«Οξειδωτικό στρες σε όργανα αρουραίου και σε αίμα ανθρώπου με αποφρακτικό ίκτερο»

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Οξειδωτικό στρες σε όργανα αρουραίου και σε αίμα ανθρώπου με αποφρακτικό ίκτερο» Κωνσταντίνος Γκρίντζαλης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ, 2007

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή διεκπεραιώθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του τομέα Γενετικής, Βιολογίας κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα 2005-2007. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά μου, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Χρήστο Γεωργίου, ο οποίος μου δίδαξε τον σωστό τρόπο προσέγγισης επιστημονικών ζητημάτων. Πάντα έβρισκα τις συμβουλές του εποικοδομητικές και χρήσιμες και μέσω αυτών θεωρώ ότι συνέβαλε στο να αποκτήσω έναν άλλο τρόπο σκέψης. Εκτός των άλλων, η βοήθεια και η καθοδήγησή του ήταν σημαντική σε όλη την πορεία μου στο εργαστήριο. Θα ήθελα ακόμη, να ευχαριστήσω την κ. Μαρίνα Κεφαλιακού και τον κ. Νίκο Παναγόπουλο, Λέκτορες του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την πρόθυμη συμμετοχή τους στη τριμελή εξεταστική επιτροπή, καθώς και για τις εύστοχες υποδείξεις τους κατά την συγγραφή της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Θα ήταν μεγάλη παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον πολύ καλό φίλο και συνεργάτη Γιάννη Παπαποστόλου για την ευχάριστη διάθεση και την πολύ καλή συνεργασία που είχαμε, καθώς και για όλα όσα έμαθα από αυτόν στο εργαστήριο. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τους γιατρούς του Γενικού Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών Αδαμάντιο Μαυράκη και Στέλιο Ασσημακόπουλο για την βοήθειά τους στο σχεδιασμό και την διεξαγωγή του κλινικού μέρους των πειραμάτων και τη διάθεση των ιστών. Κατά το διάστημα 2005-2007 υπήρξα υπότροφος του Μορφωτικού Ιδρύματος Ηθικής και Κοινωνικής Διαπαιδαγώγισης του οποίου η οικονομική ενίσχυση ήταν σημαντική για την εξέλιξη των σπουδών μου. Θα πρέπει να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Πρόεδρο του Ιδρύματος, κο. Νικόλαο Φυτρολάκη για τις προσωπικές προσπάθειες που έκανε ώστε το Ίδρυμα να με στηρίξει οικονομικά. Κλείνοντας, θα ήθελα ολόψυχα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην μητέρα μου για την πολύπλευρη υποστήριξή της καθ όλη την πορεία των σπουδών μου, αλλά και στους φίλους μου. 2

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεωργίου Χρήστος Επιβλέπων Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Κεφαλιακού Μαρίνα Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Παναγόπουλος Νίκος Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 3

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Ο στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής είναι η διερεύνηση της ανάπτυξης του οξειδωτικού στρες κατά την πάθηση του ίκτερου, in vivo σε ένα πειραματικό μοντέλο αποφρακτικού ίκτερου και σε αίμα ανθρώπων που παρουσίασαν την πάθηση. Συγκεκριμένα μελετήθηκε ο ρόλος της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου (O 2 ), κεντρικού παράγοντα του οξειδωτικού στρες και η υπεροξείδωση των λιπιδίων, στις εγκεφαλικές περιοχές και τα εσωτερικά όργανα αρουραίων που τους προκλήθηκε αποφρακτικός ίκτερος και σε πλάσμα αίματος ανθρώπων. Η σημασία της μελέτης είναι διπλή διότι όχι μόνο επικεντρώνεται στην κεντρική παράμετρο του οξειδωτικού στρες (ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου) αλλά εισάγει για πρώτη φορά την ανίχνευσή της σαν έναν κλινικό δείκτη στους ανθρώπους. Τέλος με την μελέτη δίνεται έμφαση στην αναγνώριση του ενζύμου της οξειδάσης της ξανθίνης ως μια εκ των πηγών της παραγόμενης ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στο αίμα των ασθενών. 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 4 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 1. Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες 7 1.1. Η εξέλιξη της αερόβιας διαβίωσης 7 1.2. Ελεύθερες ρίζες και άλλες δραστικές μορφές οξυγόνου 7 1.3. Οι συνέπειες του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα 11 1.4. Aντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών 13 2. Βιοχημεία της ρίζας του ανιόντος του σουπεροξειδίου 14 2.1. Μηχανισμοί πρόκλησης βλαβών από το O 2 15 2.1.1. Η κύρια οδός βιομετατροπής του O 2 16 2.1.2. Η εναλλακτική οδός βιομετατροπής του O 2 19 3. Ίκτερος και οξειδωτικό στρες 20 3.1. Η πάθηση του ίκτερου 20 3.2. Αποφρακτικός ίκτερος και οξειδωτικό στρες 21 3.3. Η οξειδάση της ξανθίνης 21 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 23 1. Πειραματικό Υλικό 23 1.Α. Μοντέλο αποφρακτικού ίκτερου σε αρουραίους 1.Α.1. Σχεδιασμός μοντέλων ζώων και χειρουργικές διαδικασίες 1.Α.2. Επεξεργασία ιστών 23 23 24 1.Β. Δείγματα ολικού αίματος ανθρώπων 24 2. Εφαρμογή μεθόδων που υπάρχουν ήδη στη διεθνή βιβλιογραφία για την εκτίμηση δεικτών οξειδωτικού στρες 25 2.Α. Προσδιορισμός του O 2 μέσω απομόνωσης και ποσοτικοποίησης φθορισμομετρικά του 2-υδροξυαιθιδίου 25 2.Β. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (ισοδύναμα MDA) 29 2.Γ. Ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών με την μέθοδο Bradford 32 2.Δ. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων 34 5

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 35 1. Μοντέλο αποφρακτικού ίκτερου σε αρουραίους 35 1.Α. Εγκεφαλικές περιοχές 35 1.Β. Εσωτερικά όργανα 36 2. Δείγματα ολικού αίματος ανθρώπων 37 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 39 1. Μοντέλο αποφρακτικού ίκτερου σε αρουραίους 39 1.Α. Εγκεφαλικές περιοχές 39 1.Β. Εσωτερικά όργανα 41 2. Δείγματα ολικού αίματος ανθρώπων 3. Τελικά συμπεράσματα 43 44 H. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 46 6

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες 1.1. Η εξέλιξη της αερόβιας διαβίωσης Το μοριακό οξυγόνο εισήχθη στην αρχέγονη ανοξική ατμόσφαιρα σαν παραπροϊόν της φωτοσυνθετικής δράσης των κυανοβακτηρίων και η αναγωγή του ήταν αυτή που έδωσε στους οργανισμούς το πλεονέκτημα του εποικισμού της ξηράς, εφοδιάζοντάς τους με ένα φίλτρο προστασίας από τη επικίνδυνη υπεριώδη ακτινοβολία, την στοιβάδα του όζοντος (Ο 3, τριατομικό οξυγόνο). Γενικά οι οργανισμοί που εισήγαγαν το οξυγόνο στον μεταβολισμό τους επωφελήθηκαν ενεργειακά σημαντικά. Παρόλα αυτά, η αναγωγή του οξυγόνου με τα διάφορα μοριακά συστήματα των κυττάρων δεν είναι τέλεια και σε αυτό το σημείο έρχεται η θεωρία του οξειδωτικού stress, η οποία εμπλουτίζει την κλασική βιοχημεία και εστιάζει στη μελέτη της βλαπτικής πλευράς του αερόβιου μεταβολισμού. 1.2. Ελεύθερες ρίζες και άλλες δραστικές μορφές οξυγόνου Σήμερα πιστεύεται ότι όλες σχεδόν οι επιβλαβείς επιδράσεις του οξυγόνου οφείλονται στο σχηματισμό ελεύθερων ριζών (free radicals) και άλλων δραστικών παραγώγων οξυγόνου (reactive oxygen species). Με τον όρο ελεύθερη ρίζα ορίζεται κάθε άτομο ή μόριο που φέρει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (ασύζευκτο ή μονήρες καλείται το ηλεκτρόνιο που καταλαμβάνει μόνο του ένα ατομικό ή μοριακό τροχιακό). Στον ορισμό αυτό εμπίπτει τεράστιος αριθμός χημικών μορίων, με απλούστερο το ατομικό υδρογόνο που ως γνωστόν διαθέτει ένα μόνο ηλεκτρόνιο. Η ύπαρξη ενός τουλάχιστον ασύζευκτου ηλεκτρονίου συμβολίζεται συνήθως με μια τελεία ως εκθέτη στη δεξιά πλευρά του χημικού τύπου της ελεύθερης ρίζας, συμβολισμός τον οποίο θα ακολουθήσουμε στη συνέχεια. Μια ελεύθερη ρίζα σχηματίζεται από μία μη-ρίζα η οποία (α) χάνει ένα ηλεκτρόνιο, (β) δέχεται ένα ηλεκτρόνιο ή (γ) υφίσταται ομολυτική διάσπαση (homolytic fission) ενός ομοιοπολικού δεσμού (στην ομολυτική διάσπαση τα 2 ηλεκτρόνια του ομοιοπολικού δεσμού δεν μένουν με το πιο ηλεκτραρνητικό άτομο αλλά μοιράζονται μεταξύ των δύο αποχωρισμένων ατόμων): α) Χ e - + X + β) Y + e - Y γ) Χ : Y X + Y 7

Αντιστροφή της περίπτωσης της ομόλυσης έχουμε όταν δύο ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν μεταξύ τους και συνδεθούν με ομοιοπολικό δεσμό, οπότε προκύπτει μια μη-ρίζα (X + Y X Y), γεγονός που είναι πολύ σπάνιο, αφού η συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών διατηρείται σε πολύ χαμηλά επίπεδα ακόμη και σε καταστάσεις έντονου οξειδωτικού stress. Από την άλλη πλευρά, μια ελεύθερη ρίζα μπορεί να αντιδράσει με μια μη-ρίζα (κάτι που συνηθίζεται, αφού τα περισσότερα βιολογικά μόρια δεν είναι ελεύθερες ρίζες) με τους εξής τρόπους: α) προσθετικά, όταν η ελεύθερη ρίζα συνδέεται με τη μη-ρίζα (π.χ. προσθήκη του ΟΗ στην γουανίνη του DNA): Χ + Υ [Χ-Υ] β) αναγωγικά, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως αναγωγικός παράγοντας, παραχωρώντας το ασύζευκτό της ηλεκτρόνιο στη μη-ρίζα: Χ + Υ Χ + + Υ γ) οξειδωτικά, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως οξειδωτικός παράγοντας, δεχόμενη ένα ηλεκτρόνιο από τη μη-ρίζα: X + Y X - + Y + δ) αφαιρετικά, όταν η ελεύθερη ρίζα αποσπά ένα άτομο υδρογόνου από τον ανθρακικό σκελετό μιας οργανικής ένωσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιας αντίδρασης είναι η προσβολή των πλευρικών αλυσίδων λιπαρών οξέων από την ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου, με την οποία αρχίζουν οι αλυσωτές αντιδράσεις της υπεροξείδωσης των λιπιδίων: Το κοινό χαρακτηριστικό αυτών των αντιδράσεων είναι ότι σχηματίζεται πάντα μια νέα ελεύθερη ρίζα, η οποία αν είναι επίσης δραστική μπορεί να αντιδράσει εκ νέου με ένα άλλο μόριο κ.ο.κ. Τυπικό παράδειγμα τέτοιων αλυσιδωτών αντιδράσεων ελευθέρων ριζών είναι η υπεροξείδωση των λιπιδίων που είναι και ο κύριος μηχανισμός πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών σε βιολογικές μεμβράνες και θα αναφερθεί παρακάτω. Είναι σημαντικό ότι η ύπαρξη ενός ή περισσοτέρων ασύζευκτων ηλεκτρονίων σε ένα χημικό μόριο δεν είναι ούτε ικανή ούτε αναγκαία συνθήκη για την εμφάνιση υψηλής χημικής δραστικότητας. Η τάση ενός μορίου να αντιδρά είναι συνάρτηση ενός μεγάλου αριθμού παραγόντων όπως η συνολική ηλεκτρονιακή του κατανομή, που καθορίζει τη σταθερότητα των ενδομοριακών δεσμών, ο αριθμός και η θέση των 8

ασύζευκτων ηλεκτρονίων σε περίπτωση που πρόκειται για ελεύθερη ρίζα, το ph και η χημική φύση του περιβάλλοντος μέσου (υδρόφιλο ή υδρόφοβο) κ.α. Σύμφωνα με την ηλεκτρονιακή του κατανομή, το μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) στην βασική (μη διεγερμένη) κατάσταση (ground-state O 2 ) είναι ελεύθερη ρίζα, αφού διαθέτει δύο ηλεκτρόνια που λόγω των παράλληλων στροφορμών τους (spin) δεν μπορούν να ζευγαρώσουν και ως εκ τούτου καταλαμβάνουν το καθένα ένα διαφορετικό μοριακό τροχιακό. Η κατανομή αυτή προσδίδει στην όλη δομή υψηλού βαθμού χημική σταθερότητα, αφού προκειμένου το Ο 2 να αντιδράσει απευθείας με κάποια ένωση, θα πρέπει η ένωση αυτή να διαθέτει επίσης δύο μονά ηλεκτρόνια με spin παράλληλα μεταξύ τους και αντίθετα ως προς τα spin των ασύζευκτων ηλεκτρονίων του Ο 2. Ο περιορισμός αυτός (spin restriction) εξηγεί την αδυναμία του οξυγόνου να προσβάλλει απευθείας τα διάφορα βιολογικά μόρια και γενικότερα ενώσεις που δεν είναι ελεύθερες ρίζες, αλλά μπορεί να αρθεί με το σχηματισμό δραστικότερων παραγώγων Ο 2 με τους δύο ακόλουθους τρόπους: α) με πρόσληψη ενέργειας του Ο 2 βασικής κατάστασης, το οποίο έτσι μεταπίπτει στη διεγερμένη κατάσταση του μονήρους οξυγόνου (singlet oxygen). H απορροφούμενη ενέργεια αρχικά αντιστρέφει το spin του ενός ασύζευκτου ηλεκτρονίου (ενδιάμεση μορφή μονήρους οξυγόνου, 1 Σg + O 2 ). Στην συνέχεια, τα δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια που έχουν αντίθετα spin (Triplet Oxygen, Οξυγόνο Τριπλότητας), ζευγαρώνουν σε κοινό τροχιακό και δίνουν την τελική μορφή μονήρους οξυγόνου ( 1 ΔgO 2, Singlet Oxygen, Οξυγόνο Απλότητας) που είναι ιδιαίτερα δραστικός οξειδωτικός παράγοντας. Η μετάπτωση του μοριακού οξυγόνου από τη βασική στη μονήρη κατάσταση είναι κατά κανόνα συζευγμένη με την αποδιέγερση κάποιου κατάλληλου μορίου, το οποίο είχε προηγουμένως διεγερθεί με την απορρόφηση φωτεινής ακτινοβολίας ορισμένου μήκους κύματος (φωτοενεργοποίηση). β) με προοδευτική αναγωγή του μοριακού οξυγόνου μετά από πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου τη φορά. Η σταδιακή αυτή μονοσθενής αναγωγή μπορεί να συνεχισθεί μέχρι την προσθήκη τεσσάρων συνολικά ηλεκτρονίων, που καταλήγει στη μετατροπή ενός μορίου O 2 σε δύο μόρια Η 2 Ο με τη μεσολάβηση πολύ δραστικών και μερικώς ανηγμένων μορφών Ο 2. Οι μορφές αυτές είναι με τη σειρά το ανιόν (ελεύθερη ρίζα) σουπεροξειδίου O 2 (superoxide radical), το υπεροξείδιο του υδρογόνου H 2 O 2 (hydrogen peroxide) και η ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου OH (hydroxyl radical). 9

Εικόνα 1. Ηλεκτρονιακή κατανομή του ground state Ο 2 και των παραγώγων του. Δραστικά παράγωγα οξυγόνου σχηματίζονται αναπόφευκτα στον αερόβιο μεταβολισμό και είναι η κύρια αιτία εκδήλωσης του φαινομένου της οξειδωτικής πίεσης στα κύτταρα. Το μονήρες οξυγόνο (singlet oxygen) στην σταθερή του μορφή ( 1 ΔgO 2 ) και η ελεύθερη ρίζα του ανιόντος του σουπεροξειδίου (superoxide radical, O 2 ) δεν έχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια και έτσι ο όρος ελεύθερες ρίζες οξυγόνου γι αυτά χρησιμοποιείται καταχρηστικά και εσφαλμένα. Έτσι, χρησιμοποιείται πια ο όρος δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) που περιλαμβάνει τα πρωτογενή δραστικά παράγωγα του οξυγόνου αλλά και όλα εκείνα (ρίζες ή μη), τα οποία προκύπτουν δευτερογενώς κατά τις διάφορες χημικές αλληλεπιδράσεις με τα στοιχεία του κυτταρικού περιβάλλοντος (π.χ. ελεύθερες υπεροξυλ-ρίζες R-C-O-O και αλκοξυλ-ρίζες R-C-O, ενδιάμεσα προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων). Εκτός από τις ROS πολύ σημαντικές στο οξειδωτικό στρες είναι και οι δραστικές μορφές (ρίζες ή μη) άλλων χημικών στοιχείων και μορίων, που διακρίνονται ανάλογα με την προέλευσή τους σε α) εκείνες που ενυπάρχουν στο κυτταρικό περιβάλλον και β) σε εκείνες που σχηματίζονται από τη δράση των ROS επί των διαφόρων κυτταρικών συστατικών. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα ιόντα Fe, Cu και άλλων μετάλλων μετάπτωσης (που καταλύουν αντιδράσεις του οξειδωτικού stress και προάγουν οξειδωτικές βλάβες στο κύτταρο), τα ιόντα Cl και το ΝΟ (που παράγεται από την L-αργινίνη με τη δράση του ενζύμου συνθετάση του ΝΟ και έχει οξειδωτική και αντιοξειδωτική δράση). Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι ελεύθερες ρίζες θείου RS (προϊόντα της οξειδωτικής βλάβης ή αντιοξειδωτικής δράσης διαφόρων θειολών), ελεύθερες ρίζες άνθρακα R-C (ενδιάμεσα προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων), ο περοξυνιτρίτης ΟΝΟΟ - (προϊόν της αντίδρασης O2 και ΝΟ ), το υποχλωριώδες οξύ HOCl (προϊόν της αντίδρασης H 2 O 2 και Cl - ) κ.α. 10

1.3. Οι συνέπειες του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα Το οξειδωτικό στρες, δηλαδή η αύξηση των δραστικών μορφών οξυγόνου και των ελευθέρων ριζών σε βάρος των αντιοξειδωτών, είναι υπεύθυνο για την πρόκληση πληθώρας βλαβών στα κύτταρα, προκαλώντας αλλαγές στα βιο(μακρο)μόρια του κυττάρου. Η ρίζα ΟΗ είναι η πιο δραστική ελεύθερη ρίζα οξυγόνου και αποτελεί έναν εξαιρετικά ισχυρό οξειδωτικό παράγοντα που αντιδρά σχεδόν ακαριαία με οποιοδήποτε τύπο βιομορίου τυγχάνει να βρίσκεται πλησίον της θέσης σχηματισμού της. Ένα από τα σημαντικά συστατικά του κυττάρου είναι τα νουκλεϊκά οξέα (DNA και RNA), που μπορεί να υποστούν αλλαγές στις βάσεις (π.χ. προσθήκη του ΟΗ, απαμινώσεις, απομάκρυνση του Η) αλλά και στα σάκχαρα ή ακόμα και δημιουργία σπασιμάτων και DNA-protein cross links. Εκτός από τα νουκλεϊκά οξέα, συνήθεις είναι και οι βλάβες στις πρωτεΐνες, όπως η δημιουργία υπεροξειδίων στον πεπτιδικό κορμό ή στις πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων, η οξείδωση ομάδων του S, τα πρωτεϊνικά καρβονύλια, και οι απαμινώσεις, που επιφέρουν αλλαγές στη δομή και την λειτουργία των πρωτεϊνών. Τέλος, τα λιπιδικά συστατικά των κυττάρων είναι από τους πλέον σημαντικούς στόχους των δραστικών μορφών οξυγόνου. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων και κυρίως των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) περιλαμβάνει δύο στάδια: 1. Το στάδιο έναρξης (initiation) που αρχίζει όταν κάποιο μόριο ROS υψηλής δραστικότητας (π.χ. ΟΗ ) αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από μια ομάδα μεθυλενίου (CH 2 ) (Parsons 2000), με περισσότερο ευάλωτες τις θέσεις της ανθρακικής αλυσίδας που γειτονεύουν με διπλό δεσμό (γιατί εξασθενεί το δεσμό C H των μεθυλενικών ομάδων): CH=CH CH 2 CH=CH + ΟΗ CH=CH C H CH=CH + Η 2 Ο Έτσι δημιουργείται μιας ελεύθερης ρίζας άνθρακα (carbon-centered radical) με ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, που επειδή η παραπάνω διάταξη είναι ασταθής, συνήθως υφίσταται μια ενδομοριακή αναδιάταξη και μεταπίπτει σε συζυγές διένιο (αλληλουχία διπλού - μονού - διπλού δεσμού, προκύπτοντας δύο ισομερή συζυγή διένια): CH=CH C H CH=CH C H CH=CH CH=CH ή CH=CH CH=CH C H 2. Το στάδιο διάδοσης (propagation stage) στο οποίο η ρίζα άνθρακα που σχηματίζεται (R ) συνδυάζεται με ένα μόριο Ο 2 (που αντιδρά εύκολα με ελεύθερες 11

ρίζες και συσσωρεύεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο εσωτερικό των μεμβρανών λόγω της υδροφοβικότητάς του) και δημιουργείται μία υπεροξυλ-ρίζα: R + Ο 2 R O O (peroxyl radical) Η ελεύθερη υπεροξυλ-ρίζα είναι πολύ δραστική και μπορεί να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από κάποιο γειτονικό μόριο PUFA, μετατρεπόμενη στο αντίστοιχο υδροϋπεροξείδιο (R O O H): R O O + CH 2 R O O H + C H Πρόκειται για μία αντίδραση που οδηγεί στον σχηματισμό μιας νέας ελεύθερης ρίζας άνθρακα, η οποία μπορεί να αντιδράσει με Ο 2 και να δώσει εκ νέου ρίζα περοξυλίου, που με τη σειρά της μπορεί να αποσπάσει ένα υδρογόνο από άλλο μόριο PUFA κ.ο.κ., συνεχίζοντας έτσι την αλυσίδα αντιδράσεων που ξεκίνησε από την προσβολή ενός αρχικού μορίου PUFA από ΟΗ. Αυτή η συνεχώς ανατροφοδοτούμενη αλυσιδωτή αντίδραση μπορεί να διακοπεί με τους εξής τρόπους: α) με επίθεση της ρίζας υπεροξυλίου σε γειτονικό διπλό δεσμό της ίδιας ανθρακικής αλυσίδας, οπότε σχηματίζεται κυκλικό ενδοϋπεροξείδιο. Αυτό το κυκλικό ενδοϋπεροξείδιο είναι ελεύθερη ρίζα και μπορεί να αποσπάσει υδρογόνο από άλλο PUFA, συνεχίζοντας την αλυσίδα αντιδράσεων, αλλά συνήθως μετατρέπεται σε διάφορα τελικά προϊόντα όπως malonyldialdehyde (MDA) ισοπροστάνες κ.α., β) με οξειδωτική επίθεση των ριζών C H ή R O O σε άλλα μεμβρανικά συστατικά (στερόλες και πρωτεΐνες), γ) με αλληλεξουδετέρωση δύο ριζών C H ή δύο ριζών R O O. Στην πρώτη περίπτωση σχηματίζεται πλευρική διασύνδεση δύο αλυσίδων λιπαρών οξέων, ενώ στη δεύτερη απελευθερώνεται μονήρες οξυγόνο: και δ) με αναγωγή της ρίζας R O O από κατάλληλο αντιοξειδωτή (chain-breaking antioxidant), όπως π.χ. η βιταμίνη Ε, το butyl hydroxyltoluene (ΒΗΤ), το butyl hydroxylanisole (ΒΗΑ) κ.α. Εικόνα 2. Οι κύριες μορφές οξειδωτικής επίθεσης που δέχεται ένα κύτταρο. 12

1.4. Aντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών Οι αερόβιοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει αρκετούς αμυντικούς μηχανισμούς ώστε να μπορούν να επιβιώσουν σε έντονα οξειδωτικές συνθήκες. Είναι σημαντικό ότι κατορθώνουν να διατηρούν την ενδοκυτταρική συγκέντρωση του Ο 2 σε επίπεδα χαμηλότερα από της ατμόσφαιρας (21%) καθώς και την ικανότητα αποτελεσματικής λειτουργίας της αναπνευστικής αλυσίδας σε αυτά τα χαμηλά επίπεδα Ο 2. Το οξειδωτικό φορτίο (ROS και προϊόντα δράσης τους) που δημιουργείται σε αυτές τις συνθήκες αντιμετωπίζεται από την αντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών που συνίσταται σε ένα πολύπλοκο σύστημα με συνεργητικά δρώντα επιμέρους στοιχεία ως ακολούθως: Αντιοξειδωτές χαρακτηρίζονται οι ουσίες που συμμετέχουν στους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς (με ενδογενή ή εξωγενή προέλευση) και μπορούν να καθυστερούν την οξείδωση των μορίων. Η αντιοξειδωτική άμυνα του κυττάρου εκδηλώνεται σε τρία βασικά επίπεδα (γραμμές άμυνας) (Halliwell 1995): α) ο περιορισμός της διαθεσιμότητας των μετάλλων μετάπτωσης και άλλων ουσιών με προ-οξειδωτική δράση (προάγουν την οξειδωτική καταστροφή των βιομορίων από ROS ή άλλα προϊόντα του οξειδωτικού στρες), και εδώ συμμετέχουν πρωτεΐνες που δεσμεύουν μέταλλα μετάπτωσης (μεταλλοπρωτεΐνες) και συνεπώς μειώνουν τη διαθεσιμότητά τους (τρασφερρίνη, φερριτίνη και σερουλοπλασμίνη κ.λπ.). β) η εκκαθάριση των ROS και άλλων δραστικών μορίων πριν πλήξουν τα βιομόρια, που επιτυγχάνεται με ένζυμα με αντιοξειδωτική δράση (δισμουτάσες της ρίζας σουπεροξειδίου, καταλάσες και υπεροξειδάσες), και με οργανικές ενώσεις μικρού συνήθως μοριακού βάρους που δρουν ως εκκαθαριστές ελεύθερων ριζών (free radical scavengers) και δραστικών μορίων όπως γλουταθειόνη, χολερυθρίνη, λιποϊκό οξύ, ουρικό οξύ, ουμπικινόνη, μελανίνες, ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), τοκοφερόλες και τοκοτριενόλες, καροτενοειδή, ΒΗΤ και ΒΗΑ. γ) η επιδιόρθωση των πληγέντων μορίων και αποκατάσταση των βλαβών που αφορά μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA (DNA γλυκοζυλάσες), αναγωγής οξειδωμένων σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών και την επιδιόρθωση των λιπιδικών υπεροξειδίων. Χωρίς αυτούς τους μηχανισμούς οι οργανισμοί θα συσσώρευαν οξειδωτικές βλάβες σε βαθμό τέτοιο που δεν θα επέτρεπε την επιβίωσή τους (Liu 2000, Nordberg 2001). 13

2. Βιοχημεία της ρίζας του σουπεροξειδίου Το 85-90% του Ο 2 που προσλαμβάνεται από τα κύτταρα καταναλώνεται στο μιτοχόνδριο ως δέκτης των ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας (Lehninger 1975). Η μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, η καρδιά του αερόβιου μεταβολισμού, αποτελεί μια αποτελεσματική βιοχημική λειτουργική μονάδα, εξελικτικά τελειοποιημένη ώστε το 97-99% του Ο 2 που υπό φυσιολογικές συνθήκες διαχειρίζεται το μιτοχόνδριο να υφίσταται πλήρη αναγωγή στην εντελώς ακίνδυνη μορφή του Η 2 Ο. Το εντυπωσιακό αυτό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται χάρη στη συνολική δομή και οργάνωση των ενζυμικών συμπλόκων της αλυσίδας, που διασφαλίζει την διοχέτευση των εισερχόμενων ηλεκτρονίων προς την κυτοχρωμική οξειδάση αλλά και εξαιτίας του σχεδόν αλάνθαστου μηχανισμού δράσης της κυτοχρωμικής οξειδάσης, η οποία καταλύει την σταδιακή αναγωγή του Ο 2 σχεδόν χωρίς καμία διαφυγή μερικώς ανηγμένων δραστικών μορφών Ο 2 (ROS) από το ενεργό της κέντρο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Όμως ακόμη και υπό τις πλέον ιδανικές συνθήκες (φυσιολογική συγκέντρωση οξυγόνου και άψογη λειτουργική κατάσταση αναπνευστικής αλυσίδας), το 1-3% του Ο 2 (αυξάνεται σε υψηλό επίπεδο όταν δυσλειτουργεί η αλυσίδα ή ανέλθει το επίπεδο Ο 2 πάνω από το φυσιολογικό) ανάγεται μερικώς προς ελεύθερη ρίζα σουπεροξειδίου (O 2 ). Η αναγωγή αυτή δεν είναι ενζυμική αλλά οφείλεται σε διαρροή ηλεκτρονίων προς μόρια Ο 2 από αρχικά τμήματα της αναπνευστικής αλυσίδας. Κύρια σημεία διαρροής φαίνεται να είναι το σύμπλοκο Ι, η ημιανηγμένη μορφή (ημικινόνη) του συνενζύμου Q και το κυτόχρωμα b του συμπλόκου ΙΙΙ. Σε ελεύθερη ρίζα O 2 μετατρέπεται και ένα μέρος από το υπόλοιπο 10-15% του O 2 που καταναλώνεται σε άλλες περιοχές του κυττάρου πλην των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, κυτταροπλασματικές πηγές O 2 είναι α) η δράση διαφόρων ενζύμων που χρησιμοποιούν το O 2 ως υπόστρωμα για την οξείδωση διαφόρων βιολογικών μορίων (οξειδάσες, οξυγενάσες και υδροξυλάσες, π.χ. οξειδάση της ξανθίνης, υδροξυλάση της τυροσίνης, λιποξυγενάση κ.α.), και β) η αυτοοξείδωση (δηλαδή απευθείας οξείδωση από το μοριακό O 2 ) διαφόρων βιομορίων (π.χ. γλυκεραλδεϋδη, FADH 2, FMNH 2, NADH κ.α.). Η αυτοοξείδωση είναι κανονικά αμελητέα αλλά επιταχύνεται σημαντικά από την παρουσία μετάλλων μετάπτωσης ως καταλυτών (π.χ. Fe 2+ και Cu + ). Τέλος, σημαντική πρωτογενής πηγή O 2 είναι το ενδοπλασματικό δίκτυο λόγω της δράσης των κυτοχρωμάτων Ρ450, ενζυμικών συμπλόκων που 14

χρησιμοποιούν το O 2 για χημικές τροποποιήσεις (συνήθως υδροξυλίωση) και αποτοξικοποίηση πληθώρας υποστρωμάτων. Το παραγόμενο O 2 δεν μπορεί λόγω της ιοντικής του φύσης να εισχωρήσει στο ανιονικό περιβάλλον των λιπιδικών μεμβρανών και να τις διασχίσει, γι αυτό και παραμένει εγκλωβισμένο στο κυτταρικό διαμέρισμα (μιτοχόνδριο, κυτταρόπλασμα ή ενδοπλασματικό δίκτυο) στο οποίο σχηματίζεται. Στην συνέχεια θα δούμε την τύχη του παραγόμενου O 2 και την συμμετοχή του σε διάφορα είδη κυτταροτοξικών επιδράσεις. Στο εργαστήριο για το O 2 υπάρχουν μέθοδοι παραγωγής του όπως: α) η ηλεκτροχημική αναγωγή του Ο 2 σε κατάλληλη ηλεκτρολυτική διάταξη παρουσία ενός οργανικού διαλύτη όπως το ακετονιτρίλιο, β) η διάλυση του tetramethylammonium superoxide σαν ιοντικό συστατικό (CH 3 ) 4 N + O - 2, γ) η καύση μεταλλικού Καλίου σε οξυγόνο για δημιουργία ιοντικού potassium superoxide (Κ + O - 2 ), δ) με pulse radiolysis και ανίχνευσή του από το UV φάσμα απορρόφησης, ε) με αποσύνθεση ορισμένων αζω-συστατικών (azo compounds) και στ) με ενζυμικές και φωτοχημικές αντιδράσεις όπως το σύστημα ξανθίνης και οξειδάσης της ξανθίνης. 2.1. Μηχανισμοί πρόκλησης βλαβών από το O 2 Γενικά το O 2 σε υδατικό διάλυμα και φυσιολογικό ph ( 7,4) δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό με μόρια που δεν είναι ελεύθερες ρίζες και έτσι η ταχύτητα αντίδρασής του με το DNA, τα λιπίδια, τα αμινοξέα και άλλους μεταβολίτες είναι πρακτικά αμελητέα λόγω της ταχύτατης αυτοοξειδωαναγωγής του σε Η 2 Ο 2 και Ο 2. Συνεπώς, οι άμεσες τοξικές επιδράσεις του O 2 είναι εξειδικευμένες και αφορούν κυρίως έναν αριθμό συγκεκριμένων ενζυμικών στόχων. Ορισμένα από τα ένζυμα που πλήττονται άμεσα από το O 2 είναι η ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση (ένζυμο κλειδί στη βιοσύνθεση των δομικών λίθων του DNA), η αφυδρογονάση του NADH (σύμπλοκο Ι της αναπνευστικής αλυσίδας) και κυρίως σιδηροθειούχα ένζυμα με σύμπλοκα σιδήρουθείου [xfe-xs] στα ενεργά κέντρα τους, τα οποία μετά την προσβολή από το O 2, οξειδώνονται και αποικοδομούνται, απελευθερώνοντας τον περιεχόμενο Fe (π.χ. τα ένζυμα του Κύκλου του Krebs ακονιτάση και φουμαράση και άλλες αφυδρατάσες). Πέραν αυτών, το O 2 μπορεί να προκαλεί επιπλέον απελευθέρωση Fe από την φερριτίνη, ενώ μειώνει και τη δραστικότητα σημαντικών αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως η καταλάση (Aronoff 1965, Sumner 1955) και ορισμένες υπεροξειδάσες. 15

Η δραστικότητα του O 2 σε υδατικό διάλυμα αυξάνεται έντονα κατόπιν πρωτονίωσής του (O 2 + Η + ΗO 2 ). Η πρωτονιωμένη μορφή ΗO 2 καλείται υδροϋπεροξειδική ρίζα (hydroperoxyl radical) και μπορεί να διασχίζει τις βιολογικές μεμβράνες πιο εύκολα λόγω της έλλειψης φορτίου και είναι πολύ ισχυρότερος οξειδωτικός και αναγωγικός παράγοντας από το O 2 (π.χ. προσβάλλει τα λιπίδια και ξεκινά την υπεροξείδωσή τους). Αν και μόλις 1% των μορίων O 2 είναι πρωτονιωμένα σε φυσιολογικό ph, το γεγονός ότι στην επιφάνεια των μεμβρανών (όπου σχηματίζεται και το μεγαλύτερο μέρος του O 2 μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας) το περιβάλλον είναι συνήθως πιο όξινο, αυτό πιθανώς καθιστά την πρωτονίωση του O 2 σημαντικό παράγοντα ενίσχυσης των άμεσων τοξικών επιδράσεων του σουπεροξειδίου, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις δυσλειτουργίας της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου. Επειδή το O 2 έχει χαμηλή δραστικότητα μετατρέπεται γρήγορα σε άλλες ROS, έτσι η κυτταροτοξική επίδραση του O 2 εκδηλώνεται κυρίως έμμεσα, δηλαδή με την παραγωγή από αυτό άλλων περισσότερο δραστικών μορίων που πλήττουν άμεσα και ισχυρά τα πλησιέστερα σε αυτά βιομόρια. Η βιομετατροπή του O 2 σε δραστικότερες μορφές μπορεί να γίνει με δύο εναλλακτικούς μηχανισμούς, που δεν έχουν την ίδια βαρύτητα. Ο κυριότερος είναι ενζυμικός και καταλήγει στην παραγωγή ελεύθερης ρίζας υδροξυλίου (ΟΗ ) ως δραστικού μορίου, με ενδιάμεσο στάδιο τον σχηματισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου Η 2 Ο 2. Ο εναλλακτικός μηχανισμός είναι μη ενζυμικός και οδηγεί στο σχηματισμό υπεροξυνιτρίτη (ΟΝΟΟ - ) ως δραστικού μορίου. 2.1.1. Η κύρια οδός βιομετατροπής του O 2 Το περισσότερο από το παραγόμενο O 2 μετατρέπεται γρήγορα σε Η 2 Ο 2 με την παρακάτω αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής (dismutation) (αντιδράσεις αυτοοξειδοαναγωγής είναι οι οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις κατά τις οποίες μια χημική ένωση δρα τόσο οξειδωτικά όσο και αναγωγικά): O 2 + O 2 + 2Η + Η 2 Ο 2 + Ο 2. Σύμφωνα με την προηγούμενη εξίσωση, τα μισά μόρια O 2 που συμμετέχουν στην αντίδραση ανάγονται σε Η 2 Ο 2, ενώ τα υπόλοιπα μισά οξειδώνονται σε Ο 2 βασικής κατάστασης. Έτσι, με αυτή την πορεία βιομετατροπής του O 2 ο συνολικός αριθμός μορίων ROS μειώνεται στο μισό. 16

Απουσία κατάλληλου ενζύμου, ο ρυθμός δισμουτοποίησης του O 2 σε υδατικό διάλυμα εξαρτάται από το ph, ξεκινώντας από σχεδόν μηδέν σε ουδέτερο ph και αυξανόμενος όσο πιο όξινο γίνεται το διάλυμα. Στα βιολογικά συστήματα η δισμουτοποίηση του O 2 είναι εξαιρετικά γρήγορη παρά το σχεδόν ουδέτερο ph ( 7,4) λόγω της αποτελεσματικής κατάλυσής της από ειδικά ένζυμα, τις δισμουτάσες του σουπεροξειδίου (SuperOxide Dismoutases, SODs) (Marklund 1976, Misra 1977). Ανάλογα με τα μεταλλικά ιόντα που φέρουν στο ενεργό τους κέντρο, οι δισμουτάσες διακρίνονται σε CuZnSODs (με το Cu μόνο να παίρνει μέρος στον καταλυτικό μηχανισμό) και MnSODs (μια τρίτη κατηγορία, οι FeSODs, η οποία απαντά μόνο στα βακτήρια). Η CuZnSOD είναι κυτταροπλασματική κυρίως αλλά σε μικρότερες ποσότητες απαντά και στον πυρήνα, τα λυσοσώματα και τα υπεροξειδιοσώματα, ενώ η MnSOD εντοπίζεται αποκλειστικά στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων και αναλαμβάνει το μεγαλύτερο φορτίο της εκκαθάρισης του O 2 που διαρρέει από την αναπνευστική αλυσίδα. Η δράση των δισμουτασών επί του παραγόμενου O 2 οδηγεί στον σχηματισμό μιας σημαντικής ποσότητας Η 2 Ο 2, η οποία συμπληρώνεται από το Η 2 Ο 2 που παράγεται κατά την ενζυμική δράση διαφόρων οξειδασών και άλλων ενζύμων των υπεροξειδιοσωμάτων. Σε αντίθεση με το O 2, το Η 2 Ο 2 μπορεί να διαπερνά τις βιολογικές μεμβράνες και ως εκ τούτου διαχέεται ελεύθερα μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών διαμερισμάτων. Γενικά είναι ασθενής οξειδωτικός και αναγωγικός παράγοντας αλλά δεν εμφανίζει δραστικότητα με τα περισσότερα βιομόρια. Έτσι, οι άμεσες επιδράσεις του περιορίζονται στην απενεργοποίηση ορισμένων ενζύμων (π.χ. της 3-φωσφορικής γλυκεριναλδεϋδης, βασικό ενζύμου της γλυκόλυσης) μέσω της οξείδωσης καίριων θειολικών ομάδων (-SH) του ενεργού τους κέντρου, στην οξείδωση ορισμένων κετοξέων (π.χ. του πυροσταφυλικού) και στην απελευθέρωση Fe από διάφορες αιμοπρωτεΐνες. Το Η 2 Ο 2 υστερεί σε δραστικότητα ως προς το O 2 αλλά είναι ένα κομβικό μόριο στη διαδικασία πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών, αφού υπό κατάλληλες συνθήκες (και αν δεν εκκαθαριστεί εγκαίρως από την αντιοξειδωτική άμυνα) μπορεί να δημιουργήσει την ελεύθερη ρίζα ΟΗ, το πλέον δραστικό και επικίνδυνο για την ακεραιότητα των βιομορίων είδος ROS. Το απαραίτητο ηλεκτρόνιο για την μονοσθενή αναγωγή του Η 2 Ο 2 σε ΟΗ προέρχεται από κάποιο μέταλλο μετάπτωσης, 17

συνήθως Fe ή Cu. H μεταλλοεξαρτώμενη αναγωγή του Η 2 Ο 2 ονομάζεται αντίδραση Fenton και περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: Η 2 Ο 2 + Μe OH + OH - + Me +1, όπου Me = Fe 2+ ή Cu + Επειδή η διαθεσιμότητα μετάλλων μετάπτωσης βρίσκεται υπό αυστηρό έλεγχο και διατηρείται φυσιολογικά σε πολύ χαμηλά επίπεδα, απαραίτητη προϋπόθεση για τη λειτουργία του μηχανισμού αυτού παραγωγής ΟΗ είναι η ανακύκλωση των ιόντων Fe ή Cu από την οξειδωμένη (Me +1 ) στην ανηγμένη τους μορφή (Me). Ο ρόλος αυτός αρχικά αποδόθηκε στη ρίζα O 2 και έτσι η συνολική αντίδραση είναι: Η 2 Ο 2 + Μe OH + OH - + Me +1 (αντίδραση Fenton) Me +1 + O 2 Μe + Ο 2 Net : Η 2 Ο 2 + O 2 OH + OH - + Ο 2 (αντίδραση Haber-Weiss) Η αντίδραση αυτή ερμηνεύει διάφορα πειραματικά αποτελέσματα που έδειχναν σαφή εξάρτηση της in vivo παραγωγής ΟΗ από Η 2 Ο 2 από τα επίπεδα O 2. Τα κύτταρα όμως διαθέτουν μια πληθώρα εξίσου ισχυρών ή ισχυρότερων ακόμα αναγωγικών παραγόντων (π.χ. GSH, NAD(P)H, κυστεΐνη, ασκορβικό οξύ) που βρίσκονται σε εξαιρετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις από το O 2, με αποτέλεσμα η αναγωγή των μετάλλων μετάπτωσης από το O 2 να είναι στην πραγματικότητα τελείως απίθανη. Μια ερμηνεία εξάγεται από το ότι το O 2 μπορεί να προκαλεί απελευθέρωση Fe από την φερριτίνη και διάφορα ένζυμα. Δηλαδή, τα αυξημένα επίπεδα O 2 δημιουργούν τις κατάλληλες συνθήκες (αυξημένη διαθεσιμότητα Fe) για την αναγωγή του Η 2 Ο 2 σε ΟΗ. Επιπλέον, όταν τα κύτταρα εκτεθούν σε υπεριώδη ακτινοβολία, σχηματίζεται ΟΗ ανεξάρτητα από τη διαθεσιμότητα των μετάλλων, με απευθείας ομόλυση του Η 2 Ο 2 : 2Η 2 Ο 2 2 OH Έχει βρεθεί ότι η CuZnSOD (αλλά όχι και η MnSOD) μπορεί να ανασταλεί από το Η 2 Ο 2 που παράγεται κατά την αντίδραση δισμουτοποίησης και κατά την αναστολή αυτή απελευθερώνονται ελεύθερες ρίζες ΟΗ. Ο τρόπος αυτός σχηματισμού ΟΗ είναι ανεξάρτητος από την παρουσία μετάλλων μετάπτωσης, αλλά δεν είναι ακόμα γνωστό αν συνεισφέρει σημαντικά στη συνολική ποσότητα του παραγόμενου ΟΗ. Η 18

ρίζα ΟΗ προκαλεί στη συνέχεια την λιπιδική υπεροξείδωση όπως περιγράφτηκε προηγουμένως και χρησιμοποιείται συχνά ως δείκτης οξειδωτικού στρες για την αξιολόγηση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων (De Zwart 1999, Kaschnitz 1975, Nowak 2001). 2.1.2. Η εναλλακτική οδός βιομετατροπής του O 2 Όπως προαναφέρθηκε η αποτελεσματική κατάλυση από το σύστημα των δισμουτασών μετατρέπει το μεγαλύτερο ποσοστό των ριζών O 2 σε Η 2 Ο 2. Ένα από τα λίγα κυτταρικά προϊόντα που, λόγω του ότι είναι και το ίδιο ελεύθερη ρίζα, μπορεί να αντιδράσει με το O 2 με ρυθμούς παραπλήσιους με εκείνους της αντίδρασης με τις SOD, είναι το μονοξείδιο του αζώτου ΝΟ. Η αντίδραση ΝΟ και O 2 μπορεί επομένως να ανταγωνιστεί την αντίδραση δισμουτοποίησης του O 2 και οδηγεί στο σχηματισμό υπεροξυνιτρίτη ΟΝΟΟ -, ενός ισχυρού οξειδωτικού και κυτταροτοξικού παράγοντα, του οποίου η δραστικότητα συγκρίνεται με εκείνη της ρίζας ΟΗ : ΝΟ + O 2 ΟΝΟΟ - In vivo, αυτή η εναλλακτική πορεία μετατροπής του O 2 σε πιο δραστικές μορφές εξαρτάται από τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΝΟ, το οποίο συντίθεται κατά τη μετατροπή του αμινοξέος L-αργινίνη σε L-κιτρουλίνη από το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (Nitric Oxide Synthase, NOS): L-arginine + O 2 + NADPH L-citrulline + NO + NADP + Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις, το ΝΟ λειτουργεί πρωτίστως ως ενδοκυττάριος μηνυματοδότης (μέσω της γουανιλικής κυκλάσης και πρωτεϊνικών κινασών), ενώ διασχίζοντας τις κυτταρικές μεμβράνες συμμετέχει και στην διακυτταρική μεταγωγή σημάτων. Η παραγωγή του ΝΟ σε μεγαλύτερες ποσότητες προκαλεί την οξειδωτική του δράση, η οποία εκδηλώνεται κυρίως με την αντίδρασή του με το O 2 και τον σχηματισμό του υπεροξυνιτρίτη. Παρόλα αυτά σε χαμηλές ποσότητες μπορεί να δρα και αντιοξειδωτικά, αντιδρώντας με ποικίλες δραστικές ελεύθερες ρίζες (π.χ. ρίζες αλκοξυλίου και υπεροξυλίου) και μετατρέποντάς τις σε πιο αδρανείς μορφές. Καθοριστικός παράγοντας φαίνεται να είναι ο λόγος ΝΟ / O 2, αφού σε υψηλές τιμές του οποίου (μέχρι ενός ορίου βέβαια) η αντιοξειδωτική δράση του NO δείχνει να υπερτερεί. 19

3. Ίκτερος και οξειδωτικό στρες 3.1. Η πάθηση του ίκτερου Ο ίκτερος είναι μια κατάσταση που προκαλείται όταν υπερβολικά ποσά χολερυθρίνης (bilirubin) που κυκλοφορούν στο αίμα διαλύονται στο υποδόριο λίπος (τη στιβάδα λίπους κάτω ακριβώς από το δέρμα), προκαλώντας το κίτρινο χρώμα στο δέρμα και το λευκό στα μάτια. Στις περισσότερες περιπτώσεις η πάθηση συνοδεύεται από ηπατική βλάβη ή ανεπάρκεια της μεταφοράς της χολερυθρίνης μέσω της χοληφόρου οδού στο έντερο. Η χολερυθρίνη προκύπτει από την αποικοδόμηση της αιμοσφαιρίνης κατά το θάνατο των ερυθροκυττάρων. Η χολερυθρίνη μεταφέρεται με την κυκλοφορία του αίματος στο συκώτι και τελικά καταλήγει στη χολή και της προσδίδει το κίτρινο-πράσινο χρώμα. Το συκώτι παράγει φυσιολογικά περίπου 1 λίτρο χολής κάθε μέρα, που εκκρίνεται στον χοληφόρο αγωγό και αποθηκεύεται στην χοληδόχο κύστη. Η χολή απελευθερώνεται στο λεπτό έντερο μέσω του χοληφόρου πόρου, για να βοηθήσει στην πέψη των λιπών. Υπάρχουν διάφορες μορφές ικτέρου. Ο αιμολυτικός (ή προηπατικός) ίκτερος, προκύπτει από την γρήγορη αποικοδόμηση των ερυθροκυττάρων (αιμόλυση) που οδηγεί στην υπερπαραγωγή χολερυθρίνης. Αυτό μπορεί να συμβεί εξαιτίας ελονοσίας, δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, σηψαιμίας ή δηλητηρίασης του αίματος. Ο ηπατοκυτταρικός ίκτερος προκαλείται όταν το συκώτι υφίσταται βλάβη και εξασθενεί η ικανότητά του να απομακρύνει την χολερυθρίνη από το αίμα. Είναι συχνή κατάσταση σε περιπτώσεις ηπατίτιδας, κίρρωσης του ήπατος και ηπατικών καρκίνων αλλά ακόμα και του αλκοολισμού, ενώ ανιχνεύεται η χολερυθρίνη στα ούρα. Ο φυσιολογικός ίκτερος των νεογνών εμφανίζεται σε νεογέννητα μωρά που έχουν αυξημένη χολερυθρίνη στο αίμα και εξαφανίζεται μέσα σε λίγες μέρες καθώς αναπτύσσεται το συκώτι και η ικανότητα να διαχειρίζεται την χολερυθρίνη. Ο αποφρακτικός ίκτερος (obstructive jaundice ή μηχανικός ίκτερος, mechanical jaundice ή μεταηπατικός ίκτερος) προκαλείται από την απόφραξη (σε οποιοδήποτε σημείο) της ροής της χολής προς τον δωδεκαδάκτυλο και είναι είτε ενδο- είτε εξω-ηπατικός. Μπορεί να προκύψει από χολόλιθους, τραύματα, όγκους ή φλεγμονές που επηρεάζουν τον χοληφόρο πόρο. Σε σπανιότερες περιπτώσεις η αιτία είναι παράσιτα (π.χ. σκώληκες), ουλές από προηγούμενες εγχειρίσεις και ανωμαλίες στην κατασκευή των χολικών αγωγών. Ο ίκτερος δεν είναι από μόνος του μία ασθένεια, αλλά ένα σύμπτωμα διαφόρων παθήσεων που επηρεάζουν το συκώτι, το αίμα, τη χοληδόχο κύστη και την χολή. 20

Μπορεί να συνοδεύεται και από άλλα συμπτώματα, όπως σκούρο καφέ χρώμα στα ούρα εξαιτίας της παρουσία της χολερυθρίνης σε αυτά. Ως εκ τούτου για την διάγνωσή του γίνονται έλεγχοι τόσο στο αίμα και στα ούρα όσο και βιοψίες στο συκώτι για να ανιχνευτεί η θέση της βλάβης. Επιπλέον μπορεί να χρειαστούν και υπέρηχοι για την εύρεση χολόλιθων που μπορεί να προκαλούν απόφραξη. 3.2. Αποφρακτικός ίκτερος και οξειδωτικό στρες Ο αποφρακτικός ίκτερος οδηγεί σε ανεπάρκεια του εντερικού φραγμού με επικείμενη συστημική ενδοτοξαιμία (systemic endotoxemia) σχετιζόμενη με σηπτικές επιπλοκές. Ένας πιθανός παράγοντας γι αυτή την κατάσταση είναι το οξειδωτικό στρες που είναι γνωστό πως έχει διαπιστωθεί ως αυξημένα επίπεδα οξειδωμένων πρωτεϊνών σε αρουραίους με απόφραξη στο χοληδόχο πόρο (Assimakopoulos 2005b, Chroni 2006). Σχετικά με την οξειδωαναγωγική θειολική κατάσταση αρουραίων με αποφρακτικό ίκτερο, έχει βρεθεί αυξημένη η οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης (GSSG) και οι πρωτεϊνικές και μη πρωτεϊνικές θειόλες με ταυτόχρονα μειωμένα επίπεδα της αναγμένης γλουταθειόνης (GSH) και των αναγμένων θειολικών ομάδων (Assimakopoulos 2005b, Chroni 2006). 3.3. Η οξειδάση της ξανθίνης Η οξειδάση της ξανθίνης (xanthine oxidase, XO) και η αφυδρογονάση της ξανθίνης (xanthine dehydrogenase ή xanthine reductase, XDH) είναι οι δύο μορφές του ενζύμου οξειδοαναγωγάση της ξανθίνης (xanthine oxidoreductase XOR) (Harrison 2002, Hille 1995). Πρόκειται για μόλυβδο-ένζυμα που περιέχουν φλαβινοπρωτεΐνες και αποτελούνται από δύο πανομοιότυπες μονάδες των 145 kda. Στα θηλαστικά συντίθεται στη μορφή της αφυδρογονάσης αλλά μετατρέπεται άμεσα σε οξειδάση με οξείδωση των θειολικών ομάδων ή με πρωτεόλυση. Η XOR βρίσκεται σε διάφορα όργανα όπως το συκώτι, το έντερο, τους πνεύμονες, τους νεφρούς, την καρδιά, τον εγκέφαλο καθώς και στον ορό του αίματος. Η XO μεταφέρει αναγμένα ισοδύναμα στο οξυγόνο, ενώ η XDH χρησιμοποιεί το NAD ή το οξυγόνο σαν τον τελικό αποδέκτη ηλεκτρονίων και είναι εξίσου ικανές να παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου. Τα φυσιολογικά υποστρώματα είναι η ξανθίνη και η υποξανθίνη που προσδένονται στο οξειδωμένο ένζυμο και δίνουν δύο ηλεκτρόνια στον μολυβδενικό συμπαράγοντα (molybdenum cofactor) τον οποίο ανάγουν από MoVI σε MoIV. Τα υποστρώματα υδροξυλιώνονται από μόρια Η 2 Ο στο 21

μολυβδενικό κέντρο καθώς τα ηλεκτρόνια ταξιδεύουν μέσω δύο σιδηροθειούχων κέντρων στην φλαβινοαδενινοδινουκλεοτιδική ομάδα (flavine adenine dinucleotide, FAD). Η αναγμένη FAD μπορεί να επαναοξειδωθεί δισθενώς από το οξυγόνο και να παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου ή μονοσθενώς σε δύο βήματα και να παράγει δύο ισοδύναμα της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου. Το ένζυμο καταλύει τη μετατροπή της υποξανθίνης σε ξανθίνη και της ξανθίνης σε ουρικό οξύ. Γι αυτό, σε κληρονομικές παθήσεις που υπάρχει έλλειψη του ενζύμου, τα άτομα χαρακτηρίζονται από ξανθινουρία και δυσλειτουργία πολλών οργάνων από υπερβολική συσσώρευση ξανθίνης σε αυτά (Battelli 2001). Σε φυσιολογικές συνθήκες, αυτά τα ένζυμα συμμετέχουν σε πολλές βιοχημικές οδούς όπως η υδροξυλίωση πουρινών, πτερινών, αλειφατικών και αρωματικών αλδεϋδών, συμβάλλοντας στην αποτοξίνωση ή στην ενεργοποίηση ενδογενών ενώσεων και ξενοβιοτικών (Harrison 2004). Η οξειδάση της ξανθίνης έχει δειχθεί ότι συμμετέχει σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως η ισχαιμία (Yokoyama 1990), το αιμορραγικό σοκ, η αθηροσκλήρυνση και η δρεπανοκυτταρική αναιμία, και γι αυτό είναι υπεύθυνη η παραγωγή της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου (Fridovich 1970). Επιπλέον, η παρουσία του ενζύμου έχει βρεθεί σε αυξημένα επίπεδα στον ορό ανθρώπων με βλάβη στο συκώτι (Shamma'a 1973, Stirpe 2002) ή στην έκκριση και μεταφορά της χολής (Martin 2004), καθώς και σε ασθενείς με διαβήτη τύπου Ι καθώς και με βλάβες στο πάγκρεας (Flaishon 2006). Ένας ειδικός αναστολέας της οξειδάσης της ξανθίνης είναι η αλλοπουρινόλη, που οξειδώνεται από την ΧΟ στο δραστικό ασυναγώνιστο αναστολέα οξυπουρινόλη (Pacher 2006). Η αλλοπουρινόλη χρησιμοποιείται ως φάρμακο σε διάφορες παθήσεις και έχει δειχθεί πως μειώνει τους δείκτες οξειδωτικού στρες, σε μοντέλα όπως αυτό του αποφρακτικού ίκτερου (Assimakopoulos 2007, Karageorgos 2006) αλλά και σε μοντέλα αρουραίων για διαβήτη (Jin 2004) και ισχαιμία-επαναιμάτωση (Manning 1984). 22

Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Πειραματικό Υλικό Α. Μοντέλο αποφρακτικού ίκτερου σε αρουραίους Α1. Σχεδιασμός μοντέλων ζώων και χειρουργικές διαδικασίες Χρησιμοποιήθηκαν 10 αρσενικοί λευκοί αρουραίοι Wistar, βάρους από 250 μέχρι 350 g. Τα ζώα στεγάζονταν σε κλουβιά από ανοξείδωτο ατσάλι (2 σε κάθε κλουβί) υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, με 12ωρο κύκλο φωτός/σκότους, και διατηρούνταν σε μία πρότυπη εργαστηριακή δίαιτα με παροχή νερού βρύσης ad libitum καθ όλη την διάρκεια του πειράματος, εκτός από μία ολονύχτια νηστεία το βράδυ πριν την εγχείριση. Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες, ομάδα Ι (n=5), τα sham εγχειρισμένα (sham operated) και ομάδα ΙΙ (n=5), αυτά που τους φράχτηκε ο χοληφόρος πόρος (bile duct ligated ή BDL). Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες έγιναν την ίδια ημέρα, κάτω από αυστηρά αποστειρωμένες συνθήκες με αναισθησία μέσω αιθέρα. Τα άτομα από τις δύο ομάδες υπέστησαν λαπαροτομία την ημέρα 0, κατά την οποία ο γαστροδωδεκαδακτυλικός σύνδεσμος απομονώθηκε και ακινητοποιήθηκε ο χοληφόρος πόρος. Στα ζώα της ομάδας ΙΙ, ο χοληφόρος πόρος φράχτηκε διπλά με μία μεταξένια κατασκευή και κόπηκε εγκάρσια ανάμεσα στις περιδέσεις. Η κοιλιακή τομή έκλεισε σε δύο επίπεδα, με πολυγλυκολικό οξύ και νάυλον δομές. Την ημέρα 10, σε όλα τα ζώα έγινε ενδοπεριτοναϊκή ένεση με διάλυμα 1 ml υδροαιθιδίου (HE) που είναι η ουσία της in vivo παγίδευσης της ρίζας του σουπεροξειδίου. Η ένεση έγινε στο κατώτερο τεταρτημόριο της κοιλίας υπό ελαφρά αναισθησία. Ύστερα από 75 λεπτά όλα τα ζώα θυσιάστηκαν την ίδια ημέρα με αφαίμαξη (exsanguinations) και αποκεφαλισμό. Ο εγκέφαλος απομονώθηκε γρήγορα και χωρίστηκε σε εγκεφαλικό φλοιό, μεσεγκέφαλο και παρεγκεφαλίδα, ενώ απομονώθηκαν και το συκώτι, το έντερο, η καρδιά και οι νεφροί για περαιτέρω ανάλυση. Για την παρασκευή του 1 ml διαλύματος HE (σε 40% DMSO), χρησιμοποιήθηκαν 8.5 mg HE/Kg βάρους που αρχικά διαλύθηκε σε 0.4 ml 100% DMSO και κατόπιν αραιώθηκε στο 1 ml σε 40% DMSO προσθέτοντας στάγδην 0.6 ml νερό υπό συνεχή ανάδευση για την αποφυγή θολούρας. Η χρησιμοποιηθείσα δόση του HE είναι σε περίσσεια, ώστε να μπορεί επαρκώς να παγιδεύσει την ρίζα του σουπεροξειδίου που δημιουργείται κατά την επώαση των 75 λεπτών. Αυτό καθορίστηκε πειραματικά ώστε (1) η ταχύτητα παραγωγής του σουπεροξειδίου να 23

είναι σταθερή εντός του χρόνου επώασης με HE και (2) να μπορεί να ανιχνεύεται HE στον ιστό μετά το πέρας της επώασης για να διασφαλίζεται η ύπαρξή του σε περίσσεια. Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα μεταχείρισης των ζώων και σε συμφωνία με τις επιταγές της Επιτροπής Ηθικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Πάτρας. Α2. Επεξεργασία ιστών Οι απομονωμένες εγκεφαλικές περιοχές (εγκεφαλικός φλοιός, μεσεγκέφαλος και παρεγκεφαλίδα) ομογενοποιήθηκαν σε πάγο με γυάλινο έμβολο με ίσο όγκο (με το βάρος του ιστού) παγωμένου διαλύματος ομογενοποίησης φωσφορικών συγκέντρωσης 50 mm και ph 7.8 (που περιείχε επιπλέον 10 mm NaCN σαν αναστολέα των ενδογενών μη ειδικών υπεροξειδασών). Στις ίδιες συνθήκες ομογενοποίηθηκαν και τα εσωτερικά όργανα όσον αφορά την καρδιά και το έντερο, ενώ για το νεφρό και το συκώτι η αναλογία του όγκου του διαλύματος ομογενοποίησης σε σχέση με το βάρος του ιστού ήταν τριπλάσια. Β. Δείγματα ολικού αίματος ανθρώπων Η μελέτη ήταν σύμφωνη με την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών και οι ασθενείς, που συμμετείχαν οικειοθελώς στη μελέτη, είχαν συγκεντρώσεις χολερυθρίνης μεγαλύτερες από 5 mg/dl που είχε προκληθεί από περιφερική κακοήθη απόφραξη στην χοληδόχο κυκλοφορία. Ο αποφρακτικός ίκτερος είχε καθοριστεί από αυξημένες χολεστατικές παραμέτρους (χολερυθρίνη, αλκαλική φωσφατάση, γ-γλουταμυλτρανσφεράση) και διαδικασίες απεικόνισης (υπέρηχος και ενδοσκόπηση). Οι ασθενείς αποκλείονταν αν είχαν κάποια φλεγμονή στη γαστρεντερική οδό ή συστημικές ασθένειες με ανοσοκαταστολή (σακχαρώδης διαβήτητς, ρευματικές ασθένειες, αιματολογικές κακοήθιες) ή αν ελάμβαναν τον τελευταίο μήνα θεραπευτική αγωγή που επηρεάζει το οξειδωτικό στρες (π.χ. αλλοπουρινόλη, βιταμίνη C και E, κορτικοστεροειδή, αντιφλεγμονώδη φάρμακα). Η ομάδα control αποτελείτο από άτομα που είχαν κάποια κακοήθεια η οποία δεν προκαλούσε απόφραξη στο χολικό σύστημα και ως εκ τούτου είχαν φυσιολογικές χολεστατικές παραμέτρους. Σε ολικό αίμα (0.2 ml) ή απομονωμένο ορό αίματος προστέθηκε υδροαιθίδιο (dihydroethidine ή HE) σε τελική συγκέντρωση 300 μm (με 2 μl από στοκ διάλυμα 24

30 mμ ΗΕ σε 100% DMSO) και επωάστηκε στους 37 C για 30 λεπτά. Παράλληλα ένα άλλο δείγμα 0.2 ml πριν επωαστεί με το HE είχε επωαστεί για 10 λεπτά (στους 37 C) με 100 μm αλλοπουρινόλη (προσθέτοντας 2 μl από πυκνό διάλυμα 10 mμ σε 100% DMSO), που είναι ειδικός αναστολέας του ενζύμου οξειδάση της ξανθίνης. Τα επωασμένα με το HE κύτταρα του αίματος διαχωρίστηκαν από τον ορό με φυγοκέντρηση στα 3,000 g για 5 λεπτά και τα κύτταρα πλύθηκαν με 0.5 ml PBS και συλλέχτηκαν. Ο ορός αίματος και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση της ρίζας του σουπεροξειδίου και της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης, ενώ για την ποσοτικοποίηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, εκφρασμένης ως ουσίες αντιδρούσες με θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbiruric acid reactive substances, TBARS), χρησιμοποιήθηκε ξεχωριστό δείγμα 0.2 ml που δεν επωάστηκε με HE γιατί η ουσία αυτή δημιουργεί παρεμβολή στην μέθοδο των TBARS. 2. Εφαρμογή μεθόδων που υπάρχουν ήδη στη διεθνή βιβλιογραφία για την εκτίμηση δεικτών οξειδωτικού στρες Α. Προσδιορισμός του O 2 μέσω απομόνωσης και ποσοτικοποίησης φθορισμομετρικά του 2-υδροξυαιθιδίου Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της ρίζας του σουπεροξειδίου (O 2 ) με το υδροαιθίδιο (ΗΕ) και τον σχηματισμό του 2-υδροξυαιθίδιο (2-OH-E + ) (Georgiou 2005). Το ειδικό αυτό προϊόν της αντίδρασης απομονώνεται με κατιονική και κατόπιν με υδρόφοβη χρωματογραφία και τελικά ποσοτικοποιείται φθορισμομετρικά με κορυφές διέγερσης/εκπομπής 480/583 nm (ή 515/567 nm παρουσία DNA). Η μέθοδος είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και ενισχύεται ακόμα περισσότερο με την παρουσία DNA κατά την μέτρηση του φθορισμού του 2-υδροξυαιθιδίου. Εικόνα 3. Η αντίδραση σχηματισμού του 2-υδροξυαιθιδίου Υλικά: 25

1. Υδροαιθίδιο (HE) 5 mm σε 100% διμεθυλικό σουλφοξείδιο (DMSO): Διαλύεται 1 mg HE (MB:315) σε 633 μl 100% DMSO. Το διάλυμα αποθηκεύεται σε γυάλινη αμπούλα αεροστεγώς κλεισμένη υπό ατμόσφαιρα αζώτου στους 80 ο C τυλιγμένο με αλουμινόχαρτο για προστασία από το φως. 2. Ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) 50 mm Νa 2 ΗPO 4, ph 7.8: Διαλύονται 1.42 g Νa 2 HPO 4 (MB:141.96) σε 200 ml dh 2 O και το ph ρυθμίζεται με στο 7.8 με 1 Ν HCl. Το διάλυμα χρησιμοποιείται για αραιώσεις του ομογενοποιήματος του ιστού. 3. 0.1 N HCl. 4. 1 N HCl. 5. 10 N HCl. 6. 0.1 N NaOH. 7. 1 N NaOH. 8. 10 N NaOH. 9. Διμεθυλικό σουλφοξείδιο (DMSO) 100%. 10. Ακετόνη 100%. 11. Διαιθυλαιθέρας 100%. 12. Μεθανόλη (ΜetOH) 100%. 13. Χλωροφόρμιο (CHCl 3 ) 100%. 14. Ακετονιτρίλιο (ACN) 100%. 15. Ακετονιτρίλιο 17%: Αναμειγνύονται 1.7 ml ACN με 8.3 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα 2. 16. Ακετονιτρίλιο 25%: Αναμειγνύονται 2.5 ml ACN με 7.5 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα 2. 17. Ακετονιτρίλιο 60%: Αναμειγνύονται 6 ml ACN με 4 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα 2. 18. Ρυθμιστικό διάλυμα Tris 2.5 M, ph 7: Διαλύονται 15 g Tris (ΜΒ 121.14) σε 50 ml dh 2 O και το ph ρυθμίζεται στο 7.0 με 10 Ν HCl. 19. Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ: Περιέχει 10 mm Tris ph 8.0 και 1 mm EDTA. Διαλύονται 0.012 g Tris (ΜΒ 121.14) και 0.0037 g EDTA (ΜΒ:372.24) σε 10 ml dh 2 O. Tο ph ρυθμίζεται στο 8.0 με 10 Ν HCl. 20. DNA απομονωμένο από σολομό (salmon testes): Ζυγίζονται 2 mg DNA σε 1 ml από το διάλυμα ΤΕ (19) και αφήνεται να διαλυθεί επί 24 ώρες στους 4 C. Το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο. 26

21. H 2 O 2 700 μμ: Γίνεται διαδοχική αραίωση 10 4 φορές στο ρυθμιστικό διάλυμα 2 από το πυκνό stock υπεροξειδίου του υδρογόνου 6.77 M. 22. Υπεροξειδάση των αγριοραφανίδων (HRP) 1310 Units/mg πρωτεΐνης: Διαλύεται 1 mg σε 1 ml dh 2 O. 20 μl από αυτό προστίθενται σε 180 μl από το ρυθμιστικό διάλυμα 2. 23. Υλικό κατιονικού ανταλλάκτη Dowex 50WX-8 (400): 4 g υλικού προστίθενται σε ποτήρι ζέσης με 4 όγκους (16 ml) 0.1 Ν ΗCl και αφήνονται υπό ανάδευση 30 λεπτά με μαγνητικό αναδευτήρα. Αποχύνεται το ΗCl και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με 16 ml dh 2 O και στη συνέχεια το ίδιο με 16 ml 0.1 Ν NaOH. Στο τέλος γίνονται 5 πλύσεις με 16 ml dh 2 O (ανάδευση και απόχυση) για να επανέλθει το ph στο ουδέτερο και το υλικό είναι έτοιμο για χρήση. Το υλικό διατηρείται στο ψυγείο σε dh 2 O. 24. Προετοιμασία στηλών με υλικό DOWEX: Κόβεται το μακρύ ρύγχος μιας πιπέτας pasteur και στη συνέχεια γεμίζεται με λίγο υαλοβάμβακα για συγκράτηση του υλικού DOWEX που τοποθετείται αμέσως μετά καλύπτοντας έναν όγκο περίπου ίσο με 250 μl. Αφού πακεταριστεί το υλικό στον πάτο της πιπέτας γίνεται πλύσιμο και ενεργοποίηση της στήλης. Συγκεκριμένα η στήλη πλένεται με 2 ml ACN και 2 ml dh 2 O. Στη συνέχεια ενεργοποιείται με 1 ml 0.1 Ν ΗCl, 5 ml dh 2 O, 1 ml 0.1 N NaOH και τέλος 5 ml dh 2 O. 25. Υδρόφοβες HLB στήλες Waters, Oasis 30 μμ, 30 mg: Πριν από τη χρήση η στήλη πρέπει να ενεργοποιείται με 1 ml ΜetOH και 1 ml dh 2 O. 26. Διάλυμα ξανθίνης 3.75 mm: Αρχικά διαλύονται 0.0057 g (MB:152.1) σε 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα 2 και προστίθενται 10 μl 10 Ν NaOH για να διαλυθεί. Στη συνέχεια αραιώνουμε 10 φορές το διάλυμα σε ρυθμιστικό διάλυμα 2 έτσι, ώστε το stock να είναι 3.75 mm σε ph 7.8. 27. Οξειδάση της ξανθίνης 0.67 Units/mg στερεού: Το ένζυμο αντλείται κατευθείαν από το μπουκαλάκι (υγρή μορφή ενζύμου που διατηρείται στο ψυγείο) υπολογίζοντας να προστεθούν 0.08 units. 28. Βρωμιούχο αιθίδιο (E + ) 2.5 mm: Διαλύεται 1 mg (MB:394.3) σε 1 ml dh 2 O. Πορεία: O ιστός (είτε πρόκειται για ολικό αίμα ανθρώπου είτε για ολόκληρο αρουραίο) αρχικά επωάζεται για 30 λεπτά με 30 μμ ΗΕ. Τα όργανα συλλέγονται και ομογενοποιούνται σε γυάλινο έμβολο σε πάγο. Σε 0.1 g ή 100 μl ομογενοποιήματος 27

οργάνου προστίθενται 0.9 ml 100% ακετόνης και 0.01 ml 10 Ν NaOH και το δείγμα αναδεύεται έντονα. Στην συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται σε 15,000 g για 5 λεπτά και συλλέγεται το υπερκείμενο. Αραιώνεται η ακετόνη στο 50% με dh 2 O και προστίθενται 0.05 μl 2.5 Μ Tris ph 7.0 για 2 ml συνολικού αραιωμένου δείγματος. Στη συνέχεια, το αραιωμένο υπερκείμενο εισάγεται σε ενεργοποιημένη στήλη Dowex και αφήνεται να εκλουστεί χωρίς πίεση. Στη συνέχεια η στήλη πλένεται με 2 ml ACN, 2 ml 4N HCl και 2 ml dh 2 O και η έκλουση γίνεται με 1 ml 10 Ν HCl. Ξεπλένεται η στήλη με 1 ml dh 2 O το οποίο συλλέγεται και προστίθεται ακόμα 1 ml dh 2 O, ώστε η τελική συγκέντρωση του HCl να γίνει 3 Ν. Κατόπιν το δείγμα εισάγεται στη στήλη HLB που έχει ενεργοποιηθεί με 1 ml 100% ΜetOH και 1 ml dh 2 O και εκλούεται με ταχύτητα ροής 2 ml min -1. Η στήλη πλένεται με 1 ml 17% ΑCN και η έκλουση του 2-OH-E + γίνεται με 1.5 ml 25% ACN. Στη συνέχεια εισάγεται 1 ml 60% ACN για την έκλουση του ελεύθερου ΗΕ και των υπαρχουσών παρεμβολών (το κλάσμα μετριέται για να επιβεβαιωθεί ότι το ΗΕ βρισκόταν σε περίσσεια και ότι δεν είχε καταναλωθεί πλήρως). Επειδή σε αυτή τη φάση η αραίωση του προϊόντος είναι μεγάλη και επειδή θα πρέπει υποχρεωτικά στο τέλος το 2-OH-E + να διαλυθεί σε σκέτο dh 2 O για να ενισχυθεί τεχνητά ο φθορισμός του παρουσία DNA, το δείγμα εκχειλίζεται σε CHCl 3 και στη συνέχεια εξατμίζεται. Η παρουσία του ACN δεν επιτρέπει την αύξηση του φθορισμού παρουσία DNA και έτσι κάθε έκλουσμα των 1.5 ml εκχειλίζεται σε 1.5 ml CHCl 3 μετά από έντονη ανάδευση και φυγοκέντρηση σε 15,000 g. Το δείγμα εξατμίζεται σε κώδωνα με αντλία κενού. Το στερεό ερυθρό ίζημα διαλύεται σε 0.003 ml DMSO και 0.047 ml ρυθμιστικό διάλυμα 2. Στη συνέχεια προστίθενται 0.25 ml διάλυμα 2. Προστίθενται 0.02 ml από το διάλυμα DNA που έχει την ιδιότητα να αυξάνει το σήμα 25 περίπου φορές και γίνεται η μέτρηση με διέγερση στα 515 nm και εκπομπή στα 567 nm. Ο διαχωρισμός του συνυπάρχοντος αιθίδιου (E + ) από το 2-OH-E + γίνεται με την προσθήκη 0.025 ml από το διάλυμα H 2 O 2 700 μμ (διάλυμα 21) και 0.008 ml διάλυμα HRP (1 unit). Το ένζυμο χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα μόνο το 2-OH-E + με αποτέλεσμα να χάνεται ο φθορισμός του και να παραμένει μόνο ο φθορισμός που οφείλεται στο σχηματισθέν E +. Οι μετρήσεις γίνονται χρησιμοποιώντας μικροκυψελίδα χαλαζία εσωτερικών διαστάσεων 4x4x45 mm μέγιστου όγκου 0.5 ml. Στην συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιείται φθορισμόμετρο Shimadzu RF-1501 (Shimadzu Co, Kyoto, Japan) 28