ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΤΟΞΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ ΣΕ ΠΟΡΩΔΗ ΜΕΣΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΤΟΞΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ ΣΕ ΠΟΡΩΔΗ ΜΕΣΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβληθείσα στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών Υπό Ιωάννη Ν. Σγούντζου Χημικού Μηχανικού Για την απόκτηση του τίτλου του Διδάκτορος του Πανεπιστημίου Πατρών Πάτρα, 27

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Από την θέση αυτή θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες προς όλους όσους βοήθησαν στην εκπόνηση αυτής της διδακτορικής διατριβής. Καταρχάς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Αλκιβιάδη Χ. Παγιατάκη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντας μου την εκπόνηση της συγκεκριμένης διατριβής. Η στήριξη και οι ιδέες του κατά την διάρκεια αυτής της δύσκολης προσπάθειας ήταν ιδιαίτερα σημαντικές. Για την στήριξη τους κάθ όλη την διάρκεια του ερευνητικού έργου θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Σταύρο Παύλου και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Δημήτρη Βαγενά. Ιδιαίτερα επίσης ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή κ. Χρηστάκη Παρασκευά για την βοήθεια και στήριξη του στις δύσκολες στιγμές. Τις θερμές μου ευχαριστίες και στον ερευνητή κ. Γιώργο Κωνσταντινίδη για την ουσιαστική του συμβολή στην δημιουργία του θεωρητικού εξομοιωτή. Θέλω επίσης να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στους φίλους και συναδέλφους του Εργαστηρίου Φαινομένων Μεταφοράς & Φυσικοχημικής Υδροδυναμικής και του Εργαστηρίου Βιοχημικής Μηχανικής και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος του τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών, τόσο για την αμέριστη και ανιδιοτελή συμπαράσταση τους όλα αυτά τα χρόνια στην ερευνητική μου προσπάθεια, αλλά κυρίως γιατί μοιράστηκαν μαζί μου πολλές όμορφες αλλά και δύσκολες στιγμές. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στους φίλους και συναδέλφους απο το Ερευνητικό Ινστιτούτο Χημικής Μηχανικής και Χημικών Διεργασιών Υψηλής Θερμοκρασίας για την στήριξη τους, καθώς και στο ίδιο το Ινστιτούτο για την οικονομική του στήριξη. Ευχαριστώ επίσης το ΥπΕΠΘ για την οικονομική στήριξη της ερευνητικής αυτής προσπάθειας μέσω του προγράμματος «ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ». Τέλος ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια μου που ήταν πάντα δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια και μου έδινε δύναμη να συνεχίζω. Χωρίς εσάς τίποτα δεν θα ήταν το ίδιο.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το πρόβλημα της ρύπανσης του εδάφους και του υδροφόρου ορίζοντα έχει πάρει ανησυχητικές διαστάσεις τις τελευταίες δεκαετίες. Η βιομηχανική ανάπτυξη πέρα απο τις θετικές συνέπειες που έχει για την ζωή των ανθρώπων, έχει δυστυχώς επιφέρει προβλήματα ρύπανσης του υπεδάφους και του υδροφόρου ορίζοντα με επικίνδυνες οργανικές ενώσεις. Η αλόγιστη και ανεύθυνη διαχείριση και διάθεση των αποβλήτων έχει αρνητικές και συχνά μη αντιστρεπτές συνέπειες για το οικοσύστημα και την δημόσια υγεία. Ανάμεσα στις μεθόδους για την αντιμετώπιση του προβλήματος της ρύπανσης του εδάφους και των υπογείων υδάτων, οι βιολογικές μέθοδοι κερδίζουν ολοένα έδαφος λόγω του χαμηλού κόστους, της αποτελεσματικότητας και του ελάχιστου αριθμού παραπροϊόντων. Οι βιολογικές μέθοδοι αποσκοπούν στην αποκατάσταση των εδαφών με την χρήση γηγενών μικροοργανισμών του εδάφους. Η κινητική ανάπτυξης των μικροοργανισμών στο έδαφος διαφέρει σημαντικά από την κινητική ανάπτυξης όταν οι μικροοργανισμοί αιωρούνται σε καλά αναδευόμενα περιβάλλοντα. Η συγκεκριμένη εργασία έχει σαν στόχο να μελετηθεί η κινητική ανάπτυξης ενός γηγενούς βακτηριακού πληθυσμού, του Pseudomonas fluorescens κατά την βιοαποδόμηση της φαινόλης σε κατάλληλη πειραματική διάταξη, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο πορώδες μέσο πυριτική άμμο (SiO 2 ) η οποία αποτελεί ένα από τα βασικότερα συστατικά του εδάφους. Η φαινόλη είναι μία αρωματική ένωση η οποία χρησιμοποιείται συχνά στην βιομηχανία για την παρασκευή χρωμάτων, πλαστικών και φαρμάκων. Εξαιτίας της ευρείας χρήσης της, συναντάται συχνά στο έδαφος και τον υδροφόρο ορίζοντα. Για τον σκοπό αυτό έγιναν αρχικά πειράματα σε διαφορικές κλίνες άμμου με πηγή άνθρακα την γλυκόζη έτσι ώστε να αναπτυχθεί η κατάλληλη πειραματική διάταξη και διαδικασία για την περαιτέρω μελέτη της κινητικής ανάπτυξης του μικροοργανισμού Pseudomonas fluorescens. Στην συνέχεια μελετήθηκε η κινητική ανάπτυξης του μικροοργανισμού χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα την φαινόλη σε κλίνες άμμου. Παράλληλα έγιναν και πειράματα διαλείποντος έργου για την μελέτη της κινητικής ανάπτυξης του συγκεκριμένου μικροοργανισμού σε υγρές καλλιέργειες με θρεπτικό υπόστρωμα τόσο την γλυκόζη όσο

και την φαινόλη. Σκοπός των πειραμάτων αυτών ήταν ο προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων. Τέλος αναπτύχθηκε κατάλληλο θεωρητικό μοντέλο για την προσομοίωση της κινητικής ανάπτυξης ενός βακτηριακού πληθυσμού στην μικροσκοπική κλίμακα. Απώτερος στόχος του θεωρητικού μοντέλου σε συνδυασμό με τα πειραματικά αποτελέσματα είναι να γίνει αποσαφήνιση των μηχανισμών αποδόμησης τοξικών ρύπων στην μικροσκοπική κλίμακα απο γηγενή βακτήρια και να αναπτυχθούν απλά κριτήρια για την πρόβλεψη και τον σχεδιασμό αποτελεσματικών μεθόδων αντιμετώπισης περιπτώσεων ρύπανσης του υπεδάφους και του υδροφόρου ορίζοντα.

ABSTRACT The problem of soil and groundwater contamination has been increasing in the last few decades. Industrial growth is usually accompanied by pollution of groundwater with hazardous organic compounds. Irresponsible disposal of organic compounds into the soil has serious adverse consequences for the ecosystem and public health. Among methods that have been proposed for remediation of contaminated soils, biological methods using microorganisms which are indigenous in soil, are preferable because of their low cost, effectiveness and the low production of byproducts. Growth kinetics of microorganisms in soil differs significantly from growth kinetics of microorganisms suspended in a well-mixed stirred tank reactor. The aim of the present work was the experimental study of growth kinetics of a soilindigenous strain of the bacterium Pseudomonas fluorescens in sand packs (model soil) during the biodegradation of phenol. Phenol is an aromatic organic compound, which is widely used in industry, e.g. in paints, plastics, pharmaceuticals and many other products. Due to its extensive use, phenol is a common pollutant, especially in soil and groundwater. Experiments were initially conducted in sand packs, using glucose as a carbon source. The purpose of these experiments was the setup and test of the experimental procedure. Further experiments of growth kinetics in sand packs were conducted using phenol as a carbon source. In order to determine the growth kinetic parameters of Pseudomonas fluorescens for glucose and phenol biodegradation, batch experiments in liquid cultures were conducted. Finally, a hybrid simulator was developed for the theoretical investigation of growth kinetics of a bacterial population consisted a biofilm in microscale. The further aim of the theoretical simulator combined with the experimental results, was the elucidation of biodegradation mechanisms of toxic compounds by soil-indigenous bacteria in microscale, in order simple criteria for the prediction and remediation of polluted soils and groundwater to be developed.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Σελ. ΜΕΡΟΣ Α : ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ & ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - Βιοαποδόμηση και Βιοαποκατάσταση 7 1.1 Το πρόβλημα της ρύπανσης του περιβάλλοντος 7 1.2 Βιολογική διάσπαση οργανικών ενώσεων 9 1.3 Συνθήκες για την βιοαποδόμηση των οργανικών ενώσεων 13 1.4 Βιοαποκατάσταση ρυπασμένων περιοχών 15 1.5 Κριτήρια βιοαποκατάστασης 16 1.6 Τεχνολογίες επιτόπιας βιοαποκατάστασης (in situ) 17 1.7 Συστήματα διαχείρισης οργανικών ρύπων (ex situ) 18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Μικροβιακή οικολογία 24 2.1 Οι μικροοργανισμοί του εδάφους 24 2.2 Βακτήρια 26 2.3 Κινητική μικροβιακής ανάπτυξης σε βιοαντιδραστήρες 3 2.4 Κινητική μικροβιακής ανάπτυξης στο έδαφος 37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Φαινόλη 45 3.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες 45 3.2 Παραγωγή και χρήση 46 3.3 Έκθεση της φαινόλης στο περιβάλλον και επιτρεπτά όρια συγκέντρωσης 47 3.4 Επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία και το οικοσύστημα 49 3.5 Βιοαποδόμηση της φαινόλης 51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Βιοφίλμ 57 4.1 Εισαγωγή 57 4.2 Σχηματισμός βιοφίλμ 59 4.3 Δομή και σύσταση βιοφίλμ 64

4.4 Εξωκυτταρικές πολυμερικές ενώσεις (EPS) 75 4.5 Φαινόμενα μεταφοράς μάζας στα βιοφίλμ 81 4.6 Αποκόλληση βιοφίλμ 86 4.7 Χημικά σήματα και συναίσθηση πληθυσμού βακτηρίων (quorum sensing) 93 4.8 Μοντελοποίηση βιοφίλμ 98 ΜΕΡΟΣ Β : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Υλικά και μέθοδοι 18 5.1 Μικροοργανισμοί και θρεπτικό μέσο 18 5.2 Όρια τοξικότητας Pseudomonas fluorescens στην φαινόλη 11 5.3 Εγκλιματισμός του Pseudomonas fluorescens στην φαινόλη 11 5.4 Πειράματα κινητικής σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου 112 5.5 Πειράματα σε κλίνες με πορώδες υλικό 114 5.5.1 Προετοιμασία κλινών 115 5.5.2 Εμβολιασμός κλινών 115 5.5.3 Πειράματα εμβολιασμού κλινών 116 5.5.4 Πειράματα κινητικής σε κλίνες 117 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 - Πειράματα κινητικής σε υγρές καλλιέργειες αντιδραστήρα διαλείποντος έργου με πηγή άνθρακα την γλυκόζη 121 6.1 Σκοπός των πειραμάτων 121 6.2 Αποτελέσματα 122 6.3 Συμπεράσματα 129 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 - Πειράματα κινητικής σε κλίνες με άμμο και με πηγή άνθρακα την γλυκόζη 13 7.1 Σκοπός των πειραμάτων 13 7.2 Αποτελέσματα 131 7.3 Συμπεράσματα 151

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 - Πειράματα κινητικής σε υγρές καλλιέργειες αντιδραστήρα διαλείποντος έργου με πηγή άνθρακα την φαινόλη 153 8.1 Σκοπός των πειραμάτων 153 8.2 Αποτελέσματα 154 8.3 Συμπεράσματα 159 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 - Πειράματα εμβολιασμού του Pseudomonas fluorescens σε κλίνες με πορώδες υλικό 161 9.1 Σκοπός των πειραμάτων 161 9.2 Αποτελέσματα και συμπεράσματα 161 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - Πειράματα κινητικής σε κλίνες με άμμο και με πηγή άνθρακα την φαινόλη 166 1.1 Σκοπός των πειραμάτων 166 1.2 Αποτελέσματα 166 1.3 Ανάλυση αποτελεσμάτων και συμπεράσματα 25 ΜΕΡΟΣ Γ : ΘΕΩΡΗΤΙΚΗ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΒΙΟΦΙΛΜ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Θεωρητικός εξομοιωτής της ανάπτυξης βιοφίλμ στην κλίμακα των πόρων του εδάφους 212 11.1 Σκοπός του εξομοιωτή 212 11.2 Περιγραφή του εξομοιωτή 213 11.3 Παράμετροι του εξομοιωτή 238 11.4 Αποτελέσματα 242 11.5 Συμπεράσματα 35 ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 38 ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ 312 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 314 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΜΒΟΛΩΝ 35 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ & ΠΙΝΑΚΩΝ 353 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 375

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που καλείται να αντιμετωπίσει σήμερα η ανθρωπότητα είναι η ρύπανση του περιβάλλοντος. Το πρόβλημα της ρύπανσης του περιβάλλοντος δεν είναι καινούργιο και ούτε βέβαια προέκυψε ξαφνικά και αναπάντεχα. Η φύση είχε πάντοτε τους απαραίτητους μηχανισμούς έτσι ώστε οτιδήποτε περιττό για τα ζώα, τα φυτά και τον άνθρωπο να μετατρέπεται μέσου διαφόρων διεργασιών σε κάτι το οποίο δεν αποτελούσε πηγή κινδύνου για το οικοσύστημα. Μέσω φυσικών, χημικών αλλά και βιολογικών διεργασιών διατηρούταν μια ισορροπία η οποία ήταν και είναι απαραίτητη για την διατήρηση και ομαλή συμβίωση όλων των ζωντανών οργανισμών πάνω στην γη. Ωστόσο η ολοένα αυξανόμενη ανθρώπινη δραστηριότητα σε συνδυασμό με την πρόοδο της επιστήμης και της τεχνολογίας είχαν σαν αποτέλεσμα την διατάραξη αυτής της ισορροπίας. Οι ολοένα και αυξανόμενες ανάγκες που δημιουργούσε ως αποτέλεσμα η εξέλιξη του ανθρώπινου είδους, οδήγησε στην ανακάλυψη νέων τεχνολογιών, υλικών και εφαρμογών, παραμελώντας ή και αδιαφορώντας όμως ταυτόχρονα για την επιβάρυνση που δεχόταν το περιβάλλον. Η επιβάρυνση αυτή αφορούσε την ανεξέλεγκτη και αρκετές φορές αλόγιστη διάθεση και μεταχείριση των αποβλήτων της ανθρώπινης δραστηριότητας. Καθώς η επιβάρυνση αυτή διογκωνόταν, η φύση με τους μηχανισμούς που διέθετε αδυνατούσε να αποκαταστήσει την απαραίτητη ισορροπία και έτσι σιγά σιγά προέκυπτε ένα σημαντικό πρόβλημα. Ένα πρόβλημα το οποίο δεν άργησε να κάνει ορατές τις αρνητικές του συνέπειες τόσο στην χλωρίδα και πανίδα, όσο και στην ανθρώπινη υγεία. Σε πολλές μάλιστα περιπτώσεις οι συνέπειες αυτές δεν ήταν άμεσα ορατές αλλά προέκυπταν μετά από χρόνια δράση αυτών των αρνητικών παραγόντων κυρίως σε ότι αφορά τον άνθρωπο, φέρνοντας έτσι την ανθρωπότητα αντιμέτωπη με ένα μεγάλο όσο και σοβαρό πρόβλημα. Η επιστημονική κοινότητα δεν άργησε να κρούσει τον κώδωνα του κινδύνου για τις αρνητικές επιπτώσεις που έχει η ρύπανση του εδάφους, των υδάτων και του αέρα, στην υγεία ανθρώπων, φυτών και ζώων. Έτσι εξετάστηκαν και εφαρμόστηκαν πλήθος μεθόδων για την αντιμετώπιση του προβλήματος και την αποκατάσταση οικοσυστημάτων που αποτελούσαν εστίες ρύπανσης. Παράλληλα αρκετοί κρατικοί 1

φορείς και υπηρεσίες διαφόρων χωρών θέσπισαν κανόνες ενώ ψηφίστηκαν κατάλληλα νομοθετικά πλαίσια σε μια προσπάθεια να περιοριστούν όσο το δυνατόν μελλοντικά κρούσματα ρύπανσης του περιβάλλοντος. Ωστόσο έως και σήμερα παρ όλες τις προσπάθειες που γίνονται, το πρόβλημα δεν έχει εξαλειφθεί. Καθημερινά έρχονται στην επιφάνεια συνεχώς κρούσματα ρύπανσης των εδαφών, των θαλασσών, των υπόγειων υδάτων, ενώ συνεχής παρόλα τα μέτρα που λαμβάνονται είναι και η επιβάρυνση της ατμόσφαιρας από αέριους ρύπους κυρίως στις μεγαλουπόλεις. Πολλά βέβαια κρούσματα ρύπανσης είναι αποτέλεσμα κάποιου ατυχήματος ή απροσεξίας αλλά και σε αυτή την περίπτωση οι συνέπειες είναι το ίδιο δυσάρεστες. Ανάμεσα στις διάφορες μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί για την αντιμετώπιση του προβλήματος της ρύπανσης άλλες διακρίνονται για την αποτελεσματικότητα τους, την αμεσότητα στην αντιμετώπιση του προβλήματος, το κόστος αλλά και διάφορα παράπλευρα αποτελέσματα που έχουν εκτός από το αποτέλεσμα της αντιμετώπισης του προβλήματος. Ανάμεσα σε αυτές μπορεί κανείς να διακρίνει μεθόδους που βασίζονται σε βιολογικές διεργασίες. Οι βιολογικές μέθοδοι χαρακτηρίζονται από την δράση διαφόρων μικροοργανισμών οι οποίοι έχουν την ικανότητα να διασπούν ή και να αποδομούν πλήρως ένα μεγάλο αριθμό ρύπων σε διάφορα φυσικά ή και τεχνητά περιβάλλοντα. Η βιολογική διάσπαση διαφόρων οργανικών μορίων από την δράση μικροοργανισμών αποτελεί κομμάτι των μηχανισμών που διαθέτει η φύση για την ανακύκλωση στοιχείων όπως ο άνθρακας, το άζωτο, ο φώσφορος κ.α. Το αξιοθαύμαστο αυτό εργαλείο «αυτοκάθαρσης» που διαθέτει η φύση δεν άργησε να γίνει αντικείμενο μελέτης από επιστήμονες που ασχολούνται με την αντιμετώπιση της ρύπανσης του περιβάλλοντος. Έτσι σύντομα αναπτύχθηκαν τεχνικές και μεθοδολογίες που βασίζονται στην δράση μικροοργανισμών για την αποκατάσταση συστημάτων που αποτελούν εστίες ρύπανσης από διάφορες χημικές ενώσεις. Οι τεχνολογίες αυτές όπως θα αναφερθεί και στην συνέχεια εφαρμόζονται είτε επιτόπου στο σημείο της ρύπανσης, είτε σε κατάλληλες μονάδες επεξεργασίας αποβλήτων. Οι βιολογικές μέθοδοι επεξεργασίας και αντιμετώπισης αποβλήτων και ρυπασμένων περιοχών αντίστοιχα, υπερτερούν έναντι άλλων μεθόδων αντιμετώπισης του προβλήματος, όπως συστήματα αερισμού του εδάφους ή διεργασίες διαχωρισμού με χρήση μεμβρανών, κυρίως λόγω του χαμηλού 2

κόστους εφαρμογής τους στις περισσότερες περιπτώσεις και της ευρείας κλίμακας όσον αφορά το είδος και τον αριθμό των ρύπων που μπορούν να αντιμετωπιστούν. Για να μπορέσει η εφαρμογή των βιολογικών μεθόδων να δώσει λύση στο πρόβλημα της ρύπανσης θα πρέπει να ικανοποιούνται κάποια κριτήρια. Το χρονικό διάστημα, η πορεία, αλλά και το αποτέλεσμα μιας τέτοιας εφαρμογής απαιτεί την γνώση και συχνά την ρύθμιση πολλών παραγόντων. Οι παράγοντες αυτοί έχουν να κάνουν με τις ιδιότητες του συστήματος, φυσικού ή τεχνητού στο οποίο εφαρμόζεται η μέθοδος και τις συνθήκες που επικρατούν σε αυτό, στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του ρύπου ή των ρύπων που στοχεύει η μέθοδος και στην δυναμική που χαρακτηρίζει τους φορείς των μεθόδων αυτών, που είναι οι μικροοργανισμοί. Όσον αφορά το τελευταίο, με τον όρο δυναμική συμπεριλαμβάνονται τόσο τα χαρακτηριστικά και οι ιδιότητες των μικροοργανισμών, όσο και οι συνθήκες και τα χαρακτηριστικά της δράσης τους και η αλληλεπίδραση τους τόσο με τους διάφορους βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες που συνυπάρχουν σε ένα σύστημα. Ένα σημαντικό κομμάτι των περιπτώσεων που σχετίζεται με την ρύπανση φυσικών οικοσυστημάτων αφορά περιπτώσεις ρύπανσης της επιφάνειας του εδάφους, του υπεδάφους και του υδροφόρου ορίζοντα. Η γνώση της δυναμικής που αναπτύσσουν οι γηγενείς μικροοργανισμοί σε τέτοια συστήματα είναι ιδιαίτερα σημαντική για την επιτυχή ολοκλήρωση του στόχου των βιολογικών μεθόδων. Η διερεύνηση και διαλεύκανση των μηχανισμών που αναπτύσσουν οι μικροοργανισμοί κατά την βιοαποδόμηση των ρύπων αποτελεί σημαντικό κομμάτι έρευνας εδώ και αρκετές δεκαετίες. Οι σημαντικές διαφορές που παρουσιάζονται στην κινητική ανάπτυξης των μικροοργανισμών σε εδαφικά συστήματα σε σχέση με υγρές καλλιέργειες όπου συχνά μελετούνται, κάνει το κομμάτι αυτό της έρευνας ιδιαίτερα ελκυστικό, αλλά και ενδιαφέρον από περιβαλλοντολογικής άποψης. Σε μία προσπάθεια να γίνει αποσαφήνιση των μηχανισμών αποδόμησης οργανικών ενώσεων στην μικροσκοπική κλίμακα από γηγενείς μικροοργανισμούς του εδάφους, η παρούσα διατριβή στοχεύει στην μελέτη της κινητικής της ανάπτυξης ενός γηγενούς βακτηριακού πληθυσμού του εδάφους κατά την βιοαποδόμηση ενός πρότυπου ρύπου σε κατάλληλη πειραματική διάταξη χρησιμοποιώντας ως πρότυπο πορώδες υλικό, πυριτική άμμο (SiO 2 ) η οποία αποτελεί ένα από τα βασικότερα συστατικά του εδάφους. 3

Παράλληλα γίνεται προσπάθεια θεωρητικής μελέτης της κινητικής ανάπτυξης με την δημιουργία και εφαρμογή κατάλληλου θεωρητικού εξομοιωτή, ο οποίος αναπαριστά την δυναμική της ανάπτυξης ενός βακτηριακού πληθυσμού στην μικροσκοπική κλίμακα. Πιο συγκεκριμένα η πειραματική μελέτη αφορά την κινητική ανάπτυξης ενός βακτηρίου του είδους Pseudomonas fluorescens το οποίο απομονώθηκε από ρυπασμένο με μίγμα οργανικών ενώσεων, έδαφος στο Ringe της Δανίας στο οποίο λειτουργούσε για αρκετά χρόνια εργοστάσιο παρασκευής πίσσας. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πειραματική διάταξη η οποία αποτελούνταν από πολλές όμοιες κλίνες οι οποίες ήταν πληρωμένες με πυριτική άμμο ως πρότυπο πορώδες μέσο. Ο ρύπος που επιλέχθηκε να μελετηθεί ήταν η φαινόλη. Η φαινόλη είναι μία από τις πλέον διαδεδομένες οργανικές ενώσεις τόσο στην παραγωγή και χρήση της, όσο και ως πηγή ρύπανσης σε διάφορα εδαφικά και υδάτινα οικοσυστήματα. Η ικανότητα πλήθους μικροοργανισμών, όπως και ο μικροοργανισμός που μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή, να την βιοαποδομούν έχει στρέψει το ενδιαφέρον των ερευνητών στην μελέτη των μηχανισμών βιοαποδόμησης της σε πολυάριθμα φυσικά ή και τεχνητά συστήματα. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε μία νέα πειραματική μεθοδολογία για την μελέτη της κινητικής του μικροοργανισμού Pseudomonas fluorescens σε κλίνες με πορώδες υλικό πυριτική άμμο κατά την βιοαποδόμηση της φαινόλης. Η ανάπτυξη της πειραματικής διάταξης και μεθοδολογίας έγινε χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα για τους μικροοργανισμούς μία εύκολα και γρήγορα αποδομήσιμη ένωση όπως είναι η γλυκόζη. Η πρώτη αυτή επιλογή επέτρεψε τον έλεγχο της λειτουργικότητας και της αξιοπιστίας της συγκεκριμένης πειραματικής διάταξης και μεθοδολογίας και την καταγραφή και επίλυση τυχόν προβλημάτων ή σφαλμάτων πριν την διεξαγωγή των βασικών πειραμάτων αυτής της διατριβής που αφορούν την φαινόλη. Το βασικό αντικείμενο διερεύνησης του θεωρητικού εξομοιωτή ήταν η μελέτη βασικών μηχανισμών με τους οποίους τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται και εξαπλώνονται στον χώρο και με πιο τρόπο αυτοί συντελούν στην διαμόρφωση της δομής του βιοφίλμ. Η μελέτη καθώς και η σύγκριση ανάμεσα στους μηχανισμούς εξάπλωσης των κυττάρων του βιοφίλμ αποτελεί την ουσιαστική καινοτομία του παρόντος εξομοιωτή έναντι των αντίστοιχων μοντέλων που αναφέρονται στην βιβλιογραφία. 4

Η παρούσα διατριβή αποτελείται από τρία κυρίως μέρη. Στο πρώτο μέρος αναπτύσσονται ορισμένες βασικές αρχές που διέπουν τα φαινόμενα στων οποίων την μελέτη αποσκοπεί η παρούσα διατριβή καθώς και μία εκτενής ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας. Πιο συγκεκριμένα στο 1 ο κεφάλαιο γίνεται συζήτηση σχετικά με τις διεργασίες της βιοαποδόμησης των οργανικών ρύπων και ιδιαίτερα σε εδαφικά συστήματα και στο υπέδαφος. Αναπτύσσονται τα κριτήρια και οι συνθήκες που πρέπει να πληρούνται ούτως ώστε να λάβουν χώρα τέτοιου είδους διεργασίες και να είναι αποτελεσματικές. Τέλος γίνεται εκτενής ανασκόπηση των βιολογικών μεθόδων που εφαρμόζονται για την αποκατάσταση ρυπασμένων περιοχών με ιδιαίτερη έμφαση σε μεθοδολογίες και συστήματα που αναπτύσσονται μακριά (ex situ) από την περιοχή μόλυνσης. Το 2 ο κεφάλαιο αναφέρεται στην μικροβιακή οικολογία. Αφού γίνει μια μικρή αναφορά στα είδη και τα γενικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών του εδάφους, παραθέτονται ορισμένα στοιχεία που αφορούν τα βακτήρια και τον μικροοργανισμό Pseudomonas fluorescens. Στην συνέχεια συζητείται η κινητική ανάπτυξης των μικροοργανισμών σε βιοαντιδραστήρες και τα μοντέλα που χρησιμοποιούνται για την περιγραφή αυτής της κινητικής. Το κεφάλαιο αυτό κλείνει με συζήτηση που αφορά την κινητική των μικροοργανισμών στο έδαφος και τις φάσεις ανάπτυξης που παρατηρούνται σε τέτοια συστήματα. Το 3 ο κεφάλαιο αφορά την φαινόλη. Αφού γίνει μια αναφορά στις φυσικοχημικές ιδιότητες της και στον τρόπο με τον οποίο παράγεται και χρησιμοποιείται, στην συνέχεια αναφέρονται τα επίπεδα έκθεσης της στο περιβάλλον καθώς και τα επιτρεπτά όρια συγκέντρωσης που έχουν θεσπιστεί σε διάφορες χώρες. Έπειτα από μία μικρή αναφορά στις επιπτώσεις που έχει η φαινόλη στο οικοσύστημα και στην ανθρώπινη υγεία, γίνεται εκτενής ανασκόπηση των μελετών που αφορούν την βιοαποδόμηση της με ιδιαίτερη έμφαση σε συστήματα που προσομοιώνουν το έδαφος. Στο 4 ο και τελευταίο κεφάλαιο του 1 ου μέρους γίνεται μια εκτενής αναφορά στα βιοφίλμ, τα οποία αποτελούν τους σχηματισμούς που αναπτύσσουν οι μικροοργανισμοί στο έδαφος και που η μελέτη τους αποτελεί ένα τεράστιο όσο και πολύπλοκο κλάδο της επιστήμης συνδυάζοντας αρχές μικροβιολογίας, φυσικοχημείας και μηχανικής. 5

Το 2 ο μέρος αφορά το πειραματικό κομμάτι της παρούσας διατριβής. Στο κεφάλαιο 5 αναλύονται οι πειραματικές μέθοδοι και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα που παρουσιάζονται στη συνέχεια Στο κεφάλαιο 6 παρουσιάζονται τα πειράματα κινητικής σε υγρές καλλιέργειες αντιδραστήρων διαλείποντος έργου, ενώ στο κεφάλαιο 7 τα πειράματα κινητικής σε κλίνες με άμμο, με πηγή άνθρακα την γλυκόζη, για την ανάπτυξη και τον έλεγχο της πειραματικής διάταξης και μεθοδολογίας. Στα κεφάλαια 8, 9 και 1 παρουσιάζονται τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με πηγή άνθρακα την φαινόλη. Στο κεφάλαιο 8 παρουσιάζονται τα πειράματα κινητικής σε υγρές καλλιέργειες αντιδραστήρων διαλείποντος έργου, ενώ στο κεφάλαιο 9 παρουσιάζονται τα πειράματα εμβολιασμού των κλινών με καλλιέργεια του μικροοργανισμού Pseudomonas fluorescens. Τέλος στο κεφάλαιο 1 παρουσιάζονται τα πειράματα κινητικής σε κλίνες με άμμο κατά την βιοαποδόμηση της φαινόλης. Στο 3 ο και τελευταίο μέρος και στο κεφάλαιο 11 παρουσιάζεται η ανάπτυξη και τα αποτελέσματα του θεωρητικού μοντέλου που προσομοιάζει την δυναμική της ανάπτυξης ενός βακτηριακού πληθυσμού στην μικροσκοπική κλίμακα. Η παρούσα διατριβή κλείνει με την παρουσίαση των ορισμένων προτάσεων για μελλοντική έρευνα. 6

ΜΕΡΟΣ Α ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ & ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΑΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗ 1.1 Το πρόβλημα της ρύπανσης του περιβάλλοντος Το περιβάλλον μέσα στο οποίο ζούμε, ο αέρας που αναπνέουμε, το νερό που πίνουμε, το έδαφος το οποίο καλλιεργούμε, αλλά και ο χώρος μέσα στον οποίο ζουν και αναπτύσσονται τα ζώα και τα φυτά, είναι ρυπασμένο από μία ποικιλία συνθετικών χημικών. Στο έδαφος και τα επιφανειακά νερά αγροτικών και καλλιεργήσιμων περιοχών, τα χημικά αυτά είναι συνήθως φυτοφάρμακα και παραπροϊόντα αυτών. Πολλά επίσης χημικά προερχόμενα από βιομηχανίες έχουν διατεθεί είτε εσκεμμένα είτε άθελα σε υδάτινους πόρους και εδάφη σαν έμμεσο αποτέλεσμα της εκτεταμένης χρήσης τους. Άλλα πάλι περιλαμβάνουν παραπροϊόντα μεταποιητικών διεργασιών τα οποία είτε δεν διατέθηκαν σε μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων είτε δεν υπέστησαν επαρκή επεξεργασία. Μερικά από αυτά πιθανότατα να σχηματίστηκαν στην φύση από συνθετικές ενώσεις, ενώ κάποια σχηματίστηκαν ως αποτέλεσμα αντίδρασης της οργανικής ύλης του εδάφους με χλώριο, το οποίο χρησιμοποιείται για την επεξεργασία του πόσιμου νερού. 7

Κατά κανόνα οι χημικές αυτές ενώσεις δεν βρίσκονται μεμονωμένες στην φύση, αλλά συνήθως ως απλά ή και σύνθετα μίγματα. Τα μίγματα αυτά είναι αποτέλεσμα της εκπομπής, αποθήκευσης ή μεταφοράς πολλών χημικών ενώσεων στην επιφάνεια ή τον υδροφόρο ορίζοντα, στις μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων και στα εδαφικά συστήματα. Ο αριθμός των χημικών και τα είδη των μιγμάτων αυτών, που έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα, είναι τεράστιος. Επιπρόσθετα οι συγκεντρώσεις κάθε ένωσης ξεχωριστά ποικίλει σημαντικά και μπορεί να φτάσει μέχρι και το 1 g ανά λίτρο νερού ή kg χώματος, και σε περιοχές που αποτελούν εστίες ρύπανσης από διαρροές σε δεξαμενές ή φορτηγά αποθήκευσης και μεταφοράς χημικών ή εξαιτίας της διάθεσης αποβλήτων εργοστασίων. Αντίθετα οι συγκεντρώσεις μπορεί να είναι χαμηλότερες από 1μg ανά λίτρο νερού ή κιλό χώματος σε κάποια απόσταση από την εστία ρύπανσης. Ακόμα όμως και σε αυτές τις χαμηλές συγκεντρώσεις, κάποιες χημικές ενώσεις είναι τοξικές και σύμφωνα με ειδικές αναλύσεις επικινδυνότητας μπορούν να δράσουν επιβλαβώς σε αρκετούς οργανισμούς εάν εκτεθούν σε μεγάλες πληθυσμιακές ομάδες. Για την πρόβλεψη της επικινδυνότητας μιας οργανικής ένωσης στον άνθρωπο, στα ζώα και στα φυτά είναι απαραίτητη η γνώση όχι μόνο της τοξικότητας της συγκεκριμένης ένωσης αλλά και ο βαθμός έκθεσης του ζωντανού οργανισμού στην ένωση αυτή. Για να χαρακτηριστεί μία χημική ένωση ως επικίνδυνη δεν αρκεί απλώς να βρίσκεται στο περιβάλλον, αλλά με κάποιο τρόπο να εκτίθεται σε αυτή κάποιος ζωντανός οργανισμός. Στην εκτίμηση της επικινδυνότητας θα πρέπει να συνυπολογιστεί τόσο η μεταφορά όσο και η κατάληξη της χημικής ένωσης. Μία χημική ένωση η οποία δεν μεταφέρεται στο περιβάλλον δεν αποτελεί περιβαλλοντικό πρόβλημα υγιεινής, εκτός από τους ζωντανούς οργανισμούς που υπάρχουν στην εστία της ρύπανσης. Έτσι αυτό που έχει ουσιαστικότερη σημασία είναι η πληροφορία που αφορά την διασπορά μιας χημικής ένωσης από το σημείο απελευθέρωσης της, σε περιοχές που μπορεί να έχει αρνητικές επιπτώσεις. Ωστόσο μία χημική ένωση μπορεί να μετατραπεί δομικά ή και να διασπαστεί τελείως κατά την μεταφορά της, κάτι το οποίο αποτελεί σημαντική πληροφορία για την εκτίμηση του βαθμού διάδοσης της. Μια χημική ένωση η οποία μετατρέπεται παράγει προϊόντα τα οποία είναι είτε λιγότερο είτε περισσότερο τοξικά από την αρχική ένωση. Επίσης η πλήρης διάσπαση της ή η συσσώρευση της αποτελούν 8

παράγοντες οι οποίοι είναι καθοριστικοί για τον βαθμό επικινδυνότητας της συγκεκριμένης ένωσης στους ζωντανούς οργανισμούς στους οποίους επιδρά. Σημαντική είναι η επίδραση διαφόρων αβιοτικών παραγόντων σε μία οργανική ένωση στην περιοχή απελευθέρωσης της ή και κατά την μεταφορά της στο περιβάλλον. Φωτοχημική διάσπαση είναι πιθανό να λάβει χώρα στην ατμόσφαιρα ή κοντά στην επιφάνεια των υδάτων και του εδάφους. Μια τέτοια διεργασία μπορεί να διασπάσει πλήρως ή να μετατρέψει σημαντικά ένα μεγάλο αριθμό οργανικών ενώσεων. Μη ενζυματικές και μη φωτοχημικές αντιδράσεις είναι χαρακτηριστικές σε εδαφικά συστήματα και στον υδροφόρο ορίζοντα. Αν και τέτοιου είδους διεργασίες μπορούν να έχουν σημαντική επίδραση στην δομή μιας ένωσης, ωστόσο σπάνια μπορούν να διασπάσουν μια οργανική ένωση σε ανόργανα συστατικά. Η πλειοψηφία των μη ενζυματικών αντιδράσεων μετασχηματίζουν ελάχιστα το μόριο της οργανικής ένωσης με αποτέλεσμα το προϊόν να έχει συνήθως παρόμοια δομή και τοξικότητα με την αρχική οργανική ένωση. 1.2 Βιολογική διάσπαση οργανικών ενώσεων Αντίθετα οι βιολογικές διεργασίες μπορούν να μετασχηματίσουν τα διάφορα οργανικά μόρια στην περιοχή απελευθέρωσης τους ή και κατά την μεταφορά τους. Τέτοιου είδους διεργασίες που περιλαμβάνουν δράση ένζυμων τα οποία έχουν καταλυτικές ιδιότητες, έχουν σαν αποτέλεσμα την μετατροπή της δομής του μορίου της ένωσης αλλά και των τοξικών ιδιοτήτων της σε εκτεταμένο βαθμό. Συχνά αυτές οι λεγόμενες βιοτικές διεργασίες μπορούν να μετατρέψουν μια οργανική ένωση σε άλλες οργανικές ενώσεις ή και να την διασπάσουν πλήρως σε ανόργανα συστατικά. Τα φυτά και σε λιγότερη έκταση τα ζώα στην φύση ή σε τεχνητά από τον άνθρωπο περιβάλλοντα, μπορούν να μετατρέψουν μια μεγάλη ποικιλία χημικών ενώσεων συμβάλλοντας με αυτό τον τρόπο είτε στην μείωση, είτε στην αύξηση της τοξικότητας μιας ένωσης ως προς τον οργανισμό στον οποίο αυτή εκτίθεται. Παρόλα αυτά με βάση την διαθέσιμη πληροφορία που υπάρχει μέχρι και σήμερα, οι κυριότεροι φορείς που ευθύνονται για τέτοιου είδους βιολογικές διεργασίες, στην επιφάνεια του εδάφους, στο υπέδαφος, στα υγρά απόβλητα, στον υδροφόρο ορίζοντα και σε άλλες πολλές περιοχές, είναι οι γηγενείς 9

μικροοργανισμοί στα περιβάλλοντα αυτά. Οι μικροβιακοί πληθυσμοί είναι αυτοί που ευθύνονται και καθορίζουν την τύχη και κατάληξη των χημικών ουσιών στις περιοχές όπου αυτές απελευθερώνονται ή στις περιοχές που τυχαίνει να μεταφέρονται. Με τον όρο βιοαποδόμηση καλούμε την βιολογικά καταλυτική διάσπαση διαφόρων χημικών ενώσεων σε απλούστερες δομές (Alexander, 1999). Όσον αφορά τις οργανικές ενώσεις, σε αρκετές περιπτώσεις, αν και όχι απαραίτητα, η βιοαποδόμηση οδηγεί στην μετατροπή αρκετών από τα στοιχεία του άνθρακα, του αζώτου, του φωσφόρου και του θείου στις αρχικές οργανικές ενώσεις, σε αντίστοιχα ανόργανα προϊόντα αυτών. Η λεγόμενη «απόλυτη βιοαποδόμηση» είναι ένας όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει την πλήρη μετατροπή των οργανικών ενώσεων σε ανόργανα συστατικά όπως CO 2 και ανόργανες ενώσεις του αζώτου, του φωσφόρου και του θείου, που απελευθερώνονται από τους μικροοργανισμούς στο περιβάλλον. Αν και η αναπνοή των φυτών και των ζώων περιλαμβάνουν παρόμοιες διεργασίες διάσπασης οργανικών μορίων, η πλήρης διάσπαση συνθετικών χημικών κατά τις βιολογικές διεργασίες, ως ένα μεγάλο ποσοστό ή και πλήρως σε ορισμένα περιβάλλοντα, είναι αποτέλεσμα της δράσης μικροβίων. Στην πραγματικότητα οι μικροοργανισμοί είναι στην συντριπτική πλειοψηφία οι φορείς που μπορούν να διασπάσουν μία συνθετική οργανική ένωση σε ανόργανα συστατικά. Ελάχιστες μη βιολογικές αντιδράσεις στην φύση μπορούν να έχουν ανάλογα αποτελέσματα. Γι αυτό τον λόγο είναι σημαντικός ο ρόλος και έχει μεγάλη σημασία η ύπαρξη των μικροοργανισμών στα εδαφικά και υδάτινα συστήματα. Πολλές από τις χημικές ενώσεις που απορρίπτονται στα συγκεκριμένα περιβάλλοντα είναι τοξικές ή μπορούν να δράσουν επικίνδυνα εξαιτίας της συσσώρευσης τους με την πάροδο του χρόνου στους ζωντανούς οργανισμούς. Η πλήρης διάσπαση τέτοιων ενώσεων σε ανόργανα συστατικά είναι μία ευεργετική διεργασία. Από την άλλη πολλές μη βιολογικές αλλά και αρκετές βιολογικές διεργασίες διασπούν τις οργανικές ενώσεις σε άλλα οργανικά προϊόντα. Μερικά από αυτά μπορεί να είναι τοξικά ή και να μην έχουν καμία αρνητική επίδραση. Επιπλέον με την εφαρμογή νέων τεχνικών ανάλυσης και τοξικολογικών μετρήσεων μπορεί η συσσώρευση ενός εκ των προϊόντων μιας τέτοιας διάσπασης να αποδειχθεί επικίνδυνη μελλοντικά, παρόλο που κάτι τέτοιο μπορεί να μην είναι γνωστό σήμερα. Στον τομέα της τοξικολογίας υπάρχουν 1

παραδείγματα για ουσίες οι οποίες μέχρι πρότινος θεωρούντο ακίνδυνες αλλά με την ανάπτυξη νέων μεθόδων και τεχνικών ανάλυσης αποδείχθηκαν επικίνδυνες. Έτσι η πλήρης αποδόμηση τέτοιων ουσιών είναι θέμα κρίσιμης σημασίας όσον αφορά την αποκατάσταση του οικοσυστήματος από ενώσεις που μπορούν να δράσουν επικίνδυνα στην υγεία των ανθρώπων αλλά και στην πανίδα και χλωρίδα. Τα διάφορα περιβάλλοντα στα οποία λαμβάνει χώρα η βιοαποδόμηση από μικροοργανισμούς, ποικίλουν. Η βιοαποδόμηση ρύπων λαμβάνει χώρα σε μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων, στο έδαφος, σε χώρους ταφής χημικών αποβλήτων, στον υδροφόρο ορίζοντα, σε επιφανειακά νερά, σε ωκεανούς, και σε εκβολές ποταμών. Οι μικροβιολογικές διεργασίες που πραγματοποιούνται σε αερόβια και αναερόβια συστήματα επεξεργασίας βιομηχανικών, αγροτικών αλλά και δημόσιων αποβλήτων, έχουν ιδιαίτερη σημασία διότι τέτοια συστήματα αποτελούν συνήθως το αρχικό σημείο διάθεσης πολλών χημικών ουσιών στο περιβάλλον. Η συμβολή των μικροβιακών διεργασιών στην διάσπαση ενός μεγάλου αριθμού συνθετικών ενώσεων, στα υγρά απόβλητα, είναι αναμφισβήτητη. Τα εδάφη επίσης λαμβάνουν τεράστιο αριθμό συνθετικών ενώσεων από αγροτικές και κτηνοτροφικές δραστηριότητες, από βιομηχανικά απόβλητα, από απροσδόκητες διαρροές και από διάθεση ενεργού ιλύος. Η αποδόμηση της φυσικής ύλης του εδάφους, είναι γνωστή από την προϊστορική περίοδο. Στην σημερινή εποχή η διάθεση βιομηχανικών αποβλήτων στην επιφάνεια του εδάφους αλλά και στο υπέδαφος είχε πάρει τεράστιες διαστάσεις πριν ακόμα διαπιστωθεί η ρύπανση του υδροφόρου ορίζοντα. Ωστόσο στις περιοχές όπου γίνεται η διάθεση των αποβλήτων, υπάρχει μεγάλος αριθμός μικροβιακών πληθυσμών, οι οποίοι, εφόσον δεν επηρεάζονται από την τοξικότητα, έχουν την ικανότητα να διασπούν μεγάλο αριθμό οργανικών ενώσεων. Παρόμοια και σε υδροφόρους ορίζοντες που βρίσκονται στα σημεία απελευθέρωσης των χημικών αποβλήτων, αλλά και σε λίμνες ή και ποτάμια στα οποία διατίθενται μεγάλες ποσότητες αποβλήτων, υπάρχει μία μεγάλη ποικιλία μικροβιακών πληθυσμών υψηλής ενεργότητας, που περιλαμβάνουν βακτήρια, μύκητες και πρωτόζωα. Οι συγκεκριμένοι μικροβιακοί πληθυσμοί έχουν την ικανότητα να διασπούν άμεσα ή έμμεσα πολλά τόσο φυσικά όσο και συνθετικά προϊόντα. Οι γηγενείς μικροβιακοί πληθυσμοί στα διάφορα αυτά φυσικά περιβάλλοντα έχουν μία αξιοθαύμαστη προσαρμοστικότητα. Έχουν την δυνατότητα να μεταβολίζουν 11

και αρκετά συχνά να διασπούν πλήρως ένα απίστευτο αριθμό οργανικών μορίων. Κατά πάσα πιθανότητα, οποιοδήποτε φυσικό προϊόν, ανεξαρτήτου της πολυπλοκότητας του μπορεί να αποδομηθεί από κάποιο συγκεκριμένο είδος μικροοργανισμών και σε συγκεκριμένο περιβάλλον. Στην περίπτωση που κάτι τέτοιο δεν συμβαίνει με κάποιες ενώσεις τότε αυτές θα έχουν με την πάροδο των αιώνων, συσσωρευτεί σε τεράστιες ποσότητες. Η απουσία μεγάλης ποσότητας συσσωρευμένων φυσικών προϊόντων σε καλά οξυγονωμένα περιβάλλοντα, αποτελεί ένδειξη ότι οι γηγενείς μικροοργανισμοί στα περιβάλλοντα αυτά, βιοαποδομούν μία μεγάλη γκάμα φυσικών συστατικών του εδάφους. Ένα μικροβιακό είδος μπορεί να αποδομήσει ένα μικρό μέρος από αυτή την γκάμα φυσικών συστατικών, αλλά στο ίδιο περιβάλλον ένα άλλο είδος μπορεί να συνεχίσει ότι έχει αφήσει ανεκπλήρωτο το προηγούμενο είδος. Παρόλο που σε αρκετά είδη βακτηρίων αλλά και μυκήτων, το εύρος των οργανικών ενώσεων που μπορούν να αποδομήσουν είναι αρκετά μεγάλο, μέχρι σήμερα δεν έχει αναφερθεί κάποιο είδος που να μπορεί να αποδομεί την συντριπτική πλειοψηφία των φυσικών χημικών ενώσεων που σχηματίζονται από τα φυτά, τα ζώα και άλλους μικροοργανισμούς. Κατά παρόμοιο τρόπο αρκετά μεγάλος είναι και ο αριθμός των συνθετικών χημικών ενώσεων που μπορούν να μεταβολίσουν πληθυσμοί βακτηρίων και μυκήτων. Αν και δεν έχει επίσημα καταγραφεί ο αριθμός των ενώσεων, βιβλιογραφικά υπάρχουν χιλιάδες χημικές ενώσεις οι οποίες αποδομούνται εξαιτίας της μικροβιακής δραστηριότητας σε διάφορα περιβάλλοντα. Δεν είναι ξεκάθαρο πόσα από τα εκατομμύρια των γνωστών οργανικών μορίων που συνθέτονται στο εργαστήριο ή παρασκευάζονται βιομηχανικά, μπορούν να βιοαποδομηθούν. Ωστόσο από την λίστα των χημικών ενώσεων οι οποίες θεωρούνται ως ρύποι και προκύπτουν ως αποτέλεσμα της ανθρώπινης δραστηριότητας, αρκετές είναι ξεκάθαρο ότι μπορούν να μετατραπούν ή και να αποδομηθούν πλήρως με την δράση γηγενών μικροοργανισμών του εδάφους. Επειδή όμως ο αριθμός των γνωστών οργανικών ρύπων που έχουν εξεταστεί, είναι σχετικά μικρός, δεν είναι ακόμα γνωστό έως πιο βαθμό αυτή η αξιοθαύμαστη προσαρμοστικότητα των μικροοργανισμών μπορεί να έχει θετικά αποτελέσματα σε όλες τις οργανικές ενώσεις. Τουλάχιστον η ευρύτητα της προσαρμοστικότητας των μικροοργανισμών έχει γίνει εμφανής σε ότι αφορά τους οργανικούς ρύπους που 12

απασχολούν κυρίως σήμερα τον άνθρωπο για την αντιμετώπιση του προβλήματος της ρύπανσης του περιβάλλοντος. 1.3 Συνθήκες για την βιοαποδόμηση των οργανικών ενώσεων Αρκετές είναι οι συνθήκες οι οποίες πρέπει να ικανοποιούνται για να λάβει χώρα η βιοαποδόμηση σε ένα περιβάλλον (Alexander, 1999): α) Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να έχει τα απαραίτητα ένζυμα για την βιοαποδόμηση. Η ύπαρξη ενός μικροοργανισμού με το κατάλληλο μεταβολικό δυναμικό είναι απαραίτητη αλλά όχι και αρκετή για να λάβει χώρα η βιοαποδόμηση. β) Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να είναι παρών στο περιβάλλον στο οποίο υπάρχει και η προς βιοαποδόμηση χημική ένωση. Αν και μερικοί μικροοργανισμοί βρίσκονται ουσιαστικά σε οποιονδήποτε περιβάλλοντα χώρο κοντά στην επιφάνεια της γης, ωστόσο σε συγκεκριμένα περιβάλλοντα μπορεί να μην υφίστανται μικροοργανισμοί με τα απαραίτητα ένζυμα. γ) Η χημική ένωση πρέπει να είναι διαθέσιμη στον μικροοργανισμό με τα κατάλληλα ένζυμα. Πολλές χημικές ενώσεις εξακολουθούν να υφίστανται ακόμα και σε περιβάλλοντα στα οποία υπάρχουν οι κατάλληλοι μικροοργανισμοί για την βιοαποδόμηση τους, διότι οι μικροοργανισμοί δεν έχουν πρόσβαση σε αυτές. Αυτή η έλλειψη πρόσβασης μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η χημική ένωση είναι διαλυμένη σε ένα αδιάλυτο στο νερό διαλύτη ή είναι προσροφημένη στην στερεή επιφάνεια του εδάφους. δ) Εάν το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την έναρξη της βιοαποδόμησης είναι εξωκυτταρικό, θα πρέπει να απελευθερωθεί από τους δεσμούς που το συγκρατούν έτσι ώστε να δράσει καταλυτικά. ε) Εφόσον τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τα αρχικά στάδια της βιοαποδόμησης είναι ενδοκυτταρικά, το μόριο της χημικής ένωσης θα πρέπει να μπορεί να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη του μικροοργανισμού και να εισέλθει στο εσωτερικό, εκεί όπου το ένζυμο μπορεί να δράσει. Εναλλακτικά τα προϊόντα μιας εξωκυτταρικής αντίδρασης θα πρέπει να έχουν την ικανότητα να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη για την περαιτέρω βιοαποδόμηση της ένωσης. 13

στ) Επειδή αρχικά οι πληθυσμοί ή τα επίπεδα βιομάζας των βακτηρίων και των μυκήτων που βιοαποδομούν διάφορες συνθετικές οργανικές ενώσεις, είναι σχετικά μικρά, θα πρέπει οι συνθήκες του περιβάλλοντος να είναι τέτοιες που να ευνοούν την εξάπλωση και τον πολλαπλασιασμό των ενεργών μικροοργανισμών. Επειδή οι μικροοργανισμοί είναι συχνά οι κυριότεροι και κατά περιστάσεις οι μοναδικοί, φορείς της αποδόμησης συγκεκριμένων ενώσεων, η απουσία τους από συγκεκριμένα περιβάλλοντα ή η αδυναμία δράσης τους, έχουν σαν αποτέλεσμα την βραδεία απομάκρυνση της ένωσης. Στην περίπτωση μάλιστα όπου οι μικροοργανισμοί είναι οι μοναδικοί φορείς που μπορούν να επιτύχουν την διάσπαση μιας ένωσης, τότε η ένωση μπορεί να μην καταστραφεί ποτέ. Κατά παρόμοιο τρόπο εάν κάποια από τις παραπάνω συνθήκες δεν ικανοποιείται, τότε η διάρκεια ύπαρξης της συγκεκριμένης ένωσης αυξάνεται σημαντικά. Επομένως η συνεχής ύπαρξη κάποιων ρύπων αποτελεί ένδειξη ότι ή οι μικροοργανισμοί είναι ανενεργοί, ή ότι ενεργούν ιδιαιτέρως αργά, ή ότι δεν υπάρχει ικανός αριθμός αυτών για την διάσπαση των ρύπων. Μέχρι σήμερα δεν είναι σίγουρο εάν η διαρκής ύπαρξη κάποιων ρύπων σε ορισμένα περιβάλλοντα οφείλεται στην έλλειψη των κατάλληλων μικροοργανισμών στο συγκεκριμένο σημείο, ή στην μη ύπαρξη των κατάλληλων περιβαλλοντικών συνθηκών για την βιοαποδόμηση ή και ακόμα στην πλήρη έλλειψη των κατάλληλων μικροβιακών ειδών για την βιοαποδόμηση αυτών των ενώσεων. Ειδικά προγράμματα παρακολούθησης των ρύπων στο οικοσύστημα έχουν δείξει ότι, πολλοί χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία και στην γεωργία, ενώσεις που περιέχουν υποκατάστατα εκτός των αλογόνων, αλλά και άλλες κατηγορίες χημικών ενώσεων, έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής. Κάτι το οποίο αποδεικνύει ότι είτε οι μικροοργανισμοί δεν είναι ικανοί για όλα, είτε οι συνθήκες που επικρατούν σε αυτά τα περιβάλλοντα δεν ευνοούν τις βιολογικές διεργασίες. Ως αποδεικτικό της επιτυχούς αποστολής των μικροβίων αποτελεί η καταστροφή των χημικών ενώσεων, ενώ αντίθετα η αποτυχία τους αποδεικνύεται εξαιτίας της συνεχιζόμενης ύπαρξης κάποιων ρύπων. 14

1.4 Βιοαποκατάσταση ρυπασμένων περιοχών Τα τελευταία χρόνια η πρακτική εφαρμογή των μικροοργανισμών στην καταστροφή των χημικών ρύπων έχει συγκεντρώσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Κατά την διάρκεια των χρόνων αυτών έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνολογίες οι οποίες βασίζονται στην ικανότητα για βιοαποδόμηση των μικροοργανισμών. Οι τεχνολογίες αυτές έχουν σαν κυριότερους στόχους, είτε την επιτάχυνση των βραδέων διεργασιών βιοαποδόμησης που επικρατούν στην φύση, είτε στο να φέρουν σε επαφή τους ρύπους με τους μικροοργανισμούς με την βοήθεια διαφόρων τύπων αντιδραστήρων που επιτρέπουν την γρήγορη βιοαποδόμηση. Στις περισσότερες των περιπτώσεων οι νέες αυτές τεχνικές επικεντρώνονται στην επιτόπια αντιμετώπιση του προβλήματος στην εστία ρύπανσης και περιγράφονται με τον ευρύτερο όρο της «βιοαποκατάστασης». Ο όρος αυτός χρησιμοποιώντας το συνθετικό «αποκατάσταση» αναφέρεται εύστοχα στην αντιμετώπιση και λύση του προβλήματος. Ο στόχος της βιοαποκατάστασης είναι η διάσπαση των οργανικών ρύπων σε επίπεδα συγκεντρώσεων τα οποία να είναι είτε μη ανιχνεύσιμα είτε, εφόσον είναι ανιχνεύσιμα, να είναι χαμηλότερα από τα όρια ασφαλείας ή τα αποδεκτά όρια που ορίζει η νομοθεσία κάθε κράτους. Ο όρος της βιοαποκατάστασης χρησιμοποιείται για να περιγράψει την αντιμετώπιση προβλημάτων ρύπανσης στο έδαφος, στον υδροφόρο ορίζοντα, σε υγρά απόβλητα, λάσπες, απόβλητα βιομηχανικών μονάδων και αέρια. Η λίστα των ενώσεων οι οποίες υπόκεινται σε βιοαποδόμηση με την εφαρμογή διαφόρων συστημάτων βιοαποκατάστασης είναι τεράστια. Ωστόσο το ενδιαφέρον έχει επικεντρωθεί σε ενώσεις οι οποίες είναι ευρύτατα διαδεδομένες στην φύση και ανήκουν στις χαρακτηρισμένες ως επικίνδυνες για την υγεία και το οικοσύστημα ενώσεις. Ανάμεσα σ αυτές είναι συστατικά και προϊόντα του πετρελαίου και της βενζίνης, πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, χλωριωμένες αλειφατικές ενώσεις όπως το τριχλωροαιθυλένιο (TCE) και το τετραχλωροαιθυλένιο και χλωριωμένοι αρωματικοί υδρογονάνθρακες. 15

1.5 Κριτήρια βιοαποκατάστασης Τα κριτήρια τα οποία πρέπει να ικανοποιούνται για να θεωρηθεί η βιοαποκατάσταση ως επιτυχής μέθοδος αντιμετώπισης του προβλήματος συνοψίζονται ως εξής (Alexander, 1999) : α) Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι έχουν το κατάλληλο μεταβολικό δυναμικό, θα πρέπει να βιοαποδομούν τις ενώσεις με εύλογους και αποδεκτούς ρυθμούς και να μειώνουν τις συγκεντρώσεις στα ελάχιστα όρια που έχουν θεσπιστεί. β) Τα προϊόντα της βιοαποδόμησης δεν θα πρέπει να είναι τοξικά στις συγκεντρώσεις που πιθανότατα προκύπτουν κατά την διάρκεια της αποκατάστασης. γ) Στο σημείο της βιοαποκατάστασης οι συγκεντρώσεις ή και μίγματα των χημικών ενώσεων δεν θα πρέπει να δρουν παρεμποδιστικά στην δράση των μικροοργανισμών ή σε αντίθετη περίπτωση θα πρέπει με κάποιο μέσο να υπάρχει η δυνατότητα για αραίωση τους. δ) Οι χημικές ενώσεις στόχοι θα πρέπει να είναι προσβάσιμες στους μικροοργανισμούς. ε) Οι συνθήκες στην περιοχή της βιοαποκατάστασης ή στον βιοαντιδραστήρα, θα πρέπει να είναι κατάλληλες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Θα πρέπει να υπάρχει ικανοποιητική τροφοδοσία σε ανόργανα θρεπτικά, επαρκής ποσότητα οξυγόνου ή κάποιου άλλου δέκτη ηλεκτρονίων, ευνοϊκές συνθήκες υγρασίας και θερμοκρασίας και πηγή άνθρακα και ενέργειας στην περίπτωση που ο ρύπος δεν μπορεί να μεταβολιστεί απευθείας. στ) Το κόστος της εφαρμοζόμενης τεχνικής θα πρέπει να είναι μικρότερο ή στην χειρότερη περίπτωση όχι ακριβότερο από αντίστοιχες άλλες τεχνολογίες που μπορούν να έχουν παρόμοια αποτελέσματα. Ο κύριος λόγος για τον οποίο οι τεχνικές βιοαποκατάστασης προτιμούνται έναντι άλλων μεθόδων για την καταστροφή των οργανικών ρύπων είναι το κόστος. Αν και γενικότερα η διεργασίες για την απομάκρυνση και καταστροφή των ρύπων κοστίζουν ακριβά, οι βιολογικές μέθοδοι είναι οι λιγότερο δαπανηρές. Ο καθορισμός του κόστους δεν είναι πάντα εύκολη υπόθεση διότι εξαρτάται από χρονιά σε χρονιά, από τα 16

χαρακτηριστικά του εδάφους, τα είδη των ρύπων, το κόστος εξοπλισμού, την τοποθεσία και άλλους παράγοντες. 1.6 Τεχνολογίες επιτόπιας βιοαποκατάστασης (In situ) Ανάμεσα στις τεχνολογίες της επιτόπιας βιοαποκατάστασης (in situ), που εφαρμόζονται για την αντιμετώπιση του προβλήματος, ξεχωρίζουν οι εξής (Alexander, 1999): α) Διαχείριση γης (land farming). Κατά την μέθοδο αυτή οι ρύποι εισάγονται στο έδαφος απ όπου αναμένεται η βιοαποδόμηση τους από τους γηγενείς μικροβιακούς πληθυσμούς. Σε αρκετές περιπτώσεις εισάγονται επιπλέον θρεπτικά στο έδαφος για την επιτάχυνση της βιοαποδόμησης (biostimulation) β) Προετοιμασμένες κλίνες (prepared beds). Μία παρόμοια με την προηγούμενη, τεχνική στην οποία όμως υπάρχει περισσότερο μηχανικός έλεγχος, όπως συστήματα τροφοδοσίας νερού και θρεπτικών, ένα μέσο ευθυγράμμισης στον πάτο του εδάφους και ένα σύστημα για την συλλογή των στραγγισμάτων. γ) Σωροί χώματος (soil piles or biopiles). Γίνεται εκσκαφή του εδάφους που περιέχει τους ρύπους και τοποθέτηση του σε ειδικό μη διαπερατό σύστημα που συγκρατεί τα στραγγίσματα. Με κατάλληλο δίκτυο σωληνώσεων τροφοδοτείται αέρας ή οξυγόνο στην σωρό για την επιτάχυνση της αερόβιας αποικοδόμησης των ρύπων. δ) Φυτοαποκατάσταση (phytoremediation). Περιλαμβάνει διεργασίες οι οποίες αφορούν την διάσπαση ενός ρύπου από κάποιο φυτό ή την βιοαποδόμηση του ρύπου από μικροοργανισμούς που έχουν σχηματίσει αποικίες στις ρίζες του φυτού ή στον άμεσο περιβάλλοντα χώρο. ε) Βιο αερισμός (Bioventing και Biosparging). Με την τεχνική αυτή εισάγεται αέρας είτε στην ακόρεστη ζώνη (bioventing), είτε στην κορεσμένη ζώνη (biosparging) του εδάφους όπου στην μεν πρώτη περίπτωση παρέχεται το απαραίτητο οξυγόνο για τα αερόβια βακτήρια ενώ στην δεύτερη εκτός της παροχής οξυγόνου, μεταφέρονται και οι πτητικοί ρύποι στην ακόρεστη ζώνη όπου συνήθως υπάρχουν οι απαραίτητοι μικροβιακοί πληθυσμοί για την βιοαποδόμηση αυτών των ενώσεων. 17

στ) Κομποστοποίηση (Composting). Με την μέθοδο αυτή το προς επεξεργασία ρυπασμένο υλικό αναμιγνύεται σε ένα σωρό από εύκολα αποδομήσιμο οργανικό υλικό, όπως άχυρα, πριονίδια, κοπριά κ.α. Συχνά γίνεται προσθήκη πηγών φωσφόρου και αζώτου αλλά και άλλων ανόργανων θρεπτικών. Το υλικό είτε στρώνεται με την μορφή σειραδίων, είτε τοποθετείται σε μεγάλα δοχεία τα οποία είναι εξοπλισμένα με τέτοιο τρόπο έτσι ώστε να εξασφαλίζουν τον κατάλληλο αερισμό και τα κατάλληλα επίπεδα υγρασίας στο μίγμα. 1.7 Συστήματα διαχείρισης οργανικών ρύπων (ex situ) Ωστόσο έχουν αναπτυχθεί και τεχνολογίες για την διαχείριση των τοξικών χημικών όχι στο μέρος στο οποίο υφίστανται αλλά αφού πρώτα το ρυπασμένο υλικό χώματος ή ύδατος αφαιρεθεί και μεταφερθεί σε άλλο χώρο στις περισσότερες περιπτώσεις εργαστηριακό. Οι τεχνολογίες αυτές χαρακτηρίζονται ως ex situ. Ο διαχωρισμός ανάμεσα στις in situ και ex situ τεχνικές είναι αρκετές φορές δύσκολος. Ωστόσο στις ex situ τεχνικές η βιοαποδόμηση λαμβάνει χώρα σε βιοαντιδραστήρες. Διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων έχουν αναπτυχθεί για την διαχείριση υγρών, στερεών και αέριων υλικών. Τέτοιου είδους συστήματα χρησιμοποιούνται για την διάσπαση υπολειμμάτων διαφόρων χημικών, παραπροϊόντων και άλλων αποβλήτων από εργοστασιακές μονάδες και προτιμούνται εξαιτίας του χαμηλού τους κόστους έναντι άλλων μεθόδων για την διάθεση των αποβλήτων. Αν και γενικότερα οι ex situ τεχνικές είναι συνήθως πιο ακριβές από τις in situ παρόλα αυτά προτιμούνται έναντι των in situ διότι οι τελευταίες είναι στις περισσότερες περιπτώσεις μη πρακτικές εξαιτίας των ιδιοτήτων των ρύπων και των χαρακτηριστικών του εδάφους. Οι περισσότεροι από τους βιοαντιδραστήρες που χρησιμοποιούνται για την βιοαποδόμηση τοξικών ρύπων είναι σχεδιασμένοι για να λειτουργούν σε αερόβιες συνθήκες και η μεταφορά του απαραίτητου οξυγόνου με ικανοποιητικό ρυθμό έτσι ώστε να εξασφαλίζονται αυτές οι συνθήκες, αποτελεί το μεγαλύτερο κόστος της λειτουργίας τους. Ωστόσο έχουν σχεδιαστεί και αναερόβιοι βιοαντιδραστήρες για την διαχείριση αρκετών οργανικών ρύπων. 18

Οι αντιδραστήρες μπορούν να καταταγούν σε δύο κύριες κατηγορίες με βάση εάν οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται αιωρούνται ή είναι ακινητοποιημένοι σε κάποιο μέσο. Στην πρώτη περίπτωση οι μικροοργανισμοί διατηρούνται συνεχώς στο αιώρημα και αναπτύσσονται ελεύθερα στο υγρό μέσο ή προσκολλώνται στο στερεό υλικό που υπάρχει στο αιώρημα. Στους αντιδραστήρες αυτούς υπάρχει αρκετές φορές μηχανική ανάδευση ή ανάδευση που προκαλείται εξαιτίας του συνεχούς έντονου αερισμού. Μερικά παραδείγματα τέτοιων αντιδραστήρων είναι αντιδραστήρες λάσπης, αεριζόμενες λίμνες και αντιδραστήρες ενεργού ιλύος (Alexander, 1999). Πολλών ειδών είναι οι αντιδραστήρες στους οποίους οι μικροοργανισμοί ακινητοποιούνται σε κάποιο στερεό μέσο. Το υλικό στήριξης ή υπόστρωμα των μικροβίων μπορεί να είναι σταθερό (fixed) ή να διατηρείται σε αιώρημα (fluidized). Εφόσον το υπόστρωμα είναι σταθερό, το διάλυμα των ρύπων μπορεί πολύ απλά να εισέλθει από την κορυφή του αντιδραστήρα και να εξέλθει από το κάτω μέρος του. Εάν το υπόστρωμα αιωρείται, τότε τα στερεά σωματίδια που το αποτελούν και στα οποία συγκρατείται η βιομάζα, θα πρέπει να είναι επαρκώς βαριά έτσι ώστε να μην ξεπλυθούν με το υγρό ρεύμα που περιέχει και τους ρύπους. Αρκετοί είναι οι μικροοργανισμοί, όπως αναλύεται και σε επόμενο κεφάλαιο, που από την φύση τους έχουν την τάση να προσκολλώνται σε στερεές επιφάνειες σχηματίζοντας βιοφίλμ και γι αυτό τον λόγο χρησιμοποιούνται σε τέτοιου είδους αντιδραστήρες. Η λειτουργία αρκετών βιοαντιδραστήρων είναι συνεχής, με την έννοια ότι το διάλυμα ή αιώρημα ρύπων εισέρχεται και το επεξεργασμένο υγρό απομακρύνεται σε συνεχή λειτουργία. Η διαχείριση αρκετών ρύπων από την άλλη γίνεται σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου (batch). Συστήματα διαλείποντος έργου χρησιμοποιούνται συνήθως για την διαχείριση στερεών όπως χώμα ή λάσπη και όταν ο χρόνος της βιοαποδόμησης είναι μεγάλος. Οι αντιδραστήρες συνεχούς λειτουργίας μπορούν να διαχειριστούν μεγάλους όγκους υγρών, αλλά μόνο μικροί όγκοι είναι εφαρμόσιμοι σε συστήματα διαλείποντος έργου. Αρκετοί τύποι αντιδραστήρων λειτουργούν ως συστήματα ημι διαλείποντος έργου όπως ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου περιοδικής λειτουργίας (Sequencing batch reactor, SBR). Οι αντιδραστήρες στους οποίους οι μικροοργανισμοί είναι ακινητοποιημένοι σε κάποιο στερεό υλικό έχουν ευρύτατη εφαρμογή και προτιμούνται κυρίως διότι επιδεικνύουν, 19

α) μεγάλους ρυθμούς και μεγάλα ποσοστά βιοαποδόμησης εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης κυττάρων και β) υψηλή ανθεκτικότητα σε μεγάλες συγκεντρώσεις ρύπων εξαιτίας κυρίως της ρόφησης αυτών στο στερεό υπόστρωμα. Αρκετά είδη βακτηρίων αλλά και μύκητες ή και μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών έχουν χρησιμοποιηθεί για την βιοαποδόμηση μεγάλου αριθμού οργανικών ενώσεων σε συστήματα όπου οι μικροοργανισμοί είναι ακινητοποιημένοι. Στον Πίνακα 1.1 αναφέρονται ορισμένα χαρακτηριστικά παραδείγματα. Οι κυριότεροι τύποι αντιδραστήρων των οποίων η λειτουργία βασίζεται στην δράση ακινητοποιημένων μικροοργανισμών ή και βιοφίλμ περιλαμβάνουν: α) Αντιδραστήρες σταθερής κλίνης (fixed-bed or packed-bed reactor). Ο λειτουργικός όγκος των αντιδραστήρων αυτού του τύπου πληρούται με στερεό υλικό, σε αρκετές περιπτώσεις μεγάλης ειδικής επιφάνειας, το είδος του οποίου ποικίλει από εφαρμογή σε εφαρμογή. Έτσι έχει χρησιμοποιηθεί ως υλικό πλήρωσης διοξείδιο του πυριτίου ή άμμος (Kelly και άλλοι, 1996; Essa και άλλοι, 1996; Antizar-Ladislao και Galil, 23), σφαιρίδια από γυαλί ή τεφλόν (Quail και Hill, 1991; Steinle και άλλοι, 1998; Alshafie και Ghosal, 23), φυσικό χώμα (Estrella και άλλοι, 1993;), νηματοειδείς πορώδεις μεμβράνες (Shim και Yang, 1999). Σε ορισμένες εφαρμογές οι μικροοργανισμοί ακινητοποιούνται σε σφαιρίδια πολυμερών alginate ( Aksu και Bulbul,1998; O Reilly και Crawford, 1989 α ; O Reilly και Crawford, 1989 β ) ή σε αφρό πολυουρεθάνης (Anselmo και Novais, 1992, O Reilly και Crawford, 1989 β ). Ανάλογα με το είδος και το μέγεθος του υλικού πλήρωσης αλλά και τις συνθήκες λειτουργίας οι αντιδραστήρες αυτού του τύπου παρουσιάζουν αρκετά πλεονεκτήματα αλλά και μειονεκτήματα όσον αφορά την αποτελεσματική βιοαποδόμηση των ρύπων. Δύο βασικά πλεονεκτήματα αντιδραστήρων σταθερής κλίνης είναι ότι προσομοιώνουν καλύτερα από οποιοδήποτε άλλο τύπο αντιδραστήρα τις συνθήκες του εδάφους, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις που χρησιμοποιείται φυσικό χώμα από ρυπασμένη περιοχή, αλλά και επιτρέπουν την ανάπτυξη μεγάλου πάχους βιοφίλμ. από την άλλη όμως Εάν ο στόχος είναι η μεγιστοποίηση της απόδοσης σε βιοαποδόμηση, κάτω από ορισμένες συνθήκες λειτουργίας μπορούν να μην δίνουν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Παραδείγματος χάρη, οι Kim και άλλοι (22) έδειξαν ότι οι αντιδραστήρες σταθερής κλίνης δεν ήταν 2