ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ - ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ -ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ. Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών

ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ - ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ -ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών

Νέα κύτταρα προκύπτουν μόνο από άλλα ζωντανά κύτταρα μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται κυτταρική διαίρεση. Με τον τρόπο αυτό αμέτρητες διαιρέσεις ενός κυττάρου του ζυγωτού- δημιουργούν ένα οργανισμό εκπληκτικής πολυπλοκότητας και οργάνωσης. Οι κυτταρικές διαιρέσεις δεν σταματούν βέβαια με το σχηματισμό του ώριμου ατόμου αλλά συνεχίζονται σε όλη του τη ζωή. Υπολογίζεται ότι κάθε δευτερόλεπτο περίπου 25 εκατομύρια κύτταρα (από τα 10 13 ) διαιρούνται στον ανθρώπινο οργανισμό προκειμένου να αντικατασταθούν νεκρά ή και γηρασμένα κύτταρα. Το κύτταρο σε ένα ώριμο οργανισμό θα μπορούσε να θεωρηθεί σαν ένα σταθερό σύστημα το οποίο αν και αλλάζουν κάθε στιγμή οι πρωτεΐνες που συντίθενται μέσω αλλαγών στο mrna το κύτταρο παραμένει ανεπηρέαστο και ισσοροπημένο αφού ούτε μεγαλώνει ούτε συρικνώνεται ούτε αλλάζει τις λειτουργίες του. Στη πραγματικότητα όμως αυτή η στατική αντιμετώπιση παραβλέπει όλη τη δυναμική της ζωής των κυττάρων αφού αυτά μάχονται συνεχώς ενάντια σε ένα περιβάλλον που αυθόρμητα οδηγείται σε αταξία, όπως άλλωστε καθορίζεται και από θερμοδυναμικούς νόμους. Στο περιβάλλον αυτό τα βιολογικά συστήματα προσπαθούν να επιβιώσουν αλλά τελικά κανένα φυσιολογικό κύτταρο δεν μπορεί να λειτουργεί για άπειρο χρόνο. Όπως διατυπώνει ο Schrodinger στοβιβλίοτου«τι είναι ζωή», το κύτταρο έχει να πολεμήσει ενάντια στην αδιάκοπη τάση για αποσύνθεση των συστατικών του που προκαλείται με την αδιάκοπη θερμική κίνησή τους. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της συνεχούς παραγωγή ενέργειας.

Η διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης διακρίνεται στο στάδιο της μίτωσης (mitosis, πυρηνική διαίρεση) και στο στάδιο της κυτταροκίνησης (cytοkinesis, διαίρεση κυτταροπλάσματος). Πριν φτάσει όμως το κύτταρο στη φάση της μίτωσης θα πρέπει πρώτα να γίνει αύξηση των συστατικών που θα μοιραστούν στα δύο κύτταρα, στην περίοδο του κυτταρικού κύκλου που ονομάζεται μεσόφαση.

Kυτταρική Διαίρεση

Τρεις γενικές κατηγορίες κυττάρων μπορούν να αναγνωριστούν σε έναν οργανισμό 1. Κύτταρα με εξαιρετική δομική εξειδίκευση όπως είναι τα νευρικά κύτταρα, τα μυϊκά κύτταρα ή τα ερυθροκύτταρα που έχουν χάσει τη δυνατότητα διαιρέσεων (μετα-μιτωτικά κύτταρα, post-mitotic cells). Τα κύτταρα αυτά από τη στιγμή που θα διαφοροποιηθούν παραμένουν σε αυτή την κατάσταση μέχρι να πεθάνουν.

2. Κύτταρα τα οποία δεν διαιρούνται υπό κανονικές συνθήκες αλλά που μπορεί να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο αν διεγερθούν κατάλληλα. Για παράδειγμα τα κύτταρα του συκωτιού μπορεί να αρχίσουν να διαιρούνται μετά από χειρουργική επέμβαση αφαίρεσης τμήματος του συκωτιού, ενώ τα λεμφοκύτταρα μπορεί να αρχίσουν να διαιρούνται μετά από αλληλεπίδραση με το κατάλληλο αντιγόνο. 3. Τέλος στον οργανισμό υπάρχουν και κύτταρα τα οποία διατηρούν τη δυνατότητα σχετικά υψηλών επιπέδων μιτωτικής ενεργότητας. Στη κατηγορία αυτή ανήκουν κύτταρα ιστών με έντονη ανάγκη ανανέωσης όπως τα κύτταρα των γονάδων (ωογόνια και σπερματογόνια) από τα οποία προκύπτουν οι γαμέτες, τα βλαστοκύτταρα από τα οποία προκύπτουν τα λευκά και ερυθρά αιμοσφαίρια αλλά και τα επιθηλιακά κύτταρα από τα οποία περιγράφουν τις σωματικές κοιλότητες και τις επιφάνειες του σώματος και διπλασιάζονται με μέσο χρόνο ~8 ώρες.

Ο κυτταρικός κύκλος στα προκαρυωτικά κύτταρα Στα προκαρυωτικά κύτταρα ο κυτταρικός κύκλος είναι σχετικά απλός και σύντομος. Η αντιγραφή του DNA αρχίζει στο σημείο έναρξης διπλασιασμού το οποίο προσδένεται στη μεμβράνη (replication origin). Οταν αυτή η διαδικασία ολοκληρωθεί η αυτοσυγκρότηση μιας νέας μεμβράνης και ένος κυτταρικού τοιχώματος διαμορφώνει ένα septum που τελικά διαιρεί το κύτταρο στα δύο. Σε ιδανικές συνθήκες (διαθεσιμότητα τροφής) ο κύκλος διαρκεί περίπου 30 λεπτά και κάθε απόγονος παίρνει από ένα χρωμόσωμα καθώς αυτά είναι προσδεδεμένα σε διαφορετικά σημεία στη μεμβράνη. Μόνο λίγοι τύποι ευκαρυωτικών κυττάρων διπλασιαζονται τόσο γρήγορα όπως τα βακτήρια.

Ο κυτταρικός κύκλος στα ευκαρυωτικά κύτταρα G 2 Συμπύκνωση χρωμοσωμάτων Κατάρρευση πυρηνικού φακέλου ιαχωρισμός χρωμοσωμάτων M ΙΑΙΡΕΣΗ S Σύνθεση DNA 24 ΩΡΕΣ ΜΕΣΟΦΑΣΗ G 1 Κύτταρα Απόγονοι G 0 Aποτελείται από τη μεσόφαση και τη μίτωση (Μ) και εξελίσσεται συνεχόμενα για διάστημα 10-20 ώρων ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και τη φάση της ανάπτυξης. Η μεσόφαση διαιρείται στις φάσεις G 1, S και G 2 ενώ μεταξύ δύο κύκλων μεσολαβεί η μίτωση. Τα μη διαιρούμενα κύτταρα είναι δυνατόν να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να εισέλθουν στη φάση G 0 (κατάσταση ηρεμίας quiescent state) που χαρακτηρίζεται σαν φάση γενικευμένης αδράνειας. Από τη φάση G 0 μπορούν να ξαναμπούν στον κυτταρικό κύκλου παρουσία των κατάλληλων αναπτυξιακών παραγόντων (μιτογόνα). Όλα τα απαιτούμενα μακρομόρια συντίθενται σε όλη τη διάρκεια της μεσόφασης, έτσι ώστε η μάζα του κυττάρου περίπου διπλασιάζεται, ενώ ειδικότερα το DNA συντίθεται αποκλειστικά κατά τη φάση S. Κατά τη φάση G 2 το κύτταρο προετοιμάζεται για τη φάση Μ όπου τόσο το γενετικό υλικό όσο και τα υπόλοιπα συστατικά του κυττάρου μοιράζονται σε ίσα μέρη και το κύτταρο διαιρείται.

Μεσόφαση Πρόφαση Μετάφαση Τελόφααη Ανάφαση Μεσόφαση Τομές Φωτονικήςμικροσκοπίαςσε κύτταρα φυτικού ιστού όπου διακρίνεται η κυτταρική οργάνωση κατά τη μεσόφαση και η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων κατά τη μίτωση.

Πατρικό κύτταρο στη φάση G 1 (2n) ιπλασιασμός DNA Μιτωτική άτρακτος Πατρικό κύτταρο στη φάση G 2 (4n) Χρωματίδες Κύτταρο Μετάφασης Σημείο μετάπτωσης Ανάφαση-Μετάφαση Κύτταρο Ανάφασης Κυττοκίνηση Η κυτταρική διαίρεση. Κάθε κύτταρο στη φάση G1, έχει δύο αντίγραφα από κάθε χρωμόσωμα (2n) ένα μητρικό (κόκκινο) και ένα πατρικό (μπλε). Τα χρωμοσώματα διπλασιάζονται στη φάση S οπότε το γενομικό υλικό ανέρχεται σε 4n. Στη μέση της μίτωσης (μετάφαση) τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα ευθυγραμμίζονται και παραμένουν στη θέση τους στο κέντρο του κυττάρου με τη βοήθεια της μιτωτικής ατράκτου. Στη συνέχεια όλα τα όμοια χρωμοσώματα κινούνται σε αντίθετες κατευθύνσεις στο κύτταρο, η πυρηνικήμεμβράνη επαναδημιουργείται γύρω από κάθε ομάδα χρωμοσωμάτων και τελικά κατά τη φάση της κυττοκίνησης το κύτταρο διαιρείται σε δύο γενετικά πανομοιότυπα κύτταρα απογόνους. Κύτταρα απόγονοι (2n)

Φωτονιογραφίες Ζωϊκού κυττάρου σε διάφορες φάσεις τις κυτταρικής διαίρεσης μετά από ανοσοφθορισμό Μετάφαση Ανάφαση Πρόφαση Χρώσεις: Χρωμοσώματα (μπλε) Μικροσωλισκοί (πράσινο) Ινίδια ακτίνης (κόκκινο)

Αριθμός κυττάρων G 1 G 2 0 1 2 Ποσότητα DNA/κύτταρο S Με τη βοήθεια ενός διαχωριστή κυττάρων ενεργοποιούμενου με φθορισμό (Fluorescent Activated Cell Sorter; FACS) είναι δυνατή η ανάλυση ενός κυτταρικού πληθυσμού όσον αφορά τον αριθμό των κύτταρων που περιέχουν μια δεδομένη ποσότητα DNA. Τα κύτταρα επωάζονται με μια ουσία που φθορίζει όταν προσδεθεί στον DNA οπότε η ποσότητα του φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας DNA ανά κύτταρο. Τρεις κατηγορίες κυττάρων παρατηρούνται σε ένα τυπικό διάγραμμα μιας τέτοιας ανάλυσης. Αυτά που δεν έχουν διπλασιάσει το DNA τους (1 μονάδα φθορισμού) και προφανώς βρίσκονται στη φάση G1, αυτά που έχουν διπλάσια ποσότητα DNA (2 μονάδες φθορισμού) και είναι στη φάση G 2 και M και τέλος σε αυτά που έχουν μια ενδιάμεση ποσότητα DNA καιείναιστηφάσηs. Το γεγονός ότι μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων είναι στη φάση G1 σημαίνει ότι αυτή η φάση του κυτταρικού κύκλου διαρκεί περισσότερο.

Διαλογέας κυττάρων ενεργοποιούμενος με φθορισμό Το DNA των κυττάρων σημαίνεται με ειδικές φθορίζουσες ουσίες π.χ. ιωδιούχο προπίδιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια περνούν από μια δέσμη Laser όπου ελέγχονται όσον αφορά στην ποσότητα φθορισμού που φέρουν. Αν φθορίζουν παίρνουν αρνητικό φορτίο ενώ σε αντίθετη περίπτωση φορτίζονται θετικά. Στη συνέχεια διοχετεύονται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο ~ 2.000 Volt όπου και διαχωρίζονται σε ειδικά δοχεία συλλογής αναλόγως του φορτίου τους. Ειδικοί καταγραφείς καταγράφουν τον αριθμό των κυττάρων ανά περίπτωση.

Φάση G 1 Φάση S Φάση G 2 Α G1 24 ώρες S G2 M 1/10 X 24 ώρες =2.4 ώρες 16 Β G1 24 ώρες S G2 M 3/10 X 24 ώρες =7.2ώρες Ποσότητα 8 4 2 Γ 36 ώρες G1 S G2 M 3/20 X 36 ώρες =5.4 ώρες 0 8 16 24 Ώρες ΥπολογισμόςτηςδιάρκειαςτηςφάσηςΜμε μέτρηση του «μιτωτικού δείκτη» δηλαδή του ποσοστού των κυττάρων που εμφανίζουν φάσεις μίτωσης (1/10Χ24, 2.4 ώρες). Υπολογισμός της φάσης S με αυτοραδιογραφία. Μετά από επώαση με 3 Η-Thy, διαπιστώνεται το ποσοστό των κυττάρων που συνθέτουν DNA (εδώ 3 κύτταρα στα 10) και από αυτό υπολογίζεται η διάρκεια της φάσης (π.χ. 3/10Χ24, 7.2 ώρες).

Η μετάβαση από τη μια φάση στην άλλη προαπαιτεί κάποιες συνθήκες που είναι απαραίτητες προκειμένου να ξεπεραστεί η αναστολή σε κάποια σημεία ελέγχου (check points) όπου ελέγχεται για παράδειγμα η ακριβής αντιγραφή του DNA ή η παρουσία θρεπτικών μέσων. Όταν οι συνθήκες αυτές ικανοποιούνται το κύτταρο προχωρά στο επόμενο σημείο ελέγχου, μέχρι τελικά να διαιρεθεί και να προκύψουν δύο κύτταρα που περιέχουν ένα πανομοιότυπο αντίγραφο γενετικού υλικού με το μητρικό κύτταρο. Ολες αυτές οι διαδικασίες πυροδοτούνται από ένα κεντρικό σύστημα ελέγχου. Δύο είναι τα πιο σημαντικά σημεία όσον αφορά τη δυνατότητα ελέγχου της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και αυτά αφορούν την έναρξη διπλασιασμού του DNA (G1 S) και την έναρξη της μίτωσης (G2 M). Ειδικότερα το τέλος της φάσης G1 ονομάζεται περιοριστικό σημείο (σημείο R) γιατί όποιο κύτταρο έχει περάσει απ' αυτό προχωρεί στην επόμενη φάση ανεξάρτητα απ' τις συνθήκες του περιβάλλοντος (π.χ. απουσία μιτογόνων).

Σημεία ελέγχου του Κυτταρικού κύκλου (check points)

Σημεία ελέγχου του Κυτταρικού κύκλου (check points) ιπλασιάστηκε όλο το DNA? Είναι το περιβάλλον ευνοϊκό? Είναι το μέγεθος του κυττάρου ικανοποιητικό? Βλάβη στο DNA (G 2 ) Πρόφαση: Υψηλά Επίπεδα MPF G 2 Μη διπλασιασμένο DNA (S) M ΕΛΕΓΚΤΗΣ S Είναι όλα τα χρωμοσώματα ευθυγραμμισμένα στην άτρακτο? Μη φυσιολογική Μιτωτική άτρακτος (Μ) G 1 ΕΚΚΙΝΗΣΗ (R) Βλάβη στο DNA (G 1 ) Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται από πολλαπλά σημεία ελέγχου (check points) τόσο κατά τη μεσόφαση όσο και κατά τη μίτωση. Στα σημεία αυτά ελέγχονται μια σειρά από παραμέτρους που σχετίζονται με τη δραστηριότητα που λαμβάνει χώρα σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου όπως για παράδειγμα η παρουσία μιτογόνων, ή βλαβών στο DNA στο σημείο G 1 S, η ακεραιότητα του διπλασιασμένου DNA μετά το τέλος της S φάσης, ή η σωστή διαμόρφωση της μιτωτικής ατράκτου κατά τη μίτωση. Ο εντοπισμός βλαβών από τον ελεγκτή οδηγεί σε αναστολή εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Είναι το μέγεθος του κύτταρου αρκετά μεγάλο? Είναι το περιβάλλον ευνοϊκό? Μπορεί το DNA να διπλασιαστεί με ασφάλεια?

Σημεία ελέγχου του Κυτταρικού κύκλου (check points)

Μοριακός μηχανισμός (βασίζεται σε ενεργότητα πρωτεϊνικής κινάσης) που ελέγχει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου Ολοένζυμο Συμπλέγματος Κινάσης Εξαρτώμενης από κυκλίνη Cdk-Cyc Σύνδεση Cdk με διαφορετικές Cycs Καταλυτικη υπομονάδα (Κινάση εξαρτώμενη από κυκλίνη-cdk) Ρυθμιστική υπομονάδα (Κυκλίνη-Cyc) Φωσφορυλίωση διαφορετικών πρωτεϊνών Βασίζεται κατά κύριο λόγο σε μια οικογένεια κινασών (ετεροδιμερή) που αποτελούνται από μια ρυθμιστική υπομονάδα (κυκλίνη-cyc) και μια καταλυτική υπομονάδα (κυκλινοεξαρτώμενη κινάση-cdk). Η ενεργοποιημένη μορφή της κινάσης μπορεί να φωσφορυλιώσει (και να ενεργοποιήσει) διάφορα υποστρώματα. Στους μύκητες η ίδια Cdk μπορεί να συνδεθεί με διάφορες Cyc.

Παράλληλα, κατά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα είναι δυνατόν να μαρκάρουν είτε κάποιους ειδικούς αναστολείς των διαφόρων γεγονότων του κυτταρικού κύκλου είτε τιςίδιεςτιςκυκλίνες(εναλακτικός μηχανισμός ρύθμισης της ενεργότητας των Cyc-Cdk συμπλόκων) προωθόντας έτσι την αποδόμηση τους στο πρωτεόσωμα. Όταν η συγκέντρωση της Cyc είναι χαμηλή η Cdk λόγω απώλειας της Cyc είναι ανενεργή και ενεργοποιείται μόνο όταν η συγκέντρωση της Cyc υπερβεί κάποια όρια. NH 2 NH 2 APC Πρωτεόσωμα Πρωτεόλυση COOH COOH Ρύθμιση σχετικής συγκέντρωσης κυκλινών μέσω αποδόσης στο πρωτεάσωμα Κουτί καταστροφής Ενεργότητα MPF Συγκέντρωση κυκλινών Σχετική συγκέντρωση κυκλινών και ενεργότητας MPF στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου G 1 S G 2 M

Οι ενεργότητες κινάσης που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο εστιάζονται κυρίως σε δύο σημεία, τα οποία είναι η μετάβαση μεταξύ των σταδίων G 1 -Sκαι μεταξύ των σημείων G 2 - Μ. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου σε κάθενα από τα σημεία αυτά απαιτεί την παροδική ενεργοποίηση μιας Cdk από μια ειδική Cyc. Σε κάθε φάση δε η ενεργοποίηση οδηγεί στη φωσφορυλίωση μιας σειράς υποστρωμάτων. Για παράδειγμα στο σημείο G 1 S φωσφορυλιώνται κάποιοι μεταγραφικοί παράγοντες απαραίτητοι για την αντιγραφή του DNA. Στο σημείο G 2 M φωσφορυλιώνται κάποιοι άλλοι παράγοντες όπως η ιστόνη Η1 η φωσφορυλίωση της οποίας ίσως βοηθάστησυμπύκνωσητωνχρωμοσωμάτωνκαιηπυρηνικήλαμίνητηςοποίαςηφωσφορυλίωση οδηγεί στη διάλυση του πυρηνικού φακέλου κατά τη μίτωση. Παράλληλα φωσφορυλιώνονται και μια σειρά από κυτταροπλασματικές πρωτεϊνες που συμμετέχουν στη δυναμική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού για τη μετάβαση από τη μεσόφαση στην μίτωση.

ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΤΑ ΤΗ ΜΕΣΟΦΑΣΗ Σ Ε ΚΑΤΩΤΕΡΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ πυρηνική διαίρεσηκυττοκίνηση X X G 1 G 2 M Κυτταρικός κύκλος στο σακχαρομύκητα G 1 Cdc2 + Cdc2 - Μεταλλαγές που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο στο σακχαρομύκητα Cdc2 D

Γενικά στους σακχαρομύκητες η ίδια Cdk (cdc2 στον S. pombe και Cdc28 στον S. cerevisiae) είναι ενεργή και στα δύο κύρια σημεία ελέγχου (check points) αλλά ενεργοποιείται από διαφορετικές Cyc σε κάθε ένα από τα δύο αυτά σημεία ελέγχου. Το πρώτο σημείο μετάπτωσης ονομάζεται ΕΚΚΙΝΗΣΗ (START, ή R) και βρίσκεται πριν το τέλος της G 1. Το πέρασμα από το START απαιτεί την ενεργοποίηση της Cdk από μια ή περισσότερες Cyc της φάσης G 1 ενώ αντίθετα το πέρασμα από το σημείο G 2 Μ απαιτεί ενεργοποίηση της Cdk από άλλες μιτωτικές Cyc. Ειδικότερα η συγκέντρωση των Cyc κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλεται συνεχώς λόγω αλλαγών στους ρυθμούς σύνθεσης και αποδόμοσης τωνμορίωναυτών. Ενα από τα σημαντικά υποστρώματα των συμπλόκων Cdk-Cyc κατά τη μετάβαση G 1 S είναιτοσύμπλοκοπρόωθησηςτηςανάφασης(apc). Το σύμπλοκο αυτό έχει ενεργοποιηθεί κατά την ανάφαση της μίτωσης (που έχει προηγηθεί) πιθανώς μέσω φωσφορυλίωσης από τον παράγοντα MPF. O ενεργοποιημένος APC στη συνέχεια κατευθύνει τη πολυουμπικιτινίωση και έτσι τη αποδόμηση μέσω πρωτεασώματος του αναστολέα της ανάφασης, του αναστολέα των κυκλινών τύπου Β και κάποιων συστατικών της μιτωτικής ατράκτου. Η φωσφορυλίωση του APC από τα σύμπλοκα Cdk-Cyc απενεργοποιεί το μόριο στην όψιμη G 1. Παράλληλα κατά τη φάση αυτή επάγεται η πρωτεόλυση του παράγοντα Sic1 που αποτελεί ισχυρό αναστολέα της S-φάσης. Τα κύτταρα μπαίνουν στη φάση S όταν ο Sic1 αποδομείται ταχύτατα λόγω ουμπικιτινίωσης από ένα διακριτό ένζυμο που ονομάζεται SCF.

Cdk-CycEs (MPF) Σύνθεση DNA Cdk-CycEs S σύνθεση DNA Cdk-CycDs APC (απενεργοποίηση) G 2 Σχηματισμός μιτωτικής ατράκτου Cdk-CycAs ιέγερση μίτωσης/ ιαίρεση πυρήνα Ενεργοποίηση APC M Πρώιμη G 1 Μέση-Όψιμη G 1 START Cdk-CycCs Ολοκλήρωση μίτωσης/ Απενεργοποίηση MPF Cdk-CycB Σχετική μεταβολή της συγκέντρωσης των κυκλινών και των ενεργών συμπλόκων κινασών (μεγάλα βέλη) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (και συνδέονται με συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα) στο σακχαρομύκητα. Οι ονομασίες των Cyc σαν A, B, C κτλ είναι αυθαίρετη. Πρωτεόλυση Sic1 Μεταγραφή CycCs, CycDs

Καθώς τα κύτταρα ολοκληρώνουν το διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων τους και μπαίνουν στη φάση G 2 ενεργοποιούνται μια σειρά από άλλες Cyc που δρούν σαν μιτωτικές κυκλίνες και συδέονται με τη Cdk προκειμένου να δημιουργήσουν τα σύμπλοκα που απαιτούνται για τον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων και τη διαίρεση του πυρήνα. Είναι λοιπόν φανερό ότι κάθε ομάδα κυκλινών κατευθύνει την ενεργότητα κινάσης της Cdk σε ειδικές ανά φάση του κυτταρικού κύκλου λειτουργίες. Η είσοδος ενός κυττάρου στη μίτωση πυροδοτείται από την ενεργοποίηση μιας κινάσης που ονομάζεται MPF (maturation promoting factor ή Μ phase kinase) που όπως και τα υπόλοιπα σύμπλοκα αποτελείται από δύο υπομονάδες (μια Cdk και μια Cyc). Ειδικότερα η Cdk συνδέεται με μια μιτωτική κυκλίνη (Cyc) προκειμένου να δημιουργηθεί ένα διμερές που είναι ισοδύναμο του MPF. ΕπιπλέοντηςρύθμισηςαπότιςCyc όμως η ενεργότητα της Cdk του MPF παράγοντα ελέγχεται και από τη κατάσταση φωσφορυλίωσης της που στο σακχαρομύκητα ρυθμίζεται από τουλάχιστον δύο κινάσες (Weel, CAK) και μια φωσφατάση (cdc25) όπου η Wee1 και η cdc25 δρουν σαν ανταγωνιστές απενεργοποιώντας ή ενεργοποιώντας τη cdk αντίστοιχα. Ο ανταγωνισμός αυτός είναι κρίσιμος για την έναρξη της μίτωσης αφού καθώς τα κύτταρα μπαίνουν στη μίτωση η ενεργότητα της Wee1 πέφτει ενώ της Cdc25 ενισχύεται έχοντας σαν αποτέλεσμα την περαιτέρω ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk-Cyc (MPF). Είναι σαφές πάντως ότι εκτός από τις μεταβολές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης κάποιων μορίων οι σημαντικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου(έναρξη της φάσης S και της ανάφασης και η έξοδος από τη μίτωση) ελέγχονται και μέσω ρυθμιζόμενης πρωτεόλυσης που κατευθύνεται από ειδικά σύμπλοκα ουμπικιτινίωσης (όπωςγιαπαράδειγμααυτάτων Cdk-APC ή Cdk-SCF).

ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΤΑ ΤΗ ΜΕΣΟΦΑΣΗ Σ Ε ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Σε αντίθεση με τους σακχαρομύκητες όπου σε όλα τα στάδια φαίνεται να δρα ο η ίδια cdk (cdc2 ή Cdc28), στα θηλαστικά η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντικά πιό πολύπλοκη αφούμέχριτώραστακύτταρααυτάέχουναπομονωθείαρκετέςτόσοcyc όσο και Cdks που φαίνεται να συμμετέχουν ενεργά στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Εδώ βέβαια η σύνδεση Cyc-cdk είναι ειδική και μόνο συγκεκριμένοι συνδυασμοί συμπλόκων Cyc-Cdk απαντώνται Οι κύριες Cdks έχουν ονομαστεί 1, 2, 3 στη βάση της σειράς απομόνωσης τους. Η Cdk1 είναι η ομόλογη της cdc2, ενώ η Cdk2 εμφανίζει μεγάλη ομολογία με την cdc28. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ούτε οι Cyc ούτε οι Cdks εκφράζονται (παράγονται) απουσία μιτογόνων γεγονός που δικαιολογεί την απουσία διπλασιασμού κυττάρων που βρίσκονται σε φάση G 0. Η προσθήκη μιτογόνων σε κύτταρα θηλαστικών που βρίσκονται στη φάση G 0 επάγει την προώθηση του κυτταρικού κύκλου μέσω της ενεργοποίησης πολλαπλών γονιδίων που ομαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες. Σε αυτά τις πρώϊμης απόκρισης και σε αυτά της όψιμης απόκρισης (η ονοματολογία εξαρτάται από το πόσο γρήγορα ενεργοποιούνται τα γονίδια αυτά). Η επαγωγή των γονιδίων αυτών δεν μπλοκάρεται απο αναστολείς πρωτεϊνοσύνθεσης αφού οι μεταγραφικοί τους παράγοντες υπάρχουν ήδη στο κύτταρο οπότε μετά από το κατάλληλο σινιάλο από ένα αναπτυξιακό παράγοντα ενεργοποιούνται με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως για παράδειγμα φωσφορυλίωση.

Ταπιοπολλάαπόταπρώιμα ενεργοποιούμενα γονίδια κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες όπως είναι το c-fos ή τοc-jun τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν τη μεταγραφή των όψιμων γονιδίων. Μετά δε από μια αρχική κατακόρυφη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών αυτών που διαρκεί για περίπου 30 λεπτά η συγκέντρωση τους μειώνεται και παραμένει σε κάποιο μέσο επίπεδο για όσο χρόνο υπάρχουν σινιάλα από τα μιτογόνα. Σχετική ενεργότητα 15 10 5 c-fos c-myc 30 60 90 2 4 6 8 10 Προσθήκη ορού Εάν η συγκέντρωση των μιτογόνων για κάποιο λόγο μειωθεί η μεταγραφή των γονιδίων αυτών αναστέλλεται και δεδομένου ότι οι ήδη παραχθείσες πρωτεΐνες είναι ασταθείς η συγκέντρωση τους πέφτει γρήγορα. Έτσι αν το κύτταρο δεν έχει περάσει το σημείο START δεν ξεκινά το διπλασιασμό του DNA.

Ιοικοί ενεργοποιητές υποδοχέων Αναπτυξιακοί παράγοντες Υποδοχείς αναπτυξιακών παραγόντων Αντι-αποπτωτικά γονίδια Πρωτεϊνες μεταγωγής σήματος Ενδοκυττάριοι υποδοχείς Μεταγραφικοί παράγοντες Πρωτεΐνες ελέγχου κυτταρικού κύκλου Πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA Η έκφραση των όψιμων ενεργοποιούμενων γονιδίων προϋποθέτει την ύπαρξη των πρωϊμων πρωτεϊνών κάποιες από τις οποίες ειναι ο παράγων E2F, οι κυκλίνες τύπου D, η Cyc-E και οι Cdks 2-, 4- και 6-. Oι Cdks4, 6 και οι κυκλίνες τύπου D εκφράζονται πρώτες και μετά ακολουθούν οι Cyc- ΕκαιηCdk2. Ετσι κατά την διάρκεια της G1 η ποσότητα των D-τύπου κυκλινών αυξάνεται και τελικά οι πρωτεϊνες αυτες συνδέονται και ενεργοποιούν τις Cdk4 και Cdk6. Το πρώτο αυτό κύμα ενεργότητας κινασών που εξαρτάται από τις D κινάσες ακολουθείται στην όψιμη G1 από μια αύξηση στην ενεργότητα της Cdk2 που ακολουθείται από ενεργοποίηση των συμπλόκων Cdk2-CycE και Cdk2-CycA.

Cdk1-Cycs Α,B S Cdk2-CycA Μικρή ενεργότητα κινάσης M G 2 3-4 hrs 1hr 6-8 hrs 6-12 hrs Σημείο Περιορισμού G 1 Cdk2-CycΕ G 0 Cdks 4, 6- (5?) Cycs D1,2,3 E2F 4,5 Μεγάλη ενεργότητα κινάσης E2F 1,2,3 Ενεργότητα των συμπλόκωνκυκλινώνκαι κυλινο-εξαρτώμενων κινασών (τόξα) κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα θηλαστικών (τα οποία είναι δυνατόν να βρίσκονταν σε φάση G 0 και έχουν διεγερθεί μέσω μιτογόνων να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο). Το πλάτος των γραμμών (τόξα) απεικονίζει χονδρικά την ενεργότητα των συμπλόκων Cdk-Cyc που αναφέρονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα σκιασμένα βέλη στη φάση G 1 υποδεικνύουν την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας του μεταγραφικού παράγοντα E2F από το αντίστοιχο Cdk-Cyc σύμπλοκο.

ΔΡΑΣΗ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Αναπτυξιακός παράγοντας TGFβ RII RI RII RI Κινάση Α Κινάση Β Smad4 Smad3 Πρώιμα γονίδια Όψιμα γονίδια

Γενικά η προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου R (restriction point) εξαρτάται από την ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες απαιτούνται για την μεταγραφή αρκετών γονιδίων όπως είναι οι Cyc-Α,-Ε και Cdk2-, ενώ επιπλέον οι E2F ενεργοποιούνκαιταίδιατουςταγονίδια (αυτοενεργοποίηση). Η μεταγραφική ενεργότητα των E2F παραγόντων αναστέλεται είτε από τη πρόσδεση της πρωτεϊνης του ρετινοβλαστώματος (prb) είτε από την πρόσδεση δύο σχετίζομενων πρωτεϊνών των p107 και p130.

Το γεγονός που επιτρέπει την είσοδο του κυττάρου στη φάση S είναι η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνης Rb που καταλύεται κύρια από τα σύμπλοκα CycD-Cdk4 και CycD-Cdk6 στo μέσο της φάσης G 1 (βήμα ). Η φωσφορυλίωση αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την αποδέσμευση της μεταγραφικής ενεργότητας των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F από την ανενεργή κατασταλμένη μορφή του συμπλόκου prb-e2f. Ο E2F στη συνέχεια επάγει την παραγωγή των CycE και Cdk2 (βήμα ) και η δημιουργία του συμπλόκου CycΕ-Cdk2 καταλύει την περαιτέρω φωσφορυλίωση της prb (βήμα ). Το γεγονός αυτό αποτελεί και το καθοριστικό βήμα για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου R της G 1 S. Ο κυτταρικός κύκλος τώρα θα συνεχιστεί ακόμη και απουσία μιτογόνων. Η πρωτεϊνη Rb παραμένει φωσφορυλιωμένη στις φάσεις S, G2 και M από τα σύμπλοκα Cdk2-, Cdk1- με τις Cyc A, B, ενώ τελικά οι παράγοντες E2F αναστέλονται στη φάση M μέσω αποφωσφορυλίωσης της prb από τη φωσφατάση PP-1 (βήμα ). Η αποφωσφορυλίωσητηςprb επιτρέπει την πρόσδεση της στον E2F (βήμα ) επάγοντας έτσι την πλήρη καταστολή της μεταγραφικής του ενεργότητας μέχρι ναεμφανιστούνκαι πάλι οι κατάλληλες συνθήκες για να ξεκινήσει ένας νέος κυτταρικός κύκλος. Για τη σύνθεση του DNA απαιτείται η CycA αφού κύτταρα θηλαστικών που φέρουν μεταλλαγμένη CycA χάνουν την ικανότητα να συνθέτουν DNA. Η σύνθεσητηςcyca αρχίζει όταν τα κύτταρα πλησιάζουν το σημείο μετάβασης G1 S και συνοδεύεται με άμεση μετατόπιση της πρωτεϊνης στον πυρήνα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί πoια πρωτεΐνη παίζει το ρόλο της Sic1 στα θηλαστικά η οποία αναλογικά θα δρα σαν αναστολέας (μέχρι να αποδομηθεί εντελώς κατά την έναρξη της φάσης S) του συμπλόκου CycA-Cdk2.

Μοριακά γεγονότα που απαιτούνται για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο μετάπτωσης G 1 S μετά από ενεργοποίηση εισόδου στον κυτταρικό κύκλο παρουσία μιτογόνων G 2 M PP-1 S E2F G 1 E2F Απο-φωσφορυλίωση του prb πρόσδεση στον E2F Όμοια σε G 0 κύτταρα Rb ή p107, p130 E2F ΜΙΤΟΓΟΝΑ Κυκλίνη D Cdk4/6 Κυκλίνη E Cdk2 Φωσφορυλίωση του prb Αποδέσμευση του E2F Τα μιτογόνα μέσω διακριτών μονοπατιών μεταγωγής σήματος ενεργοποιούν τα σύμπλοκα κυκλινών-κινασών CycD-Cdk4, CycD-Cdk6 και CycΕ-Cdk2 τα οποία με τη σειρά τους φωσφορυλιώνουν την πρωτεϊνη prb που έχει προσδέσει τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας E2F (ή τις πρωτεϊνες p107, p130 που επίσης προσδένουν τους E2F παράγοντες) Η φωσφορυλίωση της prb έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων E2F που ενεργοποιούν στησυνέχειαταίδιατουςταγονίδια (αυτορύθμιση), τις κυκλίνες και τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες που εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση του prb αλλά και μια σειρά άλλων γονιδίων που συμμετέχουν στο διπλασιασμό του DNA επιτρέποντας έτσι την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο G 1 S. Η αποφωσφορυλίωση του E2F (από τη φωσφατάση PP-1) κατά το τέλος της μίτωσης έχει σαν αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής αύξησης μέχρι να παρουσιαστεί και πάλι το κατάλληλο ερέθισμα (παρουσία μιτογόνων).

ΗκύριαCdk κατά τη φάση G2 είναι η Cdk1 ενώ η είσοδος του κυττάρου στη μίτωση οφείλεται στην ενεργότητα MPF των συμπλόκων CycA-Cdk1 και CycB-Cdk1. Στα ανθρώπινα κύτταρα η CycΒ αρχικά συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμακαιμετάεισέρχεταιστονπυρήναακριβώς πριν τη κατάρρευση του στη πρώϊμη μίτωση. Ετσι η MPF ενεργότητα των συμπλόκων μπορεί να ελέγχεται όχι μόνο μέσω φωσφορυλίωσης-αποφωσφορυλίωσης αλλά και από το χρονισμό της εισόδου στον πυρήνα. Γενικά στα ανθρώπινα κύτταρα η είσοδος στη μίτωση ρυθμίζεται από μια σειρά από φωσφορυλιώσειςαποφωσφορυλιώσεις των συμπλεγμάτων Cdk1-CycA και Cdk1-CycΒ (πιθανώς στις φάσεις αυτές εμπλέκεται και η Cdk2). H πρόσδεση της Cdk1 στις CycΑ, Β και οι συνεπακόλουθες φωσφορυλιώσεις (Wee1, CAK) και αποφωσφορυλιώσεις (Cdc25) ρυθμίζουν τη μετάβαση G2 Μ αφού δομικές μελέτες στις ανθρώπινες πρωτεϊνες έδειξαν ότι η πρόσδεση της CycA στη Cdk1 και η τελική φωσφορυλίωση της Thr 161 προκαλούν μια σειρά από αλλαγές διαμόρφωσης που εκθέτουν το ενεργό κέντρο και τροποποιούν την επιφάνεια πρόσδεσης έτσι ώστε να εμφανίζει υψηλή συγγένεια για τα διάφορα υποστρώματα. Επιπλέον η κατευθυνόμενη μέσω APC (προωθεί την πρωτεόλυση μιτωτικών κυκλινών) πολυουμπικιτινίωση των CycΑ και CycΒ και η αποδόμηση τους στα πρωτεοσώματα (αρχικά της CycΑ κατά την μετάφαση, που ακολουθείται από την αποδόμηση της CycΒ) προκαλεί μια γρήγορη πτωση της ενεργότητας MPF επιτρέποντας την ολοκλήρωση της μίτωσης και την είσοδο του κυττάρου στον επόμενο κύκλο. Η αποδόμηση της Cyc-A και η γενική πτώση της συγκέντρωσης των Cyc και Cdk προς το τέλος της M ήστην πρώϊμη G 1 (ή ακόμη αν τα κύτταρα εισέλθουν στη φάση G 0 ) συμπίπτει με την αποφωσφορυλίωση της prb. Ετσι τα κύτταρα βγαίνουν από τη φάση Μ χωρίς μιτωτικές κυκλίνες (Α, Β) οι οποίες αν και στη συνέχεια συντίθενται και προσδένονται στη Cdk1 η πρόσδεση τους αυτή δεν αρκεί για να επάγει την ενεργοποίηση του συμπλόκου. Γενικά είναι φανερό ότι η ρύθμιση των ενδοκυττάριων επιπέδων των κυκλινών γίνεται είτε μεσω της μεταγραφικής τους ρύθμισης είτε μέσω πρωτεολύσης του αναστολέα τους είτε τέλος μέσω πρωτεόλυσης της ίδιας της κυκλίνης.

Κινάση Wee1 Tyr 15 Cdk1 Cyc-A,B ΑΝΕΝΕΡΓΗ Cdk1 Cyc-A,B Κινάση CAK Φωσφορυλίωση κινάσης Φωσφορυλίωση κινάσης Σύνδεση Κυκλίνης- Κινάσης Ενεργοποίηση Cdk1 Cyc-A,B Cdk1 Cyc-A,B Thr 161 ΑΝΕΝΕΡΓΗ Φωσφατάση Cdc25 Απο-φωσφορυλίωση κινάσης Αυτο-φωσφορυλίωση κυκλίνης Αποδόμησηση κυκλίνης Αποφωσφορυλίωση κινάσης Σύνθεση Κυκλίνης Rb πρόσδεση υποστρώματος Cdk1 Cyc-A,B ΕΝΕΡΓΗ Cdk1 Cyc-A,B MFP APC Η ενεργότητα της κινάσης της φάσης της μίτωσης (MPK ή MPF) (σύμπλοκο CycA ή B-Cdk1) ρυθμίζεται στα θηλαστικά (όπως και στον σακχαρομύκητα) μέσω φωσφορυλιώσεων (κινάσες Wee1, CAK) και αποφωσφορυριώσεων (φωσφατάση Cdc25) της Cdk1 και πρωτεϊνικής αποδόμησης των κυκλινών Α, Β κατά το τέλος της μίτωσης. Οι κινάσες που ενεργοποιούν το σύμπλοκο είναι αντίστοιχες με αυτές που έχουν βρεθεί στους μύκητες. Τα αμινοξέα που φωσφορυλιώνονται στην Cdk2 είναι η Tyr 15 και η Thr 161. Ο σχετικό χρονισμός για κάθε γεγονός δεν είναι ακόμη απόλυτα γνωστός.

Η καταστολή της ενεργότητας των συμπλόκων Cyc-Cdk (ενεργότητα κινάσης) και κατ επέκταση η περαιτέρω ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου επιτυγχάνεται μέσω αρνητικών ρυθμιστών στους οποίους περιλαμβάνονται ομάδες πρωτεϊνών μικρού (συνήθως) μοριακού βάρους που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι ειδκοί αυτοί αναστολείς δρούν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω πρόσδεσης τους στη Cyc), είτε παρεμποδίζοντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk. Οι CdkIs αποτελούνμέροςτωνμηχανισμώνανάδρασηςτωνκυττάρωνπουελέγχουντακατάσταση των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα κατά τον κυτταρικό, κύκλο όπως η αντιγραφή του DNA ή η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων. Η ανάλυση της πληροφορία αυτής στη συνέχεια καθορίζει αν ο κυτταρικός κύκλος θα συνεχιστεί. Κατά αυτήν την έννοια τα σημεία G 1 S και G 2 M είναι ζωτικής σημασίας όσον αφορά τους πρωταρχικούς ελέγχους των μηχανισμών ανάδρασης και αφορούν τη δέσμευση (που λαμβάνει χώρα κατά τη φάση G 1 ) για τον διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων και τη δέσμευση (που συμβαίνει στο τέλος της φάσης G 2 ) για την είσοδο στη μίτωση (δευτερεύων σημείο ελέγχου). Αν ένα κύτταρο εκτεθεί σε παράγοντες που προκαλουν βλάβες στο DNA το πέρασμα από το σημείο G 1 -S καθυστερεί μέχρι να διορθωθεί η βλάβη, ενώ αν διαπιστωθεί μη σωστός σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου ο κύκλος διακόπτεται κατά την ανάφαση.

Επαγωγέας Αναστολή ενεργότητας κινασών Aναστολέας Cdk (CdkI) ΑΝΑΣΤΟΛΗ της ενεργότητας κινάσης ΑΝΑΣΤΟΛΗ κυτταρικού κύκλου Η επιτυγχάνεται μέσω καταστολής της ενεργότητας κινάσης των συμπλόκων Cyc-Cdk. Μεταξύ των αρνητικών ρυθμιστών περιλαμβάνεται μια ομάδα από μικρού μοριακού βάρους πρωτεΐνες που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι αναστολείς αυτοί δρουν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω φυσικής τους αλληλεπίδρασης με την Cyc), είτε μπλοκάροντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk.

Οι CdkIs ομαδοποιούνται σε δύο οικογένειες: (1) Την οικογένεια ΙΝΚ4 (inhibitors of kinase 4) που αποτελείται από τέσσερα μέλη και ειδικότερα τις πρωτεϊνες p16 Ink4a, p15 Ink4b, p18 Ink4c και p19 Ink4d. (ή p14 ARF το ανθρώπινο ομόλογο γονίδιο) που αναστέλουν ειδικά τα σύμπλοκα CycD-Cdk4, CycD-Cdk6. (2) Την οικογένεια Cip/Kip που αποτελείται από τρία μέλη. Την p21 Cip1, την p27 Kip1 και την p57 Kip2. Οι πρωτεΐνες αυτές αναστέλουν ισχυρά τα σύμπλοκα των Cdk2-CycE και Cdk2-CycA κινασών ενώ παρότι έχει βρεθεί ότι τα σύμπλοκα CycD-Cdk όχι μόνο δεν επηρεάζονται αλλά και απαιτούν τις Cip/Kip πρωτεϊνες για σωστή αυτοσυγκρότηση δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι κάτω από συγκεκρίμενες συνθήκες οι Cip/Kip πρωτεϊνες μπορούν να αναστείλουν την ενεργότητα και των Cdk4-6/CycD.

Η ανακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κάποιο από τα σημεία ελέγχου συνδέεται με τη σύνθεση των CdkIs η οποία ενεργοποιείται ειδκά μέσω ειδικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που εντοπίζουν τις εν λόγω βλάβες. Βλάβη στο DNA ATM p53 Cyclin G άγνωστη λειτουργία p53 GADD45 IGF-BP3 Bax απόπτωση p21 MDM2 προσδένεται στο PCNA επιδιόρθωση DNA σινιάλα από μιτογόνους αναπτυξιακούς παράγοντες Cdk-Cyc, PCNA p14 ARF ATM Τα πιο πολλά τέτοια μονοπάτια μεταγωγής σήματος ελέγχονται από την πρωτεΐνη p53 (τον «φύλακα του γονιδιώματοσ»)

Δομής της πρωτεΐνης p53 Θέση ενεργοποίησης μεταγραφής Περιοχή πρόσδεσης στο DNA εξαρτώμενη από την ακολουθία στόχο Περιοχή πρόσδεσης στο DNA μη-εξαρτώμενη από την ακολουθία Ν I II III IV V C Πρόσδεση MDM2 Πρόσδεση E6, E1b Πρόσδεση SV40T Θέση τετραμερισμού Mdm2 αποδόμηση p53 αναστολή έκφρασης p21

Γήρανση

ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΠΡΩΪΜΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ

Γενετικός καθορισμός Χωρητικότητα μεταβολισμού Γενετική αστάθεια Γήρανση Απόκριση σε στρες Απόθεμα για τη διατήρηση της ζωής Γήρανση Γήρανση Επιγενετικές αλληλεπιδράσεις Περιβάλλον κατά την ανάπτυξη Εξωτερικό Εσωτερικό (ορμονικό) Περιβάλλον Ενήλικα -Βλάβες -Στρες -Ασθένειες Απορύθμιση Διαγραμματική απεικόνιση των φυσιολογικών συσχετισμών (δεν απεικονίζονται οι μοριακοί μηχανισμοί) που καθορίζουν τη γήρανση και τη μακροβιότητα στον άνθρωπο. Η χωρητικότητα του μεταβολισμού, η ικανότητα απόκρισης στο στρες αλλά και το περιβάλλον κατά την ανάπτυξη συνεισφέρουν στη δημιουργία του αρχικού αποθέματος για το υπόλοιπο της ζωής. Στη συνέχεια η δεδομένη γενετική αστάθεια (που καθορίζεται σε γονιδιακό επίπεδο) σε συνδυασμό με διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες έχει σαν αποτέλεσμα τη συσσώρευση γενετικών μεταβολών. Συμπερασματικά λοιπόν, η γήρανση είναι μια διαδικασία που εμπλέκεται σε όλα τα επίπεδα βιολογικής οργάνωσης και κατά αυτή την έννοια δεν είναι δυνατός ο διαχωρισμός μεταξύ κυτταρικών μεταβολών και γήρανσης σε επίπεδο οργανισμού.

Γήρανση Εξωκυττάρια Ουσία Γηρασμένος Ιστός Μετά-μιτωτικά Κύτταρα ιαιρούμενα Κύτταρα Φυσιολογική απώλεια κυττάρων (πληγές, τραυματισμοί, αιμοδυναμικό στρες) Αντικατάσταση κυττάρων- Κυτταρική διαίρεση Προοδευτική συσσώρευση γηρασμένων κυττάρων Μεταβληθέν κυτταρικό μικρο-περιβάλλον Η γήρανση των ανθρωπίνων ιστών είναι μια πολύπλοκη μη προγραμματισμένη διαδικασία (σε αντίθεση με την ανάπτυξη) στην οποία δεν συνεισφέρουν μόνο τα ενεργά διαιρούμενα κύτταρα, αλλά τόσο η συσσώρευση μεταβολών στην εξωκυττάρια ουσία όσο και η γήρανση των μετα-μιτωτικών (post-mitotic) κυττάρων (κύτταρα νευρικού συστήματος κτλ). Θεωρητική αλληλουχία γεγονότων που παρέχει μια πιθανή εξήγηση για την συνεισφορά ΑΚΓ στη γήρανση των ανθρωπίνων ιστών και τελικά στη γήρανση του οργανισμού. συνεισφορά της Γηρασμένος Ιστός

Αναδιπλασιαστική Κυτταρική Γήρανση

Κυτταροκαλλιέργειες ανθρώπινων ινοβλαστών

Early passage (young) Late passage (senescent) Human fibroblasts B-gal (-)( B-gal (+)

In vitro γήρανση ανθρωπίνων ινοβλαστών Αναδιπλασιαστική Γήρανση Πυρήνας Τελομερές Χρωμόσωμα

Ηλικία HPV E6/E7 Smooth muscle cells pd 16 pd 30 pd 46 pd 60 pd 88 kb Telomeres: (TTAGGG)n Human somatic cells: Loss of ~100bp/cell division Loss of telomeric ands Senescent cell Senescent cell Μη αντιστρεπτή αναστολή αύξησης

In Vitro: Replicative Senescence in Normal Cells Short telomeres correlate with replicative senescence

Πρώϊμη Κυτταρική Γήρανση λόγω στρες

Χαρακτηριστικά και γεγονότα επαγωγείς του φαινοτύπου της κυτταρικής γήρανσης (ΚΓ) ο οποίος χαρακτηρίζεται από μια μη αντιστρεπτή αναστολή του κυτταρικού κύκλου, αντοχή στην απόπτωση (σε μερικούς τύπους κυττάρων) και μεταβολές σε προϋπάρχουσες (λόγω διαφοροποίησης) κυτταρικές λειτουργίες. Ο φαινότυπος της Κυτταρικής Γήρανσης Μη αναστρέψιμη αναστολή αύξησης Μεταβαλλόμενες λειτουργίες Ογκογονικά/ μιτογόνα Αναδιαμόρφωση σινιάλα Μείωση χρωματίνης μήκους τελομερών Αντοχή σε απόπτωση Βλάβη DNA Ενεργότητα Ογκοκατασταλτικών Ο φαινότυπος της ΚΓ είναι δυνατόν να επαχθεί με μια ποικιλία σημάτων όπως η έκφραση διαφόρων ογκογονιδίων, η παρουσία μεγάλου αριθμού μιτογόνων σινιάλων, μεταβολές στη δομή της χρωματίνης, μείωση του μήκους των τελομερών, βλάβες στο DNA καθώς και υπερέκφραση συγκεκριμένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Ηπρωτεΐνηp53 απαιτείται για την απόκριση όσον αφορά την επαγωγή του φαινοτύπου της ΚΓ στις πιο πολλές αν όχι σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις. Μιααπότιςβιοχημικέςμεταβολέςπουχαρακτηρίζειταin vitro γηρασμένα κύτταρα είναι η θετική χρώση (βέλος β2) για SA-βgalactosidase σε ph 6.0.