ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΔΩΡΙΖΑ ΖΑΜΠΕΤΑ Επιμελήτρια Β Αιματολογικού Εργαστηρίου Γ.Ν.Α. «Ο ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ»

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες αποτελούν τις πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες παγκοσμίως. Ο όρος αιμοσφαιρινοπάθειες υπονοεί διαταραχή της αιμοσφαιρίνης και επομένως περιλαμβάνει εννοιολογικά δύο οντότητες, αυτή των διαταραχών του μεταβολισμού της αίμης (πορφυρίες) και αυτή των διαταραχών της σφαιρίνης. Ωστόσο, στην πράξη έχει επικρατήσει να αναφέρεται σε διαταραχές της σφαιρίνης και μόνο.

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες μπορούν να διακριθούν σε (Α) ποσοτικές, όπου παρατηρείται έλλειψη ή ελάττωση της παραγωγής μιας αλυσίδας. Εδώ ανήκουν τα θαλασσαιμικά σύνδρομα. 1. β-θαλασσαιμικά σύνδρομα ομόζυγη β-θαλασσαιμία ενδιάμεση β-θαλασσαιμία ετερόζυγη β-θαλασσαιμία δβ - θαλασσαιμία γδβ - θαλασσαιμία δ - θαλασσαιμία Hb-Lepore 2. α-θαλασσαιμικά σύνδρομα α 1 θαλασσαιμία (σιωπηλός φορέας) (_α/αα) α 2 θαλασσαιμία (ετερόζυγη) (_α/αα) ή (_α/_α) α 3 θαλασσαιμία (ενδιάμεση, Hb H) ( /_α) α 4 θαλασσαιμία (εμβρυϊκός ύδρωπας ή μείζων α-θαλασσαιμία ( / ) 3. Hb Constant Spring

Β) Ποιοτικές ή αλλιώς παθολογικές αιμοσφαιρίνες όπου χαρακτηρίζονται από αντικατάσταση ενός ή περισσότερων αμινοξέων στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, έτσι ώστε η νέα αλυσίδα να προσδίδει διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες στην παραγόμενη αιμοσφαιρίνη. 1. Προκαλούσες αιμολυτική αναιμία Με διαταραχές της μορφολογίας των ερυθροκυττάρων (Hb S) Με διαταραχές της σταθερότητας της Hb (ασταθείς Hb) 2. Προκαλούσες πολυκυτταραιμία 3. Προκαλούσες κυάνωση (Hb M) 4. Φαινοτυπικά όμοιες με θαλασσαιμία Με ελαττωμένο ρυθμό σύνθεσης Hb E Με παθολογικό τερματισμό αλυσίδας Ενώ έχουμε και τις μικτές ετεροζυγωτίες, όπως η μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία (συνύπαρξη δρεπανοκυτταρικού και β- θαλασσαιμικού γονιδίου).

ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι ίσως το μοναδικό γενετικό νόσημα στο οποίο η αναγνώριση των φορέων επιτυγχάνεται με απλή αιματολογική εξέταση. Ηδιάγνωσημπορείναγίνειείτε στο πλαίσιο της πρόληψης (Μονάδες Μεσογειακής Αναιμίας, Γενικό Νοσοκομείο, ιδιωτικό εργαστήριο), είτε τυχαία κατά τη διερεύνηση μιας υπόχρωμης μικροκυτταρικής αναιμίας. Για τη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών πρέπει να προηγείται ο αιματολογικός και βιοχημικός έλεγχος και να ακολουθούν οι πιο εξειδικευμένες τεχνικές και η μελέτη του οικογενειακού ιστορικού. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ασφαλή διάγνωση είναι η κοινή αποδοχή αλγόριθμου εργαστηριακής διάγνωσης.

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 1. Γενική αίματος 2. Μελέτη μορφολογίας ερυθροκυττάρων 3. Ερυθροκυτταρικά έγκλειστα ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 1. Ηλεκτροφόρηση Hb 2. Ισοηλεκτρική εστίαση 3. HPLC (Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης) 4. Ποσοτικός προσδιορισμός HbA 2, HbS κ.ά. 5. Δοκιμασία δρεπάνωσης 6. Ωσμωτική αντίσταση ερυθροκυττάρων 7. Μέτρηση σιδήρου, φερριτίνης 8. Βιοσύνθεση αιμοσφαιρίνης ΜΟΡΙΑΚΗΜΕΛΕΤΗΤΟΥDNA 1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

ΓΕΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΣ Οι παράμετροι που αξιολογούνται στη γενική αίματος είναι RBC, Hb, MCV, MCH, RDW. Ο συνδυασμός των δεικτών MCV, MCH και RDW αποτελεί σημαντική βοήθεια στην εργαστηριακή διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Κατά την αξιολόγηση της γενικής αίματος μπορούμε να διαπιστώσουμε την ύπαρξη: α. Υπόχρωμης, μικροκυτταρικής αναιμίας β. Υποχρωμία, μικροκυττάρωση χωρίς αναιμία γ. Οριακούς δείκτες (MCV, MCH) Δεν είναι σπάνιο να συνυπάρχει σιδηροπενία σε ετεροζυγώτες θαλασσαιμίας. Σε περίπτωση ελέγχου αποκαθίσταται σε πρώτη φάση η σιδηροπενία (εφόσον υπάρχει) και ακολουθεί ο έλεγχος.

ΕΠΙΧΡΙΣΜΑ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΕΓΚΛΕΙΣΤΑ Κατά τη μελέτη του επιχρίσματος περιγράφεται η ύπαρξη ή όχι υποχρωμίας, πολυχρωματοφιλίας, μικροκυττάρωσης, ποικιλοκυττάρωσης, ανισοκυττάρωσης, στοχοκυττάρωσης, δρεπανοκυττάρων, βασεόφιλης στίξης, καθώς και η ανεύρεση εμπύρηνων ερυθροκυττάρων. Ερυθροκυτταρικά έγκλειστα αναζητούνται εφόσον: α. Υπάρχει υποψία HbH ή στην ηλεκτροφόρηση υπάρχει ταχύ κλάσμα. β. Υπάρχει υποψία α-θαλασσαιμίας. γ. Πιθανολογείται ύπαρξη ασταθούς αιμοσφαιρίνης Στα ερυθρά αιμοσφαίρια πασχόντων από α-μα παρατηρούνται σφαιρικά έγκλειστα στα οποία οφείλονται σε τετραμερή B 4.

Ετερόζυγη β-θαλασσαιμία

Ομόζυγη β-θαλασσαιμία

Δρεπανοκύτταρο Δρεπανοκυτταρική αναιμία

Αιμοσφαιρινοπάθεια Η Επίχρισμα περιφερικού Έγκλειστα (Β 4 τετραμερή)

Εμβρυϊκός ύδρωπας

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Hb (1) ΗηλεκτροφόρησηHb παραμένει η πιο συνηθισμένη τεχνική στην άμεση ανίχνευση και χαρακτηρισμό των διάφορων αιμοσφαιρινών. Η συλλογή αίματος γίνεται σε σωληνάριο γενικής αίματος. Το δείγμα αίματος και το αιμόλυμα μπορεί να διατηρηθεί εντός ψυγείου (4 C) και να χρησιμοποιηθεί μέσα σε μια εβδομάδα.

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Hb (2) Η ηλεκτροφόρηση Hb σε οξεική κυτταρίνη σε αλκαλικό PH (8.2-8.6) είναι η συνηθέστερη μέθοδος για την ανίχνευση και το χαρακτηρισμό των διάφορων αιμοσφαιρινών. Η αλκαλική ηλεκτροφόρηση διακρίνει αποτελεσματικά τις φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες Α, Α 2 και F και τις παθολογικές S και C. Η ηλεκτροφόρηση σε όξινο PH γίνεται σε κιτρικό άγαρήγέληαγαρόζης. Έτσι διαχωρίζονται: Η Hb C από την Hb E. Η Hb S από τις Hb D, Hb G και HD Lepore.

α-θαλασσαιμικά σύνδρομα ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Εμβρυϊκός ύδρωπας Αιμοσφαιρινοπά θεια Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ HbA=0Hb Bart (γ4) μη HbF=0 HbH (β4) λειτουργικές Hb Portland HbH: 1-30% (ταχύ κλάσμα) HbA HbA 2 : 1-2% Αιμολυτική αναιμία ποικίλης βαρύτητας Ετερόζυγη α-μα HbΑ: κ.φ. MCV, MCH HbA 2 : κ.φ. 3-5% Hb Bart κατά τη γέννηση Σιωπηλός φορέας α-μα HbΑ: κ.φ. MCV, MCH ή HbA 2 : κ.φ. Οριακά ή κ.φ. ΓΟΝΟΤΥΠΟΣ α 0 thal/α 0 thal α 0 thal/α + thal α 0 thal/α ή α + thal/α + thal α + thal/α

Γενική αίματος: κ.φ. MCV>82 fl, MCH>28 pg M. EP: κ.φ. A 2 <3%, F<2% Υγιείς A 2 3%, F<2% Υγιείς ή β-σιωπηλοί φορείς (μελέτη DNA) A 2 <3%, F>3% HPFH Χρώση Kleihauer - Betke Μελέτη DNA A 2 <1,8%, F<2% Σιδηροπενία* ετερ. δ. ΜΑ Hb Κνωσσός * Η διόρθωση υπάρχουσας σιδηροπενίας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιόπιστη μέτρηση της HbA 2.

Γενική αίματος MCV<82 fl, MCH<28 pg M. EP: + A 2 >3,5%, F 1-3% Τυπική β ετεροζυγώτες (30% των περιπτώσεων) A 2 6%, F 3-15% β-ετεροζυγώτες (~15%) A 2 3,5-4% MCV, MCH A 2 <3%, MCV, MCH οριακά A 2 >3,5% MCV-MCH A 2 <3%, F<2% A 2 <3%, F>5% β-ετεροζυγώτες ΣχετικάήπιαμετάλλαξηIVSI-6 Ήπιοι β-ετεροζυγώτες (-101/Ν1) Διπλοί ετεροζυγώτες α+β Έλεγχος γονέων-βιοσύνθεση-dna α-μα (Έγκλειστα ερυθροκυττάρων) γδβ-μα Σιδηροπενία Ετερ δβ - ΜΑ HPFH + α - ΜΑ Μοριακή μελέτη DNA

Μεθοδολογία Εργαστηριακής Διερεύνησης Παθολογικών Hb Ηλεκτροφόρηση Hb (Αλκαλικό ΡΗ 8,6) ή HPLC Παρουσία παθολογικού κλάσματος Δοκιμασία Δρεπάνωσης Θετική Παρουσία HbS Αρνητική Ηλεκτροφόρηση Hb (όξινο ΡΗ 6,4) Ηλεκτροφόρηση πεπτιδικών αλυσίδων Ισοηλεκτρική εστίαση Ποσοτική μέτρηση Βιοσύνθεση Hb DNA

A 2 3%, S<50% A 2 <3% S70-95% A=O Ετερόζυγη δρεπανοκυτταρική αναιμία Ομόζυγη δρεπανοκυτταρική αναιμία A 2 >3% S>50% A 10-30% F 5-30% HbS/Hbβ + A 2 >3% S>50% A=Ο F 1-15% HbS/Hbβ ο

HPLC Χρησιμοποιείται σε εργαστήρια με μεγάλο φόρτο εργασίας, αν και έχει πλέον αντικαταστήσει την κλασσική ηλεκτρόφορηση Hb. Τα πλεονεκτήματα, σε σχέση με την κλασσική ηλεκτροφόρηση, είναι τα εξής: Λιγότερο επίπονη και συντομότερη μέθοδος, ενώ δεν απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό. Απαιτεί μικρότερη ποσότητα δείγματος (5 μl). Ανιχνεύονται περισσότερες παθολογικές αιμοσφαιρίνες. Με την ποσοτική μέτρηση της HbA 2 επιτρέπει τη διάγνωση της ετερόζυγης β-θαλασσαιμίας σε ένα στάδιο, αποφεύγοντας έτσι την ηλεκτροφόρηση και τη χρωματογραφία σε στήλη ρητίνης. Μειονέκτημα: Το μεγάλο κόστος τόσο του μηχανήματος όσο και των αντιδραστηρίων.

ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της HbA 2 είναι: Ο χρωματογραφικός δαχωρισμός σε μικροστήλες ρητίνης (μέθοδος αναφοράς). Ο αυτόματος χρωματογραφικός διαχωρισμός με την HPLC. Η έκλουση του κλάσματος της Α 2 μετά από ηλεκτροφόρηση σε οξεική κυτταρίνη και η μέτρησή του σε φωτόμετρο. ΗαύξησητηςHbA 2 είναι ένα από τα πιο αξιόπιστα και ειδικά κριτήρια για τη διάγνωση της ετερόζυγης β-μα.!! Η HPLC δεν συνιστάται για την ποσοτική μέτρηση της HbA 2 σε περίπτωση που συνυπάρχει HbS ή Hb Lepore.

ΧΡΩΣΗ KLEIHAUER-BETKE (ΚΥΤΤΑΡΑ F) Χρησιμοποιείται για τη διαφορική διάγνωση της HPFH από τις θαλασσαιμίες με αυξημένη HbF. Τα κύτταρα που περιέχουν HbF βάφονται ροζ, ενώ τα ερυθροκύτταρα, που δεν περιέχουν HbF, δεν βάφονται (ghost cells). Στις θαλασσαιμίες παρατηρείται ετερογενής κατανομή της HbF, ενώ στην HPFH όλα σχεδόν τα ερυθροκύτταρα περιέχουν HbF.

Χρώση Kleihauer-Betke

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΡΕΠΑΝΩΣΗΣ Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των παθολογικών αιμοσφαιρινών που μεταναστεύουν μαζί με την HbS (Hb D, Hb G, Hb Lepore ) στην αλκαλική ηλεκτροφόρηση σε οξεική κυτταρίνη. Η δοκιμασία στηρίζεται στο γεγονός ότι τα ερυθροκύτταρα που περιέχουν HbS μετατρέπονται σε δρεπανοκύτταρα όταν το αίμα αποξυγονοποιηθεί (προϋπόθεση ποσοστό HbS>15%). Το φαινόμενο της δρεπάνωσης εμφανίζεται γρήγορα στην ομόζυγη ΔΑ και αργά στην ετερόζυγη ΔΑ και στη ΜΔΚ.

Δοκιμασία δρεπάνωσης

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Με την in vitro βιοσύνθεση των αιμοσφαιρινικών αλυσίδων παρουσία ενός τουλάχιστον ραδιοσεσημασμένου αμινοξέος, υπάρχει η δυνατότητα να καθοριστεί με αυξημένη ακρίβεια η αναλογία των συντιθέμενων αλυσίδων. Βιοσυνθετικός λόγος α/β > 1,20 υποδηλώνει β-μα, ενώ βιοσυνθετικός λόγος α/β < 0,85 υποδηλώνει α-μα. Φυσιολογικά ο βιοσυνθετικός λόγος α/β είναι περίπουίσοςμετημονάδα.