Σεμινάριο στα ειδικά βιοχημείας Noncoded amino acids in protein engineering: Structure activity relationship studies of hirudin thrombin interaction Ομάδα 13: Ψαρρά Μαρίνα Α.Μ:1113201400169 Κουκούλη Ολγα Α.Μ:1113201300056 Πουλημένου Ευαγγελία Α.Μ:500106 Υπεύθυνος Καθηγητής : Κ.Βοργιάς Ημερομηνία παράδοσης :30/3/2018
Noncoded amino acids in protein engineering: Structure activity relationship studies of hirudin thrombin interaction Vincenzo De Filippis(1), Laura Acquasaliente(1), Giulia Pontarollo(1), Daniele Peterle(1) Author information : (1) Laboratory of Protein Chemistry, Department of Pharmaceutical & Pharmacological Sciences, University of Padua, Padua, Italy Abstract: The advent of recombinant DNA technology allowed to site- specifically insert, delete, or mutate almost any amino acid in a given protein, significantly improving our knowledge of protein structure, stability, and function. Nevertheless, a quantitative description of the physical and chemical basis that makes a polypeptide chain to efficiently fold into a stable and functionally active conformation is still elusive. This mainly originates from the fact that nature combined, in a yet unknown manner, different properties (i.e., hydrophobicity, conformational propensity, polarizability, and hydrogen bonding capability) into the 20 standard natural amino acids, thus making difficult, if not impossible, to univocally relate the change in protein stability or function to the alteration of physicochemical properties caused by amino acid exchange(s). In this view, incorporation of noncoded amino acids with tailored side chains, allowing to finely tune the structure at a protein site, would facilitate to dissect the effects of a given mutation in terms of one or a few physicochemical properties, thus much expanding the scope of physical organic chemistry in the study of proteins. In this review, relevant applications from our laboratory will be presented on the use of noncoded amino acids in structure activity relationships studies of hirudin binding to thrombin. C 2017 International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Volume 65, Number 1, Pages 69 80, 2018
Θέμα :Σχέσεις δομής- δραστικότητας και αλληλεπιδράσεις ιρουδίνης- θρομβίνης Εισαγωγή: Τα εργαλεία που διαθέτουμε για την μελέτη της πρωτεϊνικής λειτουργίας και σταθερότητας αυξάνονται συνεχώς με την εμφάνιση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, διευρύνοντας με αυτόν τον τρόπο, τις γνώσεις μας πάνω στην πρωτεϊνική μηχανική. Παρά την εξέλιξη όμως των εργαλείων αυτών και την συνεχή διεύρυνση του πεδίου εφαρμογής τους, παραμένει ακόμη άγνωστος ο τρόπος με τον οποίο η φύση έχει συνδυάσει σε 20 φυσικά κωδικοποιημένα αμινοξέα, διαφορετικές ιδιότητες (πολικότητα, τάση διαμόρφωσης, ικανότητα δέσμευσης υδρογόνου, υδροφοβικότητα), τις ιδιότητες δηλαδή που καθιστούν μια πρωτεΐνη λειτουργικά ενεργή. Βιολογικό ερώτημα : Η παρούσα ανασκόπηση άπτεται λοιπόν αυτού του ουσιώδους βιολογικού ερωτήματος.επιχειρεί δηλαδή να βρει τον τρόπο με τον οποίο θα αποδωθεί μία πιο λεπτομερής ποσοτική περιγραφή της φυσικοχημικής βάσης που οδηγεί μία πολυπεπτιδική αλυσίδα στην αποτελεσματική της αναδίπλωση σε μία λειτουργικά ενεργή και σταθερή διαμόρφωση, ενώ σε επόμενο στάδιο, σκοπεύει να συσχετίσει μονοσήμαντα την αλλαγή των ιδιοτήτων της πρωτεΐνης με την αλλαγή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων που προκαλούνται από την αντικατάσταση αμινοξέων. Μεθοδολογική Προσέγγιση για την επίλυση του προβλήματος : Από αυτή την άποψη, η ενσωμάτωση μη κωδικοποιημένων αμινοξέων με τροποποιημένες πλευρικές ομάδες, που επιτρέπουν τον λεπτό συντονισμό της δομής μιας πρωτεϊνικής θέσης, θα διευκολύνει την ανάλυση των επιδράσεων μιας δεδομένης μετάλλαξης σε μια ή περισσότερες φυσικοχημικές ιδιότητες. Γιατί χρησιμοποιήθηκε ; Η χρήση των μη κωδικοποιημένων αμινοξέων προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα στη μελέτη των μοριακών μηχανισμών: Πιο συγκεκριμένα, μας επiτρέπει την τοποειδική εισαγωγή, διαγραφή ή μετάλλαξη οποιουδήποτε αμινοξέος με υψηλή ακρίβεια σε κάθε δεδομένη πρωτεΐνη χωρίς να οδηγούμαστε σε αποδόμηση ή απωλεια λειτουργίας της πρωτεΐνης, λόγω του ότι τα τροποποιημένα αμινοξέα είναι σε μεγάλο βαθμό όμοια με τα αντίστοιχα φυσικά κατάλοιπα που θα αντικαταστήσουν στην αλυσίδα, (έχουν παρόμοιο μέγεθος και ιδιότητες ).
Επιπλέον, η δυνατότητα εισαγωγής μη κωδικοποιημένων αμινοξέων, με δομική και χημική ποικιλότητα σαφώς μεγαλύτερη από αυτή που επιτυγχάνεται με τα πρότυπα αμινοξέα, σε μια δεδομένη περιοχή πρωτεΐνης, θα βελτιώσει την κατανόηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων που υπαγορεύουν τη μοριακή αναγνώριση, η οποία μας οδηγεί σε καλύτερη κατανόηση αλλά και στην διευκρίνιση του κεντρικού ρόλου των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης συνδέτη και πρωτεΐνης πρωτεΐνης στη λειτουργία όλων των βιολογικών συστημάτων. Ωστόσο, η εκτεταμένη τους εφαρμογή στις μελέτες πρωτεΐνικής μηχανικής έγινε δυνατή με την χρήση των μεθόδων SPPS(σταδιακή χημική σύνθεση στερεάς φάσης, stepwisesolid- phasechemicalsynthesis). Η αποτελεσματικότητα των SPPSμεθόδων ήταν γενικά περιορισμένη από το μήκος της αλυσίδας οδηγώντας σε εκθετική μείωση στην απόδοση του τελικού προϊόντος, λόγω χρήσης σκληρών συνθηκών που οδηγούσαν σε αποδόμηση της πρωτεΐνης. Παράλληλα, άλλες στρατηγικές που κάνουν χρήση των μη κωδικοποιημένων αμινοξέων, όπως η ενζυμο- καταλυόμενη ημισύνθεση και οι βιοσυνθετικές μέθοδοι, που κάνουν χρήση αυξοτροφικών στελεχών βακτηρίων, εμφανίζουν χαμηλή τοποειδικότητα ενσωμάτωσης και έτσι η χρήση τους περιορίζεται μόνο στις περιπτώσεις όπου το νεοεισερχόμενο αμινοξύ έχει όμοια δομή με το φυσικό κατάλοιπο που θα αντικαταστήσει. Η βελτίωση των αντιδραστηρίων για SPPSμεθόδουςεπομένως, βοήθησε στο να μπορούμε να ενσωματώσουμε τοποειδικά και με υψηλές αποδόσεις σχεδόν οποιοδήποτε μη κωδικοποιημένο αμινοξύ, ακόμα και σε μακριές πολυπεπτιδικές αλυσίδες (50-90 αμινοξέα ) που προσεγγίζουν το μέγεθος μικρών πραγματικών πρωτεϊνών. Με αυτόν τον τρόπο, δίνεται η δυνατότητα για την χρήση των μεθόδων SPPS σε ευρεία εργαστηριακή κλίμακα και την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μεγάλες ποσότητες, με αποτέλεσμα την χρήση τους ως βιοθεραπευτικές. Πού εφαρμόστηκε ; Στο άρθρο παρουσιάζονται σχετικές εφαρμογές της πρωτεϊνικής μηχανικής με μη κωδικοποιημένα αμινοξέα, που στοχεύουν στην περαιτέρω μελέτη των σχέσεων δομής δραστικότητας (structure activity relationship, SAR) της αναστολής της θρομβίνης από την ιρουδίνη και στην παραγωγή καινούριων ισχυρών αναστολέων θρομβίνης που βασίζονται στην ιρουδίνη. Ø Θρομβίνη: Πρόκειται για μια πρωτεάση σερίνης που διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη διαδικασια της πήξης. Το ενεργό της κέντρο εντοπίζεται στη διεπιφάνεια δύο β- βαρελιών. Η αναγνώριση του υποστρώματος της θρομβίνης ρυθμίζεται από δύο Exosites. Εμφανίζει δύο λειτουργίες: o προ- πήκτικη δηλαδή μετατροπή ινωδογόνου σε ινώδες και ενεργοποίηση αιμοπεταλίων. o αντιπηκτική λειτουργία δηλαδή ενεργοποίηση της αντιπηκτικής πρωτεΐνης C. Ø Iρουδίνη: Αποτελεί ισχυρό αναστολέα της θρομβίνης και η δομή της αποτελείται από μία συμπαγής Ν- τελική περιοχή (αμινοξέα 1-47), διασυνδεδεμένη με τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς, και μια εύκαμπτη αρνητικά φορτισμένη C- τελική ουρά. Η Ν- τελική περιοχή της ιρουδίνης καλύπτει τη δραστική θέση της πρωτεάσης και συγκεκριμένα διεισδύει σε εξειδικευμένους θύλακες του ενζύμου μέσω των τριών πρώτων
αμινοξέων της (Val, Ser, Tyr). Το Ν- τερματικό τριπεπτίδιο πραγματοποιεί περίπου τις μισές από τις συνολικές επαφές που παρατηρούνται στη σύνδεση του τομέα 1-47 με θρομβίνη και αφορά το 30% της συνολικής ελεύθερης ενέργειας του δεσμού. Υπό περιορισμένες συνθήκες πρωτεόλυσης, η παραλλαγή ιρουδίνης,ημ2, έχει διασπάστεί από τρυψίνη σε μία μοναδική θέση και αυτό μας επέτρεψε να απομονώσουμε με υψηλές αποδόσεις το Ν- τελικό τομέα 1-47.Η παραλλαγή αυτή δεσμεύεται 30 φορές πιο σφιχτά στην ταχεία από ότι στην αργή μορφή της θρομβίνης (όπως και ο φυσικός τύπος της ιρουδίνης). Συνεπώς, συμπεραίνουμε ότι η καθοριστική πληροφορία αποθηκεύεται στο Ν- τελικό άκρο. Ανάλογα του HM2,δηλαδή, υποκαταστάσεις στο τριπεπτίδιο (Val- Ser- Tyr) δείχνουν τη σημασία των εκάστοτε θέσεων για τη λειτουργία της ιρουδίνης και προκαλούν διαφορές στο σύμπλοκο λόγω φυσικοχημικών ιδιοτήτων και λιγότερο λόγω διαφορών στη διαμόρφωση. Tα αποτελέσματα που περιγράφονται: Υποκατάσταση Val- 1 Κατά την αντικατάσταση της Val- 1 με Ala, ένα πολύ μικρότερο αμινοξύ, μειώνεται η συγγένεια της θρομβίνης σε κάθε μορφή της ενώ η ενσωμάτωση του t- bugαυτή τη θέση ενισχύει την συγγένεια της γρήγορης μορφής θρομβίνης. Υπάρχουν μελέτες που υποδεικνύουν ότι το t- bug ταιριάζει απόλυτα στην S2 πλευρά του ενζύμου και καλύπτει περίπου τις ίδιες υδροφοβικές επιφάνειες με την Val1 μετά την δημιουργία συμπλόκου με την θρομβίνη. Ως εκ τούτου, η μεγάλη αλληλεπίδραση του Val1tBugανάλογου με την θρομβίνη οφείλεται στη μεγάλη συμμετρία του t- bug σε σύγκριση με την ισοπροπυλική πλευρική αλυσίδα της Val1. Από τα παραπάνω διαπιστώνεται η δυνατότητα να βελτιωθεί σημαντικά η συγγένεια δέσμευσης εισάγοντας noncoded αμινοξέα με συμμετρικές πλευρικές αλυσίδες όπου ευνοϊκά μειώνουν την ολική εντροπία του δεσμού. Υποκατάσταση Ser- 2 Η υποκατάσταση της κοντής πλευρικής αλυσίδας της Ser2 με Arg (που έχει μακριά και εύκαμπτη πλευρική αλυσίδα) ή με το p- Gnd- Phe (το οποίο θεωρείται ένα πιο άκαμπτο ανάλογο Arg) προκαλεί μεγάλη αύξηση της συγγένειας της ΗΜ2 με την θρομβίνη. Αυτά τα αποτελέσματα αναμένονταν από μελέτες προσομοιώσεων που δείχνουν ότι η θετική πλευρική αλυσίδα της Arg δημιουργεί ηλεκτροστατικό ζευγάρι με την αρνητική Asp- 189 που βρίσκεται στον πυθμένα της S1 περιοχής. Να σημειωθεί ότι η σταθεροποίηση της αλυσίδας Arg, όπως συμβαίνει με το p- Gnd- Phe, δεν βελτιώνει την συγγένεια ΗΜ2 με θρομβίνη γιατί το πλεονέκτημα από την σταθεροποίηση της πλευρικής αλυσίδας αντισταθμίζεται από ανεπιθύμητα αποτελέσματα προσανατολισμού. Υποκατάσταση Tyr- 3: η επίδραση του όγκου της πλευρική αλυσίδας και η υδροφοβικότητα Όπως αποδεικνύεται από τη δομή του συμπλόκου, η θέση 3 της ιρουδίνης καταλήγει και γεμίζει την S3 περιοχή της θρομβίνης. Για να αξιολογήσουμε την επίδραση του μεγέθους του αμινοξέος σε αυτή τη θέση σε σχέση με την συγγένεια της ΗΜ2 για την γρήγορη και την αργή μορφή της θρομβίνης, αντικαταστάθηκε η Tyr3 με ένα μικρότερο κι ένα μεγαλύτερο αμινοξύ. Να
σημειωθεί ότι για τα περισσότερα εξεταζόμενα αμινοξέα η αύξηση του μεγέθους της πλευρικής αλυσίδας είναι παράλληλη με μια συνακόλουθη αύξηση της υδροφοβικότητας. Δεδομένα των αναστολέων θρομβίνης υποδεικνύουν ότι αντικαθιστώντας την Tyr3 με την (μικρότερη) Ala μειώνεται αισθητά η συγγένεια της γρήγορης θρομβίνης κατά 65 φορές, όταν η αργή αντιπηκτική μορφή μειώνεται μόνο κατά 1,8 φορές. Αντίθετα, μεγαλώνοντας το μέγεθος της πλευρικής αλυσίδας στη θέση 3 ενισχύεται η συγγένεια και για τις δύο μορφές και περισσότερο για την γρήγορη. Η χαμηλή υδροφοβικότητα της Ala μαζί με την έλλειψη δυνάμεων van der Waals στην S3 περιοχή του ενζύμου μπορεί λογικά να εξηγήσει την μειωμένη συγγένεια της Tyr3Ala στην γρήγορη θρομβίνη. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν, αν και έμμεσα, ότι η S3 περιοχή στην αργή μορφή είναι πιο συμπαγής και κλειστή από την γρήγορη. Πράγματι, σε μελέτες προσομοιώσεων της Tyr3Ala δέσμευσης στη θρομβίνη αποκαλύπτουν ότι κόβοντας την πλευρική αλυσίδα της Tyr3 δημιουργείται μια μεγάλη εγκοπή στην επιφάνεια του ενζύμου- αναστολέα στην S3 περιοχή η οποία επιτρέπει συγκέντρωση νερού και αποσταθεροποίηση του συμπλόκου. Αντίθετα, μεγαλώνοντας την πλευρική αλυσίδα στη θέση 3, αυξάνεται η συγγένεια με την θρομβίνη καθώς αυξάνεται και ο αριθμός των δυνάμεων van der Waals και καθώς «κρύβεται» μια μεγαλύτερη υδροφοβική επιφάνεια στο σύμπλοκο ΗΜ2- θρομβίνη. Ένα επιπλέον στοιχείο για τον σημαντικό ρόλο που παίζουν οι υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις στην δέσμευση ΗΜ2- θρομβίνης δίνεται από την αντικατάσταση Tyrμε Τρπ3 αλλά και με ένα ισομετρικό αλλά λιγότερο υδροφοβικό 7- aza- Trpανάλογο. Αυτό που παρατηρείται είναι ότι το 7- aza- Trp παράγωγο της ΗΜ2 δένεται στην θρομβίνη με συγγένεια 10 φορές μικρότερη από το ανάλογο που περιέχει Trp. Μια ακόμη αντικατάσταση στη θέση 3 έγινε από την Phe η πλευρική αλυσίδα της οποίας είναι πιο υδρόφοβη από την Tyr. Όπως ήταν αναμενόμενο ηtyr3phe αναστέλλει την θρομβίνη κατά 10 φορές περισσότερο. Ωστόσο, η homo- Phe, παρ ότι είναι εξαιρετικά πιο υδροφοβική από την Phe,η συγγένεια της Tyr3homo- Phe με την θρομβίνη είναι 40 φορές μικρότερη από την Tyr3Phe. Αυτό συμβαίνει λόγω ενός αρωματικού δακτυλίου που δημιουργούν δύο μεθυλομάδες της πλευρικής αλυσίδας της homo- Phe και σχηματίζεται έτσι μια εγκοπή στην S3 περιοχή που αποσταθεροποιεί το σύμπλοκο θρομβίνης- ιρουδίνης καθώς επιτρέπει την είσοδο νερού. Σε αυτό το σημείο των SAR μελετών, τα δεδομένα μας φαίνεται να υποδεικνύουν ότι το «θάψιμο» των υδροφοβικών επιφανειών είναι η κατευθυντήρια δύναμη για την αληλλεπίδραση ιρουδίνης- θρομβίνης και υπογραμμίζει ότι και μια μοναδική μετάλλαξη στην θέση 3 της ιρουδίνης μπορεί να έχει δραματική επίδραση στην συγγένεια του συμπλόκου. Υποκατάσταση Tyr- 3: η επίδραση του προσανατολισμού της πλευρικής αλυσίδας. Ο προσανατολισμός της πλευρικής αλυσίδας επιδρά και παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην μοριακή αναγνώριση. Κατά την αντικατάσταση της Tyr3 με δύο ίδια σε υδροφοβικότητα και μοριακό όγκο μόρια όπως το α- Nal και B- Nal παρατηρήθηκε ότι το Tyr3β- Nal έχει 6 φορές περισσότερη ισχύ σαν αναστολέας θρομβίνης απ ότι το Tyr3α- Nal. Αυτό συμβαίνει διότι λόγω διαφορετικού προσανατολισμού Το Tyr3β- Nal «γεμίζει» πιο εκτεταμένα τις εγκοπές στην S3 περιοχή του ενζύμου και επομένως καλύπτει μεγαλύτερη ποσότητα επιφανειών κατά την δέσμευση. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω υποδεικνύουν ότι η επίδραση της υδροφοβικότητας (η εγγενής τάση των μη πολικών ομάδων να αποφεύγουν το νερό) είναι κυρίαρχη κατευθυντήρια δύναμη για τη δέσμευση μόνο όταν τα επιθυμητά αποτελέσματα που
προκαλούνται από την μετακίνηση αυτών των αδιάφορων ομάδων από τους υδατικούς διαλύτες δεν εξουδετερώνονται από ανεπιθύμητες στερεοδομικές επιδράσεις. Τελικά, η αντικατάσταση 3 αμινοξέων (Val1 σε t- Bug, Ser2 σε Arg,Tyr3 σε β- Nal ) δημιουργεί το BAN που ήταν 15.750 φορές πιο ισχυρό από την φυσικού τύπου HM2. Το BAN εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα σε σχεση με τη χορήγηση όλοκληρου του μορίου ιρουδίνης όπως υψηλή σταθερότητα, αντίσταση σε πεπτικές πρωτεάσες κ.α. Συμπερασματικα- Σύνοψη: Από τα διάφορα ανάλογα ΗΜ2 καταλήγουμε στον σπουδαίο ρόλο που διαδραματίζουν κυρίως οι ηλεκτροστατικής φύσεως, «κρυφές αλληλεπιδράσεις». Έτσι, η δυνατότητα εισαγωγής μη κωδικοποιημένων αμινοξέων, με δομική και χημική ποικιλότητα σαφώς μεγαλύτερη από αυτή που επιτυγχάνεται με τα πρότυπα αμινοξέα, σε μια δεδομένη περιοχή πρωτείνης, θα βελτιώσει την κατανόηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων που υπαγορεύουν τη μοριακή αναγνώριση σε πρωτείνες. Εν κατακλείδι, αποδεικνύεται, πως είναι πιθανό να μεταφέρουμε την ποιοτική μεθοδολογία SAR στην ανάπτυξη μικρών μορίων, προκειμένου να μελετηθούν οι φυσικοχημικές παράμετροι αναγνώρισης σε μακρομοριακά συστήματα, όπως το σύμπλοκο ιρουδίνης- θρομβίνης. Ποιό μπορεί να είναι το επόμενο βήμα: Συνεχείς εξελίξεις στις μεθόδους σύνθεσης πεπτιδίων, θα επιτρέψουν στους ερευνητές στο μέλλον να επεκτείνουν αυτή την ποιοτική προσέγγιση, σε μεγαλύτερα συστήματα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών, σχετικού φαρμακευτικού ενδιαφέροντος.