δυο μεγάλες επιπρόσθετες οικογένειες τις ADAMs και ADAMTS, των οποίων τα περισσότερα μέλη διαθέτουν σημαντικές 15

22 Εισαγωγή περικυτταρικές πρωτεολυτικές δράσεις και ως εκ τούτου συμμετέχουν στην αγγειογενετική διαδικασία (van Hinsbergh and Koolwijk, 2008). Ο αναστολέας RECK είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που εντοπίζεται στην κυταρική μεμβράνη. Ρυθμίζει τις δράσεις τουλάχιστον των ΜΤ1-ΜΜΡ, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ADAM-10. Ανεπάρκεια RECK προκάλεσε διερρηγμένη αγγειακή ανάπτυξη και πρώιμο θάνατο σε έμβρυα ποντικών (Noda et al., 2003). Απ την άλλη, ο αναστολέας ΤΙΜΡ-3 και όχι οι ΤΙΜΡ-2 ή ΤΙΜΡ-1, εμπλέκεται στη δέσμευση του VEGF στον υποδοχέα του VEGFR-2 (KDR) και ανταγωνίζεται για τη δέσμευση του αυξητικού παράγοντα στον υποδοχέα του (Qi et al., 2003). Οι ΜΜΡs συμμετέχουν στην ανακατασκευή των βασικών μεμβρανών και στην αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, όπως έχει προαναφερθεί. Μπορούν επίσης, να ενισχύουν την αγγειογένεση με τους εξής τρόπους: βοηθώντας στην αποκόλληση των περικυττάρων από τα αγγεία που υφίστανται αγγειογένεση μέσω απελευθέρωσης αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων, που είναι δεσμευμένοι στην εξωκυττάρια ύλη μέσω έκθεσης κρυμμένων θέσεων δέσμευσης στην εξωκυττάρια ύλη προαγγειογενετικών ιντεγκρινών μέσω παραγωγής προμεταναστευτικών στοιχείων της εξωκυττάριας ύλης και διασπώντας τις προσκολλήσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων μεταξύ τους Οι παραπάνω δράσεις φαίνονται και στην εικόνα Ε.4 υποδεικνύοντας την πολυπλοκότητα και τη δυσκολία εύρεσης διακριτών ρόλων των MMPs στη διαδικασία της αγγειογένεσης. 16

23 Εισαγωγή Εικόνα Ε.4: Ενδεχόμενοι και παγιωμένοι ρόλοι των ΜΜΡs κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης. Οι ΜΜΡs θεωρείται πλέον ότι δεν εμπλέκονται μόνο στην ανακατασκευή της εξωκυττάριας ύλης και στην κυτταρική διεισδυτικότητα, αλλά επίσης και στη δημιουργία του εξωκυττάριου περιβάλλοντος, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου των βιολογικών δράσεων παραγόντων, που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. Στην αγγειογένεση, αυτοί οι ρόλοι περιλαμβάνουν: α) τροποποίηση των μορίων της κυτταρικής επιφάνειας, β) απελευθέρωση ή ενεργοποίηση προαγγειογενετικών παραγόντων, γ) ενεργοποίηση των προ-μμρs, δ) αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, ε) τροποποίηση/ αλληλεπίδραση ιντεγκρινών και στ) παραγωγή αντι-αγγιογενετικών παραγόντων. Η ΜΤ1-ΜΜΡ παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση (Pepper, 2001). Η αύξηση της δράσης των ΜΜΡs πιθανά συνδέεται με αύξηση των μεταστάσεων και της αγγειογενετικής ικανότητας των όγκων. Αύξηση επίσης, στην έκφραση του mrna των ΜΜΡ-2, -7, -9 και -11 έχει εντοπιστεί σε διεισδυτικότητα και μετάσταση όγκων (Handsley and Edwards, 2005). 17

24 Εισαγωγή Οι ΜΜΡs ωστόσο, συνεισφέρουν και αρνητικά στην αγγειογένεση μέσω παραγωγής ενδογενών αναστολέων της, μέσω πρωτεόλυσης συγκεκριμένων αλυσίδων κολλαγόνου και πλασμινογόνου και μέσω τροποποίησης της σηματοδότησης κυτταρικών υποδοχέων, αποικοδομώντας τις δομές τους που είναι υπεύθυνες για τη δέσμευση του προσδέτη (Rundhaug, 2005). Η ΜΜΡ-12 μαζί με τις ΜΜΡ-7 και ΜΜΡ-9 πιθανά μπλοκάρει την αγγειογένεση μετατρέποντας το πλασμινογόνο σε αγγειοστατίνη, έναν ισχυρό αγγειογενετικό ανταγωνιστή. Όγκοι σε λανθάνουσα κατάσταση εκκρίνουν ανασταλτικούς παράγοντες, όπως η αγγειοστατίνη, οι θρομβοσπονδίνες και οι ΤΙΜΡs, που εμποδίζουν τους όγκους από το να μετατρέπεται σε αγγειογενετικό φαινότυπο και έτσι σταματά η ανάπτυξη τους (Raffetto and Khalil, 2008). Η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης οδηγεί στην απελευθέρωση αγγειογενετικών παραγόντων, όπως οι VΕGF, bfgf και TGFβ. Οι ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 αποικοδομούν την πρωτεογλυκάνη περλεκάνη στη βασική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων και έτσι απελευθερώνεται ο bfgf. Ο αυξητικός παράγοντας συνδετικού ιστού (CTGF) σχηματίζει ανενεργό σύμπλοκο με τον VEGF 165 και η αποικοδόμηση του CTGF από τις ΜΜΡ-1, -3, -7 ή -13 οδηγεί στην απελευθέρωση ενεργού VEGF 165. Οι ΜΜΡ-2, -3 και -7 αποικοδομούν την πρωτεογλυκάνη decorin της εξωκυττάριας ύλης απελευθερώνοντας TGF-1, ενώ οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ενεργοποιούν τον TGF-β1. Επαγωγή της έκφρασης της ΜΜΡ-9 σε αγγειογενετικά νησίδια έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του VEGF από την εξωκυττάρια ύλη, οπότε και επάγεται ο αγγειογενετικός φαινότυπος. Τέλος, υπερέκφραση της ΜΜΡ-9 σε MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού οδηγεί σε αγγειογένεση και ανάπτυξη του όγκου και το σχηματισμό του συμπλόκου VEGF/ VEGFR, προτείνοντας ότι η ΜΜΡ-9 ελέγχει την απελευθέρωση του VEGF από την εξωκυττάρια ύλη (Rundhaug, 2005). 2.7 Ζελατινάσες Στη διαδικασία της αγγειογένεσης εμπλέκονται πολλές ΜΜPs όπως έχει προαναφερθεί, με πιο κρίσιμους ρυθμιστές όμως τις ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, αλλιώς γνωστές ως ζελατινάσες Α και Β αντίστοιχα (Πίνακας Ε.2) (Egeblad and Werb, 18

25 Εισαγωγή 2002). Ποντίκια στα οποία λείπει το γονίδιο της ΜΜΡ-2 εμφανίζουν μειωμένη καρκινική αγγειογένεση (Itoh et al., 1998), μια δράση που ενδεχομένως σχετίζεται με τη σύνδεση μεταξύ της ΜΜΡ-2 και της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην αγγειογένεση (Brooks et al., 1996). Ο ρόλος της ΜΜΡ-9 στην αγγειογένεση, επίσης φαίνεται να είναι σημαντικός, μια και αυτή η πρωτεϊνάση αναφέρεται ως στοιχείο του αγγειογενετικού διακόπτη, ο οποίος ορίζει το σχηματισμό αγγείων στους όγκους (Bergers et al., 2000). Σε αντίθεση με τις άλλες MMPs, οι ζελατινάσες μοιράζονται το εξής κοινό δομικό χαρακτηριστικό: περιέχουν τρεις επαναλήψεις τύπου ΙΙ της αλληλουχίας της ινονεκτίνης (FnII) στην καταλυτική τους περιοχή. Πέρα όμως από αυτή τη δομική ομοιότητα τους υπάρχει μεγάλη διαφορά στο μοριακό μέγεθος μεταξύ τους. Η προ-μμρ-2 έχει μοριακό βάρος 72 kda, ενώ η προ-μμρ-9 92 kda. Η διαφορά αυτή οφείλεται κυρίως στη μεγαλύτερη εύκαμπτη περιοχή της ΜΜΡ-9 αλλά και στο γεγονός ότι η ΜΜΡ-9 διαθέτει δυο θέσεις γλυκοζυλίωσης σε αντίθεση με την ΜΜΡ-2 που δεν είναι γλυκοζυλιωμένη (van den Steen et al., 2001). Παρά τις δομικές ομοιότητες ανάμεσα σε αυτές τις δυο MMPs, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι όσον αφορά στην αγγειογένεση όγκων, οι μηχανισμοί δράσης τους είναι διαφορετικοί. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις όπου ενώ και οι δυο ΜΜΡs εκφράζονται στους όγκους, μόνο η μια συμμετέχει στον αγγειογενετικό διακόπτη (Bergers et al., 2000). Παρόμοιες διαφορές στο ρόλο αυτών των δυο πρωτεϊνασών έχουν παρατηρηθεί επίσης στη λειτουργία των αιμοπεταλίων (Fernandez-Patron et al., 1999) και στην κυτταρική μετανάστευση (Giannelli et al., 1997). Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει μηχανιστική εξήγηση για αυτές τις διαφορές, πιστεύεται όμως ολοένα και περισσότερο ότι οι δυο ΜΜΡs αποικοδομούν διαφορετικά υποστρώματα. Τα δυο ένζυμα επιπλέον, δρουν σε ανάλογα αλλά όχι ταυτόσημα υποστρώματα (Bjorklund and Koivunen, 2005). Η ΜΜΡ-2 δρα σε τέσσερις ξεχωριστές ομάδες υποστρωμάτων με γενικά μοτίβα: PXX X Hy, L/IXXX Hy, X Hy SXL και HXXX Hy, όπου X Hy είναι ένα υδρόφοβο αμινοξύ (Chen et al., 2002). Η ΜΜΡ-9 αντίστοιχα, δρα σε τρεις οικογένειες υποστρωμάτων (Kridel et al., 2001). 19

26 Εισαγωγή Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την ΜΜΡ-2 διαφέρει σημαντικά από αυτά των άλλων ΜΜΡs, μια και δε διαθέτει στον υποκινητή του την αλληλουχία ΤΑΤΑ ούτε και θέσεις για την πρόσδεση του ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα (Huhtala et al., 1990; Harendza et al., 1995; Corcoran et al., 1996). Οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 συντίθενται από διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Η ΜΜΡ-2 εκφράζεται σταθερά από ινοβλάστες, ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα. Η ΜΜΡ-9 από την άλλη, παράγεται από μονοκύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα, επιθηλιακά κύτταρα και η έκφραση της επάγεται από διαφορετικά στοιχεία, όπως οι κυτταροκίνες, οι χημειοκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες (Bjorklund and Koivunen, 2005). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η τοπική δράση της ΜΜΡ-9 επάγεται σε απάντηση συγκεκριμένων φυσιολογικών και παθοφυσιολογικών περιστατικών. Και οι δυο ζελατινάσες εκκρίνονται από τα κύτταρα ως μονομερείς και ποικίλες διμερείς μορφές. Η ΜΜΡ-2 σχηματίζει μόνο ετεροδιμερή, όπου συνδέεται με μια άλλη πρωτεΐνη, όπως κάποια γλυκοζαμινογλυκάνη (Ilda et al., 2007) ενώ η ΜΜΡ-9 σχηματίζει και ομοδιμερή και ετεροδιμερή με πρωτεΐνες, όπως η λιποκαλίνη στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα (Tschesche et al., 2001). Οι δυο ζελατινάσες, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σχηματίζουν ποικίλους τύπους διμερών και συμπλόκων. Η περιγραφή νέων συμπλόκων και των θεωρούμενων λειτουργιών τους αυξάνει σε σημαντικό βαθμό τη γνώση γύρω από τις ζελατινάσες με σεβασμό στη βιολογική και παθοβιολογική λειτουργία των συμπλόκων τους. Η ιδιότητα αυτή πιθανά να βρει σημαντικές εφαρμογές στο μελλοντικό σχεδιασμό φαρμάκων (Malla et al., 2008). 20

27 Εισαγωγή 3. Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη 3.1 Γενικά Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, ΡΤΝ) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας μεγέθους 18 kda, με μεγάλη συγγένεια δέσμευσης για την ηπαρίνη. Παρουσιάζει 55% ομολογία στην αμινοξική της αλληλουχία με τη midkine, με την οποία συγκροτούν μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων και επιπλέον περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες στο μόριο της. Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, τα δυο μόρια χρησιμοποιούν τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, με πιο καλά χαρακτηρισμένες την επαγωγή των νευριτών και την ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al., 2004; Mikelis et al., 2007). Στη βιβλιογραφία συναντάται με διαφορετικές ονομασίες, όπως ΗARP (heparin affin regulatory peptide) ή HB-GAM (heparin-binding growth associated molecule), γεγονός που οφείλεται στο ότι η απομόνωση του μορίου αυτού έγινε συγχρόνως σε διάφορα εργαστήρια και από διαφορετικά είδη ιστών. Στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας Ε.3) παρουσιάζονται οι διαφορετικές ονομασίες με τις οποίες συναντούμε την PTN στη βιβλιογραφία, η προέλευσή της και το είδος από το οποίο απομονώθηκε. Λόγω της ευρείας κατανομής του mrna της και των ποικίλλων δράσεων της πρωτεΐνης πήρε το όνομα πλειοτροπίνη (Li et al, 1990). Η ΡΤΝ έχει βρεθεί σε νευρωνικούς ιστούς, στην καρδιά, στο χόνδρο και στα οστά. Στο μαστικό αδένα, στη μήτρα και στον προστάτη το μόριο αυτό εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Υψηλά επίπεδα του γονιδίου αυτού εκφράζονται σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πνεύμονα (Papadimitriou et al., 2004). Η ΡΤΝ, όπως αναφέρει και το όνομά της, είναι ένας αυξητικός παράγοντας με πολλές δράσεις. Παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση, ρυθμίζεται από αγγειογενετικά ερεθίσματα και ασκεί δράση μέσω των υποδοχέων της στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Mikelis and Papadimitriou, 2008). Παρ όλο που αρχικά είχε θεωρηθεί παράγοντας που επάγει ογκογενετικό φαινότυπο, υπάρχουν δεδομένα που της αποδίδουν πλέον και ανασταλτικό χαρακτήρα (Mikelis et al, 2007). 21

28 Εισαγωγή Πίνακας Ε.3: Οι διαφορετικές ονομασίες και πηγές απομόνωσης της ΡΤΝ. Σύντμηση HARP HB-GAM HBGF-8 Πλήρες όνομα Heparin-Affin Regulatory Peptide Heparinbinding growthassociated molecule p18 Protein 18 kda Μορφή Προέλευση Είδος Παραπομπή Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Βους Courty et al., 1991 Πρωτεΐνη Καρδιά Όρνιθα Hampton et al., 1992 cdna Εγκέφαλος Αρουραίος Merenmies and Rauvala, 1990 Γονιδιωματικό DNA Πρωτεΐνη Ήπαρ Μυς Naito et al., 1992 Μήτρα/ Ορός PTN Pleiotrophin Πρωτεΐνη Καρκινικά κύτταρα πνεύμονα HBNF OSF-1 Heparinbinding growthfactor-8 Heparinbinding neurotrophic factor Osteoblastspecific factor-1 Βους Άνθρωπος Milner et al.,1989 Novotny et al., 1993 Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Αρουραίος Rauvala, 1989 cdna Γονιδιωματικό DNA Καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, Πλακούντας Βους Άνθρωπος Άνθρωπος Novotny et al., 1993 Wellstein et al., 1992 Wellstein et al., 1992 Maier et al., 1990 Μήτρα Βους Lai et al., 1992; Milner et al.,1992 Εγκέφαλος Άνθρωπος Lai et al., 1995 cdna Εγκέφαλος Αρουραίος Kovesdi et al., 1990 Γονιδιωματικό DNA cdna Γονιδιωματικό DNA Εγκέφαλος/ Πλακούντας Οστεοβλάστες Άνθρωπος Άνθρωπος Μυς Kretschmer et al., 1991 Pencil et al., 1993 Tezuka et al., 1990 Ήπαρ Μυς Lai et al., 1992; Milner et al.,

29 Εισαγωγή 3.2 Δομή του γονιδίου της ΡΤΝ, ρύθμιση του & γονιδιακή έκφραση Στον άνθρωπο, το γονίδιο της PTN καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al, 1992; Kretshmer et al, 1993). Το m-rna της PTN οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al, 1993). Το σηματοδοτικό πεπτίδιο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου, εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al, 1993). Ο υποκινητής της ΡΤΝ δεν περιέχει την αλληλουχία ΤΑΤΑ, αλλά περιέχει μια αλληλουχία CAAT, τέσσερις περιοχές πρόσδεσης για MyoD, δυο για AP1 και μια για GT1 (Li et al, 1992). Οι αλληλουχίες ΤΑΑΤ, που εντοπίζονται περίπου 100 νουκλεοτίδια ανοδικά του υποκινητή της ΡΤΝ, είναι τα σημεία πρόσδεσης του HOXA5, ο οποίος και τον ενεργοποιεί (Chen et al, 2005). Μια 5 -μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 -UTR), η οποία καλύπτει ένα ολόκληρο εξώνιο, έχει περιγραφεί από πολλούς ερευνητές (Lai et al., 1992; Kretschmer et al., 1993). Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο παρουσιάζουν αντίστοιχα υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της hsp (heat shock protein) 70 και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al, 1992). Επίσης, στην 3 - μη μεταφρασμένη περιοχή έχουν εντοπιστεί 3 επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ. Η αλληλουχία αυτή, η οποία εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna εντοπίζεται στην 3 περιοχή αρκετών ογκογονιδίων (Lai et al, 1992). Όσον αφορά στη γονιδιακή ρύθμιση της PTN, λίγα είναι τα στοιχεία που υπάρχουν στη βιβλιογραφία. Η ερευνητική μας ομάδα ανέδειξε την εμπλοκή του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της PTN, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη. Ο FGF-2 και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) επάγουν τη μεταγραφή του γονιδίου της PTN μέσω ενεργοποίησης του AP-1, με αποτέλεσμα την επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Η δράση του FGF-2 οφείλεται σε επαγωγή της NADPH οξειδάσης και αύξηση της παραγωγής του Η 2 Ο 2, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα FGFR1 (Hatziapostolou et al., 2006), ενώ απαιτούνται και οι δύο θέσεις 23

30 Εισαγωγή δέσμευσης του ΑΡ-1 (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Επίσης, δείξαμε ότι η ακτινοβόληση με ακτίνες-χ επάγει την έκφραση του γονιδίου της PTN στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Polytarchou et al., 2004). Η έκφρασή της PTN επάγεται σημαντικά αναπτυξιακά και κατά τη γέννηση (Rauvala, 1989; Vanderwinden et al, 1992; Yeh et al, 1998), ενώ κατά την ανάπτυξη περιορίζεται σε κάποιες φυσιολογικές λειτουργίες (Vanderwinden et al, 1992; Milhiet et al, 1998). Στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα, το mrna της ΡΤΝ εντοπίζεται στο νευροεξώδερμα και μεσόδερμα (Vanderwinden et al, 1992), στα νευρικά εμβρυικά κύτταρα (Furuta et al, 2004; Jung et al, 2004), στα μονοπάτια των αναπτυσσόμενων νευρώνων (Rauvala et al, 1994), στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 στον ιππόκαμπο και σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους, όπως αστροκύτταρα και κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al, 1992). Επαγωγή της έκφρασης της ΡΤΝ εντοπίζεται σε νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως σύνδρομο Alzheimer και Down, όπου έχει προταθεί και ως δείκτης νευρωνικής βλάβης (Wisniewski et al, 1996), ενώ υπερεκφράζεται και στη νόσο του Parkinson (Ferrario et al, 2004). Το mrna της ΡΤΝ εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα οστού και χόνδρου (Vanderwinden et al, 1992) και σε κυτταρικά υποστρώματα σχηματισμού οστού (Imai et al, 1998), ενώ η έκφρασή της επάγεται κατά την επούλωση οστών (Imai et al, 1998) και στα κατάγματα (Petersen et al, 2004). Η έκφραση της ΡΤΝ επάγεται σημαντικά και σε ασθένειες οστών που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση, όπως η οστεοαρθρίτιδα (Sanchez et al, 2005; Pufe et al, 2007). H ΡΤΝ εκφράζεται επιπλέον, στα λεία μυϊκά κύτταρα (Milhiet et al, 1998), και στο μυοκάρδιο (Chen et al, 2004), ενώ φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νευρομυϊκή σύναψη, όπου συμμετέχει στη συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης (Peng et al, 1995). Επιπλέον, η ΡΤΝ φαίνεται να συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις επιθηλίου-μεσεγχύματος (Vanderwinden et al, 1992). Η απομόνωσή της από μήτρα βοός (Milner et al, 1989; Li et al, 1990) και η ανίχνευση της έκφρασής της στο αναπαραγωγικό σύστημα υποδηλώνουν το βασικό ρόλο της ΡΤΝ στη ρύθμιση του αναπαραγωγικού κύκλου (Milhiet et al, 1998; Fan et al, 2000). H ανίχνευσή της στο μαστικό αδένα (Ledoux et al, 1997), 24

31 Εισαγωγή η σημασία της στη μορφογένεσή του (Kouros-Mehr and Web, 2006), η ανίχνευσή της στα Leydig κύτταρα των όρχεων (Vanderwinden et al, 1992) και η στειρότητα και οι μορφολογικές ανωμαλίες στους όρχεις των ποντικιών που δεν εκφράζουν την ΡΤΝ (Zhang et al, 1999) ολοκληρώνουν τον πολύπλευρο ρόλο της στην αναπαραγωγική διαδικασία. Tελευταία εντοπίστηκε υπερέκφραση του γονιδίου της ΡΤΝ σε όγκους RET918 του θυρεοειδούς, στους οποίους η έκφραση της ΡΤΝ συσχετίστηκε με μετάσταση. Στην κυτταρική σειρά MTC μάλιστα, που το ογκογονίδιο RET έχει αποσιωπηθεί παρατηρείται αναστολή της γονιδιακής έκφρασης της ΡΤΝ (Ameur et al., 2009). 3.3 Πρωτεϊνική δομή της πλειοτροπίνης Η πρωτοταγής πρωτεϊνική δομή της ΡΤΝ αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα πρώτα 32 από τα οποία αποτελούν το πεπτίδιο-σινιάλο, μετά από πέψη του οποίου προκύπτει η ώριμη πρωτεΐνη των 136 αμινοξέων (Πίνακας Ε.4). Η πέψη του πεπτιδίου-σινιάλου μπορεί να πραγματοποιηθεί στις θέσεις -1 και -3 της πρόδρομης πρωτεΐνης (Merenmies et al, 1990), γεγονός που καθορίζεται από τον τύπο του κυττάρου. Το αποτέλεσμα των διαφορικών πέψεων οδηγεί σε δυο ισομορφές της ώριμης πρωτεΐνης, που η μια έχει 3 αμινοξέα παραπάνω (139) στο αμινοτελικό της άκρο (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η ώριμη πρωτεΐνη περιέχει μεγάλο ποσοστό (24%) κατιονικών αμινοξέων, που είναι κυρίως λυσίνες, εντοπισμένες στα άκρα (Merenmies et al, 1990). Περιέχει επίσης και 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες (Merenmies et al, 1990), οι οποίες δημιουργούν πέντε (Kuo et al, 1990) ή τρεις (Hampton et al, 1992) δισουλφιδικούς δεσμούς. Η απουσία κλασικών θέσεων Ν-γλυκοσιλίωσης (Hampton et al, 1992) οδηγεί στο συμπέρασμα ότι δεν υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, κάτι που επιβεβαιώνεται και με φασματομετρικές μεθόδους (Kuo et al, 1990). 25

32 Εισαγωγή Πίνακας Ε.4: Αμινοξική αλληλουχία της ΡΤΝ. Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο-σινιάλο. Διακρίνονται έντονα βαμμένα τα τρία επιπλέον αμινοξέα της επιμηκυσμένης μορφής του μορίου. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T A E A G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Σχετικά με την τριτοταγή διάταξη της ΡΤΝ, δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα πολλά δεδομένα (Εικόνα Ε.5). Ένα πιθανολογούμενο μοντέλο προτείνει ότι αποτελείται από δυο β-δομές, καθεμιά από τις οποίες περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές, ενώ περιέχει και TSR αλληλουχίες, μέσω των οποίων δεσμεύεται σε πρωτεΐνες εξωκυττάριου χώρου και κυτταρικής μεμβράνης. Κατά τη δέσμευση της ΡΤΝ στην ηπαρίνη, που γίνεται μέσω των β-δομών, πραγματοποιείται αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης, ενώ αναγωγή του δισουλφιδικών δεσμών αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα δέσμευσης (Kilpelainen et al, 2000). Οι δυο β-δομές της ΡΤΝ παρουσιάζουν μικρή ομολογία με τις τυπικές TSP1 δομές και διαφορετική στερεοδιαμόρφωση (Roszmusz et al, 2002). Εικόνα Ε.5: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της ΡΤΝ. Οι β- πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη. Διακρίνονται επίσης οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης. (Papadimitriou et al., 2004) 26

33 Εισαγωγή 3.4 Μόρια που αλληλεπιδρούν με την πλειοτροπίνη Η PTN απομονώθηκε αρχικά ως ένας αυξητικός παράγοντας των νευριτών μετά από έκλουση στήλης ηπαρίνης-σεφαρόζης από 1Μ ΝaCl (Rauvala et al., 1989). Όπως αποδείχθηκε αργότερα, παρόλο που οι άμινο- και καρβοξυτελικές ουρές είναι πλούσιες σε λυσίνη και είναι ισχυρά φορτισμένες, η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη εξαρτάται από τις TSR περιοχές εντός των β-πτυχωτών δομών. Όπως αποδείχθηκε με φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού (NMR), η ηπαρίνη σε διάλυμα δεσμεύεται και στις δύο β-περιοχές (Kilpelainen et al, 2000). Επίσης, παρόλο που οι τελικές, πλούσιες σε λυσίνη περιοχές περιέχουν αλληλουχίες πρόσδεσης της ηπαρίνης, οι τελευταίες δεν απαιτούνται για την υψηλής συγγένειας πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη και τη θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και αλλαγές στις αλληλουχίες των πλούσιων σε λυσίνη τελικών περιοχών του μορίου, δεν επηρεάζουν την πρόσδεση (Munoz et al, 2004). Η μεγάλη συγγένεια της ηπαρίνης για την PTN χρησιμοποιείται ως αρχή απομόνωσης του μορίου από το μέσο καλλιέργειας κυττάρων και τα βιολογικά υγρά (Soulie et al, 2002). Η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης της ηπαρίνης στην PTN οδήγησε στο σκεπτικό ότι πιθανά να δεσμεύεται σε πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παρούσες στην κυτταρική επιφάνεια και την εξωκυττάρια ύλη. Πράγματι, η PTN αποδείχτηκε να αλληλεπιδρά με τις παραπάνω πρωτεογλυκάνες του εξωκυττάριου τμήματος σε διάφορες κυτταρικές σειρές (Papadimitriou et al., 2000;2001; Polycratis et al., 2004; Soulie et al., 2002; Bernard-Pierrot et al., 2004; Vacherot et al., 1999). Στη συνέχεια, έγιναν αναφορές σχετικά με την πρόσδεση της PTN, με χαμηλότερη όμως συγγένεια, με διάφορες άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης Α, αλλά όχι με γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης C και θειικής κερατάνης (Vacherot et al., 1999). Η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη είναι πρωτεογλυκάνες, των οποίων η γλυκοζαμινογλυκανική πλευρική αλυσίδα αποτελείται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες -GlcUA-GalNAc- (D-γλυκουρονικό οξυ-) και IdoUAGalNAc- (L-ιδουρονικό οξυ-) αντίστοιχα, οι οποίες εμφανίζουν πολλά και διαφορετικά ποσοστά θειικών και μπορούν να υπάρξουν και ως συμπολυμερή (CS/DS) (Silbert and Sugumaran, 2002; Sugahara et al., 2003). Οι 27

34 Εισαγωγή τελευταίες είναι σημαντικές για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων, τη γένεση των νευριτών και την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Sugahara et al., 2003). Έχει αποδειχθεί ότι η PTN επάγει την προέκταση των νευριτών μέσω αλληλεπιδράσεων με την πλευρική αλυσίδα θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 (Kinnunen et al., 1996), ενώ άλλες μελέτες δείχνουν ότι η PTN αλληλεπιδρά με ενδογενείς και εξωγενείς αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης και δερματάνης (Deepa et al, 2002; Bao et al., 2004; Nandini et al., 2004; 2005; Bao et al., 2005). Έχει αναφερθεί ότι η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη ευνοείται όταν η PTN είναι προσκολλημένη στον πυθμένα των τρυβλίων επώασης (Mitsiadis et al, 1995). Και εδώ παίζουν ρόλο οι γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας, αφού έτσι υπάρχει πιο ισχυρή πρόσδεση τους με την PTN, με αποτέλεσμα να επάγεται ο πολλαπλασιασμός σε αντίθεση με την περίπτωση που η PTN βρίσκεται διαλυμένη στο θρεπτικό μέσο (Papadimitriou et al., 2000). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες φαίνεται να προστατεύουν τη PTN από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης επί του πεπτιδικού δεσμού Κ59-Κ60, o οποίος βρίσκεται μεταξύ των δύο β-πτυχωτών δομών αλλά όχι σε άλλες θέσεις (Polykratis et al, 2004), γεγονός που οδηγεί στη σκέψη ότι πιθανόν να είναι υπεύθυνες για την παρουσίαση του μορίου στους ειδικούς υποδοχείς του. Η ΡΤΝ αλληλεπιδρά, πέρα από τον εαυτό της (διμερισμός), και με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Πιο συγκεκριμένα, αναστέλλει τη βιολογική δράση του VEGF 165 (Heroult et al, 2004; Parthymou et al, 2007), δεσμευόμενη άμεσα σε αυτόν (Κ D =1.38 nm). Για την αλληλεπίδραση αυτή σημαντικό ρόλο φαίνονται να παίζουν οι TSR δομές της ΡΤΝ (Heroult et al, 2004). Η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με το Υ-Ρ30, ένα πολυπεπτίδιο που παράγεται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) του ανοσοποιητικού συστήματος της μητέρας κατά την εγκυμοσύνη, αποτελεί ακόμα ένα μηχανισμό επικοινωνίας του νευρικού με το ανοσοποιητικό σύστημα. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να είναι τελικά υπεύθυνη για την επαγωγή των νευριτών που αποδίδεται στο πεπτίδιο Υ-Ρ30 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Landgraf et al, 2008). H PTN προσδένεται και στη νουκλεολίνη, η οποία πιθανά τη μεταφέρει μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα (Said et al, 2005). Η νουκλεολίνη είναι μια 28

35 Εισαγωγή πρωτεΐνη με μοριακή μάζα 100 kda, η οποία εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλές διαδικασίες, όπως η κίνηση του κυττάρου, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μεταφορά συστατικών του ριβοσώματος μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα, η μεταγωγή σήματος και η αποσυμπύκνωση της u967 χρωματίνης (Tuteja and Tuteja, 1998; Ginisty et al, 1999). Εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στην επιφάνεια σε κάποιους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών (Christian et al., 2003) και καρκινικών κυττάρων (Destouches et al., 2008; Ayelet et al., 2008; Joo et al., 2005). Το ψευδοπεπτίδιο HB-19, ένας ειδικός ανταγωνιστής που προσδένεται στο C-άκρο της νουκλεολίνης, φαίνεται να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση σε ποικίλα in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα (Destouches et al., 2008). Φαίνεται ότι η νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας βοηθά στην είσοδο της PTN στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης και θειικής χονδροϊτίνης υποβοηθούν την αλληλεπίδραση της PTN με τη νουκλεολίνη (Said et al, 2005). 3.5 Υποδοχείς της ΡΤΝ Ν-Συνδεκάνη Η PTN έχει βρεθεί ότι προσδένεται στις συνδεκάνες 1 και 3 (Raulo et al, 1994). Η τελευταία, η οποία ονομάζεται και Ν-συνδεκάνη, είναι μια πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας μοριακής μάζας 200 kda που περιέχει αλυσίδες θειικής ηπαράνης, με υψηλά ποσοστά σε 2-Ο σουλφωνικά κατάλοιπα ιδουρονικού οξέος, με αποτέλεσμα να προσδένεται εύκολα με την PTN (Kinnunen et al, 1996). Ο υποδοχέας αυτός της ΡΤΝ παρουσιάζει υψηλή ομολογία σε άνθρωπο, ποντίκι και αρουραίο (Bernt et al, 2001). Η έκφραση της ΡΤΝ και της Ν-συνδεκάνης συμπίπτει χρονικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου, ενώ επίσης συνεντοπίζονται σε συγκεκριμένα σημεία στον εγκέφαλο του αρουραίου (Nolo et al, 1995). H N-συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι προσδένει την PTN σε οστεοβλάστες και πρόδρομα οστικά κύτταρα (Imai et al, 1998; Tare et al., 2002). Το mrna για την 29

36 Εισαγωγή Ν-συνδεκάνη και την PTN έχει ανευρεθεί και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα, επηρεάζοντας την περαιτέρω εξέλιξη τους (Furuta et al, 2004). Η ΡΤΝ, σε συνδυασμό με την Ν-συνδεκάνη και τον RPTPβ/ζ, φαίνεται να ρυθμίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κυκλικού AMP (c-amp) στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Mourlevat et al, 2005). H συμμετοχή της Ν-συνδεκάνης στη ρύθμιση της μακροχρόνιας ενίσχυσης (LTP, long term potentiation) φαίνεται από το γεγονός ότι η ΡΤΝ δεν την επηρεάζει σε ποντίκια που δεν εκφράζουν την Ν- συνδεκάνη (Kaksonen et al, 2002). Αυτή η ρύθμιση της πλαστικότητας από την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την Ν-συνδεκάνη φαίνεται να είναι σημαντική για τη μάθηση και τη μνήμη (Pavlov et al, 2002). Επιπλέον, η Ν-συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα EGF (EGFR, endothelial growth factor receptor) και ρυθμίζει τη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων (Hienola et al, 2006). Μελέτες σχέσης δομής-δράσης στην ΡΤΝ έχουν δείξει ότι και οι δυο TSR δομές της δεσμεύονται στην θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και ρυθμίζουν την πλαστικότητα των συνάψεων (Raulo et al, 2006). Πρόσφατα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η ΡΤΝ και η Ν-συνδεκάνη συνεκφράζονται σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος Yao et al., 2009). H αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την Ν-συνδεκάνη οδηγεί στην ενεργοποίηση της c-src και της Fyn και την αλληλεπίδρασή τους με την κορτακτίνη και την τουμπουλίνη. Τελικό επακόλουθο αυτών είναι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού με αποτέλεσμα την προέκταση των νευριτών (Imai et al, 1998) και τη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Kinnunen et al, 1998) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος Ένας άλλος χαρακτηρισμένος υποδοχέας της PTN έχει δράση κινάσης τυροσίνης και ονομάζεται κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 200 kda. O ALK ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας πρωτεΐνης σύντηξης με δράση κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφωσμίνης-alk, η οποία σχετίζεται με το αναπλαστικό λέμφωμα των μεγακαρυοκυττάρων (Morris et al, 1994). Έχουν 30

37 Εισαγωγή βρεθεί δύο μορφές του ALK, με μοριακές μάζες 220 και 140 kda (Lutz et al, 2005; Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Η 140 kda μορφή προέρχεται από τμήση της 220 kda μορφής (Lutz et al, 2005). Η τελευταία έχει την τυπική δομή υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης και αποτελείται από μια μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή, μια λιπόφιλη διαμεμβρανική περιοχή και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δράση κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Το γονίδιο για τον ALK εκφράζεται στο νευρικό σύστημα (Pulford et al, 1997), σε καλλιέργειες ινοβλαστών, ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παγκρέατος και μαστού (Stoica et al, 2001; 2002; Perez-Pinera et al., 2007b), μελανώματος (Dirks et al, 2002), νευροβλαστώματος (Lamant et al., 2000;), γλοιοβλαστώματος (Powers et al, 2002) και σε non- Hodgkin λεμφώματα (Delsol et al, 1997). Η PTN προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή του ALK σε διάφορους τύπους κυττάρων (Stoica et al., 2002) με μεγάλη συγγένεια, ενώ αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου τμήματος του υποδοχέα ή για την PΤΝ παρεμποδίζουν την πρόσδεση και τη μεταγωγή σήματος (Stoica et al, 2001; Bowden et al, 2002; Powers et al, 2002; Lu et al, 2005). Η δέσμευση είναι ειδική και πιθανότατα πραγματοποιείται μέσω του καρβοξυτελικού άκρου της PTN, και πιο συγκεκριμένα με το τμήμα που περιλαμβάνει τα αμινοξέα (Bernard-Pierrot et al., 2002). Γενικά, υπάρχουν αντικρουόμενες πληροφορίες σχετικά με την άμεση αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση του ALK από την PTN (Miyake et al., 2002; Dircks et al., 2002; Moog-Lutz et al., 2005; Motegi et al., 2004; Duyster et al., 2001; Mourali et al., 2006; Mathivet et al., 2007). Μία πιθανή εκδοχή είναι η διαφορετική ενεργοποίηση του ALK από τις δύο φυσικές μορφές της PTN (Lu et al., 2005) ή η έμμεση ενεργοποίηση του ALK από τη PTN, μέσω της PTN-επαγώμενης απενεργοποίησης του υποδοχέα της RPTPβ/ζ ( Perez- Pinera P. et al., 2007). Πρόσφατη όμως, θεραπευτική προσέγγιση του γλοιοβλαστώματος προτείνει τη διπλή στόχευση του συμπλόκου ALK/PTN για ενίσχυση της αντιαγγειογενετικής δράσης του σε σχέση με απλή knockdown προσέγγιση (Grzelinski et al., 2009). 31

38 Εισαγωγή Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) Η PTN έχει βρεθεί να δεσμεύεται στο διαμεμβρανικό υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTP β/ζ) (Maeda et al., 1996). Η φαινομενική μοριακή μάζα του είναι 250 kda, ενώ οι γλυκοζυλιωμένες του μορφές αναλύονται στα 300 kda. Παρόλο που περιέχει δύο περιοχές με αλληλουχία φωσφατάσης τυροσίνης στο κυτταροπλασματικό τμήμα του, μόνο αυτή που είναι πλησιέστερη στη μεμβράνη παρουσιάζει τέτοια δράση (Krueger and Saito, 1992). Ο RPTPβ/ζ είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα (Canoll et al, 1993; Krueger and Saito, 1992; Levy et al, 1993) και η εξαρτώμενη από το χώρο και τη χρονική στιγμή έκφραση του, υποδεικνύει τον πιθανό του ρόλο στη μορφογένεση και την πλαστικότητα του νευρικού συστήματος (Canoll et al, 1993). O RPTPβ/ζ έχει τέσσερις διαφορετικές ισομορφές: δυο διαμεμβρανικές, μια τρίτη εκκρινόμενη (γνωστή και ως φωσφακάνη) και μια τελευταία γνωστή ως PSI (Εικόνα Ε.6), οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μετάγραφου (Barnea et al, 1994; Maurel et al, 1994; Garwood et al., 2003). Οι διαμεμβρανικές μορφές του υποδοχέα εκφράζονται κυρίως στους νευρώνες του φλοιού (Canoll et al, 1996). Η έκφραση της φωσφακάνης, στην οποία λείπει η διαμεμβρανική και η κυτταροπλασματική περιοχή (Krueger and Saito, 1992; Maurel et al, 1994; Barnea et al, 1994) επάγεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (Sakurai et al, 1996). Επίσης, μετεμβρυϊκά εκφράζεται από τα κύτταρα της γλοίας ανάλογα με τη φάση ανάπτυξης του νευρικού συστήματος και συνεκφράζεται με διάφορα μόρια προσκόλλησης (Canoll et al, 1993; Milev et al, 1994; Grumet et al, 1994). Οι δύο άλλες μορφές αναφέρονται ως long και short μορφές. Η τελευταία διαφέρει από την πρώτη στο ότι της λείπει ένα μεγάλο τμήμα της εξωκυττάριας περιοχής πλησίον της μεμβράνης (Levy et al, 1993). Τέλος, η PSI (Phophacan Short Isoform) αντιστοιχεί στο εξωκυττάριο τμήμα της short μορφής του υποδοχέα. Όπως και η φωσφακάνη, επάγει την προέκταση των νευριτών του φλοιού (Garwood et al, 2003), ενώ μετεμβρυϊκά περιορίζεται στους νευρώνες και όχι στα κύτταρα της γλοίας, όπως συμβαίνει με τη φωσφακάνη (Heck et al, 2005). Η φωσφακάνη και η long μορφή του υποδοχέα είναι ισχυρά γλυκοζυλιωμένες πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ενώ ο PSI και η short 32

39 Εισαγωγή μορφή είναι γλυκοπρωτεΐνες (Garwood et al, 2003). Φαίνεται ότι στους οστεοβλάστες, σε αντίθεση με τα νευρικά κύτταρα, εκφράζεται κυρίως η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του RPTP και παίζει καθοριστικό ρόλο στη μορφογένεση των οστών σε ποντίκια (Schinke et al., 2008). Εκτός από τις ισομορφές του RPTPβ/ζ, σε φυσιολογικές συνθήκες ο RPTPβ/ζ μπορεί να αποικοδομηθεί από την MMP-9, από το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF (TACE, Tumor Necrosis Factor Converting Enzyme), από την πρεσενιλίνη/γ-σεκρετάση (Chow et al, 2008) και από την πλασμίνη (Chow et al, 2008). Τόσο η πλειοτροπίνη (Polykratis et al, 2004), όσο και ο υποδοχέας της, RPTPβ/ζ (Chow et al, 2008) είναι και οι δυο φυσιολογικοί στόχοι της πρωτεολυτικής αποικοδόμησης από το σύστημα tpa/πλασμίνη. Φαίνεται ότι η πρωτεολυτική αποικοδόμηση του RPTPβ/ζ συμμετέχει σε λειτουργικές διαδικασίες των συνάψεων (Chow et al, 2008) και στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Η αλληλεπίδραση του RPTPβ/ζ με άλλες πρωτεΐνες αποκαλύπτει τις διαφορετικές δράσεις στις οποίες συμμετέχει. Η δέσμευση της φωσφακάνης στην τενασκίνη, μια πρωτεΐνη του εξωκυττάριου χώρου, λαμβάνει χώρα στο νευρικό σύστημα in vivo και φαίνεται να παίζει ρόλο στην ιστογένεση του νευρικού ιστού και στην ανάπτυξή του (Grumet et al, 1994; Barnea et al, 1994). Η περιοχή της καρβονικής ανυδράσης του RPTPβ/ζ δεσμεύεται ειδικά στην κοντακτίνη, μια πρωτεΐνη 140 kda που εντοπίζεται στην επιφάνεια των νευρικών κυττάρων, και δρα σα λειτουργικός υποδοχέας για τον RPTPβ/ζ (Peles et al, 1995). Ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά με τον DNER, μια σχετιζόμενη με το Notch διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται έντονα στα κύτταρα Purkinje της παρεγκεφαλίδας, και ρυθμίζει τον υποκυτταρικό εντοπισμό του, ελέγχοντας έτσι τη δημιουργία νευριτών (Fukazawa et al, 2008). 33

40 Εισαγωγή Εικόνα Ε.6: Aναπαράσταση των ισομορφών του RPTPβ/ζ και των περιοχών τους. Ολες οι ισομορφές περιλαμβάνουν την περιοχή που προσομοιάζει την αλληλουχία καρβονικής ανυδράσης (κατάλοιπα ) και την περιοχή τύπου ΙΙΙ ινονεκτίνης (κατάλοιπα ). Παρόλο που όλες οι ισομορφές περιλαμβάνουν την περιοχή συνδέτη μεταξύ της περιοχής τύπου ΙΙΙ ινονεκτίνης και την αλληλουχία ματίσματος για τη μικρή ισομορφή του υποδοχέα (κατάλοιπα ), η αλληλουχία του PSI ολοκληρώνεται 196 αμινοξικά κατάλοιπα μετά την περιοχή τύπου ΙΙΙ ινονεκτίνης. Επιπρόσθετα, η μεγάλη ισομορφή και η φωσφακάνη περιλαμβάνουν περιοχές δέσμευσης με GAGs και αποτελούν υποψήφια μόρια για μετα- μεταφραστική γλυκοζυλίωση. Οι διαμεμβρανικές ισομορφές έχουν μία διαμεμβρανική περιοχή που ακολουθείται από δύο κυτταροπλασματικές περιοχές με δράση φωσφατάσης τυροσίνης (Garwood et al., 2003). Η πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών σήματος. Αυτή εξαρτάται από το ποσοστό αλυσίδων θειϊκής χονδροϊτίνης του υποδοχέα και απομάκρυνση αλυσίδων θειϊκής χονδροϊτίνης (CS) προκαλεί δραστική μείωση στην ισχύ της αλληλεπίδρασης και εκδήλωσης των βιολογικών δράσεων της PTN (Maeda et al., 1996; 1998). Έχει διαπιστωθεί πως τα ποσοστά θειϊκής χονδροϊτίνης της φωσφακάνης μεταβάλλονται δυναμικά 34

41 Εισαγωγή κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου και συνάδουν με τις αλλαγές στη συγγένεια δέσμευσης για την PTN (Maeda et al., 2003). Το μονοπάτι της ΡΤΝ με τον RPTPβ/ζ επάγει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης της β-κατενίνης, καταστρέφει την αλληλεπίδρασή της με την κυτταροπλασματική περιοχή των καντερινών, αποσταθεροποιεί τα σημεία προσκόλλησης (adherens junctions) και μειώνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων (Meng et al, 2000; Deuel et al, 2002). Μέσω ακριβώς της ίδιας φωσφορυλίωσης η ΡΤΝ επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων εμβρυϊκού πνεύμονα (Weng et al., 2009). Από έρευνα του εργαστηρίου έχει προκύψει ότι η κινάση c-src επίσης αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ και μετά από ενεργοποίησή του από την ΡΤΝ ενεργοποιείται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK, focal adhesion kinase), η κινάση της 3-φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PI3K, phosphatidylinositol 3- kinase) και οι ERK1,2 (extracellular signal regulated kinases, κινάσες που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα) (Polykratis et al, 2005). Ο RPTPβ/ζ εκφράζεται σε γλοιοβλαστώματα και νευροβλαστώματα (Goldmann et al, 2000), καθώς επίσης και σε μηνιγγιώματα (Tong et al, 2006). Ωστόσο, τα επίπεδα του υποδοχέα εμφανίζονται μειωμένα σε καρκίνο του ορθού (Yamakawa et al, 1999). Έχει επίσης, βρεθεί σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και διαμεσολαβεί την επαγόμενη από PTN μετανάστευση αυτών (Polykratis et al., 2005). Φαίνεται ότι ο RPTP β/ζ παίζει ρόλο στη μορφολογία των κυττάρων Purkinje της παρεγκεφαλίδας και ανιχνεύεται μαζί με την PTN στους δενδρίτες (Tanaka et al. 2003) Ιντεγκρίνη α ν β 3 Πρόσφατα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αποτελεί λειτουργικό υποδοχέα της PTN και παίζει σημαντικό ρόλο στην PTN-επαγόμενη κυτταρική μετανάστευση μέσω του RPTPβ/ζ (Mikelis et al., 2009). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι μία διαμεμβρανική ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται σχεδόν σε όλα τα κύτταρα που προέρχονται από το μεσέγχυμα και σε διάφορους τύπους κυττάρων των αγγείων, όπως 35

42 Εισαγωγή ενδοθηλιακά κύτταρα, λεία μυϊκά, ινοβλάστες, αιμοπετάλια κ.τ.λ. Φαίνεται να έχει τη πιο σημαντική de novo έκφραση στην επιφάνεια των αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων και να εκφράζεται ευρέως κατά την εμβρυογένεση, ενώ στο ενήλικο άτομο, η έκφρασή της περιορίζεται κυρίως στα αγγειογενετικά ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα (Κumar, 2003). 3.6 Σχέση δομής βιολογικής δράσης Πολλές έρευνες έχουν διεξαχθεί, προκειμένου να καθοριστούν οι διαφορετικές δράσεις της ΡΤΝ, που είναι υπεύθυνες για τις διακριτές της δράσεις, σε μια προσπάθεια να ταυτοποιηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτές αλλά και νέοι πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι. Τα δυο μοτίβα με ομολογία με την επαναλαμβανόμενη αλληλουχία της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ηπαρίνη διαμεσολαβώντας έτσι πολλές από τις βιολογικές δράσεις της ΡΤΝ (Kilpelainen et al., 2000). Τουλάχιστον μια από αυτές τις δυο περιοχές φαίνεται να εμπλέκεται στη μιτογόνο δράση της (Stoica et al, 2001), ενώ και οι δυο απαιτούνται για τη δράση της στην ανάπτυξη νευριτών (Raulo et al., 2005). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η κάθε μια από αυτές τις δομές ξεχωριστά δεν δεσμεύεται ισχυρά στην ηπαρίνη (Heroult et al., 2004; Raulo et al., 2005) και αποτυγχάνει να επηρεάσει την ανάπτυξη και την πλαστικότητα των νευριτών (Raulo et al., 2005) ή να αναστείλει τη δράση του VEGF (Heroult et al., 2004). Απ την άλλη η δομή της ΡΤΝ, στην οποία και οι δυο περιοχές είναι παρούσες απαιτείται για τη δέσμευση στην ηπαρίνη (Heroult et al., 2004; Raulo et al., 2005), την αλληλεπίδραση με τους νευρώνες του ιπποκάμπου (Raulo et al., 2005) και την αναστολή της δράσης του VEGF (Heroult et al., 2004). Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι ένα πεπτίδιο, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ αναστέλλει τη δέσμευση της στην ηπαρίνη, όπως και τις μιτογόνες, μετασχηματικές και αγγειογενετικές δράσεις της in vitro και in vivo σε ποντίκια (Hamma-Kourbali et al., 2008). 36

43 Εισαγωγή Η ύπαρξη διακριτών λειτουργιών των δυο περιοχών της ΡΤΝ με ομολογία στη θρομβοσπονδίνη υποστηρίζεται από πρόσφατα δεδομένα, που δείχνουν ότι η αντίστοιχη αμινοτελική περιοχή διεγείρει τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων ενώ η καρβοξυτελική παίζει ρόλο στην επαγόμενη από τον όγκο αγγειογένεση (Zhang et al., 2006). Η καρβοξυτελική πλούσια σε λυσίνες περιοχή της ΡΤΝ (αμινοξέα ) δεν εμπλέκεται στη δράση της στην ανάπτυξη νευριτών, αλλά φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στις μιτογόνες και ογκογενετικές της δράσεις (Bernard-Pierrot et al., 2001), μέσω δέσμευσης στον ALK (Bernard-Pierrot et al., 2002), ή στον RPTPβ/ζ (Βermek et al., 2007). Υπερέκφραση του καρβοξυτελικού άκρου της ΡΤΝ (αμινοξέα ) στα SW13 κύτταρα οδηγεί στην επαγωγή αγγειογένεσης in vivo σε ίδια ποσοστά με την ΡΤΝ, ενώ αντίθετα στην υπερέκφραση του αμινοτελικού άκρου αν και δημιουργούνται όγκοι, εντούτοις δεν πραγματοποιείται αγγειογένεση (Zhang et al, 2006). Οι ακριβείς καρβοξυτελικές περιοχές της ΡΤΝ που είναι υπεύθυνες για τη δέσμευση στους υποδοχείς της δεν είναι γνωστές και σίγουρα χρήζουν περαιτέρω διευκρίνισης. Έχει προταθεί ότι και τα δυο πλούσια σε λυσίνες άκρα της ΡΤΝ είναι απαραίτητα για τον επιτυχή μετασχηματισμό κυττάρων (Zhang et al., 1999), αν και οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί δεν είναι κατανοητοί. Η ΡΤΝ που δεν διαθέτει τα αμινοξέα αναστέλλει την ανάπτυξη όγκων δρώντας ταυτόχρονα σε ενδοθηλιακά και κύτταρα καρκίνου του μαστού (Duces et al., 2008). Τέλος, πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι η ΡΤΝ υπάρχει σε δυο φυσικά εμφανιζόμενες μορφές, τις ΡΤΝ 15 και ΡΤΝ 18, που αλληλεπιδρούν διαφορετικά με τους υποδοχείς ALK και RPTPβ/ζ και έτσι εμφανίζουν και ξεχωριστές δράσεις. Η ΡΤΝ 18 αλληλεπιδρά με τον ΡΤΡβ/ζ και επάγει τη μετανάστευση των γλοιωματικών κυττάρων, ενώ η ΡΤΝ 15 αλληλεπιδρά με τον ALK και επάγει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων κυττάρων (Lu et al., 2005). 37

44 Εισαγωγή 3.7 Πλειοτροπίνη & αγγειογένεση / καρκίνος Ένας πιθανός ρόλος της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε όταν ανιχνεύτηκε το mrna και απομονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η μήτρα βοός και η μήτρα επίμυος (Milner et al., 1989; Vanderwinden et al., 1992). Μια πληθώρα αναφορών δείχνουν μια θετική συσχέτιση ανάμεσα στην ΡΤΝ και στην in vivo και in vitro αγγειογένεση (Mikelis et al, 2007; Mikelis and Papadimitriou, 2008). H ΡΤΝ επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών (Papadimitriou et al, 2001; Brockman et al, 2003; Polykratis et al, 2005), αλλά και προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Heiss et al, 2008). Η αγγειογενετική δράση της PTN όσον αφορά τα in vivo συστήματα μελέτης, έχει διαπιστωθεί στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM assay) και σε εμφυτεύματα matrigel σε μυς (Papadimitriou et al., 2000; Bernard-Pierott et al., 2002). Εκτός όμως από το ρόλο της ΡΤΝ στη φυσιολογική αγγειογένεση, που προαναφέραμε, η ΡΤΝ θεωρείται παράγοντας που επάγει την παθολογική αγγειογένεση και την ανάπτυξη των όγκων. Ο αγγειογενετικός ρόλος της PTN μπορεί να σχετίζεται με την παθογένεση του ενδομητρίου, μια ήπια γυναικολογική διαταραχή (Chung et al., 2002). Επιπλέον, η PTN εντοπίζεται σε ενήλικα άτομα σε καταστάσεις φλεγμονής, όπως κατά τη ρευματοειδή αρθρίτιδα (Pufe et al., 2003), όπου μπορεί να δρα ως παρακρινής αγγειογενετικός παράγοντας. Φαίνεται ότι η έκφρασή της σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε τομές μεσοσπονδύλιων δίσκων έδειξαν ότι η ΡΤΝ εντοπίζεται στα κύτταρα του δίσκου, στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στο εξωκυτταρικό υλικό και επάγει την αγγειογένεση του ιστού (Johnson et al., 2007). Όσον αφορά στην καρκινική αγγειογένεση, αύξηση της έκφρασης της ΡΤΝ επάγει την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού στα ποντίκια, πιθανότατα μέσω ενεργοποίησης του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων του στρώματος (Chang et al, 2007). Η αναστολή της έκφρασης της ΡΤΝ με ριβοένζυμα αποκαλύπτει το ρυθμιστικό ρόλο της ΡΤΝ και στα γλοιοβλαστώματα (Grzelinski et al, 2005; 2006). Αναστολή της έκφρασης της ΡΤΝ στα ανθρώπινα κύτταρα από καρκίνο προστάτη LNCaP μειώνει την ανάπτυξη και τη μετανάστευσή τους και τη 38

45 Εισαγωγή δυνατότητα να επάγουν αγγειογένεση in vitro και in vivo (Hatziapostolou et al, 2005). Τέλος, πέρα από τη χαρακτηρισμένη επαγωγική δράση της ΡΤΝ, πρόσφατα δεδομένα της αποδίδουν ανασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και της αγγειογένεσης. Η ΡΤΝ δεσμεύεται με το VEGF και προκαλεί αναστολή στη βιολογική του δράση (Heroult et al, 2004). Η ΡΤΝ επιπλέον, έχει χαρακτηρισθεί ως αγγειοστατικός παράγοντας σε ένα in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος (Calvet et al, 2006). Αναστολή της έκφρασης της ΡΤΝ στα C6 κύτταρα γλοιώματος οδηγεί σε αύξηση του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και ανάπτυξης in vitro και επαγωγή της αγγειογένεσης in vivo και in vitro (Parthymou et al, 2007). 39

46 Εισαγωγή 40

47 ΣΚΟΠΟΣ

48 Σκοπός Σκοπός της εργασίας Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας μεγέθους 18 kda, που εμφανίζει υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη (Rauvala et al., 1994; Courty et al., 1991; Hampton et al., 1992). Το μόριο της ΡΤΝ είναι πολύ συντηρημένο μεταξύ των ειδών και εμφανίζει 50% αμινοξική αλληλουχία με τη midkine, το άλλο μέλος της ίδιας οικογένειας αυξητικών παραγόντων με συγγένεια για την ηπαρίνη (Rauvala et al., 2000; Papadimitriou et al., 2004). Η ΡΤΝ διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και την ανάπτυξη όγκων. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα ΡΤΝ εντοπίζονται σε ανθρώπινους όγκους ή καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης, όπως σε καρκίνο παγκρέατος, προστάτη, μαστού, πνεύμονα, γλοιοβλαστώματα, νευροβλαστώματα και μελανώματα (Papadimitriou et al., 2009), υποδεικνύοντας έτσι την εξέχουσα σημασία της στον καρκίνο. Πέρα, όμως από την άμεση δράση της ΡΤΝ στα καρκινικά κύτταρα, πολλές αναφορές συσχετίζουν τη δράση της με την in vitro και in vivo αγγειογένεση (Mikelis et al., 2007). Για το λόγο αυτό, η ΡΤΝ θεωρείται ένας πολλά υποσχόμενος νέος στόχος για τη θεραπεία και τη διάγνωση πιθανά πολλών τύπων καρκίνου (Papadimitriou et al., 2004). Η ΡΤΝ διαμεσολαβεί τις αγγειογενετικές δράσεις της δεσμευόμενη σε κάποιους υποδοχείς. Ο πιο καλά χαρακτηρισμένος υποδοχέας της είναι ο υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ και από προηγούμενη δουλειά της ερευνητικής μας ομάδας διαπιστώθηκε ότι η ΡΤΝ επάγει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω αυτού (Polykratis et al, 2005). Πρόσφατα ωστόσο, βρέθηκε και ένας νέος λειτουργικός υποδοχέας της ΡΤΝ, η ιντεγκρίνη α ν β 3, η οποία σχηματίζει λειτουργικό σύμπλοκο με τον RPTPβ/ζ στην επιφάνεια των κυττάρων και η παρουσία της είναι απαραίτητη για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al., 2009). Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι η α ν β 3 εκφράζεται σε ιστούς μεσεγχυματικής προέλευσης και παρουσιάζει την πιο σημαντική de novo έκφραση κατά την αγγειογένεση, εκφραζόμενη στην επιφάνεια αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Stupack and Cheresh, 2004). Αντικείμενο έρευνας έχει αποτελέσει η σχέση δομής-βιολογικής δράσης διαφορετικών πεπτιδικών τμημάτων της PTN, με τα μέχρι σήμερα αποτελέσματα από λειτουργικές μελέτες της δράσης τροποποιημένων μορφών της PTN να είναι 41

49 Σκοπός πολλές φορές αντιφατικά. Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες αφορούν στις δύο τελικές περιοχές της ΡΤΝ, οι οποίες φαίνεται να είναι σημαντικοί ρυθμιστές της δράσης του μορίου. H ΡΤΝ από την οποία λείπουν 26 αμινοξέα από το καρβοξυτελικό άκρο (ΡΤΝΔ ), δε φαίνεται να φέρει μιτογόνο δράση, διατηρεί την ικανότητα να επάγει τη διαφοροποίηση πρωτογενών νευρώνων, ενώ δεν παίζει ρόλο στην προέκταση νευριτών από εγκεφαλικά κύτταρα εμβρύου αρουραίου, σε αντίθεση με έλλειμμα στην Ν- τελική περιοχή, το οποίο ανέστειλε σχεδόν ολοκληρωτικά αυτή τη δράση (Inui et al., 2000). Παρόμοια, αποκοπή των τελευταίων 26 αμινοξέων της PTN φαίνεται να δρα αρνητικά όσον αφορά στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων, στην ανάπτυξη όγκων σε ποντίκια (Bernard-Pierrot et al., 2001, 2002) και στην ενεργοποίηση του μονοπατιού των MAP κινασών (Souttou et al., 1997). Συνθετικό πεπτίδιο της PTN που αντιστοιχεί στα αμινοξέα αναστέλλει τις in vitro δράσεις της αγρίου τύπου πρωτεΐνης σε καρκινικά κύτταρα, λόγω ανταγωνισμού για την πρόσδεση στον υποδοχέα ALK (Bernard-Pierrot et al., 2002) ή RPTPβ/ζ (Bermek et al., 2007). Tα πεπτίδια της PTN 1-21 και επάγουν τον πολλαπλασιασμό κυττάρων BBC και RAME αλλά όχι των HUVEC (Papadimitriou et al., 2000), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο τύπος των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο. Συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-21 και και αντιστοιχούν στα δύο άκρα της PTN, επάγουν την in vivo αγγειογένεση και την in vitro μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και το σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Στην παρούσα εργασία, προκειμένου να μελετηθούν περαιτέρω οι δράσεις των διαφορετικών περιοχών του μορίου της ΡΤΝ, χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν σε διακριτές περιοχές της PTN. Χρησιμοποιήθηκαν τα εξής πεπτίδια: 1) ΡΤΝ 1-5 που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1-5, 2) ΡΤΝ που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 16-24, 3) ΡΤΝ που αντιστοιχεί στα αμινοξέα και 4) ΡΤΝ που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της πλειοτροπίνης (Εικόνα Σ.1). Η επιλογή των πεπτιδίων αυτών έγινε με βάση δημοσιευμένα αποτελέσματα που αποδίδουν στις αντίστοιχες περιοχές πιθανή συμμετοχή στις βιολογικές δράσεις της ΡΤΝ (Papadimitriou et al., 2000; Kilpelainen et al., 2000; Zhang et al., 2006; Zhang et al., 1999; Mikelis et al., αδημοσίευτα αποτελέσματα). 42

50 Σκοπός Τα δυο πρώτα αντιστοιχούν στην αμινοτελική περιοχή του μορίου, ενώ τα δυο τελευταία στην καρβοξυτελική. Τα πεπτίδια ΡΤΝ και PTN αντιστοιχούν σε περιοχή της πλειοτροπίνης με θεωρούμενη ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι (Kilpelainen et al., 2000). Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος στερεάς φάσης και η Fmoc/tBu χημεία, με τη χρήση 2-χλωροτριτυλ χλωριδίου ρεζίνης ως στερεά φάση. Τα τελικά προϊόντα διέθεταν καθαρότητα τουλάχιστον 97%, όπως βρέθηκε μετά από HPLC ανάλυση και οι μοριακές τους μάζες ταυτοποιήθηκαν με ESI-MS. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης των πεπτιδίων αυτών στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος και στο χημειοτακτισμό ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση των ίδιων πεπτιδίων στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τους υποδοχείς της α ν β 3 και RPTPβ/ζ, καθώς και με τις μεταλλοπρωτεϊνάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, σε μια προσπάθεια να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη δράση της PTN στην κυτταρική μετανάστευση, δράση που είναι διαφορετική ανάλογα με το είδος των κυττάρων (Μikelis et al., 2009). Οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 επιλέχτηκαν με βάση δημοσιευμένα αποτελέσματα που δείχνουν ότι πρωτεολύουν την ΡΤΝ (Dean et al., 2007) και τον RPTPβ/ζ (Chow et al., 2008) αντίστοιχα, γεγονός που μας οδήγησε στην υπόθεση μιας πιθανής εμπλοκής τους σε δράσεις της PTN. 43

51 Σκοπός ΡΤΝ 1-5 : NH 2 -GKKEK-COOH ΡΤΝ :NH 2 -GEWQWSVCV-COOH ΡΤΝ : NH 2 -FQAWGEC-COOH ΡΤΝ : NH 2 -KLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKMLD-COOH Εικόνα Σ.1: Σχηματική αναπαράσταση των αλληλουχιών (αριστερά) των συνθετικών πεπτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα μελέτη, καθώς και των θέσεών τους (δεξιά) πάνω στη θεωρούμενη τριτοταγή δομή του μορίου της ΡΤΝ. 44

52 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

53 Υλικά και Μέθοδοι 1. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (Pipili-Synetos et al, 1998) Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα κολλαγενάσης 1% κ.β. 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml θρεπτικού μέσου Μ199 Το διάλυμα μοιράζεται σε ποσότητες μικρότερου όγκου και φυλάσσεται στους - 20 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Θρεπτικό μέσο M199 Αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο 2. Πλήρες θρεπτικό μέσο για HUVEC Αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο 2. Διαδικασία 1. Ο ομφάλιος λώρος ανθρώπου λαμβάνεται σε ασηπτικές συνθήκες, επιλεκτικά από γέννες που πραγματοποιούνται με καισαρική τομή. Η απομόνωση των κυττάρων λαμβάνει χώρα στο εργαστήριο αμέσως μετά την άφιξη του λώρου. 2. Η κολλαγενάση αραιώνεται με θρεπτικό μέσο μέχρι τελικής συγκέντρωσης 0.01%. Η αραίωση πραγματοποιείται πάντα σε θρεπτικό μέσο ή σε άλλο διάλυμα που περιέχει Ca +2, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύμου. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύμων, μεταξύ των οποίων και της κολλαγενάσης. Από τη στιγμή της αραίωσής της, η κολλαγενάση δε 45

54 Υλικά και Μέθοδοι διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα (λιγότερο από 1 εβδομάδα στους 4 ο C). Ιδανικά, πρέπει να αραιώνεται αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί. Η τελική συγκέντρωση της κολλαγενάσης αποτελεί ένα από τα πιο κρίσιμα στάδια για την απομόνωση των κυττάρων. 3. Ο ομφάλιος λώρος έχει δυο αρτηρίες και μια φλέβα, η οποία είναι μεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και με μαλακότερα τοιχώματα. Ξεπλένεται η φλέβα με PBS (με σύριγγα των 20 ml), ώστε να απομακρυνθούν υπολείμματα αίματος και θρόμβοι. Ελέγχεται εάν η φλέβα του ομφάλιου λώρου είναι ακέραια. Πριν την προσθήκη της κολλαγενάσης πρέπει να διασφαλιστεί ότι το τμήμα του λώρου που χρησιμοποιείται είναι ακέραιο. Τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώματος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την απομόνωση των κυττάρων. 4. Κλείσιμο με τη βοήθεια αιμοστάτη του ενός άκρου του ομφάλιου λώρου. 5. Από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου διοχετεύεται μέσα στη φλέβα το θρεπτικό μέσο με την κολλαγενάση. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται λόγω του εισερχόμενου διαλύματος. 6. Με αιμοστάτη φράσσεται και το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 7. Ο ομφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και επωάζεται στους 37 ο C για λεπτά. 8. Αφαιρείται ο ένας αιμοστάτης και το διάλυμα που περιέχεται στη φλέβα του ομφάλιου λώρου (θρεπτικό μέσο με κολλαγενάση και αποκολλημένα κύτταρα HUVEC) συλλέγεται σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml. 9. Αφαιρείται ο αιμοστάτης και από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 10. Διοχετεύεται PBS, ξεπλένοντας τη φλέβα του ομφάλιου λώρου και το έκλουμα συλλέγεται στο ίδιο αποστειρωμένο σωληνάριο. 11. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 12. Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων. 46

55 Υλικά και Μέθοδοι 13. Επώαση των κυττάρων σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. 14. Μια ημέρα αργότερα ακολουθεί αφαίρεση του θρεπτικού μέσου από το τρυβλίο, δυο ήπιες πλύσεις με PBS και αντικατάσταση με 10 ml νέου πλήρους θρεπτικού μέσου. Η διαδικασία πραγματοποιείται για να απομακρυνθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια και άλλα κύτταρα που δεν έχουν προσκολληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου, και τα οποία είναι τοξικά για τα ζωντανά κύτταρα. 15. Παρατήρηση της καλλιέργειας σε μικροσκόπιο. Εάν η απομόνωση είναι επιτυχής διακρίνονται συσσωματώματα κυττάρων τα οποία είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου. 16. Η επώαση των κυττάρων γίνεται με ανανέωση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων κάθε 3-4 ημέρες, έως ότου φθάσουν σε βαθμό κάλυψης 80-90% του πυθμένα του τρυβλίου (πλήρης κάλυψη). 2. Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα HUVEC Θρεπτικό μέσο Μ199: Υλικά και διαλύματα Μ199 (earl s) Πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη L-γλουταμίνη 500 ml 100 U ανά ml 50 μg ανά ml 2.5 μg ανά ml 2 M 47

56 Υλικά και Μέθοδοι Πλήρες θρεπτικό μέσο για HUVEC: Μ199 Ορός εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) Endothelial cell growth supplement (ECGS) Ηπαρίνη 340 ml 60ml 15 mg Sigma ή 60mg απομονωμένου ECGS 5 U ανά ml Διαδικασία 1. Ανοίγεται η σφραγισμένη φιάλη των 500 ml θρεπτικού μέσου Μ199 (earl s). 2. Τοποθετούνται τα αντιβιoτικά: πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (5ml), γενταμυκίνη (2.5 ml) και αμφοτερικίνη (5ml). Σε θρεπτικά μέσα Μ199 με ένδειξη ότι στερούνται γλουταμίνης (w/o glutamine) προσθέτουμε και γλουταμίνη (5ml). Η πενικιλίνη στρεπτομυκίνη έχει δράση ενάντια σε βακτήρια, ενώ η γενταμυκίνη και η αμφοτερικίνη έχουν δράση ενάντια σε μύκητες. Σε αυτό το στάδιο έχουμε το θρεπτικό μέσο Μ199. Είναι το ένα διάλυμα που χρησιμοποιούμε στις κυτταροκαλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων. 3. Παρασκευάζεται το πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα HUVEC (100 ml). Αυτό αποτελείται από 85 ml θρεπτικό μέσο Μ199, 15 ml ορό εμβρύου βοός (fetal bovine serum, FBS), 100λ διαλύματος ηπαρίνης (5000 Units/ml) και 15 mg ECGS (Endothelial cell growth supplement). Το εκχύλισμα ECGS είναι εμπλουτισμένο σε FGF και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται για να ενεργοποιηθεί ο ECGS. 4. Το θρεπτικό μέσο αποστειρώνεται με διοχέτευσή του με σύριγγα των 20 ml μέσα από φίλτρο με πόρους που έχουν διάμετρο 0,2 μm. Φυλάσσεται στους 4 0 C. 48

57 Υλικά και Μέθοδοι 3. Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα C6, U87MG και MO59K Υλικά και διαλύματα C6: πρόκειται για κύτταρα γλοιώματος, που παραλαμβάνονται από την εταιρεία ATCC. Απομονώνονται από εγκέφαλο αρουραίου (Rattus norvegicus) και έχουν χαρακτηριστική μορφολογία ινοβλαστών. U87MG: πρόκειται για κύτταρα γλοιοβλαστώματος (αστροκυτώματος), που παραλαμβάνονται από την εταιρεία ATCC. Απομονώνονται από εγκέφαλο ανθρώπου (Homo sapiens) στο στάδιο ΙΙΙ της ασθένειας και φέρουν χαρακτηριστική μορφολογία επιθηλιακών κυττάρων. ΜΟ59Κ: όπως και τα κύτταρα U87MG προέρχονται από ανθρώπινο κακοήθες γλοιοβλάστωμα και έχουν τη μορφολογία ινοβλαστών. Θρεπτικό μέσο HAM S F-12 (για τα κύτταρα C6): HAM S F-12 Πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη L-γλουταμίνη 500 ml 100 U ανά ml 50 μg ανά ml 2.5 μg ανά ml 2.5 μm Θρεπτικό μέσο DMEM HAM S F-12 (για τα κύτταρα ΜΟ59Κ και U87MG): DMEM HAM S F-12 Πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη L-γλουταμίνη HEPES Non essential amino acids 500 ml 100 U ανά ml 50 μg ανά ml 2.5 μg ανά ml 2.5 μm 15 mm 0.05 mm 49

58 Υλικά και Μέθοδοι Πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα C6, U87MG και MO59Κ: HAM S F-12 ή DMEM HAM S F- 12 Ορός εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) 45 ml 5 ml 4. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Η μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (Eικόνα Μ.1) είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια από αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν τετραγώνου 1 mm 2 ). Το κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2.5 μm, και οι οποίες χρησιμεύουν για το καθορισμό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγματος. Σε κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχονται επιπλέον διαβαθμίσεις για διευκόλυνση της μέτρησης των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0.1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. 50

59 Υλικά και Μέθοδοι 1.0 mm Πρώτο τετράγωνο περι οχή βάθος όγκος = μετρήσιμα = μη μετρήσιμα Εικόνα Μ.1: Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0.1 mm 3 (1 mm x 0.1 mm) ή 10-4 ml. Έτσι η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρημα (κύτταρα/ml) είναι: Αριθμός κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x Ανακαλλιέργεια κυττάρων Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφοι 2 & 3) 51

60 Υλικά και Μέθοδοι Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφοι 2 & 3) Τρυψίνη EDTA ( % σε PBS χωρίς Ca +2 ) Αιματοκυτταρόμετρο Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα ζελατίνης (G1393, Sigma) Διάλυμα ζελατίνης 2%, το οποίο αραιώνεται πριν από τη χρήση του σε τελική συγκέντρωση 1% με PBS 1x. Διατηρείται στους 4 ο C. Χρησιμοποιείται μόνο στην περίπτωση των HUVEC. Διαδικασία Παρατήρηση: Στην περίπτωση των κυττάρων HUVEC, πριν προηγηθεί η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται επίστρωση των τρυβλίων καλλιέργειας που θα χρησιμοποιηθούν με διάλυμα ζελατίνης. Μετά την επίστρωση του διαλύματος ζελατίνης τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστικό θάλαμο, όπου επωάζονται για χρόνο τουλάχιστον 20 λεπτά, ώστε η ζελατίνη να δεσμευθεί στον πυθμένα των τρυβλίων. Η ζελατίνη βελτιώνει τη δέσμευση των HUVEC στο τρυβλίο και βελτιώνει την κατάστασή τους σε πειράματα που απαιτείται επώαση σε θρεπτικό μέσο μειωμένης περιεκτικότητας σε ορό. Την επώαση ακολουθεί μια πλύση με διάλυμα PBS για την απομάκρυνση της περίσσειας ζελατίνης και ξεκινάει η διαδικασία της ανακαλλιέργειας. 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Η μορφολογία των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται 52

61 Υλικά και Μέθοδοι αυτά που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου χωρίς να έχει αλλάξει η μορφολογία τους. 2. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Έκπλυση των κυττάρων δυο φορές με PBS. Παρατήρηση: με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς τρυψίνης. Οι διαδικασίες πρέπει να γίνονται όσο το δυνατόν γρηγορότερα, γιατί τα κύτταρα δεν πρέπει να μείνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς θρεπτικό μέσο ή PBS, αφού είναι ιδιαίτερα ευπαθή κατά την επαφή τους με τον αέρα. Επιπλέον, ο χρόνος που παραμένουν τα κύτταρα στο PBS (το οποίο δεν περιέχει ιόντα Ca +2 ) πρέπει επίσης να είναι μικρός, καθώς παρατηρείται απώλεια της επαφής των κυττάρων με το υπόστρωμα. 5. Προσθήκη 1 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 100 mm. 6. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Εάν η αποκόλληση δεν είναι ικανοποιητική, μπορούν να πραγματοποιηθούν ελαφρές αναταράξεις του τρυβλίου. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. 7. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων η τρυψίνη αναστέλλεται με την προσθήκη 3 ml του αντίστοιχου πλήρους θρεπτικού μέσου, ανάλογα με το είδος των κυττάρων. 8. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml. Ακολουθεί ήπιο ξέπλυμα με διάλυμα PBS και μεταφορά των κυττάρων που έχουν απομείνει στο τρυβλίο. 9. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία 26 ο C (ή θερμοκρασία δωματίου). 53

62 Υλικά και Μέθοδοι 10. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης ακολουθεί μεταφορά του σωλήνα στο θάλαμο νηματικής ροής και αναρρόφηση του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11. Προσθήκη (στον ίδιο σωλήνα) πλήρους θρεπτικού μέσου, ανάλογα με το είδος των κυττάρων, μέχρι τελικού όγκου 3 ml. 12. Επαναιώρηση των κυττάρων με τη βοήθεια πιπέτας. Ο λόγος της επαναιώρησης είναι για να μην υπάρχουν συσσωματώματα κυττάρων, κάτι που θα καθιστούσε δυσκολότερο τον υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων στο αιματοκυτταρόμετρο. 13. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων. 14. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων. 15. Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται κύτταρα ανά ml πλήρους θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. 6. Κατάψυξη κυττάρων HUVEC, MO59K, U87MG και C6 Υλικά και διαλύματα Διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) Πρέπει να είναι ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). Πλήρες θρεπτικό μέσο (ανάλογα με το είδος των κυττάρων, όπως περιγράφεται και στις παραγράφους 2 & 3) Ορός εμβρύου βοός (FBS) Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials) Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη Επιτρέπει την ήπια αρχική ψύξη των κυττάρων 54

63 Υλικά και Μέθοδοι Δοχείο Dewar με υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων με τα κύτταρα Διαδικασία Παρατήρηση: Η διατήρηση των κυττάρων για μεγάλο διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ -195 ο C και -210 ο C. Για μικρότερο χρονικό διάστημα (λίγους μήνες) μπορεί να διατηρηθεί και σε θερμοκρασίες -80 ο C. Για την επιτυχή διατήρησή τους είναι απαραίτητη η καλή μεταβολική τους κατάσταση πριν την ψύξη, για το λόγο αυτό και η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων πραγματοποιείται όταν αυτά έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Για την επιτυχή κατάψυξή τους είναι απαραίτητη και η βαθμιαία ψύξη τους (περίπου 1 ο C ανά ώρα), μέχρι ένα κρίσιμο σημείο θερμοκρασίας, -20 ο C. Η βαθμιαία ψύχη επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας συσκευής με υποδοχές η οποία περιέχει ισοπροπανόλη, λόγω της οποίας γίνεται και η σταδιακή ψύξη. Προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού χρησιμοποιείται διμεθυλοσουλφοξείδιο DMSO ή γλυκερόλη. Ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρθηκε στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). Τα κύτταρα από 1 τρυβλίο 100 mm αποθηκεύονται σε ένα φιαλίδιο. 2. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 3. Σημειώνονται στο φιαλίδιο το όνομα της κυτταρικής σειράς, η ημερομηνία κατάψυξης και η γενιά των κυττάρων. 4. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 5. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 900 μl ορού (στην περίπτωση των HUVEC). Εναλλακτικά μπορεί να επαναιωρηθεί σε 950 μl πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση των C6, MO59K, U87MG). Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων στο ειδικό φιαλίδιο για την ψύξη των κυττάρων. 55

64 Υλικά και Μέθοδοι 6. Προσθήκη της ποσότητας DMSO που απαιτείται (100 μl στα HUVEC και 50 μl στα C6, MO59K και U87MG). Την προσθήκη του DMSO ακολουθεί γρήγορη ανάδευση με πιπέτα και άμεση μεταφορά στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με ισοπροπανόλη. Παρατήρηση: Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας, ενώ η προσθήκη του μειώνει τη δημιουργία κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 7. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους -80 ο C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 ο C ανά ώρα), η οποία συμβάλλει στη μεγαλύτερη βιωσιμότητα των κυττάρων. 8. Τοποθέτηση του φιαλιδίου για την ψύξη των κυττάρων σε ειδική υποδοχή βυθισμένη σε υγρό άζωτο στο δοχείο Dewar, έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιμοποίηση τους. 7. Απόψυξη κυττάρων HUVEC, MO59K, U87MG και C6 Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (όπως περιγράφεται στις παραγράφους 2 & 3) Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (όπως περιγράφεται στις παραγράφους 2 & 3) Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διαδικασία Παρατήρηση: Με τη διαδικασία αυτή, κύτταρα που βρίσκονται παγωμένα ακόμα και για μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατό να επανακαλλιεργηθούν. Λόγω της 56

65 Υλικά και Μέθοδοι τοξικότητας του DMSO οι κινήσεις στη διαδικασία αυτή, όπως και στην κατάψυξη, πρέπει να είναι γρήγορες. 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου ανάλογα με το είδος των κυττάρων. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Σύντομο ξεπάγωμα με ανακίνηση σε υδατόλουτρο στους 37 ο C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο που βρίσκονται τα κύτταρα, το οποίο είναι πολύ τοξικό για αυτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 6. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml θρεπτικού μέσου, ανάλογα με το είδος των κυττάρων στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη επιπλέον θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 8. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 9. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 10. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 11. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. (Στην περίπτωση των HUVEC το τρυβλίο πρέπει να έχει επωασθεί με ζελατίνη). 12. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 13. Μεταφορά του τρυβλίου στον επωαστικό θάλαμο. 14. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3-4 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 57

66 Υλικά και Μέθοδοι 8. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΜΟ59Κ, U87MG και C6 Υλικά και διαλύματα Μικροπλακίδια 48 μικροκυψελίδων κατάλληλα για κυτταροκαλλιέργειες. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (όπως περιγράφεται στην παραγράφο 3) Διάλυμα ΜΤΤ 10Χ 5 mg 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dimethyl tetrazolium bromide (MTT) σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS). Διατηρείται στους 4 0 C και απουσία φωτός. Διάλυμα οξινισμένης ισοπροπανόλης 0.33 ml HCl ανά 100 ml ισοπροπανόλης Διαδικασία 1. Το πρώτο μέρος της μεθόδου αφορά τη διαδικασία της ανακαλλιέργειας των κυττάρων, που έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο 5. Συγκεκριμένα, ακολουθούνται τα βήματα της ανακαλλιέργειας και η διαφοροποίηση της διαδικασίας εμφανίζεται μετά τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. 2. Καθορίζουμε τις αραιώσεις του διαλύματος των κυττάρων, ώστε σε ένα μικροπλακίδιο που έχει 48 μικροκυψελίδες να προστεθούν 10,000 κύτταρα 58

67 Υλικά και Μέθοδοι ανά μικροκυψελίδα σε τελικό όγκο 0,25 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 3. Μια ημέρα μετά την επίστρωση των κυττάρων στις μικροκυψελίδες, προστίθενται οι ουσίες στις επιθυμητές συγκεντρώσεις, στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. Παρατηρήσεις: 1) Πριν την προσθήκη της αραιωμένης ουσίας αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο σε κάθε μικροκυψελίδα. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα επωάζονται με την επίδραση μόνο της αραιωμένης ουσίας. 2) Κατά την επίδραση των πεπτιδίων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-5, 16-24, & της πλειοτροπίνης στα κύτταρα M059K & U87MG η αραίωση τους γίνεται σε θρεπτικό μέσο περιεκτικότητας 0% σε ορό, ώστε να γνωρίζουμε ότι οποιαδήποτε μεταβολή παρατηρήσουμε οφείλεται στη δράση της επιδρώσας ουσίας και όχι σε κάποιο συστατικό (αυξητικό παράγοντα κτλ) του ορού. 3) Κατά την επίδραση των ίδιων πεπτιδίων σε κύτταρα C6 (εκτός του πεπτιδίου ) η αραίωση τους γίνεται σε θρεπτικό μέσο περιεκτικότητας 2% σε ορό. Αυτό γίνεται γιατί παρατηρούνται μορφολογικές αλλαγές των συγκεκριμένων κυττάρων, όταν καλλιεργούνται σε θρεπτικό μέσο απουσία ορού. 4. Οι μικροκυψελίδες μεταφέρονται στον επωαστή, όπου επωάζονται για 48 h σε θερμοκρασία 37 0 C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% σε CO Μετά το πέρας 48 h πραγματοποιείται προσθήκη 1/10 του όγκου του θρεπτικού μέσου στη μικροκυψελίδα (δηλαδή, 25 μl ανά μικροκυψελίδα) από το διάλυμα ΜΤΤ συγκέντρωσης 10Χ. 6. Οι μικροκυψελίδες επανατοποθετούνται στον επωαστή, στους 37 0 C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% σε CO Μετά από πάροδο δυο ωρών, οι μικροκυψελίδες αφαιρούνται από τον επωαστή. 8. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Παρατήρηση: Δείκτη του ικανοποιητικού μεταβολισμού του ΜΤΤ στα κύτταρα κάθε μικροκυψελίδας αποτελεί ο σχηματισμός κρυστάλλων 59

68 Υλικά και Μέθοδοι φορμαζάνης στο εσωτερικό των κυττάρων. Επομένως, η μετατροπή του ΜΤΤ σε κρυστάλλους φορμαζάνης αποτελεί ένδειξη για τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων. 9. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου που βρίσκεται στις μικροκυψελίδες, υπό κενό και με πιπέτα Pasteur. 10. Προσθήκη 100 μl οξινισμένης ισοπροπανόλης ανά μικροκυψελίδα. Ακολουθεί ήπια ανακίνηση, ώστε να μην υπάρχουν κρύσταλλοι φορμαζάνης οι οποίοι δεν έχουν διαλυθεί και πιθανόν να επηρεάσουν τη φωτομέτρηση. 11. Μεταφορά του διαλύματος σε μικροπλακίδιο ELISA 96 κυψελίδων και φωτομέτρηση στα 490 nm, χρησιμοποιώντας φωτόμετρο για ELISA. Σε μια κυψελίδα προστίθενται 100 μl καθαρής οξινισμένης ισοπροπανόλης και αυτή χρησιμοποιείται ως μάρτυρας (control). 12. Από τις οπτικές απορροφήσεις υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων με βάση την πρότυπη καμπύλη που έχει κατασκευαστεί, μετρώντας την οπτική απορρόφηση που δίνουν με τη μέθοδο αυτή γνωστοί αριθμοί κυττάρων. 9. Έλεγχος της επίδρασης του πεπτιδίου, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της πλειοτροπίνης, στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων C6 κατόπιν κατεργασίας με τρυψίνη Υλικά και διαλύματα Μικροπλακίδια 48 μικροκυψελίδων κατάλληλα για κυτταροκαλλιέργειες Θρεπτικό μέσο HAM S F12 κατάλληλο για καλλιέργεια κυττάρων C6 Τρυψίνη EDTA (0.05 %-0.02 % σε PBS χωρίς Ca + ). 60

69 Υλικά και Μέθοδοι Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Διαδικασία Παρατήρηση: Η συγκεκριμένη διαδικασία πραγματοποιήθηκε μόνο στην περίπτωση της κατεργασίας των κυττάρων C6 με το πεπτίδιο Αυτό γίνεται γιατί σε προηγούμενα πειράματα με αυτά τα κύτταρα (επίδραση πεπτιδίου ) κατόπιν παρατήρησης στο μικροσκόπιο φαινόταν επαγωγή του αριθμού των κυττάρων, ενώ το αποτέλεσμα του ΜΤΤ ήταν ανασταλτικό. Αυτό ίσως να σημαίνει ότι κάποια κύτταρα γίνονται μεταβολικά λιγότερο ενεργά, και το ΜΤΤ δεν μπορεί να δράσει. Έτσι, λοιπόν ο αριθμός των κυττάρων μετά την επίδραση του συγκεκριμένου πεπτιδίου μετρήθηκε με τη μέθοδο που περιγράφεται παρακάτω. 1. Το πρώτο μέρος της μεθόδου αφορά τη διαδικασία της ανακαλλιέργειας των κυττάρων, που έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο 5. Συγκεκριμένα, ακολουθούνται τα βήματα της ανακαλλιέργειας και η διαφοροποίηση της διαδικασίας εμφανίζεται μετά τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. 2. Καθορίζουμε τις αραιώσεις του διαλύματος των κυττάρων, ώστε σε ένα μικροπλακίδιο που έχει 48 μικροκυψελίδες να προστεθούν 10,000 κύτταρα ανά μικροκυψελίδα σε τελικό όγκο 0,25 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 3. Μια ημέρα μετά την επίστρωση των κυττάρων στις μικροκυψελίδες, προστίθενται οι ουσίες στις επιθυμητές συγκεντρώσεις, στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. 4. Οι μικροκυψελίδες μεταφέρονται στον επωαστή, όπου επωάζονται για 48 h σε θερμοκρασία 37 0 C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% σε CO Μετά το πέρας 48 h πραγματοποιείται απομάκρυνση του υπερκείμενου με τη χρήση πιπέτας Pasteur υπό κενό σε όλες τις μικροκυψελίδες. 6. Σε κάθε μικροκυψελίδα προσθέτουμε με προσοχή 200 μl θρεπτικού μέσου, το οποίο απομακρύνουμε αμέσως με τη χρήση πιπέτας Pasteur υπό κενό. 61

70 Υλικά και Μέθοδοι 7. Στη συνέχεια, προσθέτουμε 100 μl διαλύματος τρυψίνης σε κάθε μικροκυψελίδα και το μικροπλακίδιο επωάζεται στους 37 0 C για 2 λεπτά ώστε να δράσει η τρυψίνη και να αποκολληθούν τα κύτταρα. 8. Κατόπιν, γίνεται παρατήρηση του μικροπλακιδίου στο μικροσκόπιο για να επιβεβαιωθεί η πλήρης αποκόλληση των κυττάρων. 9. Επαναιώρηση των κυττάρων με αναρροφήσεις με πιπέτα. 10. Αμέσως μετά την επαναιώρηση (για να μην προλάβουν να καθιζήσουν τα κύτταρα), λαμβάνονται με μια πιπέτα 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων και τοποθετούνται στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρομέτρου. 11. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων στο αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. 10. Πείραμα μελέτης του χημειοτακτισμού των κυττάρων HUVEC και ΜΟ59Κ (transwell) Υλικά και διαλύματα Θρεπτικά μέσα για μελέτες κυτταρικής μετανάστευσης HUVEC: Μ199 με 0.25% BSA. Μετά τη διάλυση του BSA στο θρεπτικό ακολουθεί διήθηση με βακτηριοστατικό φίλτρο. ΜΟ59Κ: DMEM HAM S F-12 Σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού Transfilter assay Μικροπλακίδια Transwell με διάμετρο πόρων μεμβράνης 8 μm (Costar, Avon, France). Διάλυμα κυανούν της τολουϊδίνης 0.33% κ.β. κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS 1x 62

71 Υλικά και Μέθοδοι Μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. NaH 2 PO 4.Η 2 Ο 0.1 Μ NaOH 0.1 Μ Απεσταγμένο νερό Διαδικασία Για τα πειράματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και κύτταρα γλοιοβλαστώματος ΜΟ59Κ, στα οποία είχε προηγηθεί επώαση με θρεπτικό μέσο Μ199 και DMEM HAM S F-12 αντίστοιχα, χωρίς ορό για 16 ώρες. 1. Σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιούνται μικροπλακίδια (Transwell Costar), τα οποία έχουν την ακόλουθη διαμόρφωση (Εικόνα Μ.2): Στην πάνω επιφάνεια του μικροπλακιδίου, πάνω από κάθε κυψελίδα στερεώνεται μια ένθεση, η οποία διαμερισματοποιεί το κελί σε δυο μέρη. Ο μερικός διαχωρισμός της εσωτερικής μικροκυψελίδας (ένθετη) από την εξωτερική επιτυγχάνεται με τη βοήθεια μιας πολυμερούς κινητής μεμβράνης ανθρακικών, που αποτελεί και τον πυθμένα της εσωτερικής κυψελίδας. Εικόνα Μ.2: Σχηματική παράσταση μικροκυψελίδας Transwell Costar, που χρησιμοποιείται για Βoyden chamber. 2. Σε κάθε εξωτερική μικροκυψελίδα (κάτω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 600μl θρεπτικό μέσο Μ199 με 0,25 % BSA ή DMEM HAM S F-12. Το κελί που χρησιμοποιείται ως μάρτυρας περιέχει μόνο το προαναφερόμενο θρεπτικό μέσο. Στις υπόλοιπες μικροκυψελίδες (στις οποίες επιθυμούμε να μελετήσουμε 63

72 Υλικά και Μέθοδοι τη χημειοτακτική δράση μιας ουσίας), στο κάτω μέρος της μεμβράνης τοποθετείται η ουσία σε καθορισμένες συγκεντρώσεις. 3. Ακολουθεί προσθήκη 100 μl θρεπτικού μέσου Μ199, που περιέχει 0,25 % BSA ή DMEM HAM S F-12 και 100,000 κύτταρα στο πάνω μέρος της μεμβράνης (εσωτερική μικροκυψελίδα). 4. Τα μικροπλακίδια τοποθετούνται στον επωαστή, όπου επωάζονται για 4 ώρες, στους 37 0 C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5 % σε CO Τα μικροπλακίδια εξέρχονται από τον επωαστή και ακολουθεί μονιμοποίηση των κυττάρων ως εξής: Σε γειτονικές εξωτερικές μικροκυψελίδες (στο ίδιο μικροπλακίδιο) που στερούνται εσωτερικής μικροκυψελίδας, προστίθεται μονιμοποιητικό Carson s. Οι εσωτερικές μικροκυψελίδες μεταφέρονται στις γειτονικές εξωτερικές, όπου εμβαπτίζονται στο μονιμοποιητικό διάλυμα για 20 min. 6. Απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο πάνω μέρος της μεμβράνης με ένα βαμβακοφόρο κολεό. Τα κύτταρα που μας ενδιαφέρουν θα έχουν διαπεράσει τη μεμβράνη και θα βρίσκονται στην κάτω επιφάνεια. Στη χρησιμοποίηση του βαμβακοφόρου κολεού απαιτείται μεγάλη προσοχή και δεν πρέπει να ασκηθεί πίεση για να μην παραμορφωθεί ή διαραγεί η μεμβράνη. 7. Με ανάλογη προσοχή κόβεται η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. 8. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα έτσι ώστε τα κύτταρα να βρίσκονται στην πάνω επιφάνεια. 9. Χρώση των κυττάρων με εναπόθεση 2 σταγόνων διαλύματος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη μεμβράνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με 3 4 διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό. 11. Τοποθέτησή της σε αντικειμενοφόρο πλάκα, με τα κύτταρα προς την κάτω επιφάνεια. 12. Εναπόθεση 2 σταγόνων νερού πάνω στη μεμβράνη και έγκλεισή της με καλυπτρίδα. 13. Μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, σε όλη την επιφάνεια της μεμβράνης, με τη βοήθεια βαθμονομημένου πλέγματος. 64

73 Υλικά και Μέθοδοι 11. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Η ανάλυση και μελέτη των πρωτεϊνών έγινε σε ολικά εκχυλίσματα από τις καλλιέργειες των κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Κατά τη διαδικασία αυτή, τα κύτταρα λύονται με διάλυμα το οποίο περιέχει απορρυπαντικό, προκειμένου να σπάσουν οι μεμβράνες των κυττάρων και αναστολείς πρωτεϊνασών για να προστατευθούν οι πρωτεΐνες από πρωτεολυτική διάσπαση. Κατόπιν, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο περιλαμβάνει το διαλυτό κλάσμα των ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε πάγο ή στους 4 0 C προκειμένου να ανασταλεί η δράση των πρωτεϊνασών και να παραταθεί η διατήρηση των πρωτεϊνών. Η μέθοδος αυτή της απομόνωσης των πρωτεϊνών εφαρμόζεται στις περιπτώσεις που θα ακολουθήσει ανοσοκατακρήμνιση. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Διάλυμα RIPA (RIPA buffer) (ph 7.4) PBS 1x SDS 0.1% Triton X-100 1% PMSF 1 mm EDTA 5 mm Απροτινίνη 1μg/ml Na 3 VO 4 20 nm Διαδικασία 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας. 2. Έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1x στους 4 ο C. 65

74 Υλικά και Μέθοδοι 3. Προσθήκη 600 μl παγωμένου διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 100 mm στους 4 ο C. 4. Παραμονή των τρυβλίων στους 4 ο C σε οριζόντια θέση για χρόνο 10 λεπτά, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. Το διάλυμα RIPA πρέπει να καλύπτει ιδανικά το τρυβλίο. Εάν όχι, πρέπει να πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των τρυβλίων. 5. Λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 6. Μεταφορά του ομογενοποιήματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. 7. Φυγοκέντρηση σε g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 8. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Ακολουθεί προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείμενο με τη μέθοδο Bradford (ακολουθεί). 12. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) (Bradford, 1976) Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα προσδιορίζεται εύκολα με χρωματομετρικές μεθόδους ή με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων σε μήκος κύματος Α=280 nm. Από τις πιο σύντομες και αξιόπιστες μεθόδους για προσδιορισμό μικροποσοτήτων πρωτεϊνών είναι η μέθοδος Bradford. Βασίζεται στην ικανότητα δέσμευσης της χρωστικής Coomasie G-250 σε βασικά αμινοξέα των πρωτεϊνών, αλλάζοντας ταυτόχρονα το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησής τους. Η δέσμευση, επομένως και η αλλαγή αυτή, είναι ανάλογη της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο διάλυμα. Για τον ακριβή υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με βάση την οπτική απορρόφηση κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (BSA). Η αλβουμίνη πρέπει να είναι διαλυμένη στο ίδιο διάλυμα που είναι και οι πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση υπολογίζεται. 66

75 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Διάλυμα Bradford (1x) Coomasie G mm 95% αιθανόλη 5% κ.ό. 85% H 3 PO 4 10% κ.ό. Διήθηση του διαλύματος 3 φορές με χρήση διηθητικού χαρτιού. Διαδικασία 1. Προσθήκη 5 ή 2 μl διαλύματος (σε περίπτωση εκχυλίσματος κυτταροκαλλιέργειας κυττάρων HUVEC ή κυττάρων ΜΟ59Κ αντίστοιχα) σε 995 ή 998 μl διαλύματος Bradford αντίστοιχα. 2. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 3. Επώαση των δειγμάτων για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 595 nm (σε φασματοφωτόμετρο Hitachi U-1100). 5. Υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο δείγμα, μέσω της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης (BSA). 6. Μεταφορά ποσότητας πρωτεΐνης 2-3 mg σε σωληνάρια φυγοκέντρου για πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 13. Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών Η ανοσοκατακρήμνιση αποτελεί μία μορφή χρωματογραφίας συγγένειας. Σε αυτήν, ως στερεή φάση χρησιμοποιούνται σφαιρίδια από αγαρόζη ή κάποιο ανάλογο υλικό. Πάνω στα σφαιρίδια βρίσκεται ομοιοπολικά δεσμευμένη πρωτεΐνη Α και πρωτεΐνη G, πρωτεΐνες βακτηριακής προέλευσης που δεσμεύουν με μεγάλη συγγένεια την Fc περιοχή ορισμένων τύπων IgG ανοσοσφαιρινών. Με τη χρήση της δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίων-πρωτεϊνών Α και G-αντισωμάτων στο 67

76 Υλικά και Μέθοδοι οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό είναι δυνατό να συλλεχθεί μετά από φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό να αποδεσμευτούν με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. Το ενδιαφέρον της μεθόδου είναι ότι και πρωτεΐνες που φυσιολογικά αλληλεπιδρούν με την αρχική επίσης δεσμεύονται στο ίδιο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μέθοδο χρήσιμη για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. Αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: 68

77 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 1: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση στην παρούσα εργασία. Στις στήλες αναγράφεται η πρωτεΐνη έναντι της οποίας πραγματοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση, η εταιρία παραγωγής, ο κωδικός του προϊόντος και η ποσότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης. Πρωτεΐνη Εταιρεία Κωδικός Ποσότητα α ν β 3 Chemicon MAB1976Z 5 μg/3 mg πρωτεΐνης PTN Santa Cruz H-75 3 μg/3 mg πρωτεΐνης MK PeproTech 500-P171 5 μg/3 mg πρωτεΐνης RPTPβ/ζ Santa Cruz C-19 3 μg/3 mg πρωτεΐνης MMP-2 Abcam Ab μg/3 mg πρωτεΐνης MMP-9 Chemicon MAB μg/3 mg πρωτεΐνης IgG Sigma I μg/3 mg πρωτεΐνης Διαδικασία Έχει προηγηθεί ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford (περιγράφηκε στην παράγραφο 12) και η μεταφορά της ποσότητας πρωτεΐνης που θα ανοσοκατακρημνισθεί σε νέα σωληνάρια φυγοκέντρου τύπου Eppendorf. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: 1. Προσθήκη σε κάθε σωληνάριο ψυχρού διαλύματος PBS μέχρι τελικού όγκου 1 ml σε όλα τα δείγματα. Αυτό πραγματοποιείται προκειμένου να επιτευχθεί η ίδια κινητική των πρωτεϊνών σε όλα τα σωληνάρια. 2. Προσθήκη του κατάλληλου αντισώματος (Πίνακας 1) σε ποσότητα ανάλογη με τη ποσότητα της πρωτεΐνης. 3. Ανάδευση για 16 ώρες στους 4 ο C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του αντισώματος με την αντίστοιχη πρωτεΐνη και τις πρωτεΐνες που αυτή δεσμεύει. 4. Προσθήκη στα σωληνάρια 15 μl (για 3 mg ολικής πρωτεΐνης) εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και πρωτεΐνης G. 5. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 o C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισώματος με τα σφαιρίδια. 69

78 Υλικά και Μέθοδοι 6. Φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά στους 4 ο C. 7. Απόρριψη του υπερκειμένου. 8. Προσθήκη 1 ml ψυχρού PBS ανά σωληνάριο (επαναιώρηση των σφαιριδίων). 9. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκειμένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές. 10. Στο ίζημα των σφαιριδίων που έχει απομείνει προστίθενται 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων (2x). 11. Τα σωληνάρια θερμαίνονται στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. Στα στάδια λαμβάνει χώρα η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για χρόνο 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέα σωληνάρια φυγοκέντρου. Απόρριψη των σφαιριδίων. 14. Αποθήκευση των σωληναρίων στους -20 ο C μέχρι την ανάλυσή τους με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. 70

79 Υλικά και Μέθοδοι 14. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970; Neville, 1971) Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. Ακρυλαμίδιο 30 g Μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 1 g Απεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 100 ml Tris-HCl 1.5M, ph 8.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. SDS 10 g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 90 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 ο C, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.9 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη (TEMED) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. 71

80 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) Γλυκίνη 2Μ Tris-base 0.25M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 0.02M Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του. Διαδικασία Στην παρούσα εργασία η ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιήθηκε παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS). Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Συναρμολόγηση της συσκευής του πηκτώματος. 2. Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον Πίνακα Την παρασκευή του πηκτώματος και την προσθήκη του στη συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. Απομακρύνεται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος και πριν την παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. 4. Προσθήκη εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα συμπύκνωσης. 72

81 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2: Σύσταση των πηκτωμάτων διαχωρισμού. Πυκνότητα πηκτώματος 17.5% 10% Απεσταγμένο H 2 O ml 3.41 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 3.34 ml Tris-HCl 1.5M ph ml 2.5 ml 10% SDS 100 μl 100 μl 20% AMPS 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl 5. Παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται στον Πίνακα Προσθήκη του πηκτώματος συμπύκνωσης στη συσκευή και αναμονή για τον πολυμερισμό του (20-30 λεπτά). 7. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων. Τα δείγματα συνήθως φυλάσσονται στους -20 o C. 8. Θέρμανση των δειγμάτων στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. 9. Φυγοκέντρηση στα 12000g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πίνακας 3: Σύσταση πηκτωμάτων συμπύκνωσης. Πυκνότητα πηκτώματος 3.5% 5% Απεσταγμένο H 2 O 2.45 ml 2.25 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 0.67 ml Tris-HCl 0.5M ph ml 1.0 ml 10% SDS 40 μl 40 μl 20% AMPS 40 μl 40 μl TEMED 4 μl 4 μl 73

82 Υλικά και Μέθοδοι 10. Με την ολοκλήρωση του χρόνου πολυμερισμού του πηκτώματος συμπύκνωσης, απομακρύνεται το εξάρτημα (χτενάκι) και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 11. Μεταφορά καθορισμένης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσεις-υποδοχές που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 12. Εφαρμογή σταθερής τάσης 100 Volt (120 Volt για δυο πηκτώματα), με αποτέλεσμα τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 13. Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, υπάρχει η δυνατότητα μεταφοράς των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF (ανάλυση κατά Western.) 15. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών Γλυκίνη 0.04 Μ Tris-base 0.05 M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 1 mm Μεθανόλη (απόλυτη) 20% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 (10x) Tris-base 0.2 M NaCl 1.36 M Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane 74

83 Υλικά και Μέθοδοι Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα 4, ενώ στον Πίνακα 5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα. Πίνακας 4: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι εταιρείες παραγωγής και οι κωδικοί των αντισωμάτων. Πρωτεΐνη Εταιρεία Κωδικός PTN Lab. CRRET, France _ PTN Abnova H M01 MK PeproTech 500-P171 RPTPβ/ζ BD R / ΜΜP-2 Abcam Ab3158 MMP-9 Chemicon MAB13415 Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα, των οποίων οι συνθήκες αναφέρονται στον Πίνακα 5, είναι τα ακόλουθα: Anti-mouse IgG (A3682, goat, Fab-specific) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Anti-rabbit IgG (A0545, goat, whole molecule) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Anti-goat IgG (B3148, mouse, clone GT-34) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) 75

84 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 5: Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη PTN (Lab Ab) PTN (Abnova Ab) MK RPTPβ/ζ MMP-2 MMP-9 Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 3% BSA σε TBS-T 0,05% 1:5000 σε TBS-T 0,05% 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,05% 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,05% 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,05% 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,05% 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,05% 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα 1:1000 σε TBS-T 0,05% 1:1000 σε TBS-T 0,05% 1:500 σε TBS-T 0,05% 1:500 σε TBS-T 0,05% 1:500 σε TBS-T 0,05% a-goat 1:7500 σε TBS-T 0,05% a-mouse 1:5000 σε TBS-T 0,05% a-rabbit 1:12500 σε TBS-T 0,05% a-mouse 1:5000 σε TBS-T 0,05% a-mouse 1:5000 σε TBS-T 0,05% a-mouse 1:5000 σε TBS-T 0,05% Διαδικασία 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης ακολουθεί τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτρομεταφορά). Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, με τέτοιο τρόπο, ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που πρόκειται να μεταφερθούν. Η συσκευή καθώς και ο τρόπος τοποθέτησης του πηκτώματος φαίνονται στην εικόνα Μ Μετά το τέλος της μεταφοράς ακολουθεί εμβάπτιση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. Πραγματοποιούνται δυο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 76

85 Υλικά και Μέθοδοι 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα (Πίνακας 5). Η μεμβράνη και στις δυο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για δυο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Εικόνα Μ.3: Σχηματική αναπαράσταση της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών. Αριστερά, σε μεγέθυνση απεικονίζεται η διάταξη που απαιτείται για τη σωστή ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών. Αυτή περιλαμβάνει σπόγγους, χαρτιά Whatman, την PVDF μεμβράνη, το πήκτωμα και την πλαστική κασετίνα ή οποία τα συμπιέζει. Η φορά της κίνησης των πρωτεϊνών είναι από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. 5. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 2 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας 5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 ο C για 16 ώρες (overnight επώαση). 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους -20 ο C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί συνήθως μέχρι 3 επαναλήψεις). Η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 2 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 77

86 Υλικά και Μέθοδοι 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (πίνακας 5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται στο φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL). 16. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Η διαδικασία της ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών με επώαση με διαφορετικά αντισώματα. Με τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) πραγματοποιείται αποκόλληση από τη μεμβράνη των συμπλόκων πρώτου και δεύτερου αντισώματος, ενώ παραμένουν προσκολλημένες στη μεμβράνη οι ισχυρά δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) σε αυτήν πρωτεΐνες από την ηλεκτρομεταφορά. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη Tris-HCl 62.5 mm, ph 6,8 Δωδεκακυλοθειικό νάτριο (SDS) 2% κ.β. β-μερκαπτοαιθανόλη 100 mm Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. 78

87 Υλικά και Μέθοδοι Διαδικασία 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 2. Επώαση της μεμβράνης στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C υπό ανακίνηση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Πραγματοποιείται επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. 17. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. 79

88 Υλικά και Μέθοδοι 80

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

90 Αποτελέσματα Α. Μελέτη της επίδρασης συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές της ΡΤΝ στον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος Τα γλοιώματα είναι υψηλής κακοήθειας όγκοι και παρουσιάζουν μεγάλη δυσκολία στη θεραπευτική τους προσέγγιση. Χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, αναστολή της απόπτωσης, υψηλή μεταναστευτική και αγγειογενετική ικανότητα, γεγονός που τα καθιστά πολύ επιθετικά και ανθεκτικά στη θεραπεία (Maher et al., 2001). Ένας σημαντικός αυξητικός παράγοντας που εκφράζεται στο γλοιοβλάστωμα είναι η ΡΤΝ (Mikelis et al., 2007), αν και τα μέχρι σήμερα αντιφατικά αποτελέσματα (Grzelinski et al., 2005; Grzelinski et al., 2006; Parthymou et al., 2007; Mikelis et al., 2009) περιορίζουν την εξακρίβωση του ρόλου της στα γλοιώματα. Είναι γνωστό ότι η ΡΤΝ εμπλέκεται στην αγγειογένεση και ότι διαφορετικές περιοχές της πρωτεΐνης ασκούν διαφορετικές δράσεις, τόσο στην αγγειογένεση (Polykratis et al., 2004), όσο και στην καρκινική ανάπτυξη (Bernard-Pierrot et al., 2001; Zhang et al., 2006). Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ΡΤΝ, προκειμένου μέσω της προσέγγισης αυτής να διερευνήσουμε την πιθανότητα διαλεύκανσης μηχανισμών που εμπλέκονται στις δράσεις της ΡΤΝ στο γλοιοβλάστωμα. Α.1. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1-5 της ΡΤΝ (ΡΤΝ 1-5 ) στoν πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος M059K, U87MG και C6 Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα μέτρησης του αριθμού των κυττάρων με τη μέθοδο του ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι, στην παράγραφο 8. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων συνοψίζονται στην εικόνα Α.1, όπου και παρατηρούμε ότι το πεπτίδιο PTN 1-5 προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων MO59K και C6, ενώ δεν είχε καμία δράση στα κύτταρα U87MG. 81

91 Αποτελέσματα Α Β Αριθμός κυττάρων * 1 10 PΤΝ 1-5 (ng/ml) *** 100 Αριθμός κυττάρων *** *** 1 10 PΤΝ 1-5 (ng/ml) *** 100 Γ Αριθμός κυττάρων PΤΝ 1-5 (ng/ml) 100 Εικόνα Α.1. Επίδραση του πεπτιδίου PΤΝ 1-5 στον αριθμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ (Α), C6 (B) και U87MG (Γ). Διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου προστέθηκαν στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και μετά από 48 ώρες προσδιορίστηκε ο αριθμός τους με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Τα σημεία * και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05 και 0,001 αντίστοιχα. Α.2. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στoν πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος M059K, U87MG και C6 Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.2, το πεπτίδιο PTN δεν επηρέασε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό τον αριθμό των κυττάρων σε καμία από τις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (MO59K, U87MG και C6). 82

92 Αποτελέσματα Α Β Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) 100 Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) 100 Γ Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) 100 Εικόνα Α.2. Επίδραση του πεπτιδίου PΤΝ στον αριθμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ (Α), C6 (B) και U87MG (Γ). Διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου προστέθηκαν στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και μετά από 48 ώρες προσδιορίστηκε ο αριθμός τους με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Α.3. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στoν πολλαπλασιασμό των κυττάρων M059K, U87MG και C6 Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.3, το πεπτίδιο PTN προκάλεσε μια πολύ μικρή μείωση του αριθμού όλων των τύπων κυττάρων, που ήταν στατιστικά 83

93 Αποτελέσματα σημαντική στα κύτταρα U87MG μόνο στη μεγαλύτερη συγκέντρωση και στα κύτταρα C6 σε όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Α Β Αριθμός κυττάρων Αριθμός κυττάρων *** *** *** ΡΤΝ (ng/ml) PTN (ng/ml) 100 Γ * Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) Εικόνα Α.3. Επίδραση του πεπτιδίου PΤΝ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ (Α), C6 (B) και U87MG (Γ). Διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου προστέθηκαν στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και μετά από 48 ώρες προσδιορίστηκε ο αριθμός τους με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Τα σημεία * και *** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05 και 0,001 αντίστοιχα. 84

94 Αποτελέσματα Α.4. Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της ΡΤΝ (ΡΤΝ ) στoν πολλαπλασιασμό των κυττάρων M059K, U87MG και C6 Το πεπτίδιο ΡΤΝ είχε δοκιμαστεί σε προηγούμενες εργασίες της ερευνητικής μας ομάδας ως προς τη δράση του στον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων, στα οποία δεν είχε καμία δράση (Mikelis et al., αδημοσίευτα αποτελέσματα). Στην παρούσα εργασία δοκιμάσαμε τη δράση του στον αριθμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων συνοψίζονται στην εικόνα Α.4, όπου φαίνεται ότι το πεπτίδιο PTN δεν είχε καμία επίδραση στον αριθμό των κυττάρων U87MG και C6, με μια μικρή τάση επαγωγής στα τελευταία, που όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Αντίθετα, προκάλεσε στατιστικά σημαντική, δοσο-εξαρτώμενη μείωση του αριθμού των κυττάρων MO59Κ. Επίσης, στην εικόνα Α.5 βλέπουμε και κάποιες μορφολογικές μεταβολές που προκάλεσε το πεπτίδιο PTN στα κύτταρα Μ059Κ (Α και Β) και C6 (Γ και Δ). Δεν είναι γνωστό που οφείλονται οι αλλαγές αυτές στο σχήμα των κυττάρων ή ποια είναι η φυσιολογική τους σημασία. 85

95 Αποτελέσματα Α Β Αριθμός κυττάρων * 10 ** 100 Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) ΡΤΝ (ng/ml) Γ Αριθμός κυττάρων ΡΤΝ (ng/ml) Εικόνα Α.4. Επίδραση του πεπτιδίου PΤΝ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ (Α), C6 (B) και U87MG (Γ). Διαφορετικές συγκεντρώσεις του πεπτιδίου προστέθηκαν στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και μετά από 48 ώρες προσδιορίστηκε ο αριθμός τους με τη μέθοδο του ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Τα σημεία * και ** υποδηλώνουν επίπεδο σημαντικότητας P<0,05 και 0,01 αντίστοιχα. 86

96 Αποτελέσματα Α Β Γ Δ Εικόνα Α.5. Aντιπροσωπευτικές φωτογραφίες κυττάρων Μ059Κ (Α και Β) και C6 (Γ και Δ), ύστερα από επίδραση του πεπτιδίου ΡΤΝ σε συγκέντρωση 100 ng/ml (B και Δ). Β. Μελέτη της επίδρασης της ΡΤΝ και του πεπτιδίου ΡΤΝ στη μετανάστευση κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ Από προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας γνωρίζουμε ότι η ΡΤΝ επάγει τη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων (Polykratis et al., 2005), ενώ το πεπτίδιο ΡΤΝ αναστέλλει τη δράση της (Mikelis et al., αδημοσίευτα αποτελέσματα). Επίσης, γνωρίζουμε ότι τα ενθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη, ενώ τα κύτταρα M059K όχι (Mikelis et al., 2009). Έτσι, στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε αρχικά η επίδραση εξωγενώς χορηγούμενης ΡΤΝ (100 ng/ml) στη μετανάστευση των κυττάρων M059K. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα μελέτης 87

97 Αποτελέσματα χημειοτακτισμού transwell, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι, στην παράγραφο 10. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.6, η ΡΤΝ αναστέλλει στατιστικά σημαντικά σε ποσοστό περίπου 30% το χημειοτακτισμό των κυττάρων, σε αντίθεση με τη δράση της στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το πεπτίδιο PTN , σε συγκέντρωση 100 ng/ml, προκαλεί επαγωγή της μετανάστευσης που, όμως, δεν είναι στατιστικά σημαντική, ενώ ο συνδυασμός των δυο μορίων, δεν επηρεάζει την ανασταλτική δράση της ΡΤΝ στη μετανάστευση των κυττάρων ΜΟ59Κ % Μετανάστευση Μάρτυρας ΡΤΝ *** ΡΤΝ *** ΡΤΝ & ΡΤΝ Εικόνα Α.6. Eπίδραση της ΡΤΝ, του πεπτιδίου PTN , και του συνδυασμού τους (όλα σε συγκέντρωση 100 ng/ml) στο χημειοτακτισμό των κυττάρων MO59K σε σύστημα transwell. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (μη διεγερμένα κύτταρα) που θεωρείται 100%. Τα σημεία *** αντιστοιχούν σε επίπεδο σημαντικότητας P < 0,

98 Αποτελέσματα Γ. Μελέτη της επίδρασης των πεπτιδίων ΡΤΝ 1-5, ΡΤΝ και ΡΤΝ στη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μετά από τη μελέτη της επίδρασης των πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ΡΤΝ στον πολλαπλασιασμό διαφορετικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος, συνεχίστηκε η μελέτη της επίδρασης των ίδιων πεπτιδίων στη μετανάστευση των κυττάρων της σειράς ΜΟ59Κ ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος. Η επιλογή της περαιτέρω μελέτης σε αυτόν τον τύπο έναντι των υπολοίπων κυττάρων γλοιοβλαστώματος έγινε με βάση τα εξής: α) Τα κύτταρα Μ059Κ είναι ανθρώπινα, β) δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 ως υποδοχέα της ΡΤΝ (Mikelis et al., 2009), γ) στα κύτταρα αυτά η ΡΤΝ μειώνει την κυτταρική μετανάστευση, όπως είδαμε στην προηγούμενη παράγραφο και δ) ήταν πιο ευαίσθητα στη δράση των πεπτιδίων ΡΤΝ 1-5 και ΡΤΝ Έτσι λοιπόν, διερευνήθηκε η επίδραση των πεπτιδίων PTN 1-5, PTN και PTN σε συγκέντρωση 100 ng/ml στο χημειοτακτισμό των κυττάρων ΜΟ59Κ. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού transwell, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι, στην παράγραφο 10. Παράλληλα έγινε έλεγχος της επίδρασης των ίδιων πεπτιδίων και σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Όπως φαίνεται, στην εικόνα Α.7, τα πεπτίδια PTN και PTN ΡΤΝ προκαλούν στατιστικά σημαντική επαγωγή του χημειοτακτισμού των κυττάρων Μ059Κ, ενώ το πεπτίδιο PTN 1-5 δεν έχει καμία δράση. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, το πεπτίδιο PTN 1-5 δεν έχει δράση, ενώ το πεπτίδιο PTN αναστέλλει στατιστικά σημαντικά τη μετανάστευση τους. Τέλος, το πεπτίδιο PTN 16-24, προκαλεί επαγωγή της μετανάστευσης, που όμως δεν είναι στατιστικά σημαντική. 89

99 Αποτελέσματα Α Β % Μετανάστευση 250 * Μάρτυρας ΡΤΝ 1-5 * ΡΤΝ ΡΤΝ % Μετανάστευση Μάρτυρας ΡΤΝ 1-5 ΡΤΝ ** ΡΤΝ Εικόνα Α.7. Eπίδραση των πεπτιδίων PTN 1-5, PTN και PTN (100 ng/ml) στο χημειοτακτισμό των κυττάρων M059K (Α) και HUVEC (Β) σε σύστημα transwell. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (μη διεγερμένα κύτταρα) που θεωρείται 100%. Τα σημεία * και ** αντιστοιχούν σε επίπεδο σημαντικότητας P < 0,05 και 0,01 αντίστοιχα. Δ. Η επίδραση του πεπτιδίου PTN στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ιντεγκρίνη α ν β 3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι η καρβοξυτελική περιοχή της ΡΤΝ είναι υπεύθυνη για τη μιτογόνο δράση του μορίου στα ενδοθηλιακά κύτταρα και ότι η περιοχή αυτή διαμεσολαβεί τις κυριότερες δράσεις της ΡΤΝ στην αγγειογένεση (Papadimitriou et al., 2000; Papadimitriou et al., 2001; Bernard- Pierrot et al., 2001; Zhang et al., 1999). Επιπλέον, πρόσφατα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αποτελεί ένα λειτουργικό υποδοχέα για την ΡΤΝ και είναι απαραίτητη για την επαγόμενη από την ΡΤΝ μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω σχηματισμού συμπλόκου της με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ (Mikelis et al., 2009). Ξέρουμε επίσης ότι το πεπτίδιο PTN αναστέλλει τη δέσμευση της ΡΤΝ στην ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al., αδημοσίευτα αποτελέσματα). Με δεδομένο ότι, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, και το πεπτίδιο ΡΤΝ αναστέλλει τη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων, παρόμοια με το πεπτίδιο ΡΤΝ , διερευνήθηκε ο ρόλος του πεπτιδίου PTN 71-90

100 Αποτελέσματα 77, που αντιστοιχεί σε περιοχή της ΡΤΝ με θεωρούμενη ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου I (Kilpelainen et al., 2000), στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Για το σκοπό αυτό, ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία του πεπτιδίου και μετά τη λύση τους ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ανάλυση κατά Western έναντι της ΡΤΝ. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.8, το πεπτίδιο PTN δεν επηρέασε καθόλου την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Εικόνα Α.8. Μελέτη του ρόλου του πεπτιδίου PTN στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία του πεπτιδίου. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΡΤΝ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 91

101 Αποτελέσματα Ε. Η επίδραση των πεπτιδίων PTN και PTN στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και σε κύτταρα γλοιώματος ΜΟ59Κ Ένας καλά χαρακτηρισμένος υποδοχέας της ΡΤΝ είναι ο υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ). Η ΡΤΝ δεσμεύεται στον υποδοχέα RPTPβ/ζ με υψηλή συγγένεια, ενεργοποιώντας ποικίλα σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με κυτταρική μετανάστευση (Maeda et al., 1996; Maeda and Noda, 1998). Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας ξέρουμε ότι ο RPTPβ/ζ είναι απαραίτητος για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση (Polykratis et al., 2005). Ξέρουμε επίσης ότι ο RPTPβ/ζ εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC (Polykratis et al., 2005) και στα γλοιωματικά κύτταρα ΜΟ59Κ (Mikelis et al., 2009). Επομένως, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των πεπτιδίων PTN και PTN στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ και στα δυο είδη κυττάρων. Για το λόγο αυτό ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και κύτταρα γλοιοβλαστώματος ΜΟ59Κ καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία των πεπτιδίων και μετά τη λύση τους ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση έναντι του RPTPβ/ζ και ανάλυση κατά Western έναντι της ΡΤΝ. Όπως φαίνεται στην Εικόνα A.9., στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, περίσσεια του πεπτιδίου PTN δεν επηρέασε τη δέσμευση της ΡΤΝ στον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Μείωση παρατηρήθηκε μόνο στην αλληλεπίδραση του RPTPβ/ζ με μία ζώνη που αναγνωρίζεται πάντα από όλα τα αντισώματα έναντι της ΡΤΝ που έχουμε χρησιμοποιήσει, σε μοριακό βάρος περίπου στα 70 kda, που ίσως αντιστοιχεί σε κάποιο τετραμερές της ΡΤΝ. Στα κύτταρα ΜΟ59Κ, περίσσεια του πεπτιδίου PTN ανέστειλε τη δέσμευση της ΡΤΝ στον RPRPβ/ζ. Το πεπτίδιο PTN δεν επηρέασε σημαντικά την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον RPTPβ/ζ σε κανέναν από τους δύο τύπους κυττάρων (Εικόνα Α.9). 92

102 Αποτελέσματα Α Β Εικόνα Α.9. Μελέτη του ρόλου των πεπτιδίων PTN και PTN στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Κύτταρα HUVEC (Α) και ΜΟ59Κ (Β) καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία των δυο πεπτιδίων. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης έναντι του υποδοχέα RPTPβ/ζ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΡΤΝ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. ΣΤ. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-2 και ΜΜP-9 αλληλεπιδρούν άμεσα με την ΡΤΝ σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος ΜΟ59Κ Από βιβλιογραφικά δεδομένα είναι γνωστό ότι η MMP-2 αποικοδομεί την ΡΤΝ σε δυο σημεία, ανάμεσα στις δυο περιοχές με ομολογία στη θρομβοσπονδίνη τύπου Ι και στο πλούσιο σε λυσίνες καρβοξυτελικό της άκρο (Dean et al., 2007). Συνεπώς, σε μια προσπάθεια να διερευνηθεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου η ΡΤΝ μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων γλοιώματος ΜΟ59Κ, καθώς και άλλων τύπων κυττάρων που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 (Mikelis et al., 2009), μελετήθηκε στην παρούσα εργασία η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις ζελατινάσες. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα των κυττάρων ΜΟ59Κ με αντισώματα έναντι των MMP-2 και MMP-9 και ανάλυση 93

103 Αποτελέσματα κατά Western για την ΡΤΝ. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.10, η ΡΤΝ αλληλεπιδρά άμεσα και με τις δυο μεταλλοπρωτεϊνάσες. Η αλληλεπίδραση με την MMP-2 φαίνεται να γίνεται σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με την MMP-9, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει και η παρατήρηση ότι η ΜΜΡ-2 φαίνεται να αλληλεπιδρά με μία λίγο μικρότερου ΜΒ μορφή της ΡΤΝ. Εικόνα Α.10. Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ΡΤΝ και τις MMP-2 και MMP-9 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων Μ059Κ. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΡΤΝ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Για επιβεβαίωση του προηγούμενου αποτελέσματος πραγματοποιήθηκε και η αντίστροφη διαδικασία, δηλαδή πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ίδιων κυττάρων ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα έναντι της ΡΤΝ και στη συνέχεια έγινε ανάλυση κατά Western για τις δύο μεταλλοπρωτεϊνάσες. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.11, επιβεβαιώθηκε η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις MMP-2 και MMP-9. 94

104 Αποτελέσματα Εικόνα Α.11. Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ΡΤΝ και τις MMP-2 και MMP-9 σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων Μ059Κ. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για την ΡΤΝ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι των MMP-2 και MMP-9, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Ζ. Οι ζελατινάσες MMP-2 και ΜΜP-9 αλληλεπιδρούν άμεσα με την ΡΤΝ αλλά όχι με τη midkine σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις ζελατινάσες MMP-2 και MMP- 9 και σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν η αλληλεπίδραση είναι ειδική για τα κύτταρα Μ059Κ ή είναι γενικότερου ενδιαφέροντος. Όπως διαπιστώνεται και από τις εικόνες Α.12 και Α.13, επιβεβαιώθηκε στα κύτταρα HUVEC η άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ ΡΤΝ και MMP-2 και MMP-9 και μάλιστα με το ίδιο πρότυπο. Επιπλέον, διερευνήθηκε εάν με τις ζελατινάσες αλληλεπιδρά και η midkine, το άλλο μέλος της ίδιας με την ΡΤΝ οικογένειας αυξητικών παραγόντων. Βρέθηκε ότι η midkine δεν αλληλεπιδρά με τις MMP-2 και MMP-9 (Εικόνες Α.12 και Α.13), συνεπώς η αλληλεπίδραση αυτή είναι ειδική για την ΡΤΝ. 95

105 Αποτελέσματα Εικόνα Α.12. Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ΡΤΝ ή τη midkine (MK) και τις MMP- 2 και MMP-9 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για τις ΜΜPs 2 και 9 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΡΤΝ ή της midkine, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η midkine αναμένεται σε μοριακή μάζα 11 kda. Εικόνα Α.13. Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ΡΤΝ και τη midkine (ΜΚ) με τις MMP-2 και MMP-9 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για την ΡΤΝ ή τη midkine και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της MMP-2 και της MMP-9, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η αλληλεπίδραση με την ΜΜΡ-9 δεν είναι εμφανής, γεγονός που πιθανά οφείλεται στη μειωμένου βαθμού αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ΜΜΡ-9 σε σχέση με την ΜΜΡ-2, όπως φαίνεται και στις Εικόνες Α.10 και Α

106 Αποτελέσματα Η. Επίδραση των πεπτιδίων ΡΤΝ 16-24, ΡΤΝ και ΡΤΝ στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις MMP-2 & MMP-9 Διερευνήθηκε κατά πόσον τα πεπτίδια που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ΡΤΝ επηρεάζουν την αλληλεπίδρασή της με τις ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Για το σκοπό αυτό, κύτταρα ΜΟ59Κ καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία των πεπτιδίων και μετά τη λύση τους ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και ανάλυση κατά Western έναντι της ΡΤΝ. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.14, μόνο το πεπτίδιο ΡΤΝ προκαλεί μείωση της αλληλεπίδρασης της ΡΤΝ με την ΜΜΡ-2, ενώ αυξάνει την αλληλεπίδρασή της με την ΜΜΡ-9. Την ίδια δράση έχει το πεπτίδιο ΡΤΝ όταν συγχορηγείται με το πεπτίδιο ΡΤΝ Εικόνα Α.14. Μελέτη του ρόλου των πεπτιδίων PTN , PTN και ΡΤΝ στην αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τις ΜΜΡ-2 (αριστερά) και ΜΜΡ-9 (δεξιά). Κύτταρα ΜΟ59Κ καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία των πεπτιδίων. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης έναντι των δυο ΜΜΡs και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΡΤΝ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 97

107 Αποτελέσματα Θ. Η ΜΜΡ-2 δεν αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Γνωρίζοντας πλέον την αλληλεπίδραση μεταξύ της ΡΤΝ και των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, διερευνήθηκε εάν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ της ΜΜΡ-2 και του υποδοχέα της ΡΤΝ RPTPβ/ζ. Πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων με αντισώματα για την ΡΤΝ και τον RPTPβ/ζ και ανάλυση κατά Western για την ΜΜΡ-2 (Εικόνα Α.15). Επιπλέον, έγινε και η αντίστροφη διαδικασία, δηλαδή ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα για τη μεταλλοπρωτεϊνάση και ανάλυση κατά Western για τον RPTPβ/ζ (Εικόνα Α.16). Και από τις δυο εικόνες προκύπτει ότι δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ του υποδοχέα RPTPβ/ζ και της ΜΜΡ-2. Εικόνα Α.15. Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον υποδοχέα RPTPβ/ζ και την ΜΜΡ-2 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για την ΡΤΝ και τον RPTPβ/ζ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της MΜΡ2, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 98

108 Αποτελέσματα Εικόνα Α.16. Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον υποδοχέα RPTPβ/ζ και την ΜΜΡ-2 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης για την ΜΜΡ-2 και ανάλυση κατά Western στα ανοσοϊζήματα έναντι του RPTPβ/ζ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Ι. Διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της μεταλλοπρωτεϊνάσης ΜΜΡ-2 και της ιντεγκρίνης α ν β 3 Όπως προαναφέρθηκε, ένας πρόσφατα χαρακτηρισμένος υποδοχέας της ΡΤΝ είναι και η ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al., 2009). Στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε εάν η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά άμεσα με την ΜΜΡ-2. Σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και της ΡΤΝ και ανάλυση κατά Western έναντι της ΜΜΡ-2, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Βρέθηκε ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεν αλληλεπιδρά άμεσα με την ΜΜΡ-2 (Εικόνα Α.17). 99

109 Αποτελέσματα Εικόνα Α.17. Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην ιντεγκρίνη α ν β 3 και την ΜΜΡ-2 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση 3 mg ολικής πρωτεΐνης έναντι της ιντεγκρίνης και της ΡΤΝ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της ΜΜΡ-2, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 100