Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 1-3 EIΣAΓΩΓH ΣΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ DNA Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 541 24 Θεσσαλονίκη
Oι Διδάσκοντες Xρήστος Παναγιωτίδης Kαθηγητής Kυτταρικής & Mοριακής Bιολογίας Τμήμα Φαρμακευτικης Α.Π.Θ. Επικοινωνία: καθημερινά 11 π.μ.-12 μ., Γραφείο 315/ 3ος όρόφος Φαρμακευτικής ή ηλεκτρονικά (e-mail) στο : pchristo@pharm.auth.gr Γεώργιος Παμπαλάκης, Επίκουρος καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας, gpampalakis@pharm.auth.gr ΠΛHPOΦOPIEΣ σχετικά με τομάθημα, ανακοινώσεις, διαλέξεις, βαθμολογίες, κλπ. θα αναρτώνται στους πίνακες ανακοινώσεων του 3ου ορόφου και στην ιστοσελίδα: Επίσης, τις επόμενες ημέρες θα δημιουργηθεί σελίδα μαθήματος στην πλατφόρμα elearning.auth.gr
Διαδικασία εξέτασης και εργαστήρια α) Η εξέταση γίνεται κάθε Ιανουάριο και Σεπτέμβριο με γραπτές εξετάσεις. β) Οι εξετάσεις αποτελούνται από 20 ισοβαρή θέματα (0,5 μονάδες το καθένα). Κάθε θέμα είναι μία πρόταση που πρέπει να απαντηθεί αν είναι σωστή ή λάθος (0,1 μονάδας για κάθε σωστή απάντηση και - 0,1 για κάθε λάθος). Η σωστή αιτιολόγηση του κάθε θεματος λαμβάνει 0,4 μονάδες. Η διάρκεια της εξέτασης είναι μία ώρα. γ) Τα εργαστήρια είναι υποχρεωτικά και γίνονται είτε την εβδομάδα πριν τις διακοπές των Χριστουγέννων ή αμέσως μετά τις διακοπές και πριν την εξεταστική του Ιανουαρίου.
Tι είναι Μοριακή Βιολογία; Mοριακή βιολογία είναι η επιστήμη που μελετά την δομή και την έκφραση του γενετικού υλικού.
Eναύσματα για την ανάπτυξη της σύγχρονης Μοριακής Βιολογίας H δυνατότητα μας να αναλύουμε τη δομή και την έκφραση του γενετικού υλικού (αντικείμενο της μοριακής βιολογίας) είναι ευθεία συνάρτηση της ικανότητας μας: Nα «κόβουμε» το DNA σε μικρότερα τμήματα Να «αρχειοθετούμε» το DNA στο εργαστήριο Nα αναλύουμε την πρωτοταγή δομή του DNA Nα μετράμε την έκφραση των γονιδίων Nα εκφράζουμε τα γονίδια σε ετερόλογα συστήματα είτε για να μελετήσουμε τη λειτουργικότητά τους ή για να παράγουμε μεγάλες ποσότητες των προϊόντων τους Να ενισχύουμε γενετικό υλικό από απειροελάχιστες ποσότητες
ΓIATI H ΓΝΩΣΗ ΤΗΣ MOPIAKHΣ BIOΛOΓIAΣ EINAI ΣHMANTIKH ΓIA ENA ΦOITHTH ΦAPMAKEYTIKHΣ;
Η σημασία της τεχνολογίας του ανασυνδυσμένου DNA στη Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία 1973: Oι Stanley Cohen και Herbert Boyer ανακαλύπτουν τη μέθοδο για τη μεταφορά της γενετικής πληροφορίας μεταξύ οργανισμών 1976: Ο Herbert Boyer ιδρύει, μαζί με άλλους, την Genentech την πρώτη εταιρεία στις Η.Π.Α. που χρησιμοποιεί τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA 1978: Η σωματοστατίνη, μία ορμόνη-ρυθμιστής της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης, παράγεται με χρήση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA 1980: Ο Herbert Boyer κλωνοποιεί το γονίδιο της ανθρώπινης ινσουλίνης και χρησιμοποιεί το βακτήριο E. coli για την παραγωγή ανασυνδυασμένης ινσουλίνης 14 Οκτωβρίου 1980: Η μετοχή της Genentech υπερδιπλασιάζεται ($35-> $89) 1977-1980: Οι Wigler, Axel & Silvestein, στο πανεπιστήμιο Columbia, αναπτύσσουν την τεχνολογία της εισαγωγής και έκφρασης ξένων γονιδίων σε κύτταρα θηλαστικών 1980-1983: Κατοχύρωση των δικαιωμάτων της παραπάνω τεχνολογίας με πατέντες από τις οποίες το πανεπιστήμιο Columbia είχε έσοδα 100 εκατομυρίων το χρόνο (σύνολο σχεδόν 1 δις) [πηγή: Colaianni, A; Cook-Deegan, R (2009). ].
DNA μπορεί να απομονωθεί είτε από κύτταρα ή από ιστούς προκειμένου να μελετηθεί ΠΡΟΣΟΧΗ: Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών. ΕΠΟΜΕΝΩΣ üτο «κόψιμο» του DNA σε μικρότερα θεραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του
Πως μπορούμε να «κόψουμε» το DNA σε μικρότερα θραύσματα; ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ; NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ
Τι είναι οι ενδονουκλεάσες περιορισμού; Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις ίδιες προκαθορισμένες θεσεις. Θα δείξουμε μερικά παραδείγματα στις επόμενες δύο διαφάνειες
Τέσσερις δημοφιλείς ενδονουκλεάσες περιορισμού
Περισσότερες ενδονουκλεάσες περιορισμού θέση διάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός HindIII EcoRI AluI NotI PstI
Πέψη DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού παράγει είτε λεία είτε κολλώδη άκρα
Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προέρχονται από βακτήρια
Ποιος είναι ο βιολογικός ρόλος των ενδονουκλεασών περιορισμού στα βακτήρια; Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού απομονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός μηχανισμού άμυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από μόλυνση με κάποιον βακτηριοφάγο. Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισμού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τις παράγει;
Χημικές τροποποιήσεις του DNA των βακτηρίων που παράγουν ενδονουκλεάσες περιορισμού το προστατεύουν από ενδονουλεολυτική πέψη από αυτές Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI EcoRI μεθυλάση Μη μεθυλιωμένο DNA Μη μεθυλιωμένο DNA «κολλώδη» άκρα Διάσπαση του DNA Μεθυλιωμένο DNA Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA
ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΚΟΠΗ ΤΙ; Πως αναλύεται και πως χρησιμοποιείται το DNA μετά την πέψη του με ενδονουκλεάσες περιορισμού;
Hλεκτροφορητική ανάλυση του DNA
Hλεκτροφορητική ανάλυση του DNA κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού Δίκλωνο πλασμιδιακό DNA Πέψη με EcoRI Πέψη με HindIII DNA κοντό θραύσμα μεσαίουμεγέθους θραύσμα - Μεγαλύτερο μέγεθος ζεύγη νουκλεοτιδίων (Χ1000) 20 10 8 6 2 + πηκτή αγαρόζης Αρχή Τέλος μικρότερο μέγεθος Εμφάνιση φιλμ φύλλο φωτογραφικού χαρτιού εμφανισμένο αυτοραδιογράφημα
Aρχές ηλεκτροφορητικής ανάλυσης
KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA στο εργαστήριο
Πλασμίδια: Οι πιο κοινοί φορείς κλωνοποίησης
Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA - 1
Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA - 2
Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης
H διαδικασία της κλωνοποίησης δίκλωνο κυκλικό πλασμιδιακό DNA θραύσμα DNA που θα κλωνοποιηθεί ανασυνδυασμένο DNA ΚΟΠΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ DNA ΛΙΓΑΣΗ
Τα βήματα της διαδικασίας κλωνοποίησης
Πολλαπλασιασμός των αντιγράφων ενός γονιδίου με κλωνοποίηση Το ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA εισάγεται στο βακτηριακό κύτταρο βακτηριακό κύτταρο καλλιέργεια για τον πολλαπλασιασμό των βακτηριακών κυττάρων Μετά από λύση των βακτηριακών κυττάρων απομονώνονται μεγάλες ποσότητες DNA
Aπαραίτητες ιδιότητες ενός πλασμιδιακού φορέα κλωνοποίησης 1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ. αντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισμού (polylinker) 4. ( Υποκινητής που επιτρέπει ρυθμιζόμενη έκφραση)
Γενωμικές & cdna Bιβλιοθήκες γονίδιο Α χρωμοσωμικό DNA γονίδιο Β γονίδιο Α γονίδιο Β εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενο DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ RNA μετάγραφα θραύσματα DNA ΣΥΡΡΑΦΗ (ΜΑΤΙΣΜΑ) ΤΟΥ RNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ DNA mrnas ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ & ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNA γενωμικοί κλώνοι DNA σε γενωμική βιβλιοθήκη cdna κλώνοι σε βιβλιοθήκη cdna
Κατασκευή γενωμικών βιβλιοθηκών DNA ανθρώπου ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ εκατομύρια θραύσματα γενωμικού DNA ΤΑ ΘΡΑΥΣΜΑΤΑ ΤΟΥ DNA ΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙ ΣΕ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ ανασυνδυασμένα μόρια DNA ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ γενωμική βιβλιοθήκη
Διαδικασία παρασκευής cdna ιστός, π.χ. εγκέφαλος λύση των κυττάρων και απομόνωση mrna mrna υβριδισμός με εκκινητή polydt mrna κατασκευή αντιγράφου DNA με χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης κατεργασία με άλκαλι για να αποικοδομηθεί το RNA Το 3 άκρο του cdna σχηματίζει θηλειά σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA με DNA-πολυμεράση, η θηλειά του 3 άκρου δρα ως εκκινητής κατεργασία με νουκλεάση που αποικοδομεί μονόκλωνο DNA για να αποικοδομηθεί η θηλειά δίκλωνο cdna αντίγραφο του αρχικού mrna
Σύνθεση cdna & προσανατολισμένη κλωνοποίηση δίκλωνου cdna σε φορείς
Bιβλιοθήκες DNA μπορούν να κατασκευασθούν και σε βακτηριοφάγους βακτηριακό χρωμόσωμα βακτηριακό κύτταρο βακτηριφάγος λάμδα πρόσδεση του φάγου στον ξενιστή και «ένεση» του ιικού DNA Ενσωμάτωση του DNA του λ φάγου στο χρωμόσωμα του ξενιστή το DNA του φάγου κυκλοποιείται σύνθεση των ιικών πρωτεϊνών που χρειάζονται για το σχηματισμό νέων ιών κυτταρική διαίρεση βήμα ενεργοποίησης Ταχεία αντιγραφή του DNA του λ φάγου και πακετάρισμα σε πλήρεις ιούς το ενσωματωμένο DNA του λ φάγου αντιγράφεται μαζί με το χρωμόσωμα του ξενιστή σχηματισμός προφάγου (λυσιγονία) λυτική οδός λυτική οδός λύση του κυττάρου και απελευθέρωση μεγάλων ποσοτήτων νέων ιών
Πολύπλοκες γενετικές κατασκευές μπορούν να γίνουν με διαδοχικές κλωνοποιήσεις θραυσμάτων DNA πλασμιδιακός φορέας πρώτο ένθεμα δεύτερο ένθεμα τρίτο ένθεμα
ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ» ΦOPEIΣ;
Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων
Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέων με βάση την έκφραση ενός γονιδίου θανάτου Comments for pzero -2.1 3297 nucleotides Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216 M13 Reverse Priming Site: bases 205-221 LacZα ORF: bases 217-558 Sp6 Priming Site: bases 239-256 Multiple Cloning Site: bases 269-381 M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430 M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450 Fusion Joint: bases 559-567 ccdb Lethal Gene ORF: bases 568-870 f1 origin: bases 895-1307 Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322 ColE1 origin: bases 2502-3175 Sp6 Nsi I* Hind III Asp718 I Kpn I Ecl136 II Sac I BamH I Spe I EcoR I Pst I EcoR V Not I Xho I Nsi I* Xba I Dra II Apa I BstB I Afl III P lac laczα SnaB I ccdb Stu I ColE1 pzero -2.1 3.3 kb f1 ori Apo I * The two Nsi I sites in the MCS are the only sites in the vector. There are two tandem Apo I sites at this location. Apo I also recognizes the EcoR I site. BspH I Kanamycin A-160319 The sequence of pzero -2.1 has been compiled from information in sequence databases, published sequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in the sequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.
Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων μονόκλωνοι DNA ανιχνευτές για το γονίδιο Α μίγμα μονόκλωνων μορίων DNA υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 42 C υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 35 C ο υβριδισμός δεν είναι ακριβής μόνο το Α σχηματίζει σταθερή διπλή έλικα τα Α, C και E σχηματίζουν σταθερές διπλές έλικες
Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους με Yβριδισμό
ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA (πριν την κλωνοποίηση ή και μετά);
Στύπωμα κατά Southern μετά από ανάλυση DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα
Aνίχνευση της μετάλλαξης που προκαλεί δρεπανοκυτταρική αναιμία με υβριδισμό νουκλεϊνικών οξέων φυσιολογική β-σφαιρίνη μετάλλαξη παθολογική β-σφαιρίνη πρωτεΐνη φυσιολογική πρωτεΐνη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ανιχνευτής φυσιολογικού γονιδίου ανιχνευτής μεταλλαγμένου γονιδίου άτομα άτομα ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Το άτομο 1 έχει δύο φυσιολογικά γονίδια β- σφαιρίνης Το άτομο 2 έχει δύο μεταλλαγμένα γονίδια β-σφαιρίνης Το άτομο 3 έχει ένα φυσιολογικό και ένα μεταλλαγμένο γονίδιο β-σφαιρίνης
Διαδικασία αλληλούχισης DNA με τη μέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων Διδεοξυαδενοσίνη (ddatp)
Aλληλούχιση DNA με τη μέθοδο του Sanger
Η γνώση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA επιτρέπει τον προσδιορισμό των περιοχών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA πλαίσια ανάγνωσης DNA πλαίσια ανάγνωσης Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA πλαίσια ανάγνωσης DNA Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA πλαίσια ανάγνωσης Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA
TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)
PCR Η ενίσχυση του DNA in vitro
Ο κύκλος της τεχνικής PCR
Πολλαπλασιασμός του DNA με PCR
Εκθετική αύξηση του DNA κατά την PCR
Μοριακή διαγνωστική με PCR στην ομόλογα χρωμοσώματα ιατροδικαστική εκκινητές PCR Επαναλλαμβανόμενες αλληλουχίες σε θέση VNTR ηλεκτροφορητική ανάλυση πατρικό μητρικό Ηλεκτροφόρηση άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F 3 ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων VNTR: Variable Number Tandem Repeat (Μεταβλητός αριθμός ιαδοχικών επαναλήψεων) αριθμός επαναλήψεων Ηλεκτροφόρηση
Aνίχνευση HIV με RT-PCR δείγμα αίματος από μολυσμένο άτομο ελάχιστα ιοσωμάτια HIV στον ορό του μολυσμένου ατόμου Εκχύλιση του ιικού RNA γονιδιώματος Αντίστροφη μεταγραφή/ ενίσχυση με PCR αίμα μη μολυσμένου ατόμου χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή Απομάκρυνση των κυττάρων με φυγοκέντρηση
Xρήση RT-PCR με πολλαπλούς εκκινητές στη μοριακή διαγνωστική μιάς ιογενούς νόσου
H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA κύτταρα απομόνωση DNA απομόνωση RNA mrna που θα κλωνοποιηθεί DNA που θα κλωνοποιηθεί Αποδιάταξη DNA/ προσθήκη εκκινητών Προσθήκη 1 ου εκκινητή, αντίστροφης μεταγραφάσης και νουκλεοτιδίων Αποδιάταξη αλυσίδων & προσθήκη 2 ου εκκινητή Ενίσχυση Ενίσχυση με με PCR PCR Ενίσχυση με με PCR γενωμικοί κλώνοι cdna κλώνοι
Χρήση της PCR πραγματικού χρόνου για ποσοτικές μετρήσεις γενετικού υλικού
«Μοριακοί φάροι» στη PCR πραγματικού χρόνου
Ποσοτική ανίχνευση ρετροϊών με PCR πραγματικού χρόνου
Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση πλασμιδιακός φορέας κλωνοποιημένο φυσιολογικό γονίδιο αποδιάταξη αλυσίδων DNA συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο/ εκκινητής που φέρει την επιθυμητή μετάλλαξη Ολοκλήρωση της σύνθεσης με χρήση DNA πολυμεράσης και DNA λιγάσης Εισαγωγή σε κύτταρα Αντιγραφή και απομόνωση στα θυγατρικά κύτταρα μεταγραφή μετάφραση μεταγραφή μετάφραση τα μισά κύτταρα παράγουν τα μισά κύτταρα παράγουν φυσιολογική πρωτεΐνη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη που φέρει αλλαγή σε ένα αμινοξύ
Eισαγωγή τροποποιήσεων στο γενετικό υλικό Φυσιολογικό γονίδιο Χ Αντικατάσταση γονιδίου Απαλειφή γονιδίου Προσθήκη γονιδίου Μόνο το μεταλλαγμένο γονίδιο εκφράζεται Δεν υπάρχει κανένα ενεργό γονίδιο Εκφράζεται και το φυσιολογικό και το μεταλλαγμένο γονίδιο
Kατασκευή διαγονιδιακών ποντικών θηλυκό ποντίκι τροποποιημένο γονίδιο με μεθόδους γενετικής μηχανικής εισαγωγή τροποποιημένου γονιδίου στα κύτταρα τα κύτταρα Ένεση κυττάρων ES σχηματίζουν στο πρώιμο αποικίες έμβρυο ζευγάρωμα και αναμονή για 3 μέρες Απομονωμένο πρώιμο έμβρυο αναζήτηση σπάνιων αποικιών που περιέχουν το τροποποιημένο γονίδιο πρώιμο έμβρυο που σχηματίσθηκε μερικώς και από κύτταρα ES εισαγωγή εμβρύου σε ψευδο-εγκύους ποντικούς ES κύτταρα στα οποία ένα από τα δύο αντίγραφα του γονιδίου έχει αντικατασταθεί με την μεταλλαγμένη μορφή Γέννηση ελέγχεται η παρουσία του τροποποιημένου γονιδίου σε σωματικά κύτταρα απογόνων και οι θετικοί απόγονοι διασταυρώνονται Διαγονιδιακός ποντικός με γαμετικά κύτταρα τα οποία περιέχουν και τροποιημένα αντίγραφα του γονιδίου-στόχου
Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας