ΑΣΚΗΣΗ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΕΥΡΕΣΗ ΘΕΣΕΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΑΣΚΗΣΗ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΕΥΡΕΣΗ ΘΕΣΕΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΑΣΚΗΣΗ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΕΥΡΕΣΗ ΘΕΣΕΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Σκοπός της άσκησης Η εξοικείωση με τη βάση δεδομένων NCBI. Ο σχεδιασμός ειδικών εκκινητών με το εργαλείο του NCBI «Primer- BLAST». Η εξοικείωση με το πρόγραμμα NEBcutter για την κατασκευή περιοριστικών χαρτών. 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ 1.1. Βιολογικές βάσεις δεδομένων Η Βιοπληροφορική (Bioinformatics) είναι το διεπιστημονικό πεδίο που συνδυάζει τις επιστήμες της βιολογίας, της υπολογιστικής, της στατιστικής και των μαθηματικών με σκοπό την ανάλυση, επεξεργασία και ερμηνεία βιολογικών δεδομένων. Ο όγκος της βιολογικής πληροφορίας που παράγεται πλέον σήμερα είναι τόσο μεγάλος που η συνεισφορά της βιοπληροφορικής στην ερμηνεία των δεδομένων είναι καταλυτική. Τα βιολογικά δεδομένα οργανώνονται και αποθηκεύονται σε βάσεις δεδομένων από τις οποίες μπορούν εύκολα και ελεύθερα να ανασυρθούν και να αναλυθούν. Η βιολογική πληροφορία στις διάφορες βάσεις δεδομένων συνήθως είναι οργανωμένη σε δύο επίπεδα: Στο επίπεδο της αλληλουχίας και του γονιδιακού περιεχομένου Στο επίπεδο της δομής και λειτουργίας των γονιδιακών προϊόντων Οι περισσότερες βάσεις δεδομένων έχουν δημιουργηθεί από μεγάλους δημόσιους ερευνητικούς φορείς, όπως το National Center for Biotechnology Information (NCBI) και το European Molecular Biology Laboratory (EMBL), και το περιεχόμενό τους είναι ελεύθερα προσβάσιμο από όλους τους επιστήμονες ώστε να επιταχυνθεί η επίτευξη των στόχων της βιοπληροφορικής έρευνας που αναφέρονται κυρίως στην ανάλυση των αλληλουχιών των βιολογικών μακρομορίων και στην πρόβλεψη της δομής και της λειτουργίας τους.

Ο κλάδος της Βιοπληροφορικής βρίσκει σήμερα σημαντική εφαρμογή στους παρακάτω ενδεικτικούς τομείς: 1. Στην οργάνωση, αποθήκευση και διαχείριση αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη βάση δεδομένων σε αυτόν τον τομέα βρίσκεται υπό την αιγίδα του National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Το NCBI φιλοξενεί πολλές βάσεις δεδομένων με βιοϊατρικές πληροφορίες αλλά και πολλά χρήσιμα εργαλεία για βιοπληροφορική ανάλυση. Το NCBI διαχειρίζεται τη βάση δεδομένων GenBank (πληροφορίες για αλληλουχίες DNA) αλλά παρέχει και πλήθος άλλων αλληλοσυνδεόμενων βάσεων δεδομένων όπως τις Gene (πληροφορίες για γονίδια), Nucleotide (πληροφορίες για αλληλουχίες DNA), Protein (πληροφορίες για πρωτεΐνες), Pubmed (βιβλιογραφική βάση δεδομένων της τρέχουσας βιοϊατρικής έρευνας), SNP (πληροφορίες για πολυμορφισμούς σε επίπεδο ενός νουκλεοτιδίου) κ.ά. Επιπρόσθετα, μερικά από τα πολύ χρήσιμα βιοπληροφορικά εργαλεία του NCBI περιλαμβάνουν το BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, ένα εργαλείο για αναζήτηση ομοιοτήτων σε νουκλεοτιδικές και πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων), και το εργαλείο εύρεσης εκκινητών για μία δεδομένη νουκλεοτιδική αλληλουχία (Primer-BLAST). Στην ταχύτατη διάδοση της χρήσης του NCBI, αλλά και των άλλων βάσεων δεδομένων, βασικό ρόλο διαδραμάτισε η ανάπτυξη προγραμμάτων «αναζήτησης και ανάσυρσης της πληροφορίας» όπως το Entrez. 2. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή γονιδιωματικών πληροφοριών σχετικά με τις χρωμοσωμικές περιοχές, τα γονίδια, τα εσώνια (introns) και τα εξώνια (exons), τις αμετάφραστες περιοχές, τις ρυθμιστικές περιοχές της γονιδιακής έκφρασης, τις περιοχές ανοιχτού αναγνωστικού πλαισίου, τους πολυμορφισμούς, τα μετάγραφα και τα προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος κ.ά. 3. Στην ανάπτυξη προγραμμάτων εναρμόνισης αλληλουχιών (sequence alignment), τα οποία επιτρέπουν την ταυτόχρονη ανάγνωση, ανάλυση και αναζήτηση ομοιοτήτων πολλαπλών αλληλουχιών. 4. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή πληροφοριών σχετικά με το αναπτυξιακό στάδιο, το είδος ιστού αλλά και τα νοσήματα στα οποία εκφράζεται ένα γονίδιο.

5. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή συσχετισμών μεταξύ των μεταλλάξεων ενός γονιδίου και την παθογένεση ασθενειών. 6. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή συσχετισμών μεταξύ γονοτύπου και φαινοτύπου. Ο κατάλογος ΟΜΙΜ (Online Mendelian Inheritance in Man) του NCBI περιέχει πληροφορίες για τα γνωρίσματα και τις παθήσεις που κληρονομούνται με μενδελικό χαρακτήρα στον άνθρωπο. 7. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή δομικών πληροφοριών σχετικά με την πρόβλεψη της δομής των πρωτεϊνών (βάσεις δεδομένων Swiss-Prot, Worldwide Protein Data Bank κ.ά). 8. Στην ανάπτυξη μεθοδολογιών για την εξαγωγή πληροφοριών για τη λειτουργία των μορίων όπως η μοριακή λειτουργία, η κυτταρική εντόπιση, τα μεταβολικά μονοπάτια κ.ά. 9. Στην μελέτη των εξελικτικών σχέσεων των οργανισμών και την κατασκευή φυλογενετικών δένδρων. Η εφαρμογή αυτή κατέστη δυνατή μετά την ανάπτυξη των προγραμμάτων εναρμόνισης αλληλουχιών που προαναφέρθηκαν. 2. ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα πραγματοποιήσετε αναζητήσεις σε βιολογικές βάσεις δεδομένων και θα εξοικειωθείτε με τη χρήση κάποιων εργαλείων βιοπληροφορικής. 2.1. Σχεδιασμός ειδικών εκκινητών για ενίσχυση του γονιδίου της β- σφαιρίνης Στο παράδειγμα που ακολουθεί θα χρησιμοποιήσουμε το εργαλείο Primer-BLAST του NCBI για την εύρεση ειδικών εκκινητών προκειμένου να ανιχνεύσουμε με τη διαδικασία της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) το γονίδιο της β σφαιρίνης του ανθρώπου. 1. Χρησιμοποιώντας τον περιηγητή ιστοσελίδων μεταβαίνουμε στην αρχική σελίδα του NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. 2. Στο επάνω μέρος της ιστοσελίδας εμφανίζονται δύο πεδία αναζήτησης. Στο αριστερό πεδίο όπου αναγράφεται «all databases» επιλέγουμε από το μενού κύλισης την βάση δεδομένων με την οποία θέλουμε να δουλέψουμε. Σε αυτήν την περίπτωση επιλέγουμε τη βάση δεδομένων «Gene». Στο κεντρικό πεδίο αναζήτησης εισάγουμε το όνομα του γονιδίου που θέλουμε να βρούμε (beta hemoglobin) και πατάμε το κουμπί αναζήτησης (Εικόνα 2). 3. Στην οθόνη που αναδύεται (Εικόνα 3) τα αποτελέσματα είναι οργανωμένα σε τέσσερις στήλες, με την πρώτη στήλη να περιέχει το εγκεκριμένο σύμβολο του γονιδίου, τη δεύτερη την περιγραφή του, την τρίτη το χρωμόσωμα στο οποίο εντοπίζεται το γονίδιο και την τέταρτη άλλα συνώνυμα σύμβολα του γονιδίου. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται με σειρά σχετικότητας ως προς το γονίδιο που αναζητήθηκε, έτσι προσέξτε ότι τα πρώτα σε κατάταξη αποτελέσματα αναφέρονται ακριβώς στο γονίδιο της β σφαιρίνης διαφόρων ειδών [του ανθρώπου (Homo sapiens), του ποντικού (Mus musculus) και του αρουραίου (Rattus norvegicus)], ενώ τα μετέπειτα αποτελέσματα που βρέθηκαν στην βάση δεδομένων αφορούν σε πρωτεΐνες με παρόμοιο όνομα και/ή λειτουργία. Επιλέγουμε τον υπερσύνδεσμο του γονιδίου της β σφαιρίνης του ανθρώπου.

Εικόνα 2. Εικόνα 3. 4. Στην οθόνη που εμφανίζεται είναι καταχωρημένες όλες οι πληροφορίες της βάσης δεδομένων που σχετίζονται με το γονίδιο της ανθρώπινης β σφαιρίνης, χωρισμένες σε ενότητες/καρτέλες. Η πρώτη ενότητα για

παράδειγμα περιέχει μια περίληψη (Summary) ορισμένων βασικών πληροφοριών για το γονίδιο. Η δεύτερη ενότητα έχει πληροφορίες για το γονιδιωματικό πλαίσιο (Genomic context), όπως την ταυτότητα του χρωμοσώματος και τη θέση του γονιδίου πάνω σε αυτό, τον αριθμό των εξωνίων αλλά και τα γειτονικά γονίδια. Οι επόμενες ενότητες περιλαμβάνουν πληροφορίες για τη γονιδιωματική περιοχή, τα μετάγραφα και τα προϊόντα του γονιδίου (Genomic region, transcripts and products), για την έκφραση του γονιδίου (Expression), για συσχέτιση του γονιδίου με κάποια ασθένεια (Phenotypes) κ.ά. Βρείτε την ενότητα «NCBI Reference Sequences (RefSeq)», όπου είναι καταχωρημένες οι επιβεβαιωμένες αλληλουχίες της γονιδιωματικής περιοχής, της πρωτεΐνης και του mrna (Εικόνα 4). Επιλέξτε τον υπερσύνδεσμο με την αλληλουχία του mrna (συμβολισμένη με τα αρχικά ΝΜ και έναν αριθμό πρόσβασης, ενώ τα αρχικά NP συμβολίζουν την αντίστοιχη αλληλουχία της πρωτεΐνης). Εικόνα 4. 5. Η επόμενη οθόνη περιέχει πλέον πληροφορίες για το mrna του γονιδίου που αναζητήσαμε (Εικόνα 5), ξεκινώντας με την ενότητα «Locus» όπου φαίνονται ο αριθμός πρόσβασης (ΝΜ_000518), το μέγεθος (626

νουκλεοτίδια), το είδος (γραμμικό, linear) και το όνομα του μορίου, ο οργανισμός προέλευσης και σχετικές βιβλιογραφικές αναφορές. Η ενότητα «Features» περιλαμβάνει επικεφαλίδες στο αριστερό τμήμα της σελίδας όπως «source», «gene», «exon» και «CDS, coding sequence» οι οποίες περιγράφονται στο δεξί τμήμα. Στην επικεφαλίδα «source» για παράδειγμα συνοψίζονται το μήκος της αλληλουχίας (1 628), ο οργανισμός προέλευσης, το είδος της αλληλουχίας που εξετάζεται (mrna), το χρωμόσωμα στο οποίο εντοπίζεται και η θέση της αλληλουχίας πάνω στο χρωμόσωμα. Παρόμοιες πληροφορίες χαρακτηρίζουν και τις υπόλοιπες επικεφαλίδες της ενότητας. Τέλος, στην ενότητα «Origin» περιλαμβάνεται η ίδια η αλληλουχία του mrna, σε μορφή όμως που δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω αναλύσεις καθώς μεταξύ των νουκλεοτιδίων περιλαμβάνονται κενά διαστήματα και αριθμοί. Προκειμένου να χρησιμοποιηθεί η αλληλουχία σε περαιτέρω αναλύσεις πρέπει πρώτα να μετατραπεί σε μορφή FASTA, όπου μεταξύ των νουκλεοτιδίων δεν παρεμβάλλεται τίποτα άλλο. Η επιλογή για να μετατραπεί η αλληλουχία σε πρότυπο FASTA βρίσκεται στην αρχή της σελίδας ακριβώς κάτω από το όνομα της αλληλουχίας και τον αριθμό πρόσβασης.

Εικόνα 5.

Στο δεξί άκρο της σελίδας υπάρχει ένα μενού επιλογών εργαλείων ανάλυσης της αλληλουχίας. Επιλέξτε τον σύνδεσμο «Pick Primers» για να μεταφερθείτε στο εργαλείο «Primer BLAST» (Εικόνα 6). Εικόνα 6. 6. Στην εικόνα 7 φαίνεται η οθόνη που αναδύεται για την αναζήτηση των εκκινητών. Στο πάνω αριστερό τμήμα υπάρχει ένα πεδίο αναζήτησης στο οποίο εισάγουμε την αλληλουχία για την οποία θέλουμε να σχεδιάσουμε εκκινητές. Την αλληλουχία ενδιαφέροντος μπορούμε να την προσθέσουμε είτε εισάγοντας στο πεδίο αναζήτησης τον αριθμό πρόσβασης είτε επικολλώντας την αλληλουχία σε μορφή FASTA. Παρατηρήστε ότι στη συγκεκριμένη περίπτωση ο αριθμός πρόσβασης είναι ήδη καταχωρημένος (ΝΜ_000518.5). Στη συνέχεια το πρόγραμμα εμφανίζει διάφορες παραμέτρους τις οποίες μπορεί ο χρήστης να αλλάξει κατ επιλογήν. Συνήθως οι προκαθορισμένες ρυθμίσεις που υπάρχουν για τις παραμέτρους αυτές είναι ικανοποιητικές και δεν χρειάζονται μεγάλες αλλαγές. Πάνω δεξιά, δίπλα στο πεδίο αναζήτησης, δίνεται στον χρήστη η επιλογή να οριοθετήσει την περιοχή της αλληλουχίας που θα αναγνωρίσει ο κάθε εκκινητής. Αν θέλουμε οι εκκινητές μας να ενισχύσουν όλο το γονίδιο, όπως για παράδειγμα θα ήταν απαραίτητο στην περίπτωση που θέλαμε να το κλωνοποιήσουμε, τότε θα επιλέγαμε οι εκκινητές να αναγνωρίζουν συγκεκριμένο εύρος νουκλεοτιδίων στην αρχή και

Εικόνα 7. το τέλος του γονιδίου. Σε περίπτωση που απλώς θέλουμε να ενισχύσουμε οποιοδήποτε τμήμα του γονιδίου για να δούμε αν το γονίδιο περιέχεται στο δείγμα που θέλουμε να αναλύσουμε, τότε δεν μας ενδιαφέρει η περιοχή όπου θα υβριδοποιηθούν οι εκκινητές και αφήνουμε κενά τα συγκεκριμένα πεδία.

Στη συνέχεια μπορούμε να επιλέξουμε το μέγεθος του προϊόντος της αντίδρασης PCR που θα προκύψει από τη χρήση των εκκινητών που σχεδιάζουμε. Οι προκαθορισμένες ρυθμίσεις έχουν ένα εύρος μεγέθους από 70 μέχρι 1000 νουκλεοτίδια. Για να διευκολύνουμε την αντίδραση PCR μπορούμε να επιλέξουμε ένα μικρότερου μεγέθους τελικό προϊόν, π.χ. με εύρος από 100 έως 400 νουκλεοτίδια (Εικόνα 8). Σε αυτήν την ενότητα επιλέγουμε επίσης τον αριθμό των αποτελεσμάτων που θέλουμε να μας προτείνει το πρόγραμμα και, πολύ σημαντικό, τη θερμοκρασία τήξης (Tm, melting temperature) των εκκινητών. Η θερμοκρασία τήξης των εκκινητών πρέπει να είναι μεταξύ των 50-65 C, επομένως οι προκαθορισμένες ρυθμίσεις είναι ικανοποιητικές. Στη συνέχεια μπορούμε να επιλέξουμε αν οι εκκινητές θα αναγνωρίζουν περιοχές σύνδεσης εξονίων. Στη συγκεκριμένη περίπτωση δεν μας ενδιαφέρει αυτή η παράμετρος, επομένως από το μενού κύλισης επιλέγουμε «No preference» (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Η τελευταία ενότητα περιλαμβάνει παραμέτρους για τον έλεγχο της ειδικότητας των εκκινητών, έτσι πρέπει να είναι πάντα ενεργοποιημένη η επιλογή «Specificity Check». Στα υπόλοιπα πεδία αφήνουμε τον αυτόματο τρόπο αναζήτησης και τη βάση δεδομένων RefSeq mrna και ελέγχουμε ότι

είναι επιλεγμένος ο σωστός οργανισμός. Αφήνουμε επίσης τις προκαθορισμένες ρυθμίσεις στο πεδίο Primer specificity stringency, που ορίζει την αυστηρότητα των κριτηρίων ειδικότητας των εκκινητών. Τέλος, είμαστε τώρα έτοιμοι να αναζητήσουμε τους εκκινητές πατώντας το κουμπί «Get primers» στο κάτω αριστερό άκρο της σελίδας. 7. Στην Εικόνα 9 φαίνεται η οθόνη με τα τελικά αποτελέσματα της αναζήτησής μας. Η σελίδα αυτή των αποτελεσμάτων αποτελείται πρώτα από ένα γραφικό τμήμα ακολουθούμενο από μία λεπτομερή περιγραφή. Και τα δύο τμήματα περιέχουν την ίδια περίπου πληροφορία σε διαφορετική όμως μορφή. Στο γράφημα καταρχήν παρουσιάζονται το mrna και το αντίστοιχο πρωτεϊνικό προϊόν σε γραμμική μορφή (μαύρη και κόκκινη γραμμή αντίστοιχα). Κάτω από την γραμμή του mrna απεικονίζονται με μπλε γραμμές τα προϊόντα που προκύπτουν από τα ζεύγη εκκινητών που προτείνει το πρόγραμμα. Οι ίδιοι οι εκκινητές παρουσιάζονται με τα μπλε βέλη. Στην λεπτομερή αναφορά που ακολουθεί περιγράφεται το κάθε ζεύγος εκκινητών χωριστά. Η σειρά προτίμησης των εκκινητών ακολουθεί τη συσχέτιση με τα κριτήρια που θέσαμε στην προηγούμενη ενότητα. Στην περιγραφή του κάθε ζεύγους εκκινητών αναγράφεται η αλληλουχία και το μέγεθος των εκκινητών, το μέγεθος του PCR προϊόντος που παράγουν, οι θερμοκρασίες τήξης τους, το περιεχόμενό τους σε γουανίνη και κυτοσίνη (GC%), το αν έχουν εσωτερική συμπληρωματικότητα (self complementarity), καθώς και η περιοχή του γονιδίου στην οποία υβριδοποιούνται. Αξιολογώντας τα χαρακτηριστικά αυτά (π.χ. οι δύο εκκινητές πρέπει να έχουν παραπλήσιες θερμοκρασίες τήξης, περιεκτικότητα σε GC περίπου 50% κ.ά., δείτε και άσκηση «Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης») επιλέγετε τελικά το επιθυμητό ζεύγος εκκινητών.

Εικόνα 9.

2.2. σε μια νουκλεοτιδική αλληλουχία Στο δεύτερο μέρος της πρακτικής άσκησης θα χρησιμοποιήσετε ένα εργαλείο διαθέσιμο ελεύθερα στο διαδίκτυο προκειμένου να εντοπίσετε τις θέσεις περιορισμού που υπάρχουν σε μία δεδομένη νουκλεοτιδική αλληλουχία. Το πρόγραμμα αυτό είναι το NEBcutter (http://nc2.neb.com/nebcutter2/), το οποίο ανιχνεύει τις θέσεις αναγνώρισης όλων των ενζύμων περιορισμού τύπου ΙΙ και των εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων τύπου ΙΙΙ και παράγει χρήσιμα δεδομένα όπως την απεικόνιση των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης που μπορεί να υπάρχουν στην αλληλουχία ενδιαφέροντος, χάρτες περιορισμού, οδηγίες για την διεξαγωγή αντιδράσεων πέψης, θέσεις μεθυλίωσης και συνδέσμους για την βάση δεδομένων των ενζύμων περιορισμού REBASE (http://rebase.neb.com). 1. Χρησιμοποιώντας τον περιηγητή ιστοσελίδων μεταβαίνουμε στην αρχική σελίδα του NEBcutter (http://nc2.neb.com/nebcutter2/) (Εικόνα 10). Η οθόνη διεπαφής έχει ένα πεδίο αναζήτησης στο οποίο εισάγεται η αλληλουχία ενδιαφέροντος, είτε ως αριθμός πρόσβασης είτε ως μορφή FASTA. Ακριβώς κάτω από το πεδίο αναζήτησης, το πρόγραμμα ζητάει να καθορίσουμε την μορφή της αλληλουχίας ενδιαφέροντος (γραμμική ή κυκλική), τα ένζυμα που θα χρησιμοποιήσει για να κατασκευάσει τον χάρτη περιορισμού (υπάρχει πληθώρα επιλογών για το συγκεκριμένο πεδίο όπως όλα τα εμπορικά διαθέσιμα ένζυμα ή όλες οι γνωστές αλληλουχίες αναγνώρισης περιορισμού κ.ά.) και το ελάχιστο μέγεθος του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (αν υπάρχει) που θα επιδείξει. Επίσης, στο πάνω δεξί άκρο της οθόνης το πρόγραμμα έχει δύο μενού πολλαπλών επιλογών («Plasmid vectors» και «Viral + phage»), όπου βρίσκονται ήδη αποθηκευμένες οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες αλληλουχίες πλασμιδίων, ιών και φάγων. 2. Επιλέξτε από το μενού πολλαπλών επιλογών το πλασμίδιο pbr322, εισάγετε την πληροφορία ότι η αλληλουχία είναι κυκλική και ορίστε στο πρόγραμμα να χρησιμοποιήσει όλα τα εμπορικά διαθέσιμα ένζυμα περιορισμού. Στη συνέχεια πατήστε το κουμπί «Submit» στο δεξί άκρο της σελίδας (Εικόνα 11).

Εικόνα 10. Εικόνα 11.

3. Η Εικόνα 12 εμφανίζει την αναδυόμενη οθόνη αποτελεσμάτων. Το πλασμίδιο απεικονίζεται στην κυκλική μορφή του και πάνω στο πλασμίδιο αναγράφονται όλα τα ένζυμα περιορισμού που κόβουν την αλληλουχία μία φορά. Το πρόγραμμα αναγνώρισε επίσης δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης μέσα στο πλασμίδιο, τα οποία απεικονίζονται με τα γκρι βέλη μέσα στο πλασμίδιο και αντιστοιχούν στις αλληλουχίες παραγωγής των πρωτεϊνών τετρακυκλίνης (a) και β λακταμάσης (b). Στο πάνω αριστερό άκρο εμφανίζεται ένα υπόμνημα που επεξηγεί τον τρόπο δράσης των ενζύμων περιορισμού. Εικόνα 12. Στο κάτω μέρος της οθόνης εμφανίζονται τέσσερις στήλες με πολλαπλές επιλογές. Επιλέγοντας από τη στήλη «Main options» το μενού «Custom digest» έχουμε τη δυνατότητα να σχεδιάσουμε πολύ εύκολα μία αντίδραση πέψης. Η επιλογή «View sequence» μας μεταφέρει στην καταχώρηση της αλληλουχίας που αναζητήσαμε στο NCBI, ενώ η επιλογή «ORF summary» εμφανίζει έναν πίνακα όπου συνοψίζονται τα χαρακτηριστικά των ανοιχτών

πλαισίων ανάγνωσης που περιέχονται στην αλληλουχία. Οι επιλογές στη δεύτερη στήλη «Availability» εμφανίζουν πληροφορίες για τη διαθεσιμότητα των ενζύμων περιορισμού. Οι επιλογές στην τρίτη στήλη «Display» αλλάζουν την απεικόνιση του κεντρικού γραφήματος σε μορφές που να εμφανίζουν τα ένζυμα που κόβουν δύο ή τρεις φορές το πλασμίδιο («2 cutters» και «3 cutters» αντίστοιχα) αλλά και σε μορφή που εμφανίζει το πλασμίδιο γραμμικό («linear») με τα ένζυμα που το κόβουν μία φορά (Εικόνα 13). Η μορφή αυτή απεικόνισης είναι πολύ χρήσιμη γιατί μπορεί να περιέχει πληροφορίες για ένζυμα που δεν φαίνονται στην κυκλική απεικόνιση και γιατί, με αυτόν τον τρόπο, μπορούμε πολύ εύκολα να εντοπίσουμε τα ένζυμα που δρουν εκατέρωθεν των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης, κάτι εξαιρετικά χρήσιμο στην περίπτωση που θέλουμε να απομονώσουμε το συγκεκριμένο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης για να το μεταφέρουμε σε έναν άλλο φορέα. Π.χ., για να πραγματοποιηθεί εκτομή του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης που κατευθύνει την έκφραση της πρωτεΐνης β λακταμάση αρκεί να τεμαχίσουμε τον πλασμιδιακό φορέα pbr322 με τα ένζυμα BspHI και EarI. Εικόνα 14. Τέλος, η στήλη «List» παρέχει λίστες όπου αναγράφονται τα ένζυμα περιορισμού, η αλληλουχία αναγνώρισής τους και η θέση όπου αυτή βρίσκεται πάνω στην πλασμιδιακή αλληλουχία που χρησιμοποιήσαμε.

3. Βιβλιογραφία 1. Κ. Μπούρτζης, Εργαστηριακές Ασκήσεις Βιολογίας ΙΙ, Σχολή Θετικών Επιστημών και Τεχνολογίας, Ελληνικό Ανοικτό Πανεπιστήμιο, 2008. 2. Ιστοσελίδα NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 3. Ιστοσελίδα NEBcutter (http://nc2.neb.com/nebcutter2/)