ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ (ΜΑΘΗΜΑ 5ο) 1
ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΜΕΣΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ DNA Υπάρχουν φυτά που δεν είναι εύκολη η χρήση του Agrobacterium (πχ σιτηρά) Οι τεχνικές ιστοκαλλιέργειας που απαιτούνται στην αξιοποίηση του Agrobacterium δεν είναι ανεπτυγμένες σε ορισμένα είδη (πχ ψυχανθή) Τεχνικές άμεσης εισαγωγής DNA (χωρίς ενδιάμεσο φορέα το βακτήριο) Αποσκοπούν να χειριστούν ανώριμα έμβρυα, μεριστώματα, γαμέτες και ζυγώτες χωρίς να επηρεάζουν με μη αναστρέψιμο τρόπο την κανονική τους λειτουργία 2
ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΜΕΣΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ DNA Μπορεί να αξιοποιούν μικρά πλασμίδια ως φορείς, συνήθως του Echerica coli, με μόνο μια τροποποίηση την προσθήκη γονιδίου επιλογής (αντοχής σε αντιβιοτικό) ληκτική ακολουθία (nos) «ξένο» DNA συστατικός προαγωγέας αρχή αντιγραφής βακτηριακό γονίδιο επιλογής (Amp) γονίδιο μάρτυρας (GUS) Μικρό πλασμίδιο E. coli για μεταφορά γυμνού DNA. 3 Εικ. 6.3
ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΜΕΣΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ DNA 1. ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ 2. ΒΟΜΒΑΡΔΙΣΜΟΣ ΜΕ ΣΩΜΑΤΙΔΙΑ 3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ 4. ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ 4
Στόχος: Η εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου για τη δημιουργία πόρων στη μεμβράνη των φυτικών κυττάρων που θα αποτελέσουν τη δίοδο του «ξένου» DNA στο εσωτερικό τους. 5
Τεχνική δημιουργίας πόρων στο κύτταρο : Τα φυτικά κύτταρα που συνήθως χρησιμοποιούνται παίρνονται από ιστούς του μεσοφύλλου, αλλά ενδέχεται να είναι αξιοποιήσιμα και κύτταρα από κυτταροκαλλιέργειες ή καλλιέργειες κάλλου. Στα φυτικά κύτταρα απαιτείται προηγούμενη αφαίρεση του κυτταρικού τοιχώματος και για το λόγο αυτό κύτταρα αρχικά εμβαπτίζονται σε μέσο που περιέχει κατάλληλα ένζυμα αποικοδόμησης του τοιχώματος (πηκτινάσες, κυτταρινάσες) Εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο το οποίο προκαλεί βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη. Αν το πεδίο είναι ισχυρό προκαλείται λύση (καταστροφή) της μεμβράνης. Με ήπιο ηλεκτρικό πεδίο η διάμετρος των πόρων είναι πολύ μικρή για να επιτρέψει τη δίοδο του DNA. Η ένταση του ηλ. πεδίου καθορίζεται από την τάση και τη διάρκεια των ηλεκτρικών παλμών. Απαραίτητο είναι να βρεθεί το κατάλληλης τάσης και διάρκειας ηλεκτρικό πεδίο (πρωτόκολλο ηλεκτροπόρωσης) που οδηγεί σε αναστρέψιμη βλάβη της μεμβράνης με δημιουργία πόρων διαμέτρου που επιτρέπει τη δίοδο του DNA και οι οποίοι κλείνουν όταν ανασταλεί η εφαρμογή του. 6
Κύκλος δημιουργίας πόρων και μετασχηματισμού κυττάρων: 2 P 1: Φάση εφαρμογής ηλεκτρικού πεδίου 2: Φάση σφραγίσματος πόρων C 1 C: αρχική κατάσταση κυτταρικής μεμβράνης Ρ: πορώδες στάδιο κυτταρικής μεμβράνης 7
Τεχνική δημιουργίας πόρων στο κύτταρο : δημιουργία ρηγμάτων με εισροή νερού δημιουργία υδρόφοβων πόρων υδρόφιλοι πόροι σύνθετοι πόροι (φωσφολιπίδια και πρωτεϊνες) 8 Εικ. 5.4
Τεχνική δημιουργίας πόρων στο κύτταρο : πρωτοπλάστης Στα πρώτα στάδια εφαρμογής του ηλεκτρικού πεδίου δημιουργούνται πόροι η διάμετρος των οποίων είναι 20-40nm, που στο τέλος (μετά από λίγα s) κυμαίνεται από 20-120nm. Με την πάροδο 10s οι πόροι παίρνουν τη μορφή κοιλωμάτων και σε μισό min εξαφανίζονται. Το διάστημα από τη δημιουργία μέχρι την εξάλειψη των πόρων είναι αρκετό για τη διάχυση των επίμηκων μορίων του «ξένου» DNA. 9 Εικ. 5.3
Δημιουργία πόρων στο κύτταρο : ερυθροκύτταρα Κατανομή συχνότητας πόρων ερυθροκυττάρων 40ms μετά την εφαρμογή ηλ. πεδίου 10 Εικ. 5.2
Τεχνική δημιουργίας πόρων στο κύτταρο : ερυθροκύτταρα 11 Εικ. 5.1
Παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα: Ωσμωτική πίεση μέσου ηλ. πεδίου Συγκέντρωση DNA στο περιβάλλον μέσο: Δυναμικό ηλεκτρικού πεδίου: 12
Ωσμωτική πίεση μέσου ηλ. πεδίου: Αν το περιβάλλον μέσο δεν είναι ισοτονικό με αυτό του πρωτοπλάστη, η δημιουργία πόρων διευκολύνει τη μετακίνηση ιόντων και μορίων με συνέπεια την διόγκωση και καταστροφή του κυττάρου. 13 Εικ. 5.3
Συγκέντρωση DNA στο περιβάλλον μέσο: Συσχέτιση μετασχηματισμένων κυττάρων Ε. Coli και συγκέντρωσης DNA 14 Εικ. 5.5
Συγκέντρωση DNA στο περιβάλλον μέσο: συγκέντρωση DNA σε μικρογραμμάρια Δραστικότητα ενζύμου CAT (γονίδιο επιλογής που ενσωματώθηκε με ηλεκτροπόρωση σε πρωτοπλάστες Petunia)σε σχέση με τη συγκέντρωση DNA 15 τροποποιημένη Εικ. 5.8
Δυναμικό ηλεκτρικού πεδίου: Διάρκεια παλμού Ένταση ηλ. πεδίου ικανοποιητικό αριθμό επιζώντων πρωτοπλάστων (50%?) Σχέση έντασης ηλ. πεδίου και βιωσιμότητας πρωτοπλαστών Βιωσιμότητα πρωτοπλαστών (%) 100 75 50 25 0 0 1 2 3 Ένταση ηλ. πεδίου (KV/cm) 16
Δυναμικό ηλεκτρικού πεδίου: ένταση παλμού Δραστικότητα ενζύμου CAT σε πρωτοπλάστες Petunia σε σχέση με την ένταση παλμού 17 τροποποιημένη Εικ. 5.7
18 Πίν. 5.2
Πρωτόκολλο εφαρμογής ηλ. πεδίου: 1. Χαρακτηριστικά ηλεκτρικού πεδίου (παλμοί και διάρκεια) 2. Συγκέντρωση (ωσμωτική πίεση) του περιβάλλοντος μέσου Είδος του φυτού 3. Μέγεθος και συγκέντρωση του DNA στο περιβάλλον μέσο 19
Πρωτόκολλο εφαρμογής ηλ. πεδίου: Ρυθμιστικό διάλυμα: KCl, CaCl 2, μανιτόλη Συγκέντρωση πρωτοπλαστών : 1-10 x 10 6 πρωτοπλάστες /ml ρυθμιστικού διαλύματος Συγκέντρωση DNA: 10-100 μg /ml Θερμοκρασία: 4 o C Παλμοί: ευθύγραμμοι διάρκειας 5-10 ms και έντασης περίπου 750 V/cm Μετά την εφαρμογή του ηλ. πεδίου οι πρωτοπλάστες αραιώνονται σε κατάλληλο θρεπτικό διάλυμα χαμηλής θερμοκρασίας για να ξεπεράσουν το σοκ του ηλεκτρισμού. 20
Ηλεκτροπόρωση γύρης Υπάρχουν φυτά (καλαμπόκι, ρύζι, σόγια, σιτάρι) που είναι δύσκολο να αναγεννηθούν από πρωτοπλάστες. Επίσης η κυτταροκαλλιέργεια που διαρκεί πολλούς μήνες δημιουργεί σωμακλωνική παραλλακτικότητα. Ηλεκτροπόρωση εκβλαστημένων γυρεόκοκκων Μετά την ηλεκτροπόρωση και αφού πιστοποιηθεί η μεταμόρφωσή τους οι γυρεόκοκκοι χρησιμοποιούνται για επικονίαση και τα φυτά που προκύπτουν (είναι ημίζυγα) αυτογονιμοποιούνται ώστε να σταθεροποιηθούν ως προς το «ξένο» γονίδιο. 21
Ηλεκτροπόρωση γύρης Πλεονεκτήματα: Δεν απαιτείται δημιουργία και σταθεροποίηση πρωτοπλαστών Δεν απαιτούνται μακρόχρονες κυτταροκαλλιέργειες Η ζωτικότητα και γονιμότητα των φυτών που προέρχονται από ηλεκτροπορωμένους γυρεόκοκκους είναι ανώτερη από φυτά που προέρχονται από ηλεκτροπορωμένους πρωτοπλάστες Η πιθανότητα σωμακλωνικής παραλλακτικότητας ελαχιστοποιείται 22
Ταυτοποίηση μετασχηματισμού: Ανάλυση κατά Southern ηλεκτροπορωμένων κυττάρων (2,3,4) Ανάλυση κατά Southern ηλεκτροπορωμένης γύρης (1) 23 Εικ. 5.13
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποιες είναι οι μέθοδοι άμεσης μεταφοράς DNA στα φυτά, σε τι είδη φυτικών ιστών συνήθως εφαρμόζονται; Να περιγραφεί η δομή ενός πλασμιδίου στο οποίο ενσωματώνεται το «ξένο» γονίδιο για άμεση μεταφορά σε φυτικούς ιστούς. Σε τι αποσκοπεί η ηλεκτροπόρωση, και ποια είναι η διαδικασία; Σε τι ιστούς συνήθως εφαρμόζεται η ηλεκτροπόρωση, και ποια η μεταχείριση φυτικών κυττάρων πριν την εφαρμογή της; Για τι χρονικό διάστημα εφαρμόζεται η μεταχείριση με ηλεκτρικό πεδίο στην τεχνική της ηλεκτροπόρωσης, ποιος είναι ο κύκλος δημιουργίας πόρων και μετασχηματισμού κυττάρων) Ποιοι είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού φυτικών κυττάρων με ηλεκτροπόρωση; Πώς επηρεάζει η συγκέντρωση (ωσμωτική πίεση) του ρυθμιστικού διαλύματος την αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού φυτικών κυττάρων με ηλεκτροπόρωση; Πώς επηρεάζει η συγκέντρωση DNA στο περιβάλλον μέσο την αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού φυτικών κυττάρων με ηλεκτροπόρωση; Πώς επηρεάζει το δυναμικό του ηλεκτρικού πεδίου την αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού φυτικών κυττάρων με ηλεκτροπόρωση; Σε ποιους παράγοντες βασίζονται τα πρωτόκολλα αξιοποίησης της ηλεκτροπόρωσης αποτελεσματικό μετασχηματισμό φυτικών κυττάρων με ηλεκτροπόρωση; για τον Σε ποια περίπτωση καταφεύγουμε στην ηλεκτροπόρωση γύρης, σε ποιο στάδιο γίνεται, και πως προκύπτουν αναγεννημένα τροποποιημένα φυτά; Ποια τα πλεονεκτήματα της ηλεκτροπόρωσης γύρης; 24
5. ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ 2 Υπάρχουν φυτά που δεν είναι εύκολη η χρήση του Agrobacterium (πχ σιτηρά), ενώ oι τεχνικές ιστοκαλλιέργειας που απαιτούνται στην αξιοποίηση του Agrobacterium δεν είναι ανεπτυγμένες σε ορισμένα είδη (πχ ψυχανθή). Στις περιπτώσεις αυτές χρησιμοποιούνται τεχνικές άμεσης εισαγωγής DNA (χωρίς ενδιάμεσο φορέα το βακτήριο). Οι τεχνικές άμεσης εισαγωγής DNA αποσκοπούν να χειριστούν ανώριμα έμβρυα, μεριστώματα, γαμέτες και ζυγώτες χωρίς να επηρεάζουν με μη αναστρέψιμο τρόπο την κανονική τους λειτουργία 3 Οι τεχνικές άμεσης εισαγωγής DNA μπορεί να αξιοποιούν μικρά πλασμίδια ως φορείς, συνήθως του Echerica coli, με μόνο μια τροποποίηση την προσθήκη γονιδίου επιλογής (αντοχής σε αντιβιοτικό). Στην περίπτωση αυτή το ξένο γονίδιο ενσωματώνεται στο πλασμίδιο και στη συνέχεια εφαρμόζεται η τεχνική της άμεσης μεταφοράς. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιλαμβάνει ένα γονίδιο μάρτυρα για την επιλογή του μεταμορφωμένου φυτού. Η ληκτική ακολουθία είναι αναγκαία για τη σωστή λήξη της μεταγραφής σε RNA Ο συστατικός προαγωγέας απαιτείται για την έναρξη της μεταγραφής του ξένου γονιδίου στο φυτό όταν έχει αφαιρεθεί ο προαγωγέας του 4 Η ηλεκτροπόρωση, ο βομβαρδισμός με σωματίδια, η χημική μέθοδος και η μικροέγχυση είναι ορισμένες από τις μεθόδους άμεσης μεταφοράς «ξένου» DNA στα φυτά.. 5 Στόχος στην ηλεκτροπόρωση είναι η εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου το οποίο συμβάλει στη δημιουργία πόρων στη μεμβράνη των φυτικών κυττάρων. Από τους πόρους αυτούς το «ξένο» DNA εισέρχεται στο εσωτερικό των κυττάρων. 6 βλέπε διαφάνεια 7 Ο κύκλος δημιουργίας πόρων στα φυτικά κύτταρα και μετασχηματισμού τους με «ξένο» DNA, περιλαμβάνει δύο φάσεις. Στην 1 η φάση εφαρμόζεται το ηλεκτρικό πεδίο οπότε τα κύτταρα από την αρχική κατάσταση κυτταρικής μεμβράνης (C) περνούν στο πορώδες στάδιο κυτταρικής μεμβράνης. Στη διάρκεια του σταδίου αυτού το «ξένο» DNA εισέρχεται στα φυτικά κύτταρα. Στη 2 η φάση παύει η επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου και κλείνουν οι πόροι των κυττάρων.
8 Διαγραμματική απεικόνιση της μεμβράνης του κυττάρου κατά την ηλεκτροπόρωση. Η ηλεκτροπόρωση είναι δυνατό να δημιουργήσει ρήγματα στην πλασματική μεμβράνη με εισροή νερού (Α), με αποτέλεσμα τη δημιουργία υδρόφοβων πόρων (Β). Οι πόροι αυτοί είναι μάλλον πρόδρομοι των υδρόφιλων πόρων (Γ). Το θεωρητικό μοντέλο βασίζεται στη δημιουργία παροδικών υδρόφιλων πόρων, αλλά δεν αποκλείεται η δημιουργία σύνθετων πόρων (Δ) που αποτελούνται από φωσφολιπίδια και πρωτεϊνες. (r η ακτίνα του πόρου) 9 βλέπε διαφάνεια 10 Η κατανομή της συχνότητας πόρων σε ερυθροκύτταρα 40ms μετά την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου δείχνει ότι η διάμετρος των πόρων κυμαίνεται από 20-120 nm. Τη μεγαλύτεροι συχνότητα έχουν οι μέσου μεγέθους πόροι (γύρω στα 60 nm). 11 Στην εικόνα Α φαίνεται η επιφάνεια των ερυθροκυττάρων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο στο στάδιο δημιουργίας των πόρων Στην εξωτερική στοιβάδα της μεμβράνης διακρίνονται 3 βαθείς και ένας μερικά ανοιχτός (βέλος) πόροι (εικόνα Β). (Η εικόνα γίνεται ορατή με ψυκτοτεμαχισμό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο). 12 Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα μεταφοράς «ξένου» DNA στα φυτικά κύτταρα είναι: 1.Η ωσμωτική πίεση του υποστρώματος (του μέσου) στο οποίο εφαρμόζεται το ηλεκτρικό πεδίο 2. Η συγκέντρωση του «ξένου» DNA στο περιβάλλον μέσο 3. Το δυναμικό του ηλεκτρικού πεδίου 13 Το περιβάλλον μέσο πρέπει να είναι ισοζυγισμένο ωσμωτικά με το εσωτερικό του κυττάρου (του πρωτοπλάστη) ώστε με το άνοιγμα των πόρων να μη υπάρξει υπερβολική είσοδος ιόντων και μορίων από το μέσο στο κύτταρο και με τη λήξη της εφαρμογής του ηλεκτρικού πεδίου οι πόροι να κλείσουν. Σε περίπτωση που το περιβάλλον μέσο δεν είναι ισοτονικό και είναι πυκνότερο από αυτό του πρωτοπλάστη, η δημιουργία πόρων διευκολύνει τη μετακίνηση ιόντων και μορίων από το μέσο στον πρωτοπλάστη με συνέπεια την διόγκωση και καταστροφή του κυττάρου.
14 Υπάρχει μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης του μέσου σε DNA με τον αριθμό των κυττάρων Ε. Coli που μετασχηματίζονται, δηλαδή όσο μεγαλύτερος ο αριθμός των τμημάτων του «ξένου» DNA στο μέσο τόσο μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων θα μετασχηματιστεί. Για παράδειγμα με συγκέντρωση 10 pg/ml (1 στον άξονα Χ) θα μετασχηματιστούν περίπου 1.000 κύτταρα (3 στον άξονα Υ), ενώ με συγκέντρωση 1.000 pg/ml (3 στον άξονα Χ) θα μετασχηματιστούν περίπου 100.000 κύτταρα (5 στον άξονα Υ). 15 Η εικόνα δείχνει τη δραστικότητα του ενζύμου της καταλάσης (CAT) που ενσωματώθηκε με ηλεκτροπόρωση σε πρωτοπλάστες Petunia, σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση DNA στο μέσο της ηλεκτροπόρωσης. Όσο μεγαλύτερη η συγκέντρωση τόσο εντονότερα εκφράστηκε το γονίδιο που σημαίνει ότι μετασχηματίστηκε μεγαλύτερος αριθμός πρωτοπλαστών. 16 Όσο αφορά το δυναμικό του ηλεκτρικού πεδίου, δύο είναι τα χαρακτηριστικά του που είναι καθοριστικά, η διάρκεια και η ένταση. Υπερβολική διάρκεια και πολύ μεγάλη ένταση νεκρώνουν μεγάλο αριθμό πρωτοπλαστών. Ο στόχος είναι να εξασφαλίζεται η επιβίωση περίπου 50% των πρωτοπλαστών. Το σχήμα δείχνει ότι αναφορικά με ένταση περίπου 1.000-1.500 V/cm επιβιώνει περίπου το 50% των πρωτοπλαστών. 17 Το σχήμα δείχνει ότι όσο μεγαλύτερη είναι η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου τόσο εντονότερη είναι η έκφραση του ενζύμου της καταλάσης (CAT) σε πρωτοπλάστες Petunia που σημαίνει μεγάλες εντάσεις οδηγούν σε μεγαλύτερα ποσοστά μετασχηματισμού των πρωτοπλαστών. Εντούτοις δεν πρέπει να ξεπερνά τα 1500 V/cm για τους λόγους που αναφέρθηκαν προηγούμενα. 18 Ο πίνακας δείχνει διάφορα πρωτόκολλα ηλεκτροπόρωσης που χρησιμοποιήθηκαν σε φυτικά κύτταρα από διάφορα είδη φυτών, όπως πλασμίδιο «φορέας», τύπος παλμού και συνθήκες παλμού (ένταση διάρκεια) 19 Με βάση όλα τα προηγούμενα φαίνεται ότι για την επιλογή του κατάλληλου πρωτοκόλλου εφαρμογής ηλεκτροπόρωσης και σε συνάρτηση πάντα με το είδος του φυτού στο οποίο γίνεται η μεταμόρφωση πρωτοπλαστών παίρνονται υπόψη: 1. Τα χαρακτηριστικά του ηλεκτρικού πεδίου και συγκεκριμένα η ένταση (παλμοί) και η διάρκεια εφαρμογής 2. Η συγκέντρωση του περιβάλλοντος μέσου σε ιόντα και μόρια που σε συνάρτηση με η συγκέντρωση του πρωτοπλάστη καθορίζουν την ωσμωτική πίεση. 3. Το μέγεθος και η συγκέντρωση του DNA στο περιβάλλον μέσο
20 Η διαφάνεια δείχνει ένα τυπικό πρωτόκολλο ηλεκτροπόρωσης 21 Υπάρχουν φυτά (καλαμπόκι, ρύζι, σόγια, σιτάρι) που είναι δύσκολο να αναγεννηθούν από πρωτοπλάστες. Επίσης η κυτταροκαλλιέργεια που διαρκεί πολλούς μήνες δημιουργεί σωμακλωνική παραλλακτικότητα. Στην περίπτωση αυτή καταφεύγει κανείς στην ηλεκτροπόρωση εκβλαστημένων γυρεόκοκκων. Μετά την ηλεκτροπόρωση και αφού πιστοποιηθεί η μεταμόρφωσή τους οι γυρεόκοκκοι χρησιμοποιούνται για επικονίαση και τα φυτά που προκύπτουν (είναι ημίζυγα) αυτογονιμοποιούνται ώστε να σταθεροποιηθούν ως προς το «ξένο» γονίδιο. 22 βλέπε διαφάνεια για πλεονεκτήματα ηλεκτροπόρωσης 23. Με την τυπική ανάλυση κατά Southern ηλεκτρο-πορωμένων κυττάρων ή γυρεόκοκκων μπορεί να γίνει η ταυτοποίηση αυτών που ενσωμάτωσαν το «ξένο» DNA