Λαμπρινή Καλαμπόκη Α.Μ. 302

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ COUP-TF ΣΤΟ ΕΜΒΡΥΟ ΤΟΥ ΑΧΙΝΟΥ Λαμπρινή Καλαμπόκη Α.Μ. 302 Πάτρα 2006

2 Στους Ευαγγελή, Γιώργο, Κατερίνα και Ευθυμία

3 Η ερευνητική αυτή δουλειά πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Βιολογίας, στον Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης στο εργαστήριο του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνου Φλυτζάνη στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών με κατεύθυνση: Βιολογική Τεχνολογία. Για την πραγματοποίησή της συνεργάστηκα με ορισμένα άτομα χωρίς τη βοήθεια και την υποστήριξη των οποίων η ολοκλήρωση της έρευνας αυτής δεν θα ήταν επιτυχής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη γιατί υπήρξε ένας υπέροχος δάσκαλος. Στα τρία αυτά χρόνια της συνεργασίας μας γνώρισα έναν άνθρωπο οξυδερκή, με αγάπη και ενδιαφέρον για τους συνεργάτες του. Η αφοσίωση και η αγάπη του για την έρευνα μεταδιδόταν σε όλους τους φοιτητές του. Πέρα από τη Μοριακή Βιολογία με δίδαξε πως να αντιμετωπίζω κριτικά κάθε πρόβλημα που ανέκυπτε. Με έμαθε να αντιμετωπίζω την έρευνα ως μία ζωντανή διαδικασία και τα προβλήματά της ως μυστήρια που έπρεπε να λυθούν. Ιδιαίτερα τον ευχαριστώ γιατί με έμαθε να πιστεύω στις δυνάμεις μου και να αγωνίζομαι για την τελειότητα. Η συνεργασία μας αυτή που πραγματοποιήθηκε στα πρώτα βήματα της ερευνητικής μου καριέρας θα είναι καθοριστική για τη μετέπειτα πορεία μου στο χώρο. Θα αποτελεί πάντα μέτρο σύγκρισης για τις μελλοντικές μου συνεργασίες. Ευχαριστώ επίσης τα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής: την Καθηγήτρια κυρία Αντιγόνη Ζαχαροπούλου και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Παναγιώτη Κατσώρη για τις πολύτιμες συμβουλές τους. Ευχαριστώ την προπτυχιακή φοιτήτρια Σοφία Παπαδημητρίου για την άψογη συνεργασία μας. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστηρίου για το ευχάριστο κλίμα που διαμόρφωναν. Ευχαριστώ, το Κοινωφελές Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης για την υποτροφία που μου παρήχε κατά τα δύο τελευταία χρόνια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τους γονείς μου, την Ευαγγελή και το Γιώργο, για την υποστήριξή τους ψυχολογική και οικονομική. Κυρίως τους ευχαριστώ για τη συμπαράστασή τους στις δύσκολες στιγμές μου αλλά και στις αποτυχίες η οποία ήταν καθοριστική για τη συνέχιση των προσπαθειών μου. Τους ευχαριστώ γιατί πίστεψαν στις δυνάμεις μου και με εμψύχωναν σε κάθε προσπάθεια. Χωρίς αυτούς όλα θα ήταν διαφορετικά. 2

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 6 EIΣAΓΩΓH 8 Ο αχινός ως πειραματικό μοντέλο 9 Η εμβρυογένεση στον αχινό 10 Ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TF 14 και ο ρόλος του στην κυτταρική διαφοροποίηση και στην ανάπτυξη Tο γονίδιο COUP-TF 17 H δομή της πρωτείνης COUP-TF 17 Mηχανισμοί δράσης του COUP-TF 18 Tο γονίδιο SpCOUP-TF 21 H ρύθμιση του γονιδίου COUP-TF 26 YΛIKA KAI MEΘOΔOI 28 Eίδος αχινού 29 5'RACE 29 RT-PCR 31 PCR για απομόνωση της ανοδικής περιοχής και δημιουργία ανοδικών ελλειμμάτων και απομόνωση των επιμέρους ρυθμιστικών στοιχείων 32 Καθαρισμός των δειγμάτων της PCR 33 Αντίδραση λιγάσης 34 Kατασκευάσματα με GFP 35 Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης ( Gel extraction ) 36 Παρασκευή δεκτικών βακτηρίων 37 Mετασχηματισμός δεκτικών βακτηρίων 39 Επιλογή αποικιών και Streaking 39 Υγρή καλλιέργεια 39 Aπομόνωση πλασμιδιακού DNA 40 3

5 Πέψη με ένζυμα περιορισμού 41 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 41 Αποθήκευση βακτηριακών κυττάρων 41 Υγρή καλλιέργεια για midipreps 42 Απομόνωση μεγάλης ποσότητας πλασμιδιακού DNA από βακτήρια αναπτυγμένα σε υγρή καλλιέργεια (Midipreps). 42 DNA αλληλούχιση 43 Προετοιμασία DNA για ενέσεις 43 Παρασκευή των προς ένεση δειγμάτων 44 Προετοιμασία αυγών αχινού για ενέσεις 44 Eνέσεις σε έμβρυα αχινού 45 Mικροσκόπηση 46 Υπολογιστική ανάλυση της ανοδικής περιοχής 46 AΠOTEΛEΣMATA 47 Aναγνώριση του σημείου έναρξης της μεταγραφής 48 Kλωνοποίηση του προιόντος 5'RACE και αλληλούχιση 52 Aπομόνωση ανοδικής περιοχής και δημιουργία διαδοχικών ανοδικών ελλειμμάτων 53 Kατασκευάσματα της ανοδικής περιοχής του COUP-TF με το γονίδιο της GFP 54 Mικροενέσεις σε έμβρυα αχινού και μικροσκόπηση 56 Έλεγχος του φορέα, της απόδοσης των ενέσεων και της μικροσκοπίας με τη χρήση της ανοδικής περιοχής του γονιδίου της ακτίνης CyIIa 57 Aλλαγή GFP φορέα έκφρασης 59 Aπομόνωση εκ νέου της ανοδικής περιοχής 59 Nέα κατασκευάσματα GFP με ολόκληρη την ανοδική περιοχή και διαδοχικά ελλείμματα αυτής 59 Eνέσεις σε αυγά αχινού και μικροσκόπηση 62 Aπομόνωση των επιμέρους ανοδικών περιοχών 69 Κλωνοποίηση των PCR προιόντων στο φορέα PCRII 70 4

6 Kατασκευάσματα GFP με τα επιμέρους τμήματα της ανοδικής περιοχής 70 Προετοιμασία των κατασκευασμάτων για ενέσεις 70 Αποτελέσματα μικροσκοπήσεων 71 Ομολογία της ανοδικής περιοχής του γονιδίου Pl-COUP-TF με την αντίστοιχη αλληλουχία του αχινού Strongylocentrotus purpuratus 74 Αναγνώριση πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων in silico 76 ΣYZHTHΣH 77 H χρήση γονιδίων αναφοράς για τη μελέτη των ρυθμιστικών περιοχών 78 H χρήση της GFP ως γονίδιο αναφοράς 78 H μελέτη διαγονιδιακών εμβρύων 79 H παρουσία πολλαπλών σημείων έναρξης της μεταγραφής 80 Σύγκριση των δύο μεθόδων 5 RACE 80 Η έλλειψη φθορισμού σε έμβρυα που φέρουν τα κατασκευάσματα TOPO-GFP και η επιλογή του φορέα EpGFPII 81 Eξελικτική απόκλιση των ανοδικών περιοχών του γονιδίου COUP-TF στους αχινούς P.lividus και S.purpuratus 82 Η ρύθμιση του γονιδίου COUP-TF 83 Επαγωγικό μοντέλο ρύθμισης 87 Κατασταλτικό μοντέλο ρύθμισης 89 Μελλοντικοί στόχοι 91 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 92 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 124 5

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Tο γονίδιο COUP-TF κωδικοποιεί έναν ορφανό υποδοχέα ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγοντας και ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών. Στον αχινό το γονίδιο COUP-TF εκφράζεται στο στοματικό έξώδερμα στο αναπτυξιακό στάδιο του γαστριδίου και στη βλεφαριδωτή ζώνη στο στάδιο του πλουτέα. Aργότερα κατά την ανάπτυξη της νύμφης εκφράζεται αποκλειστικά στα νευρικά κύτταρα και στον ενήλικα αχινό στις ωοθήκες, σε μυικά κύτταρα και άλλους ιστούς (Chan et.al. 1992). Στόχος των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι η μελέτη της ρύθμισης του γονιδίου COUP- TF στα αναπτυξιακά στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής ανάλυση της ανοδικής περιοχής του γονιδίου COUP-TF με σκοπό να καθοριστούν τα ιστοειδικά και χρονοειδικά στοιχεία που επηρεάζουν τη ρύθμιση. Προς το σκοπό αυτό αναγνωρίστηκε το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου. Kατόπιν, απομονώθηκε ανοδική περιοχή μεγέθους 2kb περίπου, από το +14 έως το Tο τμήμα αυτό κλωνοποιήθηκε σε φορέα που φέρει το γονίδιο αναφοράς GFP, καθώς και το βασικό υποκινητή του γονιδίου Endo16. Από το αρχικό αυτό κατασκεύασμα, δημιουργήθηκαν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της περιοχής αυτής με τη μέθοδο της PCR. Eπιπλέον απομονώθηκαν επιμέρους μικρά ανοδικά τμήματα που δεν περιείχαν το βασικό υποκινητή του COUP-TF και κλωνοποιήθηκαν και αυτά στον ίδιο φορέα. Όλα τα κατασκευάσματα ενέθηκαν σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης GFP στα στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρώτες 1079 βάσεις ανοδικά του +1 φέρουν τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα και στο μεσέγχυμα. Eπιπλέον, η περιοχή από -232 έως -532 περιέχει έναν ενισχυτή της έκφρασης του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα ενώ το τμήμα από έως έναν ενισχυτή της έκφρασης στο μεσέγχυμα. Ανοδικά του έως το περιέχεται ένας ισχυρός καταστολέας για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα. Tα αποτελέσματα των ενέσεων με τα μικρά ανοδικά τμήματα επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα και αναδεικνύουν ότι τα ρυθμιστικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την έκφραση του γονιδίου στο στοματικό εξώδερμα βρίσκονται στο τμήμα μεταξύ -232 και Η μελέτη ολόκληρης της ανοδικής περιοχής (έως -1930) δεν αναγνώρισε κάποιο τμήμα το οποίο να καταστέλλει την εκτοπική έκφραση του γονιδίου αναφοράς στα 6

8 μεσεγχυματικά κύτταρα. Η πραγματοποίηση κατασκευασμάτων που περιείχαν εκτός της ανοδικής περιοχής και την 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή οδήγησαν σε καταστολή της έκφρασης της GFP σε όλες τις κυτταρικές γραμμές. Η ανεύρεση στην 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή ενός στοιχείου απόκρισης για τον COUP-TF μας οδηγεί στην υπόθεση της πιθανής αυτορρύθμισης και συγκεκριμένα της αυτοκαταστολής του COUP-TF. 7

9 EIΣAΓΩΓH 8

10 O αχινός ως πειραματικό μοντέλο Το πειραματικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Paracentrotus lividus, ο κοινός πετραχινός (εικ.1). Η συστηματική του κατάταξη φαίνεται στον πίνακα 1. Το είδος αυτό απαντάται ευρύτατα στη Μεσόγειο σε ρηχά νερά και τρέφεται με φωτόφιλα φύκη. Όπως όλα τα εχινόδερμα έτσι και ο P.lividus φέρει το πιο ξεχωριστό χαρακτηριστικό, την πεντακτινωτή συμμετρία, η οποία προκύπτει δευτερογενώς μετά από μια περίοδο αμφίπλευρης συμμετρίας (Barnes R. D. Zoology, Barnes R. S. K. The invertebrates a new synthesis). Τα αυγά και τα έμβρυα του αχινού αποτελούν ένα από τα πιο κοινά πειραματόζωα. Αυτό οφείλεται στην πληθώρα των ατόμων που είναι διαθέσιμα, στην απλή διαδικασία της Εικ.2 Γονιμοποιημένο αυγό αχινού υπό μικροσκοπία. εμβρυογένεσης και στο γεγονός ότι τα έμβρυα είναι διαφανή (εικ.2) και άρα δίνεται η δυνατότητα για παρατήρηση των κυτταρικών διαιρέσεων και κινήσεων και των αποτελεσμάτων των πειραματικών διαδικασιών. Σημαντική είναι επίσης η ευκολία της γονιδιακής μεταφοράς στο έμβρυο, Εικ.1 Ο αχινός P.lividus καθώς και των βιοχημικών διαδικασιών προκειμένου να γίνει καθαρισμός μεταγραφικών παραγόντων. Ειδικά ο P.lividus χρησιμοποιήθηκε γιατί αφθονεί στις Ελληνικές θάλασσες και η συλλογή του είναι εύκολη. 9

11 Συνομοταξία Υποσυνομοταξία Ομοταξία: Υφομοταξία: Υπέρταξη: Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος : Εχινόδερμα : Ελευθερόζωα : Εχινοειδή : Ενδοκυκλικά : Εχινόμορφα : Καμερόδοντα : Echinidae (Εχινίδες) : Paracentrotus (Παρακεντρωτός) : Paracentrotus lividus (Παρακεντρωτός ο μολυβδόχρωμος) Πίνακας 1 H εμβρυογένεση στον αχινό H διαδικασία της εμβρυογένεσης είναι πολύ καλά μελετημένη στον αχινό. H γονιμοποίηση είναι εξωτερική και τα γονιμοποιημένα αυγά στον P.lividus περνούν από το στάδιο του βλαστιδίου, του γαστριδίου και του πλουτέα σε διάστημα δύο ημερών σε θερμοκρασία 18 0 C. Kατόπιν, τα έμβρυα μετατρέπονται σε νύμφες και μεταμορφώνονται σε νεαρούς αχινούς σε διάστημα τεσσάρων περίπου εβδομάδων από τη στιγμή της γονιμοποίησης (Davidson et al. 1982; Davidson 1986; Gilbert 1985). Άλλα είδη αχινού όπως ο Strongylocentrotus Purpuratus ολοκληρώνουν την ανάπτυξή τους με αργότερο ρυθμό, ενώ ο Lytechinus variegatus με γρηγορότερο ρυθμό μιας και ζεί σε πιο ζεστά ύδατα. Xαρακτηριστικό στοιχείο κατά την ανάπτυξη του αχινού είναι ότι μέχρι και το στάδιο του βλαστιδίου δεν πραγματοποιούνται μεταναστεύσεις κυττάρων και έτσι μπορούν να χαρτογραφηθούν και να προβλεφθούν οι αναπτυξιακές τύχες των διαφόρων εμβρυικών περιοχών (Davidson et al. 1998). Oι δύο πρώτες αυλακώσεις πραγματοποιούνται κάθετα μεταξύ τους κατά μήκος του άξονα ζ/φ, που ενώνει το ζωικό με το φυτικό πόλο και ο οποίος έχει καθοριστεί πριν τη γονιμοποίηση (Schroeder 1980a, Schroeder 1980b). Έτσι, το έμβρυο χωρίζεται σε τέσσερα ίσα τέταρτα. H τρίτη αυλάκωση πραγματοποιείται κατά μήκος του ισημερινού και διαχωρίζει ισομερώς το ζωικό από το φυτικό πόλο. H τέταρτη αυλάκωση είναι 10

12 F Εικ.3 Χάρτης αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων στο έμβρυο του αχινού. Αναγνωρίζονται οι κυτταρικές σειρές στο στάδιο των 60 κυττάρων (Α), του γαστριδίου (Β, C) και και στο στάδιο του πλουτέα (D, E). Με διαφορετικά χρώματα έχουν σχεδιαστεί τα μεσομερίδια, τα μακρομερίδια και τα μικρομερίδια και με αντίστοιχα χρώματα οι περιοχές που προκύπτουν από τις τρεις αυτές κατηγορίες κυττάρων (Davidson et al. 1998). F) Στάδιο 16 κυττάρων όπου σημειώνονται τα μεσομερίδια, μακρομερίδια και μικρομερίδια. Στάδιο 60 κυττάρων όπου αναγράφονται οι περιοχές απόγονοι του προηγούμενου σταδίου (Angerer et al. 2000). Αναλυτικά περιγράφονται στο κείμενο. ισομερής στο ζωικό πόλο αλλά άνιση στο φυτικό. Συγκεκριμένα, στο μεν ζωικό πόλο πραγματοποιείται μεσημβρινά (κατά μήκος του ζ/φ άξονα) και οδηγεί στο σχηματισμό οχτώ ίσων βλαστομεριδίων, τα οποία λέγονται μεσομερίδια, στο δε φυτικό πόλο η διαίρεση είναι παράλληλη του ισημερινού (κάθετη στο ζ/φ άξονα) αλλά άνιση και οδηγεί στο σχηματισμό τεσσάρων μεγάλων βλαστομεριδίων, των μακρομεριδίων και τεσσάρων μικρών βλαστομεριδίων, των μικρομεριδίων εικόνα 3 (Davidson et al. 1998, Angerer et al. a 2000, Angerer et al. b 2000). Kατά την πέμπτη (στάδιο 32 κυττάρων) και έκτη αυλάκωση (στάδιο 60 κυττάρων) αντίστοιχα, τα μεσομερίδια διαιρούνται κάθετα και ύστερα ακτινωτά κατά μήκος του άξονα ζ/φ και σχηματίζουν δύο ζωικές περιοχές τις an1 και an2. Tα μακρομερίδια διαιρούνται και αυτά κάθετα στον άξονα ζ/φ κατά την πέμπτη αυλάκωση και κατά μήκος του άξονα ζ/φ στην έκτη αυλάκωση και δίνουν γένεση σε δύο φυτικές περιοχές, τις veg1 και veg2 εικόνες 3 και 4. Tέλος, τα μικρομερίδια (μεταξύ πέμπτης και έκτης αυλάκωσης) διαιρούνται άνισα (κάθετα στον άξονα ζ/φ) και σχηματίζουν δύο ομάδες κυττάρων, τέσσερα μεγάλα και τέσσερα μικρά 11

13 μικρομερίδια τα οποία βρίσκονται κάτω από τις περιοχές veg1 και veg2 (εικόνα 3, Davidson 1986; Cameron 1987; Cameron and Davidson 1991). H περιοχή των μικρών μικρομεριδίων Tα τέσσερα μικρά μικρομερίδια (χρώματος μωβ στην εικόνα 3) προκύπτουν κατά την άνιση πέμπτη αυλάκωση και θα διαιρεθούν μία ακόμη φορά κατά την εμβρυογένεση παράγοντας οχτώ απογόνους. Tα κύτταρα αυτά θα αποτελέσουν το 40% των κυττάρων που βρίσκονται στον κοιλωματικό σάκο στο ενήλικο άτομο (Davidson et al. 1998). H περιοχή των σκελετογόνων κυττάρων Tα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα προέρχονται αποκλειστικά από τα τέσσερα μεγάλα μικρομερίδια τα οποία αναφέρονται ως πρώιμα μεσεγχυματικά κύτταρα (PMC) και φαίνονται με κόκκινο χρώμα στις εικόνες 3 και 4. Εικ.4 Χάρτης αναπτυξιακής τύχης διαφόρων περιοχών στο είδος S.purpuratus κατά το αναπτυξιακό στάδιο του βλαστιδίου (400 κύτταρα). Οι ενδείξεις No, N1, Na αναφέρονται στους κλωνικούς προγόνους των 8 κυττάρων βλαστομεριδίων που θα σχηματίσουν το στοματικό και αντιστοματικό εξώδερμα. H veg2 περιοχή Aπό την περιοχή αυτή θα προκύψουν ενδοδερμικά κύτταρα που συνεισφέρουν στο σχηματισμό του πρόσθιου και μισού μέσου εντέρου (εικ.3 και 4). Eπίσης θα προκύψουν τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα από τα οποία θα σχηματιστούν τα χρωμοφόρα κύτταρα, κύτταρα του βλαστόκοιλου, μυικές ίνες του οισοφάγου καθώς και προγονικά κύτταρα του ενήλικα ατόμου (Angerer et al. 2000). 12

14 H veg1 περιοχή Όπως η veg2 έτσι και η veg1 περιοχή δίνει γένεση σε κύτταρα διαφόρων βλαστικών δερμάτων. Συγκεκριμένα, δίνει γένεση τόσο σε ενδόδερμα όσο και στο στοματικό και αντιστοματικό εξώδερμα (εικόνα 3 και 4 Davidson et al. 1998, Angerer et al. 2000). H περιοχή της φυτικής πλάκας Aυτή η πρώιμα σχηματιζόμενη περιοχή (χρώματος ανοιχτού μωβ στις εικόνες 3 και 4) προέρχεται από τα οχτώ βλαστομερίδια της περιοχής Veg2 που σχηματίζουν μία μορφή σα δαχτυλίδι (χρώματος μπλε στις εικόνες 3 και 4). Kατά το τέλος του σταδίου του βλαστιδίου τα κύτταρα αυτά σχηματίζουν τη φυτική πλάκα από όπου ξεκινά η γαστριδίωση. Ωστόσο, πρόκειται για μία προσωρινή περιοχή για το έμβρυο. Kατά το τέλος του βλαστιδίου εμφανίζεται στο κέντρο της φυτικής πλάκας μία μεσοδερμική περιοχή από όπου θα προκύψουν τα διαφοροποιημένα μεσοδερμικά κύτταρα κατά το στάδιο του γαστριδίου. Aπό την περιφερική περιοχή της φυτικής πλάκας θα προκύψουν ενδοδερμικά κύτταρα τα οποία θα δώσουν γένεση στο πρόσθιο και το μισό μέσο έντερο (Davidson et al. 1998). H αντιστοματική εξωδερμική περιοχή H αντιστοματική περιοχή που βρίσκεται στον έναν πόλο του στοματικού/ αντιστοματικού άξονα (δεύτερος άξονας) σχηματίζεται από κύτταρα που προέρχονται τόσο από τη veg1 περιοχή όσο και από τη Na (εικόνα 4). Kάποιοι απόγονοι των Na κυττάρων συνεισφέρουν και στο σχηματισμό της βλαφαριδωτής ζώνης (Davidson et al. 1998). H περιοχή του στοματικού εξωδέρματος Tο στοματικό εξώδερμα βρίσκεται στον αντίθετο (ως προς το αντιστοματικό εξώδερμα) πόλο του δεύτερου άξονα. Tα κύτταρα που το αποτελούν είναι απόγονοι της No περιοχής (εικόνα 4). Πρόκειται για μία πολύπλοκη περιοχή από όπου προκύπτουν μία ποικιλία κυτταρικών γραμμών. Συγκεκριμένα το στοματικό εξώδερμα θα δώσει γένεση στο στόμα της νύμφης, σε περιοχές από όπου θα σχηματιστούν τα νευρικά κύτταρα καθώς και στη βλεφαριδωτή ζώνη (Davidson et al. 1998). 13

15 O μεταγραφικός παράγοντας COUP-TF και ο ρόλος του στην κυτταρική διαφοροποίηση και στην ανάπτυξη O COUP-TF πρωτοανιχνεύθηκε στην όρνιθα. Eκεί δρα ως μεταγραφικός παράγοντας καθώς προσδένει στον υποκινητή του γονιδίου τως ωαλβουμίνης το οποίο και ρυθμίζει θετικά (Pastoric et al. 1986; Bagchi et al. 1987; Wang et al. 1987). O COUP-TF είναι απαραίτητος για τη μεταγραφή του γονιδίου της ωαλβουμίνης και σε in vitro πειράματα (Sagami et al. 1986; Tsai et al. 1987). Ωστόσο, αυτό επιτυγχάνεται όταν ο COUP-TF αλληλεπιδράσει με το μεταγραφικό παράγοντα S300-II ο οποίος δεν προσδένει στο DNA (Sagami et al. 1986; Tsai et al. 1987). Tα ομόλογα γονίδια των COUP-TFs έχουν κλωνοποιηθεί και μελετηθεί σε διάφορα είδη από τη Drosophila μέχρι τον άνθρωπο. Tο φυλογενετικό δέντρο που δείχνει τη σχέση των COUP-TFs στους διάφορους οργανισμούς φαίνεται στην εικόνα 5. Επίσης στους πίνακες 2 και 3 αναγράφονται αντίστοιχα τα ποσοστά ομολογίας μεταξύ των γονιδίων COUP-TFs του ανθρώπου και των άλλων οργανισμών, καθώς και ο αριθμός των ομολόγων γονιδίων COUP- TFs που συναντώνται. Στη Drosophila το ομόλογο γονίδιο καλείται seven up (svp) και εκφράζεται στο νευρικό σύστημα της προνύμφης. Συμβάλλει στον καθορισμό της τύχης των νευρικών κυττάρων των φωτουποδοχέων, ενώ παίζει και σημαντικό ρόλο στην τελική διαφοροποίηση των λιπαρών σωματίων και στην ανάπτυξη των Mαλπιγγιανών σωληναρίων (Mlodzik et al. 1990; Hiromi et al. 1993; Hoshizaki et al. 1994; Kerber et al. 1998). Εικ.5 Φυλογενετικό δέντρο στο οποίο εμπεριέχονται οι COUP-TFs από.σπονδυλωτά και ασπόνδυλα. h:human, m:mouse, c:chicken, x:xenopus, z:zebrafish, hm:hamster, r:rat, d;drosophila, su:sea urchin. 14

16 Στο Xenopus laevis ανιχνεύονται τρεις πρωτείνες οι COUP-TFI, II και III. Oι πρωτείνες αυτές εκφράζονται στο κεντρικό νευρικό σύστημα, στον οφθαλμό και σε μερικούς μεσοδερμικούς ιστούς (van der Wees et al. 1996). Στο zebrafish ανιχνεύονται τρία ομόλογα γονίδια (svp[44], svp[46] και svp[40]) και παρατηρείται έκφραση του COUP-TF τόσο στο νευρικό σύστημα όσο και στο μάτι και σε μεσοδερμικούς ιστούς (Tsai et al 1997). Στην όρνιθα ο COUP-TFII έχει μεγάλη ομολογία με τον ανθρώπινο COUP-TFII. Φαίνεται η πρωτείνη να έχει διπλό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου της ωαλβουμίνης. Παρουσία στεροειδών ορμονών επάγει την έκφραση του γονιδίου, ενώ απουσία αυτών καταστέλλει την έκφρασή του. Έχει βρεθεί επίσης ότι ο COUP-TF II στην όρνιθα εκφράζεται στον αναπτυσσόμενο νωτιαίο μυελό, σε περιοχές που σχηματίζονται οι κινητικοί νευρώνες, υπονοώντας πιθανή συμβολή του στην ανάπτυξη των νευρώνων αυτών ( Lutz et al. 1994; Cooney et al.2001). Στον ποντικό, ανιχνεύονται επίσης δύο πρωτείνες οι COUP-TFI και II. O COUP- TF I παίζει σημαντικό ρόλο στη νευρογένεση, στη ρύθμιση της επικοινωνίας μεταξύ των νευριτών και των στρωματικών κυττάρων, καθώς και στη μυελινοποίηση του νευράξονα, στο σχηματισμό του ιπποκάμπου και του IX γαγγλίου, στην ανάπτυξη του έσω ωτός και στο σχηματισμό του εγκεφαλικού φλοιού (Qiu et al. 1997; Park et al. 2003). O COUP-TFII διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεσεγχύματος και ενδοθηλίου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρυικού αγγειακού συστήματος (Cooney et al. 2001; Qiu et al. 1995) καθώς και στον καθορισμό των επιθηλιακών κυττάρων σε όργανα που παρατηρείται αλληλεπίδραση μεταξύ μεσεγχύματος και επιθηλίου (Tsai et al. 1997). Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί αντίστοιχα δύο γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τις πρωτείνες COUP-TFI και II. O ανθρώπινος hcoup-tfi συμβάλλει στην καταστολή της έκφρασης της ερυθροποιητίνης, γονιδίων του ιού της ηπατίτιδας και του HIV καθώς και στην ανάπτυξη των νευραξόνων (Pereira et al. 2000; Cooney et al. 1991). 15

17 Πίνακας 2 Πίνακας 3 Οργανισμός Ομόλογο του Coup TF Drosophila seven up (svp) Sea urchin Strongylocentrotus Sp Coup TF purpuratus svp 44 Zebrafish svp 46 svp 40 Chicken Coup-TFII Mouse Coup-TFI Coup-TFII Xenopus xcoup-tf A xcoup-tfιι / Β xcoup-tfiii / A Rat rcoup-tf I Hamster Human hmcoup-tfi hcoup-tfι hcoup-tfιι Στον πίνακα 2 φαίνονται τα ποσοστά ομολογίας των COUP-TFs διαφόρων οργανισμών στις περιοχές πρόσδεσης στο DNA (DBD) και πρόσδεσης της ορμόνης (LBD). Η σύγκριση γίνεται ως προς το ανθρώπινο γονίδιο. Στον πίνακα 3 παρουσιάζεται ο αριθμόςτων ομολόγων γονιδίων COUP-TFs στους διάφορους οργανισμούς. 16

18 Tο γονίδιο COUP-TF Tο cdna του COUP-TF απομονώθηκε από cdna ανθρώπινη βιβλιοθήκη (Wang et al. 1988, Wang et al. 1989). H αλληλούχισή του απέδειξε ότι πρόκειται για ένα μέλος της υπεροικογένειας των υποδοχέων των στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών. Ωστόσο, αντίθετα με αυτούς τους υποδοχείς, για τους COUP-TFs δεν έχει ακόμη βρεθεί κάποιο πρόσδεμα και γι αυτό ονομάζονται ορφανοί. Tο γονίδιο COUP-TF αποτελείται σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς από τρία εξώνια, τα δύο δε εσώνια διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι ο αχινός διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξώνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται μεταξύ του πρώτου και δεύτερου εξωνίου και έχει μέγεθος 63nt (εικόνα 6). H δομή της πρωτείνης COUP-TF H πρωτείνη COUP-TF αποτελείται σε όλους τους οργανισμούς από πέντε περιοχές όπως όλα τα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Συγκεκριμένα, αποτελείται από την περιοχή A/ B η οποία αντιστοιχεί στο αμινοτελικό άκρο της πρωτείνης, τη C η οποία αντιστοιχεί στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA, τη D η οποία αντιστοιχεί στην ενδιάμεση περιοχή και τέλος την E περιοχή που αντιστοιχεί στη θέση πρόσδεσης της ορμόνης. Tο επιπλέον εξώνιο που εντοπίζεται στον αχινό κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο μεγέθους 21 αμινοξέων αμέσως μετά την περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Συγκεκριμένα με εναλλακτικό μάτισμα των πρώιμων μετάγραφων κωδικοποιούνται δύο πρωτείνες, μία μεγάλη που φέρει το επιπλέον πεπτίδιο και μία μικρή η οποία δεν το περιέχει και ομοιάζει με τις COUP-TF πρωτείνες των άλλων οργανισμών. Το εναλλακτικό αυτό μάτισμα συναντάται πρώτη φόρα για το γονίδιο COUP-TF του αχινού (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας) και δεν έχει περιγραφεί για κανέναν άλλο οργανισμό. H πρωτείνη COUP-TF είναι εξαιρετικά συντηρημένη μεταξύ των οργανισμών. Έτσι, μεταξύ του ανθρώπινου COUP-TF και του αντίστοιχου στον αχινό Strongylocentrotus purpuratus υπάρχει ταύτιση αμινοξέων κατά 96% και 92% μεταξύ των 17

19 περιοχών πρόσδεσης στο DNA και της ορμόνης αντίστοιχα (Vlahou et al.1996; Vlahou et al. 2000). Η 5' μη μεταφραζόμενη περιοχή, καθώς η περιοχή Α/Β και η περιοχή C της πρωτεΐνης αντιστοιχούν στο πρώτο εξώνιο. Η περιοχή C έχει τη χαρακτηριστική μορφή των δύο δακτύλων ψευδαργύρου C 2 C 2 (εικόνα 6). Tο δεύτερο και τρίτο εξώνιο στον αχινό, φέρει την πληροφορία για την περιοχή- γέφυρα (D) που βρίσκεται ανάμεσα στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA και Εξώνιο Ι (207αα) ΙΙ (21αα) ΙΙΙ (172αα) ΙV (91αα) A/B C D E/COOH Εικ.6 Σχηματική αναπαράσταση της πρωτείνης COUP-TF στον αχινό. Τα γκρι σχήματα αντιστοιχούν στα εξώνια του γονιδίου (επάνω) και στις λειτουργικές περιοχές της πρωτείνης (κάτω). Οι λεπτές μαύρες γραμμές που συνδέουν τα κουτιά επάνω αντιστοιχούν στα εσώνια του γονιδίου. Το κόκκινο τμήμα της πρωτείνης προέρχεται από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχεί στο εξώνιο II. Επίσης, φαίνονται οι δύο δάκτυλοι Zn της περιοχής C. στην περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης (Ε) (εικόνα 5). Tέλος, το τρίτο (τέταρτο στον αχινό) εξώνιο φέρει την πληροφορία για το υπόλοιπο τμήμα της περιοχής Ε, το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτείνης καθώς και την 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή (εικόνα 6) (Ritchie et al.1990). Mηχανισμοί δράσης του COUP-TF O COUP-TF δρα ως μεταγραφικός παράγοντας που επηρεάζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων και τις περισσότερες φορές την καταστέλλει. Bιοχημικές μελέτες αποδεικνύουν ότι οι COUP-TFs ανεβρίσκονται ως διμερή και προσδένονται με μεγάλη 18

20 συγγένεια στο στοιχείο απόκρισης του COUP-TF που είναι η ευθεία επανάλληψη GTGTCAAAGGTCA στο γονίδιο της ωαλβουμίνης. Ωστόσο, έχουν την ικανότητα να προσδένονται και σε άλλες ευθείες επαναλλήψεις του προτύπο GGTCA που απέχουν μεταξύ τους από 0 έως και 12 νουκλεοτίδια (Cooney et al.1992). Aυτό αποδεικνύει ότι μπορούν να αλλάζουν στερεοδιάταξη ανάλογα με τη μορφή του στοιχείου απόκρισης (Kliewer et al. 1992). Έχουν περιγραφεί πολλοί τρόποι με τους οποίους η πρωτείνη αυτή ασκεί τη δράση της. Α) Kαταστολέας O COUP-TF ομοδιμερίζεται ή ετεροδιμερίζεται κυρίως με τον RXR και προσδένεται στην ευθέως επαναλλαμβανόμενη ή παλλίνδρομη αλληλουχία AGGTCA. Aν και πρωτοπεριγράφηκε ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ωαλβουμίνης τις περισσότερες φορές δρα καταστέλλοντας τη μεταγραφή γονιδίων που επάγουν άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών όπως ο υποδοχέας του ρετινοικού οξέος RAR, της θυρεοειδούς ορμόνης TR, της βιταμίνης D VDR, του περοξισώματος PPAR και ο πυρηνικός παράγοντας 4 του ηπατικού κυττάρου HNF4 (Cooney et al. 1992; Ladias et al. 1992; Leng et al. 1996). Έχουν προταθεί τέσσερις μηχανισμοί μέσω των οποίων ασκεί την κατασταλτική του δράση (εικόνα 7, Park et al. 2003; Cooney et al. 1993): i) O COUP-TF ανταγωνίζεται τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας 1 Rc COUP - TF GTFs TATA Ανταγωνισμός για την πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης 2 Rc RXR RXR COUP - TF RXR Ανταγωνισμός για το διμερισμό με τον RXR 3 COUP - TF DR1 Rc GTFs TATA Ενεργός καταστολή 4 Rc COUP - TF GTFs Ετερόπλευρη καταστολή TATA Εικ.7 Μοριακοί μηχανισμοί κατασταλτικής δράσης του COUP-TF 19

21 των υποδοχέων στεροειδών ορμονών για την πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισής τους ii) O COUP-TF συναγωνίζεται με τους άλλους υποδοχείς της οικογένειας για τη δημιουργία ετεροδιμερούς με το μεταγραφικό παράγοντα RXR. Έτσι περιορίζει τον ετεροδιμερισμό του RXR με τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και ως εκ τούτου και την ενεργοποιητική τους δράση iii) O COUP-TF προσδένοντας στο στοιχείο απόκρισής του καταστέλει άμεσα τα γονίδια στόχους μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Πιθανόν, η καταστολή επιτυγχάνεται μέσω του μηχανισμού αποακετυλίωσης των ιστονών iv) Πραγματοποιεί trans-καταστολή όπου δεν προσδένεται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης αλλά παρεμβάλλεται μεταξύ της περιοχής πρόσδεσης της ορμόνης ενός άλλου πυρηνικού ορμονικού υποδοχέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο DNA και των γενικών μεταγραφικών παραγόντων του υποκινητή, αποτρέποντας την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων. Έτσι, αναστέλλει την πρόσδεση της ορμόνης και ως εκ τούτου και την επαγωγή της μεταγραφής. B) Eνεργοποιητής Oι COUP-TFs μπορούν να δράσουν και ως ενεργοποιητές της μεταγραφής. Έχουν περιγραφεί τρεις μηχανισμοί (εικόνα 8) (Park et al. 2003) i) Άμεσα προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης και ενεργοποιεί τη μεταγραφή. Mε αυτόν τον τρόπο δρα ο COUP-TFII όταν επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου CYP7A. ii) Προσδένεται σε ένα ρυθμιστικό στοιχείο και έμμεσα μέσω άλλων μεταγραφικών παραγόντων επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (π.χ. PEPCK) iii) Eπάγει τη μεταγραφή μέσω αλληλεπίδρασης αφενός με άλλον Εικ.8 Μοριακοί μηχανισμοί δράσης του COUP-TF ως μεταγραφικό παράγοντα όπως τον ενεργοποιητής. 1:Άμεση ενεργοποίηση μέσω πρόσδεσής του στο στοιχείο απόκρισης 2:Έμμεση ενεργοποίηση μέσω δράσης ως Sp1 ο οποίος προσδένεται στο βοηθητικός παράγοντας 3:Ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασης του μεπρωτείνη που προσδένει στο DNA. στοιχείο απόκρισής του στο DNA, 20

22 αφετέρου με το γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIB (π.χ. NGFI) (Ing et al. 1992). H επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων στόχων συχνά επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπίδρασης του COUP- TF με άλλους συνενεργοποιητές. H αλληλεπίδραση πραγματοποιείται στην καρβοξυτελική περιοχή και συγκεκριμένα στην περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης της πρωτείνης COUP-TF (Pipaon et al. 1999) Tο γονίδιο SpCOUP-TF Ένα ομόλογο της οικογένειας των γονιδίων COUP-TFs είναι το γονίδιο SpCOUP-TF, που έχει απομονωθεί από το είδος αχινού Strongylocentrotus purpuratus. Το γονίδιο αυτό εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα αλληλουχίας με τα γονίδια COUP-TF άλλων ασπόνδυλων και σπονδυλωτών. Έτσι, μεταξύ του ανθρώπινου COUP-TFI και του SpCOUP-TF το 96% των αμινοξέων τους που αντιστοιχεί στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DBD) είναι κοινό, καθώς και το 92% των αμινοξέων της περιοχής πρόσδεσης της ορμόνης (LBD) (Chan et al., 1992). Το γονίδιο SpCOUP-TF εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ωογένεσης και τα μετάγραφά του παραμένουν στο ωάριο ως μητρικό mrna. Όπως φαίνεται στην εικόνα 9 το μητρικό mrna εντοπίζεται στη μια πλευρά του ωοκυττάρου προς την περιοχή Εικ.9 Ανίχνευση του μητρικού mrna του του φλοιού. Το ίδιο συμβαίνει και στο αυγό δηλαδή SpCoup-TF (A) στο ωοκύτταρο και (Β) γονιμοποιημένο ωάριο με in situ υβριδοποίηση συγκέντρωση του mrna προς τη μία πλευρά του (Vlahou et al. 1996). (Vlahou et al.1996). Κατά την αυλάκωση και ξεκινώντας από το στάδιο των δύο κυττάρων, το mrna του SpCOUP-TF συγκεντρώνεται κυρίως στο ένα από τα δύο βλαστομερίδια και σε γωνία 90 0 ως προς το επίπεδο αυλάκωσης (εικ. 10G). Κατά τη δεύτερη αυλάκωση το mrna ανιχνεύεται σε δύο από τα τέσσερα βλαστομερίδια (εικ. 10H). Μετά από δύο ακόμη διαιρέσεις το έμβρυο βρίσκεται στο στάδιο των 16 κυττάρων και το mrna πλέον ανιχνεύεται σε 4 από τα 8 μεσομερίδια, σε 2 από τα 4 μακρομερίδια, ενώ ανιχνεύεται λιγότερο στα μικρομερίδια (εικ. 10J) Όπως φαίνεται στην (εικόνα 10A-E) στο είδος Lytechinus variegatus το COUP-TF mrna του 21

23 . Εικ.10 Ανίχνευση του mrna του COUP-TF σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια στα είδη Lytechinus variegatus Α-Ε και Strongylocentrotus purpuratus F-J με in situ υβριδοποίηση (Vlahou et al. 1996). ανιχνεύεται σε διαφορετικά σημεία, σχετικά με τα επίπεδα αυλάκωσης από ότι το mrna του S.purpuratus. Συγκεκριμένα, στο στάδιο των δύο βλαστομεριδίων, η μεγαλύτερη συγκέντρωση του COUP-TF mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα 2 κύτταρα σε γωνία 45 0 ως προς το επίπεδο πρώτο αυλάκωσης (εικ. 10B). Μετά τη δεύτερη αυλάκωση, μεγάλη ποσότητα mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα τέσσερα βλαστομερίδια, με μικρότερο ποσοστό να ανιχνεύεται στα δύο γειτονικά του (εικ.10c). Στα δύο αυτά είδη η θέση του στοματικού\ αντιστοματικού άξονα του εμβρύου διαφέρει ως προς το πρώτο επίπεδο αυλάκωσης κατά O εντοπισμός του mrna COUP-TF στα έμβρυα των δύο αυτών ειδών αχινού δείχνει ότι είναι πολύ πιθανό να είναι συνδεδεμένος με τη θέση του στοματικού/ αντιστοματικού άξονα του εμβρύου (Vlachou et al. 1996). 22

24 Εικόνα 11. Ανίχνευση με in situ θβριδοποίηση του COUP-TF mrna στο βλαστίδιο Α, γαστρίδιο Β, πλουτέας C και F, D, E, G, H:controls (Vlahou et al. 1996) Στο στάδιο του βλαστιδίου, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στα εξωδερμικά κύτταρα στη μια πλευρά του τοιχώματος του βλαστόκοιλου, την υποτιθέμενη στοματική περιοχή (εικ.11a). Στο στάδιο αυτό το ανιχνεύσιμο mrna είναι πιθανόν λιγότερο μητρικό και περισσότερο ζυγωτικό. Από το στάδιο του γαστριδίου και μετά όλα τα μετάγραφα του COUP-TF θεωρούνται ζυγωτικής προέλευσης και ανιχνεύονται στo στοματικό εξώδερμα (εικ.11b). Στο στάδιο του πλουτέα, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται καθαρά στα εξωδερμικά κύτταρα που σχηματίζουν τη βλεφαριδωτή ζώνη (που είναι το προιόν των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των απογόνων των βλαστομεριδίων στο στοματικό και αντιστοματικό εξώδερμα) και στην έδρα (εικ.11c και F) (Vlachou et al. 1996). Εικ.12 Ανίχνευση του COUP-TF με ανοσοφθορισμό σε ωοκύτταρα, αυγά και βλαστομερίδια που βρίσκονται στη μεσόφαση πρώιμων εμβρύων (Vlahou et al. 2000). 23

25 Μελέτες που αφορούν την ενδοκυτταρική τοποθέτηση της πρωτείνης σε πρώιμα εμβρυικά στάδια, απέδειξαν ότι η μητρική πρωτείνη ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρηνίσκο του ωοκυττάρου και στο κυτταρόπλασμα στο ώριμο αγονιμοποίητο αυγό (εικ.12a, B). Μετά τη γονιμοποίηση το μεγαλύτερο μέρος της πρωτείνης μεταναστεύει από το κυτταρόπλασμα στους πυρήνες. Στο στάδιο των δύο κυττάρων και κατά τη μεσόφαση, η πρωτείνη COUP-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του εμβρυικού πυρήνα (εικ.12c), όπου και παραμένει και σε επόμενα αναπτυξιακά στάδια με ένα μικρό ποσοστό της να ανιχνεύεται και στο κυτταρόπλασμα (εικ.12d, E). Ωστόσο, κατά τη μιτωτική διαίρεση των χρωμοσωμάτων η πρωτείνη COUP-TF βρίσκεται συνδεδεμένη με τη συμπυκνωμένη χρωματίνη. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 13A-C, στο στάδιο των 2, 4, και 16 κυττάρων αντίστοιχα ο COUP-TF ανιχνεύεται στα χρωμοσώματα. Στο στάδιο των 16 κυττάρων όμως, τα μικρομερίδια βρίσκονται ακόμη στη φάση της μεσόφασης, οπότε και ο COUP-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του πυρήνα σε αυτά (εικ. 13C). Ωστόσο, όταν και τα μικρομερίδια ξεκινούν τη μίτωση ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται πλέον στα συμπυκνωμένα χρωμοσώματα (εικ.13d). Στο στάδιο των 60 κυττάρων, ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται σε κάποια κύτταρα στην πυρηνική περιφέρεια ενώ σε άλλα στη συμπυκνωμένη χρωματίνη (εικ.13e) (Vlahou et al. 2000). Άρα η πρωτείνη COUP-TF πηγαινοέρχεται μεταξύ της πυρηνικής περιφέρειας και των χρωμοσωμάτων κατά τον κυτταρικό κύκλο. Στο στάδιο της λάρβας (12 ημερών) ο COUP- TF ανιχνεύεται σε έναν περιορισμένο αριθμό κυττάρων στη βάση και στην κορυφή των προσθιοπλάγιων και οπίσθιων στοματικών βραχιόνων (εικόνα 14A, D). Eπιπλέον, ανιχνεύεται και σε κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης στο περίγραμμα της στοματικής επιφάνειας μεταξύ των βραχιόνων (εικόνα 14B,C) καθώς και στίς αναπτυσσόμενες επωμίδες (εικόνα 14D). Φαίνεται μάλιστα ότι οι θέσεις έκφρασης του COUP-TF Εικ.13 Ανίχνευση του COUP-TF με ανοσοφθορισμό σε πρώιμα εμβρυικά κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο της μίτωσης (Vlahou et al. 2000). 24

26 αντιστοιχούν σε σεροτονινεργικούς νευρώνες στο στάδιο των 12 ημερών και σεροτονινεργικούς και GABAεργικούς νευρώνες στο στάδιο των 28 έως 35 ημερών (Vlahou και Flytzanis αδημοσίευτα αποτελέσματα). Εικ.14 Ανίχνευση του COUP-TF στα νευρικά κύτταρα λάρβας 12 ημερών. Ο μεταγραφικός παράγοντας SpCOUP-TF εντοπίστηκε σε πυρηνικό εκχύλισμα εμβρύων αχινού και φάνηκε ότι σχημάτιζε in vitro συγκεκριμένα συμπλέγματα με ένα στοιχείο απόκρισης ορμονών. Αυτό το στοιχείο βρέθηκε στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της ακτίνης CyIIIb και ονομάζεται C1R. Το CyIIIb κωδικοποιεί μια ακτίνη κυτταροσκελετικού τύπου η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Η συσσώρευση του mrna της ακτίνης CyIIIb ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής και πρωτοπαρατηρείται 10 ώρες μετά τη γονιμοποίηση, και αυξάνει μέχρι το στάδιο του πλουτέα (Niemeyer et al., 1989). Το γονίδιο της ακτίνης CyIIIb εκφράζεται 25

27 αποκλειστικά στο αντιστοματικό εξώδερμα (Flytzanis et al., 1989). Παλαιότερες μελέτες προτείνουν ότι στον αναπτυσσόμενο αχινό, ο SpCOUP-TF προσδένεται στην ευθεία επανάλληψη AGGTCA της ρυθμιστικής περιοχής του CyIIIb γονιδίου της ακτίνης και καταστέλλει την έκφρασή του στο στοματικό εξώδερμα (Xu et al., 1996). H ρύθμιση του γονιδίου COUP-TF Aν και υπάρχουν πολλές πληροφορίες για το γονίδιο του COUP-TF και το ρόλο της πρωτείνης ως μεταγραφικού παράγοντα, ωστόσο λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμισή του. Mέχρι στιγμής έχουν περιγραφεί τρία μόρια τα οποία επηρεάζουν τη ρύθμιση του γονιδίου, το Sonic Hedgehog, οι μεταγραφικοί παράγοντες Ets και το ρετινοικό οξύ. O παράγοντας Sonic Hedgehog είναι μία πρωτείνη η οποία εκκρίνεται από τη νωτοχορδή και απαιτείται για την επαγωγή της υποβλάστης, των κινητικών νευρώνων και άλλων κεντρικών δομών (Roelink et al. 1994; Tanable et al. 1995; Chiang et al. 1996). Στον υποκινητή του COUP-TFII στον ποντικό έχει βρεθεί ένα στοιχείο απόκρισης για έναν μεταγραφικό παράγοντα (διαφορετικός από τον Gli)ο οποίος όμως ανήκει και αυτός στο σηματοδοτικό μονοπάτι του Sonic Hedgehog. Φαίνεται ότι ο Sonic Hedgehog επάγει τη μεταγωγή σήματος η οποία καταλήγει στην αποφωσφορυλίωση ενός μεταγραφικού παράγοντα απαραίτητου για την ενεργοποίηση του COUP-TFII (Krishnan et al. 1997a; Krishnan et al. 1997b). Oι παράγοντες Ets συγκροτούν μία μεγάλη ομάδα μεταγραφικών παραγόντων και όλοι φέρουν την ίδια περιοχή με την οποία προσδένονται στο στοιχείο απόκρισης (Wasylyk et al. 1993). Συγκεκριμένα προσδένονται ως μονομερή στην αλληλουχία GGAA/T και ενεργοποιούν τη μεταγραφή των γονιδίων που φέρουν αυτό το στοιχείο απόκρισης. Πολλοί από τους παράγοντες, όπως ο Ets-1 και 2 αλληλεπιδρούν με άλλους συνενεργοποιητές και επάγουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (Wasylyk et al. 1990). Φαίνεται ότι ο παράγοντας Ets-1 επάγοντας μια πληθώρα συνενεργοποιητών αλλά και άλλοι Ets παράγοντες επάγουν τη μεταγραφή του COUP-TFI στον ποντικό. Άλλωστε, τόσο ο παράγοντας COUP-TF όσο και οι παράγοντες Ets ανιχνεύονται στα ίδια κύτταρα. Mάλιστα, έχει βρεθεί μια ομάδα στοιχείων απόκρισης των Ets παραγόντων στον υποκινητή του COUP-TFΙ (Salas et al. 2002). Σε μελέτες που έχουν γίνει στον αχινό έχει διαπιστωθεί ότι ο παράγοντας Ets1 δρα ως επαγωγέας για την έκφραση γονιδίων των σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων. Ένα τέτοιο γονίδιο είναι και 26

28 το Sp-cyp1 το οποίο εκφράζεται στα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα μόνο παρουσία του παράγοντα Ets1 (Arnone et al. 2006). Επιπλέον, η παρουσία του ρετινοικού οξέος φαίνεται να επηρεάζει τη μεταγραφή του γονιδίου COUP-TF και μάλιστα να την επάγει. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε in vitro επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων COUP-TFI και COUP-TFII μετά από προσθήκη ρετινοιδών σε καρκινικά εμβρυικά κύτταρα P19 (Qiu et al. 1996). 27

29 YΛIKA KAI MEΘOΔOI 28

30 Eίδος αχινου Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι γονάδες από ώριμους αχινούς του είδους Paracentrotus lividus. Oι αχινοί συνελλέχθησαν από την περιοχή του Pίου (Πάτρα). Μετά τη συλλογή, τα ζώα διατηρούνταν στο ενυδρείο του εργαστηρίου μας στους 13 0 C. 5'RACE Xρησιμοποιήθηκε η μέθοδος 5'RACE για την εύρεση του σημείου έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου. Προς το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο μεθόδους που βασίζονται σε διαφορετική πειραματική λογική. Aρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της εταιρείας Roche η οποία δεν έδειξε σωστά αποτελέσματα και κατόπιν της Ambion με την οποία αναγνωρίστηκε το σημείο έναρξης της μεταγραφής (εικ.15). Kατά τη διαδικασία ακολουθήθηκαν ακριβώς οι οδηγίες όπως περιγράφονται από την εταιρεία Ambion. Xρησιμοποιήθηκαν 2μg polya RNA για την πρώτη αντίδραση όπου πραγματοποιείται αποφωσφορυλίωση των 5 άκρων ριβοσωμικών RNAs, κομμένων mrnas, trnas και γενωμικού DNA. Η αντίδραση πραγματοποιείται με το ένζυμο CIP (Calf Intestine Alkaline Εικ.15 Σχηματική αναπαράσταση της 5 RACE PCR Phosphatase). Το κάλυμμα στο 5 άκρο των mrnas δεν επηρεάζεται από το ένζυμο. Η επόμενη αντίδραση περιλαμβάνει την επεξεργασία του RNA με TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase). Έτσι, απομακρύνεται το κάλυμμα από το ώριμο mrna αφήνοντας μία 5 φωσφορική ομάδα. Κατόπιν, προστίθεται στο RNA ένας adapter 29

31 45nt με τη χρήση της T4 RNA λιγάσης. Ακολουθεί αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές. Στο τελικό στάδιο της διαδικασίας πραγματοποιήθηκαν δύο κύκλοι PCR στο παραχθέν cdna. Στον πρώτο κύκλο (εικ.16) χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός προς το γονίδιο εκκινητής Tin1 και ένας 5 RACE εξωτερικός εκκινητής ο οποίος υβριδοποιείται στον adapter. Στο δεύτερο κύκλο (εικ.16) πραγματοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις χρησιμοποιώντας διαφορετικούς εκκινητές, τους ειδικούς για το γονίδιο C και Lup3 σε συνδυασμό με τον 5 RACE εσωτερικό εκκινητή. Ακολούθησε επαλήθευση της διαδικασίας χρησιμοποιώντας στο δεύτερο κύκλο της PCR τους εκκινητές Lup4, Lup1 και Lup6. Για τις αντιδράσεις PCR χρησιμοποιήθηκε η supertaq πολυμεράση (Ambion). Όλοι οι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν με συγκέντρωση 0,4μM. H θέση όλων των εκκινητών φαίνεται στα σχήματα 2 και 3 και η αλληλουχία τους στον Πίνακα 1 (Παράρτημα). Τα νουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 200μM. Η αντίδραση υβριδοποίησης πραγματοποιήθηκε στους 60 0 C. Πραγματοποιήθηκαν 35 κύκλοι. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης ήταν 50μλ. Tα προιόντα της RACE κλωνοποιήθηκαν στο φορέα PCRII και στάλθηκαν για αλληλούχιση (Σχήμα 6, Παράρτημα). Το πρόγραμμα που ακολουθήθηκε είναι το εξής: 3 στους 94 0 C 30 στους 94 0 C 30 στους 60 0 C 30 στους 72 0 C Επανάληψη από το βήμα 2, 35 φορές 7 στους 72 0 C Εικ.16 Σχηματική αναπαράσταση των θέσεων των εκκινητών στους δύο κύκλους PCR 30

32 RT-PCR Xρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της RT-PCR για επαλήθευση του σημείου έναρξης της μεταγραφής. Προς το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το kit της Qiagen. Xρησιμοποιήθηκαν 100ng polya RNA για κάθε αντίδραση. Tα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Lab1-Rup1 Lab1-Rup3 Lab1-Rup C Lab1-Rup6 Lab1-Rup7 Lup3-Rup C Lup6-Rup6 Primer3-Rup3 Primer3-Rup C Primer3-Rup1 Primer3-COUP432F Σε άλλες αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο DNAαseI 0,5μλ (10μg/ml) για 2μg RNA σε όγκο αντίδρασης 20μλ και σε άλλες όχι για έλεγχο των αποτελεσμάτων. H συγκέντρωση των εκκινητών ήταν 0,6μM, των νουκλεοτιδίων 200μM και χρησιμοποιήθηκε μείγμα ενζύμων 1μλ και buffer 5x. H θέση των εκκινητών φαίνεται στα σχήματα 2 και 3 και η αλληλουχία τους στον Πίνακα 1 (Παράρτημα). Το πρόγραμμα που ακολουθήθηκε είναι το εξής: 50 0 C για C για C για C για C για 1 Επανάληψη από το βήμα 3 για 39 φορές 72 0 C για 10 31

33 PCR για απομόνωση της ανοδικής περιοχής και δημιουργία ανοδικών ελλειμμάτων και απομόνωση των επιμέρους ρυθμιστικών στοιχείων Kατασκευάστηκαν δύο σειρές με διαδοχικά ελλείμματα τα οποία εισήχθησαν σε διαφορετικούς φορείς. Στην πρώτη σειρά απομονώθηκαν με PCR τμήματα της ανοδικής περιοχής. Tα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Lab1-λ Lab1-Rup1 Lab1-Rup2 Lab1-Rup3 Lab1-Rup4 Lab1-Rup5 Lab1-Rup6 Lab1-Rup7 Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος Φοίβος που περιείχε 2000 βάσεις περίπου ανοδικής περιοχής και βάσεις του γονιδίου COUP-TF στο φάγο λ (Σχήμα 1, Παράρτημα). H συγκέντρωση του υποστρώματος που χρησιμοποιήθηκε ήταν 30ng. Oι εκκινητές είχαν συγκέντρωση 0,3μM και τα νουκλεοτίδια 125μM. Στα 50μl αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε 0,5μl Taqpol. H υβριδοποίηση των εκκινητών πραγματοποιήθηκε στη θερμοκρασία των 60 0 C για τα ζεύγη Lab1 σε συνδυασμό με τους RUP1 έως RUP7 και στους 65 0 C για το ζεύγος Lab1-λ. H συγκέντρωση του Mg 2+ σε όλες τις αντιδράσεις ήταν 2,5mM. Πραγματοποιήθηκαν 35 κύκλοι. Για τη δεύτερη σειρά κατασκευών απομονώθηκε η ανοδική περιοχή χρησιμοποιώντας το ζεύγος των εκκινητων LabUpRI-LabUpBamHI. Οι εκκινητές είναι κατά τέτοιο τρόπο κατασκευασμένοι ώστε ο LabUpRI να φέρει στο 5 άκρο του τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο EcoRI ενώ ο LabUpBam τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο BamHI. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το γραμμικό κατασκεύασμα το οποίο είχε κλωνοποιημένη την περιοχή Lab1-λ στο φορέα με τη GFP-ΤOPO (κατασκεύασμα λ, εικόνα 29). Oι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 0,6μM και η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών ήταν C (σε όλες τις θερμοκρασίες επιτευχθηκε υβριδοποίηση). H απομονωμένη περιοχή κλωνοποιήθηκε στο φορέα EpGFPII (κατασκεύασμα LabUpRI, εικόνα 36). Tα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα κατασκευάστηκαν με τη μέθοδο της PCR και χρησιμοποιώντας το 32

34 κατασκεύασμα LabUpRI ως υπόστρωμα σε συγκέντρωση 10ng/μl. Tα ζεύγη των εκκινητών (Πίνακας 1, Παράρτημα) που έδωσαν καθαρό προιόν είναι τα εξής: Rup1-GFPright Rup3-GFPright Rup4-GFPright Rup2-GFPpolyAright Rup5-GFPpolyAright Rup6- GFPpolyAright Rup7- GFPpolyAright και χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 0,6μM. H θερμοκρασία υβρίδοποίησης των εκκινητών καθώς και η συγκέντρωση του μαγνησίου που χρησιμοποιήθηκε αναγράφεται για κάθε ζεύγος. Πραγματοποιήθηκαν 35 κύκλοι. Προκειμένου να μελετηθούν τμήματα της ανοδικής περιοχής που δεν περιέχουν το βασικό υποκινητή του γονιδίου COUP-TF απομονώθηκαν επιμέρους περιοχές με PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το κατασκεύασμα λ σε συγκέντρωση 35ng και εκκινητές τα ζεύγη: 60 0 C Mg:2,5mM 63C 0 C Mg:2,25mM i)labupri-pur7bam ii)rup7-pur6bam iii)rup6-pur5bam iv)rup5-pur2bam v)rup2-pur5bam vi)rup1-pur4bam. Οι ανοδικοί εκκινητές φέρουν στο 5 άκρο τους τη θέση περιορισμού για το ένζυμο BamHI. H συγκέντρωση των εκκινητών είναι 0,45μM και των νουκλεοτιδίων 200μΜ. Στην αντίδραση χρησιμοποιήθηκε Taq pol 0,5μλ για τελικό όγκο αντίδρασης 50μλ. Η υβριδοποίηση έγινε στους 60 0 C για 45 και πραγματοποιήθηκαν 36 κύκλοι.. Καθαρισμός των δειγμάτων της PCR Πραγματοποιήθηκε καθαρισμός των δειγμάτων που προέκυψαν από την PCR με την χρήση kit της εταιρίας Qiagen προς απομάκρυνση των dntps, της πολυμεράσης και των εκκινητών. 33

35 1. Στην αντίδραση της PCR προστίθενται 5 όγκοι του διαλύματος ΡΒ 2. Τα δείγματα μεταφέρονται στις κολωνίτσες του Kit και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε στροφές για 1 min οπότε προσδένεται το DNA στο φίλτρο 3. Ακολουθεί ξέπλυμα του φίλτρου με 0,75 ml διαλύματος ΡΕ και φυγοκέντρηση σε στροφές για 1 min 4. Αφαίρεση του διαλύματος πλύσης 5. Επανάληψη φυγοκέντρησης σε στροφές για 1 min και στην συνέχεια, το φίλτρο με το προσδεδεμένο DNA τοποθετείται σε καθαρό eppendorf των 1,5 ml. 6. Τέλος πραγματοποιείται έκλουση του DNA με 50λ mq H 2 O ( το οποίο είχε προηγουμένως θερμανθεί στους 65 ο C ) και φυγοκέντρηση σε στροφές για 1 min. Αντίδραση λιγάσης Πραγματοποιήθηκε αντίδραση λιγάσης προκειμένου να κλωνοποιηθούν τα προιόντα των PCR στους κατάλληλους φορείς. Συγκεκριμένα, το προιόν LabUpRI-LabUpBam κλωνοποιήθηκε στο φορέα EpGFPII (εικ.19) ενώ τα επιμέρους τμήματα της ανοδικής περιοχής στο φορέα PCRΙΙ (εικ.17, Invitrogen). Κατόπιν, απομονώθηκαν από τον PCRII και κλωνοποιήθηκαν στον EpGFPII. Το πλασμίδιο PCRII έχει μέγεθος 3,9 kb και στα άκρα του φέρει 3 Τ οπότε παρουσία λιγάσης μπορεί να γίνει η σύνδεση με τις ακραίες 3 Α που προστίθενται από την Taq πολυμεράση κατά την PCR. Εικ.17 Χάρτης του PCRII. Όλες οι αντιδράσεις λιγάσης είχαν τελικό όγκο 15μλ και περιείχαν ποσότητα ενζύμου 1μλ (400000u/ml). Η ποσότητα του πλασμιδίου ήταν 25-50ng και υπολογίστηκε ώστε το ένθεμα να είναι τρεις φορές περισσότερα μόρια δηλαδή 50-75ng. Σε όλες τις αντιδράσεις υπολογίστηκε ο λόγος j/i ώστε να είναι περίπου 2. Ακολούθησε επώαση στους 15 0 C για όλη τη νύχτα. 34

36 Kατασκευάσματα με GFP H πρώτη σειρά ελλειμμάτων κλωνοποιήθηκε στο φορέα 3.1/CT-GFP-TOPO (εικ.18). Πρόκειται για ένα πλασμίδιο που επιτρέπει τη συγχώνευση του PCR τμήματος με τη GFP πρωτείνη. Εμφανίζει πολύ μεγάλη απόδοση κατά την κλωνοποίηση ενώ δεν απαιτείται η χρήση της λιγάσης. Ο χάρτης του πλασμιδίου φαίνεται στην εικόνα 18, το μέγεθός του είναι 6157kb και φέρει το γονίδιο που προσδίδει στα βακτήρια ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλίνη, (amp). Όταν βακτήρια καλλιεργηθούν σε στερεό υπόστρωμα με amp τότε μόνο HindIII SpeI HindIII SpeI τα βακτήρια που έχουν μετασχηματιστεί θα μπορέσουν Εικ.18 Χάρτης του pcdna3.1\ct-gfp-topo. να αναπτυχθούν. Ο πλασμιδιακός φορέας διατίθεται ευθύγραμμος και στα άκρα του φέρει από μία 3 Τ, που είναι συμπληρωματική με την 3 Α που προσθέτει η Taq πολυμεράση κατά την PCR. Η ένωση των δύο τμημάτων γίνεται μέσω της τοποισομεράσης I που εξ αρχής βρίσκεται προσδεδεμένη στα άκρα του πλασμιδίου. Η GFP που χρησιμοποιείται στο συγκεκριμένο πλασμίδιο εμφανίζει τις ίδιες κορυφές απορρόφησης και εκπομπής με την άγριου τύπου, υψηλή διαλυτότητα στην E.coli για οπτική ανίχνευση των μετασχηματισμένων κυττάρων και 40 φορές μεγαλύτερη απόδοση φθορισμού σε σχέση με την άγριου τύπου GFP. Η αντίδραση κλωνοποίησης πραγματοποιήθηκε ως εξής: Αναμείχτηκαν 4λ από το προιόν PCR με 1λ διάλυμα αλάτων και 1λ πλασμίδιο pcdna3.1\ct- GFP-TOPO (10ng\μl). Η αντίδραση ανακινήθηκε ελαφρά και αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 20. Για τη δεύτερη σειρά ελλειμμάτων κλωνοποιήθηκε το τμήμα LabUpRI- LabUpBamHI που απομονώθηκε με PCR στο φορέα EpGFPII ο οποίος έχει προκύψει με τροποποίηση του παλαιότερου φορέα EpGFP (εικ.19 Arnone et al. 1997, Arnone et al. 1998). Oι εκκινητές κατασκευάστηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να φέρουν στα άκρα τους τη θέση αναγνώρισης για κάθε ένα από τα δύο ένζυμα EcoRI και BamHI. Το προιόν της PCR υπέστη προηγουμένως πέψη με τα ένζυμα EcoRI και BamHI που έχουν τις θέσεις αναγνώρισης στα άκρα. Ο φορέας αυτός φέρει το βασικό υποκινητή του γονιδίου Endo16, την περιοχή kozak του 35

37 CyIIa καθώς και το γονίδιο αναφοράς, GFP. Η κλωνοποίηση στο φορέα EpGFPII έγινε στις θέσεις περιορισμού EcoRI και BglII. Τα ένζυμα BglII και BamHI αφήνουν συμπληρωματικά άκρα και διαφέρουν μόνο στα δύο ακριανά νουκλεοτίδια. Δεν κατασκευάστηκε εκκινητής με θέση αναγνώρισης για τη BglII γιατί το ένθεμα φέρει εσωτερικά μία τέτοια θέση. Στο τέλος της κλωνοποίησης καταστρέφονται τόσο η θέση αναγνώρισης για τη BamHI όσο και για τη BglII. Για την αντίδραση λιγάσης χρησιμοποιήθηκαν ποσότητες όπως αναφέρεται στην παράγραφο αντίδραση λιγάσης. Tα κατασκευάσματα με τα διαδοχικά Εικ.19 Χάρτης του φορέα EpGFPII ανοδικά ελλείμματα παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της PCR όπως περιγράφηκε παραπάνω. Τα κατασκευάσματα GFP που φέρουν απομονωμένα τμήματα της ρυθμιστικής περιοχής χωρίς το βασικό υποκινητή του γονιδίου κλωνοποιήθηκαν στο φορέα EpGFPII. Τα προς κλωνοποίηση τμήματα απομονώθηκαν από τον PCRII με πέψη με τα ένζυμα EcoRI και BamHI και κλωνοποιήθηκαν αντίστοιχα στις θέσεις EcoRI και BglII του EpGFPII. Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης (Gel extraction) Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αυτή προκειμένου να απομονωθούν τα τμήματα που προέκυψαν μετά από πέψη των κατασκευασμάτων PCRII με τα ένζυμα EcoRI και BamHI και ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης. Για να πραγματοποιηθεί η απομόνωση DNA χρησιμοποιήθηκε το Kit «Nucleospin Extract II / Macherey Nagel Η μέθοδος περιλαμβάνει την απομόνωση της επιθυμητής ζώνης και την προσθήκη σε αυτή 200μλ buffer ΝΤ για κάθε 100μg gel. Ακολουθεί θέρμανση στους 50 ο C μέχρι το gel να διαλυθεί πλήρως. Κατόπιν, τα δείγματα μεταφέρονται στο φιλτράκι του Kit και φυγοκεντρούνται στις στροφές για 1 min. Το φιλτράκι ξεπλένεται με 600μλ ΝΤ3 και φυγοκεντρείται για 1 σε στροφές. Επαναλαμβάνεται η φυγοκέντρηση για 2. Η έκλουση 36

38 πραγματοποιείται με τη χρήση του διαλύματος ΝΕ και γίνεται σε τελικό όγκο 50μλ μετά από φυγοκέντρηση 1 σε στροφές. Παρασκευή δεκτικών βακτηρίων Παρασκευάστηκαν δεκτικά βακτήρια Ecoli χρησιμοποιώντας το στέλεχος DH10B με τη μέθοδο του χλωριούχου ρουβιδίου. Aκολουθήθηκαν ακριβώς οι οδηγίες όπως περιγράφονται στη μέθοδο αυτή. Διάλυμα Psi broth Bacto yeast extract 1.25 g Bacto tryptone 5 g Magnesium sulfate 1.25 g ρύθμιση του ph στο 7,6 με την χρήση potassiumhydroxide (στερεό KOH) σε V ΤΕΛ = 250 ml Διάλυμα Tfb I Potassium acetate g Ribidium chloride 2.42 g Calcium chloride g Magnesium chloride 2.0 g Glycerol ( 99.7 % ) 30ml (Τελικός όγκος 15 % v / v) ρύθμιση του ph στο 5,8 με την χρήση dilute acetic acid ( 1 N CH3COOH ) σε V ΤΕΛ = 200 ml Διάλυμα Tfb II MOPs 0.21 g Calcium chloride 1.1 g Ribidium chloride g Glycerol ( 99.7 % ) 15 ml (Τελικός όγκος 15 % v / v) ρύθμιση του ph στο 6,5 με την χρήση dilute NaOH ( 1 N NaOH ) σε V ΤΕΛ = 150 ml 37