ΜΙΚΡΟΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ: ΝΕΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ Faulwetter, Sarah & Αρβανιτίδης, Χρήστος Abstract MICROTOMOGRAPHY: NEW APPROACHES TO MARINE BIODIVERSITY RESEARCH Faulwetter, Sarah & Arvanitidis, Christos The Institute of Marine Biology and Genetics has recently acquired a SkyScan 1172 microcomputertomograph, in the framework of the European project MARBIGEN. Microcomputertomography (also known as microtomography or micro-ct) is a recently developed technique which follows the same principles as clinical tomography, but it can be applied to samples of a few centimetres or even millimetres and results in high-resolution images. The images are acquired by placing an object between a camera (detector) and an x-ray source. The object is rotated and projection images from each angle (<1 ) are obtained. These images, after processing, are finally assembled to display a three-dimensional image which can be interactively rotated, zoomed or dissected. Micro-CT is an established technique in various research fields such as geology, material sciences, food production or preclinical studies, but only recently it has been applied to biodiversity studies. The scanning of microscopic organisms, the study of developmental stages, research in functional morphology and the analysis of fossils are possible applications of the technology. Microtomography seems to have great potential for many possible and promising applications in the field of marine biodiversity research. Το Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής έχει πρόσφατα προμηθευτεί ένα υπολογιστικό μικροτομογράφο Skyscan 1172 (Εικ. 1), στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού Προγράμματος MARBIGEN. Η υπολογιστική μικροτομογραφία ακτίνων Χ (ή απλά ροτομογραφία ή micro-ct) είναι μια νέα τεχνική παρόμοια με την ιατρική τομογραφία αλλά εφαρμόζεται σε κλίμακες μεγέθους χιλιοστού ή εκατοστού και παράγει εικόνες υψηλότερης διακριτικής ικανότητας. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την απεικόνιση των εξωτερικών και εσωτερικών μικροδομών του αντικειμένου υπό μελέτη σε τρεις διαστάσεις, όπως και άλλες πρόσφατες τεχνικές όπως τα συνεστιακά μικροσκόπια σάρωσης με ακτίνες Laser (Confocal laser scanning microscopy), η απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (micro magnetic resonance imaging, µmri), η οπτική προβολική τομογραφία (Optical Projection Tomography, OPT). Η μικροτομογραφία διαφέρει από αυτές τις τεχνικές διότι χρησιμοποιώντας ακτίνες Χ επιτρέπει τη σάρωση αρκετά πυκνών υλικών. Εικόνα 1: Ο μικροτομογράφος SkyScan 1172 εγκατεστημένος στα εργαστήρια του ΙΘΑΒΙΓ H απόκτηση μίας τρισδιάστατης εικόνας πραγματοποιείται σε τρία βήματα (Εικ. 3): 1. Σάρωση: Το δείγμα τοποθετείται μεταξύ μιας κάμερας (ανιχνευτής) και μιας πηγής ακτίνων Χ και περιστρέφεται. Από κάθε γωνία (συνήθως μικρότερη από 1 ) αποκτάται μια εικόνα προβολής (Εικ. 2). Οι εικόνες οι οποίες παράγονται με αυτό το τρόπο είναι εικόνες
διαβάθμισης του γκρι στις οποίες απεικονίζεται η απορρόφηση της ακτίνας από το αντικείμενο: πυκνές περιοχές (μεγάλη απορρόφηση των ακτίνων Χ) αντιστοιχούν στο μαύρο χρώμα, λιγότερο πυκνές περιοχές (μικρή απορρόφηση των ακτίνων Χ) στο λευκό (Εικ.3). 2. Ανακατασκευή Εικόνας: Από το σύνολο εικόνων προβολής υπολογίζονται ένα δεύτερο σύνολο εικόνων οι οποίες αποτελούν τομές διαμέσου του αντικειμένου. Για κάθε εικόνα προβολής υπολογίζονται όλες οι δυνατές θέσεις των σημείων απορρόφησης και απεικονίζονται ως γραμμές. Επαναλαμβάνοντας τη διαδικασία αυτή για κάθε οπτική γωνία, η εικόνα βελτιώνεται. Αυτή η μαθηματική επεξεργασία ονομάζεται οπισθοπροβολή (back projection). Η διαδικασία παρουσιάζεται σχηματικά στην Εικόνα 4 για ένα απλό κυκλικό αντικείμενο. 3. Επεξεργασία εικόνων: Το σύνολο των τομογραφιών μπορεί να αναλυθεί ποιοτικά και ποσοτικά. Για την ποσοτική ανάλυση των τρισδιάστατων δεδομένων υπάρχει πληθώρα λογισμικών. Η ποιοτική ανάλυση μπορεί να γίνει είτε σε δύο διαστάσεις (εικόνες τομών), είτε σε τρεις διαστάσεις: η στοίβα των τομών απεικονίζονται ως διαδραστικό τρισδιάστατο είδωλο το οποίο μπορεί να περιστρέφεται, να μεγεθύνεται και να τέμνεται εικονικά (απόδοση όγκου). Εικόνα 2: Σχηματική αναπαράσταση της απόκτησης εικόνας στο μικροτομογράφο Εικόνα 3: Επεξεργασία εικόνων: από εικόνες προβολής σε ένα τρισδιάστατο είδωλο
Εικόνα 4: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας της ανακατασκευής εικόνας για ένα απλό κυκλικό αντικείμενο Η μικροτομογραφία αποτελεί ήδη σημαντικό εργαλείο σε πολλά επιστημονικά πεδία, π.χ. στη γεωλογία, στην επιστήμη υλικών, στην παραγωγή τροφίμων και στις προκλινικές μελέτες. Όμως, η εφαρμογή της στη μελέτη της βιοποικιλότητας έχει αρχίσει μόνο πρόσφατα (π. χ. Alba-Tercedor et al. 2011, Dinley et al. 2010, Golding & Jones 2006, Holford 2008, Huckstorf & Wirkner 2011). Φαίνεται ότι η τεχνολογία παρουσιάζει πληθώρα υποσχόμενων επιθυμητών εφαρμογών στη μελέτη τις θαλάσσιας βιοποικιλότητας. Τα σύγχρονα μηχανήματα διαθέτουν διακριτική ικανότητα κάτω από 1μm/pixel. Έτσι, η διακριτική ικανότητα δεν φτάνει στο εύρος του SEM καίτοι τα πλεονεκτήματα του συστήματος οφείλονται στην ικανότητά του να απεικονίζει όχι μόνο την εξωτερική μορφολογία των οργανισμών αλλά και τα εσωτερικά χαρακτηριστικά τους (Εικ. 5 & 6). Εικόνα 5: Eunice sp. (Πολύχαιτος): Τομές από διαφορετικές όψεις. Διακρίνονται όλα τα βασικά ανατομικά χαρακτηριστικά όπως γνάθοι, φάρυγγας, μύες, σμήριγγες, κ.ά. Διάμετρος του δείγματος: 25mm Εικόνα 6: Eunice sp. (Πολύχαιτος): Απόδοση όγκου: αδιαφανής άποψη (αριστερά), ημιδιαφανής (μεσαία), εικονική ανατομή (δεξιά). Η μικροτομογραφία, σε αντίθεση με το SEM, είναι μία μη-καταστρεπτική και επομένως ιδανική για ταξινομικές μελέτες τεχνική, η οποία δεν αποδομεί το πολύτιμο υλικό (Εικ. 7). Επιπλέον, η αναπαράσταση σε τρεις διαστάσεις επιτρέπει την παρατήρηση των εσωτερικών χαρακτηριστικών στη
φυσική τους θέση (Εικ. 8). Η σάρωση μικροσκοπικών οργανισμών, οι μελέτες αναπτυξιακών σταδίων (Εικ. 9), οι μελέτες λειτουργικής μορφολογίας καθώς και η εξέταση απολιθωμένων οργανισμών αποτελούν άλλες ενδεχόμενες εφαρμογές της τεχνικής. Εικόνα 7: Απόδοση όγκου ατόμων διαφορετικών θαλασσίων ειδών: α) Πολύχαιτος, β) Ισόποδο, γ) Δεκάποδο, δ) Οφίουρος, ε) Δίθυρο. Όλα τα δείγματα είναι μικρότερα από 5mm.
Εικόνα 7: Απόδοση όγκου τμήματος σπόγγου. Διαφαίνονται οι ιστοί και τα ασβεστοποιημένα εγκλωβίσματα σε τρεις διαστάσεις. Εικόνα 8: Προνύμφες του γαστεροπόδου Charonia sp. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Alba-Tercedor J, Sánchez-Tocino L (2011) The use of the SkyScan 1172 high-resolution micro-ct to elucidate if the spicules of the sea slugs (Mollusca: Nudibranchia, Opisthobranchia) have a structural or a defensive function. SkyScan User meeting Abstract Book 2011: 113 121. Dinley J, Hawkins L, Paterson GLJ, Ball AD, Sinclair I, Sinnett-Jones P, Lanham S (2010) Microcomputed X-ray tomography: a new non-destructive method of assessing sectional, fly-through and 3D imaging of a soft-bodied marine worm. Journal of Microscopy 238: 123-33. Golding RE, Jones AS (2006) Micro-CT as a novel technique for 3D reconstruction of molluscan anatomy. Molluscan Research 27: 123 128. Holford P (2008) X-ray computerised microtomography (MicroCT): a new technique for assessing external and internal morphology of bees. Journal of Apicultural Research 47: 286 291. Huckstorf K, Wirkner CS (2011) Comparative morphology of the hemolymph vascular system in krill (Euphausiacea; Crustacea). Arthropod structure & development 40: 39 53.