Review Article Apoptosis in the ovary and follicular atresia Mazoochi T 1*, Ehteram M 2 1- Gametogenesis Research Center, Kashan University of Medical Sciences, Kashan, I. R. Iran. 2- Student Research Committee, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, I. R. Iran. Abstract: Received: 2018/01/24 Accepted: 2018/02/19 Background: In the ovary, growing follicles develop from a pool of primordial follicles constituted early in life. The majority of ovarian follicles undergo atresia. Follicular atresia is an important and negative process during the development of ovarian follicles. Cell apoptosis is believed to be involved in this process. This article is an overview of some researches on apoptosis in the ovaries and the factors involved in it. Materials and Methods: In this review article, the PubMed, Scopus, Embase, Current Content, and IranMedex databases were searched using keywords such as "apoptosis" and "ovary". The full-text articles published between 1997 and 2017 in English or Persian were included in the study. The genes involved in ovarian apoptosis and factors controlling follicle atresia and their role in ovarian follicular reserve and fertility were investigated. Results: Although follicular atresia occurs at all stages of follicular development, it has been shown that this process is dependent on the developmental stage and a large part of it is observed in the transitional stage between the preantral follicles and the antrum formation. Different paracrine and autocrine factors control the cell death of the ovary. Conclusion: Ovarian cells receive conflicting signals for survival and death, and it seems that the reason for determining the fate of cells in different stages of follicular development is the interaction between different signals. Keywords: Ovary, Atresia, Apoptosis, Follicle * Corresponding Author. Email: mazoochi45@yahoo.com Tel: 0098 913 361 0153 Fax: 0098 315 557 9028 Conflict of Interests: No Feyz, Journal of Kashan University of Medical Sciences, April, 2018; Vol. 22, No 1, Pages 112-119 Please cite this article as: Mazoochi T, Ehteram M. Apoptosis in the ovary and follicular atresia. Feyz 2018; 22(1): 112-9. 112
آپوپتوز در تخمدان و آترزي فوليكولي 2 *1 طاهره مازوچي محمد احترام مقدمه در دوران جنيني در تخمدان انسان تقريبا 7 ميليون سلول زايا وجود دارد كه تعداد زيادي از آنها از طريق Prenatal germ cell death از بين ميروند. اين مرگ سلولي بعد از تولد هم ادامه پيدا ميكند تا اينكه در زمان بلوغ تقريبا چهارصدهزار فوليكول در دو تخمدان وجود دارد. از اين تعداد فوليكول كه در شروع بلوغ وجود دارد تنها حدود 400 فوليكول در طول زندگي توليد مثلي يك زن تخمكگذاري و رها ميشود. ازآنجاييكه فوليكولهاي كمي در تخمدان افراد ياي سه ديده ميشوند بنابراين بيش از 99 درصد فوليكولهاي تخمداني در طول زندگي توليد مثلي از طريق فرايندي به نام Postnatal follicular atresia دژنره ميشوند.[2 1] خلاصه: سابقه و هدف: در تخمدان فوليكولهاي در حال رشد از مجموعه فوليكولهاي بدوي كه در ابتداي زندگي جنيني ايجاد شدهاند تكامل مييابد. بيشتر فوليكولهاي تخمداني دچار فرايند حذفي به نام آترزي فوليكولي ميشوند. آترزي فوليكولي يك فرآيند مهم و انتخاب منفي در طول رشد و تكوين فوليكولهاي تخمداني است. عقيده بر اين است كه مرگ سلولي آپوپتوز در اين فرآيند دخيل است. اين مقاله مروري است بر برخي پژوهشهايي كه در زمينه آپوپتوز در تخمدان و فاكتورهاي دخيل در آن انجام شده است. مواد و روشها: براي انجام اين مطالعه مروري ابتدا جستجو در بانكهاي اطلاعاتي PubMed, Scopus, Embase, Current Content, IranMedex با كلمات كليدي آپوپتوز و تخمدان انجام شد. سپس مقالات چاپ شده به زبانهاي انگليسي و فارسي از سال 1376 تا 1396 كه بهصورت تماممتن در دسترس بودند مطالعه شدند. ژنهاي دخيل در آپوپتوز تخمداني و فاكتورهاي كنترل كننده آترزي فوليكولي و نقش آنها در ذخيره فوليكولهاي تخمداني و باروري بررسي شدند. نتايج: اگرچه آترزي فوليكولي در همه مراحل تكوين فوليكولي اتفاق ميافتد اما مشخص شده است كه يك فرآيند وابسته به مرحله تكويني 1 دانشيار مركز تحقيقات توليد سلول هاي جنسي دانشگاه علوم پزشكي كاشان كاشان ايران 2 دانشجوي دندان پزشكي كميته تحقيقات دانشجويي دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي تهران ايران * نشاني نويسنده مسي ول: مركز تحقيقات توليد سلول هاي جنسي دانشگاه علوم پزشكي كاشان كاشان ايران دورنويس: 03155579028 تلفن: 09133610153 پست الكترونيك: mazoochi45@yahoo.com تاريخ دريافت: 1396/11/4 است و بخش زيادي از آن در مرحله انتقالي بين فوليكولهاي پرهآنترال و شروع تشكيل آنتروم مشاهده ميشود. فاكتورهاي پاراكرين و اتوكرين مختلفي مرگ سلولي تخمدان را كنترل ميكنند. نتيجهگيري: سلولهاي تخمدان سيگنالهاي متضادي را براي بقا و مرگ دريافت ميكنند و آنچه كه تعيينكننده سرنوشت سلولها در مراحل مختلف تكوين فوليكولي است تعامل بين سيگنالهاي مختلف است. واژگان كليدي: تخمدان آپوپتوز آترزي فوليكول دو ماهنامه علمي پژوهشي فيض دوره بيست و دوم شماره 1 فروردين و ارديبهشت 97 صفحات 112-119 تاريخ پذيرش نهايي: 1396/11/30 اترزي فوليكولي يك فرآيند مهم و انتخاب منفي در طول رشد و تكوين فوليكولهاي تخمداني است كه تا حد زيادي به سرنوشت فوليكولهاي تخمداني و باروري وابسته است [4 3]. اين فرايند اگرچه در همه مراحل تكوين فوليكولي اتفاق ميافتد اما مشخص شده است كه يك فرآيند وابسته به مرحله تكويني است و بخش زيادي از آن در مرحله انتقالي بين فوليكولهاي پرهآنترال و شروع تشكيل آنتروم مشاهده شده است [5-7]. عقيده بر اين است كه مرگ سلولي آپوپتوز در اين فرآيند دخيل است [8-10]. گنادو- تروپينها فاكتورهاي بقايي هستند كه از آترزي جلوگيري ميكنند. همچنين فاكتورهاي رشد IGF-1 bfgf TGF-α EGF و سيتوكين IL-1β بهعنوان فاكتور بقاي فوليكولي شناسايي شدهاند. استروژن و اينهيبين بهعنوان مهاركننده آترزي فوليكولي شناخته شدهاند. درحاليكه آندروژنها TNFα IL-6 activin FasL (Tumor Necrosis Factor-α) و GnRH آترزي را القا ميكنند [11-14]. نقش آنتيژن Fas و مسير مرگ با واسطه p53 بهعنوان نقش مركزي در القا آترزي فوليكولي مطرح شده است [15]. همچنين مطالعات نشان دادهاند كه آترزي فوليكولي با آپوپتوز سلولهاي گرانولوزاي فوليكولي آغاز شده و سپس ديگر تركيبات فوليكولي دچار مرگ ميشوند [10 5]. تغييرات مورفولوژيك كه مشخصه آپوپتوز است (حبابدار شدن 113
مازوچي و احترام سيتوپلاسم متراكم شدن كروماتين قطعهقطعه شدن سلولي و تشكيل اجسام آپوپتوتيك) ابتدا در سلولهاي گرانولوزا و سپس در لايه سلولهاي تكا ديده ميشود. همچنين حضور فعاليت اندونوكلي از وابسته به / +2 Ca كه مشخصه بيوشيميايي mg 2+ آپوپتوز بوده و بر تغييرات مورفولوژيك مقدم است بهطور مشخص در سلولهاي گرانولوزا و سپس سلولهاي تكا ديده شده است [16]. اگرچه وقوع مرگ سلولي طبيعي در فوليكولهاي تخمداني اولين بار بهوسيله [17] Flemming در سال 1885 و براساس مشاهدات مورفولوژيكي توصيف شده است و عليرغم وقوع زياد آن حوادث مولكولي اين پديده هنوز بهخوبي مشخص نشده است. در اين مطالعه مروري به بحث پيرامون ژنهاي درگير در آپوپتوز فوليكولهاي تخمداني و مراحل آن پرداختهايم. مواد و روشها براي انجام اين مطالعه مروري ابتدا جستجو در بانكهاي اطلاعاتي Content, PubMed, Scopus, Embase, Current IranMedex با كلمات كليدي آپوپتوز تخمدان و آترزي فوليكولي انجام شد. اين مطالعات مقالات چاپ شده به زبانهاي انگليسي و فارسي از سال 1997 تا 2017 به صورت مقاله كامل را شامل ميشود. نتايج روشهاي بررسي آترزي فوليكولي و آپوپتوز در مقالات: در تعدادي از مطالعات جهت بررسي آپوپتوز فوليكول- هاي تخمداني ابتدا آترزي القا شده است بدينمنظور از روشهاي مختلفي استفاده شده است مثل حذف گنادوتروپينها بهوسيله هيپوفيزكتومي يا كاربرد فنوباربيتون و يا استفاده از ecg Post ) PMSG و يا (ecoin Choronic Gonadotropin) (Menopausal Gonadotrophin كه اين تركيبات رشد و تكوين فوليكولهاي تخمداني را براي 2-3 روز تحريك كرده سپس بهعلت كاهش سطح تروفيكها فوليكولها دچار آترزي ميشوند. در مطالعه Hughes و همكاران [16] با القا اترزي فوليكولي بهوسيله تزريق 15 IU از PMSG و سپس كاهش سطح حمايت تروفيكي حاصل از متابوليسم گنادوتروپينها نشان دادند كه زودترين علامت مورفولوژيك آترزي 4 روز پس از تزريق PMSG مشاهده ميشود. استروژن سرم در روز سوم از سطح پايه تا 7 برابر گروه كنترل افزايش يافته اما از روز چهارم به بعد كاهش مييابد. برعكس پروژسترون تا روز سوم در سطح پايه باقي مانده ولي در روز چهارم و پنجم پس از تزريق بهترتيب 3 و 8 برابر ميشود. همچنين مشخص شد كه با القا آترزي فوليكولي توليد استروي يدها از استروژن به پروژسترون شيفت پيدا ميكند. 200μl در 15 IU) ecg و همكاران در سال [15] 1999 از Kim سالين) براي القا تكوين فوليكولي و آترزي استفاده كردند و نشان دادند كه القا آپوپتوز سلول گرانولوزا و آترزي فوليكول فعاليت Fas را در يك مكانيسم وابسته به p53 سبب ميشود. همچنين بيان بيش از اندازه ژن p53 سبب افزايش پروتي ين Fas و آپوپتوز شديد ميشود. Uma و همكاران [10] در تحقيقي به تعيين زمان شروع آپوپتوز سلولهاي گرانولوزاي فوليكولهاي پرهاوولتيوري در ميمون پس از قطع گنادوتروپينها پرداختند. حضور قطعات با وزن مولكولي كم (LMV) پس از 48 ساعت از قطع گنادو- تروپينها ديده شد. اما ژل الكتروفورز طرح نردباني DNA را پس از 72 ساعت نشان داد. با شروع آپوپتوز بيان mrna براي Bax كاسپاز 2 و 3 افزايش نشان داد. به مسيرهاي تعيين كننده مرگ يا بقا فوليكول: در سطح مولكولي فرآيند آپوپتوز سلولهاي گرانولوزا 3 فاز تقسيم ميشود [18]. فاز شروع ميتواند به وسيله فاكتورهاي خارجي مانند سيتوكينها Fas (FasL) TNFα Tumor necrosis factor related (TRAIL) Ligand apoptosis inducing ligand پروتي ينهاي پوشش ويروسي و يا قطع فاكتورهاي رشد آغاز شود. همچنين ميتواند بهوسيله فاكتورهاي داخلي شامل استرسهاي اكسيداتيو اشعه يا فعاليت ژنهاي سركوب كننده تومور مانند p53 و رتينوبلاستوم القا شود [19]. حالت اول را با واسطه گيرنده و دومي را مستقل از گيرنده ميگويند. هركدام از اين مسيرها يك يا چند كاسپاز آغازين مانند كاسپاز 8 و 9 را درگير ميكند. اين فاز قابل برگشت است و ميتواند در بعضي موارد بهوسيله مسيرهاي كه سريعا فعال شدهاند ممانعت شود. فاز دوم فاز اجرايي است و مشخصه اين فاز تغيير در غشاء سلول (مانند حبابدار شدن) قطعهقطعه شدن هسته متراكم شدن كروماتين و دژنره شدن DNA است. اين فاز غيرقابل برگشت است و بهوسيله فعاليت كاسپازهاي عمل كننده مانند 6 3 و 7 كه آن هم در نتيجه فعاليت كاسپازهاي آغازين بوده است انجام ميگيرد. در فاز اختتام دژنره شدن پروتي ينها تشكيل اوليگو- نوكلي وزوم حبابدار شدن غشا و تشكيل اجسام آپوپتوتيك انجام ميشود. درنهايت فاگوسيتوز اجسام آپوپتوتيك قطعهقطعه شده به- وسيله فاگوسيتها و سلولهاي زنده مجاور از طريق يك فرآيند غيرالتهابي صورت ميگيرد [20 11 1]. در نوع دوم مرگ سلولي كه از طريق مسير داخلي و در حقيقت غيروابسته به گيرنده انجام 114
آپوپتوز در تخمدان و اترزي... ميگيرد در نهايت اختلالات غيرقابل برگشتي در غشاء ميتوكندري ايجاد ميكند. چنين تغييراتي سبب آزاد شدن سيتوكروم C ميتو- كندريايي و second mitochondria drived Diablo/smac activator of caspases به داخل سيتوزول ميشود. هركدام از اين حوادث سبب فعال شدن كاسپازهاي آغازين و آبشار كاسپازي ميشود. پروتي ينهاي آنتيآپوپتوتيك مثل اعضاي خانواده آنتي- آپوپتوتيك Bcl-2 و پروتي ينهاي بقا وجود دارد كه پيشرفت آپوپتوز را در مراحل مختلف مسير مرگ سلولي بلوك ميكند. اين پروتي ينها يا بهطور مستقيم از آزاد شدن و يا فعاليت فاكتورهاي ميتوكندريايي مثل سيتوكروم C جلوگيري ميكنند يا از فعاليت كاسپازهاي آغازين جلوگيري كرده و يا اينكه فعاليت كاسپازهاي اجرايي را خنثي ميكنند. در فوليكولهاي بدوي و اوليه ميزان بقا بستگي به فاكتورهاي بقاي مشتق شده از تخمك دارد. در اين مرحله از تكوين فوليكولي مرگ سلولهاي زايا ميتواند در نتيجه چندين عامل باشد: دسترسي ناكافي به فاكتورهاي بقا مانند Stem (LIF) Insulin-like growth factor (IGF-1) cell factor Growth and (GDF-9) يا Leukemia inhibitory factor factor-9 differentiation و يا نتيجه نقص ژنتيكي و يا عوامل شيميدرماني كه ساخت lipid based second messenger (ceramide) را پيش ميبرند. برخلاف فوليكولهاي بدوي و اوليه در فوليكولهاي پرهآنترال كه وابسته به FSH هستند فاكتور اوليه در تعيين سرنوشت فوليكول زنده ماندن سلولهاي گرانولوزا است كه سلول ژرم را تغذيه ميكند. لايه گرانولوزا ممكن است سيگنالهاي بقا سلولي را از سلولهاي ژرم و يا لايه تكا مجاور دريافت كند. در فوليكولهاي آنترال مكانيسمهاي مختلفي ميتواند سيگنال مرگ فوليكولي باشد. دو الگوي مشخص مرگ سلولي در اين مرحله وجود دارد: آترزي آنترال كه در آن مرگ سلولي آپوپتوتيك ابتدا در نزديكترين سلولهاي گرانولوزا به آنتروم صورت ميگيرد و ممكن است بهوسيله عواملي از لايه گرانولوزا يا حتي تخمك منشا گرفته باشد. حالت دوم آترزي بازال است كه ابتدا مرگ سلولي در سلولهاي گرانولوزا نزديك به غشاء پايه صورت ميگيرد و ممكن است بهوسيله فاكتورهاي خارجي آغاز شده باشد [1]. بدينترتيب مسيرهاي متعددي وجود دارد كه مرگ يا بقا سلول را تعيين ميكند. اما آنچه كه نقش مهمي در تعيين سرنوشت سلولهاي ژرم و سوماتيك تخمدان دارد تعامل بين فاكتورهاي اندوكرين پاراكرين و اتوكرين و همچنين تعامل بين پروتوانكوژنها ژنهاي مهاركننده تومور ژنهاي بقا و ژنهاي مرگ است. فاكتورهاي اندوكرين كنترلكننده مرگ سلولي تخمدان: گنادوتروپينها FSH و LH هورمونهاي اصلي هستند كه سيگنالهاي بقا را به فوليكولها انتقال ميدهند. آنها اين كار را از طريق مسير (PKA) Protein Kinase A و بالا بردن سطح داخل سلولي camp انجام ميدهند [11]. پاسخ سلولها به camp بستگي به شدت و دوره آن و همچنين به درجه بلوغ سلولهاي گرانولوزا دارد. براي مثال FSH بهعنوان فاكتور بقا در سلولهاي گرانولوزاي پرهآنترال است درحاليكه hcg آپوپتوز را در سلولهاي لوتي يني شده القا ميكند [12]. گنادوتروپينهاي هيپوفيز مهمترين فاكتور بقا براي سلولهاي فوليكولي تخمدان هستند زيرا تيمار با گنادوتروپينها بيان فاكتورهاي بقا موضعي را در فوليكولهاي تخمداني افزايش ميدهد. بهطور ويژه گنادو - تروپينها آپوپتوز سلولهاي تخمداني را بهوسيله فعاليت مسير وابسته به camp و افزايش توليد فاكتورهاي پاراكرين و اتوكرين مانند استروژنها Interleukin-1(IL-1) نيتريك اكسايد و IGF-1 مهار ميكنند. اين فاكتورها بقا سلول را از طريق فعاليت گيرنده هستهاي استروژن مسير وابسته به cgmp و فسفريلاسيون پروتي ين تيروزين بهترتيب پيش ميبرند [17]. مشخص شده است كه سلولهاي گرانولوزاي جدا شده از فوليكولهاي كوچك متوسط و بزرگ گاوي موقعي كه در محيط كشت فاقد سرم كشت داده ميشوند آپوپتوز خودبهخودي را شروع ميكنند. اما اضافه كردن FSH به محيط كشت آپوپتوز را در فوليكولهاي كوچك و متوسط مهار ميكند. همچنين استفاده از IGF-1 10 ng/ml آپوپتوز را در سلولهاي گرانولوزاي كشت شده از فوليكولهاي كوچك مهار كرده اما غلظت بيشتر آن mg/ml) 100) برعكس آپوپتوز را تحريك ميكند. استفاده از FSH اين اثر تحريكي دوز بالاي IGF-1 را ممانعت ميكند. بدينترتيب همراهي FSH و IGF-1 ميتواند آپوپتوز را در سلولهاي گرانولوزاي كشت شده گاوي كاهش دهد [14 13]. فاكتورهاي پاراكرين و اتوكرين كنترل كننده مرگ سلولي تخمدان هورمونهاي استروي يدي تخمدان به- عنوان فاكتورهاي اتوكرين هستند كه ممكن است يك نقش مهم در كنترل مرگ سلولي تخمدان داشته باشند. استروژن بهعنوان يك فاكتور بقا مهم هم در جسم زرد و هم سلولهاي گرانولوزا عمل ميكند. پروژسترون بقا سلول گرانولوزا را حفظ ميكند. گلوكو- كورتيكوي يدها مانند هيدروكورتيزون و دگزامتازون هم بهعنوان محافظت كننده بر عليه آپوپتوز مشخص شدهاند. اگرچه مكانيسم اثر هورمونهاي استروي يدي مشخص نيست اما ميتواند از طريق افزايش ساخت Bcl-2 باشد [14]. فاكتورهاي رشد و تركيبات ماتريكس خارج سلولي (ECM) كه در غشاء پايه 115
مازوچي و احترام فوليكول مستقر هستند و همچنين سيتوكينها از فاكتورهاي پاراكرين كنترل كننده مرگ سلولي تخمدان هستند كه مهار كننده و يا تحريك كننده تمايز سلولهاي گرانولوزا هستند. اغلب آنها يك اثر همافزايي با تحريك گنادوتروپ ني ها براي استروي يدوژنز دارند. از ميان تركيبات غشاء پايه لامينين كه در حدود 35 درصد غشاء پايه را تشكيل ميدهد روي زنده ماندن سلولهاي گرانولوزا اثر مثبت دارد اما استروي يدوژنز را تحريك نميكند. (bfgf) basic Fibroblast Growth Factor استروي يدوژنز را تحريك و آپوپتوز را مهار ميكند. بدينترتيب ميتوان گفت غشاء پايه بهدليل داشتن فاكتورهاي بقا اثر محافظتي روي سلولهاي گرانولوزاي نزديك خود دارد و از فرآيند آپوپتوز جلوگيري ميكند. فاكتور- هاي رشد مثل (EGF) IGF Epidermal Growth Factor انسولين و FGF از طريق گيرندههاي وابسته به تيروزين كيناز رشد سلولهاي گرانولوزاي نابالغ را پيش ميبرند اما روي سلولهاي بالغ بيشتر اثر تمايزي داشته و استروي يدوژنز را افزايش ميدهند [14]. ازمجموع اين مطالب مشخص ميشود كه سلولهاي تخمدان سيگنالهاي متضادي را براي بقا و مرگ دريافت ميكنند و آنچه كه تعيينكننده سرنوشت سلولها در مراحل مختلف تكوين فوليكولي است تعامل بين سيگنالهاي مختلف است. استروي يدوژنز و آپوپتوز: مطالعات نشان داده است كه در طول ساعات اوليه بعد از القاء آپوپتوز در سلولهاي گرانولوزا توليد پروژسترون برخلاف انتظار افزايش مييابد [21 14]. مطالعات ميكروسكوپ الكتروني و ايمنوفلورسنس مشخص كرده است كه ميتوكندري تماميت و ساختار ظريف خودش را حفظ ميكند. ميتوكندري دستگاه بيوشيميايي مسي ول براي تبديل كلسترول به پروژسترون است [22]. در مراحل اوليه آپوپتوز جابهجايي ميتوكندري به منطقه اطراف هسته و غياب آن در حبابهاي آپوپتوتيك سبب ادامه فعاليت استروي يدوژنيك ميشود. كلاستر شدن ميتوكندري و قطرات ليپيد در سلولهاي آپوپتوتيك ممكن است حتي كارآيي فرآيند استروي يدوژنيك را افزايش دهد. مشخص شده است كه تا 24 ساعت اول شروع تحريك آپوپتوتيك استروي يدوژنز افزايش مييابد [21]. حفظ ميتوكندري در طول مراحل اوليه آپوپتوز سلولهاي گرانولوزا تنظيم ميكند. يكي از آنها در عمل ميتوكندري تداخل ايجاد ميكند مانند آپوپتوز القاء شده بهوسيله p53 در شرايط استرس كه سبب فعاليت Bax و آزادسازي سيتوكروم C ميشود. مسير ديگر براي آپوپتوز سلولهاي گرانولوزا مسيري است كه ميتوكندري را دور ميزند. در اين مسير camp ميتواند آپوپتوز را بهوسيله فعاليت گرانزيم B القاء كند. گرانزيم B بهوسيله پرفورين از گرانولهاي ثانويه آزاد ميشود و بهطور مستقيم سوبستراهاي مرگ را ميشكند. مشخص شده است كه پروتي ين گرانزيم B بهطور تعجبآور تجمع يافته و به قطعات مولكولي فعال تبديل ميشود كه ميتواند بهطور مستقيم يك آبشار كاسپازي را كه تخريب ميتوكندري را دور ميزند فعال كند [22 21]. تحقيقات بيشتري لازم است تا تعيين شود كه كدام مسير ابتدا شروع ميشود اما بهنظر ميرسد باتوجه به حفظ فعاليت استروي يدوژنز در سلولهاي گرانولوزا در مراحل اوليه آپوپتوز مسير دوم كه تخريب ميتوكندري را سبب نميشود ابتدا شروع ميشود. ژنهاي درگير در آترزي فوليكولي: يك گروه كليدي فاكتورهاي داخل سلولي تنظيم كننده آپوپتوز پروتي ينهاي خانواده Bcl-2 هستند. اعضاي اين خانواده به پروتي ينهاي آنتيآپوپتوتيك Bcl-2) و (Bcl xl و پروتي ين- هاي پروآپوپتوتيك Bax) و (BAD تقسيم ميشوند. پروتي ينهاي آنتي و پروآپوپتوتيك مرگ سلولي را بهوسيله اتصال به همديگر و تشكيل هترودايمر تنظيم ميكنند. برطبق اين مدل بين اعضاي خانواده آنتي و پروآپوپتوتيك Bcl-2 در هر سلول تعادلي وجود دارد و تراكم نسبي اين دو گروه از پروتي ينها تعيين ميكند كه آيا سلول باقي بماند يا آپوپتوز را تحمل كند. از بيش از 15 عضو خانواده Bcl-2 در هر بافت يا سلول تعدادي از آنها بهطور ويژه بيان ميشوند [23]. براي بررسي اين كه آيا سيستم Bcl-2 در تنظيم آپوپتوز سلول تخمداني در شرايط درونتني مهم است موشهاي ترانسژنيك كه Bcl-2 در تخمدان آنها بيشبيان شده بود ايجاد شدند. در اين موشها مهار آپوپتوز سلول فوليكولار و افزايش فوليكولوژنزيس ديده شد كه نشاندهنده اين است كه سيستم Bcl-2 در تخمدان عمل ميكند [24]. Choi و همكاران [25] سطح بيان ژنهاي آپوپتوز وابسته به ميتوكندري (p53 Bcl- 2 و (Bax را در سلولهاي گرانولوزاي كشت شده بررسي كردند از بين ژنهاي وابسته به ميتوكندري p53 دقيقا با آپوپتوز سلول- هاي گرانولوزا در طول مراحل تكويني فوليكولي ارتباط داشت. Kim و همكاران [26] طي مطالعهاي به درگيري سيستم غيرمعمول است زيرا در سيستمهاي سلولي ديگر خيلي سريع تخريب شده و نشت سيتوكروم C به داخل سيتوپلاسم صورت ميگيرد [14]. اين احتمال وجود دارد كه در سلولهاي گرانولوزا انتقال يك سيگنال آپوپتوتيك ميتواند ميتوكندري را دور بزند [14]. بهنظر ميرسد حداقل 2 مسير وجود دارد كه آپوپتوز را در 116
آپوپتوز در تخمدان و اترزي... Fas/FasL و p53 در آپوپتوز سلولهاي گرانولوزا در مراحل مختلف فوليكولي پرداختند. اين تحقيق نشان داد كه تغيير در محتواي پروتي ين p53 سلولهاي گرانولوزا در طول تكوين با بيان Fas همراه است. همچنين بيشبيان ژن p53 در شرايط برونتني سبب افزايش در محتواي پروتي ين Fas و آپوپتوز شديد ميشود. Bcl- و همكاران [27] با روش ايمنوهيستوشيمي فعاليت Deplao 2 را در 75 درصد فوليكولهاي ثانويه انسان مشاهده كردند اما در همه نمونهها منفي بود. بدينترتيب ميتوان گفت Bcl-2 p53 سبب فرار سلولها از فرآيند آپوپتوز ميشود. منفي بودن p53 نشاندهنده اين است كه ژنوم در سلولهاي فوليكولار زنان در سن توليد مثلي تماميت خود را حفظ ميكند. در اين مطالعه رنگآميزي TUNEL در 23/4 درصد فوليكولهاي بدوي و 23/2 درصد فوليكولهاي اوليه هم در تخمك و هم در گرانولوزا مثبت بود در- حاليكه در همه فوليكولهاي ثانويه منفي بود. Zeuner و همكاران [28] آپوپتوز را در اجزاء مختلف فوليكولهاي آنترال گاو بررسي كردند. فوليكولها براساس مورفولوژي به 3 گروه تقسيم شدند فوليكولهاي درجه I بهترين مورفولوژي را داشتند. در تمام اجزاء سه گروه فوليكولي يعني سلولهاي كومولوس سلولهاي گرانولوزاي آزاد در مايع فوليكولي و سلولهاي ديواره فوليكولي (تكا و گرانولوزاي مجاور غشاء پايه) آپوپتوز مشاهده شد. فقط در سلولهاي كومولوس تعدادي از فوليكولهاي درجه I و II آپوپتوز مشاهده نشد. ميتوان گفت احتمالا در هر زمان درجه خاصي از سلولهاي آپوپتوتيك درون فوليكول وجود دارد فقط موقعي كه به حد آستانه برسد ميتواند روي بقا تخمك تا ثيرگذار باشد. Johnson و همكاران در سال [29] 2002 به بيان Survivin در سلولهاي گرانولوزاي مرغ پرداختند. Survivin يكي از اعضاي خانواده پروتي ينهاي مهاركننده آپوپتوز (IAPs) است [30]. Tringler و همكاران [31] در سال 2004 بيان survivin را با روش ايمنوهيستوشيمي در تومورهاي خوشخيم و بدخيم تخمدان نشان دادند. XY و همكاران در سال [32] 2004 بيان بيشتر survivin را در كارسينوماي اپيتليال تخمداني نسبت به تومور خوشخيم و تخمدان طبيعي و همچنين ارتباط آن را با بيان Fas/FasL نشان دادند. براساس نتايج اين تحقيق survivin در تخمدان طبيعي بيان نشده بود. در تحقيقي كه Slot و همكاران [33] در سال 2006 انجام دادند بيان و توزيع پروتي ينهاي Fas Bax Bcl-2 FasL و كاسپاز 3 را در حالت فعال و غيرفعال در سرتاسر سيكل تخمداني موش صحرايي بررسي كردند. نتايج تحقيق نشان داد كه در بافت تخمداني در سرتاسر سيكل تخمداني اين پروتي ينها بيان ميشوند. ايمنوهيستوشيمي هم پروتي ين آنها را نشان داد اما مقدار اين پروتي ينها در فازهاي مختلف سيكل تخمداني متفاوت بود. پروتي ينهاي Fas Bax و كاسپاز 3 در دي- استروس بالاترين حد بود و بهطرف متاستروس كاهش مييافت. برعكس سطح پروتيي ن Bcl-2 FasL در دياستروس پايينترين حد بود و به طرف متاستروس افزايش مييافت. همچنين در مقاطع بافتي توزيع اين پروتي ينها در فوليكولهاي مختلف مقايسه شد. پروتيي ن FasL Fas و Bax بيشتر در سلولهاي تكاي فوليكولهاي آترتيك آنترال و پرهآنترال ديده شد درحاليكه پروتي ين Bcl-2 در حد متوسط در سلولهاي گرانولوزا و تكاي فوليكولهاي پرهآنترال و آنترال سالم ديده شد. همچنين پروتي ين Fas و FasL در سلولهاي گرانولوزاي فوليكولهاي پرهآنترال سالم مشاهده نشد. مازوچي و همكاران [34] در سال 2009 بيان نيمهكمي ژنهاي Survivin FasL Fas p53 Bax و Bcl-2 را در فوليكولهاي پرهآنترال و آنترال تخمداني نشان دادند. Glamoclija و همكاران [35] در سال 2005 به بررسي آپوپتوز و بيان شكل فعال كاسپاز 3 در بافتهاي تخمداني زناني كه تخمدان آنها به دلايلي خارج شده بود و همچنين سلولهاي گرانولوزاي فوليكولي زناني كه براي IVF مراجعه كرده بودند پرداختند. در بافت تخمدان انسان در فوليكولهاي بدوي و اوليه با رنگآميزي TUNEL آپوپتوزي مشاهده نشد. همچنين آپوپتوز فقط در سلولهاي گرانولوزاي فوليكولي آنترال آترتيك ديده شد. سلول- هاي گرانولوزا براساس ظاهر مورفولوژيك به سالم و آپوپتوتيك تقسيم شدند. همه سلولهاي گرانولوزاي با مورفولوژي آپوپتوز كاسپاز 3 فعال را بيان ميكردند اما با روش TUNEL مقدار كمي DNA قطعهقطعه شده مشاهده شد. تعداد زيادتر سلولهاي گرانولوزاي مثبت براي كاسپاز 3 نسبت به TUNEL پيشنهاد مي- كند كه فعاليت كاسپاز 3 در مقايسه با قطعهقطعه شدن DNA زودتر اتفاق ميافتد و همچنين يك پديده طولانيتر است. نتايج تحقيق نشان داد كه در سلولهاي گرانولوزاي انسان آپوپتوز وابسته به كاسپاز 3 اتفاق ميافتد و موقعي كه فوليكولها رشد خود را آغاز ميكنند كاسپاز 3 به شكل فعال در ميآيد. بعد از تشكيل اوليه آنتروم فعاليت كاسپاز 3 يك فرآيند طبيعي فيزيولوژي براي اترزي و لوتي ينه شدن فوليكولها است. نتيجهگيري باتوجه به اينكه آپوپتوز در طيف وسيعي از وقايع تخمداني ازجمله حذف سلولهاي زايا قبل از تولد آترزي فوليكولي و حذف جسم زرد دخيل ميباشد در ذخيره فوليكولي و باروري موثر است. در مجموع از مطالعه مقالات مشخص ميشود 117
مازوچي و احترام كه تعامل بين سيگنالهاي مختلف عامل تعيينكننده سرنوشت فوليكولهاي تخمداني است. از آنجاييكه القاء و اجراي حوادث آپوپتوتيك بهوسيله چندين مسير سيگنالينگ بهقوع ميپيوندد محققين درصدد هستند كه اين مسيرها را در آترزي فوليكولي مشخص نمايند. مسير وابسته به ميتوكندري يكي از مهمترين مسيرهاي آپوپتوز است كه طي آن سيتوكروم C بهسرعت از ميتوكندري به داخل سيتوزول آزاد ميشود. چندين ژن مانند p53 Bax و Bcl-2 مثبت و يا منفي با آزاد شدن سيتوكروم C ارتباط دارند. آزاد شدن سيتوكروم C كاسپاز 3 را فعال ميكند و عقيده بر اين است كه مجري نهايي مرگ سلولي آپوپتوز است. ازآنجاييكه سلولهاي گرانولوزا محل اوليه آپوپتوز در طول آترزي فوليكولي شناخته شدهاند بررسي ژنهاي وابسته به ميتوكندري در اين سلولها در مراحل مختلف فوليكولي ميتواند الگوي آپوپتوز را مشخص نمايد. تشكر و قدرداني نويسندگان مقاله برخود لازم ميدانند از زحمات تمامي عزيزاني كه در گردآوري مقالات ما را ياري كردند سپاسگزاري References: نمايند. [1] Johnson AL. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles. Anim Reprod Sci 2003; 78(3-4): 185-201. [2] Rossi V, Lispi M, Longobardi S, Mattei M, Di Rella F, Salustri A, et al. LH prevents cisplatininduced apoptosis in oocytes and preserves female fertility in mouse. Cell Death Differ 2017; 24(1): 72 82. [3] Dong Z, Huang M, Liu Z, Xie P, Dong Y, Wu X, et al. Focused screening of mitochondrial metabolism reveals a crucial role for a tumor suppressor Hbp1 in ovarian reserve. Cell Death Differ 2016; 23(10): 1602 14. [4] Li J, Gao H, Tian Z, Wu Y, Wang Y, Fang Y, et al. Effects of chronic heat stress on granulose cell apoptosis and follicular atresia in mouse ovary. J Animal Sci Biotechnol 2016; 7(1): 57. [5] Hsu SY, Hsueh AJ. Tissue specific Bcl-2 protein partners in apoptosis: an ovarian paradigm. Physiol Rev 2000; 80: 593-614. [6] Mazoochi T, Salehnia M. Rezazadeh Valojerdi M, Mowla SJ. Morphologic, ultrastructural, and biochemical identification of apoptosis in vitrifiedwarmed mouse ovarian tissue. Fertil Steril 2008; 90(4): 1480-6. [7] Yang MY, Rajamahendran R. Morphological and biochemical identification of apoptosis in small, medium and large bovine follicles and the effects of FSH and IGF-1 on spontaneous apoptosis in cultured bovine granulosa cells. Boil Reprod 2000; 62(5): 1209-17. [8] Kaipia A, Hsueh AJ. Regulation of ovarian follicle atresia. Anna Rev Physiol 1997; 59: 349-63. [9] Johnson AL, Bridgham JT. Caspase- mediated apoptosis in the vertebrate ovary. Reproduction 2002; 124(1): 19-27. [10] Uma J, Muraly P, Verma-kumar S, Medhamurthy R. Determination of onset of apoptosis in granulosa cells of the preovulatory follicles in the bonnet monkey. Biol Reprod 2003; 69(4): 1379-87. [11] Hsueh AJ, Billig H, Tsafriri A. Ovarian follicle atresia: a hormonally controlled apoptotic process. Endocr Rev 1994; 15(6): 707-24. [12] Aharoni D, Dantes A, Oren M, Amsterdam A. camp mediated signals as determinants for apoptosis in primary granulosa cells. Exp Cell Res 1995; 218(1): 271-82. [13] Yang MY, Rajamahendran R. Morphological and biochemical identification of apoptosis in small, medium and large bovine follicles and the effects of FSH and IGF-1 on spontaneous apoptosis in cultured bovine granulosa cells. Boil Reprod 2000; 62(5): 1209-17. [14] Amsterdam A, Gold RS, Hosokawa K, Yoshida Y, Sasson R, Jung Y, et al. Crosstalk among multiple signaling pathways controlling ovarian cell death. Trends Endoctinal Metab 1999; 10(7): 255-62. [15] Kim JM, Yoon YD, Tsaong BK. Involvement of the fas/fasl system in p53-mediated granulosa cell apoptosis during follicular development and atresia. Endocrinology 1999; 140(5): 2307-17. [16] Hughes F, Gorospe W. Biochemical identification of apoptosis. Endocrinology 1991; 129(5): 2415-22. [17] Hsu SY, Hsueh AJ. Hormonal Regulation of Apoptosis: An ovarian perspective. TEM 1997; 8(5): 207-13. [18] Tilly JL. The Molecular Basis of ovarian Cell death during germ attrition, follicular atresia, and luteolysis. Front Biosci 1996; 1: 1-11. [19] Mazoochi T, Khamechian T, Ehteram M, Kashani HH. The effect of melatonin on expression of p53 and ovarian preantral follicle development isolated from vitrified ovary. Comparative Clin Pathol 2018; 27(1): 83-88. [20] Ghafari F, Rajabi MR, Mazoochi T, Taghizadeh M, Nikzad H, Atlasi MA. Comparing apoptosis and necrosis effects of Arctium lappa root extract and doxorubicin on MCF7 and MDA-MB- 118
آپوپتوز در تخمدان و اترزي... 231 cell lines. Asian Pacific J Cancer Prevention 2017; 18(3): 795. [21] Amsterdam A, Sasson R, Keren-Tal I, Aharoni D, Dantes A, Rimon E, et al. Alternative pathways of ovarian apoptosis: death for life. Biochem Pharmacol 2003; 66(8): 1355-62. [22] Keren-Tal I, Suh BS, Dantes A, Lindner S, Oren M, Amsterdam A. Involvement of p53 expression in camp mediated apoptosis in immortalized granulosa cell. Exp Cell Res 1995; 218(1): 283-95. [23] Hussein MR. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Hum Reprod Update 2005; 11(12): 162-77. [24] Leo CP, Hsu SY, Chun SY, Bae HW, Hsueh AJ. Characterization of the antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 and the stimulation of its message by gonadotropins in the rat ovary. Endocrinology 1999; 140(12): 5469-77. [25] Choi D, Hwang S, Lee E, Yoon S, Yoon B, Bae D. Expression of mitochondria dependent apoptosis genes (p53, Bax, Bcl-2) in rat granulosa cells during follicular development. J Soc Gynecol Investig 2004; 11(5): 311-7. [26] Kim JM, Yoon YD, Tsaong BK. Involvement of the fas/fasl system in p53-mediated granulosa cell apoptosis during follicular development and atresia. Endocrinology 1999; 140(5): 2307-17. [27] Depalo R, Nappi L, Loverro G, Bettocchi S, Caruso ML, Valentini AM, et al. Evidence of apoptosis in human primordial and primary follicles. Hum Reprod 2003; 18(12): 2678-82. [28] Zeuner A, Muller K, Reguszynski K, Jewgenow K. Apoptosis within bovine follicular cells and its effect on oocyte development during in vitro maturation. Theriogenology 2003; 59(5): 1421-33. [29] Johnson AL, langer JS, Bridgham JT. Survivin as a cell cycle - related and antiapoptotic protein in granulosa cells. Endocrinology 2002; 143(9): 3405-13. [30] Eslami M, Khamechian T, Mazoochi T, Ehteram H, Sehat M, Alizargar J. Evaluation of survivin expression in prostate specimens of patients with prostate adenocarcinoma and benign prostate hyperplasia underwent transurethral resection of the prostate or prostatectomy SpringerPlus 2016; 5(1): 621. [31] Tringler B, Lehner R, Shroyer Al, Shroyer KR. Immunohistochemical localization of survivin in serous tumor ovary. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2004; 12(1): 40-3. [32] Ma XY, He FX, Wu SF, Lu YP, Ma D. Expression of survivin in ovarian epithelial carcinoma and its correlation with expression of Fas and FasL. Ai Zheng 2004; 23(2): 173-76. [33] Slot KA, Voorendt M, Boer-Brouwer M, Van Vugy HH, Teerds KJ. Estrous cycle dependent changes in expression and distribution of Fas, Fas ligand, Bcl-2, Bax, and pro- and active caspase-3 in the rat ovary. J Endocrinol 2006; 188(2): 179-92. [34] Mazoochi T, Salehnia M, Pourbeiranvand S, Forouzandeh Mb, Mowla SJ, Hajizadeh E. Analysis of apoptosis and expression of genes related to apoptosis in cultures of follicles derived from vitrified and non-vitrified ovaries. Mol Hum Reprod 2009; 15(3): 155-64. [35] Glamoclija V, Vilovic K, Saraga-Babic M, Baranovic A, Sapunar D. Apoptosis and active caspase-3 expression in human granulosa cells. Fertil Steril 2005; 83(2): 426-31. 119