1- ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ

DX CT/NG/MG ASSAY 96 εξετάσεις 37005 Άμεση ανίχνευση των μικροοργανισμών Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae και Mycoplasma genitalium μέσω εξέτασης PCR σε πραγματικό χρόνο 1- ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το κιτ Dx CT/NG/MG Assay είναι ένα κιτ για in vitro πολυπαραμετρικού ποσοτικό προσδιορισμό νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, με ενίσχυση, το οποίο επιτρέπονταςι την άμεση ανίχνευση, σε ένα μόνο σωλήνα, των βακτηρίων Chlamydia trachomatis (χλαμύδια του τραχώματος), Neisseria gonorrhoeae (μικρόβιο του γονόκοκκου) και Mycoplasma genitalium (μυκόπλασμα) σε κλινικά δείγματα ατόμων με ή χωρίς συμπτώματα. Το κιτ Dx CT/NG/MG Assay προορίζεται για χρήση σε ενδοτραχηλικά, κολπικά και ορθοπρωκτικά (από άνδρες και γυναίκες) δείγματα στυλεών που συλλέγονται από κλινικό προσωπικό σε, κολπικά δείγματα 1 στυλεών που συλλέγονται από ασεθενείς 1 καθώς και σε δείγματα ούρων ανδρών και γυναικών. 1 Που συλλέγονται με το κιτ Bio-Rad Dx Collection System-F50 (αρ. κατ. #37007). 2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Το Chlamydia trachomatis εμφανίζεται υποχρεωτικά εως ένα ενδοκυτταρικό παρασιτικό βακτήριο, το οποίο προκαλεί το πιο κοινό σεξουαλικώς μεταδιδόμενο νόσημα στις βιομηχανοποιημένες χώρες, με περίπου 89 εκατομμύρια νέα περιστατικά ετησίως, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (Π.Ο.Υ) (1). Η λοίμωξη που προκαλείται από το Chlamydia trachomatis είναι συχνά ασυμπτωματική και στις γυναίκες και στους άνδρες και αν δεν θεραπευθεί μπορεί να επιφέρει σοβαρές κλινικές συνέπειες όπως φλεγμονώδη νόσο της πυέλου (PID), εκτοπική εγκυμοσύνη, υπογονιμότητα λόγω σαλπίγγων (2) στις γυναίκες ή μη γονοκοκκική ουρηθρίτιδα και επιδιδυμίτιδα στους άνδρες (3). Οι μοριακές διαγνωστικές εξετάσεις, καθώς χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και βαθμό επακριβούς προσδιορισμού (ειδικότητα) σε σχέση με άλλες υπάρχουσες τεχνολογίες, συνιστώνται πλέον για την ανίχνευση των λοιμώξεων από Chlamydia trachomatis (4). Το Neisseria gonorrhoeae είναι ένα μη κινητικό Gram- διπλόκοκκο βακτήριο που προκαλεί περίπου 62 εκατομμύρια νέα περιστατικά γονόρροιας παγκοσμίως κάθε χρόνο (1). Οι κλινικές συνέπειες είναι παρόμοιες με αυτές που προκαλεί το Chlamydia trachomatis, αλλά συχνά με πιο σοβαρά συμπτώματα. Η καλλιέργεια κυττάρων, που χρησιμοποιείται συχνά για την ανίχνευση του N. gonorrhoeae, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το σωστό χειρισμό του δείγματος και από τη βιωσιμότητα των βακτηρίων στα δείγματα. Οι μοριακές διαγνωστικές εξετάσεις μπορούν, επομένως, να συνδυαστούν με τις συμβατικές τεχνικές για την ανίχνευση του N. gonorrhoeae, προσφέροντας ιδιαίτερα πλεονεκτήματα. Το Mycoplasma genitalium είναι ένα μικρό βακτήριο που αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως συχνός παράγοντας πρόκλησης ουρηθρίτιδας στους άνδρες και λοιμώξεων του κατώτερου γεννητικού συστήματος στις γυναίκες, με συμπτώματα και ενδείξεις στο μικροσκόπιο παρόμοια με αυτά που παρατηρούνται στην περίπτωση του Chlamydia trachomatis. Υπάρχουν επίσης υποψίες ότι οι λοιμώξεις από M. genitalium ευθύνονται για την πρόκληση υπογονιμότητας καθώς μπορεί να επηρεάσει την φυσιολογική τις σάλπιγγες των γυναικών (5-13). Οι μοριακές διαγνωστικές εξετάσεις είναι η μέθοδος που πρέπει να επιλέγεται για την ανίχνευση του Mycoplasma genitalium, καθώς η καλλιέργειά του είναι ιδιαίτερα δύσκολη. 3. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay περιλαμβάνει δύο κύρια βήματα: προετοιμασία δείγματος και ενίσχυση/ανίχνευση του DNAστόχος μέσω αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα προϊόντα της ενίσχυσης ανιχνεύονται κατά την αντίδραση PCR με φθορίζουσες χρωστικές ύλες. Με κάθε δείγμα, απομονώνεται, ενισχύεται και ανιχνεύεται συστηματικά ένα εσωτερικό δείγμα (νουκλεοτιδική αλληλουχία) ελέγχου με τον ίδιο τρόπο όπως και το DNA-στόχος, γεγονός που επιτρέπει τον έλεγχο της διαδικασίας εξαγωγής και της ανίχνευσης ενδεχόμενης αναστολής της αντίδρασης PCR. Το κιτ περιέχει όλα τα απαραίτητα αντιδραστήρια για τη διεξαγωγή της προετοιμασίας δειγμάτων και της ενίσχυσης/ανίχνευσης, για 96 εξετάσεις. Προετοιμασία δείγματος Η εξαγωγή DNA διεξάγεται σε όλους τους τύπους δειγμάτων που παρατίθενται στο κεφάλαιο «Συλλογή και χειρισμός δειγμάτων», με χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (L1) που παρέχεται με το κιτ (μέθοδος Bio-Rad Chelex). Μαζί με τα δείγματα, κατά τη διάρκεια ολόκληρης της διαδικασίας προετοιμασίας δείγματος λαμβάνεται ένα δείγμα ελέγχου αρνητικού. Το Εσωτερικό δείγμα ελέγχου (C1) προστίθεται σε κάθε δείγμα και στο δείγμα ελέγχου αρνητικού στην αρχή της διαδικασίας προετοιμασίας δείγματος. 1

Ενίσχυση/Ανίχνευση PCR σε πραγματικό χρόνο Στην αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιούνται συγκεκριμένοι ανιχνευτές φθορισμού ολιγονουκλεοτιδίων για την ανίχνευση του DNA κατά την ενίσχυση, μέσω υβριδοποίησης με τα αμπλικόνια. Στη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay, χρησιμοποιούνται τέσσερις διαφορετικοί ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίων: Ανιχνευτής C. trachomatis που επικεντρώνεται σε μια ακολουθία του κρυπτικού πλασμιδίου. Αυτή η στοχευόμενη ακολουθία εντοπίζεται εκτός της νουκλεοτιδικής περιοχής που έχει απαληφθεί στο νέο μεταλαγμένο στέλεχος του C. trachomatis (nvct) το οποίο χαρακτηρίστηκε πρόσφατα (14). Ανιχνευτής N. gonorrhoeae που επικεντρώνεται σε μια νουκλεοτιδική ακολουθία του γονιδίου pile. Αυτή η στοχευόμενη ακολουθία παρουσιάζεται και σε κάποια από τα στελέχη του N. meningitidis (βακτήριο της μηνιγγίτιδας), γεγονός που μπορεί, σε σπάνιες περιπτώσεις, να οδηγήσει σε ενδεχόμενα ψευδή θετικά αποτελέσματα NG. Αυτό δεν αποτελεί πρόβλημα καθώς το βακτήριο N. meningitidis μπορεί να αντιμετωπιστεί με τα ίδια φάρμακα όπως και το N. gonorrhoeae. Ανιχνευτής M. genitalium που επικεντρώνεται σε μια ακολουθία του γονιδίου MgPa. Ανιχνευτής εσωτερικού δείγματος ελέγχου Όταν δεν υπάρχει DNA-στόχος σε έναν δεδομένο ανιχνευτή ολιγονουκλεοτιδίων, δεν εκπέμπεται ο αντίστοιχος φθορισμός, επομένως δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Όταν υπάρχει DNA-στόχος, η ένταση του φθορισμού αυξάνεται όσο αυξάνεται η ποσότητα των αμπλικονίων με κάθε γύρο ενίσχυσης. Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου της αντίδρασης PCR, στο βήμα ανόπτησης, η οπτική μονάδα του συστήματος Dx Real-Time System καταμετράει το φθορισμό που λαμβάνεται από κάθε φθοριοφόρο και το συνδεδεμένο λογισμικό Dx Real-Time Software διαγράφει την ένταση φθορισμού έναντι του αριθμού των κύκλων. Στο τέλος της ανάλυσης, το λογισμικό Dx Real-Time Software αναλύει αυτόματα τα αποτελέσματα για όλα τα δείγματα και τα δείγματα ελέγχου. 4. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΚΙΤ DX CT/NG/MG ASSAY 4.1. Περιγραφή Μαζί με το κιτ παρέχονται αντιδραστήρια και αναλώσιμα που επαρκούν για τη διεξαγωγή 96 εξετάσεων. Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση. Επισήμανση Αντιδραστήρια Παρουσίαση L1 Lysis Buffer Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: Ρητίνη Chelex σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Συντηρητικό: 0,03 ProClin 300. Κάθε φιάλη περιέχει μία μαγνητική ράβδο ανάδευσης. 2 x 21 ml Έτοιμο προς χρήση R1 Amplification Mix Συμπυκνωμένο μίγμα ενίσχυσης, 10X: Πολυμεράση DNA σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα PCR που περιέχει εκκινητές, συγκεκριμένους ανιχνευτές φθορισμού ολιγονουκλεοτιδίων, τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntp), γλυκοσιδάσες ουρακίλης DNA (UDG) και χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl). 2 Συντηρητικό: 0,05 αζίδιο νατρίου. 2 x 150 µl Προς αραίωση με προσθήκη του R2 R2 C1 C3 Amplification Mix Diluent Internal Control Positive Control Αραιωτικό μίγματος ενίσχυσης: Ρυθμιστικό διάλυμα PCR που περιέχει χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl). 2 Συντηρητικό: 0,05 αζίδιο νατρίου. Εσωτερικό δείγμα ελέγχου: Μη λοιμώδες DNA σε ρυθμιστικό διάλυμα. Συντηρητικό: 0,03 ProClin 300. Δείγμα ελέγχου θετικού CT, NG, MG: Μη λοιμώδες DNA από CT, NG και MG σε ρυθμιστικό διάλυμα. Κίτρινου χρώματος. Συντηρητικό: 0,03 ProClin 300. 2 x 900 µl Έτοιμο προς χρήση 2 x 1.050 µl Έτοιμο προς χρήση 1 x 600 µl Έτοιμο προς χρήση Dx 24-Well PCR Strips Θερμικές πλάκες: Λευκές μικροπλάκες 24 βυθισμάτων, με γραμμικούς κώδικες για μοναδική αναγνώριση ταυτότητας. 4 Dx 8-Cap Strips Καλύμματα λωρίδων: Λωρίδες με 8 καλύμματα για τις θερμικές πλάκες. 12 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Δείγμα ελέγχου αρνητικού: το δείγμα ελέγχου αρνητικού είναι ένα δείγμα του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης L1. Επομένως, επισημαίνεται ένας κενός μικροσωλήνας 2 ml με βιδωτό πώμα ως «Δείγμα ελέγχου αρνητικού» και υφίσταται την επεξεργασία από το βήμα 5 της εξαγωγής DNA (δείτε κεφάλαιο 8.1) 2

4.2. Αποθήκευση και απαιτήσεις χειρισμού Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C. Όταν αποθηκεύεται σε αυτήν τη θερμοκρασία, κάθε αντιδραστήριο που περιέχεται στο κιτ Dx CT/NG/MG Assay μπορεί να χρησιμοποιηθεί μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα του αντιδραστηρίου. Αναγνωριστικά στοιχεία L1 C1 C3 R1+R2 (ανασυσταμένο μίγμα) Συντήρηση μετά το άνοιγμα 6 μήνες στους 2-8 C. Αν κάποιο από αυτά τα αντιδραστήρια επιμολυνθεί, απορρίψτε το. 2-8 C μέχρι την ημερομηνία λήξης. Αν το αντιδραστήριο επιμολυνθεί, απορρίψτε το. 4 ώρες στους 18-30 C ή 16 ώρες στους 2-8 C ή 2 εβδομάδες στους -20 C. Αν καταψυχθεί, το ανασυσταμένο μίγμα μπορεί να αποψυχθεί μόνο μία φορά. 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση. 5.1. Προφυλάξεις υγείας και ασφαλείας Φοράτε γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά κατά το χειρισμό των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων. Πλένετε προσεκτικά τα χέρια σας μετά το χειρισμό των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων. Μην καταναλώνετε ποτά και τρόφιμα ή μην καπνίζετε στους προσδιορισμένους χώρους εργασίας. Χειρίζεστε όλα τα δείγματα ως δυνητικά μολυσματικά, σύμφωνα με την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Ο χειρισμός και η απόρριψη των χημικών πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας διατίθεται κατόπιν αιτήματος από τον αντιπρόσωπο της Bio-Rad στην περιοχή σας. 5.2. Προφυλάξεις ως προς τη διαδικασία Το παρόν κιτ είναι πιστοποιημένο για χρήση μόνο με το σύστημα Dx Real-Time System (Bio-Rad) και με το αντίστοιχο λογισμικό Dx Real-Time Software. Για τη συλλογή των ενδοτραχηλικών, κολπικών και ορθο-πρωκτικών δειγμάτων που συλλέγονται από κλινικό προσωπικό με την χρήση στυλεών αλλά και των κολπικών δειγμάτων στυλεών που συλλέγονται από ασθενείς, χρησιμοποιείτε μόνο το σύστημα Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, αρ. κατ. 37007). Το παρόν σύστημα δεν προορίζεται για οικιακή χρήση. Για τη συλλογή των δειγμάτων του πρώτου μέρους της ροής των ούρων, χρησιμοποιείτε καθαρούς ουροσυλλέκτες από πολυπροπυλένιο, χωρίς συντηρητικά. Μην χρησιμοποιείτε το σύστημα Dx Collection System-F50 αν έχει φθαρεί η συσκευασία ή αν το μέσο μεταφοράς έχει διαρρεύσει από το σωλήνα. Η απόρριψη των συστημάτων που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί, που έχουν φθαρεί ή που παρουσιάζουν διαρροή πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Αν το εργαστήριο παραλάβει ένα δείγμα στυλεού που δεν έχει συλλεγεί και μεταφερθεί με το σύστημα Dx Collection System-F50, ή ένα σωλήνα μεταφοράς δείγματος στυλεού που δεν περιέχει στυλεό ή που περιέχει δύο στυλεούς, το δείγμα πρέπει να απορριφθεί. Μην χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην ανταλλάσσετε, αναμιγνύετε ή συνδυάζετε αντιδραστήρια από κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας. Μην αλλάζετε τη διαδικασία της δοκιμασίας. Αποφεύγετε προσεκτικά τη διασταυρούμενη μόλυνση κατά τη διαδικασία χειρισμού των δειγμάτων: Βεβαιωθείτε ότι τα δοχεία των δειγμάτων δεν έρχονται σε επαφή το ένα με το άλλο. Αν τα γάντια σας έρθουν σε επαφή με το δείγμα, αλλάξτε τα αμέσως. Χρησιμοποιείτε νέο φίλτρο για κάθε δείγμα. Χρησιμοποιείτε μικροσωλήνες και φίλτρα χωρίς δεοξυριβονουκλεάση και ριβονουκλεάση. Διεξάγετε προσεκτικά την ανασύσταση του μίγματος ενίσχυσης, αποφεύγοντας τυχόν επιμόλυνσή του. Ελέγχετε τις πιπέτες και τον υπόλοιπο εξοπλισμό ως προς την ακρίβεια και τη σωστή λειτουργία τους. Αποφεύγετε την έκχυση των δειγμάτων ή των διαλυμάτων που περιέχουν δείγματα. Οι εκχύσεις πρέπει να ξεπλένονται με χλωρίνη αραιωμένη κατά 10. Το υλικό που χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για επιμολυσμένα απορρίμματα. Οι επιφάνειες εργασίας, οι πιπέτες και ο υπόλοιπος εξοπλισμός πρέπει να απολυμαίνονται σε τακτική βάση με χλωρίνη αραιωμένη κατά 1. Χώροι εργασίας: εντός του εργαστηρίου, πρέπει να χρησιμοποιούνται δύο αποκλειστικοί χώροι μιάς κατεύθυνσης για τη διεξαγωγή των βημάτων προετοιμασίας δείγματος και ενίσχυσης/ ανίχνευσης: 1. Ο χώρος προ ενίσχυσης προορίζεται αποκλειστικά για: (α) την προετοιμασία των δειγμάτων και των δειγμάτων ελέγχου και (β) την ετοιμασία για την αντίδραση PCR (τοποθέτηση με πιπέτα του μίγματος ενίσχυσης, των δειγμάτων ελέγχου και των δειγμάτων στις λωρίδες Dx 24-Well PCR Strips). Αυτά τα δύο βήματα πρέπει να διεξάγονται σε δύο σαφώς διακεκριμένες ζώνες του χώρου προ ενίσχυσης. 2. Ο χώρος ενίσχυσης προορίζεται αποκλειστικά για την αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο. Όλα τα αντιδραστήρια, ο εξοπλισμός και οι ποδιές εργαστηρίου που χρησιμοποιούνται στον ένα χώρο πρέπει να παραμένουν σε αυτόν και να μην μεταφέρονται ποτέ στον άλλο χώρο. Ποτέ μην μεταφέρετε προϊόντα ενίσχυσης ή εξοπλισμό από το χώρο ενίσχυσης στο χώρο προ ενίσχυσης. 3

6. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 6.1. Δείγματα στυλεών που συλλέγονται με το σύστημα Bio-Rad Dx Collection System-F50 Το κιτ Dx CT/NG/MG Assay προορίζεται για χρήση με ενδοτραχηλικά, κολπικά και ορθοπρωκτικά (από άνδρες και γυναίκες) δείγματα στυλεών που συλλέγονται από κλινικό προσωπικό και με κολπικά δείγματα στυλεών που συλλέγονται από ασθενείς. Η συλλογή και η μεταφορά των δειγμάτων πρέπει να πραγματοποιούνται μόνο με το σύστημα Dx Collection System-F50. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη συλλογή και τη μεταφορά των δειγμάτων, ανατρέξτε στο ένθετο της συσκευασίας του συστήματος Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, αρ. κατ. 37007). Οι σωλήνες μεταφοράς που περιέχουν στυλεούς οι οποίοι δεν παρέχονται από την Bio-Rad, ή πολλούς στυλεούς ή που δεν περιέχουν κανέναν στυλεό δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν με το κιτ Dx CT/NG/MG Assay. Η παρουσία αίματος ή κάποιων σπερματοκτόνων ουσιών και φαρμάκων για την αντιμετώπιση κολπικών περιστατικών ενδέχεται να επηρεάσει την αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις ουσίες που μπορούν να επηρεάσουν την αντίδραση, ανατρέξτε στο κεφάλαιο «Χαρακτηριστικά απόδοσης». Μετά τη συλλογή τους, τα δείγματα στυλεών μπορούν να διατηρηθούν έως 28 ημέρες στους 18-30 C ή στους 4 C. 6.2. Δείγματα ούρων Το κιτ Dx CT/NG/MG Assay προορίζεται για χρήση με δείγματα ούρων ανδρών και γυναικών από ασθενείς που παρουσιάζουν ή δεν παρουσιάζουν συμπτώματα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: ο ασθενής δεν πρέπει να έχει ουρήσει για τουλάχιστον 1 ώρα πριν από τη συλλογή του δείγματος. 1. Συλλέξτε 10-20 ml από το πρώτο μέρος της ροής των ούρων σε έναν καθαρό ουροσυλλέκτη από πολυπροπυλένιο, χωρίς συντηρητικά. 2. Κλείστε το πώμα και αναγράψτε στην ετικέτα τα αναγνωριστικά στοιχεία του ασθενή και την ημερομηνία/ώρα συλλογής. 3. Μεταφέρετε τα δείγματα στον τόπο εξέτασης σε θερμοκρασία δωματίου (18-30 C). Τα δείγματα ούρων παραμένουν σταθερά για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Αν η ανάλυση δεν μπορεί να διεξαχθεί μέσα σε 24 ώρες από τη συλλογή, τα δείγματα ούρων πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C και να αναλύονται μέσα σε 7 ημέρες. 4. Τα δείγματα ούρων που αναλύονται σε εξωτερικούς τόπους εξέτασης πρέπει να μεταφέρονται στον τόπο εξέτασης μέσα σε 24 ώρες από τη συλλογή τους. Αν επιλεγεί η αποστολή σε θερμοκρασία δωματίου, τα δείγματα πρέπει να αποθηκευθούν στους 2-8 C πριν από την αποστολή και μετά την άφιξή τους, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι η αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες από τη συλλογή. 7. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ 7.1. Παρεχόμενα υλικά Dx CT/NG/MG Assay (Bio-Rad, αρ. κατ. # 37005) 7.2. Απαιτούμενα υλικά που πωλούνται ξεχωριστά Σύστημα Dx Real-Time System, λογισμικό Dx Real-Time Software, Η/Υ και εξαρτήματα (Bio-Rad, αρ. κατ. συσκευασίας 94000) Εργαλείο Dx Strip Cap Tool (παρέχεται με τη συσκευασία του συστήματος Dx Real-Time System, Bio-Rad αρ. κατ. 94000) Σύστημα Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, αρ. κατ. 37007) για συλλογή και μεταφορά δειγμάτων στυλεών από γυναίκες και ορθοπρωκτικών δειγμάτων στυλεών 7.3. Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Καθαροί ουροσυλλέκτες από πολυπροπυλένιο, χωρίς συντηρητικά Επιτραπέζια φυγόκεντρος για τις θερμικές πλάκες PCR Επιτραπέζια φυγόκεντρος για τους μικροσωλήνάρια 1,5 ml και 2 ml Θερμαινόμενο μπλοκ που μπορεί να φτάσει τους 105 C Αναμικτήρας με στρόβιλο (vortex) Μαγνητικός αναδευτήρας Βαθμονομημένες πιπέτες 10 έως 1.000 µl Αποστειρωμένα ρύγχοι πιπετών με φίλτρα Επαναληπτική πιπέτα θετικής μετατόπισης με αποστειρωμένα ρύγχοι 1,25 ml σε ξεχωριστή συσκευασία Μικροσωληνάρια 2 ml με βιδωτό πώμα για ερμητικό κλείσιμο και καμπύλο κάτω μέρος (Simport αρ. κατ. T335-6S ή αντίστοιχοι) Γάντια μίας χρήσης χωρίς πούδρα 4

8. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Ακολουθείτε αυστηρά αυτές τις οδηγίες και εφαρμόζετε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. 8.1. Εξαγωγή DNA 1. Προσδιορίστε τον αριθμό των προς εξέταση δειγμάτων και λάβετε ένα μικροσωλήνα με βιδωτό πώμα ανά δείγμα συν άλλον ένα για το δείγμα αρνητικού ελέγχου. Επισημάνετε με αναγνωριστικά στοιχεία κάθε μικροσωλήνα. 2. Προσθέστε 1 ml από κάθε δείγμα (μέσο μεταφοράς ή ούρα) στον αντίστοιχο μικροσωλήνα. Αφήστε σε αυτό το βήμα ένα μικροσωλήνα κενό για το δείγμα αρνητικού ελέγχου. 3. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 5.000 g και στη συνέχεια απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό γυρίζοντας κάθε μικροσωλήνα ανάποδα. 4. Ανακινήστε τη φιάλη με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (L1) γυρίζοντάς το ανάποδα και στη συνέχεια τοποθετήστε τη σε έναν μαγνητικό αναδευτήρα, ώστε η ρητίνη Chelex να παραμείνει υπό μορφή αιωρήματος. 5. Χορηγήστε 400 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (L1) σε κάθε μικροσωλήνα, συμπεριλαμβανομένου του μικροσωλήνα για το δείγμα αρνητικού ελέγχου. 6. Προσθέστε 10 µl από το εσωτερικό δείγμα ελέγχου (C1) σε κάθε μικροσωλήνα. Βιδώστε καλά τα πώματα. Σημείωση: Εναλλακτικά, μπορείτε να προετοιμάσετε ένα μίγμα "L1+C1" και στη συνέχεια να χορηγείστε 410 µl από αυτό το μίγμα σε κάθε μικροσωληνάριο. Ο σωλήνας του μίγματος πρέπει στη συνέχεια να αναμιχθεί με στροβιλισμό πριν από κάθε χορήγηση με την πιπέτα, ώστε η ρητίνη Chelex να παραμείνει ως ως εναιώρημα. Το μίγμα αυτό διατηρείται σταθερό για 5 ημέρες στους 2-8 C. Παραδείγματα προμίγματος: 12 εξετάσεις 24 εξετάσεις 48 εξετάσεις L1 5 ml 10 ml C1 125 µl 250 µl Προσθέστε 525 µl C1 απευθείας σε 1 φιάλη με L1 7. Αναμίξτε με στροβιλισμό για 15-20 δευτερόλεπτα. 8. Επωάστε για 10 λεπτά ± 2 λεπτά στους 105 C. 9. Αφήστε το για 2 λεπτά ώστε να επανέλθει σε θερμοκρασία δωματίου (18-30 C). 10. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 4.000 g. Το υπερκείμενο υγρό περιέχει το εξαγόμενο DNA. Το εξαγόμενο DNA μπορεί να διατηρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Αν το βήμα ενίσχυσης/ανίχνευσης δεν πραγματοποιηθεί εντός 2 ωρών, το εξαγόμενο DNA μπορεί να αποθηκευθεί στους 2-8 C για έως 4 ημέρες. Για πιο μακρόχρονη αποθήκευση, το εξαγόμενο DNA πρέπει να αποθηκευθεί στους -20 C για έως 6 μήνες. 8.2. Ανασύσταση του μίγματος ενίσχυσης Πριν από την ανασύσταση, τα φιαλίδια R1 (Συμπυκνωμένο μίγμα ενίσχυσης, 10X) και R2 (Αραιωτικό μίγματος ενίσχυσης) πρέπει να αναμιχθούν με στροβιλισμό για 5 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια να πραγματοποιηθεί φυγοκέντρησή τους για 15 δευτερόλεπτα. Προσθέστε ακριβώς 850 µl αραιωτικού μίγματος ενίσχυσης (R2) σε ένα φιαλίδιο συμπυκνωμένου μίγματος ενίσχυσης (R1). Αναμίξτε τα με στροβιλισμό για 10 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για σύντομο χρονικό διάστημα. Ένα φιαλίδιο ανασυσταμένου μίγματος ενίσχυσης (R1+R2) επαρκεί για 48 αντιδράσεις PCR σε πραγματικό χρόνο. Προετοιμάστε όσα φιαλίδια ανασυσταμένου μίγματος ενίσχυσης (R1+R2) απαιτούνται (για παράδειγμα, 2 φιαλίδια αν πρόκειται να διεξάγετε 96 εξετάσεις). Το ανασυσταμένο μίγμα ενίσχυσης (R1+R2) μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως ή να διαιρεθεί και να αποθηκευθεί στους -20 C για έως 2 εβδομάδες. 8.3. Ενίσχυση/Ανίχνευση PCR σε πραγματικό χρόνο Για πιο αναλυτικές πληροφορίες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος Dx Real-Time System. Κάθε εκτέλεση δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει ένα δείγμα αρνητικού ελέγχου και ένα δείγμα θετικού ελέγχου. Στο χώρο προ ενίσχυσης: 1. Πραγματοποιήστε ανασύσταση όσων φιαλιδίων μίγματος ενίσχυσης απαιτούνται, ακολουθώντας τη διαδικασία του κεφαλαίου 8-2 (αριθμός εξετάσεων = n δείγματα + 1 δείγμα ελέγχου θετικού + 1 δείγμα ελέγχου αρνητικού). 2. Λάβετε τον απαιτούμενο αριθμό λωρίδων Dx 24-Well PCR Strips, τοποθετήστε τις σε μια θήκη και χορηγήστε προσεκτικά, με την επαναληπτική πιπέτα, 20 µl ανασυσταμένου μίγματος ενίσχυσης (R1+R2) σε κάθε βύθισμα. 3. Προσθέστε 5 µl από το εξαγόμενο DNA ή από το εξαγόμενο δείγμα ελέγχου αρνητικού ή από το μη εξαγόμενο δείγμα ελέγχου θετικού (C3) στα αντίστοιχα βυθίσματα, ακολουθώντας τον καθορισμένο χάρτη πλάκας. 4. Τοποθετήστε τα καλύμματα Dx 8-Cap Strips στις λωρίδες Dx 24-Well PCR Strips. Κλείστε τα καλά με το εργαλείο Dx Strip Cap Tool (παρέχεται με το σύστημα Dx Real-Time System) προκειμένου να αποφευχθεί η εξάτμιση κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. 5. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση των λωρίδων Dx 24-Well PCR Strips για 30 δευτερόλεπτα στα 400 g, προκειμένου να αποφύγετε την παρουσία φυσαλίδων στα βυθίσματα. 5

Στο χώρο ενίσχυσης: 6. Ενεργοποιήστε, με την ακόλουθη σειρά, τον υπολογιστή και στη συνέχεια το σύστημα Dx Real-Time System. Ανοίξτε το λογισμικό Dx Real-Time Software και επιλέξτε "Dx CT/NG/MG" στο παράθυρο "PCR kit" (κιτ PCR). Σημείωση: Για να εισαγάγετε παραγγελίες εξέτασης στο λογισμικό Dx Real-Time Software (προαιρετικά), χρησιμοποιήστε ως όνομα δοκιμασίας το "CT_NG_MG". Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης του λογισμικού Dx Real-Time Software. 7. Για να καθορίσετε το χάρτη πλάκας, ακολουθήστε τις οδηγίες του λογισμικού Dx Real-Time Software. 8. Τοποθετήστε τις λωρίδες Dx 24-Well PCR Strips στο σύστημα Dx Real-Time System όπως υποδεικνύεται από το λογισμικό Dx Real-Time Software και εκτελέστε την αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο. 9. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο, αφαιρέστε τις λωρίδες Dx 24-Well PCR Strips από το σύστημα Dx Real-Time System, τοποθετήστε τις σε μια σφραγιζόμενη πλαστική σακούλα και απορρίψτε τις σύμφωνα με την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. 9. ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου PCR, στο βήμα ανόπτησης, η οπτική μονάδα του συστήματος Dx Real-Time System καταμετράει το φθορισμό που λαμβάνεται από κάθε φθοριοφόρο και το συνδεδεμένο λογισμικό Dx Real-Time Software διαγράφει την ένταση φθορισμού έναντι του αριθμού των κύκλων. Στο τέλος του πειράματος, το λογισμικό αναλύει αυτόματα τα αποτελέσματα για όλα τα δείγματα και τα δείγματα ελέγχου. Το λογισμικό Dx Real-Time Software χρησιμοποιεί έναν αποκλειστικό μαθηματικό αλγόριθμο για να προσδιορίσει τις τιμές ενός συνόλου μαθηματικών παραμέτρων (μεταξύ αυτών οι τιμές Ceep και F0) για κάθε καμπύλη PCR, οι οποίες στη συνέχεια εμφανίζονται στο λογιστικό φύλλο αποτελεσμάτων. Η εκτίμηση αυτών των παραμέτρων βασίζεται στην υπόθεση ότι η ταχύτητα αποδοτικότητας της αντίδρασης PCR είναι μέγιστη στην αρχή της αντίδρασης και μειώνεται μετά από έναν αριθμό κύκλων ο οποίος διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων. Η τιμή Ceep (Cycle of end of exponential phase -Κύκλος τέλους εκθετικής φάσης) αντιστοιχεί στον κύκλο κατά τον οποίο αρχίζει να μειώνεται η αποδοτικότητα PCR. Η τιμή Ceep συνήθως βρίσκεται κοντά στον κύκλο όπου το σήμα φθορισμού αρχίζει να αναπτύσσεται επάνω από το θόρυβο της αντίδρασης.. Σε ιδανικές συνθήκες PCR (καμία παρεμπόδιση της αντίδρασης, υψηλή αποδοτικότητα), η τιμή Ceep συσχετίζεται με τον αριθμό αντιγραφής της ακολουθίας-στόχος στο δείγμα πριν από την ενίσχυση: όσο πιο υψηλή είναι η τιμή Ceep, τόσο πιο χαμηλός είναι ο αρχικός αριθμός αντιγραφής. Η τιμή F0 αντιστοιχεί στο -μη μετρήσιμο- συγκεκριμένο, επιδιωκόμενο σήμα φθορισμού πριν από την έναρξη της ενίσχυσης. Το F0 είναι αναλογικό προς τον αριθμό αντιγραφής της ακολουθίας-στόχος στο δείγμα πριν από την ενίσχυση. Καθώς η εκτιμώμενη τιμή F0 είναι συνήθως <1, το λογισμικό Dx Real-Time Software εμφανίζει για ευκολία την τιμή -log 10 (F0). Επομένως, όσο πιο υψηλή είναι η τιμή -log10 (F0), τόσο πιο χαμηλός είναι ο αρχικός αριθμός αντιγραφής. Στη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay, η ανάλυση των αποτελεσμάτων βασίζεται στις τιμές Ceep. 10. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Δείγματα θετικού και αρνητικού ελέγχου Σε κάθε εκτέλεση δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνονται ένα δείγμα αρνητικού ελέγχου και ένα δείγμα θετικού ελέγχου προκειμένου να ανιχνεύεται ενδεχόμενη αστοχία στα βήματα επεξεργασίας, ενίσχυσης ή ανίχνευσης των δειγμάτων. Αν οι τιμές Ceep των δειγμάτων ελέγχου βρίσκονται εκτός του αναμενόμενου εύρους τους, το λογισμικό Dx Real-Time Software ακυρώνει ολόκληρη την εκτέλεση της δοκιμασίας και εμφανίζει μία από τις ακόλουθες σημαίες: * Δείγμα αρνητικού ελέγχου: Σημαία Σημασία Invalid_IC: Άκυρο εσωτερικό δείγμα ελέγχου CT_conta: επιμόλυνση από DNA με CT NG_conta: επιμόλυνση από DNA με NG MG_conta: επιμόλυνση από DNA με MG CTNG_conta: επιμόλυνση από DNA με CT και NG CTMG_conta: επιμόλυνση από DNA με CT και MG NGMG_conta: επιμόλυνση από DNA με NG και MG CTNGMG_conta: επιμόλυνση από DNA με CT, NG και MG * Δείγμα θετικού ελέγχου: Σημαία Σημασία CT_out: Τιμή CT εκτός εύρους NG_out: Τιμή NG εκτός εύρους MG_out: Τιμή MG εκτός εύρους CTNG_out: Τιμές CT και NG εκτός εύρους CTMG_out: Τιμές CT και MG εκτός εύρους NGMG_out: Τιμές NG και MG εκτός εύρους CTNGMG_out: Τιμές CT, NG και MG εκτός εύρους Όλα τα δείγματα και τα δείγματα ελέγχου από την εκτέλεση της δοκιμασίας πρέπει στη συνέχεια να υποστούν εκ νέου επεξεργασία, ξεκινώντας από το βήμα εξαγωγής DNA. 6

Ανίχνευση αναστολής: Εσωτερικό δείγμα ελέγχου Το εσωτερικό δείγμα ελέγχου προστίθεται σε κάθε δείγμα και στο δείγμα αρνητικού ελέγχου στην αρχή του βήματος εξαγωγής DNA και ανιχνεύεται με έναν ειδικό ανιχνευτή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα δείγματα στα οποία η τιμή Ceep του εσωτερικού δείγματος ελέγχου υπερβαίνει την αναμενόμενη τιμή (γεγονός που υποδεικνύει πιθανή αναστολή) ερμηνεύονται από το λογισμικό Dx Real-Time Software ως εξής: Οποιοδήποτε δείγμα με τιμή Ceep 48 για ένα δεδομένο στόχο (CT, NG ή MG) αναφέρεται ως "positive" () για το συγκεκριμένο στόχο. Οποιοδήποτε δείγμα χωρίς τιμή Ceep ή με τιμή Ceep > 48 για ένα δεδομένο στόχο αναφέρεται ως "invalid" (άκυρο) για το συγκεκριμένο στόχο. Όλα τα δείγματα που εμφανίζουν άκυρο αποτέλεσμα για ένα στόχο πρέπει να υποστούν εκ νέου επεξεργασία, ξεκινώντας από το βήμα εξαγωγής DNA. 11. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 11.1. Κριτήρια επικύρωσης εξετάσεων Η εκτέλεση δοκιμασίας είναι έγκυρη αν: Η τιμή Ceep του δείγματος ελέγχου θετικού βρίσκεται εντός του αναμενόμενου εύρους για τους τρεις στόχους CT, NG και MG, και Το δείγμα ελέγχου αρνητικού δεν έχει τιμή Ceep ή έχει τιμή Ceep > 48 για τους τρεις στόχους CT, NG και MG Αν η εκτέλεση δοκιμασίας είναι έγκυρη, το λογισμικό Dx Real-Time Software αναφέρει την κατάσταση της εκτέλεσης ως "Passed" (Επιτυχή). Διαφορετικά, το λογισμικό Dx Real-Time Software αναφέρει την κατάσταση της εκτέλεσης ως "Failed" (Ανεπιτυχή). Αν η κατάσταση της εκτέλεσης αναφέρεται ως "Failed" (Ανεπιτυχής), όλα τα αποτελέσματα εξετάσεων εκείνης της εκτέλεσης αναφέρονται ως "invalid" (άκυρα) και όλα τα αντίστοιχα δείγματα και δείγματα ελέγχου πρέπει να υποστούν εκ νέου επεξεργασία, ξεκινώντας από το βήμα εξαγωγής DNA. 11.2. Υπολογισμός / Ερμηνεία αποτελεσμάτων Ο υπολογισμός των αποτελεσμάτων διεξάγεται από το λογισμικό Dx Real-Time Software, το οποίο προσδιορίζει αυτόματα τις τιμές Ceep για τα CT, NG και MG και για το εσωτερικό δείγμα ελέγχου στα δείγματα και στα δείγματα ελέγχου. Αν η εξέταση είναι έγκυρη, οποιοδήποτε δείγμα (παρεμποδισμένο ή όχι) με τιμή Ceep 48 για ένα δεδομένο στόχο (CT, NG ή MG) αναφέρεται ως "positive" () για το συγκεκριμένο στόχο από το λογισμικό Dx Real-Time Software. Αν, παραδείγματος χάριν, ένα δείγμα είναι για CT, το αναφερόμενο αποτέλεσμα είναι "CT_POS" (CT ). Αν η εξέταση είναι έγκυρη, οποιοδήποτε μη παρεμποδισμένο δείγμα χωρίς τιμή Ceep ή με τιμή Ceep > 48 για ένα δεδομένο στόχο (CT, NG ή MG) αναφέρεται ως "negative" () για το συγκεκριμένο στόχο από το λογισμικό Dx Real-Time Software. Αν, παραδείγματος χάριν, ένα δείγμα είναι για CT, το αναφερόμενο αποτέλεσμα είναι "CT_neg" (CT ). Αν η εξέταση είναι έγκυρη, οποιοδήποτε παρεμποδισμένο δείγμα χωρίς τιμή Ceep ή με τιμή Ceep > 48 για ένα δεδομένο στόχο (CT, NG ή MG) αναφέρεται ως "invalid" (άκυρο) για το συγκεκριμένο στόχο από το λογισμικό Dx Real-Time Software, το οποίο στη συνέχεια αναφέρει το αποτέλεσμα ως "Failed" (Ανεπιτυχές) με τη σημαία "Invalid_IC" (Άκυρο εσωτερικό δείγμα ελέγχου). Το αντίστοιχο δείγμα πρέπει επομένως να υποστεί εκ νέου επεξεργασία, ξεκινώντας από το βήμα εξαγωγής DNA. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το παρεμποδισμένο δείγμα είναι δείγμα ούρων, συνιστάται να καταψυχθεί για μία νύχτα στους -20 C πριν από την εκ νέου επεξεργασία του, καθώς η κατάψυξη μπορεί να εξαλείψει τους αναστολείς στα ούρα. Αν μετά την εκ νέου επεξεργασία το δείγμα εξακολουθεί να παρεμποδίζεται, συνιστάται να διεξαχθεί νέα εξέταση με νέα συλλογή δείγματος. 12. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ Οι βέλτιστες αποδόσεις αυτής της εξέτασης εξαρτώνται άμεσα από την ποιότητα των δειγμάτων. Κατά συνέπεια, είναι σημαντικό να υπάρχει συμμόρφωση με τις ενδείξεις που παρέχονται στο κεφάλαιο «Συλλογή και χειρισμός δειγμάτων». Η δοκιμασία πρέπει να διεξάγεται μόνο στους υποδεικνυόμενους τύπους δειγμάτων. Άλλοι τύποι δειγμάτων δεν έχουν πιστοποιηθεί. Η παρουσία αίματος, βλεννών, κάποιων σπερματοκτόνων ουσιών και φαρμάκων για την αντιμετώπιση κολπικών περιστατικών ενδέχεται να επηρεάσει την αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις ουσίες που μπορούν να επηρεάσουν την αντίδραση, ανατρέξτε στο κεφάλαιο «Χαρακτηριστικά απόδοσης». Οι ενδεχόμενες επιδράσεις άλλων παραγόντων, όπως κολπικές εκκρίσεις, χρήση ταμπόν, κολπικές πλύσεις, δεν έχουν προσδιοριστεί. Η χρήση αυτής της δοκιμασίας περιορίζεται σε προσωπικό που έχει εκπαιδευθεί στη χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay, του συστήματος Dx Real-Time System και του λογισμικού Dx Real-Time Software. Ένα αποτέλεσμα δεν αποκλείει την πιθανότητα λοίμωξης, καθώς τα αποτελέσματα εξαρτώνται από αρκετές μεταβλητές. Η εσφαλμένη συλλογή ή ο εσφαλμένος χειρισμός του δείγματος, η παρουσία αναστολέων ή κάποιο τεχνικό σφάλμα μπορούν να οδηγήσουν σε ψευδή αποτελέσματα. Η συλλογή κολπικών και ορθοπρωκτικών δειγμάτων ή δειγμάτων ούρων δεν έχει στόχο να αντικαταστήσει την εξέταση του τραχήλου και τα ενδοτραχηλικά δείγματα για τη διάγνωση ουρογεννητικών λοιμώξεων στις γυναίκες. Οι ασθενείς ενδέχεται να έχουν τραχηλίτιδα, ουρηθρίτιδα, κολπικές λοιμώξεις ή λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος λόγω άλλων αιτίων ή παράλληλων λοιμώξεων με άλλους παθογόνους παράγοντες. 7

Το κιτ Dx CT/NG/MG Assay δεν προορίζεται για χρήση για την αξιολόγηση εικαζόμενης σεξουαλικής κακοποίησης ούτε για άλλες ιατροδικαστικές ενδείξεις. Η επιτυχία ή η αποτυχία της θεραπείας δεν μπορεί να προσδιοριστεί από το κιτ Dx CT/NG/MG Assay, καθώς το παθογόνο DNA μπορεί να εξακολουθεί να υπάρχει μετά από την κατάλληλη αντιμικροβιακή θεραπεία. Όπως και σε κάθε διαγνωστική εξέταση, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay πρέπει να ερμηνεύονται σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα. 13. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επιπολασμός Ο επιπολασμός θετικών δειγμάτων για C. trachomatis, N. gonorrhoeae και M. genitalium στους πληθυσμούς που έχουν μελετηθεί εξαρτάται από την κλινική εικόνα, την ηλικία, τους παράγοντες κινδύνου, το φύλο και τη μέθοδο εξέτασης. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι επιπολασμοί που παρατηρήθηκαν με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay κατά τη διάρκεια κλινικών μελετών σε 2 τοποθεσίες: Τοποθεσία Πληθυσμός Φύλο Αρ. ασθενών C. trachomatis N. gonorrhoeae M. genitalium Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα 177 150 14 24 7,9 16,0 10 24 5,6 16,0 7 4 4,0 2,7 1 Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα 539 89 37 3 6,9 3,0 0 0 0 0 8 1 1,5 1,0 2 Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα 236 24 166 27 18 2 17 4 7,6 8,3 10,3 15,4 2 4 1 2 0,8 16,7 0,6 7,7 3 3 3 2 1,3 12,5 1,8 7,7 Σύνολα στις 2 τοποθεσίες: Πληθυσμός Φύλο Αρ. ασθενών C. trachomatis N. gonorrhoeae M. genitalium Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα 413 174 32 26 7,7 14,9 12 28 2,9 16,1 10 7 2,4 4,0 Χωρίς συμπτώματα Με συμπτώματα 705 116 54 7 7,7 6,0 1 2 0,1 1,7 11 3 1,6 2,6 14. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 14.1. Απόδοση ανάλυσης Ευαισθησία ανάλυσης/όριο ανίχνευσης Το όριο ανίχνευσης του κιτ Dx CT/NG/MG Assay προσδιορίστηκε για κάθε στόχο με χρήση: - για το C. trachomatis: του διεθνούς πλαισίου QCMD06 CTDNA06B στα ούρα και στο μέσο μεταφοράς, - για το N. gonorrhoeae: του διεθνούς πλαισίου QCMD06 NgDNA06 στα ούρα, - για το M.genitalium: του στελέχους ATCC 33530D σε συγκέντρωση 1 ng DNA/µL στα ούρα. Μια σειρά αραιωμένων δειγμάτων προετοιμάστηκε για κάθε παράμετρο, και εξετάστηκε 24 έως 36 φορές. Το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε με χρήση της ανάλυσης πιθανοτήτων, διατηρώντας την αραίωση που αντιστοιχεί σε επίπεδο θετικού της τάξης του 95 ή υψηλότερο: - Το όριο ανίχνευσης για το C. trachomatis υπολογίστηκε στα: 73 αντίγραφα DNA/ml στο μέσο μεταφοράς, με διάστημα αξιοπιστίας της τάξης του 95 για 45 έως 182 αντίγραφα DNA/ml, 158 αντίγραφα DNA/ml στα ούρα, με διάστημα αξιοπιστίας της τάξης του 95 για 106 έως 315 αντίγραφα DNA/ml. - Το όριο ανίχνευσης για το N. gonorrhoeae υπολογίστηκε στα 1.559 CFU/ml στα ούρα, με διάστημα αξιοπιστίας της τάξης του 95 για 1.066 έως 3.283 CFU/ml. - Το όριο ανίχνευσης για το M. genitalium υπολογίστηκε στις 450 μονάδες DNA ανά γονιδίωμα/ml στα ούρα, με διάστημα αξιοπιστίας της τάξης του 95 για 250 έως 1.246 CFU/ml. Αυτά τα όρια ανίχνευσης επιβεβαιώθηκαν με εξέταση 16 οροτύπων C. trachomatis (A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, LGV1, LGV2, LGV3, nv CT) και 19 στελεχών του N. gonorrhoeae που απομονώθηκαν από ασθενείς. 8

Βαθμός επακριβούς προσδιορισμού κατά την ανάλυση (διασταυρούμενη αντιδραστικότητα) Ο βαθμός επακριβούς προσδιορισμού κατά την ανάλυση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay αξιολογήθηκε σε σύνολο 112 βακτηρίων, ιών, ενζύμων και στελεχών μυκήτων. Σε αυτόν τον πίνακα περιλαμβάνονται στελέχη που μπορούν να απομονωθούν στο ουρογεννητικό σύστημα και στελέχη που αντιπροσωπεύουν φυλογενετικά αντιπροσωπευτικά δείγματα με C. trachomatis, Neisseria gonorrhoeae ή Mycoplasma genitalium: Achromobacter xerosis Haemophilus influenzae Neisseria perflava Acinetobacter calcoaceticus Hepatitis B virus (HBV) Neisseria polysaccharea Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus 1 Neisseria sicca Actinomyces isrealii Herpes simplex virus 2 Neisseria subflava flava Aerococcus viridans Human Immunodeficiency Virus (HIV) Neisseria subflava perflava Agrobacterium radiobacter Human Papilloma Virus HPV 16 Paracoccus denetrificans Alcaligenes faecalis Human Papilloma Virus HPV 18 Peptostreptococcus anaerobius Bacillus subtilis Kingella dentrificans Plesiomonas shigelloides Bacteriodes fragilis Kingella kingae Propionibacterium acnes Bacteroides ureolyticus Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Bifidobacterium adolescentis Klebsiella pneumoniae Providencia stuartii Bifidobacterium breve Lactobacillus acidophilus Pseudomonas aeruginosa Brevibacterium linens Lactobacillus brevis Pseudomonas putida Campylobacter jejuni Lactobacillus jensenii Rahnella aquatilis Candida albicans Lactobacillus vaginalis Rhodospirillum rubrum Candida glabrata Legionella pneumophila Salmonella minnesota Candida tropicalis Leuconostoc mensenteroides Salmonella typhimurium Chlamydia pneumoniae Micrococcus luteus Serracia marscence Chlamydia psittaci Moraxella (Branhamella) catarrhalis Staphylococcus aureus Chromobacterium violaceum Moraxella lacunata Staphylococcus epidermidis Citrobacter freundii Moraxella osloensis Staphylococcus saprophyticus Clostridium perfringes Morganella morganii Streptococcus agalactiae Corynebacterium genitalium Mycobacterium gordonae Streptococcus bovis Corynebacterium xerosis Mycobacterium smegmatis Streptococcus griseinus Cryptococcus neoformans Mycoplasma fermentans Streptococcus mitis Cytomegalovirus Mycoplasma hominis Streptococcus mutans Derxia gummosa Mycoplasma orale Streptococcus pneumoniae Edwardsiella tarda Mycoplasma penetrans Streptococcus pyogenes Eikenella corrodens Mycoplasma pneumoniae Streptococcus salivarus Enterobacter cloacae Neisseria cinerea Streptococcus sanguis Enterococcus avium Neisseria elongata Treponema pallidium Enterococcus faecalis Neisseria flavescens Trichomonas vaginalis Enterococcus faecium Neisseria lactamina Ureaplasma urealyticum Escherichia coli Neisseria meningitidis 135 Veillonella parvula Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis serogroupe A Vibrio parahaemolyticus Fusobacterium nucleatum Neisseria meningitidis serogroupe B Yersinia enterocolitica Gardnerella vaginalis Neisseria meningitidis serogroupe C Gemella haemolysans Neisseria mucosa Όλα τα στελέχη εκτός από 22 καλλιεργήθηκαν, βαθμονομήθηκαν στα 108 CFU/ml στο μέσο μεταφοράς, εξήχθησαν και εξετάστηκαν με το κιτ Dx CT/NG/MG Assay. Για τα 22 στελέχη που δεν καλλιεργήθηκαν, εξετάστηκε DNA του εμπορίου στα 40 µg/ml έως 200 µg/ml απευθείας με το κιτ Dx CT/NG/MG Assay. Ένα στέλεχος, το Neisseria meningitidis serogroup B, έδωσε αποτέλεσμα με το επιδιωκόμενο Neisseria gonorrhoeae. Αυτή η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα παρατηρήθηκε επίσης κατά τις κλινικές αξιολογήσεις. Παρεμβολές Οι ενδεχόμενες παρεμβολές στη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay αξιολογήθηκαν με ενδογενείς ή εξωγενείς ουσίες που ενδέχεται να υπάρχουν στα δείγματα στυλεών ή/και ούρων. Δεκατέσσερις ουσίες αραιώθηκαν με διάφορες τελικές συγκεντρώσεις και προστέθηκαν σε μια σειρά από στυλεούς σε μέσο μεταφοράς ή σε μια σειρά από δείγματα ούρων που περιείχαν τους 3 στόχους CT, NG και MG σε συγκέντρωση ίση με περίπου 3 φορές το όριο ανίχνευσης, καθώς και σε μια σειρά από στυλεούς σε μέσο μεταφοράς ή σε μια σειρά από δείγματα ούρων που δεν περιείχαν κανέναν από τους 3 στόχους. Κάθε συνθήκη εξετάστηκε σε 10 πανομοιότυπα αντίγραφα. 9

Εξετάστηκαν οι ακόλουθες ουσίες: Ενδεχόμενη ουσία παρεμβολής Συγκέντρωση Πίνακας Χολερυθρίνη 1 mg/ml Ούρα Αίμα 5 v/v Ούρα 5 v/v Στυλεός Γλυκόζη 1 mg/ml Ούρα ph 4 ph 9 Πρωτεΐνες (Αλβουμίνη Ανθρώπινου Ορού) 5 Ούρα Delfen (Αντισυλληπτικός αφρός) 5 Στυλεός Betadine 5 Στυλεός Μικοναζόλη (αντιβακτηριδιακό και αντιμυκητιασικό) 5 Στυλεός Ισοκοναζόλη (αντιβακτηριδιακό και αντιμυκητιασικό) 5 Στυλεός Trophicrem (κολπική κρέμα) 5 Στυλεός Ασυκλοβίρη (κατά του έρπητα) 5 Στυλεός Λιπαντική γέλη KY 5 Στυλεός Προγεστερόνη 5 Στυλεός Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay από τις ουσίες που υποδεικνύονται παραπάνω, με εξαίρεση τις ακόλουθες περιπτώσεις: - Delfen 5: ανασταλτική επίδραση στην ανίχνευση του Neisseria gonorrhoeae και του Mycoplasma genitalium. - Αίμα στο 5: ανασταλτική επίδραση στην ανίχνευση του Neisseria gonorrhoeae. Μελέτη ανταγωνιστικής δράσης μεταξύ των διαφόρων πολυπαραμετρικών αναλυτών Προκειμένου να πιστοποιηθεί ότι η παρουσία των 3 μικροοργανισμών στο δείγμα δεν οδηγεί σε ανταγωνιστική επίδραση μεταξύ των στόχων, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε σφάλμα ανίχνευσης ενός εξ αυτών, προστέθηκαν στα δείγματα ούρων και μέσου μεταφοράς χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις καθενός από τους τρεις μικροοργανισμούς, προκειμένου να προετοιμαστούν όλοι οι συνδυασμοί (1 χαμηλό/2 υψηλά ή 2 χαμηλά/1 υψηλό). Αυτά τα δείγματα εξετάστηκαν με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay παράλληλα με δείγματα όπου είχε προστεθεί χαμηλή συγκέντρωση ενός μόνο από κάθε μικροοργανισμό προκειμένου να ανιχνευθεί τυχόν επίδραση σε καθέναν από τους στόχους. Το ποσοστό των θετικών απαντήσεων αναλύθηκε στις εξετάσεις που διεξήχθησαν σε τρεις επαναλήψεις σε περίοδο 3 ημερών. Ανεξαρτήτως του μελετώμενου μικροοργανισμού, κανένας από τους συνδυασμούς που εξετάστηκαν δεν είχε επίδραση στο αναμενόμενο αποτέλεσμα. Επομένως, δεν υπάρχει καμία ανταγωνιστική δράση μεταξύ των στόχων και η παρουσία του ενός από τους μικροοργανισμούς σε υψηλή συγκέντρωση δεν προκαλεί οποιοδήποτε σφάλμα στην ανίχνευση των άλλων δύο. Ωστόσο, η παρουσία σε υψηλή συγκέντρωση και των 3 μικροοργανισμών στο ίδιο δείγμα προκαλεί αναστολή στο εσωτερικό δείγμα ελέγχου. Μελέτη ακριβείας Διεξήχθη μελέτη για τον προσδιορισμό της ακρίβειας μεταξύ των δοκιμασιών, μεταξύ των ημερών, μεταξύ των οργάνων και μεταξύ των παρτίδων. Σε τρία δείγματα ούρων (U2, U3, U4) και σε 3 δείγματα μέσων μεταφοράς (S2, S3, S4) προστέθηκαν αντίστοιχα χαμηλές, μέτριες και υψηλές συγκεντρώσεις C. trachomatis, N. gonorrhoeae ή M. genitalium. Σύμφωνα με τις οδηγίες EP5A2 του Ινστιτούτου Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων (CLSI), αυτό το πλαίσιο εξετάστηκε σε 3 πανομοιότυπες επαναλήψεις ανά ημέρα για περίοδο 21 ημερών σε 2 διαφορετικά όργανα του συστήματος Dx Real-Time System και σε 2 διαφορετικές παρτίδες κιτ Dx CT/NG/MG Assay. Η ανάλυση των θετικών αποτελεσμάτων διεξήχθη με χρήση των τιμών Ceep. Η λειτουργία της ένθετης ανάλυσης (ΑΝOVA) χρησιμοποιήθηκε για την καταμέτρηση των συστατικών για κάθε συνθήκη (παρτίδα - όργανο - ημέρα - πανομοιότυπη επανάληψη). Όλες οι εξετάσεις έδωσαν το αναμενόμενο ποσοτικό αποτέλεσμα. Ούρα Ούρα 10

Τα αποτελέσματα έχουν ως εξής: Chlamydia trachomatis CT Μεταξύ δοκιμασιών Μεταξύ ημερών Μεταξύ οργάνων Μεταξύ παρτίδων Συνολική ακρίβεια ΠΙΝΑΚΑΣ Αρ. Μέση τιμή U2 (χαμηλό) 250 31,0 1,542 5,0 0,674 2,2 0* Δεν διατίθεται 1,151 3,7 2,038 6,6 U3 (μέτριο) U4 (υψηλό) 252 28,6 0,370 1,3 1,246 4,4 0* Δεν διατίθεται 0,872 3,0 1,565 5,5 251 22,0 0,197 0,9 0,888 4,0 0* Δεν διατίθεται 0,076 0,3 0,913 4,2 S2 (χαμηλό) 252 33,3 0,405 1,2 0,484 1,5 0* Δεν διατίθεται 0,354 1,1 0,723 2,2 S3 (μέτριο) S4 (υψηλό) 251 30,9 0,196 0,6 0,582 1,9 0* Δεν διατίθεται 0,246 0,8 0,661 2,1 252 26,9 0,166 0,6 0,176 0,7 0* Δεν διατίθεται 0,177 0,7 0,300 1,1 * Η τιμή είναι αρνητική και υπολογίζεται ως 0. Neisseria gonorrhoeae NG Μεταξύ δοκιμασιών Μεταξύ ημερών Μεταξύ οργάνων Μεταξύ παρτίδων Συνολική ακρίβεια ΠΙΝΑΚΑΣ Αρ. Μέση τιμή U2 (χαμηλό) U3 (μέτριο) U4 (υψηλό) S2 (χαμηλό) S3 (μέτριο) S4 (υψηλό) 243 31,1 1,487 4,8 1,095 3,5 0* 209 28,3 1,466 5,2 0,866 3,1 0* Δεν διατίθεται Δεν διατίθεται 1,076 3,5 2,137 6,9 0,148 0,5 1,710 6,0 242 20,2 0,693 3,4 1,127 5,6 0,25 1,2 1,062 5,3 1,715 8,5 252 33,1 0,221 0,7 0,233 0,7 0,133 0,4 0* Δεν διατίθεται 0,348 1,1 251 30,7 0,346 1,1 0,429 1,4 0,089 0,3 0* Δεν διατίθεται 0,558 1,8 252 27,1 0,382 1,4 0,708 2,6 0* * Η τιμή είναι αρνητική και υπολογίζεται ως 0. Mycoplasma genitalium Δεν διατίθεται 0* Δεν διατίθεται 0,805 3,0 MG Μεταξύ δοκιμασιών Μεταξύ ημερών Μεταξύ οργάνων Μεταξύ παρτίδων Συνολική ακρίβεια ΠΙΝΑΚΑΣ Αρ. Μέση τιμή U2 (χαμηλό) 252 32,6 0,322 1,0 0,344 1,1 0* Δεν διατίθεται 0,257 0,8 0,537 1,6 U3 (μέτριο) U4 (υψηλό) 252 29,1 0,414 1,4 1,216 4,2 0* Δεν διατίθεται 0,220 0,8 1,303 4,5 251 22,8 0,408 1,8 0,851 3,7 0* Δεν διατίθεται 0* Δεν διατίθεται 0,943 4,1 S2 (χαμηλό) S3 (μέτριο) S4 (υψηλό) 252 35,9 0,481 1,3 0,630 1,8 0* Δεν διατίθεται 0,427 1,2 0,901 2,5 251 33,2 0,439 1,3 0,658 2,0 0* Δεν διατίθεται 0,252 0,8 0,831 2,5 252 27,5 0,389 1,4 0,213 0,8 0* Δεν διατίθεται 0,162 0,6 0,472 1,7 * Η τιμή είναι αρνητική και υπολογίζεται ως 0. 11

14.2. Κλινική απόδοση Τα χαρακτηριστικά κλινικής απόδοσης της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay καθορίστηκαν κατά τη διάρκεια μιας μελέτης που διεξήχθη σε 2 κλινικές τοποθεσίες στη Γαλλία. Για τη μελέτη αυτή επιστρατεύτηκαν 1.420 ασθενείς με και χωρίς συμπτώματα που συμβουλεύθηκαν κέντρα πρόληψης σεξουαλικώς μεταδιδόμενων νοσημάτων και κέντρα ανώνυμων, δωρεάν ελέγχων. 12 ασθενείς δεν ικανοποιούσαν τα κριτήρια ένταξης που είχαν προσδιοριστεί εκ των προτέρων και εξαιρέθηκαν. Οι υπόλοιποι 1.408 ασθενείς εντάχθηκαν στη μελέτη (821 γυναίκες και 587 άνδρες). Αναλύθηκαν συνολικά 2.361 δείγματα: 430 κολπικά δείγματα που συνελέγησαν από ασθενείς, 407 ενδοτραχηλικά δείγματα, 386 κολπικά δείγματα που συνελέγησαν από κλινικό προσωπικό, 540 δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων από γυναίκες, 532 δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων από άνδρες, 57 ορθοπρωκτικά δείγματα, 9 ουρηθρικά δείγματα, Μεταξύ αυτών των δειγμάτων: Τα 381 κολπικά και ενδοτραχηλικά δείγματα και δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων ελήφθησαν από τους ίδιους ασθενείς, Τα 26 κολπικά και ενδοτραχηλικά δείγματα ελήφθησαν από τους ίδιους ασθενείς, 151 γυναίκες προσέφεραν δείγμα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων και κολπικό δείγμα που συνέλλεξαν μόνες τους, Διετέθησαν δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων και αντίστοιχα ουρηθρικά δείγματα για 6 άντρες. Η συλλογή όλων των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με το σύστημα Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, αρ. κατ. 37007) και με το σύστημα Dx Collection System-M15 (Bio-Rad, αρ. κατ. 37006). Επιπλέον, 60 καταψυγμένα δείγματα (10 δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων, 22 ορθοπρωκτικά δείγματα, 16 κολπικά δείγματα, 1 ενδοτραχηλικό δείγμα και 11 ουρηθρικά δείγματα) που διατηρήθηκαν σε μέσο φωσφορικής σακχαρόζης (2SP) και αρχικά βρέθηκαν θετικά για έναν από τους 3 μικροοργανισμούς (20 ανά μικροοργανισμό) εξετάστηκαν αναδρομικά μέσω της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay. Η απόδοση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay για το στόχο C. trachomatis καθορίστηκε σε σύγκριση με τις δύο καταχωρημένες εξετάσεις PCR σε πραγματικό χρόνο της ΕΕ. Η απόδοση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay για το στόχο N. gonorrhoeae καθορίστηκε σε σύγκριση με μία καταχωρημένη εξέταση PCR σε πραγματικό χρόνο της ΕΕ ή με την καλλιέργεια. Η απόδοση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay για το στόχο M. genitalium καθορίστηκε σε σύγκριση με μία εσωτερική εξέταση PCR με χρήση της τεχνικής TaqMan σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον Jensen (15). Σε μία από τις τοποθεσίες, μόνο τα δείγματα που βρέθηκαν θετικά με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay εξετάστηκαν με την εσωτερική εξέταση PCR. Απόδοση ως προς το C. trachomatis: Αναλύθηκαν 1.341 δείγματα από τις 2 τοποθεσίες με παράλληλη χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay και της εξέτασης PCR 1: Τοποθεσία 1 + 2 Εξέταση PCR 1 Εξέταση PCR 1 Άκυρο Δείγματα κολπικά που συνελέγησαν από τις γυναίκες Dx CT Dx CT Dx CT Dx CT δείγμα εσωτερικού ελέγχου Σύνολο 8 0 0 0 0 8 ενδοτραχηλικά 387 2 0 19 0 408 κολπικά 174 0 1 20 1 195 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 158 1 0 18 4 177 ορθοπρωκτικά 4 0 0 0 0 4 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 450 3 0 41 13 492 ορθοπρωκτικά 34 0 1 13 0 48 ουρηθρικά 8 0 0 1 0 9 Σύνολο 1.223 6 2 112 18 1.341 Ο σχετικός βαθμός επακριβούς προσδιορισμού της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR 1 είναι 1.223/1.229 = 99,5 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [98,9 99,8]. Η σχετική ευαισθησία της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR 1 είναι 112/114 = 98,3 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [93,8 99,8]. 12

Σε μία από τις 2 τοποθεσίες, αναλύθηκαν 1.014 δείγματα με παράλληλη χρήση της δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay και μιας δεύτερης εξέτασης PCR σε πραγματικό χρόνο: Τοποθεσία 1 Δείγματα Εξέταση PCR 2 Dx CT Dx CT Εξέταση PCR 2 Dx CT Dx CT Άκυρο δείγμα εσωτερικού ελέγχου κολπικά που συνελέγησαν από τις γυναίκες 199 2 2 20 1 224 ενδοτραχηλικά 5 0 0 1 0 6 κολπικά 365 2 1 16 0 384 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 345 0 2 10 2 359 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 31 0 1 4 0 36 ορθοπρωκτικά 5 0 0 0 0 5 Σύνολο Σύνολο 950 4 6* 51 3 1.014 * Δύο από αυτά τα δείγματα (1 κολπικό και 1 δείγμα του πρώτου τμήματος της ροής των ούρων) είναι στην πραγματικότητα αληθή αρνητικά, από ασθενείς των οποίων τα υπόλοιπα δείγματα ήταν αρνητικά με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay και με την εξέταση PCR 2. Ο σχετικός βαθμός επακριβούς προσδιορισμού της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR 2 είναι 950/954 = 99,6 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [98,9 99,9]. Η σχετική ευαισθησία της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR 2 είναι 51/57 = 89,5 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [78,51 96,0]. Μετά την ανάλυση των ασύμφωνων δειγμάτων, 2 δείγματα αφαιρέθηκαν από τους υπολογισμούς. Προέρχονται από τους 2 ασθενείς των οποίων τα άλλα συνδεδεμένα δείγματα ήταν αρνητικά με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay και με την εξέταση PCR 2. Η σχετική ευαισθησία μετά από την εξαίρεση ήταν 51/55 = 92,7 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [82,4 98,0]. Απόδοση ως προς το Neisseria gonorrhoeae: Αναλύθηκαν 1.012 δείγματα με παράλληλη χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay και μιας εξέτασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Άλλα 251 δείγματα αναλύθηκαν με παράλληλη χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay και της καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται παρακάτω: Σύγκριση με εξέταση PCR σε πραγματικό χρόνο Τοποθεσία 1 Εξέταση PCR NG Εξέταση PCR NG Δείγματα κολπικά που συνελέγησαν από τις γυναίκες Dx NG Dx NG Dx NG Dx NG Άκυρο δείγμα εσωτερικού ελέγχου Σύνολο 223 0 0 0 1 224 ενδοτραχηλικά 4 0 0 0 0 4 κολπικά 380 1 0 0 0 381 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 356 0 0 0 2 358 ορθοπρωκτικά 1 0 0 0 0 1 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 30 0 0 1 0 31 ορθοπρωκτικά 3 0 1 9 0 14 Σύνολο 997 1 1 10 3 1.012 Ο σχετικός βαθμός επακριβούς προσδιορισμού της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR είναι 997/998 = 99,9 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [99,4 100]. Η σχετική ευαισθησία της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εξέταση PCR είναι 10/11 = 90,9. 13

Σύγκριση με την καλλιέργεια Τοποθεσία 1 Καλλιέργεια NG Καλλιέργεια NG Άκυρο Δείγματα κολπικά που συνελέγησαν από τις γυναίκες Dx NG Dx NG Dx NG Dx NG δείγμα εσωτερικού ελέγχου Σύνολο 8 0 0 0 0 8 ενδοτραχηλικά 390 0 0 0 0 390 κολπικά 6 0 0 0 0 6 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 6 0 0 0 0 6 ορθοπρωκτικά 3 0 0 0 0 3 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 227 1 0 18 5 251 ορθοπρωκτικά 35 1 0 10 0 46 ουρηθρικά 0 0 0 2 0 2 Σύνολο 675 2 0 30 5 712 Ο σχετικός βαθμός επακριβούς προσδιορισμού της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την καλλιέργεια είναι 675/677 = 99,8 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [98,9 100]. Η σχετική ευαισθησία της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την καλλιέργεια είναι 30/30 = 100. Απόδοση ως προς το Mycoplasma genitalium: Στην τοποθεσία 2, αναλύθηκαν 656 δείγματα με παράλληλη χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay και μιας εσωτερικής εξέτασης PCR MG TaqMan: Τοποθεσία 2 Εξέταση PCR MG Εξέταση PCR MG Άκυρο Δείγματα Dx MG Dx MG Dx MG Dx MG δείγμα εσωτερικού ελέγχου πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 170 0 0 1 8 171 ενδοτραχηλικά 21 0 0 0 0 21 κολπικά 181 1 0 4 3 186 πρώτου τμήματος της ροής των ούρων 236 0 1 5 17 242 ορθοπρωκτικά 1 0 0 0 0 1 ουρηθρικά 7 0 0 0 0 7 Σύνολο 616 1 1 10 28 656 Σύνολο Ο σχετικός βαθμός επακριβούς προσδιορισμού της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εσωτερική εξέταση PCR TaqMan είναι 616/617 = 99,8 Διάστημα αξιοπιστίας 95 [99,1 100]. Η σχετική ευαισθησία της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay σε σχέση με την εσωτερική εξέταση PCR TaqMan είναι 10/11 = 90,9. 25 δείγματα από 20 ασθενείς που βρέθηκαν θετικά για M. genitalium με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay στην τοποθεσία 1 απεστάλησαν στην τοποθεσία 2 για ανάλυση με την εσωτερική εξέταση PCR MG TaqMan. 22/25 δείγματα βρέθηκαν θετικά με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay στην τοποθεσία 2, τα υπόλοιπα 3 δείγματα ήταν κοντά στο όριο ανίχνευσης. Από αυτά τα 22 δείγματα, τα 2 βρέθηκαν αρνητικά με την εσωτερική εξέταση PCR MG TaqMan. Η συμφωνία μεταξύ της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay και της εσωτερικής εξέτασης PCR TaqMan είναι επομένως 20/22 = 90,9 για τα δείγματα που προήλθαν από την τοποθεσία 1. Ωστόσο, τουλάχιστον ένα από τα δύο ασύμφωνα δείγματα είναι στην πραγματικότητα αληθές, καθώς προήλθε από έναν ασθενή του οποίου όλα τα συνδεδεμένα δείγματα βρέθηκαν θετικά για M. genitalium με τη δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay. Επομένως, η τελική συμφωνία μεταξύ της δοκιμασία Dx CT/NG/MG Assay και της εσωτερικής εξέτασης PCR TaqMan, που υπολογίστηκε μετά την πρόσθεση των αποτελεσμάτων από την τοποθεσία 1 και την τοποθεσία 2, είναι 626/629 = 99,5. 14

Αναδρομική μελέτη (Τοποθεσία 2) Εξήντα δείγματα (10 δείγματα του πρώτου μέρους της ροής των ούρων, 22 ορθοπρωκτικά δείγματα, 16 κολπικά δείγματα, 1 ενδοτραχηλικό δείγμα και 11 ουρηθρικά δείγματα) που διατηρήθηκαν στους -80 C σε μέσο φωσφορικής σακχαρόζης (2SP) και αρχικά βρέθηκαν θετικά για έναν από τους 3 μικροοργανισμούς με την εξέταση που χρησιμοποιείται τακτικά στο εργαστήριο (20 ανά μικροοργανισμό) εξετάστηκαν αναδρομικά με χρήση της δοκιμασίας Dx CT/NG/MG Assay. Για το C. trachomatis, 19/19 δείγματα ήταν σύμφωνα θετικά, το εικοστό παρουσίασε άκυρο εσωτερικό δείγμα ελέγχου. Για το N. gonorrhoeae, 19/20 δείγματα ήταν σύμφωνα θετικά, το εικοστό είχε βρεθεί προηγουμένως μέσω καλλιέργειας με μόνο 1 αποικία. Για το M. genitalium, 16/20 δείγματα ήταν σύμφωνα θετικά. Από τα 4 ασύμφωνα (ούρων), τα 2 βρέθηκαν αρνητικά μετά από έλεγχο με την τακτική εξέταση. 15. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates. Geneva: WHO; 2001. 2. Cates W Jr, Rolfs RT Jr, Aral SO. Sexually transmitted diseases, pelvic inflammatory disease, and infertility: an epidemiologic update. Epidemiol Rev 1990; 12: 199 220 3. Stamm WE. Chlamydia trachomatis infections of the adult. In: Holmes KK, Sparling P F, Mardh PA, eds. Sexually Transmitted Diseases, 3rd ed. New York: McGraw-Hill, 1999. 4. Centers for Disease Control and Prevention. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections. MMWR 2002; 51 (No. RR-15) : 1-27. 5. Taylor-Robinson D. Mycoplasma genitalium: an update. Int J STD AIDS 2002; 13: 145-151 6. Simms I, Eastick K, Mallinson et al. Associations between Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, and pelvic inflammatory disease. Sex Transm Infect 2003; 79: 154-156 7. Cohen CR, Manhart LE, Bukusi EA et al. Associations between Mycoplasma genitalium and acute endometritis. Lancet 2002; 359: 765-766 8. Clausen H F, Fedder J, Drasbek M et al. Serological investigation of Mycoplasma genitalium in infertile women. Human Reprod 2001; 16: 1866-1874 9. Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Symptomatic urethritis is more prevalent in men infected with Mycoplasma genitalium than with Chlamydia trachomatis. Sex Transm Infect 2004; 80: 289-293 10. Moi H, Reinton N, Moghaddam A. Mycoplasma genitalium in women with lower genital tract inflammation. Sex Transm Infect 2009; 85: 10-14 11. Moi H, Reinton N, Moghaddam A. Mycoplasma genitalium is associated with symptomatic and asymptomatic nongonococcal urethritis in men. Sex Transm Infect 2009; 85: 15-18 12. Haggerty CL, Totten PA, Astete SG, Lee S, Hoferka SL, Kelsey FL, Ness RB. Failure of cefoxitin and doxycycline to eradicate endometrial Mycoplasma genitalium and the consequence for clinical cure of pelvic inflammatory disease. Sex Transm Infect 2008; 84: 338-342 13. Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Signs and symptoms of urethritis and cervicitis among women with or without Mycoplasma genitalium or Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm Infect 2005; 81: 73-78 14. Ripa T, Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis 2007:34:255-56. 15. Jensen J S, Björnelius E, Dohn B, Lidbrink P. Use of TaqMan 5 Nuclease Real-Time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a Sexually Transmitted Disease clinic. J.Clin. Microbiol. 2004 42: 683 692. Με την αγορά αυτού του προϊόντος, ο αγοραστής επιτρέπεται να το χρησιμοποιήσει για τη διεξαγωγή διαγνωστικών υπηρεσιών σε διαγνωστικές εξετάσεις in vitro σε ανθρώπους. Με την παρούσα, δεν παρέχεται κανένα γενικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας ή άλλη άδεια χρήσης οποιουδήποτε είδους εκτός από το συγκεκριμένο δικαίωμα χρήσης που χορηγείται με την αγορά. Η ονομασία ProClin αποτελεί καταχωρημένο εμπορικό σήμα της Rohm and Haas Co. Οποιοδήποτε άλλο εμπορικό σήμα εμφανίζεται στο παρόν προϊόν ανήκει στους αντίστοιχους ιδιοκτήτες του. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 09/2010 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881064 www.bio-rad.com 15