9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΕ ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ VIBRIO Κοκού Φ. 1,2, Μακρίδης Π. 2, Κεντούρη Μ. 1, Divanach P. 2 1 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, bio990@edu.biology.uoc.gr 2 Ινστιτούτο Υδατοκαλλιεργειών, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών Περίληψη Πέντε στελέχη αξενικών καλλιεργειών μικροφυκών, Chlorella minutissima, Tetraselmis chuii, Arthrospira platensis, Nannochloropsis sp. και Isochrysis sp., δοκιμάστηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση ενάντια σε πέντε παθογόνα στελέχη του γένους Vibrio,τα Vibrio alginolyticus, Vibrio lentus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio splendidus, και Vibrio scophthalmi, με τη μέθοδο της συγκαλλιέργειας. Έχει βρεθεί ότι τα μικροφύκη εκκρίνουν διάφορες βιοδραστικές ουσίες οι οποίες φαίνεται να έχουν άμεσο ενδιαφέρον για τη βιομηχανία και τις υδατοκαλλιέργειες, καθώς πολλές φορές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέσα βιοελέγχου του συστήματος εκτροφής των ιχθυονυμφών, οι οποίες είναι εξαιρετικά ευαίσθητες σε ευκαιριακά παθογόνα στελέχη. Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας συμφωνούν με τα παραπάνω, καθώς βρέθηκε ότι τα μικροφύκη μείωναν αισθητά τον πληθυσμό των παθογόνων που συνυπήρχαν στις καλλιέργειες ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις, μέσα σε 12 μόνο ώρες ο πληθυσμός τους μειώθηκε πάνω από 50% σε σχέση με το μάρτυρα. Λέξεις κλειδιά: αξενικός, συγκαλλιέργεια, βιοδραστικές ουσίες. EXAMINATION OF ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF MICROALGAE AGAINST MARINE PATHOGENS OF THE GENUS Vibrio Kokou F. 1,2, Makridis P. 2, Kentouri M. 1, Divanach P. 2 1 Biology Department, University of Crete, bio990@edu.biology.uoc.gr 2 Institute of Aquaculture, Hellenic Centre for Marine Research Abstract Five species of axenic cultures of microalgae, Chlorella minutissima, Tetraselmis chuii, Arthrospira platensis, Nannochloropsis sp. and Isochrysis sp., were tested for antimicrobial activity against five pathogens of the genus Vibrio, Vibrio alginolyticus, Vibrio lentus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio splendidus, and Vibrio scophthalmi, by co-cultivation method. It has been found that microalgae are able to excrete bioactive substances, which are products of their metabolism. This property of microalgae seems to interest industry and aquaculture, since these substances can be used as a means of biocontrol in larvae tanks. Opportunistic pathogenic bacteria may proliferate in rearing tanks and cause high mortalities of fish larvae. The results of the present study are in agreement with the above, since it was observed that after 12 hours of co-cultivation of microalgae with pathogenic bacteria, the bacterial populations were reduced with more than 50% of the initial number of colonies compared to control. Keywords: axenic, co-cultivation, bioactive substances. 1. Εισαγωγή Τα μικροφύκη θεωρούνται ως οι κύριοι πρωτογενείς παραγωγοί των υδατικών συστημάτων. Σαν ομάδα, μπορούν να προσαρμοσθούν σε διαφορετικές αβιοτικές και βιοτικές συνθήκες (υψηλές ή χαμηλές θερμοκρασίες, ευνοϊκές και δυσμενείς εντάσεις φωτός, χαμηλή διαθεσιμότητα σε θρεπτικά συστατικά κ.ά.). Τα μικροφύκη παράγουν μια ποικιλία από ουσίες που αναφέρονται ως δευτερογενείς μεταβολίτες, και διαφέρουν μεταξύ τους όσον αφορά τη χημική τους δομή και τη φυσιολογική τους λειτουργία. Τέτοιες μπορεί να είναι πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (Cohen & Vonshak, 1991), αμινοξέα και πεπτίδια, αντιβιοτικές και τοξικές ουσίες. Στις μονάδες εκτροφής ψαριών και καρκινοειδών, τα μικροφύκη χρησιμοποιούνται ως παράγοντες βιοελέγχου για την καταπολέμηση παθογόνων και ευκαιριακά βακτηρίων του θαλάσσιου -1267-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ περιβάλλοντος (Vine et al., 2006). Η τεχνική του «πράσινου νερού», που συνίσταται στην προσθήκη μικροφυκών στις δεξαμενές εκτροφής ιχθυονυμφών, έχει βρεθεί ότι έχει θετική επίδραση στη βιωσιμότητα των νυμφών (Oie et al., 1997) και στη σύνθεση των ειδών της εντερικής τους μικροχλωρίδας, ελαττώνοντας τους αριθμούς των οπορτουνιστικών βακτηρίων (Salvesen et al., 1999). Επιπλέον, τα μικροφύκη επιδρούν στη βακτηριακή κοινότητα των δεξαμενών εκτροφής (Salvesen et al., 1999) προάγοντας και/ή εμποδίζοντας την ανάπτυξη των βακτηρίων με την παραγωγή μεταβολιτών (Duff et al., 1996). ενώ ορισμένα είδη βακτηρίων που συμβιούν με μικροφύκη παρουσιάζουν αντιμικροβιακές ιδιότητες ενάντια σε παθογόνα βακτήρια (Makridis et al., 2006). Τέλος, από έρευνα που έχει πραγματοποιηθεί σε θαλάσσια μικροφύκη (Katharios et al., 2005), διαπιστώθηκε ότι αποτελούν μια εξαιρετική πηγή βιολογικά ενεργών προϊόντων που μπορούν να χρησιμεύσουν ως προληπτικά και θεραπευτικά απέναντι σε βακτηριακές ασθένειες των ψαριών. Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να προσδιορίσει την αντιμικροβιακή δράση καλλιεργούμενων μικροφυκών απέναντι σε παθογόνα βακτήρια των ψαριών, με σκοπό να τα προτείνει σαν εναλλακτική πηγή αντιβιοτικών ουσιών στις υδατοκαλλιέργειες. 2. Υλικά και Μέθοδοι Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Υδατοκαλλιεργειών, σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε.) Κρήτης. Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν καθαρά στελέχη βακτηρίων που απομονώθηκαν από καλλιέργειες του είδους Artemia sp. και από νοσούντα άτομα του είδους Sparus aurata (τσιπούρα) Από την Artemia sp. απομονώθηκε το παθογόνο Vibrio alginolyticus, από την τσιπούρα το Vibrio lentus, ενώ τρία επιπλέον στελέχη που προσβάλλουν ψάρια και καρκινοειδή προήλθαν από συλλογή καθαρών στελεχών (University of Marine Biological Research, Millpot, Scotland). Πρόκειται για τα Vibrio parahaemolyticus (NCIMB 1902), Vibrio splendidus (DMC 1), και Vibrio scophthalmi (NCIMP 13623). Τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα, υποβλήθηκαν σε φυσιολογικά τεστ για φαινοτυπικό χαρακτηρισμό, σύμφωνα με τους Smibert & Krieg, 1994: χρώση Gram, ζύμωση, KOH, οξειδάσης, καταλάσης, ανάπτυξη σε μέσο με έλλειψη Na +. Στη συνέχεια, έγινε μοριακός χαρακτηρισμός των μη ταυτοποιημένων στελεχών που απομονώθηκαν από την Artemia, την τσιπούρα και το λαβράκι με 16S rdna και υπολογίστηκε η πρότυπη καμπύλη αύξησης κάθε στελέχους με τη βοήθεια φωτόμετρου. Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν πέντε αξενικές καλλιέργειες καθαρών στελεχών μικροφυκών Chlorella minutissima, Tetraselmis chuii, Arthrospira platensis (PCC7345), Nannochloropsis sp. (CCAP849/9) και Isochrysis sp. (CCAP927/14). Τα δυο πρώτα είδη απομονώθηκαν από καλλιέργειες του Ινστιτούτου Υδατοκαλλιεργειών του Ελληνικού Κέντρου Θαλάσσιων Ερευνών (ΕΛ. ΚΕ.Θ.Ε.) Κρήτης. Τα αξενικά στελέχη Arthrospira platensis, Nannochloropsis sp. και Isochrysis sp., προμηθεύτηκαν από το Institut Pasteur, France (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) το πρώτο και από το Dunstaffnage Marine Laboratory, UK (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP) τα άλλα δύο. Οι αξενικές καλλιέργειες των μικροφυκών Chlorella minutissima, Tetraselmis chuii, Arthrospira platensis, Nannochloropsis sp. και Isochrysis sp., δοκιμάστηκαν για τα αν προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των επιλεγμένων παθογόνων βακτηρίων με τη μέθοδο της συγκαλλιέργειας (cocultivation method). Τα παθογόνα βακτήρια επωάστηκαν σε υγρή καλλιέργεια TSB (Tryptic Soy Broth) για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια έγινε εμβολιασμός σε 5 ml της καλλιέργειας των αξενικών μικροφυκών σε συγκέντρωση 10 4 CFU/ ml. Για τα πειράματα χρησιμο- -1268-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ποιήθηκαν δυο συνθήκες: ο μάρτυρας, δηλαδή οι καλλιέργειες των παθογόνων μέσα σε θρεπτικό μέσο F/2 των μικροφυκών, και οι καλλιέργειες των μικροφυκών που είχαν εμβολιαστεί με το κάθε παθογόνο. Η κάθε συνθήκη είχε δυο επαναλήψεις. Για κάθε δείγμα που λαμβανόταν πραγματοποιούνταν τρεις διαδοχικές αραιώσεις (1:10-1:100) και από κάθε αραίωση απλώνονταν 50μl δείγματος σε τρία πιάτα πετρί με θρεπτικό μέσο (ψευδοεπαναλήψεις). Τα παθογόνα επωάστηκαν μαζί με τα μικροφύκη σε θερμοκρασία 26-34 ο C και φυσική φωτοπερίοδο (1500-1700 lux κατά τη διάρκεια της ημέρας) για πέντε ημέρες και ελήφθησαν δείγματα 0, 12, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά τον εμβολιασμό. Οι πληθυσμοί των παθογόνων εκτιμήθηκαν απλώνοντας 50 μl από αδιάλυτα ή διαλυμένα (1:10-1:10000) δείγματα πάνω σε στερεό θρεπτικό μέσο TSA (Tryptic Soy Agar). Οι αποικίες των παθογόνων μετρήθηκαν και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά του μάρτυρα. Για κάθε χρονικό σημείο της δειγματοληψίας, το ποσοστό μείωσης των παθογόνων βακτηρίων υπολογίστηκε με βάση τον ακόλουθο τύπο: % Μείωση Vibrio = Vh a Vh m 100% / Vh a Όπου: Vh a, ο αριθμός των Vibrio του μάρτυρα (σε CFU/mL), και Vh m, ο αριθμός των Vibrio της συγκαλλιέργειας (σε CFU/mL). Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με μονοπλευρο (non paired) t-test μεταξύ του πληθυσμού των παθογόνων του μάρτυρα και αυτού που συγκαλλιεργήθηκε με το κάθε μικροφύκος την ίδια χρονική στιγμή, ενώ σε περιπτώσεις που ο πληθυσμός δεν ήταν κανονικός χρησιμοποιήθηκε το κριτήριο Mann-Whitney για ανεξάρτητα δείγματα (Zaar, 1998). 3. Αποτελέσματα Τα βακτηριακά στελέχη που απομονώθηκαν από την καλλιέργεια της Artemia sp. και την τσιπούρα, υποβλήθηκαν σε φαινοτυπικά και βιοχημικά τεστ για να καθοριστούν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους, και στη συνέχεια έγινε αναζήτηση ομολογίας της 16S rdna αλληλουχίας τους μέσω του προγράμματος BLAST (Altschul et al.,1990), η οποία ήταν σε συμφωνία με το βιοχημικό χαρακτηρισμό των στελεχών. Στα πειράματα συγκαλλιέργειας μικροφυκών παθογόνων, παρατηρήθηκε μείωση του αριθμού των παθογόνων βακτηρίων σε σχέση με το μάρτυρα. Σε κάποιες περιπτώσεις, όπως στα είδη C.minutissima, Nannochloropsis sp. και Isochrysis sp., η μείωση ήταν έντονα αισθητή από τις 12 πρώτες ώρες της συγκαλλιέργειας. Όταν τα παθογόνα συγκαλλιεργήθηκαν με το είδος Nannochloropsis sp. μειώθηκε στα περισσότερα στελέχη, ο αριθμός των αποικιών τους (CFU) σε ποσοστό κάτω του 20% του αρχικού αριθμού. Είναι αξιοσημείωτο ότι σε όλες τις συγκαλλιέργειες, ανθεκτικότερο στέλεχος ήταν το V. alginolyticus, του οποίου ο πληθυσμός τις περισσότερες φορές δεν μειώθηκε από τις πρώτες ώρες συγκαλλιέργειας, όπως συνέβη με τα υπόλοιπα στελέχη, αλλά εμφάνισε ελάττωση μετά τις 72 ώρες. Σε κάθε περίπτωση όμως, ο πληθυσμός του στελέχους αυτού ήταν στατιστικά πολύ μικρότερος σε σύγκριση με το μάρτυρα (Εικ. 1). 4. Συζήτηση Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας έδειξαν ότι οι αξενικές καλλιέργειες των μικροφυκών C. minutissima, T. chuii, A. platensis, Nannochloropsis sp. και Isochrysis sp. εμφανίζουν αντιμικροβιακή δράση ενάντια στα παθογόνα V. alginolyticus, V.lentus, V.splendidus, V.scopthalmi και V.parahaemolyticus, καθώς εμπόδισαν αποτελεσματικά την αύξηση του πληθυσμού των παθογόνων, όταν συγκαλλιεργήθηκαν με αυτά. Τα είδη C. minutissima και Nannochloropsis sp. ήταν αυτά που έδωσαν τα πιο ενθαρρυντικά αποτελέσματα, καθώς μέσα σε 12 μόλις ώρες κατάφεραν να ελαττώσουν το CFU των παθογόνων κάτω από το 50% του αρχικού αριθμού των παθογόνων. Για το είδος Nannochloropsis sp. δεν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με την αντιμικροβιακή του -1269-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 1: Συγκαλλιέργειες των παθογόνων με τα μικροφύκη α) Isochrysis sp., β) Nannochloropsis sp., γ) C.minutissima, δ) A.platensis, ε) T.chuii και στ) ο μάρτυρας. Στον κάθετο άξονα απεικονίζεται το ποσοστό CFU (± τυπική απόκλιση, SD) του πληθυσμού των βακτηρίων σε σχέση με τον αρχικό πληθυσμό και στον οριζόντιο άξονα οι ώρες μετά τον εμβολιασμό. δράση. Υπάρχουν μονάχα κάποια αποτελέσματα των Halevy et al. (1986), οι οποίοι ανέφεραν ότι το μικροφύκος N. oculata δεν εμφανίζει ισχυρή αντιμικροβιακή δράση, καθώς εμποδίζει ελάχιστα την ανάπτυξη ενός μεγάλου εύρους βακτηρίων. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι ίσως να πρόκειται για διαφορετικό στέλεχος του Nannochloropsis sp., το οποίο αντίθετα με το είδος N. occulata, εμφανίζει αντιμικροβιακή δράση ή εμποδίζει την ανάπτυξη μονάχα οπορτουνιστικών βακτηρίων και όχι άλλων στελεχών. -1270-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Όπως ήδη αναφέρθηκε αντιμικροβιακή δράση έχει παρατηρηθεί και στο μικροφύκος C. minutissima (Katharios et al., 2005), όμως οι μηχανισμοί λειτουργίας της δεν έχουν ακόμη καθοριστεί. Ένας μηχανισμός που έχει αναφερθεί είναι ότι πιθανόν να σχετίζεται με τα συμβιωτικά βακτήρια που αναπτύσσονται μέσα στις καλλιέργειες των μικροφυκών, και εμποδίζουν την ανάπτυξη παθογόνων βακτηρίων (Makridis et al., 2006). Η δράση αυτή μπορεί να οφείλεται σε παραγωγή βακτηριοστατικών ουσιών από τα βακτήρια ή ανταγωνισμό μεταξύ των βακτηριακών πληθυσμών για θρεπτικά ή οικοθέσεις. Από τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας όμως προέκυψε ότι κάποιοι παράγοντες - και όχι τα βακτήρια - που πιθανόν προέρχονται από τα ίδια τα φύκη, εμποδίζουν την ανάπτυξη των παθογόνων στελεχών μέσα στην καλλιέργεια. Οι Tendencia et al. (2004) βρήκαν ότι όταν αξενική καλλιέργεια του μικροφύκους Chlorella sp. συγκαλλιεργήθηκε με το παθογόνο V. harvei με 10 3 cfu/ml συγκέντρωση, επιβράδυνε την ανάπτυξη του μέσα σε 72 ώρες. Η αντιβακτηριακή δράση ακόρεστων και κορεσμένων λιπαρών οξέων μακριάς αλυσίδας έχει παρατηρηθεί από τους Galbraith and Miller (1973). Συγκεκριμένα, έδειξαν ότι λιπαρά οξέα με μήκος αλυσίδας μεγαλύτερο από 10 άτομα άνθρακα προκαλούσε λύση σε βακτηριακούς πρωτοπλάστες. Επιπλέον, πολλοί συγγραφείς κατέγραψαν αντιμικροβιακές ιδιότητες σε μικροφύκη εξαιτίας της παραγωγής και απελευθέρωσης λιπαρών οξέων από αυτά (Duff et al., 1966). Το γεγονός αυτό πιθανόν να εξηγεί την ύπαρξη αντιμικροβιακής δράσης στο μικροφύκος Nannochloropsis sp., καθώς το είδος αυτό περιέχει μεγάλες ποσότητες εικοσιπεντανοϊκού οξέος (ΕΡΑ; Sukenik, 1999). Το ίδιο θα μπορούσε να προταθεί και για το μικροφύκος Isochrysis sp., το οποίο, φάνηκε από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης να εμποδίζει την ανάπτυξη των βακτηρίων μετά από 24 ώρες συγκαλλιέργειας. Το συγκεκριμένο είδος χρησιμοποιείται ευρέως στις υδατοκαλλιέργειες ως πηγή τροφής, εξαιτίας της υψηλής περιεκτικότητας του σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, και κυρίως DHA (Jeffrey et al., 1994). Η σύσταση αυτή του μικροφύκους πιθανόν να εξηγεί την αντιμικροβιακή του δράση, αν και δεν έχει αναφερθεί άλλοτε στη βιβλιογραφία. Στην παρουσία ενός λιπαρού οξέος έχουν αποδώσει και την αντιμικροβιακή δράση του μικροφύκους A. platensis (Belay et al., 1993) η οποία παρατηρήθηκε και στην παρούσα μελέτη. Έρευνες έχουν δείξει ότι εκτός από την αντιμικροβιακή του δράση, το μικροφύκος A. platensis εμφανίζει και ανοσοενισχυτικές ιδιότητες. Χορήγηση του μικροφύκους σε ψάρια με την τροφή τους βρέθηκε ότι βοηθάει στη βελτίωση του ανοσοποιητικού τους συστήματος, αλλά εμφανίζει και θεραπευτικές ιδιότητες (Belay et al., 1996). Το μικροφύκος T. chuii εμφάνισε αντιμικροβιακή δράση, αναστέλλοντας την ανάπτυξη των παθογόνων μετά από 24 ώρες συγγκαλλιέργειας. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενα πειράματα, όπου πραγματοποιήθηκαν in vivo δοκιμές με το αξενικό είδος T. suecica χρησιμοποιώντας το ως πηγή τροφής σε εκκολαπτήριο της λευκής γαρίδας Fenneropenaus indicus (Regunathan and Wesley, 2004). Ο αριθμός των Vibrio στο νερό, στο έντερο των νυμφών και στα αυγά ελαττώθηκε μετά τη χρήση συμπυκνώματος του μικροφύκους, βελτιώνοντας ταυτόχρονα και τη βιωσιμότητα των νυμφών. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε καλλιέργειες του καρκινοειδούς A. franciscana, όταν τρεφόταν με το μικροφύκος Tetraselmis sp., το οποίο συνέβαλλε στην ελάττωση του αριθμού των οπορτουνιστικών βακτηρίων στο νερό και στο έντερο των ζώων και ειδικά του παθογόνου V.alginolyticus, που κυριαρχεί στις καλλιέργειες της Artemia (Olsen et al., 2000). Επίσης, παρατηρήθηκε ότι καλλιέργειες του μικροφύκους Tetraselmis sp. εμφάνιζαν χαμηλά επίπεδα οπορτουνιστικών βακτηρίων, και επιπλέον ελάττωναν το μικροβιακό φόρτο κατά 66%, όταν εμπλούτιζαν καλλιέργειες της A. franciscana (Makridis et al., 2006). Το γεγονός αυτό δείχνει ότι το μικροφύκος T. chuii αποτελεί ένα ιδανικό είδος για την εφαρμογή της τεχνικής του «πράσινου νερού» στην εκτροφή νυμφών, ελαττώνοντας το μικροβιακό φορτίο και την ανάπτυξη παθογόνων στελεχών. -1271-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403-410. Belay, A., Ota, Y., Miyakawa, Y. & Shimamatsu, H., 1993. Current knowledge on potential health benefits of Spirulina. Journal of Applied Phycology 5: 235-241. Belay, A., Kato, T. & Ota, Y., 1996. Spirulina (Arthrospira): potential application as an animal feed supplement. International Association of Applied Algology 7th International Conference Abstracts, 23 p. Cohen, Z. & Vonshak, A., 1991. Fatty acid composition of Spirulina and Spirulina-like cyanobacteria in relation to their chemotaxonomy. Phytochemistry 30: 205 206. Duff, D.C.B., Bruce, D.L. & Anita, N.J., 1966. The antibacterial activity of marine planktonic algae. Canadian Journal of Microbiology 12: 877 884. Galbraith, H. & Miller, T.B., 1973. Effect of metal cations and ph on the antibacterial activity and uptake of long chain fatty acids. Journal of Applied Bacteriology 36: 635 646. Halevy, S., Jeffrey, S.W. & Garland, C.D., 1986. The use of algae for biological control of animal diseases in marine aquaculture. Unpublished data (internal CSIRO report). Jeffrey, S.W., Brown, M.R., & Volkman, J.K., 1994. Haptophyte as feedstocks in mariculture. In The Haptophyte Algae. Green J.C. & Leadbeater B.S.C. (Eds.), Clarendon Press, Oxford, 287-302 pp. Katharios, P., Papadakis, I.E., Prapas, A., Dermon, A.C., Ampatzis, K., & Divanach, P., 2005. Mortality control of viral encephalopathy and retinopathy on 0+ grouper Epinephelus marginatus after prolonged bath in dense Chlorella minutissima culture. Bulletin of European Association Fish Pathology 25: 28-31. Makridis, P., Costa, R.A., & Dinis, T., 2006. Microbial condition and antimicrobial activity in cultures of two algal species, Tetraselmis chuii and Chlorella minutissima, and effect on bacterial load of enriched Artemia metanauplii. Aquaculture 255: 76-81. Oie, G., Makridis, P., Reitan, K.I. & Olsen, Y., 1997. Protein and carbon utilization of rotifers (Brachionus plicatilis) in first feeding of turbot larvae (Scophthalmus maximus L.). Aquaculture 153: 103 122. Olsen A.I., Olsen Y., Attramadal Y., Christie K., Birkbeck T.H., Skjermo J. & Vadstein O., 2000. Effects of short term feeding of microalgae on the bacterial flora associated with juvenile Artemia franciscana. Aquaculture 190: 11 25. Regunathan, C. & Wesley, S.G., 2004. Control of Vibrio spp. in shrimp hatceries using the green algae Tetraselmis suecica. Asian Fisheries Science 17: 147-158. Salvesen, I., Skjermo, J. & Vadstein, O., 1999. Growth of turbot (Scophthalmus maximus L.) during first feeding in relation to the proportion of r/k strategists in the bacterial community of the rearing water. Aquaculture 175: 337 350. Smibert, R.M. & Krieg, N.R., 1994. Phenotypic characterization. In: Methods for General and Molecular Biotechnology, Gerhardt P., Wood W.A.& Krieg N.R. (Eds), American Society for Microbiology, Washington D.C, 607-654 pp. Sukenik, A., 1999. Production of eicosapentanoic acid by the marine eustigmatophyte Nannochloropsis. In: Chemicals from Microalgae, Taylor and Francis, London, 41-56 pp. Tendencia, E.A., de la Pena M.R., Fermin, A.C., Lio-Po, G., Choresca, Jr. C.H. & Inui, Y., 2004. Antibacterial activity of tilapia Tilapia hornorum against Vibrio harveyi. Aquaculture 232: 148 152. Vine, N.G., Leukes, W.D. & Kaiser, H., 2006. Probiotics in marine larviculture. FEMS Microbiol Rev 30; 404-427. Zaar, J.H., 1998. Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, New Jersey, 620 pp. -1272-