Original Article Study the Effect of Echinacea Purpurea Extract on Cellular Delayed Type Hypersensitivity and Splenocyte Proliferation in BALB/c Mice S.M. Hashemi, M.Sc. 1, S. Soudi, M.Sc. 1, A. Ghaemi, M.Sc. 2, 3, H. Soleimanjahi, Ph.D. 2, Z.M. Hassan, Ph.D. 1 1. Immunology Department, School of Medical Sciences,Tarbiat Modares University 2. Virology Department, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University 3. Faculty of Medicine, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan Corresponding Address: P.O.Box: 14115-331, Virology Department, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University Email: Soleim_h@modares.ac.ir Abstract Received: 5/May/2007, Accepted: 2/Dec/2007 Objective: Purple cone flower plant (Echinacea purpurea) is one of the most important Herbal products in many countries. Up to now a lot of experiments demonstrated the controversial effects of this herb on immune system. In this research we study the in vivo and in vitro effect of Iranian E.purpurea extract on cellular immunity. Materials and Methods: At first we determined the lethal dose of E.purpurea extract after intraperitoneal injection in BALB/c mice. Then we made five groups of mice and treat them by four times intraperitoneal injection of 1 ml extract at different doses (0, 0.4, 2, 10 and 50 mg/ml) during two weeks. Splenocyte proliferation response to extract was assessed by MTT method. Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) response was evaluated by priming mice with 1 10 8 Sheep Red Blood Cell (SRBC) injected subcutaneously in the back on day 7after treatment. Results: As a result no significant variation in weight and spleen index of test groups to control was observed. Splenocyte proliferation and DTH response of test groups to control increased significantly (p<0.05). Conclusion: However these data confirmed the results of previous studies, in addition presented the first results about significant increase in DTH response that could not be seen before. Scince the main reason of this difference refers to active compounds of herb extract, comparing effective component of this extract with that of E.purpurea cultivated in other geographical condition will consider as the next studies. Keywords: Echinacea Purpurea, Splenocyte Proliferation, Delayed Type Yakhteh Medical Journal, Vol 9, No 4, Winter 2008, Pages: 254-261 254 Yakhteh Medical Journal, Vol 9, No 4, Winter 2008 254
مقاله اصیل بررسى اثر عصاره گیاه سرخارگل Purpurea) ( Echinacea بر ازدیاد حساسیت تاخیرى و پاسخ تکثیري سلول هاي طحال در موش BALB/c 1 2 3 2 سیدمحمود هاشمی M.Sc. 1 سارا صعودي M.Sc. 1 امیر قاي می M.Sc. حوریه سلیمانجاهی Ph.D. زهیر محمدحسن Ph.D. چکیده 1. دانشگاه تربیت مدرس دانشکده پزشکی گروه ایمنى شناسى 2. دانشگاه تربیت مدرس دانشکده پزشکى گروه ویروس شناسى 3. دانشگاه علوم پزشکى گلستان دانشکده پزشکى آدرس مکاتبه : تهران صندوق پستى : 14115-331 دانشگاه تربیت مدرس دانشکده پزشکى گروه ویروس شناسى پست الکترونیک: Email:soleim_h@modares.ac.ir دریافت مقاله: 86/2/15 پذیرش مقاله : 86/9/11 هدف : بررسى اثر عصاره سرخارگل ایران بر پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري مواد و روش ها : به این منظور ابتدا اثر کشندگی مقادیر مختلف عصاره پس از تزریق داخل صفاقی در موش BALB/c تعیین شد. سپس گروه هاي ده تایی از موش ها به مدت دو هفته و هر هفته دو بار با تزریق داخل صفاقی مقادیر 2 10 50 و 0/4 میلى گرم بر میلى لیتر از عصاره در حجم یک میلی لیتر تیمار شدند. سنجش پاسخ ت کثیري (پرولیفراسیون ( سلول هاي طحال نسبت به عصاره در محیط کشت به روش MTT انجام شد. همچنین پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري DTH) ( Delayed-Type Hypersensitivity: نسبت به گلبول قرمز گوسفند :SRBC) (Sheep Red Blood Cell ارزیابی شد. یافته ها : بر اساس نتایج به دست آمده تغییر معنی دا ري در وزن و اندیکس طحال موش هاي مورد مطالعه مشاهده نشد. پاسخ پرولیفراسیون سلول هاي طحال به عصاره در گروه هاي آزمایش در مقایسه با گروه کنترل به طور معنیدارى (0/05>p) افزایش داشت. همچنین پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري در تمام گروههاي آزمایش به طور معنیداري (0/05>p) افزایش نشان مى داد. نتیجه گ ی رى : بر اساس این یافته ها مشاهده شد عصاره سرخارگل ایران سبب افزایش تکثیر سلول هاي طحال در in vivo و in vitro می شود همچنین پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري را به شدت برمی انگیزد. پیشتر گزارشی درباره افزایش معنی دار پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري اراي ه نشده بود. به نظر می رسد ترکیبات موثره این گیاه عامل اصلی بروز تفاوت باشد از این رو بررسی تفاوت این ترکیبات با انواع غیربومی آن مفید خواهد بود. واژههاي کلیدي : سرخارگل پرولیفراسیون سلولی ازدیاد حساسیت تاخیري تزریق داخل صفاقی فصلنامه پزشکى یاخته سال نهم شماره 4 زمستان 86 صفحات : 254-261 نکروز تومور و اینترلوکین شش IL-6) ( توسط ماکروفاژهاي صفاقی مىشود مقدمه (11). گیاه سرخارگل( purpurea ( Echinacea صدها سال به تزریق ترکیبات موجود در عصاره به موشهایی که سیستم عنوان گیاه دارویی در درمان سرماخوردگی برونشیت و عفونتهاي ایمنی آنها سرکوب شده مقاومت موشها را به عفونتهایی از دستگاه تنفس فوقانی و برخی التهابها استفاده میشد( 1 2).با توجه جمله لیستریا منوسیتوژنز و کاندیدا آلبیکانس افزایش داده است به این مسي له محققان به بررسی تاثیر این گیاه و ترکیبات موجود در (12). همچنین افزایش درصد حیات ) viability ( سلولهاي ایمنی ریشه و سایر قسمتهاي گیاه بر سیستم ایمنی و عفونتهاي مختلف در اثر ترکیبات موجود در عصاره این گیاه نیز نشان داده شده است پرداختهاند ( 3-5 ).در مطالعات مختلف ترکیبات موثره گیاه تخلیص (13) و در مطالعه دیگر عصاره سرخارگل باعث افزایش قدرت و شناسایی شدهاند که شامل سیکوریک اسید Acid) (Cichorc کشندگی سلولهاي کشنده طبیعی ) NK ( Natural Killer Cell: پلیساکاریدها و آلکیلآمیدها است (6). با توجه به تنوع ترکیبات علیه سلولهاي آلوده به ویروس هرپس شده است (14). همچنین موثره در ریشه و سایر قسمتهاي گیاه و همچنین تفاوت در منطقه گزارش شده است که ترکیبات موجود در گیاه سرخارگل بر جغرافیایی کشت گیاه و مسیر تجویز عصاره نتایج تحقیقات ممکن روي برخی از سلولهاي ایمنی ازجمله لنفوسیتهاي B خاصیت است در بعضی موارد با هم متفاوت باشد (2 7). در مطالعاتی که تحریککنندگی ندارد (2). تاکنون انجام شده نشان داده شده است که پلیساکاریدهاي تخلیص در مطالعه انجام شده توسط رزلر (15) تکثیر شده از گیاه سرخارگل داراي خاصیت تحریک کنندگی سلولهاي لنفوسیتهاي T به میزان کم اف زای ش پیدا کرده ایمنی است. به طوري که باعث افزایش قدرت فاگوسیتوز بود اما میزان تولید اینترلوکین 2( IL-2 ( و اینترفرون گاما کموتاکسی و انفجار تنفسی در ماکروفاژ (8 9) و همچنین نوتروفیل توسط لنفوسیتهاي T IFN-γ) (Gamma Interferon: مىشوند (10). در مطالعات نشان داده شده است که عصاره همچنین در افزایش نشان نمىداد. دهنده این گیاه باعث افزایش تولید فاکتور پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري که لنفوسیتهاي T عامل آن هستند بعد از تیمار موش با عصاره TNF) (Tumor Necrosis Factor: اینترلوکین یک IL-1) ( 255 فصلنامه پزشکى یاخته سال نهم شماره 4 زمستان 255 86
اثر عصاره گیاه سرخارگل بر پاسخ ایمنى هماتوکسیلن- اي وزین رنگآمیزي شدند. با استفاده از میکروسکوپ گیاه سرخارگل علیرغم افزایش نسبى تکثیر لنفوسیتهاي T تغییري نوري بافت طحال از نظر ارتشاح سلول در پالپ سفید و تکثیر سلول مشاهده نشده بود (2). بررسی شد. در هر گروه ده موش مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این مسي له به بررسی بیشتر در مورد اثر عصاره گیاه سرخارگل ایران بر پاسخ تکثیري سلولهاي طحال و پاسخ پوستی اثر عصاره بر درصد حیات سلولهاي طحال در محیط کشت ازدیاد حساسیت تاخیري در موش در این مطالعه پرداخته شد. ابتدا طحال موشها به منظور جدا شدن سلولها هموژن و سپس به مدت 5 دقیقه در rpm 1700 سانتریفیوژ شدند و به باقیمانده مواد و روشها NH 4 براي لیز RBC اضافه شد. پس از سلولی 5 میلیلیتر محلول Cl تهیه عصاره 5 دقیقه انکوباسیون در دماي اتاق حجم آن با محیط کشت RPMI عصاره الکلی خام crude) ( پیکر رویشی گیاه سرخارگل به 14 میلیلیتر رسید و به مدت 5 دقیقه در rpm 1700 سانتریفیوژ (ریشه ( ایران که داراي ظاهر قهوهاي تیره ph=5/7 چگالی شد. باقیمانده سلولی در RPMI حاوى 5 درصد سرم جنین گاو 1/07 درجه الکلى 0 و مقدار 100 عدد باکتري در هر گرم است ( FBS) حل و پس از تعیین درصد سلولهاى زنده به میزان 10 2 6 از شرکت گیاهان دارویی زردبند EPCO4-L002-82) ( Batch No: سلول در هر میلیلیتر رقیق شد. سپس میزان 100 میکرولیتر از آن در خریداري شد (الکل موجود در عصاره پس ازتهیه در اثر تبخیر هر چاهک پلیت 96 تایی کشت داده شد. این سلولها در انکوباتور حذف شده است ( (16). به منظور استریل کردن عصاره با استفاده co 2 و در دماي 37 درجه سانتىگراد قرار داده شدند. واجد 5 درصد از فیلترسرنگى با غشا 0/22 میکرومترى فیلتر و پس از تهیه رقت 100 میکرولیتر از مقادیر مختلف عصاره (250 و 50 و 10 و 2 و 0/4 وزن خشک آن تعیین شد. بدین منظورحجمهاي متفاوت از عصاره میلیگرم در هر میلیلیتر ( به صورت سهتایی به چاهکها اضافه شد. روي کاغذ آلومینیومی که وزن آن تا پنج رقم اعشار معلوم شده بود پس از 48 24 و 72 ساعت درصد حیات سلولهاي طحال با روش ریخته شد. سپس به مدت سه ساعت در دماي 105 درجه سانتیگراد تریپانبلو و MTT تعیین شد. قرار گرفت تا کاملا خشک شود. پس از خشک شدن مجددا کاغذ آلومینیومى وزن شد و اختلاف آن با وزن کاغذ آلومینیومى خالی پاسخ تکثیري سلولهاي طحال پس از تیمار داخل صفاقی به عنوان وزن خشک عصاره اندازه گرفته شد. میانگین اعداد به پس از پایان دوره تیمار سلولهاي طحال گروههاي آزمایش دست آمده به عنوان وزن خشک عصاره برابر 250 میلیگرم در هر در مجاور دو دوز عصاره 10 و 50 میلیگرم در میلیلیتر به مدت 72 میلیلیتر گزارش شد. ساعت قرار گرفت. پس از پایان مدت انکوباسیون سلولها از هر چاهک در میکروتیوبهاي استریل جمعآوري و با RPMI واجد 5 حیوانات درصد FBS دو بار در rpm 1700 به مدت 5 دقیقه شسته شدند تا موشهاي ماده BALB/c 6-8 هفتهاي از انستیتوپاستور ایران عصاره از محیط حذف شود و رنگ عصاره با رنگ حاصل از معرف خریداري و به گروههاي دهتایی تقسیم شدند. هر گروه در قفس MTT تداخل نکند. سپس باقیمانده سلولی با RPMI به حجم 100 جداگانه در شرایط استاندارد از نظر دما نور و آب و غذا قرار میکرولیتر رسانده و معرف MTT به آن اضافه شد. گرفتند. به گروهی از این موشها که براي تعیین دوز کشنده به کار رفتند یک میلیلیتر از مقادیر مختلفی عصاره تازه (از 0/4 تا 250 سنجش MTT میلیگرم در میلی لیتر ( به روش داخل صفاقی تزریق شد و سپس پودر 3- MTT ( 4 و 5- ديمتیل تیازولیل 2 ) 2 و 5- ديفنیل این موشها از نظر رفتار سلامت فیزیکی و میزان مرگومیر تا 3 تترازولیوم به میزان 5 میلىگرم بر میلىلیتر در PBS حل و فیلتر شد. ماه بعد بررسی شدند. پس از اتمام زمان انکوباسیون کشت طحال میزان 25 میکرولیتر از پس از تعیین دوز کشنده به منظور انجام سایر بررسیها به گروه آن به هر چاهک اضافه شد و مدت 6 ساعت در دماى 37 درجه دیگري از این موشها (گروههاي آزمایش ( یک میلیلیتر از رقت سانتىگراد قرار گرفت. با خاتمه زمان انکوباسیون همزمان با تشکیل هاى مختلف عصاره که واجد 50 و 10 و 2 و 0/4 میلیگرم در کامل کریستالها محلول رویی به آرامی از هر چاهک دور ریخته میلیلیتر بود تزریق شد. عمل تزریق به ترتیب معادل 0/06 0/3 1/6 شد و میزان 100 میکرولیتر محلول ديمتیل سولفوکساید (DMSO) و 0/01 گرم در هرکیلوگرم وزن بدن حیوان و به صورت داخل براي حل کردن کریستالها اضافه شد. پس از حل کردن کریستال صفاقی به مدت دو هفته و هر هفته دو بار انجام شد. گروه کنترل به ها جذب رنگ تولیدشده در طول موج 540 نانومتر با دستگاه همین روش PBS دریافت میکرد. الایزا ریدر MS) ( Labsystems Multiskan خوانده و سپس اندیکس تحریکی محاسبه شد (17). وزن موش اندیکس طحال و ارتشاح سلول براي تعیین وزن موشها قبل و بعد از تیمار با ترازوي حساس ازدیاد حساسیت تا خیري (DTH) وزن شدند. براي تعیین اندیکس طحال پس از خارج کردن طحال براي انجام این تست ابتدا موشها به طور تصادفی به 5 گروه از بدن موش و تعیین وزن آن از فرمول زیر استفاده شد. 5 تایی تقسیم شدند. سپس مقادیر 10 2 0/4 و 50 میلیگرم در وزن بدن /100 وزن طحال= اندیکس وزن طحال میلیلیتر از عصاره در حجم یک میلیلیتر به صورت داخل صفاقی براي تعیین وضعیت ارتشاح سلولی در طحال ابتدا بافت طحال به مدت 2 هفته و هفتهاي دوبار تزریق شد. به گروه کنترل به صورت در فرمالین 10 درصد تثبیت شد و پس از مراحل آبگیري و پارافینه داخل صفاقی PBS تزریق شد. پس از اتمام دوره تیمار تعداد کردن بافتها به ضخامت 5 میکرومتر برش داده و با استفاده از رنگ 256 Yakhteh Medical Journal, Vol 9, No 4, Winter 2008 256
هاشمى و همکاران جدول 1: اثر مقادیر مختلف عصاره گیاه سرخار گل بر اندیکس طحال و تغییرات بافت شناسی آن اندیکس وزن طحال ± مقدار عصاره خطاى استاندارد میانگین (میلی گرم در میلی لیتر ( بافت شناسی طحال 0/43 ±0/05 0 طبیعی 50 اندیکس طحال و ارتشاح سلول 10 1 8 گلبول قرمز گوسفند SRBC) ( از انستیتو رازي ایران از آنجایی که طحال یکی از مهمترین اعضاي معرف عملکرد خریداي و در حجم 0/1 میلىلیتر به صورت زیر جلدى به همه سیستم ایمنی است وزن موش و اندیکس طحال در گروههاي گروهها تزریق شد. 5 روز بعد مقدار 10 1 8 SRBC در 0/1 میلىلیتر مختلف بررسی شد. بر اساس نتایج عصاره اثري بر تغییر وزن به کف پاي چپ هر موش و هم حجم آن PBS به کف پاي راست موش و اندیکس طحال نداشته است (جدول 1). در بررسی ارتشاح به صورت زیر جلدى تزریق شد. افزایش ضخامت پاي سلولی برشهاي عرضی طحال موشهاي تیمارشده با عصاره موشها پس از 48 24 و 72 ساعت با استفاده از کولیس ) 50 میلىگرم بر میلىلیتر ( با طحال موشهایی که به آنها عصاره Caliper-Germany) (Mauser Dial اندازهگیري شد و تزریق نشده بود (کنترل) از رنگآمیزي هماتوکسیلن-اي وزین درصد افزایش ضخامت ناشى از ازدیاد حساسیت تاخیرى محاسبه با استفاده از میکروسکوپ نوري استفاده شد. همان طور که در گردید 18).(19 شکل 1 B مشخص است تراکم سلولی نسبت به شکل 1 A (کنترل) افزایش یافته و فولیکولهاي زیادي تشکیل شده است (شکل 1). آنالیز آماري در این مطالعه جهت بررسی آماري از آزمون student t-test اثر عصاره بر درصد حیات سلولهاي طحال در محیط کشت و نرمافزار SPSS استفاده شد وبا تعیین >p 0/05 به عنوان سطح در بررسی درصد حیات به روش تریپانبلو نهتنها هیچگونه معنیداري نتایج بدست آمده مورد ارزیابى قرار گرفتند. اثر سایتوتوکسیک در دوزهاي مختلف عصاره بر روي سلولهاي طحال موش پس از 48 24 و 72 ساعت مشاهده نشد بلکه درصد یافتهها حیات سلولها با افزایش دوز عصاره نسبت به کنترل (سلولهاي دوز کشنده در موش طحال فاقد عصاره ( تشدید شد. جدول 2 درصد حیات سلولهاي در بین گروههاي آزمایش عصاره تنها در مقدار 250 میلیگرم طحال را در مجاورت دوزهاي مختلف عصاره در زمانهاي مختلف و مقادیر بالاتر پس از تزریق داخل صفاقی براي موشها سمی نشان میدهد. همانطور که مشخص است با افزایش دوز عصاره از بود. همه موشهاي این گروه در فاصله 5 تا 10 دقیقه دچار ضعف کاهش درصد حیات با گذشت زمان کاسته میشود. بر اساس نتایج در حرکت و عدم تعادل شدند و پس از 30 دقیقه مردند. در دوز به دست آمده 48 و 72 ساعت پس از انکوباسیون سلولهاي طحال 50 میلىگرم بر میلىلیتر ضعف در حرکت و عدم تعادل به صورت در مجاور عصاره اختلاف معنی داري( p<0/05 ( بین درصد حیات موقت مشاهده و پس از یک ساعت کاملا برطرف شد. در دوزهاي سلولهاي آزمایش با سلولهاي کنترل (بدون عصاره ( مشاهده می پایینتر هیچ عارضهاي مشاهده نشد. شود. 0/49 ±0/03 0/4 فولیکولهاي بزرگ فعال شده و در حال میتوز 0/55 ±0/05 2 فولیکولهاي بزرگ فعال شده و در حال میتوز 004/± 10 0/44 فولیکولهاي بزرگ فعال شده و در حال میتوز 0/50 ±0/01 فولیکولهاي بزرگ فعال شده و در حال میتوز ده موش در هر گروه مورد بررسی قرار گرفت شکل 1: برش عرضى طحال موش طبیعى (A ( برش عرضى طحال موشى که مقدار 50 میلىگرم در میلىلیتر عصاره دریافت کرده است. فلشها حضور پالپهاى سفید فعال را نشان مىدهد (B ). 257 فصلنامه پزشکى یاخته سال نهم شماره 4 زمستان 257 86
اثر عصاره گیاه سرخارگل بر پاسخ ایمنى در بررسی درصد حیات به روش MTT پس از 48 24 و 72 پرولیفراسیون با گذشت زمان افزایش مییابد و این افزایش وابسته ساعت معرف MTT اضافه و پس از زمان لازم انکوباسیون جذب به دوز است. به گونهاي که در 48 ساعت اندیکس تحریکی القا چاهکها در طول موج 540 نانومتر تعیین گردید و میزان تشدید شده توسط دوز 50 میلیگرم تقریبا دو برابر دوز 10 میلیگرم و دوز حیات بر اساس فرمول اندیکس تحریکی به شرح زیر محاسبه شد 250 میلیگرم نیز دو برابر 50 میلیگرم می شود. (جدول 3). میانگین جذب سلول هاى تیمار نشده در 540 نانومتر/میانگین پاسخ تکثیري سلولهاي طحال پس از تیمار داخلی صفاقی جذب سلولهاي تیمارشده در 540 نانومتر= اندیکس تحریکى دراینبررسیاندیکسپرولیفراسیونسلولهايطحالموشهاي تیمار شده با عصاره نسبت به موشهاى کنترل تیمار شده با (PBS بر اساس نتایج به دست آمده دوز 10 میلیگرم پس از 48 ساعت محاسبهشد.دربررسیپاسختکثیريحالنسبتبهعصارهدرگروههاي و دوز 50 و 250 میلیگرم پس از 24 ساعت افزایش معنیداري تیمار شده در هر گروه در دوز 10 میلیگرم نسبت به کنترل (بدون (0/05>p ( در اندیکس پرولیفراسیون سلولهاي طحال در مقایسه تیمار ثانوي با عصاره ( افزایش معنیداري در اندیکس پرولیفراسیون با گروههایی که با 0/4 و 2 میلیگرم در میلیلیتر عصاره تیمار شده در پاسخ به تحریک مجدد با عصاره مشاهده شد بودند نشان دادند. اثر تحریکی هر دوز از عصاره بر اندیکس (جدول 4). جدول 2: درصد حیات سلولهاى طحال در مجاور مقایر مختلف عصاره به روش تریپان بلو مقدار عصاره 250 50 10 2 0/4 0 زمان (میلى گرم بر میلى لیتر) زمان 24 ساعت 100 ±0 96/6 ±1/7 75±2/1 71±2/08 66/5±1/5 a 63±2 a 48 ساعت 20±0 20±0 29±2/1 70/6±3 85/3±1/6 96/6±0/3 72 ساعت 0±0 5±0/3 0 20± 62/3±2/3 71±2 97±1/5 در هر زمان بین گروه هایی که با ستاره مشخص شده اند با گروه کنترل اختلاف معنی دار (0/05>p ( وجود دارد. a میانگین انحراف معیار (اعداد میانگین بررسی در 3 موش و به صورت 3 بار تکرار می باشد ). جدول 3: اندیکس تحریکی سلولهاي طحال به روش MTT مقدار عصاره (میلى گرم بر میلى لیتر ( 250 50 10 2 0/4 24 ساعت 1/3±0/06 1/1±0/05 1/1 ±0/006 a 2/6±0/09 3/6±0/05 48 ساعت 1/2±0/007 1/4±0/2 2/6±0/05 5/2±0/14 10/25±0/6 72 ساعت 1/2±0/08 1/25±0/04 2/2±0/14 7/4±0/19 13±0/5 در هر زمان بین گروه هاي ستاره دار با گروه کنترل که عصاره به آن تزریق نشده اختلاف a میانگین انحراف معیار (اعداد میانگین 3 بار تکرار می باشد). میانگین جذبسلول هاى تیمار نشده در 540 نانومتر / میانگین جذبسلولهاي تیمارشده معنی دار( 0/05 >p ( وجود دارد در 540 نانومتر= اندیکس تحریکى جدول 4: میانگین پاسخ پرولیفراسیونسلول هاىطحال در موش هاى تیمار شده با عصاره نسبت به موش کنترل اندیکس تحریکى خطاى استاندارد میانگین گروه 4 گروه 3 گروه 2 گروه 1 تیمار 50 میلیگرم ±0/08 1/56 ±0 /13 1/46 ±0/03 1/66 ±0/05 1/3 10 میلیگرم 2/3±0/04 2/21±0/12 1/8±0/1 ± 0/24 1/73 0 میلیگرم 1/5±0/05 1/32±0/07 1/14±0/003 1/5±0/05 گروه 1 (50 میلی گرم ( گروه 2 (10 میلی گرم ( گروه 3 (2 میلی گرم ( گروه 4 (0/4 میلی گرم ( از عصاره را دریافت کرده اند. درهرگروه پنج موش با عصاره تیمار شده بود و هر بررسی در هر موش با 3 بار تکرارانجام شد.در گروه هایی که با ستاره مشخص شده اند اختلاف معنی داري (0/05>p ( در افزایش اندیکس تحریکی در حضور تیمار ثانویه عصاره نسبت به نبود آن وجود دارد. میانگین جذبسلولهايطحالدرموش تیمارنشده در 540 نانومتر / میانگین جذبسلولهايطحال درموش تیمارشده در 540 نانومتر=اندیکس تحریکی 258 Yakhteh Medical Journal, Vol 9, No 4, Winter 2008 258
هاشمى و همکاران پاسخ ازدیاد حساسیت تا خیري در بررسی ازدیاد حساسیت تا خیري( DTH ) افزایش معنی داري در گروههاي تیمارشده با دوزهاي مختلف عصاره (میلی گرم بر میلى لیتر 0/4) 0/2 50 نسبت به کنترل در دوز بهینه 2 میلىگرم بر میلىلیتر مشاهده شد (ده موش در هر گروه ). افزایش پاسخ DTH پس از 24 و 48 ساعت در تمام گروه ها و پس از 72 ساعت تنها در گروههاي تیمارشده با دوزهاي 50 میلى گرم بر میلى لیتر و 0/4 2 نسبت به کنترل اختلاف معنیدار (0/05>p ( داشت (شکل 2). 75,00 50 میلى گرم 10 میلى گرم 2 میلى گرم 0/4 میلى گرم 0 میلى گرم 50,00 مقدار عصاره 25,00 0,00 پا کف قطر افزایش درصد شکل : 2 بررسی ازدیاد حساسیت تا خیري DTH) ). در هر زمان بین گروههاي ستاره دار با گروه کنترل که عصاره به آن تزریق نشده اختلف معنی دار( p<0/05 ( وجود دارد. ده موش در هر گروه مورد بررسی قرار گرفت. بحث گیاه سرخارگل که در ابتدا گیاه بومی نواحی شمال آمریکا بوده است و از مدت ها پیش به عنوان گیاه دارویی به منظور درمان بسیاري از بیماري ها از جمله سرماخوردگی عفونت هاي ویروسی و سرطان به کاربرده مى شد هم اکنون در بسیاري از کشورهاي دنیا مصرف گسترده یافته است (20). تحقیقات زیادي در زمینه اثر این گیاه دارویی در سیستم غیرزنده و زنده در کشورهاي مختلف انجام شده تا مواد مو ثره و مکانیسم اثر این گیاه مشخص شود. بر این اساس امروزه سرخارگل را به عنوان گیاه محرك سیستم ایمنی مطرح می کنند. هرچند که ترکیبات مو ثره آن شناخته شده است مکانیسم عمل و اثر متقابل آنها بر یکدیگر به درستی معلوم نیست.(1) از سوي دیگر بررسی ها نشان می دهد که گونه هاي مختلف اکیناسه و بخش هاي مختلف گیاه آن (ریشه و قسمت هاي هوایی گیاه) روش تهیه و آمادهسازي عصاره هاي گیاهی و یا سایر فرآورده هاي آن تا ثیر متفاوتی در سیستم زنده بر جاي می گذارند (2). طى یک بررسی در سیستم غیرزنده نشان داده شد که در یک روش تهیه غیر استاندارد عصاره ترشح سایتوکاین از ماکروفاژهاي صفاقی موش افزایش یافته و افزایش درصد حیات و تکثیر سلول هاي تک هسته اي خون محیطی انسان تشدید میشود. در حالی که در یک روش استاندارد شده فرآورده این گیاه از لحاظ ایمونولوژیک غیرفعال است ولی خاصیت آنتی اکسیدانی و ضدالتهابی نشان می دهد (13). به هر حال با توجه به مساي ل گفته شده و عدم توافق عمومی بر سر روش استانداردي براي تهیه عصاره اکیناسه به نظر می رسد کشورهایی که تصمیم به استفاده دارویی از این گیاه دارند باید بررسی هاي لازم را در زمینه گیاه موجود در کشور خود انجام دهند و پس از انجام کارآزمایی هاي مربوط نسبت به روش تخلیص و تهیه فرآورده هاي مورد نیاز اقدام کنند. در این تحقیق اثر عصاره گیاه سرخارگل ایران (تهیه شده از شرکت زردبند ( بر پاسخ ازدیاد حساسیت تاخیري و پاسخ تکثیري سلول هاي طحال در موش BALB/c بررسی شد. تاکنون تحقیقات انجام شده در حیوان آزمایشگاهی هیچ نشانی از خطر و سمیت اکیناسه اراي ه نداده اند. بر اساس گزارش هاى موجود منگز هیچ نوع اثر کشندگی در دوزهاي خوراکی بیشتر از 15 گرم در کیلوگرم وزن بدن و در تزریق وریدي دوزهاي بیش از 5 گرم در کیلوگرم در مورد رت یا موش مشاهده نشده است (21). در این مطالعه پس از تزریق داخل صفاقی عصاره در دوز کمتر از 250 میلى گرم بر میلى لیتر حتی با گذشت چند هفته هیچ نوع اثر کشندگی مشاهده نشد. اما دوز 250 میلى گرم بر میلى لیتر و بالاتر باعث مرگ موش ها شد. بنابراین در این مطالعه دوزهاي کمتر از 250 میلى گرم بر میلى لیتر براي بررسی هاي ایمونولوژي به کار رفتند. افزایش درصد حیات و تکثیر سلول هاي ایمنی پیشتر در مورد فرآورده هاي این عصاره توسط محققان گزارش شده است. رینینگر و همکارانش افزایش درصد حیات سلولهاي تک هسته اي خون محیطی توسط عصاره اکیناسه را نشان داده و آن را وابسته به دوز با دوز بهینه 1 میکروگرم بر میلى لیتر گزارش کرده اند (13). سان و همکارانش نیز در موشهایی که روزانه به مدت دو هفته 0/45 میلى گرم بر میلى لیتر از عصاره ریشهاي.E purpurea را دریافت می کردند افزایش معنیداري در تعداد مونوسیتها و سلولهاي NK (نه لنفوسیت ها و گرانولوسیتها ( نسبت به گروه کنترل گزارش کرده اند (3). در این مطالعه نیز در راستاي بررسی اثر عصاره گیاه اکیناسه برمجموعه دیگري از سلول هاي ایمنی که در عضو لنفی طحال قرار گرفته اند مشاهده شد عصاره پس از تیمار داخل صفاقی به شدت افزایش درصد حیات و تکثیر سلول هاي طحال را در in vitro و in vivo افزایش میدهد. در بررسی in vitro این تکثیر به اندازه اي است که می توان گفت دوز 250 میلی گرم پس از 72 ساعت با ایجاد اندیکس تحریکی 13 توانسته مانند یک میتوژن عمل کند. در بررسی in vivo بر اساس شکل یک تراکم بالاي سلولی در برش عرضی طحال در گروه تست نسبت به کنترل می تواند نشان دهنده میتوز فراوان و همچنین تجمع سلول هاي ایمنی مهاجر در پاسخ به تحریک با اکیناسه باشد. نتایج به دست آمده در پاسخ تکثیري سلول هاي طحال in vivo نشان می دهد که حضور یا عدم حضور عصاره در in vitro اثري بر افزایش اندیکس تحریکی سلول هاي طحال موش هایی که عصاره را به طور داخل صفاقی دریافت کرده اند ندارد. این نتیجه به دلیل آن نیست که عصاره نتوانسته بر پرولیفراسیون سلول هاي طحال در in vivo اثر بگذارد بلکه نشان دهنده اثر بالاي عصاره در in vitro است. به این ترتیب اثر تحریکی سلول هایی که قبلا در in vivo با عصاره تماس داشته اند با سلول هایی که در in vivo با عصاره تماس نداشته اند در حضور مجدد عصاره در in vitro به یکدیگر نزدیک است تا جایی که طبق جدول 4 اندیکس تحریکی حاصل از نسبت جذب موش هاي تحریک شده به تحریک نشده درvivo in به 259 259 فصلنامه پزشکى یاخته سال نهم شماره 4 زمستان 86
اثر عصاره گیاه سرخارگل بر پاسخ ایمنى و تشکیل مراکز زایا در طحال است به خوبی یافته هاي حاصل از بررسی ) DTH حذف شده است ( پاسخ تکثیري سلولهاي طحال را تایید می کند. لازم به ذکر است که به منظور تحریک سیستم ایمنی و مشاهده پاسخ سلول هاي سیستم ایمنی باید به دفعات و با فاصله با ماده محرك (خواه ترکیبات اکیناسه باشد خواه هر ماده مورد بررسی دیگر ( مواجه شوند. به همین دلیل تزریق 4 بار اکیناسه در مدت دو هفته انتخاب شد. در اینجا از اکیناسه به عنوان دارو استفاده نشده تا کاهش دوز یا ثابت بودن آن در بدن موش مهم باشد. چرا که در صورت تحریک سیستم ایمنی پاسخ هاي ایمنی و فعال شدن سلول ها به طور سلسله وار حتی درصورت کاهش محرك ادامه پیدا می کند. شاید با بررسى هاى بیشتر بتوان از خاصیت تحریک ایمنى اکیناسه به عنوان ادجوانت در کنار واکسن ها جهت تحریک غیر اختصاصى سیستم ایمنى استفاده کرد. نتیجه گیرى عصاره اکیناسه حاضر همچون سایر فرآورده هاي اکیناسه واجد خواص محرك ایمنی است. یافته هاي حاصل ضمن تایید نتایج قبلی اولین گزارش از افزایش محسوس پاسخ DTH است. از آنجایی که احتمالا سلول هاي T در پاسخ DTH شرکت دارند لازم است در مطالعات بعدي نقش عصاره در فعال شدن لنفوسیتهاي T به دقت بررسی شود. به منظور کاربردي کردن و استفاده بالینی از این گیاه دارویی بررسی هاي دقیق و کامل تر ایمنیشناسی تعیین نوع و درصد ترکیبات مو ثره این عصاره و مطالعات داروشناسی از جمله تعیین دز عصاره در بدن حیوان و روند حذف آن از بدن موش لازم به نظر می رسد. References 1. Barrett B. Medicinal properties of Echinacea: a critical review. Phytomedicine. 2003; 10: 66 86 2. Percival S.S. Use of Echinacea in medicine. Biochem Pharmacol 2000; 15: 155-158 3. Sun LZ, Currier NL, Miller SC. The American coneflower: a prophylactic role involving nonspecific immunity. J Altern Complement Med 1999; 5: 437-446 4. Bauer R. Echinacea: biological effects and active principles. Phytomedicines of Europe: Chemistry and Biological Activity. Washington, DC. 1998 5. Bauer R, Foster S. Analysis of alkamides and caffeic acid derivatives from Echinacea simulata and E. paradoxa roots. Planta Med 1991; 57: 447-449 6. Goela V,Changb C, Slamab JV, Bartonc R, Bauerd R, Gahlerb R, et al. Echinacea stimulates macrophage function in the lung and spleen of normal rats.journal of Nutritional Biochemistry 2002; 13: 487-492 7. Cundell DR, Matrone MA, Ratajczak P, Pierce JD Jr. The effect of aerial parts of Echinacea on the circulating white cell levels and selected immune functions of the aging male Sprague 260 3 هم نمی رسد. با این وجود همین اثر تحریکی تجویز عصاره در in vivo است که باعث عدد اندیکس تحریکی 2 و حدود آن می شود. این اثربه ویژه در گروهی که با دوز یادآور 10 میلی گرم در in vitro مجاور شده است دیده می شود. طی بررسی پاسخ ازدیاد حساسیت تا خیري (عبارت سنجش دیگري براي ارزیابی ایمنی سلولی حذف شده است) افزایش معنی داري در زمانهاي 24 و 48 ساعت نسبت به کنترل در همه گروهها و در زمان 72 ساعت در همه گروهها به جز گروه تیمارشده با مقدار 10 میلى گرم بر میلى لیتر مشاهده شد. از آنجایی که این پاسخ احتمالا وابسته به سلول T است به نظر می رسد که عصاره توانسته با تا ثیر بر جمعیت لنفوسیتی پاسخ DTH را برانگیزد. به منظور تعیین نقش سلول هاي T لازم است تا در بررسی هاي دیگر مطالعات بافت شناسی در محل پاسخ DTH صورت گیرد و با آزمون هاي تکمیلی فعال شدن لنفوسیت هاي T مشخص گردد. نتایج قبلی درباره اثر این گیاه بر پاسخ DTH و به طور کلی لنفوسیتهاي T بیشتر گویاي اثر عصاره بر شاخه ایمنی غیراختصاصی و فعالیتهاي ایمونولوژیک ازجمله فاگوسیتوز است و نقش اکیناسه را در تقویت پاسخهاي ایمنی سلولی از راه لنفوسیت ها ناچیز می داند. در یک بررسی در عین حال که افزایش کمی در تکثیر لنفوسیت هاي T پس از تیمار با اکیناسه گزارش شده است نقش آن را در ازدیاد حساسیت تاخیري بی اثر دانسته است (15). به این ترتیب به نظر می رسد که عصاره اکیناسه ایران به لحاظ نوع و درصد ترکیبات مو ثره متفاوت است که توانسته پاسخ DTH را القا کند. تزریق داخل صفاقی نیز می تواند دلیل دیگري برتفاوت القاي پاسخ DTH در این بررسی باشد. نتایج حاصل از بافت شناسی طحال که نمایانگر افزایش میتوز Dawley rat. Int Immunopharmacol. 2003; 3: 1041-1048 8. Stimpel H, Proksch A, Wagner H, Lohmann- Matthes ML. Macrophage activation and induction of macrophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea. Infect Immun. 1984: 46: 845-849 9. Leuttig B, Steinmuller C, Gifford GE, Wagner H, Lohmann-Matthes ML. Macrophage activation by the polysaccharide arabinogalactan isolated from plant cell cultures of Echinacea purpurea, J Natl Cancer Inst.1989: 81: 669 675 10. Wagner H, Jurcic K, Immunologic studies of plant combination preparations. In vitro and in vivo studies on the stimulation of phagocytosis, Arzneimittel Forschung. 1991; 41: 1072 1076 11. Burger RA, Torres AR, Warren RP, Caldwell VD, Hughes BG. Echinacea induced cytokine production by human macrophages. Int J Immunopharmacol. 1997; 19: 371-379 12. Steinmuller C, Roesler J, Grottrup E, Franke G, Wagner H, Lohmann-Matthes ML. Polysaccharides isolated from plant cell cultures of against systemic infections with Candida albicans and Listeria monocytogenes. Intl J Immunopharmacol.1993; 15: 605-614 Yakhteh Medical Journal, Vol 9, No 4, Winter 2008 260
هاشمى و همکاران 13. Rininger JA, Kickner S, Chigurupati P, McLean A, Franck Z. Immunopharmacological activity of Echinacea preparations following simulated digestion on murine macrophages and human peripheral blood mononuclear cells. Leukoc Biol. 2000; 68: 503-510 14. See DM, Broumand N, Sahl L, Tilles JG. In vitro effects of Echinacea and ginseng on natural killer and antibody-dependent cell cytotoxicity in healthy subjects and chronic fatigue syndrome or acquired immunodeficiency syndrome patients. Immunopharmacol.1997; 35: 229-235 15. Roesler A, Emmendorffer C, Steinmuller B, Luettig H, Wagner ML. Lohmann-Matthes. Application of purified polysaccharides from cell cultures of the plant Echinacea purpurea to test subjects mediates activation of the phagocyte system. Intl J Immunopharmacol. 1991; 13: 931 941 16. Omid Beygi R. Study of cultivation and adaptability of purple coneflower (Echinacea purpurea) in the north of Tehran. Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources, 2002; 6: 231-240 17. Denizot F, Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growh and survival. J Immunol Methods. 1986; 89: 271-277 18. Ebtekar M, Hassan ZM. Effect of immunomdulator pyrimethamine and cimetidine on immunosuppressed induced by mustard in mice. International Immunopharmacology.1993; 25: 423-430 19. Noori Sh, Naderib GA, Hassan ZM, Habibi Z, Bathaiea SZ, Hashemi SM. Immunosuppressive activity of a molecule isolated fromartemisia annua on DTH responses compared with cyclosporin A. International Immunopharmacology. 2004; 4: 1301-1306 20. Pepping J. Alternative therapies, Echinacea. Am J Health-Syst Pharm.1999: 56: 121-122 21. Mengs U, Clare CB, Poiley JA. Toxicity of Echinacea purpurea. Acute, subacute and genotoxicity studies. Arzneimittelforschung. 1991; 41: 1076-1081 261 261 فصلنامه پزشکى یاخته سال نهم شماره 4 زمستان 86 View publication stats