igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

Κεφάλαιο 16 (+κεφάλαιο 9 Hartwell) Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Πήκτωμα αγαρόζης, στο οποίο έχουν διαχωριστεί με ηλεκτροφόριση τμήματα DNA, ενώ εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία. 2

ΕΙΚΟΝΑ 16.1. Θέση περιορισμού συμμετρική ως προς τον άξονα που περνά από το μέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρομη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση. 3

Εικόνα από το κεφ. 9 (Hartwell): Πως ανακαλύφθηκαν τα περιοριστικά ένζυμα Το βακτήριο στο δικό του DNA Τροποποιεί μέσω μεθυλίωσης τις θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενύμων έτσι ώστε να μην υφίσταται πέψη το γονιδίωμα του 4

>400 διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Πρώτο γράμμα: όνομα γένους Δεύτερο/τρίτο γράμμα: το όνομα του οργανισμού που απομονώθηκαν 5

7

ΕΙΚΟΝΑ 16.2 Παραδείγματα του τρόπου με τον οποίο τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA. (α) Η SmaI δημιουργεί λεία άκρα. (β) Η BamHI δημιουργεί προεξέχοντα 5 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. (γ) Η PstI δημιουργεί προεξέχοντα 3 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. DNA λιγάση: καταλύει το σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού. Τα συμπληρωματικά άκρα ζευγαρώνουν με δεσμούς υδρογόνου και συνδέονται με ομοιοπολικό δεσμό μέσω της DNA λιγάσης. Ισχύει και για τα τμήματα με λεία άκρα. 8

ΕΙΚΟΝΑ 16.3 Πέψη του DNA από το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Το ένζυμο EcoRI δημιουργεί δύο συμμετρικές εγκοπές που ονομάζονται ασυμπτωτικές. Έτσι προκύπτουν κολλώδη άκρα. Όταν δύο τμήματα DNA προέρχονται από πέψη με το ίδιο ένζυμο, έχουν τα ίδια κολλώδη άκρα και μπορούν να συνδεθούν μέσω ζευγαρώματος των συμπληρωματικών βάσεων. Οι εγκοπές που παραμένουν είναι δυνατόν να κλείσουν με το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών από την DNA λιγάση. 9

Πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης Χαρακτηριστικά Πλασμίδιο: εξωχρωμοσωμικό γενετικό στοιχείο το οποίο αντιγράφεται αυτόνομα μέσα στο κύτταρο. Είναι παράγωγα φυσικών πλασμιδίων που έχουν τροποποιηθεί Κυκλικό, δίκλωνο DNA Λειτουργικά στοιχεία Φέρουν αλληλουχία έναρξης της αντιγραφής για τον πολλαπλασιασμό τους Φέρουν δείκτη επιλογής για να διακρίνονται εύκολα τα κύτταρα E.coli που το περιέχουν. Φέρουν μια ή περισσότερες θέσεις αναγνώρισης θέσης περιορισμού 10

Εικόνα από το Κεφάλαιο 9 Hartwell Πρέπει να διασφαλίσουμε ότι το ανθρώπινο DNA θα εντεθεί στο πλασμίδιο και ότι το πλασμίδιο θα εντεθεί στο E.coli κύτταρο.

ΕΙΚΟΝΑ 16.4 Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης puc19. Το πλασμίδιο αυτό φέρει μια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), το δείκτη επιλογής amp R και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τμήμα άλφα του γονιδίου της β- γαλακτοσιδάσης, lacz +. Tο υπόλοιπο τμήμα της γαλακτοσιδάσης (τμήμα ω) βρίσκεται στο γονιδίωμα του βακτηρίου. α+ω = λειτουργική γαλακτοσιδάση (εκτός και αν στο α έχει εισαχθεί εξωγενές τμήμα DNA) 12

ΕΙΚΟΝΑ 16.5 Ένθεση ενός τμήματος DNA στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc19 και δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA. Blue-white selection με Xgal Κάποια παλσμίδια επανασυνδέονται με τη λιγάση χωρίς όμως να περιέχουν το νέο κομμάτι DNA. 13

Η χρησιμότητα της αλκαλικής φωσφατάσης στη δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA. Η αλκαλική φωσφατάση απομακρύνει τη 5 φωσφορική ομάδα από τα συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα του φορέα αφήνοντας μια 5 υδροξυλομάδα. Απουσία της φωσφορικής ομάδας η DNA λιγάση δεν μπορεί να συνδέσει τα κολλώδη άκρα του φορέα εκτός και αν υπάρχει ανάμεσα τους το υπό κλωνοποίηση νέο τμήμα DNA (το οποίο περιέχει τις φωσφορικές ομάδες)

Κάποια πλασμίδια φέρουν υποκινητές για την έναρξη της μεταγραφής Η χρησιμότητα της πέψης με δύο περιοριστικά ένζυμα. Κάποια πλασμίδια φέρουν υποκινητές που αναγνωρίζονται από τις RNA πολυμεράσες των φάγων για την έναρξη της μεταγραφής Η χρήση δύο περιοριστικών ενζύμων δεν επιτρέπει την επανακυκλοποίηση του πλασμιδίου χωρίς την ένθεση του νέου τμήματος DNA. Επίσης το νέο τμήμα DNA εισέρχεται στο φορέα με συγκεκριμένη κατεύθυνση.

ΕΙΚΟΝΑ 16.6 Τυπικό τεχνητό χρωμόσωμα ζυμομύκητα (YAC). YAC: φορέας που επιτρέπει την κλωνοποίηση μεγάλων τμημάτων DNA (0.2-2Mb) σε κύτταρα ζύμης. Τμήματα DNA >5-10kb σε μέγεθος είναι ασταθή όταν κλωνοποιούνται σε πλασμίδια. To YAC περιέχει: ένα τελομερές ζυμομύκητα (TEL) σε κάθε άκρο, ένα κεντρομερές ζυμομύκητα (CEN), ένα δείκτη επιλογής ζυμομύκητα σε κάθε βραχίονα (εδώ τους τροφικούς δείκτες TRP1 και URA3), μία αυτόνομα αντιγραφόμενη αλληλουχία (ARS) και θέσεις περιορισμού για την κλωνοποίηση του εξωγενούς DNA. 1. Τα ευκαρυωτικά χρωμοσώματα φέρουν τελομερή. 2. Τα γονίδια Trp1 και Ura3 στο YAC είναι τροφικοί δείκτες και επιτρέπουν σε ένα κύτταρο ζύμης που στερείται λειτουργικών γονιδίων Trp1και Ura3 να αναπτυχθεί σε θρεπτικό μέσο από το οποίο απουσιάζει η τρυπτοφάνη και ουρακίλη. 3. ARS: επιτρέπει στο φορέα την αντιγραφή 4. Ένα πολυσυνδέτη για την κλωνοποίηση. 16

Tεχνητό χρωμόσωμα βακτηρίων (BAC). BAC: φορέας που επιτρέπει την κλωνοποίηση μεγάλων τμημάτων DNA (300kb) σε E.Coli. To BAC φέρει τη θέση έναρξη αντιγραφής ενός φυσικού πλασμιδίου που ονομάζεται παράγοντας F. 1. repe: επιτρέπει την αντιγραφή του πλασμιδίου και τη ρύθμιση του αριθμού αντιγράφων 2. para και parb: επιτρέπει το διαχωρισμό του F plasmid DNA στα θυγατρικά κύτταρα. 3. Δείκτες επιλογής: για αντοχή στα αντιβιοτικά; Μερικά BACs έχουν lacz για blue/white selection. 4. T7 & Sp6 phage υποκινητές για τη μεταγραφή γονιδίων. Τα BACs φέρουν μικρότερα κομμάτια DNA από τα YACs αλλά προτιμώνται επειδή υφίστανται λιγότερες αναδιατάξεις μέσα στο ξενιστή. Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 17

Bιβλιοθήκες DNA Γονιδιωματική βιβλιοθήκη: συλλογή κλώνων που περιέχει όλες τις αλληλουχίες DNA του γονιδιώματος Χρωμοσωμικές βιβλιοθήκες: συλλογή κλώνων που περιέχει συγκεκριμένα τμήματα χρωμοσωμάτων Βιβλιοθήκες συμπληρωματικού DNA: συλλογή DNA κλώνων που προέρχονται από τα mrna του κυττάρου 18

Γονιδιωματική Bιβλιοθήκη Πλήρης πέψη του γονιδιωματικού DNA με ένζυμο περιορισμού: -αν το γονίδιο περιέχει >1 θέση περιορισμού, τότε θα χωρισθεί σε >2 τμήματα -με αλληλουχίες αναγνώρισης 6kb, τα ένζυμα κόβουν το DNA σε ±4kb (μικρό μέγεθος!) Μηχανική θραύση DNA με πέρασμα μέσα από λεπτή βελόνα. -μεγαλύτερα τμήματα 100-150kb αλλά τα άκρα των τμημάτων απαιτούν πρόσθετους χειρισμούς για να κλωνοποιηθούν σε πλασμίδια. Μηχανική θραύση + μερική πέψη με ένζυμο. -Παράγεται ένας πληθυσμός σχετικά μεγάλων αλληλοεπικαλυπτόμενων τμημάτων DNA. -στη συνέχεια γίνεται ηλεκτροφόρηση για να επιλεγούν τα τμήματα με το σωστό μέγεθος. 19

ΕΙΚΟΝΑ 16.7 Παραγωγή τμημάτων DNA κατάλληλου μεγέθους για την κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης, μέσω μερικής πέψης με ένζυμο περιορισμού. Sau3a: GATC Bamh1: GGATCC Τα Sau3a άκρα είναι συμπληρωματικά με εκείνα που προκύπτουν από πέψη με Bamh1 20

Πόσους κλώνους πρέπει να σαρώσει κανείς για να εντοπίσει σε μια βιβλιοθήκη το γονίδιο που επιθυμεί να κλωνοποιήσει; ln (1-P) N= ---------- ln (1-f ) Ν: α απαιτούμενος αριθμός κλώνων P: η επιθυμητή πιθανότητα f: το μέσο μέγεθος των τμημάτων DNA που θα εισαχθούν στο φορέα/συνολικό μεγέθους του γονιδιώματος ln: φυσικός λογάριθμος Για πιθανότητα 99%: Ζύμη (γονδίωμα: 12000kb/15kb τμηματα) 3682 κλώνοι Ανθρώπινο γονιδίωμα (3.000.000 kb 920.000 κλώνοι! F Για αυτό προτιμώνται τα YACs ή τα BACs

Χρωμοσωμικές βιβλιοθήκες Για να καταστεί πιο εύκολη η διαδικασία της σάρωσης ενός γονιδίου: Ξεχωριστές βιβλιοθήκες για κάθε χρωμόσωμα = 22 αυτοσωμικές +2 φυλετικές για τον άνθρωπο. Πως; Διαχωρισμός με κυτταρομετρία ροής 1. Χρώση με φθορίζουσα χρωστική των χρωμοσωμάτων 2. Ακτινοβόληση με δέσμη ακτίνων λέιζερ 3. Εκπομπή φθορίζουσας ουσίας 4. Διαχωρισμός με βάση την ένταση (λόγω και του διαφορετικού αρχικού μεγέθους των χρωμοσωμάτων)

Βιβλιοθήκες cdna ΕΙΚΟΝΑ 16.8 Σύνθεση δίκλωνου cdna από πολυαδενυλιωμένο mrna με τη χρήση της αντίστροφης μεταγραφάσης (RNA εξαρτώμενη DNA πολυμεράση), της RNάσης Η, της DNA πολυμεράσης Ι και της DNA λιγάσης. crna? 23

ΕΙΚΟΝΑ 16.9 Πως κλωνοποιούμε τα μόρια cdna σε φορείς Κλωνοποίηση cdna με τη χρήση linkers (συνδετών) BamHI. Πρόβλημα: οι θέσεις Bamh1 μπορεί να υπάρχουν και μέσα στο γονίδιο 24

ΕΙΚΟΝΑ 16.10 Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cdna με τη χρήση ενός σημασμένου αντισώματος. 25

ΕΙΚΟΝΑ 16.10 Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cdna με τη χρήση ενός σημασμένου αντισώματος. 26

ΕΙΚΟΝΑ 16.11 Σάρωση μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε πλασμιδιακό φορέα με ιχνηθέτη ένα σημασμένο μόριο DNA. 27

ΕΙΚΟΝΑ 16.11 Σάρωση μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε πλασμιδιακό φορέα με ιχνηθέτη ένα σημασμένο μόριο DNA. Η ραδιενεργή σήμανση του ιχνηθέτη γίνεται με αποδιάταξη της διπλής έλικας του DNA και ενίσχυση του ιχνηθέτη με τυχαίους εκκινητές (εξανουκλεοτίδια με τυχαία αλληλουχία) και ραδιοσημασμένα dntps. Μη ραδιενεργή σήμανση DNA με DIG-labeled dutp που ενσωματώνεται απέναντι από τα νουκλεοτίδια αδενίνης 28

ΕΙΚΟΝΑ 16.12 Παράδειγμα κλωνοποίησης ενός γονιδίου ζυμομύκητα (του ARG1) μέσω λειτουργικής συμπληρωματικότητας. ARG1: βιοσύνθεση αργινίνης URA3: βιοσύνθεση ουρακίλης 29

Ετερόλογοι ιχνηθέτες Εντοπισμός συγκεκριμένων γονιδίων σε μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη με τη χρήση ιχνηθετών cdna από ομόλογα γονίδια άλλων οργανισμών (ποντίκι άνθρωπος) Νουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες Εφόσον γνωρίζουμε μέρος της αμινοξικής αλληλουχίας του γονιδίου: Σχεδιάζουμε μείγμα με σημασμένα oligos 20bp όλων των δυνατών επιλογών βασιζόμενοι στον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα.

Μοριακή ανάλυση κλωνοποιημένου DNA

ΕΙΚΟΝΑ 16.13 Χαρτογράφηση περιορισμού: ο χάρτης που προκύπτει μετά από πέψη με ένα περιοριστικό ένζυμο 32

ΕΙΚΟΝΑ 16.13 Χαρτογράφηση περιορισμού. 33

ΕΙΚΟΝΑ 16.14 Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτώματος αγαρόζης (δεξιά) και τροφοδοτικό (αριστερά). 34

ΕΙΚΟΝΑ 16.15 Παράδειγμα χαρτογράφησης περιορισμού με σκοπό τον προσδιορισμό του προσανατολισμού ενός τμήματος DNA που έχει κλωνοποιηθεί σε κάποιο πλασμίδιο. 35

ΕΙΚΟΝΑ 16.16 Ανάλυση κατά Southern γονιδιωματικού DNA με σκοπό τον εντοπισμό αλληλουχιών συμπληρωματικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώνες καθίστανται ορατές μέσω αυτοραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας. 36

ΕΙΚΟΝΑ 16.16 Ανάλυση κατά Southern γονιδιωματικού DNA με σκοπό τον εντοπισμό αλληλουχιών συμπληρωματικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώνες καθίστανται ορατές μέσω αυτοραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας. 37

Ανάλυση κατά Northern: RNA 38

Ανάλυση κατά Western: πρωτείνες

ΕΙΚΟΝΑ 16.17 Αλληλούχιση με διδεοξυνουκλεοτίδια. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αναφέρεται στη θέση που καταλαμβάνουν στην υπό προσδιορισμό αλληλουχία τα νουκλεοτίδια τα οποία διαβάζονται σε κάθε διαδρομή. Για παράδειγμα, τα Α που διαβάζονται στην πρώτη διαδρομή βρίσκονται στις θέσεις 1, 6 και 8 της υπό προσδιορισμό αλληλουχίας. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αντιστοιχεί στην απόσταση ανάμεσα στο 3 άκρο του εκκινητή και στη θέση που ενσωματώθηκε το ddntp. Στο «μήκος των σημασμένων τμημάτων σε νουκλεοτίδια» δε λαμβάνεται υπόψη το μήκος του εκκινητή. 40

ΕΙΚΟΝΑ 16.18 Ένα διδεοξυνουκλεοτίδιο. 41

ΕΙΚΟΝΑ 16.19 Αυτοραδιογράφημα ενός πηκτώματος αλληλούχισης με τη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων. Τα γράμματα πάνω από τις διαδρομές (A, C, G και T) υποδεικνύουν το διδεοξυνουκλεοτίδιο που χρησιμοποιήθηκε στην αντίστοιχη αντίδραση. 42

ΕΙΚΟΝΑ 16.20 Αποτελέσματα αυτοματοποιημένης αλληλούχισης με διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 43

ΕΙΚΟΝΑ 16.21 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). 44

ΕΙΚΟΝΑ 16.21 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). RT-PCR 45