ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΠΑΠΑΖΟΓΛΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ (08524) ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΑΚΤΙΚΗΣ: Νο 2 ΑΝΑΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Εισαγωγή Στην εργασία μου αυτή θα αναλύσω τις τεχνικές που είναι εφικτό να πραγματοποιηθούν στην «Μονάδα Πειραματικής Χειρουργικής και Ζωικών Προτύπων του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών» Αρχικά θα πρέπει να κάνω μία αναφορά στον ορισμό του όρου κύτταρα. Κατά την Βιολογία, κύτταρο ονομάζεται η βασική δομική και λειτουργική μονάδα που εκδηλώνει το φαινόμενο της ζωής. Έτσι, ως κύτταρο νοείται το μικρότερο δομικό συστατικό της έμβιας ύλης, που αποτελείται από μια συστηματικά οργανωμένη ομάδα μορίων, που βρίσκονται σε δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το κύτταρο διαθέτει μορφολογική, φυσική και χημική οργάνωση και την ικανότητα της αφομοίωσης, της ανάπτυξης και της αναπαραγωγής. Είναι μια μονάδα της ζωής ανεξάρτητη ως προς την αυτορύθμιση και την προσαρμοστικότητά του σε σχέση με το περιβάλλον. Εκ του υφιστάμενου αριθμού αυτών οι οργανισμοί διακρίνονται σε μονοκύτταρους και πολυκύτταρους. 1.1.1 Ανακαλλιέργεια κυττάρων Όταν η πυκνότητα ενός δοχείου καλλιέργειας κυττάρων προσεγγίζει το 90-100% πρέπει να απομακρυνθούν τουλάχιστον τα μισά κύτταρα για μην υπάρξει αναστολή της ανάπτυξής τους και θάνατος. Τα κύτταρα ανακαλλιεργούνται κάθε φορά που οι φλάσκες έχουν μεγάλο αριθμό κυττάρων, πριν τα κύτταρα φτάσουν σε senescence (συνήθως κάθε 3 μέρες περίπου).η παρακάτω διαδικασία αναφέρεται σε μια πλήρη μικρή φλάσκα (Εικόνα 1
1.2) και μπορεί να βελτιστοποιηθεί ανάλογα με το δοχείο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται. 1. Αναρρόφηση θρεπτικού 2. Ξέπλυμα με PBS 1 X ( τουλάχιστον 2 επαναλήψεις). 3. Προσθήκη 1 ml trypsin 1 και επώαση σε RT για 10 ή μέχρι να γίνει πλήρης αποκόλληση των κυττάρων. 4. Προσθήκη 2 ml θρεπτικού μέσου που περιέχει ορό ( για απενεργοποίηση της θρυψίνης). 5. Καλό πιπετάρισμα για σπάσιμο των συσσωματωμάτων. 6. Απόρριψη τουλάχιστον 1,5 ml από το θρεπτικό που περιέχει το εναιώρημα των κυττάρων. 7. Προσθήκη 4.5-5.5 ml θρεπτικού στη φλάσκα και ελαφριά ανακίνηση έτσι ώστε τα κύτταρα να απλωθούν ομοιόμορφα σε όλη την επιφάνεια καλλιέργειας. 8. Έλεγχος στο μικροσκόπιο ( ομοιόμορφη κατανομή, απουσία συσσωματωμάτων) και τοποθέτηση της φλάσκας στον επωαστήρα(incubator) σε 5% CO 2,37 C.( Εικόνα 1.3) Όλες οι διαδικασίες που αφορούν κύτταρα, πραγματοποιούνται μέσα στο hood. Εικόνα 1.1 Εικόνα 1.1: Laboratory fume hood Εικόνα 1.2: Cell culture flasks 2
Εικόνα 1.3: Incubator(outer view) Εικόνα 1.4: falcon centrifuge tubes των 15 ή 50ml. Οι φυγοκεντρήσεις γίνονταν σε falcon centrifuge tubes των 15 ή 50ml. (Εικόνα 1.4) 1.1.2 Ξεπάγωμα κυττάρων Η παρακάτω διαδικασία αφορά το ξεπάγωμα ενός ειδικού φιαλιδίου για αποθήκευση στους -80 o C ( cryovial), το οποίο περιέχει κύτταρα μέσα σε ειδικό μέσο για πάγωμα (freezing solution). Εικόνα 1.5: Cryovial 1. Ξεπάγωμα περιεχομένου του cryovial (Εικόνα 1.5) είτε με ολιγόλεπτη επώαση σε υδατόλουτρο είτε με επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Μέσα στη hood,παίρνουμε τόσα falcon όσα χρειάζονται, τα κάνουμε label και βάζουμε 4-5ml θρεπτικού(αρκετά ώστε να απενεργοποιηθεί το θρεπτικό μέσο). 3
3. Προσθήκη του περιεχομένου του cryovial σε falcon που περιέχει 3 ml προθερμασμένου θρεπτικού μέσου. 4. Φυγοκέντρηση για 10 {1000 rpm, 4 o C}(υπάρχουν ζωντανά κύτταρα και πρέπει να διατηρηθούν ζωντανά). 5. Αναρρόφηση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου και επαναδιάλυση του ιζήματος που περιέχει τα κύτταρα σε 5-6 ml θρεπτικού μέσου. 6. Προσθήκη του θρεπτικού με τα κύτταρα σε μικρή φλάσκα παρατήρηση στο μικροσκόπιο και επώαση σε κλίβανο 37 o C, 5% CO 2. Εικόνα 1.6: Centrifuge 1.1.3 Πάγωμα κυττάρων (cell freezing) Η παρακάτω διαδικασία αφορά μια μικρή φλάσκα πυκνότητας 90-100% και μπορεί να γίνει βελτιστοποίηση και για άλλα καλλιεργητικά δοχεία ( π.χ. μεγάλα τρυβλία, μεγάλες φλάσκες κ.ο.κ.) Το μέσο για πάγωμα (freezing solution) αποτελείται από 90% FBS και 10% DMSO Dimethyl sulfoxide) (κρυοπροστατευτικό). Για κάθε διαδικασία παρασκευάζεται φρέσκο και φυλάσσεται συνεχώς στον πάγο (το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου). 4
Σε κάθε ειδικό φιαλίδιο που φυλάσσεται στους -80 o C (cryovial) αντιστοιχεί περίπου 1,5 ml freezing solution. 1. Αναρρόφηση θρεπτικού. 2. Ξεπλύματα με PBS 1 x ( τουλάχιστον 2 επαναλήψεις). 3. Προσθήκη 1ml trypsin και επώαση σε RT για 10 ή μέχρι να γίνει πλήρης αποκόλληση των κυττάρων. 4. Προσθήκη 2ml θρεπτικού μέσου που περιέχει ορό ( για απενεργοποίηση της θρυψίνης). 5. Συλλογή των 35 o C ml σε falcon και φυγοκέντρηση για 10 (1000 rpm, 4 o C). 6. Αναρρόφηση υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος που περιέχει τα κύτταρα μέσα σε 3ml freezing solution. Η προσθήκη μέσου για πάγωμα πρέπει να γίνεται σταγόνα σταγόνα, με μεγάλη προσοχή και μέσα στο δοχείο με τον πάγο για να μην πεθάνουν τα κύτταρα. 7. Μοίρασμα σε 2 cryovials. 8. Τοποθετούνται cryovials στο round isopropanol bluebox (Εικόνα 1.7) {που το έχω βάλει από τα πριν στο ψυγείο για να κρυώσει}.αυτό το δοχείο περιέχει ισοπροπανόλη κι έτσι επιτρέπει την ομαλή-σταδιακή πτώση της θερμοκρασίας από τη στιγμή που τα κύτταρα θα μπουν σε καταψύκτη θερμοκρασίας -80 o C. 9. Την επόμενη μέρα γίνεται μεταφορά των παγωμένων cryovials στο ειδικό κουτί φύλαξης στον καταψύκτη των -80 o C. 10. Βάζουμε το bluebox που περιέχει τα cryovials με τα κύτταρά μας στους -80 βαθμούς. 11. Την επόμενη μέρα βγάζουμε τα cryovials από το bluebox και τα βάζουμε κανονικά στο cryovial box. (Εικόνα 1.7) 5
Εικόνα 1.7: Cryovial box 1.1.4 Μέτρηση κυττάρων Οι καμπύλες ανάπτυξης, για τον έλεγχο του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων κατασκευάστηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω, ενώ η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές για να εξασφαλιστεί η λήψη στατιστικώς σημαντικών αποτελεσμάτων. 1. Αποκόλληση κυττάρων από το δοχείο καλλιέργειας, στο οποίο βρίσκονται με θρυψίνη, απενεργοποίηση δράσης θρυψίνης με θρεπτικό μέσο που περιέχει ορό και φυγοκέντρηση. 2. Επαναδιάλυση κυττάρων σε 5ml θρεπτικού και μέτρηση κυττάρων με χρήση αιματοκυτταρομέτρου Neubauer και trypan blue (10μl trypan blue + 10 μl εναιωρήματος κυττάρων στην πλάκα Neubauer, μέτρηση και άθροισμα των κυττάρων που βρίσκονται στις 4 γκρι περιοχές και εφαρμογή τύπου: ([α (άθροισμα)]/4 x2 x 10 4 για υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων ανά ml θρεπτικού]. 3. Υπολογισμοί και αναγωγές έτσι ώστε σε κάθε θέση ενός τρυβλίου 6 θέσεων να μοιραστούν 200.000 κύτταρα. Όταν βρεθεί σε πόσα ml θρεπτικού περιέχονται 200.000 κύτταρα προσθήκη της ποσότητας αυτής σε κάθε θέση του τρυβλίου και συμπλήρωση με θρεπτικό έτσι ώστε ο τελικός όγκος να είναι 2 ml. 4. Από τη θέση που αντιστοιχεί στη μέρα 0 λήψη δείγματος και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων έτσι ώστε να γίνει επιβεβαίωση ότι η παραπάνω διαδικασία έγινε 6
σωστά [ πάλι χρησιμοποιείται ο τύπος ([α (άθροισμα)]/4x2x10 4 κύτταρα ανά ml θρεπτικού]. 5. Για τουλάχιστον 4 μέρες γίνεται μέτρηση των κυττάρων που περιέχουν οι διαδοχικές θέσεις του τρυβλίου 6 θέσεων. 6. Απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε διάγραμμα. Εικόνα 1.8: Πλάκα Neubauer Εικόνα 1.9: Οπτικό μικροσκόπιο(διοφθάλμιο) 7
Εικόνα 1.10: Χώρος μέτρησης κυττάρων της πλάκας Neubauer 8
9