Συστήματα ξενιστήφορέα Τόπακας Ευάγγελος Επίκουρος Καθηγητής ΕΜΠ Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ vtopakas@central.ntua.gr
Άδεια Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άδεια χρήσης άλλου τύπου, αυτή πρέπει να αναφέρεται ρητώς.
Φορείς: πλασμίδια,επισώματα, βακτηριοφάγοι (ιοί) Ξενιστές: Βακτήρια, ζύμες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόμων 3
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Προϊόντα γενετικά τροποποιημένων κυττάρων Έκφραση γονιδίων Συστήματα ξενιστή φορέα Γενετική αστάθεια Μεταβολική μηχανική Πρωτεϊνική μηχανική 4
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ Bακτήρια Zύμες Μύκητες Κύτταρα θηλαστικών Σύστημα κυττάρων εντόμου ιού Διαγονιδιακά ζώα Διαγονιδιακά φυτά 5
Κύτταρα ωοθήκης Κινέζικου Hamster (CHO)? 1 Βιομηχανία δισεκατ $ 2 rdna Τύποι μορίων(rdna) 1. Kyriakopoulos & Kontoravdi (2013). Eur. J. Pharm. Sci., 48(3): 428-441. 2. Evaluate Pharma (2013). 3. De Jesus & Wurm (2011). Eur. J. Pharm. Biopharm, 78(2): 184-188. 6
Κύτταρα ωοθήκης Κινέζικου Hamster (CHO)? 1 Βιομηχανία δισεκατ $ 2 Για την αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών (καρκίνος, αυτοάνοσα νοσήματα) 1 Βιομηχανική παραγωγή 3 : max όγκος εργασίας βιοαντιδραστήρα: 20,000L Επιθυμητός τρόπος: Fed batch; μέχρι 20 ημέρες Στόχος: αύξηση της απόδοσης παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών [mabs: <60pg/cell/day max: 100pg/cell/day 3 ] rdna 1. Kyriakopoulos & Kontoravdi (2013). Eur. J. Pharm. Sci., 48(3): 428-441. 2. Evaluate Pharma (2013). 3. De Jesus & Wurm (2011). Eur. J. Pharm. Biopharm, 78(2): 184-188. 7
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Escherichia coli Πλεονεκτήματα Μεγάλο εύρος γνώσεων Υψηλοί ρυθμοί ανάπτυξης Ανάπτυξη σε φθηνά και απλά θρεπτικά υλικά Μειονεκτήματα «Έξοδος» ενδοκυτταρικών πρωτεΐνες Κυτταρικά έγκλειστα Δεν γλυκοζυλιώνει Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης 8
ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΑΙ ΑΠΕΚΚΡΙΣΗ 9
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Escherichia coli Περιορισμοί: Το επιθυμητό γονίδιο δεν πρέπει να περιέχει ιντρόνια. Το επιθυμητό γονίδιο μπορεί να περιέχει αλληλουχίες που κωδικοποιούν σήματα τερματισμού της μεταγραφής για το E.coli. Codon bias: Η αποτελεσματικότητα του t RNA να αναγνωρίζει τα διαφορετικά κωδικόνια διαφέρει σε κάθε οργανισμό. 10
Επαγωγή με χρήση συνθετικών μορίων που δε μεταβολίζονται π.χ. IPTG (Isopropyl β D 1 thiogalactopyran 11
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ Πλεονεκτήματα FDA GRAS Εφαρμογή στα τρόφιμα Έκκριση πρωτεϊνών Γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών ΖΥΜΕΣ Saccharomyces cerevisae Pichia pastoris Πλεονεκτήματα Aνάπτυξη σε μεθανόλη Έκκριση πρωτεϊνών Υψηλή κυτταρική πυκνότητα Μεγαλύτερη κατ όγκο παραγωγή Μειονεκτήματα Χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης Υπεργλυκοζυλίωση Μειονεκτήματα Υψηλή θερμότητα μεταβολισμού Υψηλές απαιτήσεις σε οξυγόνο Δύσκολος έλεγχος της διεργασίας Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης 12
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Πλεονεκτήματα Σωστές μετα μεταφραστικές διαδικασίες Έκκριση πρωτεϊνών Μειονεκτήματα Ακριβά θρεπτικά υλικά Χαμηλά επίπεδα έκφρασης Θνησιγενείς κυτταρικές σειρές Παθογόνοι φορείς? Σειρές κυττάρων CHO: κύτταρα ωοθήκης κινεζικού χάμστερ Φορείς: Ιοί ανώτερων θηλαστικών 13
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΝΤΟΜΟΥ ΙΟΥ Πλεονεκτήματα Υψηλά επίπεδα έκφρασης Ασφάλεια Ταχύτητα Μειονεκτήματα Πολυπλοκότητα Μετάλλαξη του ιού Ξενιστές: Spodoptera frugipedra, Trichoplusia ni Ιός: Autographa califomica, πυρηνικός πολυεδρικός ιός 14
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΖΩΑ Πλεονεκτήματα Εξειδικευμένες μεταμεταφραστικές διαδικασίες Υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών Μειονεκτήματα Προβλήματα υγείας των ζώων Μετάδοση ιών Δαπανηρά συστήματα Πρόβατα, αίγες, χοίροι 15
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΞΕΝΙΣΤΗ ΦΟΡΕΑ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΦΥΤΑ Πλεονεκτήματα Χαμηλό κόστος Ασφάλεια Μειονεκτήματα Χαμηλά επίπεδα έκφρασης Ατελής γλυκοζυλίωση Χρονοβόρες καλλιέργειες Καλαμπόκι Αντικείμενο έρευνας: Καλλιέργειες φυτικών κυττάρων 16
Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα Ε.Μ.Π.» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και ια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.