Σ Ω Τ Η Ρ Ι Ο Σ Γ. Σ Ι Δ Ε Ρ Η Σ ΒΙΟΛΟΓΟΣ (MSc.)

Σ Ω Τ Η Ρ Ι Ο Σ Γ. Σ Ι Δ Ε Ρ Η Σ ΒΙΟΛΟΓΟΣ (MSc.) ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΑ ΤΜΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Δ Ι Δ Α Κ Τ Ο Ρ Ι Κ Η Δ Ι Α Τ Ρ Ι Β Η ΥΠΕΒΛΗΘΗ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2007

Σ Ω Τ Η Ρ Ι Ο Σ Γ. Σ Ι Δ Ε Ρ Η Σ ΒΙΟΛΟΓΟΣ (MSc.) ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΑ ΤΜΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Δ Ι Δ Α Κ Τ Ο Ρ Ι Κ Η Δ Ι Α Τ Ρ Ι Β Η ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ. ΤΖΑΡΤΟΣ Επιβλέπων Καθηγητής ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Γ. ΣΩΤΗΡΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μέλος συμβουλευτικής και εξεταστικής επιτροπής Α. ΜΑΜΑΛΑΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΕΡΕΥΝΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ Μέλος συμβουλευτικής και εξεταστικής επιτροπής Π. ΚΟΡΔΟΠΑΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μέλος εξεταστικής επιτροπής Δ. ΣΥΝΕΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μέλος εξεταστικής επιτροπής Α. ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μέλος εξεταστικής επιτροπής Κ. ΠΟΥΛΑΣ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μέλος εξεταστικής επιτροπής ii

ΠΡΟΛΟΓΟΣ «...όταν φοβάσαι ένα πράμα,θές λιοντάρι είναι αυτό, θές άνθρωπος, θές φάντασμα, να πέφτεις απάνω του με τα μούτρα, και θα δείς, φεύγει ευτύς από πάνω σου ο φόβος, φεύγει από σένα και πάει στον άλλο. Φόβος κυριεύει το θεριό,τον άνθρωπο, το φάντασμα, και που φύγει φύγει! Αυτό ναι όλο το μυστικό!» Νίκος Καζαντζάκης, από τον «ΚΑΠΕΤΑΝ ΜΙΧΑΛΗ» Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Με την ευκαιρία της ολοκλήρωσής της, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή και διευθυντή του εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας κ. Σωκράτη Τζάρτο για την άρτια και ολοκληρωμένη επιστημονική καθοδήγηση και επίβλεψη σε όλη την πορεία της εργασίας και για την ευκαιρία που μου παρείχε να αποκομίσω σημαντική εμπειρία στην έρευνα, αλλά και στην εν γένει οργάνωση και λειτουργία ενός ερευνητικού εργαστηρίου. Θερμές ευχαριστίες οφείλω να εκφράσω στον κ. Κωνσταντίνο Πουλά, Λέκτορα στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας για την πολύπλευρη και πολυδιάστατη φροντίδα του σε ζητήματα που άπτονται του γενικότερου καλού και φιλικού κλίματος σε έναν χώρο με απαιτήσεις, όπως ένα ερευνητικό εργαστήριο. Τον ευχαριστώ επίσης για τη γενικότερη θετική του στάση και την καλή του διάθεση σε όλα τα χρόνια της συνεργασίας μας! Πολλές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, κ.κ Γ. Σωτηροπούλου, και Α. Μαμαλάκη και στα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής κ.κ Π. Κορδοπάτη, Δ. Συνετό, και Α. Παπαπετρόπουλο, για την τιμή που μου έκαναν με τη συμμετοχή τους στις αντίστοιχες επιτροπές, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές και παρατηρήσεις τους, που συνέβαλλαν τα μέγιστα στην αρτιότερη και πληρέστερη διαμόρφωση της παρούσας διατριβής. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Δρ. Α. Μαμαλάκη για τη φιλοξενία της, κατά την έναρξη της εργασίας αυτής, στο εργαστήριο όπου προΐσταται στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ και την καθοδήγησή της στα πρώτα μου βήματα στο συναρπαστικό πεδίο της μοριακής βιολογίας. Ευχαριστώ επίσης για την ευγένεια, την καλή τους διάθεση και την πολύτιμη βοήθειά τους, τις κ.κ Αβραμοπούλου Βασιλική, Κωστελλίδου Πόπη και Ψαρίδη-Λιναρδάκη Λουκία, με τις οποίες είχα τη χαρά να συνυπάρξω και να συνεργαστώ στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, κατά τα πρώτα στάδια αυτής της εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ από καρδιάς οφείλω στους να εκφράσω στους φίλους μου και συνεργάτες από το εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας κ.κ Κόρδα Γρηγόρη και Λαγουμιντζή Γιώργο, χωρίς την επιστημονική βοήθεια και ηθική συμπαράσταση των οποίων, η ολοκλήρωση της εργασίας θα ήταν αδύνατη! Ευχαριστώ επίσης τον κ. Γιώργο Παμπαλάκη για την καλή γειτονία και συνεργασία! Ευχαριστούμε επίσης το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ESF), το πρόγραμμα Εκπαίδευσης και Επαγγελματικής Κατάρτισης (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) και ιδιαιτέρως το πρόγραμμα Ηράκλειτος, για την οικονομική ενίσχυση της διδακτορικής αυτής διατριβής. Τέλος, ευχαριστώ τη σύζυγό μου Έλενα για την κατανόηση, την υπομονή, την αγάπη και τη φροντίδα της, σε όλο το διάστημα εκπόνησης της διατριβής μου! iii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...iv ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ...x ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 1 1. Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ... 1 1.1 Ιοντικά κανάλια-γενικά... 1 1.2 Ιοντικά κανάλια ενεργοποιούμενα από χημικούς προσδέτες... 1 1.3 Υποδοχέας της ακετυλοχολίνης-γενικά... 2 1.3.1 Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης... 3 1.3.2 Ο νευρικού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης... 5 1.3.2.1 Κατανομή του νευρικού τύπου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 6 1.3.2.2 Φυσιολογικός ρόλος του νευρικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 7 1.4 Η δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 8 1.4.1 Η πρωτοταγής δομή του υποδοχέα... 8 1.4.2 Η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του υποδοχέα... 11 1.4.3 Η τεταρτοταγής δομή του υποδοχέα... 13 1.5 Η λειτουργία του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 17 1.5.1 Οι συνάψεις και η νευροδιαβίβαση μέσω των συνάψεων... 17 1.5.2 Η νευρομυϊκή σύναψη... 18 1.5.3 Λειτουργικές καταστάσεις του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Αλλοστερικές τροποποιήσεις του μορίου... 20 1.5.4 Υποκαταστάτες που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 21 1.5.4.1 Αγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 22 1.5.4.2 Ανταγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 24 1.6 Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ως αντιγόνο και η κύρια ανοσογόνος περιοχή του... 26 1.7 Ο μεταβολισμός του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 32 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΝΙΚOΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΣΕ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ... 32 iv

2.1 Γενικά... 32 2.2 Ασθένειες που σχετίζονται με τον AChR μυϊκού τύπου... 32 2.2.1 Η βαριά μυασθένεια (myasthenia gravis)... 32 2.2.1.1 Ιστορική αναδρομή... 32 2.2.1.2 Επιδημιολογικά δεδομένα και κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου... 34 2.2.1.3 Παθοφυσιολογία της μυασθένειας... 36 2.2.1.4 Παθογένεση της μυασθένειας... 37 2.2.1.5 Ο ρόλος της χυμικής ανοσίας στη μυασθένεια: μηχανισμοί δράσηςετερογένεια των αντισωμάτων... 39 2.2.1.6 Διάγνωση της μυασθένειας... 44 2.2.1.7 Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη βαριά μυασθένεια... 45 2.2.2 Συγγενή Μυασθενικά Σύνδρομα... 49 2.3 Ασθένειες που σχετίζονται με τον AChR νευρικού τύπου... 50 2.3.1 Η Νόσος του Alzheimer... 50 2.3.2 Η Νόσος του Parkinson... 52 2.3.3 Επιληψία... 53 2.3.4 Σχιζοφρένεια... 54 2.3.5 Ο εθισμός στη νικοτίνη... 54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 56 ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ... 56 3.1 Το Ανοσοποιητικό σύστημα... 56 3.1.1. Γενικά δομικά χαρακτηριστικά... 56 3.2 Ανοσοσφαιρίνες... 57 3.2.1 Γενικές πληροφορίες... 57 3.2.2 Οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών... 58 3.2.3 Δομή του αντισώματος... 59 3.3 Μονοκλωνικά αντισώματα και η τεχνική παραγωγής τους... 61 ΣΚΟΠΟΣ... 63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 65 ΥΛΙΚΑ... 65 1. Εργαστηριακός εξοπλισμός... 65 2. Αναλώσιμα... 66 3. Αντιδραστήρια - Διαλύματα... 67 3.1 Χημικά αντιδραστήρια... 67 v

3.2 Προσυσκευασμένα χημικά αντιδραστήρια (kits)... 68 3.3. Έναρκτήρια μόρια (primers)-ολιγονουκλεοτίδια... 68 3.4 Αντισώματα... 69 3.5. Διαλύματα... 70 4. Πλασμιδιακοί φορείς και κυτταρικά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν για την ετερόλογη έκφραση... 73 5. Κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα αντιγονικής τροποποίησης του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 76 6. Πειραματόζωα... 76 ΜΕΘΟΔΟΙ... 77 1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 77 2. Παρασκευή πλασμιδιακού DNA από καλλιέργεια βακτηρίων... 78 2.1. Παρασκευή πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα με τη μέθοδο λύσης με βρασμό (boiling miniprep of plasmids)... 78 2.2. Παρασκευή πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα με τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης (maxi preparation of plasmids-alkaline lysis)... 79 3. Ποσοτική ανάλυση διαλύματος DNA... 81 4. Ποιοτική ανάλυση δείγματος DNA με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης... 82 5. Φωτομετρικός έλεγχος της καθαρότητας διαλύματος DNA... 83 6. Καθαρισμός DNA... 83 6.1. Με συστηματοποιημένες χρωματογραφικές μεθόδους... 83 6.2. Με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες... 85 7. Κατακρήμνιση του DNA... 85 8. Επεξεργασία DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (πέψη)... 86 9. Υποκλωνοποίηση μορίων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς... 87 10. Καλλιέργειες κυττάρων... 89 10.1. Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Escherichia coli89 10.2. Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων της ζύμης Pichia pastoris... 89 11. Μετασχηματισμός βακτηρίων με τη μέθοδο του χλωριούχου ασβεστίου.90 12. Μετασχηματισμός κυττάρων του ζυμομύκητα Pichia pastoris για τον ομόλογο ανασυνδυασμό του πλασμιδιακού DNA στο χρωμόσωμα της... 91 13. Επαγωγή της έκφρασης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Έλεγχος και επιλογή κλώνων (clone screening)... 93 vi

14. Έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας. Απομόνωση ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων... 94 15. Συμπύκνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών που εκκρίνονται στο υπερκείμενο καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris με τη μέθοδο της εξαλάτωσης με προσθήκη θειϊκού αμμωνίου... 94 16. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE)... 95 17. Ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωση κουκίδας (dot blot)... 96 18. Καθαρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας από στήλη Ni- NTA-αγαρόζης... 97 19. Φασματοσκοπικές μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών... 98 20. Πρόσδεση 125 Ι-α-Bgtx στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σε διάλυμα... 99 21. Ακινητοποίηση ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων σε χρωματογραφική στήλη για τη δημιουργία ανοσοπροσροφητικών στηλών... 99 22. Εφαρμογή των ανοσοπροσροφητικών στηλών στην απομόνωση αυτοαντισωμάτων ορισμένης εξειδίκευσης από τον ορό αίματος μυασθενικών ατόμων... 100 23. Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)... 102 24. Κυτταροκαλλιέργειες των ΤΕ671 κυττάρων... 103 25. Αντιγονική τροποποίηση του μυϊκού τύπου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης που εκφράζεται στα ΤΕ671 κύτταρα.... 103 26. Πειράματα επαγωγής πειραματικής μυασθένειας σε πειραματόζωα, μέσω της χορήγησης κλασμάτων ορών μυασθενικών ατόμων... 105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 107 1. Υποκλωνοποίηση του cdna για την hk6 στο φορέα κλωνοποίησης pbluescript KSII... 107 2. Ενίσχυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας από το cdna της α1 υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 110 3. Υποκλωνοποίηση του cdna της α1 υπομονάδας του υποδοχέα στο φορέα κλωνοποίησης pbluescript KSII, που φέρει το γονίδιο για την hk6... 112 4. Υποκλωνοποίηση του πεπτιδίου-συνδέτη στον ανασυνδυασμένο φορέα κλωνοποίησης pbluescript KSII, που φέρει το γονίδιο για την hk6 και το cdna της α1 υπομονάδας του AChR... 115 vii

5. Υποκλωνοποίηση του ενθέτου hk6-linker-α1 στο φορέα έκφρασης ppic9, για την ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης-σύντηξης στο ζυμομύκητα Pichia pastoris... 116 5. Υποκλωνοποίηση του ενθέτου hk6-linker-α1 στο φορέα έκφρασης ppic9, για την ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης-σύντηξης στο ζυμομύκητα Pichia pastoris... 117 6. Μετασχηματισμός κυττάρων του ζυμομύκητα Pichia pastoris με το φορέα έκφρασης ppic9 hk6-linker-α1... 121 7. Επαγωγή της έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Έλεγχος και επιλογή κλώνων... 122 8. Παραγωγή ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων που αντιστοιχούν σε εξωκυττάρια τμήματα υπομονάδων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 125 9. Χρήση ανοσοπροσροφητικών στηλών συγγένειας για την απομόνωση αυτοαντισωμάτων ορισμένης εξειδίκευσης από τον ορό αίματος μυασθενικών ατόμων... 128 10. Χρήση ανοσοπροσροφητικών στηλών συγγένειας για τον υπολογισμό της επί τοίς εκατό περιεκτικότητας ορών μυασθενικών σε αυτοαντισώματα έναντι των διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα... 129 11. Συγκριτικός έλεγχος της ικανότητας κλασμάτων ορών μυασθενικών ατόμων να προκαλούν αντιγονική τροποποίηση του AChR σε καλλιέργειες κυττάρων ραβδομυοσαρκώματος... 131 12. Δοσοεξαρτώμενη απώλεια AChRs σε καλλιέργειες κυττάρων ραβδομυοσαρκώματος, προκαλούμενη από κλάσματα επιλεγμένων ορών μυασθενικών ατόμων... 134 13. Δοσοεξαρτώμενη απώλεια AChRs σε καλλιέργειες κυττάρων ραβδομυοσαρκώματος, προκαλούμενη από απομονωμένα αυτοαντισώματα έναντι των υπομονάδων α1 και β του υποδοχέα... 137 14. Επαγωγή πειραματικής μυασθένειας σε αρουραίους με τη χορήγηση ορών μυασθενικών ατόμων... 138 14.1 Γενικά... 138 14.2 Επαγωγή πειραματικής μυασθένειας σε αρουραίους με τη χορήγηση κλασμάτων του επιλεγμένου μυασθενικού ορού MG2. Διερεύνηση της in vivo παθογονικότητας απομονωμένων αντισωμάτων έναντι της α1 υπομονάδας του υποδοχέα... 139 viii

14.3 Επαγωγή πειραματικής μυασθένειας σε αρουραίους με τη χορήγηση κλασμάτων του επιλεγμένου μυασθενικού ορού MG3. Διερεύνηση της in vivo παθογονικότητας απομονωμένων αντισωμάτων έναντι της β υπομονάδας του υποδοχέα... 141 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 142 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 143 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ... 153 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 183 SUMMARY... 185 ix

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ ACh: Ακετυλοχολίνη AChR: Υποδοχέας της ακετυλοχολίνης nachr: Νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης machr: Μουσκαρινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Κ.Ν.Σ: Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Π.Ν.Σ: Περιφερικό Νευρικό Σύστημα Ca 2+ : Ιόντα ασβεστίου α-bungarotoxin (α-bgtx): α-μπουγκαροτοξίνη Main Immunogenic Region (MIR): Κύρια Ανοσογόνος Περιοχή ACh-binding protein (AChBP): Πρωτεΐνη πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης muscle-specific kinase (MuSK): Ειδική μυϊκή κινάση Ig: Ανοσοσφαιρίνη Antigenic Modulation: Αντιγονική τροποποίηση mab: Μονοκλωνικό αντίσωμα complementarity-determing region, (CDR): Περιοχή καθορίζουσα τη συμπληρωματικότητα Fetal Bovine Serum (F.B.S): Ορός βόειου νεογνού Radioimmunoassay (RIA): Ραδιοανοσολογική μέθοδος Counts per minute (cpm): Κρούσεις ανά λεπτό Human kallikrein-6 (Ηk6): Ανθρώπινη καλλικρεΐνη 6 x

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1. Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 1.1 Ιοντικά κανάλια-γενικά Η κυτταρική μεμβράνη αποτελεί το σημαντικότερο φυσικό φραγμό στην ελεύθερη κίνηση μορίων και ιόντων από και πρός το εσωτερικό του κυττάρου. Η αναγκαιότητα διακίνησης ιόντων εξυπηρετείται από την ύπαρξη ειδικών πρωτεϊνών στη μεμβράνη, οι οποίες είναι γνωστές ως ιοντικά κανάλια. Τα ιοντικά κανάλια σχηματίζουν πόρους στην κυτταρική μεμβράνη, επιτρέποντας την παθητική μετακίνηση των διαφόρων ιόντων σύμφωνα με την ηλεκτροχημική τους κλίση. Η κοινή δομή τους περιλαμβάνει έναν κεντρικό υδατοπληρούμενο πόρο, διαμέσου του οποίου διακινούνται τα ιόντα. Ο πόρος σχηματίζεται συνήθως από τέσσερις έως πέντε διαμεμβρανικές δομές α-έλικας, οι οποίες μπορεί να ανήκουν και σε διαφορετικές υπομονάδες και διευθετούνται κατά τρόπο που θυμίζει τη διάταξη των σανίδων που σχηματίζουν τα πλευρικά τοιχώματα βαρελιού. Οι σχηματιζόμενοι πόροι ανοίγουν με σήμα που προέρχεται από μηχανικό, χημικό ή ηλεκτρικό ερέθισμα. Τα γενικά δομικά χαρακτηριστικά των ιοντικών καναλιών, η θέση τους στο κύτταρο και ο σημαντικός λειτουργικός τους ρόλος τα καθιστούν στόχους για την ανάπτυξη φαρμακευτικών ουσιών (Kalamida et al., 2007). 1.2 Ιοντικά κανάλια ενεργοποιούμενα από χημικούς προσδέτες Μια υποομάδα των ιοντικών καναλιών είναι εκείνα τα οποία μεταφέρουν ιόντα με την επίδραση χημικών μορίων-νευροδιαβιβαστών (Ligand-gated ion channels LGICs). Κοινό δομικό χαρακτηριστικό τους αποτελεί η ύπαρξη θέσεων ικανών να δεσμεύουν σηματοδοτικά χημικά μόρια. Στην παραπάνω υπεροικογένεια ανήκουν οι υποδοχείς της 5-υδρόξυτρυπταμίνης (5-ΗΤ) ή σεροτονίνης (Maricq et al., 1991), της γλυκίνης (Gly) (Grenningloh et al., 1987), του γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) 1

(Schofield et al., 1987), και οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (ACh) (Stroud et al., 1990; Betz 1990a). Οι τελευταίοι διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στη συναπτική διαβίβαση, καθώς και στη νευρομυϊκή σύναψη, στην περιοχή δηλαδή όπου ο νευράξονας των νευρώνων αλληλεπιδρά με τη μυϊκή ίνα. Οι διαφορετικοί υποδοχείς-μέλη της υπεροικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά και υποστηρίζεται πως τα γονίδια που εμπλέκονται στην κωδικοποίηση ομόλογων περιοχών τους, προέρχονται όλα τους από κοινό προγονικό γονίδιο (Betz 1990b; Ortells and Lunt 1995). Μεταξύ των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από χημικούς προσδέτες, οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) αποτελούν την εκτενέστερα μελετημένη υποοικογένεια και για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ως οδηγός για την κατανόηση της λειτουργίας και των υπόλοιπων μελών της υπεροικογένειας (Changeux et al., 1987; Karlin, and Akabas, 1995). 1.3 Υποδοχέας της ακετυλοχολίνης - Γενικά Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) (Εικόνα 1) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες αποκρινόμενες στη δέσμευση της ACh, η οποία συντίθεται, αποθηκεύεται και εκκρίνεται από τους χολινεργικούς νευρώνες. Οι AChRs, όπως άλλωστε και άλλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, ταξινομούνται με κριτήρια όπως η χημική συγγένεια που εμφανίζουν για σηματοδοτικά μόρια και οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες, σε υποομάδες και πιο συγκεκριμένα: α) στην ομάδα των νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης (nachrs), μόρια με υψηλή ευαισθησία απόκρισης στη νικοτίνη (Changeux, and Edelstein, 2001; Lindstrom, 1997) και β) στην ομάδα των μουσκαρινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης (machrs), μόρια με αυξημένη ευαισθησία απόκρισης στη μουσκαρίνη (Wess, 1996; Ishii, and Kurachi, 2006). Οι υποδοχείς αυτοί αποτελούν μέλη της υπεροικογένειας μεμβρανικών πρωτεϊνών που συνδέονται με G-πρωτεΐνες. Οι nachrs σχηματίζονται από τη συναρμογή πέντε ομόλογων υπομονάδων, που οργανώνονται περιμετρικά ενός κεντρικού πόρου και υποδιαιρούνται σε μυϊκού τύπου, ευρισκόμενους στους σκελετικούς μύες των σπονδυλωτών όπου εξυπηρετούν τη συναπτική διαβίβαση στη νευρομυϊκή σύναψη, καθώς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ιχθύων και σε νευρικού τύπου, απαντώμενους κατά κύριο λόγο στο κεντρικό 2

(Κ.Ν.Σ) και στο περιφερικό νευρικό σύστημα (Π.Ν.Σ), αλλά σποραδικά και σε μη νευρικό ιστό (Lindstrom, 1997). Ετερομερείς-μυϊκού τύπου Εμβρυϊκού τύπου Ενηλίκου τύπου Θέσεις πρόσδεσης ACh Ομομερείς νευρικού τύπου AChRs Ετερομερείς-νευρικού τύπου AChRs Εικόνα 1: Υπεροικογένεια των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Παρουσιάζεται ενδεικτικά η διευθέτηση των υπομονάδων σε ορισμένους κυρίαρχους υποτύπους υποδοχέα. Η θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στις μεσεπιφάνειες μεταξύ υπομονάδων τύπου α και των υπομονάδων γ, δ, ε, β2 και β4 και στο σχήμα καταδεικνύονται με τα λευκά βελάκια (τροποποιημένη από Lindstrom et al. 2000) 1.3.1 Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Ο μυϊκού τύπου AChR αποτελεί το πλέον γνωστό και μελετημένο μέλος της υπεροικογένειας των μορίων-υποδοχέων νευροδιαβιβαστών. Σημαντικοί παράγοντες οι οποίοι συνέβαλαν στην εκτεταμένη μελέτη και το χαρακτηρισμό του μορίου είναι μεταξύ άλλων: α) η δυνατότητα απομόνωσης μεγάλων ποσοτήτων λειτουργικού υποδοχέα, παρόμοιου με αυτόν που συναντούμε στη νευρομυϊκή σύναψη, από τα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo (υποτρηματικός χονδριχθύς, κοινώς ονομαζόμενο μουδιάστρα) και από το χέλι του γένους Electrophorus. 3

β) η ύπαρξη ειδικών μορίων-υποκαταστατών (νευροτοξίνες φιδιών) τα οποία είναι πολύ χρήσιμα σε διαδικασίες σήμανσης και καθαρισμού του μορίου. Στη δομή του υποδοχέα μυϊκού τύπου συμμετέχουν τέσσερις διαφορετικοί τύποι υπομονάδων (α, β, γ ή ε και δ) με στοιχειομετρία α 2 βγδ ή α 2 βεδ (Wess, 1996; Ishii, and Kurachi, 2006) (Εικόνα 2). Ο συνδυασμός α2βγδ είναι χαρακτηριστικός των ηλεκτρικών οργάνων των Torpedo και Electrophorus και των μυϊκών κυττάρων εμβρύων θηλαστικών, ενώ ο συνδυασμός α 2 βεδ απαντάται στούς μύες των ενήλικων θηλαστικών. Η μεταστροφή τύπου του υποδοχέα που χαρακτηρίζει τα θηλαστικά, συνεπάγεται και μια σειρά αλλαγών στα μεταβολικά και φαρμακολογικά χαρακτηριστικά του, καθώς και στην αγωγιμότητα του ιοντικού καναλιού (Mishina et al., 1986; Schuetze, 1986). Αξίζει να σημειωθεί ότι στους εξωτερικούς οφθαλμικούς μύες των ενήλικων θηλαστικών εκφράζονται τόσο η γ όσο και η ε υπομονάδα (Horton et al., 1993). Εικόνα 2: Δομή του μυϊκού τύπου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης μεμβρανική διευθέτηση (τροποποιημένη από Wess, 1996) Τη δεκαετία 1970 αποτελέσματα ερευνών συσχέτισαν για πρώτη φορά την ανθρώπινη νόσο μυασθένεια με αυτοάνοση αντίδραση έναντι του νικοτινικού AChR στη νευρομυϊκή σύναψη (Patrick, and Lindstrom, 1973; Lindstrom et al., 1976a). 4

Έκτοτε ο μυϊκού τύπου υποδοχέας αποτέλεσε στόχο έντονης και μακροχρόνιας ερευνητικής προσπάθειας που συνεχίζεται ως και τις μέρες μας, με δεδομένο ότι η λεπτομερής ανάλυση και κατανόηση της δομής και λειτουργίας του, θα μπορούσε να προσφέρει σημαντικά, αφενός στην κατανόηση των χαρακτηριστικών και άλλων μελών της υπεροικογένειας και αφετέρου στη διαλεύκανση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη της μυασθένειας. 1.3.2 Ο νευρικού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Οι νευρικού τύπου AChRSs εκφράζονται ευρέως στο κεντρικό νευρικό σύστημα, στα περιφερικά γάγγλια, καθώς και σε μη διεγέρσιμα κύτταρα όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί εννέα διαφορετικές υπομονάδες νευρικού τύπου α (α2-α10) και τρείς υπομονάδες τύπου β (β2 - β4), προερχόμενες από διαφορετικά είδη, μεταξύ αυτών και ανθρώπινης προέλευσης (McGehee, and Role, 1995). Τα λειτουργικά μόρια των υποδοχέων σχηματίζονται με τη συμμετοχή υπομονάδων τύπου α και β αποκλειστικά και μπορεί να είναι ομο- ή ετεροπενταμερή, ενώ αξίζει να σημειωθεί πως δεν εμφανίζουν σταθερή σύσταση υπομονάδων, όπως συμβαίνει με το μυϊκού τύπου υποδοχέα. Η ταξινόμηση των υπομονάδων νευρικού τύπου σε α και β έγινε με κριτήριο την αμινοξική ομολογία που παρουσιάζει η κάθε υπομονάδα με τις αντίστοιχες υπομονάδες του υποδοχέα μυϊκού τύπου, ενώ η αρίθμηση των υπομονάδων αντικατοπτρίζει τη χρονική σειρά με την οποία αυτές απομονώθηκαν και αναλύθηκε η αμινοξική τους σύσταση. Η ύπαρξη πολλών και διαφορετικών τύπων του νευρικού υποδοχέα είναι αποτέλεσμα της ποικιλίας συνδυασμών μεταξύ των α και β υπομονάδων (Role, 1992). Με λειτουργικά κριτήρια, έγινε στη συνέχεια μια προσπάθεια να ταξινομηθούν οι νευρικού τύπου υποδοχείς βάσει των φαρμακολογικών τους ιδιοτήτων. Το αποτέλεσμα αυτής της προσπάθειας ήταν η διαίρεση των νευρικών υποδοχέων σε δυο τάξεις: α) στην τάξη της οποίας τα μέλη εμφανίζουν υψηλή συγγένεια για τον αγωνιστή (της τάξεως των nm), και δεν προσδένουν την α-μπουγκαροτοξίνη, ενώ αργότερα αποκαλύφθηκε ότι αυτοί οι υποδοχείς είναι ετεροπενταμερή σχηματιζόμενα από α2-α6 και από β2-β4 υπομονάδες και β) στην τάξη της οποίας τα μέλη εμφανίζουν χαμηλή συγγένεια για τον αγωνιστή (της τάξεως των μm) και προσδένουν ισχυρά την α- 5

μπουγκαροτοξίνη, ενώ δείχθηκε ότι συνήθως είναι ομοπενταμερή μόρια σχηματιζόμένα από α7-α9 υπομονάδες (Lindstrom, 2000). Η ποικιλία στις φυσιολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες των μελών της οικογένειας των νευρικού τύπου υποδοχέων, δικαιολογεί την εμπλοκή τους σε πολλές και διαφορετικές λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι ο έλεγχος των εκούσιων κινήσεων, η ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος, ο έλεγχος της έκκρισης νευροδιαβιβαστικών ουσιών, καθώς και η ρύθμιση πολύπλοκων ανώτερων πνευματικών διεργασιών, όπως η μνήμη, η μάθηση και η συμπεριφορά (Gotti et al., 1997). Οι νευρικού τύπου υποδοχείς έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε σειρά παθολογικών καταστάσεων και δυσλειτουργιών του νευρικού συστήματος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια και ορισμένοι τύποι επιληψίας, ενώ έχουν συσχετιστεί και με τον εθισμό στη νικοτίνη (Lindstrom, 1997). 1.3.2.1 Κατανομή του νευρικού τύπου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ο μυϊκού τύπου AChR, ο οποίος εμφανίζει σταθερή στοιχειομετρία, εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη του μετασυναπτικού νευρώνα στη νευρομυϊκή σύναψη. Η ποικιλία στη δομή των υποδοχέων νευρικού τύπου, δημιουργεί τις προϋποθέσεις για μια ευρύτατη κατανομή αυτών σε νευρικό αλλά και σε μη νευρικό ιστό. Με τη συνδρομή μιας σειράς μεθόδων, όπως είναι η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικών για κάθε υπομονάδα, σε συνδυασμό με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας και η εφαρμογή ραδιενεργά σημασμένων υποκαταστατών, έχουν ταυτοποιηθεί υπότυποι του υποδοχέα εκφραζόμενοι σε διαφορετικές περιοχές του νευρικού συστήματος. Βρέθηκε ότι υπομονάδες α4, α5, α6, β2 και β4, οι οποίες εκφράζονται στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες του μεσοραβδωτού (mesostriatal dopaminergic neurons), σχηματίζουν, αλληλεπιδρώντας μεταξύ τους, μια ποικιλία υποδοχέων, οι οποίοι διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στη ρύθμιση της έκκρισης της ντοπαμίνης (Champtiaux et al., 2003; Salminen et al., 2004). Οι υποδοχείς που αποτελούνται από την α7 υπομονάδα και είναι υπεύθυνοι για την πρόσδεση της α- μπουγκαροτοξίνης στο νευρικό σύστημα, χαρακτηρίζονται από ευρεία κατανομή, ενώ σε υψηλή συγκέντρωση είναι παρόντες στον ιππόκαμπο και κυρίως στους GABAεργικούς νευρώνες του (Breese et al., 1997; Chen, and Patrick, 1997; Kawai et al., 2002). Οι νευρικού τύπου υποδοχείς που περιέχουν την α8 υπομονάδα έχουν 6

αποκλειστικά εντοπιστεί στο νευρικό σύστημα του κοτόπουλου ως ομοπενταμερή ή σε συνδυασμούς με α7 υπομονάδες, ενώ οι περιέχοντες α9 υπομονάδες υποδοχείς εντοπίζονται στον κοχλία και στα αισθητικά γάγγλια του νευρικού συστήματος (Elgoyhen et al., 1994). Επιπλέον, η α10 υπομονάδα φαίνεται να λειτουργεί ως δομικό στοιχείο και συνδεόμενη με την α9 υπομονάδα συμμετέχει στο σχηματισμό λειτουργικών υποδοχέων στα μηχανοαισθητικά τριχοειδή κύτταρα του κοχλία (Elgoyhen et al., 2001; Plazas et al., 2005). Νευρικού τύπου υποδοχείς έχουν επίσης ανιχνευθεί και σε μη νευρικό ιστό στα θηλαστικά, όπως για παράδειγμα η ύπαρξη α7 υποδοχέα στα μακροφάγα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (Wang et al., 2003). 1.3.2.2 Φυσιολογικός ρόλος του νευρικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι νευρικού τύπου AChR συναντώνται σε πολλές περιοχές του εγκεφάλου και κατανέμονται σε προ-, περι-, και μετα-συναπτικές θέσεις (Lena et al., 1993; Wonnacott, 1997). Οι προ- και περι-συναπτικοί υποδοχείς λειτουργώντας ως αυτο- ή έτερουποδοχείς ρυθμίζουν την έκλυση σειράς σημαντικών νευροδιαβιβαστών, όπως η ακετυλοχολίνη, η ντοπαμίνη, η νορεπινεφρίνη, το γλουταμινικό οξύ, η 5- υδρόξυτρυπταμίνη και το γ-αμινοβουτυρικό οξύ σε διάφορες θέσεις στο Κ.Ν.Σ. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συναπτική απελευθέρωση συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή, σε διαφορετικές περιοχές του Κ.Ν.Σ, είναι δυνατόν να διαμεσολαβείται από διαφορετικό τύπο νευρικού AChR (Sher et al., 2004; Jensen et al., 2005). Εξαίρεση σε αυτό αποτελεί ο έλεγχος της απελευθέρωσης του γλουταμινικού οξέος που είναι αυστηρά ελεγχόμενος από υποδοχέα τύπου α7 (Sher et al., 2004). Οι μετασυναπτικοί νευρικού τύπου υποδοχείς πιθανόν εμπλέκονται στην ταχεία διεγερτική νευροδιαβίβαση στο Κ.Ν.Σ., αλλά γενικά θεωρούνται μειωμένης σημαντικότητας συγκριτικά με τους προσυναπτικούς και περισυναπτικούς νευρικούς υποδοχείς. Παρόλο που είναι δύσκολος ο εντοπισμός στον εγκέφαλο θέσεων όπου η απελευθέρωση ACh παράγει ταχείες μετασυναπτικές αποκρίσεις, εντούτοις έχει πιστοποιηθεί η παρουσία μετασυναπτικών α7, α4β2 και α3β4 νευρικών υποδοχέων σε τέτοιες θέσεις σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου (Levy, and Aoki, 2002; Sher et al., 2004). Η έκφραση ποικιλίας AChRs νευρικού τύπου κατά τα πρώιμα στάδια της εμβρυογένεσης, καθώς και η ύπαρξη ενός πρωτογενούς μηχανισμού που επιτρέπει τόσο τη σύνθεση ΑCh όσο και την απόκριση σ αυτή, μαρτυρούν ένα σημαντικό ρόλο της 7

χολινεργικής σηματοδότησης κατά τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του νευρικού συστήματος (Smith et al., 1979; Arenella et al., 1993; Corriveau, and Berg, 1993; Devay, and Role, 1994; Howard et al., 1995). Η συμμετοχή των νευρικού τύπου υποδοχέων στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων στα αρχικά αναπτυξιακά στάδια του οργανισμού, προτάθηκε με βάση την απόδειξη της ασβεστιοεξαρτώμενης ρύθμισης του γονιδίου c-fos που προκλήθηκε από την ενεργοποίηση νευρικού τύπου υποδοχέων σε κύτταρα PC12 (Greenberg et al., 1986). Οι νευρικού τύπου νικοτινικοί υποδοχείς της ΑCh θεωρείται ότι εμπλέκονται και στις γνωστικές διεργασίες, κυρίως λόγω της επίδρασης που εμφανίζονται να έχουν αγωνιστές και ανταγωνιστές των υποδοχέων αυτών στη διαδικασία της μάθησης και στη μνήμη. Η περιοχή του ιπποκάμπου στον εγκέφαλο, για την οποία πιστεύεται ότι αποτελεί περιοχή-κλειδί για την κωδικοποίηση και την ανάκληση πληροφοριών έχει αποκτήσει ιδιαίτερο επιστημονικό ενδιαφέρον με έμφαση στη δραστηριότητα των νευρικού τύπου AChRs που εντοπίζονται εκεί. Στην περιοχή του ιπποκάμπου έχουν εντοπιστεί τρείς τουλάχιστον λειτουργικά διακριτοί υπότυποι του υποδοχέα (α7, α4β2, α3β4) (Alkondon, and Albuquerque, 2004). Πέρα απο τον αδιαμφισβήτητο ρόλο των νευρικού τύπου υποδοχέων στο νευρικό σύστημα, έχει πιστοποιηθεί η έκφρασή τους και σε μη διεγέρσιμους κυτταρικούς τύπους, όπως είναι τα λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λιποκύτταρα, κερατινοκύτταρα, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και των πνευμόνων (Whaley et al., 1981; Sharma, and Vijayaraghavan, 2002; Gahring, and Rogers, 2005; Skok et al., 2006). Πειραματικά δεδομένα αποκαλύπτουν τη σημαντική συνεισφορά των νευρικού τύπου AChRs των μακροφάγων κυττάρων σε διαδικασίες καταστολής της φλεγμονώδους αντίδρασης (Borovikova et al., 2000) καθώς και τη συμμετοχή αντίστοιχων υποδοχέων των ενδοθηλιακών κυττάρων στην αύξηση των κυττάρων αυτών και στις διεργασίες της αγγειογένεσης, συμπεριλαμβανομένης και της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους (Heeschen et al., 2001, 2002). 1.4 Η δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 1.4.1 Η πρωτοταγής δομή του υποδοχέα Η πρόοδος της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA έκανε δυνατό τον προσδιορισμό των συμπληρωματικών αλυσίδων DNA (cdna) των γονιδίων των 8

διαφόρων υπομονάδων του AChR. Αρχικά έγινε ο προσδιορισμός των cdna αλληλουχιών των υπομονάδων α, β, γ, και δ του υποδοχέα από το Torpedo (Noda et al., 1982, 1983a, b; Claudio et al., 1983). Έπειτα τα παραπάνω μόρια cdna χρησιμοποιήθηκαν ως ιχνηθέτες για την απομόνωση cdna και γενομικού DNA που κωδικοποιούν για τις μυϊκού και νευρικού τύπου υπομονάδες του υποδοχέα από διάφορα είδη οργανισμών, μεταξύ των οποίων και του ανθρώπου (Claudio, 1989). Σήμερα είναι γνωστές οι νουκλεοτιδικές και αμινοξικές ακολουθίες των διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα σε μια πληθώρα ειδών. Η διαλεύκανση της πρωτοταγούς δομής των τεσσάρων υπομονάδων του υποδοχέα απο το Torpedo californica (α, β, γ και δ) και η σύγκριση μεταξύ τους στο επίπεδο των 56 αμινο-τελικών αμινοξέων, κατέδειξε ένα σημαντικό ποσοστό ομολογίας της τάξεως του 35-50%, που μαρτυρά πως πρόκειται για εξελικτικά συγγενείς πρωτεΐνες (Raftery et al., 1980; Noda et al., 1983β). Παρόμοια ποσοστά ομολογίας αμινοξικών καταλοίπων μεταξύ των διαφορετικών υπομονάδων καταγράφηκαν και σε άλλα είδη όπως και στον άνθρωπο (Nef et al., 1986). Η σύγκριση αμινοξικών αλληλουχιών της ίδιας υπομονάδας μεταξύ διαφορετικών ειδών κατέδειξε ακόμα υψηλότερα ποσοστά ομολογίας. Έτσι η μυϊκού τύπου α1 υπομονάδα βρέθηκε να εμφανίζει περίπου 80% ομολογία μεταξύ ανθρώπου και Torpedο (Hucho et al., 1996). Υψηλά είναι επίσης τα ποσοστά ομολογίας τόσο στην περίπτωση σύγκρισης μεταξύ υπομονάδων νευρικού τύπου μέσα στο ίδιο είδος και μεταξύ διαφορετικών ειδών, όσο και κατά τη σύγκριση μεταξύ υπομονάδων νευρικού με άλλες μυϊκού τύπου (Sargent, 1993). Για παράδειγμα, αναφέρεται πως η α7 νευρικού τύπου ανθρώπινη υπομονάδα, παρουσιάζει περίπου 93% ομολογία με την αντίστοιχη υπομονάδα προερχόμενη από κοτόπουλο και 97% ομολογία με εκείνη από αρουραίο. Τα παραπάνω σημαντικά ποσοστά ομολογίας ενισχύουν την άποψη περί ύπαρξης κοινού προγονικού γονιδίου από το οποίο προήλθαν μέσω εξελικτικών διεργασιών όλα τα γονίδια που σήμερα κωδικοποιούν για τις διάφορες υπομονάδες του υποδοχέα. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των υπομονάδων του υποδοχέα (μυϊκού και νευρικού τύπου) αποτελεί η ύπαρξη δυο αυστηρά συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, τα οποία αντιστοιχούν στις κυστεΐνες των θέσεων 128 και 142 της α υπομονάδας του Torpedo. Αυτές οι δυο κυστεΐνες ενώνονται μεταξύ τους με δισουλφιδική γέφυρα σχηματίζοντας έτσι μια θηλιά 15 αμινοξικών καταλοίπων (Stroud et al., 1990). Τα παρεμβαλλόμενα αμινοξέα είναι συντηρημένα και στο συνολό τους εμφανίζουν σε σημαντικό βαθμό υδρόφοβο χαρακτήρα. Η σχηματιζόμενη θηλιά 9

εμφανίζεται συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες των υποδοχέων ιοντικών καναλιών (Ortells, and Lunt, 1995). Για το λόγο αυτό τα διάφορα μέλη της υπεροικογένειας ονομάζονται εναλλακτικά και υποδοχείς Cys-θηλειάς (Karlin et al., 1995). Οι α υπομονάδες του υποδοχέα διαθέτουν ένα επιπλέον ζεύγος γειτονικών καταλοίπων κυστεΐνης, τα οποία συνδέονται με έναν ασυνήθιστο δισουλφιδικό δεσμό. Τα κατάλοιπα αυτά αντιστοιχούν στις κυστεΐνες των θέσεων 192 και 193 της υπομονάδας α του Torpedo (Kao et al., 1986). Κάποιες υπομονάδες φέρουν στο αμινοτελικό εξωκυτταρικό τους άκρο επιπλέον κατάλοιπα κυστεΐνης για τα οποία δεν έχει αποσαφηνιστεί εάν συμμετέχουν στο σχηματισμό κάποιου ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού. Από ένα κατάλοιπο κυστεΐνης έχει βρεθεί στις α1, δ, ε και α7 υπομονάδες, ενώ τρία κατάλοιπα εντοπίστηκαν στη γ υπομονάδα. Στην αμινοτελική εξωκυτταρική περιοχή όλων των επιμέρους υπομονάδων υπάρχουν επίσης θέσεις γλυκοζυλίωσης, των οποίων το πλήθος και η περιοχή εντοπισμού ποικίλουν μεταξύ των διαφόρων υπομονάδων. Στον ανθρώπινο υποδοχέα οι α1 και β1 υπομονάδες διαθέτουν μοναδική θέση γλυκοζυλίωσης, οι γ, δ, ε, α3 και β2 από 2 θέσεις, οι α2, α5, α7 και β3 από τρεις θέσεις και η β4 διαθέτει τέσσερις θέσεις γλυκοζυλίωσης (Mattson, and Heilbronn, 1975). Έχει δειχθεί πως οι αλυσίδες των ολιγοσακχαριτών έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε μαννόζη, ενώ κάποιες περιέχουν σιαλικό οξύ (Nomoto et al., 1986; Poulter et al., 1989; Shoji et al., 1992; Strecker et al., 1994). Σχετικά νωρίς έγινε γνωστό ότι στο συνολό τους οι υπομονάδες του AChR διαθέτουν εξωκυτταρικές και ενδοπλασματικές περιοχές. Η ανάλυση του διαγράμματος υδροφοβικότητας της α υπομονάδας του Torpedo στήριξε την αρχική πρόβλεψη για τη διαμεμβρανική τοπογραφία των διαφόρων υπομονάδων (Strader et al., 1979; Noda et al., 1983b; Devillers-Thiery et al., 1983; Finer-Moore, and Stroud, 1984). Η σημαντική αμινοξική ομολογία των επιμέρους υπομονάδων και μια σειρά επιπλέον πειραματικών μελετών οδήγησαν στην υιοθέτηση του μοντέλου αυτού για όλες τις υπομονάδες και σήμερα θεωρείται πως τόσο οι μυϊκές, όσο και οι νευρικές υπομονάδες εμφανίζουν το ίδιο πρότυπο υδροφοβικότητας-υδροφιλικότητας. Σύμφωνα με το κοινό αυτό πρότυπο κάθε υπομονάδα αποτελείται από τέσσερις μικρές υδρόφοβες περιοχές Μ1-Μ4 (με μήκος περίπου 15-20 αμινοξέα η καθεμιά) και από δυο μεγάλου μήκους υδρόφιλες περιοχές. Η μεγαλύτερη εξ αυτών έχει μήκος περίπου 210 αμινοξέα, εντοπίζεται στο αμινο-τελικό άκρο των υπομονάδων και εμφανίζεται αρκετά συντηρημένη. Η μικρή υδρόφιλη περιοχή, εκτεινόμενη μεταξύ των περιοχών Μ3 και Μ4 ποικίλει στη σύσταση 10

και στο μέγεθός της μεταξύ των διαφόρων υπομονάδων. Στη μικρή υδρόφιλη περιοχή εντοπίζονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης των υπομονάδων (Finer-Moore, and Stroud, 1984; Yee, and Huganir, 1987). Και τα δυο άκρα κάθε υπομονάδας είναι υδρόφιλα και εντοπίζονται εξωκυτταρικά (το μικρό καρβόξυ-τελικό άκρο έχει μήκος 4-28 κατάλοιπα) (DiPaola et al., 1989). Αυτό το διαμεμβρανικό μοντέλο περιγράφει ικανοποιητικά τις υπομονάδες όλων των υποδοχέων της υπεροικογένειας των ιοντικών καναλιών (Schofield et al., 1987; Karlin et al., 1995). 1.4.2 Η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του υποδοχέα Για τη μελέτη της δευτεροταγούς δομής των υπομονάδων του AChR χρησιμοποιήθηκαν μια σειρά από τεχνικές, μεταξύ των οποίων υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR), κυκλικός διχροϊσμός (CD), και συντονισμός Raman (Hucho et al., 1996). Οι παραπάνω μελέτες έγιναν κυρίως σε παρασκευάσματα Torpedo υποδοχέα. Σχετικά με τα ποσοστά της δευτεροταγούς διαμόρφωσης, έτσι όπως αποτυπώθηκαν κατά την εφαρμογή των διαφορετικών αναλυτικών προσεγγίσεων, παρατηρήθηκαν αποκλίσεις, αφενός διότι οι τεχνικές αυτές είναι μη συγκρίσιμες και αφετέρου γιατί σε καθεμιά χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικής φύσεως παρασκευάσματα υποδοχέα. Πιο συγκεκριμένα, σε κάποιες σχετικές μελέτες χρησιμοποιήθηκε υποδοχέας διαλυτοποιημένος σε απορρυπαντικό, ενώ σε κάποιες άλλες υποδοχέας δεσμευμένος στη μεμβράνη. Φασματοσκοπικές μελέτες έδειξαν ότι το μεγαλύτερο τμήμα του AChR αποτελείται από περιοχές με δομή α-έλικας και άλλες με δομή β-πτυχωτής επιφάνειας. Η εφαρμογή της τεχνικής FTIR έδειξε πως ο υποδοχέας αποτελείται από δομές α-έλικας σε ποσοστό 32-33%, από β-πτυχωτές επιφάνειες σε ποσοστό 36-43%, ενώ κατά το υπόλοιπο μοιράζεται μεταξύ β-στροφών (ποσοστό 14-24%) και τυχαίων αναδιπλώσεων (Naumann et al., 1993). Σχετικά με τα διαμεμβρανικά τμήματα των υπομονάδων του υποδοχέα, αρχικά επικράτησε η άποψη ότι αυτά είχαν σχεδόν αποκλειστικά δομή α-έλικας (Noda et al., 1983b; Devillers-Thiery et al., 1983; Finer-Moore, and Stroud, 1984). Η εφαρμογή ηλεκτρονικής μικροσκοπίας δισδιάστατων κρυστάλλων σε ανάλυση 9Ǻ αποκάλυψε αργότερα ότι το διαμεμβρανικό τμήμα του υποδοχέα περιλαμβάνει δακτύλιο 5 α- ελίκων, περιβαλλόμενο από πλαίσιο β-πτυχωτών επιφανειών, έτσι ώστε η προκύπτουσα σύνθετη δομή να προσομοιάζει σε βαρέλι (Unwin, 1993). Οι παραπάνω 5 α-έλικες συγκροτούν τον πόρο του ιοντικού καναλιού, ενώ σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες 11

θεωρήθηκε ότι αντιστοιχούν στις Μ2 περιοχές των υπομονάδων (Hucho et al., 1996; Imoto et al., 1988; Leonard et al., 1988). Η ηλεκτρονιακή πυκνότητα των περιοχών που γειτνιάζουν με τις Μ2 έλικες έδειξε πως δεν έχουν δομή α-έλικας και το δεδομένο αυτό οδήγησε στο συμπέρασμα πως οι διαμεμβρανικές περιοχές των υπομονάδων Μ1, Μ3 και Μ4 είναι οργανωμένες σε β-πτυχωτές επιφάνειες. Η διαμόρφωση των διαμεμβρανικών περιοχών του υποδοχέα σε α-έλικες και β-πτυχωτές επιφάνειες επιβεβαιώθηκε και από τα αποτελέσματα φασματοσκοπικών μεθόδων (Görne- Tschelnokow et al., 1994). Μια σειρά πειραμάτων ομοιοπολικής τροποποίησης αμινοξικών καταλοίπων του διαμεμβρανικού τμήματος, σε συνδυασμό με προϋπάρχοντα δεδομένα οδήγησαν στο συμπέρασμα πως το ποσοστό δομών α-έλικας στη διαμεμβρανική περιοχή είναι μικρότερο του 100% που θεωρήθηκε αρχικά και μεγαλύτερο από 25% που προβλέφθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε ανάλυση 9Ǻ (Claudio et al., 1983; Noda et al., 1983b; Devillers-Thiery et al., 1983; Unwin, 1993). Νεότερα πειραματικά δεδομένα, όπως προέκυψαν από ηλεκτρονική μικροσκοπία σε ανάλυση 4Ǻ, αποκάλυψαν πως οι διαμεμβρανικές περιοχές των υπομονάδων δομούνται από 4 τμήματα με διαμόρφωση α-έλικας και μικρές συνδετικές θηλιές. Τα τμήματα με τη δομή α-έλικας των 5 υπομονάδων διατάσσονται συμμετρικά και σχηματίζουν δύο δακτυλίους. Οι α-έλικες των Μ2 περιοχών διαμορφώνουν τον εσωτερικό δακτύλιο που περικλείει το στενότερο σημείο του πόρου του ιοντικού καναλιού. Οι α-έλικες (15 στο σύνολο) των περιοχών Μ1, Μ3, και Μ4 αναδιπλώνονται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε σχηματίζουν έναν εξωτερικό προστατευτικό δακτύλιο (Miyazawa et al., 2003). Σχετικά με το αμινοτελικό εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων, διαφορετικές αναλυτικές προσεγγίσεις όπως το διάγραμμα υδροφοβικότητας και η εφαρμογή ηλεκτρονικής μικροσκοπίας κατέληξαν σε αντίστοιχες διαπιστώσεις. Σύμφωνα με τα δεδομένα αυτά η συγκεκριμένη περιοχή περιλαμβάνει κατά κύριο λόγο β-πτυχωτές επιφάνειες και διαθέτει επιπλέον και τρία τμήματα με δομή α-έλικας. Οι τρεις α-έλικες εμφανίζονται σε σύμπλεγμα, περιελισσόμενες μεταξύ τους και αυτή η περιέλιξη πιστεύεται ότι σχηματίζει κοιλότητα που πιθανόν να αποτελεί την περιοχή πρόσδεσης της ACh (Unwin, 1993). Νεότερες μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξαν ότι οι θέσεις δέσμευσης της ACh περιβάλλονται από επτά περιελιγμένες δομές με β- διαμόρφωση (Miyazawa et al., 1999). 12

1.4.3 Η τεταρτοταγής δομή του υποδοχέα Όπως είναι γνωστό η ακριβέστερη μέθοδος ανάλυσης και προσδιορισμού της τρισδιάστατης δομής ενός μορίου είναι η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Για τον AChR, δεν κατέστη μέχρι σήμερα δυνατή η ανάλυση του με τη μέθοδο αυτή, αφού δεν έχει επιτευχθεί η λήψη καλής ποιότητας κρυστάλλων του. Εντούτοις, πληροφορίες που αφορούν στην τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης έχουν εξαχθεί με την εφαρμογή της μεθόδου της ηλεκτρονικής κρυσταλλογραφίας (ηλεκτρονική μικροσκοπία σε συνδυασμό με φασματοσκοπία περίθλασης ακτίνων Χ) σε δισδιάστατους κρυστάλλους υποδοχέα από Torpedo (Mitra et al., 1989). Η πενταμερής δομή του υποδοχέα αρχικά αποδείχθηκε με την ποσοτική ανάλυση της αλληλουχίας του υποδοχέα του Torpedo και ήταν σε συμφωνία με τα συμπεράσματα που προηγήθηκαν και προέκυψαν από αναλύσεις βάσει μοριακών βαρών (Reynolds, and Karlin, 1978; Lindstrom et al., 1979; Raftery et al., 1980). Από τις πρώτες εφαρμογές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας για τη διαλεύκανση της δομής του υποδοχέα (διακριτική ικανότητα 17Ǻ), φάνηκε ότι και οι πέντε υπομονάδες του μορίου διατάσσονται κανονικά γύρω από έναν κεντρικό άξονα, προσδίδοντας στο μόριο σχετική πενταγωνική συμμετρία. Η συνολική διάμετρος του υποδοχέα και του διαύλου του προσδιορίστηκε περίπου ίση με 85Ǻ (Toyoshima, and Unwin, 1990). Από την ίδια μελέτη προέκυψε ότι ο πόρος εμφανίζεται ευρύτερος στις περιοχές εκατέρωθεν της μεμβράνης και στενεύει στο εσωτερικό της μεμβρανικής λιπιδικής διπλοστιβάδας, ενώ ο ιοντικός δίαυλος εκτείνεται και πέραν της επιφάνειας της μεμβράνης, στον εξωκυτταρικό χώρο (Εικόνες 3, 4). Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε ανάλυση 9Ǻ, συστοιχίας υποδοχέων σε μεμβρανικά θραύσματα απομονωμένα από ηλεκτρικά όργανα του Torpedo, έδειξαν ότι ο υποδοχέας έχει σχεδόν κυλινδρικό σχήμα, με τις πέντε υπομονάδες του να περιβάλλουν το ιοντικό κανάλι. Η μέση διάμετρος είναι περίπου 65Ǻ, στην εξωκυτταρική και διαμεμβρανική περιοχή και αρκετά μικρότερη στην κυτταροπλασματική πλευρά της μεμβράνης. Το ολικό μήκος του μορίου είναι περίπου 120-125Ǻ και ο υποδοχέας προεξέχει κατά 60Ǻ πρός τη συναπτική πλευρά, ενώ διεισδύει κατά 20Ǻ στο κυτταρόπλασμα. Στο επίπεδο της μεμβράνης η εξωτερική διάμετρος του πενταμερούς μορίου είναι 80Ǻ και η διάμετρος του πόρου περίπου 20-25Ǻ (Unwin, 2003). 13

ΙΟΝΤΙΚΟ ΚΑΝΑΛΙ ΜΟΡΙΟ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ACh ΡΑΨΙΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Εικόνα 3: Ηλεκτρονική μικροσκοπία διαμήκους τομής τμήματος μεμβράνης πλούσιας σε υποδοχείς ακετυλοχολίνης από το ηλεκτρικό όργανο του Torpedo. Διακρίνονται, η διατομή ενός μεμονωμένου μορίου υποδοχέα και πάνω σε αυτόν, το ιοντικό κανάλι και η περιοχή πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης. Στην κυταροπλασματική πλευρά του μορίου διακρίνεται η ραψίνη. Η περιβάλλουσα φωσφολιπιδική διπλοστιβάδα παρουσιάζεται σκιαγραφημένη (τροποποιημένο από Unwin, 1993) Από την επεξεργασία των στοιχείων της ανάλυσης του υποδοχέα στα 9Ǻ προέκυψαν αρκετές πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του, τόσο στην κλειστή, όσο και στην ανοιχτή διαμόρφωση. Σύμφωνα πάντα με αυτές τις αναλύσεις, το εξωκυτταρικό τμήμα του μορίου έχει ανώμαλη επιφάνεια, ενώ η επιφάνεια που σχηματίζει το τοίχωμα του καναλιού είναι λεία. Το ιοντικό κανάλι που μεταφέρει το μηνυματοφόρο σήμα στο εσωτερικό του κυττάρου-στόχου σχηματίζεται από τα διαμεμβρανικά τμήματα των υπομονάδων, έχει διάμετρο 20-25Ǻ στην είσοδο του από τη συναπτική επιφάνεια της μεμβράνης και στενεύει κατά μήκος της διαμεμβρανικής περιοχής, προσεγγίζοντας διάμετρο περίπου 7-8Ǻ. Αναλυτικότερες πληροφορίες για την οργάνωση της δομής συλλέχθησαν από την πρόσφατη ανάλυση στα 4Ǻ. Με βάση τα στοιχεία από τη μελέτη αυτή, σε κάτοψη του υποδοχέα στην περιοχή της συναπτικής σχισμής, ο εξωτερικός δακτύλιος που 14

σχηματίζεται από τις Μ1, Μ3 και Μ4 περιοχές καλύπτεται από τις περιοχές πρόσδεσης των υποκαταστατών του μορίου. Σε αυτή την ανάλυση αποσαφηνίζεται ότι μόνο οι α- έλικες των Μ2 διαμεμβρανικών περιοχών, που σχηματίζουν τον εσωτερικό δακτύλιο, εκτίθενται στα διερχόμενα από το κανάλι ιόντα (Miyazawa et al., 2003). ΘΕΣΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ACh Μεγάλη υδρόφιλη περιοχή Εικόνα 4: Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Ο υποδοχέας έχει σχήμα περίπου κυλινδρικό. Οι πέντε υπομονάδες του, οι οποίες παρουσιάζονται με τη μορφή κυλίνδρων, είναι διευθετημένες κανονικά γύρω από ένα κεντρικό άξονα, σχηματίζοντας μια δομή με σχετική πενταγωνική συμμετρία. Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια μεγάλη υδρόφιλη αμινοτελική εξωκυτταρική περιοχή και τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4), οι οποίες παρουσιάζονται επίσης με τη μορφή κυλίνδρων (τροποποιημένο από Changeux, 1993) Είναι σκόπιμο να σημειωθεί ότι μαζί με τον υποδοχέα, από τις μεμβράνες του Torpedo, απομονώνεται και μια περιφερική μεμβρανική πρωτεΐνη, σε στοιχειομετρία 1:1. Η πρωτεΐνη αυτή έχει μοριακό βάρος 43kDa και ονομάστηκε ραψίνη (rapsyn από τα αρχικά των λέξεων receptor associated protein of the synapse), ενώ έχει προταθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη συνάθροιση και αγκυροβόληση του υποδοχέα στη μεμβράνη, καθώς και στη σύνδεσή του με στοιχεία του κυτταροσκελετού (Εικόνα 3) (Sealock, 1982; LaRochelle, and Froehner, 1986; Frail et al., 1988; Froehner et al., 1990; Phillips et al., 1991, 1993; Apel et al., 1995). Έχει πραγματοποιηθεί σειρά μελετών με στόχο τον προσδιορισμό της ακριβούς διευθέτησης των πέντε υπομονάδων περιμετρικά του πόρου του ιοντικού καναλιού. Σε σχέση με τον μυϊκού τύπου υποδοχέα, αρχικές μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, απέκλεισαν την περίπτωση οι δυο α υπομονάδες να είναι γειτονικές, άποψη που 15

ενισχύεται και από τη φυσιολογική αδυναμία που εμφανίζουν οι α υπομονάδες να συνδέονται μεταξύ τους (Schiebler, and Hucho, 1980; Wise et al., 1981). Συναφείς μελέτες απέκλεισαν επίσης την πιθανότητα μια δ υπομονάδα να βρίσκεται μεταξύ δυο α υπομονάδων (Wise et al., 1981). Συνεκτιμώντας τα παραπάνω δεδομένα, οι πιθανές διατάξεις μπορεί να είναι αβαγδ ή αγαβδ και οι κατοπτρικές αυτών. Ορισμένες κρυσταλλογραφικές μελέτες σε κρυστάλλους του Torpedo και πειράματα διασύνδεσης με τη χρήση νευροτοξινών και φωτοενεργοποιημένων παραγώγων τους, υποστήριξαν σθεναρά τη δομή αβαγδ (Hamilton et al., 1985; Kubalek et al., 1987; Chatrenet et al., 1990). Μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κατάδειξαν τη δομή αγαβδ ως την πιθανότερη (Wise et al., 1981; Holtzman et al., 1982; Karlin et al., 1983). Με δεδομένα, την πενταγωνική συμμετρία του υποδοχέα και το γεγονός ότι οι δυο θέσεις πρόσδεσης της ACh δε μπορεί να σχηματίζονται ανάμεσα στις υπομονάδες α και β, το μοντέλο που θεωρείται σήμερα πιθανότερο να ισχύει είναι το αγαβδ (Kurosaki et al., 1987; Blound, and Merlie, 1989; Pedersen, 1990; Sine, and Claudio, 1991). Σήμανση με διαφορετικά φωτοενεργοποιημένα παράγωγα της α-νευροτοξίνης κατέδειξε τη διάταξη αlγαηβδ, αντίθετα πρός τη φορά των δεικτών του ωρολογίου, σε κάτοψη του υποδοχέα από την πλευρά της συναπτικής σχισμής, ως την πιθανότερη κατοπτρική εικόνα για τη διάταξη αγαβδ. L: low, είναι η υπομονάδα με τη χαμηλότερη συγγένεια για το μόριο της ACh και H: high, είναι η υπομονάδα με την υψηλότερη συγγένεια για τον προσδέτη (Machold et al., 1995). Όσον αφορά στη δομή του υποδοχέα νευρικού τύπου, ελάχιστα είναι μέχρι σήμερα γνωστά. Ορισμένα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν μια πενταμερή δομή και για τους νευρικού τύπου υποδοχείς, χωρίς όμως να είναι γνωστές όλες οι πιθανές στοιχειομετρίες και η διευθέτηση των υπομονάδων γύρω από το ιοντικό κανάλι. 16

1.5 Η λειτουργία του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 1.5.1 Οι συνάψεις και η νευροδιαβίβαση μέσω των συνάψεων Η ταχεία επικοινωνία μεταξύ των νευρώνων και των κυττάρων με τα οποία αυτοί αλληλεπιδρούν επιτυγχάνεται χάρη στην ύπαρξη των συνάψεων. Σε κάθε σύναψη διακρίνουμε τρία κύρια λειτουργικά στοιχεία: το προσυναπτικό άκρο, που είναι ουσιαστικά η νευρική απόληξη του προσυναπτικού νευρώνα, τη συναπτική σχισμή και το μετασυναπτικό άκρο, το οποίο είναι περιοχή του μετασυναπτικού κυττάρου. Με βάση τη μορφολογία τους διακρίνονται σε ηλεκτρικές και χημικές συνάψεις. Στις ηλεκτρικές συνάψεις, το προσυναπτικό και το μετασυναπτικό κύτταρο βρίσκονται σε στενή επαφή μεταξύ τους (μεσοδιάστημα περίπου ίσο με 3,5 nm), ώστε ουσιαστικά καταργείται η συναπτική σχισμή. Το ηλεκτρικό δυναμικό ενέργειας στον προσυναπτικό νευρώνα μεταφέρεται άμεσα στο μετασυναπτικό κύτταρο, επάγοντας την εκεί μετάδοση της ώσης. Η επικοινωνία των αλληλεπιδρώντων κυττάρων στην περίπτωση αυτή επιτυγχάνεται μέσω χασματοσυνδέσεων που γεφυρώνουν τα κυτταροπλάσματά τους. Η έννοια της συναπτικής σχισμής αποκτά νόημα στην περίπτωση των χημικών συνάψεων που είναι και οι πολυπληθέστερες στην ομοταξία των σπονδυλωτών. Στην περίπτωση αυτή το εύρος της κυμαίνεται μεταξύ 20 και 40nm. Στις χημικές συνάψεις η αγωγή του σήματος γίνεται με τη μεσολάβηση χημικών μηνυματοφόρων μορίων που ονομάζονται νευροδιαβιβαστές. Η μεταβολή του ηλεκτρικού δυναμικού της κυτταρικής μεμβράνης του προσυναπτικού κυττάρου, οδηγεί στην απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή από την απόληξη του κυττάρου στη συναπτική σχισμή. Τα μόρια του νευροδιαβιβαστή προσδένονται σε ειδικά μόρια-υποδοχείς της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου. Συνήθως η πρόσδεση του νευροδιαβιβαστή επάγει το άνοιγμα ιοντικών διαύλων και την είσοδο ιόντων με επακόλουθο τη γένεση δυναμικού ενεργείας στο μετασυναπτικό κύτταρο (Kandel et al., 1995). Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης αποτελούν οι ίδιοι λειτουργικά στοιχεία των ιοντικών καναλιών ή αλληλεπιδρούν με άλλους μεμβρανικούς υποδοχείς (έμμεση δράση) και το αποτέλεσμα της ενεργοποιησής τους μπορεί να είναι διεγερτικό ή ανασταλτικό. Το αποτέλεσμα της συναπτικής δράσης (διέγερση ή αναστολή στο μετασυναπτικό κύτταρο) δεν εξαρτάται από το νευροδιαβιβαστή, αλλά από τη φύση και τη δράση του μετασυναπτικού υποδοχέα. Έτσι ο ίδιος νευροδιαβιβαστής μπορεί να επιφέρει 17

διαφορετικό αποτέλεσμα κατά τη δράση του σε διαφορετικού τύπου υποδοχείς (Kandel et al., 1995). 1.5.2 Η νευρομυϊκή σύναψη Έχουν πραγματοποιηθεί αναλυτικές και εκτενείς μελέτες της διαβίβασης μέσω συνάψεων, στη νευρομυϊκή σύναψη των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών, γνωστή διαφορετικά και ως τελική κινητική πλάκα. Η τελική κινητική πλάκα αποτελείται από εξειδικεύσεις της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου, από την απόληξη του κινητικού νευρώνα και από κύτταρα Schwann (Peper et al., 1974). Η απόληξη του νευράξονα υποδιαιρείται σε διακλαδώσεις με πάχος 2μm που βρίσκονται σε μια επιμήκη κοιλότητα κατά μήκος της επιφάνειας της μυϊκής ίνας. Η μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου που καλύπτει την παραπάνω κοιλότητα σχηματίζει πολλαπλές αναδιπλώσεις, γνωστές ως μετασυναπτικές πτυχές. Ακριβώς απέναντι από αυτές τις αναδιπλώσεις η προσυναπτική μεμβράνη εμφανίζει περιοχές με μικρή πάχυνση, τις ενεργές ζώνες, πάνω από τις οποίες συσσωρεύονται τα συναπτικά κυστίδια (Εικόνα 5). Η απόληξη του νευράξονα περιέχει πλήθος μιτοχονδρίων τα οποία εξασφαλίζουν την ενέργεια που απαιτείται για τη σύνθεση του νευροδιαβιβαστή ACh. Τα μόρια της ACh σχηματίζονται αρχικά στο κυτταρόπλασμα της απόληξης και έπειτα προσροφώνται στο εσωτερικό των συναπτικών κυστιδίων. Κάθε συναπτικό κυστίδιο περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα του νευροδιβιβαστή, περίπου 10 4 μόρια (Kuffler, and Yoshikami, 1975). Η άφιξη δυναμικού ενεργείας στην απόληξη του προσυναπτικού νευρώνα ενεργοποιεί τα κανάλια ασβεστίου που υπάρχουν εκεί και τα ιόντα ασβεστίου (Ca 2+ ) εισέρχονται στη νευρική ίνα. Η αύξηση της συγκέντρωσης των Ca 2+ οδηγεί στην εξωκύττωση των κυστιδίων που περιέχουν ACh (Heuser et al., 1979). Το περιεχόμενο των κυστιδίων απελευθερώνεται στη συναπτική σχισμή και ο νευροδιαβιβαστής δεσμεύεται στους υποδοχείς του στις μετασυναπτικές πτυχές της μυϊκής μεμβράνης. Η αλληλεπίδραση της ACh με τα ιοντικά κανάλια οδηγεί στο άνοιγμα των καναλιών, επιτρέποντας έτσι την παθητική μεταφορά ιόντων από και πρός το μυϊκό κύτταρο (έξοδος ιόντων καλίου και είσοδος ιόντων νατρίου) με κινητήρια δύναμη την επικρατούσα ηλεκτροχημική κλίση. 18