ΑΣΚΗΣΗ 3 ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ANIXNEΥΣΗ ΤΗΣ ΕΚΚΡΙΝΟΜΕΝΗΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α 2 1. Ηλεκτρομεταφορά και ακινητοποίηση των διαχωρισμένων πρωτεϊνών σε μεμβράνη. 2. Ανοσοαποτύπωση - υβριδισμός με αντισώματα. 3. Ανίχνευση φωσφολιπάσης Α 2. 4. Προσδιορισμός μοριακής μάζας της φωσφολιπάσης Α 2. Εισαγωγή H τεχνική της ανοσοαποτύπωσης είναι μέθοδος ανίχνευσης και ημιποσοτικού προσδιορισμού μιας επιθυμητής πρωτεΐνης σε άγνωστο βιολογικό δείγμα. Εφαρμόζεται σε μίγμα πρωτεϊνών που έχουν διαχωρισθεί με SDS-PAGE. Στηρίζεται στην ειδική σύνδεση της πρωτεΐνης με ειδικό πρώτο αντίσωμα. Η ανίχνευση γίνεται μετά από σύνδεση του πρώτου αντισώματος με ένα δεύτερο. Συνήθως ονομάζουμε την τεχνική western blotting ή immunoblotting, κατ αναλογία με την τεχνική southern blotting, η οποία εφαρμόζεται σε νουκλεϊκά οξέα και εφευρέθηκε από τον E.M. Southern. Τα στάδια της ανοσοαποτύπωσης είναι συνοπτικά τα εξής: Προκατεργασία πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολουθεί διαχωρισμός με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE. Στη συνέχεια, γίνεται ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από το πήγμα πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη (νιτροκυτταρίνη ή PVDF). Οι πρωτεΐνες που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες μεταφέρονται από το πήγμα προς τη μεμβράνη με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου (διαφοράς δυναμικού). H μεμβράνη επωάζεται με ένα διάλυμα πρωτεΐνης (αραιωμένο διάλυμα γάλακτος) προκειμένου να καλυφθούν μη ειδικές θέσεις της μεμβράνης (θέσεις που δεν έχουν προσδεθεί πρωτεΐνες). 210
Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με κατάλληλο πρώτο αντίσωμα που προσδένεται στην επιθυμητή πρωτεΐνη. Ανοσοανίχνευση: Η μεμβράνη επωάζεται με κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι ικανό να αναγνωρίζει και να δεσμεύεται στο πρώτο. Το δεύτερο αντίσωμα περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμο-δείκτη που αντιδρά με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα και δίνει έγχρωμο προϊόν, που ανιχνεύεται φωτομετρικά ή εκπέμπει φως (αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας) οπότε και επιτυγχάνεται η εμφάνιση των προσδιοριζόμενων πρωτεϊνών σε ειδικό φιλμ. Με τον τρόπο αυτό ανιχνεύεται έμμεσα η επιθυμητή πρωτεΐνη. Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης και η βαφή των πηγμάτων είναι ιδανική για την εξέταση όλων των πρωτεϊνών που υπάρχουν στο δείγμα. Ωστόσο, δεν παρέχουν επαρκείς πληροφορίες για συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης είναι απαραίτητη η χρήση ανοσοχημικών μεθόδων. Η μέθοδος αυτή της ανοσοαποτύπωσης ή western blotting, χρησιμοποιεί αντισώματα για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης μετά τη μεταφορά της από το πήγμα σε μεμβράνη PVDF. Για την απεικόνιση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισωμάτων χρησιμοποιούνται ενζυμικοί δείκτες, συζευγμένοι σε δεύτερα αντισώματα, οι οποίοι στη συνέχεια ανιχνεύονται με τη χρήση του κατάλληλου υποστρώματος μέσω χημειοφωταύγειας. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φιλμ. Οι ζώνες αυτές στη συνέχεια μπορούν να αναλυθούν για περαιτέρω πληροφορίες, με τη χρήση ειδικών υπολογιστικών προγραμμάτων. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΉ ΠΟΡΕΊΑ Υλικά και συσκευές Συσκευή ανοσοαποτύπωσης (Amersham Biosciences Corp). Μεμβράνη μεταφοράς πρωτεϊνών PVDF (Bio-Rad). Διηθητικό χαρτί. Blotter paper (Amersham Biosciences). Tween-20. Trizma Base (C 4 H 11 NO 3, FW:121.14). Διαλύματα χημειοφωταύγειας (ECL AmershamBiosciences). Κασετίνα εμφάνισης των φιλμ (LifeRay Ferrania Incorp). 211
Φιλμ. Υγρό εμφάνισης του φιλμ,ph 9-12). Υγρό μονιμοποίησης του φιλμ. Σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος εμπορίου. Διαλύματα 1. Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) 7.2g γλυκίνης, 1.5g Tris-base και 5mL 10% SDS προστίθενται σε 400mL νερού και αναδεύονται. Ο όγκος συμπληρώνεται στα 500mL με την προσθήκη 100mL μεθανόλης. Το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 ο C. 2. Διάλυμα έκπλυσης TBS (10x) 24.2g Tris-base και 80g NaCl προστίθενται σε νερό συνολικού όγκου 1L και ρυθμίζεται το ph στο 7.6. Το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 ο C. 3. Διάλυμα έκπλυσης εργασίας TBS-Tween 20 με αναστολέα πρωτεασών για την προστασία των πρωτεϊνών 100mL του διαλύματος έκπλυσης 10x αραιώνονται με νερό σε συνολικό όγκο 1L. Στη συνέχεια προστίθεται 1mL Tween-20. Το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 C. 4. Διάλυμα εμφάνισης φιλμ (Development) 50mL υγρού εμφάνισης αραιώνονται με νερό σε συνολικό όγκο 200mL. Το διάλυμα φυλάσσεται σε σκουρόχρωμο φιαλίδιο. 5. Διάλυμα μονιμοποίησης φιλμ (Fixer) 50mL υγρού εμφάνισης αραιώνονται με νερό σε συνολικό όγκο 200mL. Το διάλυμα φυλάσσεται σε σκουρόχρωμο φιαλίδιο. 6. Αντισώματα Πρωτεύοντα αντίσωματα: Rabbit anti-human spla 2 τύπου ΙΙΑ (αραίωση 1:1,000). 10μL στα 10mL TBS-Tween 20 Mouse-monoclone β-actin (C-4) (αραίωση 1:500). 10μL στα 5mL TBS-Tween 20 Δευτερεύοντα αντίσωματα: Goat anti-rabbit (αραίωση 1:5,000). 2μL στα 10mL TBS-Tween 20 Rabbit anti-mouse (αραίωση 1:5,000). 212
2μL στα 10mL TBS-Tween 20 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών Προετοιμασία της μεμβράνης PVDF Για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήγμα, χρησιμοποιείται μεμβράνη PVDF διαστάσεων όμοιων με αυτών του πήγματος (6x9cm). Η μεμβράνη διαβρέχεται με μεθανόλη 100%, ξεπλένεται με νερό και μετά τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς για περίπου 15 λεπτά. -Κατά τη διαδικασία αυτή φοράμε πάντα γάντια για να μην ρυπάνουμε το πήγμα- Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, το πήγμα εμβαπτίζεται σε διάλυμα μεταφοράς. Εκεί το τζάμι αναποδογυρίζεται έτσι ώστε το πήγμα να βρίσκεται από κάτω για να αποχωριστεί. Στη συσκευή μεταφοράς τοποθετούνται με την ακόλουθη σειρά: 2 διηθητικά χαρτιά μεγάλου πάχους, 1 απλό, η μεμβράνη PVDF, το πήγμα, 1 απλό και 2 διηθητικά χαρτιά μεγάλου πάχους που έχουν εμβαπτισθεί σε διάλυμα μεταφοράς. Προσοχή θα πρέπει να δοθεί ώστε να μην παγιδευτούν φυσαλίδες αέρα μεταξύ αυτών. Η PVDF βρίσκεται πάντα προς τη πλευρά του θετικού πόλου (κόκκινος πόλος). Η μεταφορά επιτυγχάνεται στα 75mA για ένα πήγμα ή στα 150 ma για δύο, για χρονικό διάστημα μεταξύ μίας και μιάμισης ώρας. Η διάρκεια μεταφοράς εξαρτάται από τη μοριακή μάζα των πρωτεϊνών. Για πρωτεΐνες με μεγαλύτερη μάζα απαιτείται περισσότερος χρόνος. Μετά το πέρας της μεταφοράς το πήγμα βάφεται με Coomassie blue για να διαπιστωθεί η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας. H βαφή Coomassie blue συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες μέσω ιοντικών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με ομάδες αμινοξέων. Μετά το πέρας της αντίδρασης χρώσης ακολουθεί επώαση σε διάλυμα αποχρωματισμού, κατά την οποία η χρωστική απομακρύνεται από μη πρωτεϊνικές περιοχές του πήγματος και οι περιοχές πρωτεΐνης εμφανίζονται ως ζώνες βαθυκύανου χρώματος. Κατεργασία πρωτεϊνών στη μεμβράνη Μετά το πέρας της μεταφοράς, η μεμβράνη επωάζεται για τουλάχιστον τέσσερις ώρες σε ψυχρό περιβάλλον (4 C) με διάλυμα 5% γάλακτος-διαλύματος έκπλυσης (Blocking Buffer) [2.5g σκόνη γάλακτος σε 50mL TBS, ανάδευση 10 λεπτά] για κορεσμό των περιοχών της μεμβράνης όπου δεν υπάρχουν πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, η μεμβράνη εκπλένεται και επωάζεται για όλη τη νύχτα σε αναδευτήρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το κατάλληλο μίγμα αντισωμάτων σε διάλυμα TBS-Tween 20. Ακολουθούν 3 πεντάλεπτες εκπλύσεις με TBS-Tween 20 και μιάμιση ώρα επώασης με το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα (αντι-αντίσωμα), σε διάλυμα TBS-Tween 20. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συζευγμένο 213
με τη χημική ένωση (ένζυμο) που προκαλεί χημειοφωταύγεια. Τέλος, η μεμβράνη εκπλένεται 3 φορές από 5min κάθε φορά. Εμφάνιση πρωτεϊνών Η μεμβράνη επωάζεται για 5min με το μίγμα (1:1) χημειοφωταύγειας (ECL). Στη συνέχεια τοποθετείται στην ειδική κασετίνα εμφάνισης. Στο σκοτεινό θάλαμο, κόβεται κομμάτι φιλμ, όμοιων διαστάσεων με την μεμβράνη, τοποθετείται πάνω στη μεμβράνη, σημειώνονται τα άκρα της με μαρκαδόρο και η κασετίνα κλείνεται. Το φιλμ παραμένει στην κασετίνα μερικά λεπτά. Στη συνέχεια το φιλμ τοποθετείται στο διάλυμα εμφάνισης (Development) για μερικά λεπτά έως ότου εμφανιστούν οι ζώνες και τοποθετείται στο διάλυμα μονιμοποίησης (Fixer). Τέλος, το φιλμ εκπλένεται με νερό και αφήνεται να στεγνώσει. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται με τα αντισώματα ακτίνης για να ελεγχθεί η ισοφόρτωση των δειγμάτων. 214