Research on Medicine The Quarterly journal of School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences Original Article Vol.42; No.2; 2018 Effects of PEGylated Silver Nanoparticles on the Structure, Function, and Concentrations of Different Forms of Hemoglobin Abstract Samane Zolghadri Jahromi 1,*, Ali Akbar Saboury 2 1. Department of Biology, Jahrom Branch, Islamic Azad University, Jahrom, Iran 2. Institute Of Biophysics and Biochemistry, Tehran Unversity (Received: 2017/02/11 Accept: 2018/05/12) Background: The material is always covered by proteins immediately upon contact with a physiological environment. Hemoglobin (Hb) is one of the major blood proteins. Due to the entry of substances into blood, hemoglobin may interact with them. The interaction between Hemoglobin and ligands such as nanoparticles is very important and may cause structural and functional changes on Hemoglobin. According to the recent studies, PEG (poly ethylene glycol) coated nanoparticles have better biocompatibility compared with noncoated nanoparticles, thus the present study was conducted to investigate the interaction of PEG-silver nanoparticles with hemoglobin. Materials and Methods: In the present experimental study, various spectroscopic methods, including UV Visible, fluorescence, and Circular Dichroism (CD), were used to evaluate the interaction of silver nanoparticles with polyethylene glycol coating and hemoglobin. Using these methods, the effects of nanoparticles on the second structure and variations in the alpha helix and beta sheets of the protein, as well as changes in the third structure, and thus the change in the protein function, were investigated. Results: The results of fluorescence spectroscopy and UV/Vis absorption spectroscopy indicated that the structure of the Trp residue environments was altered and the physiological functions of Hb were affected by silver nanoparticles coated with poly ethylene glycol. It could also be suggested that due to the binding of silver nanoparticle to Hb, some conformational changes are induced, enhancing the hydrophobicity. These nanoparticles have increased the ratio of deoxy and decreased hemoglobin tendency to oxygen. This increase in the highest concentration of nanoparticles is six times as common. Conclusion: The results showed that PEGylated silver nanoparticles lead to secondary structural changes and hemoglobin unfolding. Therefore, PEGylated silver nanoparticles decrease the hemoglobin function by decreasing the hemoglobin tendency toward oxygen. As a result, silver nanoparticles may cause the molecular toxicity of proteins. Considering the results obtained and the importance of nanoparticles biosafety, it is suggested that by changing the coating, size, or shape of nanoparticles and optimizing them, the possible side effects of nanoparticles on the structure and function of the protein can be prevented. Keywords: Silver Nanoparticle; Hemoglobin; Interaction *Correspondinauthor:Samane Zolghadri Jahromi Email: Z.jahromi@ut.ac.ir Research in Medicine 2018; Vol.42; No.2; 79-85
ی هش ژپو مقاهل 85 ات 79 حات صف 1397 2 شماره 42 دور فرمهای غلظت و عملکرد ساختار بر پگیله فرم به نقره نانوذرات آثار بررسی هموگلوبین مختلف چكيده: 2 صبوری اکبر علی * 1 جهرمی ذوالقدری سمانه ایران جهرم اسالمی آزاد دانشگاه جهرم واحد شناسی زیست گروه 1- ایران تهران تهران دانشگاه بیوفیزیک بیوشیمی تحقیقات مرکز 2-1395/11/23 مقاله: دریافت تاریخ مقاله: 1397/2/22 پذیرش تاریخ کارساز و مهم پروتئینهای از یکی که هم هموگلوبین میشوند. احاطه پروتئینها سوی از سرعت به فیزیولوژیک محیط یک با برخورد در همیشه مواد سابقهوهدف: وجود احتمال این و است مهم بسیار مولکول این با لیگاندها اندرکنش شود. کنش برهم وارد آنها با است ممکن خون به مواد ورود دلیل به میآید شمار به خون به توجه با شود. آن عملکرد در تغییر سبب که شود ایجاد آن سوم ساختار در تغییرهایی هموگلوبین با نانوذرات جمله از مختلف لیگاندهای اتصال اثر در که دارد با پگیله فرم به نقره نانوذرات اندرکنش بررسی تحقیق این در است پوشش بدون نانوذرات به نسبت مناسبتری زیستی سازگاری دارای نانوذرات پگیله فرم که این است. شده انجام خون هموگلوبین اندرکنش ارزیابی برای حلقوی دورنگنمایی و فلورسانس بنفش ماورای مرئی شامل طیفسنجی مختلف روشهای از تجربی مطالعه این در روشها: و مواد و هلیکس آلفا میزان در تغییر دوم ساختار بر نانوذرات آثار روشها این از استفاده با و است شده استفاده هموگلوبین و گلیکول پلیاتیلن پوشش با نقره نانوذرات است. شده بررسی پروتئین عملکرد در تغییر نتیجه در و سوم ساختار در تغییر همچنین و پروتئین بتای صفحات عملکرد و کرده تغییر تریپتوفان اسیدآمینه اطراف محیط ساختار که داد نشان بنفش ماورای مرئی جذبی طیفسنجی و فلورسانس طیفسنجی نتایج یافتهها: برخی سبب هموگلوبین به پگیله نقره نانوذرات اتصال همچنین است. گرفته قرار گلیکول پلیاتیلن پوشش با نقره نانوذرات تاثیر تحت هموگلوبین فیزیولوژیکی اکسیژن به نسبت هموگلوبین تمایل کاهش و دیاکسی نسبت افزایش سبب نانوذرات این است. شده سطح آبگریزی افزایش نتیجه در و آن فضایی شکل در تغییرها است. معمول حالت برابر شش نانوذرات غلظت بیشترین در افزایش این شدهاند. عملکرد در تغییر سبب هموگوبین سوم ساختار شدگی باز و پروتئین دوم ساختمان در تغییر ایجاد با پگیله نقره نانوذرات میدهد نشان حاصل نتایج نتیجهگیری: به توجه با میشوند. منجر هموگلوبین عملکرد توجه قابل کاهش به اکسیژن به نسبت هموگلوبین تمایل کاهش با پگیله نقره نانوذرات بنابراین شوند می پروتئین عوارض از آنها بهینه انتخاب و نانوذرات شکل یا اندازه پوشش تغییر با میشود پیشنهاد نانو ترکیبهای از استفاده در زیستی ایمنی اهمیت و آمده دست به نتایج شود. جلوگیری پروتئین عملکرد و ساختار بر نانوذرات احتمالی کنش برهم هموگلوبین پگیله نقره نانوذرات كلیدی: واژگان مقدمه: چهار کروی ساختار دارای که است مهم پروتئینهای از یکی خون هموگلوبین توانایی واحد زیر هر است. بتا( واحد زیر دو و آلفا واحد زیر دو )شامل واحدی زیر اتصال اثر در شده ایجاد ساختاری تغییرهای دارد. را اکسیژن مولکول یک حمل )اتصال هموگلوبین عملکرد در تغییر به میتواند مولکول این با مختلف لیگاندهای دلیل به تازگی به که نیز نانو ذرات رو این از شود. منجر اکسیژن( آزادسازی و مورد درمانی کاربردهای برای گستردهای طور به خود فرد به منحصر ویژگیهای با اتصال اثر در خود موثر کاربردهای کنار در میتوانند شدهاند] 1 [ واقع توجه جهرمی ذوالقدری سمانه مسئول: نویسنده z.jahromi@ut.ac.ir الکترونیک: پست Research in Medicine 2018; Vol.42; No.2; 79-85
همکاران و جهرمی ذوالقدری سمانه / 81 ساختار در تغییرهایی سبب هموگلوبین جمله از خون در موجود مختلف پروتئینهای شوند. مهم مولکولهای این عملکرد و پروتئینها مانند زیستی ملکولهای با نانوذرات این مشابه اندازه است ذکر به الزم رفتارهای مانند آنها از برخی رفتاری ویژگیهای همچنین نوکلئیک اسیدهای و و زیستشناسی علوم در آنها روزافزون استفاده سبب فلورسانس یا مغناطیسی بخشيدن عملكرد راستاي در پروتئينها دیگر سوی از است] 2 [. شده پزشکی راستاي در ميتوان پروتئين ويژگيهاي از همچنين ميروند. كار به مواد نانو به قدرتمندي تأثير هم مواد نانو مقابل در کرد. استفاده انتقال تا تشخيص و احساس اثرها اين اصولي فهم برای فراواني تالش كه دارند پروتئينها عملكرد و ساختار بر طراحي در ميتواند مواد نانو پروتئين- اندركنش دقيق فهم است. انجام حال در حائز صنعتی لحاظ از زاويه چند از که شود واقع مفيد مواد نانو پروتئين- كاربردي دارو انتقال سيستمهاي طراحي 2- حسگرها زیست طراحي است: 1 -در اهميت سلولهاي از مولكولي 4 -تصويربرداري عملكردي كامپوزيتهاي نانو ساخت 3- و پزشکی جنبه مواد نانو با آنزیم و پروتئین اندرکنش صنعتی جنبه بر عالوه زنده. تغییر و زنده موجود بخش مهمترین عنوان به ارگانها این بر مواد نانو زیانآور آثار حال در است. مهمی بسیار موضوع نیز آنها عملکردی و ساختاری خصوصیات یک در مواد سطوح که است شده پذیرفته خوبی به امر این پزشکی جامعه در حاضر و مییابند] 12-3 [ تغییر پروتئینها مانند زیستی مولکولهای جذب با زیستی محیط این از بیش زیستی محیط یک در مواد به سلولی پاسخهای که دارد وجود اجماع این مطالعههای است] 3 [. شده جذب زیستی الیه بازتاب باشد آنها خود از ناشی که است واقعیت این به ناظر مختلف سطوح با پروتئینها همکنش بر زمینه در اولیه مطالعه منظور همین به کند. تغییر جذب اثر در نیز پروتئین ساختار است ممکن که حقیقت این وجود با میرسد] 17-13 [. نظر به جدی سطوح و پروتئینها اندرکنش پروتئینهاست با فیزیولوژیک محیط یک به ورود از پس نانوذرات برخورد اولین که است. نشده انجام کاملی تحقیق هنوز زمینه این در اما شدن تجاری درجه بیشترین پزشکی بخش در نقره نانوذرات نانوذرات میان از در حتی نانوذرات این آنتیباکتریال ویژگیهای است. داده اختصاص خود به را نانوذرات این که است این افراد ديدگاه است. توجه قابل هم کم بسیار غلظتهای می نشان دیگری مطالعههایات هستند] 19-18 [. غیرسمی نسبت به موارد برخی به نسبت قویتری باکتریال آنتی خواص سیترات پوشش با نقره نانوذرات که دهد مطالعههایات تاکنون چنین هم دهند] 20 [. می نشان پوشش بدون نقره نانوذرات و آلبومین جمله از و ها پروتئین با نقره نانوذرات برهمکنش با رابطه در مختلفی نشان سرم آلبومین با نقره نانوذرات کنش برهم است. شده انجام هموگلوبین شوند می آلبومین هلیکس ساختارهای کاهش سبب نانوذرات این که دهد می سبب تواند می نقره نانوذرات پوشش دهد می نشان مطالعههاات این ]22-21[. شود ها آن باکتریال آنتی خاصیت افزایش و هموگلوبین با ها آن اتصال کاهش.]20[ مثل دیگر کوچک مولکولهای از تعدادی با هموگلوبین برهمکنش هماتوپورفیرینها] 26 [ و آبدوست] 727-24 مولکولهای دیمتیلسولفوکسید] 23 [ زیرکونیوم سیلیسی نانوذرات روی هموگلوبین جذب همچنین است. شده گزارش هموگلوبین با لیگاندها اندرکنش اثر در 28[. است] 27 - شده مطالعه نیز تیتانیوم و تعادل بنابراین و شده ایجاد هموگلوبین سوم ساختار در تغییرهایی است ممکن به هموگلوبین اتصال تمایل بنابراین کند جابهجا راست یا چپ سمت به را R T دهد. افزایش یا کاهش را اکسیژن مناسب پوشش دارای که نانوذراتی میدهد نشان تحقیقات شد اشاره که همانطور سازگاری زیست بنابراین و و دارند سلولی سمیت بر کمتری اثراتاثار هستند بررسي تحقیق این انجام از نهایی هدف بنابراین دهند. می نشان خود از بیشتری مختلف گونههاي بر داروسازي و پزشكي كاربردهاي با پگیله نقره نانوذرات آثار است. هموگلوبين روشها: و مواد مواد الف: پوشش با نقره نانوذرات انسان خون نمونه از شده استخراج انسانی هموگلوبین همین( Hemin ) کرهجنوبی Biocera شرکت از شده تهیه 10 nm گلیکول پلیاتیلن )نمکهای 7/4 ph و موالر 0/1 فسفات بافر سیگما شرکت از شده خریداری است(. شده خریداری مرک شرکت از مربوطه )شرکت 4 درصد سیترات سدیم تازه خون از هموگلوبین استخراج برای همچنین تقطیر دوبار آب مرک( )شرکت 7/4 ph با موالر 2/. فسفات بافر سالین مرک( شد. استفاده مرک( )شرکت آمونیوم 20 درصد سولفات نمک و سرد دستگاهی تجهیزات ب: ترازو ایران( ساخت تکنوژن ( آزمایشگاهی همزن سوئیس( کشور ساخت ( متر ph دستگاه آلمان( کشور ساخت )بکمن سانتریفیوژ ژاپن( کشور )ساخت آزمایشگاهی دورنگ طیفسنجی دستگاه استرالیا( کشور ساخت )وریان فلورسانس سنجی طیف ماورای مرئی سنجی طیف دستگاه آمریکا( کشور ساخت )اویو دورانی نمایی الکتروفورز دستگاه استرالیا( ساخت 100 کری و ژاپن کشور ساخت بنفش)شیماتزو کشورآمریکا(. ساخت )میکروکال همدما تیتراسیونی گرماسنج ایران( )ساخت روشها ج: انسان: خون از هموگلوبین استخراج میلیلیتر 9 شد: انجام ترتیب به زیر مراحل تازه خون از هموگلوبین استخراج برای کردن جدا برای شد. اضافه 4 درصد سیترات سدیم میلیلیتر یک به تازه خون از سانتریفیوژ نمونه شد. سانتریفیوژ دور 3000 با دقیقه 15 مدت به خونی محلول سرم مرحله در. شد درصداضافه 9/. سالین حجم 10 معادل سپس شد. سرریز شده بافر حجم 5 سپس شد. سرریز بعد و سانتریفیوژ دور هزار 10 با دقیقه 15 بعد هزار 5 با و دقیقه 15 مدت به محلول این شد. اضافه ph 7/4 موالر 2/. فسفات برابر 9 اندازه به سرد تقطیر دوبار آب بعد مرحله شد. سرریز سپس و سانتریفیوژ دور دقیقه 10 مدت به سپس شد. افزوده قرمز گلبولهای کردن لیز برای رسوب حجم را رویی محلول شد. انجام هزارسانتریفیوژ دور 18 و سانتیگراد درجه 4 دمای در حالت در دقیقه 15 و کرده اضافه آمونیوم 20 درصد سولفات نمک سپس و کرده جدا یک مدت به سانتیگراد درجه 2 دمای در 14 هزار دور با سپس و داده قرار ایستا رسوبی از است هموگلوبین که رویی محلول ترتیب این به شد. سانتریفیوژ ساعت مدت به فسفات بافر با رویی محلول سپس شد. جدا سلولهاست جداره شامل که شد] 28-31-26-29 [. فریز نمونه آخر مرحله در شد. دیالیز بار 3 ساعت 24 تا 12 هموگلوبین: الکتروفورز هموگلوبین الکتروفورز انسان خون از شده استخراج هموگلوبین تخلیص تایید برای مقایسه سیگما و مرک شرکت های نمونه با و شده انجام SDS اکریالمید پلی ژل با شد. :UV-Visible سنجی طیف دستگاه از استفاده با نانومتر 250 تا 500 محدوده در بنفش ماورای مرئی جذبی طیف و آپوهموگلوبین هموگلوبین جذبی سنجیهای طیف شد. ثبت اسپکتروفوتومتر لیگاند مختلف غلظتهای غیاب در و حضور در میکروموالر 3-1/5 hemin آزمایشهای تمامی شد. انجامک میکروموالر( 47 و 37/4 28 18/7 )0 انجام تکرار بار سه با و سانتیگراد درجه 37 دمای در و 7/4 ph در طیفسنجی است. شده فلورسانس: سنجی طیف نانوذرات تأثير مطالعه و هموگلوبین ذاتي فلورسانس نشر شدت اندازهگيري براي طول شد. استفاده هموگلوبین میکروموالر 3 غلظت از هموگلوبین ساختار بر مختلف و نانوذرات مختلف غلظتهاي در آزمايشها است. بوده نانومتر 280 تحريك موج و نشر شکافت پهنای شد. انجام تکرار بار سه با و سانتیگراد درجه دماهای 37 در سانتیمتر یک استفاده مورد سل طول شد. تنظیم نانومتر 10 و 5 ترتیب به جذب است. بوده :Circular Dichroism (CD) دورانی نمایی رنگ دو سنجی طیف است. گرد راست و گرد چپ پالریزه نور جذب اختالف براساس CD سنجی طیف پيوندهاي جذب بر منطبق كه نانومتر( دور) 190 تا 260 فرابنفش ناحيه در طيفهاي آمریکا( ساخت وود )الیک 215 مدل اسپكتروپالريمتراویو دستگاه با است پپتيدي است. آمده دست به 85 ات 79 حات صف 1397 2 شماره 42 دور
82 / هموگلوبین مختلف فرمهای غلظت و عملکرد ساختار بر پگیله فرم به نقره نانوذرات آثار بررسی 5 1 بوده هموگلوبین منظم دوم ساختارهاي ميزان به دسترسي فوق آناليز از هدف پروتئيني محلول غلظت از شدهاند. تهيه فسفات بافر در پروتئيني محلولهاي است. کی سل از شد. استفاده نانوذرات مختلف غلظتهاي و میلیلیتر بر میلیگرم 2 شد. استفاده سانتیمتری شد انجام تکرار بار سه با و نانوذرات حضور و غياب در شده انجام آزمايشهاي بر نتايج شدند. انكوبه هموگلوبین با دقيقه 2 حداقل مدت به نانوذرات اينكه ضمن ارائه 115 برابر اسيد آمينو براي مولكولي وزن متوسط اندازه به واري بيضی حسب است 29-32. شده آماری: محاسبات و میانگین اساس بر نمودارها و است شده انجام تکرار بار سه با آزمایشها تمامی است. شده گزارش اکسل نرمافزار از استفاده با و معیار انحراف یافتهها: هموگلوبین الکتروفورز الف- با که بود غلظت تعیین انسان خون از هموگلوبین استخراج از پس مرحله اولین و شد برده SDS ژل روی نمونهها سپس شد. انجام برادفورد معرف از استفاده سیگما شرکت از شده تهیه هموگلوبین با مقایسه در هموگلوبین نمونه خلوص 1(. شکل شد) واقع تایید مورد دیگر افراد توسط شده استخراج نمونه چند و مارکر 3 2 1 SDS-PAGE ژل روی بر هموگلوبین تخلیص بررسی 1: شکل سیگما هموگلوبین 3 هموگلوبین شده خالص نمونه 2 مولکولی وزن مارکر 1 هموگلوبین با نقره نانوذرات اندرکنش بررسی برای جذبی طیف ب: 4 دارای هموگلوبین است. نانومتر 406 و 278 در جذبی پیک دو دارای هموگلوبین معروف و هم گروه به مربوط نانومتری 406 پیک است. سطح نزدیکی در هم گروه منطقه کنفورماسیونی تغییرهای درباره اطالعاتی جذبی باند این است. سورت باند به نقره نانوذرات غیاب در و حضور در هموگلوبین جذبی طیف میآورد. فراهم هم شده ترسیم 2 شکل در نقره نانوذرات غیاب و حضور در هموگلوبین جذبی طیف به نانوذرات غلظت افزودن با کنید می مشاهده شکل در که طور همان است. محل در که حالی در است یافته کاهش سورت ناحیه در جذب هموگلوبین محلول نانومتر 278 ناحیه در پروتئین جذب همچنین نمیشود. مشاهده تغییری پیک غلظت و میکروموالر 1/5 هموگلوبین غلظت آزمایش این در میدهد. نشان افزایش است. شده انتخاب میکروموالر 47 37/4 28 18/7 نقره 0 نانوذرات روش کمک به هموگلوبین به نقره نانوذرات اتصال ویژگیهای ج: فلوریمتری هستند تریپتوفان یا تیروزین آمینه اسید دارای که پروتئینهایی ذاتی فلورسانس ماکرومولکولهای کنفورماسیونی و دینامیکی ویژگیهای درک برای مهم شیوه یک آمینه اسید سه دارای دایمر هر در هموگلوبین میآید. شمار به زیستی (two 14- Trp, two 15- تریپتوفان آمینه اسید 6 دارای مجموع در و تریپتوفان تریپتوفان از ناشی بیشتر هموگلوبین ذاتی فلورسانس است. Trp, 37- Trp ) دارد] 35-32-30-33 [. قرار هم گروه نزدیکی در آمینه اسید این است. 37- درجه 37 دمای در و نقره نانوذرات غیاب و حضور در هموگلوبین فلورسانس طیف طول سمت به جابهجایی یک نشاندهنده شکل )شکل 3 (. شد ثبت سانتیگراد افزایش اثر در ماکزیمم نشر شدت کاهش و آبی( )جابجایی کوتاهتر موجهای است. نانوذرات غلظت گلیکول اتیلن پلی پوشش با نقره نانوذرات و هموگلوبین فلورسانس طیف 2: نمودار ترتیب به 7 از 1 تا نقره نانوذرات غلظت و میکروموالر 3 هموگلوبین غلظت هموگلوبین. درجه 37 با برابر دما باشد. می میکروموالر 150 و 130 110 90 70 50 0 با برابر باشد. می ph 7 و گراد سانتی حلقوی نمایی دورنگ مطالعههای د: نانومتر 222 و 208 های موج طول در کمینه دو دارای هموگلوبین CD طیف طیف در تغییر ) شکل) 4 است. پروتئین هلیکسی محتوای نشاندهنده که است در که طور همان میدهد. نشان 37 دمای در نانوذرات افزایش اثر در را هموگلوبین بیضی هموگلوبین محلول به نقره نانوذرات افزایش اثر در است مشاهده قابل شکل میدهد. نشان معناداری تغییر نانومتر 222 و 208 موج طول دو در واری 66.2K 45 K 30 K 14 K هموگلوبین. گلیکول پلیاتیلن پوشش با نقره نانوذرات و هموگلوبین جذبی طیف نمودار 1 : 28=c 18/7=b 0=a با برابر نقره نانوذرات غلظت و میکروموالر 1/5 هموگلوبین غلظت است. ph 7/4 و سانتیگراد درجه 20 با برابر دما است. میکروموالر 47=e d 37/4= پوشش با نقره نانوذرات هموگلوبین- و هموگلوبین حلقوی دورنگنمایی طیف نمودار 3 : 25/. mg/ml غلظت و ph( 7 سانتیگراد( درجه 37 دمای در گلیکول پلیاتیلن میکروموالر 74/8 37/4 18/7 0 ترتیب به ا 5 تا 1 نقرهاز نانوذرات غلظت و هموگلوبین است. 85 ات 79 حات صف 1397 2 شماره 42 دور
/ 83 سمانه ذوالقدری جهرمی و همکاران با آنالیز دادههای حاصل از طیف سنجی دورنگنمایی حلقوی توسط نرمافزار CDNN مشخص شد که نانوذرات نقره سبب کاهش ساختار هلیکسی هموگلوبین و افزایش ساختار بتای آن شدهاند. به طور کلی 74 درصد از ساختار طبیعی هموگلوبین دارای ساختار آلفا هلیکس و 8/5 درصد دارای ساختار بتا است. در این تحقیق نمونه طبیعی هموگلوبین در غیاب نانوذرات دارای 70 درصد ساختار هلیکس و 10 درصد ساختار بتا بوده است 33-36. افزودن نانوذرات در بیشترین غلظت در دمای 37 درجه سانتی گراد سبب کاهش بیش از 60 درصد از ساختار آلفا )شکل 5( و در حدود 20 درصد افزایش ساختار بتا شده است. Nano Ag Concentration (μm) نمودار 4: کاهش هلیسیتی هموگلوبین در اثر افزایش نانوذرات نقره در دمای 37 درجه سانتی گراد. نمودار بر اساس میانگین و انحراف معیار گزارش شده است. ه: تاثیر نانوذرات بر گونههای مختلف هموگلوبین دریک محلول هموگلوبین شکلهای مختلفی از هموگلوبین با غلظتهایی مشخص دیده میشود که عبارت است از شکل اکسی دیاکسی و مت هموگلوبین. شکل اکسی هموگلوبین همان شکل اکسیژندار هموگلوبین و دیاکسی هموگلوبین شکل بدون اکسیژن هموگلوبین است. مت هموگلوبین حالتی بین اکسی و دیاکسی هموگلوبین بوده که در آن آهن در حالت اکسید +3 Fe و کنفورماسیون شل (R) قرار داشته و قادر به حمل اکسیژن نیست 37. برای تعیین غلظت گونه های مختلف هموگلوبین در محلول از روابط زیر استفاده می شود.. در این مطالعه به منظور جلوگیری از تشکیل شکلهای دایمر هموگلوبین از نمونه هموگلوبینی با غلظت باال (6-4 (mg/ml استفاده شده است. همان طور که در شکل 6 مشاهده می شود با افزایش غلظت نانوذرات نقره از شکل اکسیژن دار هموگلوبین کاسته شده و به شکل بدون اکسیژن آن افزوده می گردد. در حالیکه در غلظت شکل مت هموگلوبین تغییری حاصل نشده است. و: بررسی عملکرد هموگلوبین در حضور نانوذرات با استفاده از نسبت دیاکسی با استفاده از نسبت دیاکسی به جای P50 )فشاری که در آن 50 درصد هموگلوبین از اکسیژن اشباع شده باشد( میتوان تمایل هموگلوبین برای اتصال به اکسیژن را بررسی کرد. زیرا در تعادل R T )ساختار سخت ساختار شل( هر عاملی که شکل T یا دیاکسی را بیشتر افزایش دهد باعث کاهش تمایل هموگلوبین به اکسیژن میشود. نسبت دیاکسی عبارت است از غلظت شکل دیاکسی در حضور لیگاند تقسیم بر غلظت شکل دیاکسی همان نمونه در غیاب لیگاند. شکل 7 میزان تاثیر نانوذرات نقره را بر نسبت دیاکسی نشان میدهد. این نانوذره سبب افزایش نسبت دیاکسی و کاهش تمایل هموگلوبین نسبت به اکسیژن میشود. این افزایش در بیشترین غلظت نانوذرات شش برابر حالت معمول است. نمودار 5: نمودار غلظت لیگاند ( نانوذرات نقره با پوشش پلی اتیلن گلیکول( علیه غلظت گونههای اکسی) ( دی اکسی ) ( و مت ) ( هموگلوبین.. نمودار بر اساس میانگین و انحراف معیار گزارش شده است. نمودار 6: نمودار غلظت لیگاند )نانوذره نقره با پوشش پلی اتیلن گلیکول ) علیه نسبت دیاکسی هموگلوبین.. نمودار بر اساس میانگین و انحراف معیار گزارش شده است. بحث و نتیجه گیری: بررسیهای انجام شده در این تحقیق نشان داد که نانوذره نقره با پوشش پلیاتیلن گلیکول اثر قابل توجهی بر ساختار و عملکرد هموگلوبین دارند. همان طور که نتایج طیفسنجی مرئی ماورای بنفش نشان داد با افزودن غلظت نانوذرات به محلول هموگلوبین جذب در ناحیه سورت کاهش مییابد. در حالی که در محل پیک تغییری مشاهده نمی شود. همچنین طیف جذبی پروتئین در ناحیه 278 افزایش نشان داد. این تغییرهای طیفی معنادار نشان میدهد. گروههای هم متصل به پروتئین مورد هدف نانوذرات نقره با پوشش پلیاتیلن گلیکول قرار گرفتهاند و سبب تغییر موقعیت هم در جایگاه خود شده است. همچنین با آنالیز دادههای حاصل از طیفسنجی دو رنگنمایی حلقوی مشخص شد که نانوذرات نقره سبب کاهش ساختار هلیکسی هموگلوبین و افزایش ساختار بتای آن شدهاست. به طوری که در بیشترین غلظت نانوذرات بیش از 50 درصد از ساختار آلفا کاسته شده و در حدود 20 درصد به ساختار بتا افزوده شده است. به عبارت دیگر افزودن نانوذرات به هموگلوبین سبب تغییر در ساختار دوم هموگلوبین و انتقال ساختار از هلیکس به بتا گردیده است. با افزایش محتوای بتا نیز آبگریزی پروتئین افزایش می یابد. این نتیجه همسو با نتایج یک محقق هندی است که نشان داد در اثر برهمکنش هموگلوبین با نانوذرات نقره به واسطه افزایش ساختارهای بتا تغییرهای ساختاری گستردهای رخ میدهد[ 38 ]. همچنین در تحقیق دیگری برای دور 42 شماره 1397 2 صف حات 79 ات 85
بررسی آثار نانوذرات نقره به فرم پگیله بر ساختار عملکرد و غلظت فرمهای مختلف هموگلوبین / 84 نانوذرات مس نیز نتایج مشابهی حاصل شده است) 39 (. هر چند برخی تحقیقات نشان میدهد تغییر نوع اندازه و پوشش نانوذرات میتواند تاثیر متفاوتی بر برهمکنش آنها با هموگلوبین نشان دهد) 40-41(. اگر در اثر اتصال نانوذرات تغییر چشمگیری در ساختار هموگلوبین رخ دهد که در نتیجه آن تبدیل شکل از R به T و یا بالعکس رخ دهد انعکاس این تغییر در طیفهای CD فلورسانس و مرئی ماورایبنفش قابل مشاهده است. ضمن اینکه این تغییر مهم ساختاری نسبت گونههای مختلف هموگلوبین را نیز تغییر داده و بر میل اتصال هموگلوبین نسبت به اکسیژن نیز اثر گذار است. به طور مثال انتقال ساختار از R به T به کاهش تمایل اتصال هموگلوبین به اکسیژن و افزایش شکل بدون اکسیژن منجر میشود. در شکل R اتم آهن در صفحه پورفیرین قرار دارد و در این حالت انتقال از انرژی از تریپتوفان β-37 )مهمترین منبع نشر نور( به سیستم پورفیرین به راحتی انجام میشود بنابراین فلورسانس شکل R در مقایسه با شکل T با شدت بیشتری خاموش میشود بنابراین افزایش مییابد. هم چنین تغییر ساختار چهارم از R به T سبب تغییر در ساختار دوم نیز میشود. دلیل این امر جابهجایی 2+ Fe سمت صفحه پورفیرین است که سبب میشود دنباله اسید آمینه هیستیدین به سمت جایگاه کئوردیناسیون پنجم حرکت کند. این هیستیدین بخشی از آلفا هلیکس است. بنابراین با تغییر ساختار چهارم از R به T یک دگرگونی در ساختار دوم به وجود میآید که منجر به کاهش میزان هلیکس پروتئین منجر میشود. همچنین نتایج حاصل از دادههای طیف سنجی مرئی ماورای بنفش نشان داد که در اثر افزودن نانوذرات به محلول هموگلوبین از شکل اکسی کاسته و به شکل دی اکسی افزوده میشود و در نتیجه در حضور این نانوذرات نسبت دیاکسی نیز افزایش مییابد. این نتایج بدین معنی است که یک تغییر ساختار از R به T کاهش تمایل اتصال اکسیژن منجر شده است. اما همان طور که قبال نیز اشاره شد در صورتی که ساختار چهارم از R به T تغییر یابد بایید نشر فلورسانس نیز افزایش یابد. که در این جا عکس این اتفاق رخ داده است. طیف فلورسانس هموگلوبین در حضور نانوذرات نقره نشان داد که در اثر افزایش غلظت نانوذرات طول موج ماکزیمم به سمت طول موجهای کوتاه تر )جابجایی آبی( و شدت نشر ماکزیمم نیز کاهش مییابد. به نظر میرسد کاهش شدت نشر فلورسانس در اثر افزودن نانوذرات گویای این است که محل اتصال نانوذرات در نزدیکی تریپتوفان است. تغییر در طول موج ماکزیمم و کاهش آن به سمت طول موجهای کوتاه تر نیز نشاندهنده افزایش آبگریزی سطح پروتئین در اثر افزایش غلظت نانوذرات نقره است. محدودیتهای تحقیق: با توجه به هزینههای مواد و تعدد روشهای بررسی تعداد تکرارها سه بار انتخاب شد که تکرار بیشتر آب شده نانوذرات در برخی از روشها به دالیل مختلف از جمله خطای آزمایش از نتایج حذف شد. نتیجهگیری: بر اساس آنچه گفته شد تغییر در خصوصیات رفتاری و عملکردی هموگلوبین میتواند آثار زیانآوری را برموجودات زنده داشته باشد. از آنجا که تغییرهای کنفورماسیونی القایی حاصل از اندرکنش نانومواد با پروتئینهای خون به عنوان آثار مخرب این ترکیبها مطرح است در نتیجه نتایج حاصل میتواند اطالعات مفیدی برای شناسایی و معرفی ترکیبهایی با عوارض جانبی و سمیت کمتردر اختیار ما قرار دهد. از نتایج این تحقیق میتوان دریافت که اتصال نانوذرات نقره به هموگلوبین سبب تغییر ساختار آن شده است به نحوی که در اثر این تغییر ساختار محتوای هلیکسی آن کاهش و بر محتوای بتای آن افزوده شده است. به بیان دیگر ساختار پروتئین تا حد زیادی باز شده است نتیجه این امر میتواند افزایش آبگریزی سطح پروتئین باشد که آن نیز به آغاز پدیده خودتجمعی هموگلوبین منجر میشود. انعکاس این تغییر ساختار در تغییر عملکرد پروتئین نیز مشهود است به طوری که این تغییرهای ساختاری به تغییر در سطح پاکت آبگریز هم نیز منجرگردیده است بنا بر تمایل اتصال هموگلوبین نیز تاثیر گذاشته است و بر خالف آنچه انتظار می رفت پوشش پلی اتیلن گلیکول منجر به عدم ایجاد برهم کنش بین نانوذرات نقره با هموگلوبین نشد. هر چند این احتمال وجود دارد که نانوذرات نقره بدون پوشش اثرات شدیدتری بر ساختار و عملکرد هموگلوبین از خود بر جای بگذارند. به این ترتیب با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق پیشنهاد می گردد برای استفاده از نانوذرات در کارهای درمانی عوارض جانبی آنها از جمله برهم کنش های احتمالی با پروتئین ها مدنظر قرار گیرد و پوشش اندازه و شکلی از نانوذرات استفاده شود که کمترین اثرات سوء بر سایر ملکول ها برجا گذارد. منابع: 1. Gao X, Cui Y, Levenson RM, Chung LWK, Nie S: In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nat Biotechnol 2004; 22, 969. 2. Ferrari M: Cancer nanotechnology: opportunities and challenges. Nat Rev Cancer 2005; 5, 161. 3. Lynch I: Detecting Cryptic Epitopes Created by Nanoparticles, Science STKE 2006;327, 14 4. Cedervall T, Lynch I, Lindman S, Berggård T, Thulin E, Nilsson H, et al: Understanding the nanoparticle protein corona using methods to quantify exchange rates and affinities of proteins for nanoparticles. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104, 2050 5. Gan S, Zhong L, Han D, Niu L, Chi Q: Pro1bing Bio-Nano Interactions between Blood Proteins and Monolayer-Stabilized Graphene Sheets. Small. 2015 ;11(43):5814-25. 6. Norde W, Gage D: Interaction of Bovine Serum Albumin and Human Blood Plasma with PEO-Tethered Surfaces: Influence of PEO Chain Length, Grafting Density, and Temperature. Langmuir 2004; 20, 4162 7. Allen LT, Tosetto M, Miller IS, O Connor DP, Penney SC, Lynch I, et al: Surface-induced changes in protein adsorption and implications for cellular phenotypic responses to surface interaction. Biomaterials 2006; 27, 3096 8. Gray JJ: The Interaction of Proteins with Solid Surfaces. Curr Opin Struct Biol 2004; 14, 110 9. Wilson CJ, Clegg RE, Leavesley DI, Pearcy MJ.: Mediation of biomaterial-cell interactions by adsorbed proteins: a review. Tissue Eng 2005; 11, 1 10. Engel MF, Visser AJ, van Mierlo CP.: Conformation and orientation of a protein folding intermediate trapped by adsorption. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101, 11316 11. Cummings CL, Gawlitta D, Nerem RM, Stegemann JP: Properties of engineered vascular constructs made from collagen, fibrin, and collagenfibrin mixtures. J Biomaterial 2004; 25, 3699 12. Chen CS, Alonso JL, Ostuni E, Whitesides GM, Ingber DE.: Cell shape provides global control of focal adhesion assembly. Biochem Biophys Res Commun.2003; 307, 355 13. Saptarshi SR1, Duschl A, Lopata AL: Interaction of nanoparticles with proteins: relation to bio-reactivity of the nanoparticle. J Nanobiotechnology. 2013; 11, 26. 14. Mohd SA, Hamad AL, Ayman MA, Abdelrahman O E, Sami AAH. Interaction of human serum albumin with silver nanoparticles functionalized with polyvinylthiol. Journal of Molecular Liquids. 2015;204, 248-254 15. Lindman S, Lynch I, Thulin E, Nilsson H, Dawson KA, Linse S: Systematic investigation of the thermodynamics of HAS. Nano Lett 2007; 7, 914 16. Dutta D, Sundaram SK, Teeguarden JG, Riley BJ, Fifield LS, دور 42 شماره 1397 2 صف حات 79 ات 85
/ 85 سمانه ذوالقدری جهرمی و همکاران Jacobs JM, et al: Adsorbed proteins influence the biological activity and molecular targeting of nanomaterials. Toxicological Sciences. 2007;100, 303 315. 17. Sabatino P, Casella L, Granata A, Iafisco M, Lesci IG, Monzani E, et al: Synthetic chrysotile nanocrystals as a reference standard to investigate surface-induced serum albumin structural modifications.. J Colloid Interface Sci 2007; 314, 389 18. Jeong SH, Hwang YH, Yi SC, Antibacterial properties of padded PP/PE nonwovens incorporating nano-sized silver, J Mater Sci 2005; 40, 5413 5418. 19. Chen X, Schluesener HJ, Silver nanoparticle: a nanoproduct in medical application, Toxicol Lett 2008;176, 1 12. 20. Divya PG, Midhun BT, Rony T, Ashok MR and Dipshikha C. Interaction of silver nanoparticles with serum proteins affects their antimicrobial activity in vivo. antimicrob agents chemother. 2013 ; 57(10): 4945 4955. 21. AL-Thabaiti NS, Malik MA, Khan Z. Protein interactions with silver nanoparticles: Green synthesis, and biophysical approach. International Journal of Biological Macromolecules. 2017;95,421-428 22. Rahmani S, Mogharizadeh L, Attar F, Rezayat SM, Mousavi SE and Falahati M. Probing the interaction of silver nanoparticles with tau protein and neuroblastoma cell line as nervous system models, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 2017 23. DOI: 10.1080/07391102.2017.1407673 23 Songqin L, Zhihui D, Hongyuan C, Huangxian J. Immobilization of hemoglobin on zirconium dioxide nanoparticles for preparation of a novel hydrogen peroxide biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 2004; 19, 963 969 24. De S, Girigoswami A: A fluorimetric and circular dichroism study of Hemoglobin:effect of ph and anionic amphiphiles. J Colloid Interface Sci 2006; 296, 324. 25. Cheng Y, Lin HK, Xue DP, Li RC, Wang K: Lanthanide ions induce hydrolysis of Hemoglobin-bound. Biochim Biophys Acta 2001; 1535, 200. 26.Susmita Sil, Tania Bose, Dibyendu Roy, Abh ay Sankar Chakraborti. Protoporphyrin IX-induced structural and functional changes in human red blood cells, haemoglobin and myoglobin. J Biosci. 2004; 29(3), 281 27. Shuizhen Z, Yong C, Yuming Z, Huangxian Ju. Hydrogen peroxide biosensor based on hemoglobin modified zirconia nanoparticles-grafted collagen matrix. Analytica Chimica Acta 2007; 582, 361 366. 28. Devineau S, Zargarian L, Renault JP, Pin S. Structure and Function of Adsorbed Hemoglobin on Silica Nanoparticles: Relationship between the Adsorption Process and the Oxygen Binding Properties. Langmuir. 2017;33(13),3241. 29. Khodarahmi R, Maghsoodi S, Rahi H, Hamzehee K, Zamaheni S, Davarpanah E. Evidence of human hemoglobin interaction with chorionic gonadotropin hormone: Prospects for the use of hemoglobin as ligand in affinity chromatography for the purification of the hormone. Journal of Paramedical Sciences. 2014;5(3), 31 30. Andrade CT, Barros LA, Lima MC, Azero EG. Int J Biol Macromol. 2004;34(4):233-40. 31. D Alessandro A, Blasi B, D Amici GM, Marrocco C, and Zolla L. Red blood cell subpopulations in freshly drawn blood: application of proteomics and metabolomics to a decades-long biological issue. Blood Transfus. 2013;11(1): 75 87. 32. Norma JG. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nat Protoc. 2006; 1(6), 2876. 33. Zolghadri S, Saboury AA, Amin E, Moosavi-Movahedi AA. A spectroscopic study on the interaction between ferric oxide nanoparticles and human hemoglobin. Journal of the Iranian Chemical Society 2010;7,145 34. Goldbeck RA, Esquerra RM, Kliger DS: Hydrogen Bonding to Trp β37 Is the First Step in a Compound Pathway for Hemoglobin Allostery. J Americ Chem Soc 2002;124, 7646. 35. Venkateshrao S, Manoharan PT: Fluorescence Study on Reconstituted Hemoglobins. Spectrochim Acta Part A 2004; 60, 2523. 36. Kong J, Yu : Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary structures. Acta Biochim Biophys Sin 2007; 39,549 37. Asghari Khiavi M, Mechler A, Bambery K, McNaughton D and Wood B. A resonance Raman spectroscopic investigation into the effects of fixation and dehydration on heme environment of hemoglobin. Journal of Raman Spectroscopy 2009;. 40. 1668 38. Mahato M, Pal P, Tah B, Ghosh M, Talapatra GB.. Study of silver nanoparticle hemoglobin interaction and composite formation Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2011; 88, 141. 39. Bhattacharya J, Choudhuri U, Siwach O, Sen P, Dasgupta AK. Interaction of hemoglobin and copper nanoparticles: implications in hemoglobinopathy.nanomedicine 2006 ; 2(3), 191. 40. Yang W, Sun L, Weng J, Chen L, Zhang Q.. Probing the interaction of bovine haemoglobin with gold nanoparticles IET Nanobiotechnology 2012; 6, 26. 41. Shen XC, Liu XY, Liang H, Lu X: Spectroscopic Studies of Interaction between Bovine Hemoglobin and Ag Nanoparticles. Acta Chimica Sinica 2006; 64, 469. دور 42 شماره 1397 2 صف حات 79 ات 85