ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΛΑΓΟΥΔΑΚΗ ΜΑΡΙΝΑ. Τριμελής επιτροπή: Καρύδης Μιχαήλ Σπαθάρη Σοφία Μπακόπουλος Βασίλης

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ Σχολή περιβάλλοντος Τμήμα Επιστημών της θάλασσας. ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΛΑΓΟΥΔΑΚΗ ΜΑΡΙΝΑ Συγκριτική αύξηση των ειδών Pseudo-nitzschia galaxiae και P. delicatissima υπό περιορισμό θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων σε μαζικές καλλιέργειες. Τριμελής επιτροπή: Καρύδης Μιχαήλ Σπαθάρη Σοφία Μπακόπουλος Βασίλης Μυτιλήνη, Φεβρουάριος, 2012

Στον πατέρα μου που έφυγε, τη μητέρα μου που ήταν πάντα εκεί, τον Γιώργο που με στήριξε αλλά και όλους τους άλλους ανθρώπους που με εμπνέουν καθημερινά. 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ..4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Ευτροφισμός στα παράκτια οικοσυστήματα 5 1.2. Επιβλαβής εξάρσεις φυκών (Harmful Algal Blooms) και ευτροφισμός..6 1.3. Το γένος Pseudo-nitzschia 8 1.4. Τα είδη P. galaxiae και P. delicatissima..10 1.5. Πειράματα με P. galaxiae και P. delicatissima...11 1.6. Στόχος της εργασίας 13 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Τα είδη που μελετήθηκαν 14 2.2 Πειράματα περιορισμού θρεπτικών και ιχνοστοιχείων 15 2.3. Πειραματική διαδικασία..16 2.4. Εργαστηριακές αναλύσεις...17 2.5. Αναλύσεις δεδομένων..18 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Πειράματα περιορισμού θρεπτικών 19 3.2. Πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων...25 3.3. Συγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ P. galaxiae και P. delicatissima 28 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...32 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...36 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί παγκοσμίως, αύξηση στη συχνότητα περιστατικών ευτροφισμού κυρίως στα παράκτια οικοσυστήματα με παράλληλη αύξηση ανθίσεων φυτοπλαγκτού που ενίοτε λόγω της τοξικότητας του μπορεί να επιφέρει δυσμενείς συνέπειες στην δημόσια υγεία, στην οικονομία και στο περιβάλλον της περιοχής εξάπλωσής του. Τα είδη Pseudo-nitzschia galaxiae και delicatissima είναι δυνητικά τοξικά διάτομα (παράγουν την τοξίνη δομοικό οξύ) με κοσμοπολίτικη εξάπλωση. Η συμπεριφορά τους έχει μελετηθεί στο πεδίο (εκτενέστερα του είδους P. delicatissima) και στο εργαστήριο (ελάχιστα του είδους P. galaxiae) κυρίως ως προς την παραγωγή της τοξίνης δομοϊκό οξύ, ωστόσο οι μελέτες που εστιάζουν στην επίδραση των θρεπτικών και μικροθρεπτικών είναι ελάχιστες για το P. delicatissima και ανύπαρκτες για το P. galaxiae. Ο στόχος της συγκεκριμένης εργασίας ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος θρεπτικών και μικροθρεπτικών στοιχείων στην ανάπτυξη του P. galaxiae και τα αποτελέσματα να συγκριθούν με αυτά προηγούμενης πειραματική μελέτης για το P. delicatissima. Για το σκοπό αυτό διεξήχθησαν δέκα συνολικά πειράματα, τρία για τη μελέτη του ρόλου των θρεπτικών και έξι για τη μελέτη του ρόλου των μεταλλικών ιχνοστοιχείων στην ανάπτυξη του P. galaxiae. Τα πειράματα περιορισμού θρεπτικών έγιναν με μέσο καλλιέργειας f/2 με περιορισμό μόνο στο θρεπτικό (φωσφορικά και νιτρικά) το οποίο μειώνονταν στο 1/2 της ποσότητας του f/2. Τα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων έγιναν με μέσο καλλιέργειας f/2 με περιορισμό μόνο στο μεταλλικό ιχνοστοιχείο το οποίο μειώνονταν στο 1/5 της ποσότητας του f/2 (Κοβάλτιο, Μολυβδαίνιο, Χαλκός, Ψευδάργυρος, Μαγγάνιο, Σίδηρος+EDTA). 4

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Ευτροφισμός στα παράκτια οικοσυστήματα Ο ευτροφισμός είναι μια φυσική διαδικασία που χαρακτηρίζεται από υπερβολική παραγωγή φυκών λόγω παροχής θρεπτικών στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Οι βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν την διαδικασία είναι η γεωμορφολογία του συστήματος, το μέσο βάθος της περιοχής και τα επικρατούντα ρεύματα (De Jonge et al. 2002). Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί μια παγκόσμια αύξηση του ευτροφισμού ο που έχει οδηγήσει σε εκτεταμένα περιστατικά υποξίας και ανοξίας, υποβάθμισης βιοτόπων, διαφοροποίησης της δομής της τροφικής αλυσίδας και μείωσης της βιοποικιλότητας (Howarth et al. 2000, NRC 2000, Boesch 2002). Μεγαλύτερη ευθύνη στην εξάπλωση του ευτροφισμού αποδίδεται στο άζωτο αν και η ρύπανση από φώσφορο μπορεί επίσης να συνεισφέρει σε μικρότερο βαθμό στον παράκτιο ευτροφισμό (NRC 2000, Howarth et al. 2005, Howarth and Marino 2006). Κατά τους Νixon et al. (1996) οι περισσότερες εισροές αζώτου σε ευτροφικές εκβολές προέρχονται από χερσαίες πηγές. Πριν τη βιομηχανική επανάσταση το μοριακό άζωτο (N 2 ) μετατρέπονταν σε βιοδιαθέσιμη μορφή μόνο μέσω φυσικών διεργασιών όπως των βακτηρίων και χημικών αντιδράσεων του οξυγόνου σε πολύ μεγάλες θερμοκρασίες (ηφαίστεια, κεραυνοί) (Vitousek et al. 1997). Κατά τον εικοστό αιώνα η ανθρώπινη δραστηριότητα οδήγησε σε αύξηση του βιοδιαθέσιμου αζώτου με ρυθμό ίσο ή/και μεγαλύτερο από τον φυσικό ρυθμό παραγωγής, αυτή η αύξηση συσχετίστηκε με μια μεγάλη αύξηση περιστατικών παράκτιου ευτροφισμού (Boesch 2002). Οι κυριότερες πηγές της παράκτιας ρύπανσης με άζωτο, είναι τα συνθετικά αζωτούχα λιπάσματα, τα απόβλητα των μονάδων εντατικής ζωοτροφίας τα οποία απορρέουν υπόγεια ή επιφανειακά στη θάλασσα, τα οικιακά λύματα και οι ατμοσφαιρικοί αζωτούχοι ρύποι. Οι ανθρωπογενείς προσθήκες αζώτου ή/και φωσφόρου σε παράκτιες περιοχές αλλάζουν τη σχετική αναλογία του αζώτου (Ν) προς τον φώσφορο (Ρ) και το πυρίτιο (Si) σε σύγκριση με το λόγο του Redfield (Si:Ν:Ρ= 16:16:1, Redfield et al. 1962), αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να μεταβάλλεται η σύνθεση, η αφθονία και η διαδοχή των ειδών στις συναθροίσεις φυτοπλαγκτού (Bαρκιτζη 2010). 5

1.2. Επιβλαβείς εξάρσεις φυκών (Harmful Algal Blooms) και ευτροφισμός Με τον όρο επιβλαβή φύκη (Harmful algae) χαρακτηρίζεται μια μεγάλη ομάδα μικροφυκών και μακροφυκών, τα οποία υπό συγκεκριμένες συνθήκες μπορούν να γίνουν επιβλαβή για άλλους οργανισμούς ενός οικοσυστήματος (Hallegraeff 1993). Με τον όρο επιβλαβείς εξάρσεις φυκών (Harmful algal blooms, HABs) χαρακτηρίζονται φαινόμενα κατά τα οποία η αφθονία ή η τοξικότητα των επιβλαβών φυκών στο φυσικό περιβάλλον αυξάνεται τόσο ώστε να προκαλεί προβλήματα (Βακιρτζή 2010). Η μεγάλη αύξηση του ευτροφισμού στα παράκτια οικοσυστήματα τις τελευταίες δεκαετίες έχει προκαλέσει αύξηση των περιστατικών υποξίας και ανοξίας, υποβάθμιση των βιοτόπων των αυτοχθόνων ειδών χλωρίδας και πανίδας, αλλαγές στη δομή των τροφικών πλεγμάτων αλλά και αύξηση της συχνότητας, της έκτασης και της διάρκειας των HABs. Ο ευτροφισμός θεωρείται ένας από τους κυριότερους μηχανισμούς πρόκλησης των HABs σε παγκόσμια κλίμακα από τη δεκαετία του 1980 (Anderson et al. 2002, Granelli 2004, Glibert et al. 2005b) με πολλά παραδείγματα αύξησης HABs να συνδέονται με αυξημένες εισροές θρεπτικών (Heisler et al. 2008). Ενώ σε οικοσυστήματα γλυκών νερών έχει διαπιστωθεί η επίδραση των εισροών φωσφόρου σε ανθίσεις κυανοβακτηρίων (Schindler 1977, Burkholder 2002), μόλις πρόσφατα διαπιστώθηκε η επίδραση των θρεπτικών εισροών στις επιβλαβείς ανθήσεις σε παράκτια και μεταβατικά οικοσυστήματα (Smayda 1990, 1997, Anderson et al. 2002, Glibert et al. 2005a,b, Glibert and Burkholder 2006). Στον κόλπο του Μεξικού, οι καταγραφές των δυνητικά επιβλαβών διατόμων του γένους Pseudo-nitzcschia αυξήθηκαν παράλληλα με τις αυξανόμενες εισροές νιτρικών κατά τις τελευταίες δεκαετίες (π.χ. Turner and Rabalais 1991, Parsons et al. 2002, Trainer et al. 2003). Άλλο παράδειγμα είναι οι παράκτιες ανθίσεις του δινομαστιγωτού Prorocentrum sp., Karenia mikimotoi και άλλων ειδών στις ακτές της Κίνας, που τις τελευταίες δύο δεκαετίες επεκτάθηκαν σε γεωγραφική έκταση αλλά και διάρκεια (από Km 2 σε δεκάδες Km 2 και από μέρες σε μήνες) λόγω της αυξανόμενης χρήσης των λιπασμάτων (Anderson et al. 2002, Zhou 2005). Στη Βαλτική θάλασσα, το Αιγαίο, τη Β. Αδριατική και τη Μαύρη θάλασσα έχει παρατηρηθεί αύξηση σε περιστατικά HABs 6

παράλληλα με αυξημένες θρεπτικές εισροές (π.χ. Larsson et al. 1985, Bodenau 1993, Heisler et al. 2008). Τα HABs προκαλούν υποξικές και ανοξικές συνθήκες στην υδάτινη στήλη και τον πυθμένα, μειωμένη διείσδυση της ηλιακής ακτινοβολίας στα υποκείμενα υδάτινα στρώματα, ανασταλτική επίδραση στη φυσιολογία και την πληθυσμιακή ελάττωση άλλων ειδών μικροφυκών (αλληλοπάθεια) (Windust et al. 1996), μείωση της θήρευσης, παραγωγής αυγών, εκκολαψιμότητας και επιβίωσης οργανισμών του ζωοπλαγκτού (Turner and Tester 1997), επίσης οι ΕΕΦ προκαλούν συσσώρευση φυκοτοξινών στους ιστούς και υψηλή θνησιμότητα σε δίθυρα μαλάκια, ψάρια, θαλάσσια πτηνά και θηλαστικά (Hallegraeff 1993). Kατά τους (Heisler et al. 2008), η εξέλιξη των HABs δεν εξαρτάται μόνο από την συνολική ποσότητα θρεπτικών που είναι διαθέσιμη αλλά και από τη μορφή που βρίσκονται τα θρεπτικά διαθέσιμα στο σύστημα. Είδη φυκών (ή ομάδες ειδών) έχουν πολυάριθμες φυσικές προσαρμογές που τους επιτρέπουν να αξιοποιούν τα θρεπτικά διαφορετικά. Διαφορετικές ομάδες εμφανίζουν διαφορετικές διατροφικές προτιμήσεις, όπως ο λόγος των θρεπτικών ή τη μορφή των θρεπτικών (Smayda 1990, 1997, Anderson et al. 2002, Smayda and Reynolds 2001, 2003, Glibert and Burkholder 2006). Για παράδειγμα, τα διάτομα απαιτούν πυρίτιο για την ανάπτυξη τους, ενώ συγκεκριμένα δινομαστιγωτά έχουν υψηλότερες απαιτήσεις σε φώσφορο από ότι άλλες ομάδες ειδών (Heisler et al. 2008). Στις ακτές της Γερμανίας αναλύσεις χρονοσειρών συγκέντρωσης θρεπτικών (με διάρκεια αρκετών δεκαετιών), έδειξαν ότι κατά την αύξηση του λόγου Ν:Si κατά τέσσερις φορές (x4) ο πληθυσμός των διατόμων μειώθηκε αλλά παράλληλα υπήρξε αύξηση στις ανθήσεις του Phaeocystis (Radach et al. 1990). Επιπρόσθετα στα μακροθρεπτικά, ουσιώδη για την ανάπτυξη του φυτοπλαγκτού είναι και τα μικροθρεπτικά όπως τα μεταλλικά ιχνοστοιχεία που παίζουν βασικό ρόλο στη φωτοσύνθεση, στην αφομοίωση μακροθρεπτικών αλλά και στην τοξικότητα κάποιων ειδών που συμμετέχουν σε ΕΕΦ (Sunda 2006). Για παράδειγμα, εργαστηριακές μελέτες έδειξαν ότι τα διάτομα Pseudo-nitszchia multiseries και P. αustralis παράγουν 7

αυξημένες συγκεντρώσεις δομοικού οξέος σε περιβάλλον περιορισμένου σιδήρου ή χαλκού (Rue and Bruland 2001, Maldonado et al. 2002, Wells et al., 2005). Τα παραδείγματα που υποστηρίζουν ότι η υποβαθμισμένη ποιότητα νερού (λόγω εισροής θρεπτικών) προάγει την ανάπτυξη και διατήρηση πολλών HABs, αυξάνονται και επαληθεύονται από δεδομένα πεδίου και πειραματικά δεδομένα (π.χ. Riegman, 1995; Bates et al., 1998; Imai et al., 1998; Smayda, 1998), όμως η πιθανότητα κάποια HABs να προάγονται από άλλους λόγους δεν μηδενίζεται. Φυσικές, βιολογικές και άλλες χημικές διεργασίες είναι πιθανό να ρυθμίζουν τις αποκρίσεις των φυκών σε εισροές θρεπτικών (π.χ. Vadstein et al. 2004, Gobler et al. 2002), (Heisler et al., 2008). Μερικές έρευνες έχουν δείξει για παράδειγμα, ότι ούτε η ποσότητα ούτε ο λόγος των ανόργανων θρεπτικών από μόνα τους μπορούν να εξηγήσουν ικανοποιητικά ανθήσεις μεγάλης βιομάζας και διάρκειας (π.χ. Vargo et al. 2004) (Heisler et al. 2008). Άλλοι λόγοι για την παγκόσμια αύξηση των HABs μπορεί να είναι η διασπορά και εισαγωγή ειδών με μεταφορά κυττάρων η κυστών μέσω θαλάσσιων ρευμάτων ή και μέσω ανθρώπινων δραστηριοτήτων (ballast waters) (π.χ. Klein et al. 2009). Η υπεραλίευση αλλά και η αύξηση των υδατοκαλλιεργειών μπορεί να αλλάξουν την βιοκοινότητα των βοσκητών που τρέφονται από τα HABs. Συνήθως ο παράγοντας που ευθύνεται για την παγκόσμια διασπορά ενός είδους δεν είναι μόνο ένας, όπως επίσης μπορεί οι παράγοντες να διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών ειδών (G.E.O.H.A.B., 2001, H.A.R.R.N.E.S.S., 2005). 1.3. Το γένος Pseudo-nitzschia Τα είδη του γένους Pseudo-nitzschia αρχικά περιγράφηκαν από τον Peragallo (1908). Αργότερα μεταφέρθηκαν σε ένα τομέα του γένους Nitzschia και στη συνέχεια πρόσφατα ξανά αναγνωρίσθηκαν ως ένα διαφορετικό γένος από την Hasle (1994). Συγκριτικά με το συγγενικό γένος Nitzschia που αριθμεί εκατοντάδες είδη, το γένος Pseudo-nitzschia είναι σχετικά μικρό με περίπου τριάντα είδη, μερικά από αυτά μόλις πρόσφατα αναγνωρισμένα (Lundholm and Moestrup 2002, Priisholm et al. 2002, Lundholm et al. 2002, 2003). 8

Είδη του γένους Pseudo-nitzschia αποτελούν κυρίως μέρος του φυτοπλαγκτού και απαντούν ανά την υφήλιο (Hasle 2002), παρ όλα αυτά η γνώση για την κατανομή και την αφθονία των τοξικών ειδών μόλις τώρα προκύπτει (Kotaki et al. 2004). Τα είδη Pseudo-nitzschia μπορούν να σχηματίσουν πολυπληθείς ανθίσεις της τάξης των 10 6 με 10 8 κυτ. L -1. Στις ανθήσεις αυτές ένα είδος Pseudo-nitzschia μπορεί να επικρατεί με ποσοστό έως και 99% της συνολικής αφθονίας του φυτοπλαγκτού (π.χ. Subba Rao et al. 1988, Spatharis et al. 2007). Επιπλέον, έχουν καταγραφθεί ανθήσεις μεγάλης διάρκειας, όπως για παράδειγμα η άνθηση του P. multiseries στον κόλπο του Cardigan στον Καναδά το 1987 που διήρκησε δύο μήνες (Bates et al. 1989). Έρευνες στο πεδίο έχουν δείξει ότι τα είδη Pseudo-nitzschia απαντούν κατά μήκος συγκεκριμένων περιοχών και εποχών (Granelli and Turner 2006). Αρκετά από τα είδη έχουν χαρακτηριστεί ως κοσμοπολίτικα με καταγραφές από υποπολικά έως και τροπικά ύδατα. Είδη του γένους Pseudo-nitzschia τοξικά ή μη, όπως τα: P. pseudodelicatissima, P. pungens, P. fraudulenta, P. galaxiae, P. calliantha, P. multiseries, P. mannii, P. multistriata (Moschandreou and Nikolaidis 2010), έχουν καταγραφεί σε όλη σχεδόν την Ελλάδα, ακόμα και σε περιοχές παραγωγικής καλλιέργειας και συγκομιδής μαλακίων. Εξάρσεις τοξικών ειδών του γένους Pseudo-nitzschia εντοπίζονται σε περιοχές με εκτεταμένες αναβλύσεις, όπως η Ακτή της Ισπανίας στον Ατλαντικό Ωκεανό, η Πορτογαλία, η Χιλή και η δυτική ακτή των Η.Π.Α. (Bates and Trainer 2006). Εξάρσεις συμβαίνουν και σε περιοχές με σημαντικές ποτάμιες παροχές όπως την παράκτια περιοχή των Rias Baixas στη Γαλικία της Β.Δ. Ισπανίας, που είναι από τις πιο σημαντικές σε οστρακοκαλλιέργειες με αποτέλεσμα τεράστιες οικονομικές απώλειες (Blanco et al. 2006a). Αφότου το είδος Pseudo-nitzschia multiseries αναγνωρίσθηκε ως υπαίτιο της αμνησιακής δηλητηρίασης από οστρακόδερμα (amnesic shellfish poisoning -ASP) στο Prince Edward Island του Καναδά τον Δεκέμβριο του 1987 (Subba Rao et al. 1988, Bates et al. 1989), τα είδη του γένους αυτού αναγνωρίζονται ολοένα και περισσότερο ως σημαντικά από περιβαλλοντική, οικονομική και υγειονομική άποψη (Fehling et al. 2004a). Η αμνησιακή οστρακόδερμη δηλητηρίαση προκαλείται λόγω της νευροτοξίνης του δομοικού οξέως (Domoic Acid-DA) που μπορεί να μεταφερθεί μέσω της 9

θαλάσσιας τροφικής αλυσίδας δια μέσου της διατροφής (κυρίως με οστρακόδερμα) ακόμα και με θανατηφόρα αποτελέσματα (Bates 2000, Fehling et al. 2004a). Όταν καταναλωθεί επιμολυσμένο οστρακόδερμο από τον άνθρωπο συνήθως προκαλεί απώλεια μνήμης αλλά έχουν καταγραφεί και θάνατοι (Hagström 2007). Προς το παρόν τουλάχιστον δέκα διαφορετικά είδη Pseudo-nitzschia (P. australis, P. calliantha, P. delicatissima, P. fraudulenta, P. multiseries, P. multistriata, P. pseudodelicatissima, P. seriata, P. turgidula και P. galaxiae ) και 1 είδος Nitzschia (N. navis-varingica) έχουν καταγραφεί ότι παράγουν δομοικό οξύ (e.g. Bates 2000, Lundholm et al. 2003, Lundholm et al. 2004, Cerino et al. 2005). Η παραγωγή τοξινών μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τη μορφή των θρεπτικών (Heisler et al. 2008). Για παράδειγμα εργαστηριακές μελέτες αποκάλυψαν ότι η παραγωγή της νευροτοξίνης δομοικό οξύ (DA) από το γένος Pseudo-nitszchia μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την παροχή αζωτούχου υποστρώματος που εκμεταλλεύεται για να αναπτυχθεί (Cochlan et al. 2005, Armstrong-Howard et al. 2007). Σε καλλιέργειες εκθετικής αύξησης του P. αustralis κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε αζωτούχα η αμμωνιακά υποστρώματα παρήγαγαν ίσες ποσότητες διαλυμένου και σωματιδιακού DA, ενώ η παραγωγή DA ενισχύθηκε σε καλλιέργειες με αποκλειστικό αζωτούχο υπόστρωμα την ουρία (Cochlan et al. 2005, Armstrong- Howard et al. 2007). 1.4. Τα είδη P. galaxiae και P. delicatissima Το P. galaxiae είναι ένα είδος κοσμοπολίτικο που όμως δεν έχει μελετηθεί εκτενώς ακόμα, ίσως λόγω της σχετικά πρόσφατης ανακάλυψης του από τους Lundholm and Moestrup (2002). Το P. galaxiae σχηματίζει περιστασιακά αποικίες (Lundholm and Moestrup 2002, Cerino et al. 2003), και έχει παρατηρηθεί στην Νέα Ζηλανδία (Cerino 2005), στον κόλπο της Νάπολης και στην Τυρηναική Θάλασσα της Ιταλίας ως κυρίαρχο είδος με αφθονία 9x10 6 κύτταρα L -1, παράκτια των Βαλεαρίδων νήσων (Zingone et al. 2006, Cerino et al. 2005), στο Μεξικό,και την Αυστραλία (Lundholm et al. 2006, Lundholm and Moestrup 2002), την Ισπανία (Butrón et al. 2011) αλλά και στην Ελλάδα στο Θερμαικό, σαν κυρίαρχο είδος με τη αφθονία να φτάνει τα 5x10 6 10

κύτταρα L -1 (Moschandreou and Nikolaidis 2010). Ενώ παλαιότερες βιβλιογραφικές αναφορές επισημαίνουν ότι το P. galaxiae δεν εμφανίζει τοξικότητα (π.χ. Lunholm & Moestrup 2002) πιο πρόσφατες αναφορές υποστηρίζουν ότι κάποιοι κλώνοι του P. galaxiae μπορούν να παράγουν δομοικό οξύ (π.χ. Lefebvre and Robertson 2010, Zingone et al. 2006, Cerino et al. 2005). Το είδος P. delicatissima έχει μελετηθεί εκτενέστερα λόγω της μεγάλης του γεωγραφικής κατανομής, της τοξικότητας (ορισμένα στελέχη του παράγουν δομοικό οξύ (Smith et al. 1990) του αλλά ίσως και της πρωτύτερης ανακάλυψης του από τον Hasle (1965) ως Nitzschia actydrophila. Η παρουσία του P. delicatissima έχει συσχετιστεί με τον παράκτιο ευτροφισμό, χαρακτηριστικό είναι ότι οι συγκεντρώσεις νιτρικών και νιτρώδων παίζουν σημαντικό ρόλο στη αφθονία του στον κόλπο του Fundy στον Καναδά (Kaczmarska et al. 2007). Στη Μεσόγειο ευνοείται από τις υψηλές συγκεντρώσεις θρεπτικών το χειμώνα, τις τιμές της Chl a κάτω από 0,34mg m -3 και μέση πυκνότητα φυτοπλαγκτού κάτω από 10 5 κύτταρα L -1 (Caroppo et al. 2005). Έχει καταγραφθεί σε όλη την υφήλιο μερικές φορές ως το κυρίαρχο είδος διατόμου στο θαλάσσιο πλαγκτόν (Hasle 1965, 2002, Kaczmarska et al. 1986, Hasle et al. 1996, Hasle and Syvertsen 1997, Skov et al. 1999). Το P. delicatissima έχει παρατηρηθεί στο Svalbard της Νορβηγίας, στις ακτές της Δανίας, στην Ολλανδία, στη Μεσόγειο, στη Γκάνα, στο Χονκ-Κονγκ, στον Κόλπο της Καλιφόρνιας, στον Κόλπο του Μεξικού (Orsini et al. 2004), αλλά και στην Ελλάδα (Ignatiades and Gotsis-Skretas 2007). Μέχρι σήμερα έχει επιβεβαιωθεί η τοξικότητα κάποιων στελεχών του από τη Σκωτία, τη Νορβηγία, τη Δυτική ακτή των Η.Π.Α., την Ανατολική ακτή του Καναδά και τη Νέα Ζηλανδία (Fehling et al. 2004). 1.5. Πειράματα με P. galaxiae και P. delicatissima Τα περισσότερα πειράματα που έχουν γίνει για το γένος Pseudo-nitszchia, και για τα είδη P. galaxiae και P. delicatissima ειδικότερα εστιάζουν στην παραγωγή δομοικού οξέος ενώ πιο περιορισμένες είναι οι μελέτες που αφορούν στην αύξηση των ειδών υπό περιορισμό διαφορετικών θρεπτικών στοιχείων. Για το είδος P. delicatissima έχουν 11

γίνει πολλές μελέτες σε σχέση με την ικανότητα του να παράγει δομοικό οξύ (Quijana- Scheggia et al. 2010, Βακιρτζη 2010), όπως επίσης μελέτες για την επιρροή του οργανικού υλικού (Loureiro et al. 2009) και της φωτοπεριόδου (Fehling et al. 2005) στην ανάπτυξη του είδους αλλά και τις περιβαλλοντικές παράμετρους (Hinga 2002, Lundholm et al. 2004). Οι Loureiro et al. (2009) διαπίστωσαν ότι το P. delicatissima προσλαμβάνει την αμμωνία ευκολότερα από την ουρία, την οποία (ουρία) και χρησιμοποιεί σε συνθήκες έλλειψης αζώτου. Σημαντική ωστόσο παραμένει η διευκρίνηση της επίδρασης του είδους σε περιορισμό θρεπτικών και ιχνοστοιχείων για την καλύτερη κατανόηση των λειτουργιών ανάπτυξης του, ώστε οι πληροφορίες αυτές με τη βοήθεια μοντέλων να αναχθούν σε πραγματικά περιβάλλοντα και καταστάσεις. Για το είδος P. galaxiae, έχουν γίνει λίγες μελέτες παρ όλη την εμφάνιση του σε πολλά μέρη στον κόσμο και της ανακάλυψης της τοξικότητας του. Με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας και mass spectrometry οι Cerino et al. (2005) πρώτοι ανακάλυψαν την παραγωγή δομοικού οξέος από το είδος P. galaxiae σε κλειστές καλλιέργειες του είδους, σε μέσο ανάπτυξης F/2 (με προσθήκη πυριτικών) (Guillard 1983). Παράλληλα με τις καλλιέργειες οι Cerino et al. (2005) διαπίστωσαν ότι οι διαφορές στο μέγεθος και το σχήμα του P. galaxiae που παρουσιάζουν μια συγχρονισμένη και εποχιακή εμφάνιση στη διάρκεια του έτους είναι χαρακτηριστικές για τα διαφορετικά στάδια της ζωής του. Λόγω του ενδιαφέροντος που παρουσιάζει το P. galaxiae είναι σημαντική η περαιτέρω μελέτη του στο πεδίο ως προς την εκτίμηση των περιβαλλοντικών προτιμήσεων, τη διατροφή και των χαρακτηριστικών του αλλά σημαντική είναι επίσης και η εκτενής μελέτη του στο εργαστήριο ως προς τον προσδιορισμό των διατροφικών του προτιμήσεων και αναγκών, της τοξικότητας του, της αναπαραγωγής του, με σκοπό την εκτίμηση και πρόγνωση των ανθίσεων του, αλλά και τη διερεύνηση του ρόλου του μέσα στο φυσικό περιβάλλον. 12

1.6. Στόχος της εργασίας Σκοπός της εργασίας ήταν η σύγκριση των διατροφικών απαιτήσεων σε θρεπτικά (Ν και P) και μικροθρεπτικά (μέταλλα) που επηρεάζουν την αύξηση των ειδών P. galaxiae και P. delicatisssima. Για το σκοπό αυτό διεξήχθη σειρά πειραμάτων με το είδος P. galaxiae τα αποτελέσματα των οποίων συγκρίθηκαν με προηγούμενη εργασία η οποία περιλάμβανε αντίστοιχα πειράματα με το P. delicatisssima (Παλαμαύτη 2011). Αυτό επετεύχθη με την διεξαγωγή πειραμάτων αύξησης (περιορισμού γνωστών θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων) σε κλειστές μονοκαλλιέργειες, καθημερινή καταμέτρηση του κυτταρικού αριθμού και ανάλυση θρεπτικών και χλωροφύλλης από δειγματοληψίες καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων καθώς και την μετέπειτα ανάλυση των δεδομένων με κατάλληλα λογισμικά (Excel, StatGraphics) για τη διεξαγωγή συμπερασμάτων. 13

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Τα είδη που μελετήθηκαν Τα είδη που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι τα: Pseudo-nitzschia galaxiae (Lundholm & Moestrup 2002) και Pseudo-nitzschia delicatissima (Heiden & Kolbe 1928) (Εικόνα 1). Το είδος P. galaxiae όπως και το είδος P. delicatissima απομονώθηκαν από το Καβούρι Αττικής και τον Κόλπο του Θερμαϊκού αντίστοιχα. Η απομόνωση και καλλιέργεια των οργανισμών σε μέσο f/2, έγινε στο τμήμα Οικολογίας και Συστηματικής του Πανεπιστημίου Αθηνών όπου οι οργανισμοί αναγνωρίσθηκαν σε επίπεδο είδους σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (Τransmission Electron Microscopy). (α) (β) Εικόνα 1. Εικόνες από φωτονικό μικροσκόπιο διέλευσης (TEM) των ειδών P. galaxiae (α) και P. delicatissima (β). Καλλιέργειες των μικροφυκών μεταφέρθηκαν και διατηρήθηκαν σε θάλαμο σταθερών συνθηκών του εργαστηρίου Θαλάσσιας Βιολογίας & Οικολογίας του Τμήματος Επιστημών. Ο φωτισμός στον θάλαμο ήταν συνεχής (24 hr) με λάμπες λευκού φωτός 0.3 MJ/m 2 Day και η θερμοκρασία σταθερή στους 19 C. Τα πειράματα διεξήχθησαν με το είδος P. galaxiae, και περιγράφονται παρακάτω ενώ για τη σύγκριση με το είδος P. delicatissima χρησιμοποιήθηκαν αποτελέσματα προηγούμενης εργασίας η οποία περιλάμβανε αντίστοιχα πειράματα (Παλαμαύτη 2011). 14

2.2. Πειράματα περιορισμού θρεπτικών και ιχνοστοιχείων Με σκοπό τον εντοπισμό των συγκεντρώσεων κάτω από τις οποίες θρεπτικά αρχίζουν να γίνονται περιοριστικά για την αύξηση του P. galaxiae, συνολικά έγιναν τρία (3) πειράματα περιορισμού με δύο επαναλήψεις (replicates) για το κάθε πείραμα (Εικόνα 2). Στο πρώτο πείραμα το οποίο αποτελούσε την αναφορά (control) χρησιμοποιήθηκε το μέσο καλλιέργειας f/2 (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975) χωρίς περιορισμό κάποιου θρεπτικού. Στο δεύτερο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν όλες οι αναλογίες του μέσου f/2 εκτός από τα φωσφορικά τα οποία είχαν μειωθεί στη μισή ποσότητα (PO 4 /4). Στο τρίτο πείραμα ο περιορισμός αφορούσε μόνο τα νιτρικά τα οποία επίσης μειώθηκαν στη μισή ποσότητα σε σχέση με το μέσο f/2 (ΝΟ 3 /4). Εικόνα 2. Τα τρία πειράματα περιορισμού θρεπτικών για την αύξηση του P. galaxiae με δύο επαναλήψεις. Με σκοπό τον εντοπισμό των μεταλλικών ίχνο-στοιχείων που επηρεάζουν την ανάπτυξη του P. galaxiae, συνολικά έγιναν έξι πειράματα περιορισμού μεταλλικών ίχνο-στοιχείων με δύο επαναλήψεις για το καθένα. Όλα τα πειράματα έγιναν με μέσο καλλιέργειας f/2 με περιορισμό μόνο στο μεταλλικό ιχνοστοιχείο το οποίο μειώνονταν στο 1/5 της ποσότητας του f/2. Επομένως διεξήχθησαν τα παρακάτω πειράματα: 15

Κοβάλτιο (Co/10), Μολυβδαίνιο (Μο/10), Χαλκός (Cu/10), Ψευδάργυρος (Zn/10), Μαγγάνιο (Mn/10), Σίδηρος+EDTA (Fe/10). 2.3. Πειραματική διαδικασία Για κάθε πείραμα θρεπτικών και μικροθρεπτικών αρχικά διηθήθηκαν ~2L θαλασσινού νερού (φίλτρα ΜΝ GF-3 45mm, Macherey-Nagel). Έπειτα ογκομετρήθηκε 1L για κάθε επαναληπτική καλλιέργεια από το φιλτραρισμένο νερό, το οποίο και τοποθετήθηκε σε κυλινδρική γυάλινη φιάλη, όπου προστέθηκαν απ ευθείας τα κατάλληλα θρεπτικά για το κάθε πείραμα. Στη συνέχεια οι φιάλες αποστειρώθηκαν στον υγρό κλίβανο (15min, 121 C) και έπειτα προστέθηκαν ασηπτικά οι βιταμίνες. Τέλος, εμβολιάσθηκαν οι φιάλες από τη μητρική καλλιέργεια (με ασηπτικές τεχνικές) με χρήση πιπέτας ακριβείας (Nahita) και τοποθετήθηκαν στον θάλαμο σταθερών συνθηκών με συνεχή ανάδευση (σε αναδευτήρα WiseStir, ταχύτητα στροφών 650 rpm). Η χρήση ανάδευσης για αυτό ήταν απαραίτητη εφόσον το είδος αυτό είχε την τάση να σχηματίζει συσσωματώματα τα οποία προσκολλούνταν στα τοιχώματα του δοχείου καλλιέργειας. Ημέρα εμβολιασμού θεωρήθηκε η ημέρα μηδέν. Από την ημέρα μηδέν και έως το πέρας των πειραμάτων (~18 ημέρες) ορίσθηκε, καθημερινή δειγματοληψία 2.5 ml την ίδια ακριβώς ώρα, με αποστειρωμένα σιφώνια και λύχνο του Bunsen, έπειτα το δείγμα σταθεροποιούνταν με ~0.1 ml ουδέτερου διαλύματος Ιωδίνης (Lugol) και ομογενοποιούνταν σε Vortex (Velp Scientifica) στα 40 Hertz για ~3min για τη διάλυση συσσωματωμάτων. Η καταμέτρηση των κυττάρων γινόταν σε αντικειμενοφόρο Palmer Maloney (Palmer Maloney, 1945) σε ανάστροφο μικροσκόπιο Motic AE31 (x400 μεγέθυνση) με προσαρτημένη κάμερα DCM130. Η μέτρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού Scope Photo. Για τα πειράματα των θρεπτικών κάθε τρίτη μέρα διεξάγονταν ασηπτικά δειγματοληψία (50 ml) με αποστειρωμένα σιφώνια των 50 ml και λύχνο Bunsen. Μέρος του δείγματος (6 ml) τοποθετούνταν σε κυβέτες για μέτρηση φθορισμού 16

(Turner, Fluorometer). Το δείγμα που πάρθηκε (6 ml) επανατοποθετήθηκε με το υπόλοιπο (44 ml) και διηθήθηκε (φίλτρα ΜΝ GF-3 45mm, Macherey-Nagel). Στη συνέχεια τα φίλτρα (φυλαγμένα σε αλουμινόχαρτο) και το φιλτραρισμένο νερό (σε πλαστικά φιαλίδια) αποθηκεύθηκαν σε καταψύκτη (-20 C), για μετέπειτα ανάλυση Chl a. Για τα πειράματα των μικροθρεπτικών ορίσθηκε, καθημερινή δειγματοληψία (6 ml) με αποστειρωμένα σιφώνια των 10 ml για τη μέτρηση του φθορισμού. 2.4. Εργαστηριακές αναλύσεις Από τις δειγματοληψίες των 50 ml που γίνονταν κάθε τρίτη μέρα κατά την διάρκεια των πειραμάτων έγιναν αναλύσεις με σκοπό τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων κατά την διάρκεια των πειραμάτων Chl a και c και ανόργανων αλάτων (φωσφορικά, νιτρικά, νιτρώδη και πυριτικά). Οι αναλύσεις έγιναν σύμφωνα με τον οδηγό χημικών και βιολογικών μεθόδων του Parsons (1984). Για τον προσδιορισμό της Chl a και c, τα φίλτρα που φυλάχθηκαν εκχυλίστηκαν (σε πλαστικά φιαλίδια) σε διάλυμα ακετόνης 90%. Αφού υπέστησαν φυγοκέντριση στις 20000 rpm για 15 min πάρθηκε το υπερκείμενο διάλυμα. Τέλος μετρήθηκε η απορρόφηση του (εκχυλισμένου διαλύματος) με τη χρήση φασματοφωτόμετρου σε κυβέτα 1cm 3 (Parsons 1984). Με βάση τις διορθωμένες τιμές απορρόφησης, υπολογίστηκαν οι τιμές των συγκεντρώσεων της χλωροφύλλης. Για τον προσδιορισμό των φωσφορικών ιόντων, από τα δείγματα νερού που φυλάχθηκαν για αναλύσεις, ένα μέρος κατεργάστηκε με όξινο αντιδραστήριο μολυβδαινικού ιόντος (επίσης περιείχε ασκορβικό οξύ και τρυγικό καλιοχαντιμονύλιο). Από την κατεργασία προέκυψε φωσφορομολυβδαινικό οξύ (μπλε-μωβ). Με χρήση φασματοφωτομέτρου (Hitachi Digilab U-1800) σε κυβέτα 1cm 3 μετρήθηκε η απορρόφηση του φωσφορομολυβδαινικού οξέος στα 690nm (Parsons 1984). 17

Πίνακας 1. Οι συγκεντρώσεις θρεπτικών και μικροθρεπτικών για κάθε πείραμα. Συστατικό F/2 NO3/4 PO4/4 Co/10 Mo/10 Cu/10 Zn/10 Mn/10 Fe/10 (μμ) NO 3 882 441 882 882 882 882 882 882 882 PO 4 36.2 36.2 18.1 36.2 36.2 36.2 36.2 36.2 36.2 SiO 3 106 106 106 106 106 106 106 106 106 Fe + EDTA 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 2.34 Cu 0.393 0.393 0.393 0.393 0.393 0.0786 0.393 0.393 0.393 Mo 0.026 0.026 0.026 0.026 0.0052 0.026 0.026 0.026 0.026 Zn 0.076 0.076 0.076 0.076 0.076 0.076 0.0153 0.076 0.076 Co 0.042 0.042 0.042 0.0084 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 Mn 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.0184 0.092 2.5. Ανάλυση δεδομένων Τα δεδομένα από τις καταμετρήσεις του κυτταρικού αριθμού επεξεργάστηκαν αρχικά κάνοντας χρήση του λογαριθμημένου μέσου όρου των επαναλήψεων ενώ για την εύρεση αποκλίσεων έγινε προσαρμογή του τυπικού σφάλματος. Για την στατιστική επεξεργασία των όλων δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν τα λογισμικά StatGraphics Centurion XV.I. και Microsoft Excel 2010. Συνολικά οι μέσες τιμές και οι αποκλίσεις υπολογίστηκαν με διαστήματα εμπιστοσύνης 95% για όλες τις παραμέτρους. Όταν τα δείγματα ακολουθούσαν κανονική κατανομή γινόταν χρήση παραμετρικών μεθόδων (τυπική απόκλιση, μέση τιμή), με χρήση του στατιστικού ελέγχου ANOVA (Analysis Of Variance). Στα δείγματα όπου δεν ακολουθούσαν κανονική κατανομή έγινε χρήση μη-παραμετρικών μεθόδων (ενδοτεταρτημόριο, διάμεσος), και έγινε χρήση του στατιστικού ελέγχου Kruskal-Wallis. Για τη μελέτη της ανάπτυξης των καλλιεργειών P. galaxiae και P. delicatissima, ελέγχθηκε η διαφοροποίηση της κυτταρικής αύξησης με τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης, χρόνου γεννεάς και διαιρέσεις ανά ημέρα. Ο ρυθμός αύξησης GR (Growth Rate) βασίστηκε στο κλασικό τύπο ανάλυσης που εισήγαγε το 1973 ο Guillard (Andersen, 2005): GR = (lnν 2 lnν 1 ) / (t 2 t 1 ), Όπου Ν 1 και Ν 2 είναι ο κυτταρικός αριθμός, τις χρονικές στιγμές t 1 και t 2. Για τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης στο σύνολο των παρατηρήσεων, έγινε εφαρμογή γραμμικής παλινδρόμησης με χρήση του τύπου ελαχίστων τετραγώνων και προσαρμογή της τυπικής απόκλισης. Ο ρυθμός αύξησης υπολογίστηκε κατά την εκθετική περίοδο κυτταρικής αύξησης (exponential phase). Ενώ ο υπολογισμός του χρόνου γενεάς & διαιρέσεων (Divisions per day & Generation time) βασίστηκε στους τύπους: Div.day -1 = GR / Ln2, Gen. time = 1 / Div.day -1. 18

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Πειράματα περιορισμού θρεπτικών Η ανάλυση διακύμανσης κατά τον παράγοντα πείραμα δεν έδειξε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση της κυτταρική αύξησης στην στατική φάση του P. galaxiae (από την ημέρα 9 μέχρι την ημέρα 15) ανάμεσα στα πειράματα περιορισμού θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4) (Anova P>0.05). Αντίθετα το είδος P. delicatissima εμφάνισε στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση της κυτταρική αύξησης (F=25.17, P<0.001) ανάμεσα στα τρία πειράματα. Ο μεγαλύτερος μέσος όρος των διάμεσων του λογαριθμημένου κυτταρικού αριθμού του P. delicatissima παρουσιάστηκε στο πείραμα F/2, ενώ ο μικρότερος στο πείραμα PO4/4 (Γράφημα 1). Log Cell Number 6.1 6 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 F/2 PO4/4 NO3/4 P. galaxiae P. delicatissima Experiment Γράφημα 1. Μέσες τιμές και τυπικό σφάλμα του λογαριθμημένου κυτταρικού αριθμού των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4). Οι τιμές της συγκέντρωσης της Chl a (κατά τη στατική φάση) δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση στα τρία πειράματα περιορισμού θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4) του P. galaxiae (Anova P>0.05). Αντιθέτως το P. delicatissima παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά (F=21.43, P<0.001), με μέσο όρο συγκέντρωσης μεγαλύτερο στο πείραμα F/2 από τα πειράματα PO4/4 και NO3/4 (Γραφημα 2α). Το ίδιο ίσχυε και για τις τιμές της Chl c οι οποίες για το P. galaxiae δεν 19

παρουσίασαν στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση (Anova P>0.05), ενώ στο P. delicatissima παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (F=8.35,P<0.01) (Γράφημα 2β). 500 (α) Chl a (mg/l) 400 300 200 100 P. galaxiae P. delicatissima 0 F/2 PO4/4 NO3/4 Chl c (mg/l) 10 8 6 4 2 0 Experiment F/2 PO4/4 NO3/4 (β) P. galaxiae P. delicatissima Experiment Γράφημα 2. Μέση τιμή και τυπικό σφάλμα της συγκέντρωσης Chl a (α) και Chl c (β) (αντίστοιχα) των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4). Μετρήσεις φθορισμού έγιναν μόνο για το P. galaxiae. Οι τιμές της Chl a (mg/l) που μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά σχεδόν ταυτίστηκαν (ποιοτικά) με τις μετρήσεις φθορισμού για τις πρώτες έξι ημέρες των πειραμάτων, στη συνέχεια όμως άρχισαν να αποκλίνουν (Γραφημα 3). Οι μέσες τιμές φθορισμού των τριών πειραμάτων δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (Anova, P>0.05). 20

Chl-a (mg/l) 600 500 400 300 200 100 F/2 PO4/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 Day Fluoresence 600 500 400 300 200 100 F/2 PO4/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 Day Γράφημα 3. Συγκέντρωση της Chl a και τιμές φθορισμού του είδους P.galaxiae για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4). Η συγκέντρωση των νιτρικών και για τα δύο είδη (Γράφημα 4), στα τρία πειράματα είχε μέγιστες τιμές στην πρώτη δειγματοληψία (τρίτη ημέρα), την έκτη ημέρα μειώθηκε απότομα (έως και πάνω από 50%) και την ένατη ημέρα μειώθηκε εκ νέου (φτάνοντας μέχρι και στο 10% περίπου της αρχικής στο είδος P. galaxiae), ενώ τις επόμενες μέρες η συγκέντρωση έμεινε σχεδόν σταθερή. Στο πείραμα ΝΟ 3 /4 του P. delicatissima η συγκέντρωση των νιτρικών από την ένατη μέρα και έπειτα σχεδόν μηδενίστηκε. 21

NO3 (μμ) 1000 800 600 400 200 P. galaxiae F/2 PO4/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 NO3 (μμ) 1000 800 600 400 200 P. delicatissima Day F/2 PO4/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 Day Γράφημα 4. Συγκέντρωση νιτρικών (ΝΟ 3 ) των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4,NO3/4). Η συγκέντρωση των νιτρωδών για τα δύο είδη και όλα τα πειράματα (Γράφημα 5), παρουσίασε μηδενικές σχεδόν τιμές την πρώτη ημέρα και μέγιστες τιμές κατά την στατική φάση αύξησης με παρρέκλιση το πείραμα ΝΟ3/4 (και στα δύο είδη) όπου η συγκέντρωση των νιτρωδών παρουσίασε μέγιστο την έκτη ημέρα (τελευταία ημέρα εκθετικής αύξησης). 22

NO2 (μμ) 6 5 4 3 2 1 0 P. galaxiae 0 3 6 9 12 15 18 F/2 PO4/4 NO3/4 Day P. delicatissima F/2 NΟ2 (μμ) 6 5 4 3 2 1 0 ` 0 3 6 9 12 15 18 PO4/4 N03/4 Day Γράφημα 5. Συγκέντρωση νιτρωδών (NO 2 ) των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4). Η συγκέντρωση των φωσφορικών, στα πειράματα και των δύο ειδών μειώθηκε παράλληλα με την κυτταρική αύξηση, αυτό είχε σαν αποτέλεσμα την εξάντληση των φωσφορικών σχεδόν από την έκτη μέρα (τελευταία μέρα εκθετικής ανάπτυξης). Οι τιμές των φωσφορικών μετρήθηκαν υψηλότερες το P. delicatissima από αυτές του P. galaxiae (Γράφημα 6) ακόμα και την ημέρα μηδέν (ενώ θα έπρεπε να είναι ίδιες με τις τιμές του P. delicatissima), παρ όλα αυτά εξαντλήθηκαν σχεδόν την έκτη ημέρα εκτός από το πείραμα ΝΟ3/4 που μειώθηκε πολύ την ένατη ημέρα. 23

PO4 (μμ) 50 40 30 20 10 0 P. galaxiae 0 3 6 9 12 15 18 Day F/2 PO4/4 NO3/4 PO4 (mm) 50 40 30 20 10 0 P. delicatissima 0 3 6 9 12 15 18 Day F/2 PO4/4 NO3/4 Γράφημα 6. Συγκέντρωση φωσφορικών (PO 4 ) του είδους P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2,PO4/4,ΝO3/4). Η διακύμανση των τιμών της συγκέντρωσης των πυριτικών (SiO 2 ) στα τρία πειράματα, ήταν παρόμοια και για τα δύο είδη. Οι μέγιστες τιμές παρουσιάστηκαν τις πρώτες ημέρες (εώς και την τρίτη ημέρα) ενώ τις υπόλοιπες ημέρες οι τιμές διατηρήθηκαν σε παρόμοια επίπεδα, χωρίς όμως να πλησιάσουν το μηδέν. Στο είδος P. galaxiae οι μεγαλύτερες τιμές, παρουσιάστηκαν στο πείραμα F/2 κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης (Anova P>0.05) αλλά και κατά τη διάρκεια όλου το πειράματος (Anova P>0.05), για το P. delicatissima οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις παρουσιάστηκαν στο πείραμα PO4/4 (P Value > 0.05) (Γραφημα 7). 24

SiO2 (μμ) 200 150 100 50 P. galaxiae F/2 PO4/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 Day SiO2 (μm) 200 150 100 50 P. delicatissima F/2 P04/4 NO3/4 0 0 3 6 9 12 15 18 Day Γράφημα 7. Συγκέντρωση πυριτικών (SiO 2 ) του είδους P. galaxiae και P. delicatissima για τα τρία πειράματα θρεπτικών (F/2, PO4/4, NO3/4). 3.2 Πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων. Στα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων του είδους P. galaxiae και P. delicatissima παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικη διαφορά ανάμεσα στο μέσο κυτταρικό αριθμό του πειράματος F/2 και Fe/10 (F=4.08, P<0.01 και αντίστοιχα F=63.17,P<0.001). Οι μέσοι των κυτταρικών αριθμών όλων των υπόλοιπων πειραμάτων (F/2, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10) του P. galaxiae δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (Anova P>0.05). Το είδος P. delicatissima παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στο μέσο 25

κυτταρικό αριθμό του πειράματος F/2 και τον μέσο όλων των πειραμάτων περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων. Όπως επίσης διαφορά, παρουσίασαν τα πειράματα (του P. delicatissima) Co/10 και Zn/10 σε σχέση με τα πειράματα Mn/10 και Fe/10. (Γράφημα 8). Log Cell Number 7 6 5 4 3 2 1 0 F/2 Co/10 Mo/10 Cu/10 Zn/10 Mn/10 Fe+EDTA/10 P. galaxiae P. delicatissima Experiment Γράφημα 8. Μέσες τιμές και τυπικό σφάλμα του λογαριθμημένου κυτταρικού αριθμού των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για το πείραμα θρεπτικών F/2 και τα έξι πειράματα μεταλλικών ιχνοστοιχείων (Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10). O φθορισμός μετρήθηκε μόνο στα πειράματα του είδους P. galaxiae (Γράφημα 9). Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικη διαφορά ανάμεσα στις τιμές φθορισμού των πειραμάτων F/2 και Co/10 με τις τιμές φθορισμού των υπολοίπων πειραμάτων (Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10), αλλά επίσης διαφορά παρατηρήθηκε ανάμεσα στις τιμές των Mo/10, Zn/10 και Mn/10 σε σχέση με τις τιμές των Cu/10 και Fe/10 οι οποίες ήταν στατιστικώς χαμηλώτερες σύμφωνα με τη στατιστική δοκιμή Multiple range test (F=8.28, P<0.001). 26

Means and 95.0 Percent LSD Intervals 500 400 E.Fluorescence 300 200 100 0 F/2 Co/10 Mo/10 Cu/10 Zn/10 Mn/10 Fe/10 E.Experiment Γράφημα 9. Μέσες τιμές και διαστήματα εμπιστοσύνης (LSD intervals) για τη τιμή φθορισμού του είδους P. galaxiae για το πείραμα θρεπτικών F/2 και τα έξι πειράματα μεταλλικών ιχνοστοιχείων (F/2, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Μn/10 και Fe/10). Fluoresence 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Fluoresence Log cell numb. 5.8 5.6 5.4 5.2 5 4.8 4.6 4.4 Log cell number F/2 NO3/4 PO4/4 Mo/10 Co/10 Zn/10 Cu/10 Fe/10 Mn/10 Γράφημα 10. Η τιμή φθορισμού και ο λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός του είδους P. galaxiae για το πείραμα αναφοράς F/2 και τα έξι πειράματα μεταλλικών ιχνοστοιχείων (Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10). 27

3.3 Ρυθμός αύξησης στα πειράματα περιορισμού θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων. Ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης κατά την εκθετική φάση παρατηρήθηκε στο πείραμαμα Cu/10 του είδους P. galaxiae όπου όμως παρατηρήθηκε και το μεγαλύτερο σφάλμα (Γράφημα 11). Γράφημα (11). Ρυθμός αύξησης (λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός ανά ημέρα) κατά την εκθετική αύξηση των ειδών των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για όλα τα πειράματα θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων (F/2, PO4/4, NO3/4, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10, Fe+EDTA/10). 28

Τις περισσότερες διαιρέσεις ανά ημέρα (στη διάρκεια της εκθετικής φάσης) παρουσίασε το είδος P. galaxiae στο πείραμα Cu/10, ενώ τις λιγότερες παρουσίασε το είδος P. delicatissima στα πειράματα Mn/10 και Fe/10 εμφανίζοντας αρνητικές τιμές (Γράφημα 12). Ο μεγαλύτερος χρόνος γεννεάς παρατηρήθηκε στο πείραμα PO4/4 και Zn/10 του είδους P. delicatissima και στο πείραμα Mo/10 του είδους P. galaxiae (Γράφημα 13). Αναλυτικά ο ρυθμός αύξησης, η τυπική απόκλιση, οι διαιρέσεις ανά ημέρα και ο χρόνος γενεάς στον πίνακα 2. Experiment f/2 - Fe/10 f/2 - Mn/10 f/2 - Zn/10 f/2 - Cu/10 f/2 - Mo/10 f/2 - Co/10 f/2 - NO3/4 f/2 - PO4/4 f/2 P. galaxiae 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 Experiment f/2 - Fe/10 f/2 - Mn/10 f/2 - Zn/10 f/2 - Cu/10 f/2 - Mo/10 f/2 - Co/10 f/2 - NO3/4 f/2 - PO4/4 f/2 P. delicatissima 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 Γράφημα 12. Διαιρέσεις ανά ημέρα κατά την εκθετική αύξηση των ειδών των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για όλα τα πειράματα θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων (F/2, PO4/4, NO3/4, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10). 29

Γράφημα 13. Χρόνος γενεάς κατά την εκθετική αύξηση των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima για όλα τα πειράματα θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων (F/2, PO4/4, NO3/4, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10). 30

Πίνακας 2. Παρουσίαση του ρυθμού αύξησης της τυπικής απόκλισης, των διαιρέσεων ανά ημέρα και ο χρόνος γενεάς για όλα τα πειράματα (F/2, PO4/4, NO3/4, Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10). των ειδών P. galaxiae και P. delicatissima. Είδος P. galaxiae P. delicatissima Πείραμα Ρυθμός αύξησης Τυπική απόκλιση Διαιρέσεις ανά ημέρα Χρόνος Γενεάς f/2 1.04 0.02 0.50 0.68 f/2 - PO4/4 1.12 0.09 1.61 0.62 f/2 - NO3/4 1.15 0.13 1.66 0.60 f/2 - Co/10 1.39 0.31 2.00 0.50 f/2 - Mo/10 0.66 0.05 0.95 1.05 f/2 - Cu/10 1.57 0.72 2.26 0.44 f/2 Zn/10 0.71 0.19 1.02 0.98 f/2 - Mn/10 1.20 0.00 1.74 0.58 f/2 Fe/10 1.00 0.00 1.44 0.69 f/2 1.08 0.12 1.55 0.64 f/2 - PO4/4 0.63 0.10 0.90 1.11 f/2 - NO3/4 0.84 0.06 1.21 0.83 f/2 - Co/10 0.80 0.01 1.16 0.86 f/2 - Mo/10 0.82 0.12 1.19 0.84 f/2 - Cu/10 0.84 0.03 1.21 0.82 f/2 Zn/10 0.63 0.08 0.91 1.10 f/2 - Mn/10-0.17 0.03-0.25-4.05 f/2 Fe/10-0.08 0.04-0.12-8.57 31

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα πειράματα περιορισμού θρεπτικών το P. galaxiae δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στον κυτταρικό αριθμό στα τρία πειράματα. Αντιθέτως εμφάνισε μεγαλύτερο ρυθμό αύξησης στο πείραμα περιορισμού νιτρικών ακόμα και σε σε σχέση με το πείραμα αναφοράς (F/2). Έρευνες (Howard et al. 2007, Cochlan et al. 2008, Radan 2008), υποστηρίζουν ότι είδη του γένους Pseudo-nitzschia αναπτύσονται το ίδιο ή και καλύτερα σε υποστρώματα μειωμένου αζώτου. Η τιμή της συγκέντρωσης κυττάρων ανά λίτρο είναι πολύ μεγαλύτερες από μελέτες πεδίου που έγιναν σε παράκτια ύδατα στην Ελλάδα και που το P. galaxiae βρέθηκε σε πληθυσμούς της τάξης των 10 6 κυττάρων ανά λίτρο (Moschandreou and Nikolaidis, 2010). Οι τιμές της Chl a εμφάνισαν αρκετά ψηλές τιμές σφάλματος, ενώ τα πειράματα με μεγαλύτερες τιμές συγκέντρωσης Chl a είχαν μεγαλύτερο ρυθμό αύξησης. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσματα των μετρήσεων φθορισμού του P. galaxiae, που τις ημέρες εκθετικής αύξησης ταυτίστηκαν με τα αποτελέσματα των μετρήσεων της Chl a. Η μελέτη προτείνει τη μέθοδο μέτρησης του φθορισμού ως επαρκή, για τη μελέτη της αύξησης του P. galaxiae, λαμβάνοντας υπόψην και τη δυσκολεία κατά τη μέτρηση του συγκεκριμένου είδους, λόγω δημιουργίας συσσωματωμάτων. Οι τιμές της Chl c κυμάνθηκαν όπως οι τιμές της Chl a και δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά. Το P. delicatissima παρούσιασε σημαντικές διαφορές στις τιμές του μέσου κυτταρικού αριθμού στα πειράματα θρεπτικών με μέγιστες τιμές στο πείραμα F/2. Αν και οι τιμές του μέσου κυτταρικού αριθμού στα τρία πειράματα ήταν διπλάσιες σε σχέση με το είδος P. galaxiae, ο ρυθμός αύξησης στο πείραμα F/2, ήταν σχεδόν ίδιος για τα δύο είδη, ενώ στα υπόλοιπα πειράματα το είδος P. delicatissima είχε μικρότερο ρυθμό αύξησης σε σχέση με τα αντίστοιχα πειράματα του P. galaxiae. Το είδος P.delicatissima, έχει βρεθεί στο πεδίο σε μικρότερες συγκεντρωσεις απ' ότι στη συγκεκριμένη μελέτη, της τάξης 10 6 κύτταρα ανά λίτρο στην Ισπανία (Quijano- Sheggia, 2008-09). Το πείραμα αναφοράς του είδους P. delicatissima εμφάνισε 32

σημαντική διαφορά στη μέση τιμή συγκέντρωσης Chl a σε σχέση με τα υπόλειπα πειράματα περιορισμού θρεπτικών, συνεπώς για το είδος αυτό ο περιορισμός του αζώτου και του φωσφόρου έχουν αρνητικές συνέπειες στην αύξηση του. Οι τιμές της Chl a, παρατηρήθηκε ότι ήταν πολύ πιο υψηλές σε σύγκριση με συγκεντρώσεις που έχουν μετρηθεί στο πεδίο στη Μεσόγειο (4.8±2.8 mg/l σε κυτταρική πυκνότητα της τάξης 10 6 κύτταρα ανά λίτρο (Quijano-Sheggia, 2008) και 13.4±0.9 mg/l σε κυτταρική πυκνότητα της τάξης των 10 3 κυττάρων ανά λίτρο). Οι τιμές της Chl c κυμάνθηκαν (ποιοτικά) όπως οι τιμές της Chl a. Το είδος P. galaxiae, εξάντλησε τα νιτρικά πιο γρήγορα σε σχέση με το P. delicatissima. Όσο αφορά τα θρεπτικά, οι τιμές της συγκέντρωσης των νιτρικών στα πειράματα του P. galaxiae ήταν υψηλές τις πρώτες ημέρες διεξαγωγής των πειραμάτων με το πείραμα των μειωμένων νιτρικών να έχει πιο μικρές συγκεντρώσεις. Τα νιτρώδη που παρουσιάζονται σαν δευτερογενές υλικό απο το μεταβολισμό των νιτρικών, παρουσίασαν μηδενικές τιμές την πρώτη ημέρα και αυξάνονταν με το πέρας των ημερών, η μέγιστη τιμή για τα πειράματα F/2 και PO4/4 παρουσιάστηκαν την τελευταία ημέρα διεξαγωγής των πειραμάτων. Η μέση τιμή της συγκέντρωσης των φωσφορικών του P. galaxiae δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά ανάμεσα στα πειράματα θρεπτικών, οπως τα νιτρικά έτσι και τα φωσφορικά στα πειράματα θρεπτικών του P. galaxiae σχεδόν εξαντλήθηκαν την έκτη ημέρα (και στα τρία πειράματα). Η μέση τιμή της συγκέντρωσης των πυριτικών το οποίο αποτελεί απαραίτητο συστατικό για την ανάπτυξη των διατόμων τόσο για τη κατασκευή του τοιχώμτατος τους όσο και για τη διαδικασία αντιγραφής DNA και την πρωτεινοσύνθεση (Sulivan et al., 1981), δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στα πειράματα θρεπτικών F/2, PO4/4 και NO3/4. Στο είδος P. delicatissima ο περιορισμός βασικών θρεπτικών (φωσφορικά και νιτρικά) φάνηκε να παρουσιάζει αρνητική επίδραση, ενώ στην αύξηση του είδους P. galaxiae ο περιορισμός των ίδιων θρεπτικών και στην ίδια ποσότητα δεν φάνηκε να παρουσιάζει κάποια επίδραση. Ενώ τα νιτρικά παρουσίασαν υψηλότερες τιμές στο είδος P. galaxiae, το είδος P. delicatissima παρουσίασε υψηλότερες τιμές νιτρώδων το οποίο 33

μπορεί να σημαίνει καλύτερη ανταπόκριση του P. delicatissima στο υπόστρωμα αζώτου. Οι μέσες τιμές της συγκέντρωσης των φωσφορικών του P. delicatissima κυμάνθηκαν όπως και του P. galaxiae (σχεδόν εξαντλήθηκαν την έκτη ημέρα), αν και η μέση τιμή της συγκέντρωσης των φωσφορικών του είδους P. delicatissima στο πείραμα NO3/4 προκύπτει μεγαλύτερη από αυτή του πειράματος PO4/4, πιθανά λόγω κάποιου σφάλματος. Η μέση τιμή της συγκέντρωσης των πυριτικών δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά ανάμεσα στα πειράματα θρεπτικών F/2, PO4/4 και NO3/4 του κάθε είδους ξεχωριστά, αλλά και ανάμεσα στα δύο είδη. Οι τιμές που παρατηρήθηκαν στα πειράματα θρεπτικών και των δύο ειδών ήταν πολύ πιο υψηλές (~ 160-9 μμ) απ ότι σε δειγματοληψίες πεδίου σε δύο κόλπους της Μεσογείου κατά τη διάρκεια άνθισης του P. delicatissima (13.54-0.25μΜ στον κόλπο Alfac και 37.73-3.58 στον κόλπο Fanqar) (Quijano-Scheggia 2008, 2009). Ενώ οι μέσες τιμές των συγκεντρώσεων των φωσφορικών και των νιτρωδών ήταν μεγαλύτερες για όλα πειράματα του είδους P.delicatissima, στη περίπτωση των πυριτικών όπως και των νιτρικών οι μέσες τιμές των πειραμάτων PO4/4 και NO3/4 ήταν μεγαλύτερες στο είδος P. galaxiae. Όσο αφορά τα πειράματα μεταλλικών ιχνοστοιχειων (Co/10, Mo/10, Cu/10, Zn/10, Mn/10 και Fe/10) το είδος P. galaxiae φάνηκε να επηρεάζεται μόνο από τη μείωση του σιδήρου καθώς το πείραμα Fe/10 παρουσίασε σημαντικά μειωμένο κυτταρικό αριθμό σε σχέση με όλα τα υπόλοιπα πειράματα, αν και ο ρυθμός αύξησης κατά τη εκθετική και στάσιμη φάση ήταν μικρότερος στα πειράματα Zn/10 και Mo/10. Εκτός του πειράματος Fe/10, τα υπόλοιπα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχειων του είδους P. galaxiae δεν παρουσίασαν σημαντική διαφορά μεταξύ του αλλά ούτε σε σχέση με το πείραμα αναφοράς. Αξιοσημείωτο είναι ότι ο ρυθμός αύξησης στο είδος P.galaxiae των πειραμάτων Co/10, Cu/10 και Mn/10 ήταν μεγαλύτερος από το ρυθμό αύξησης του πειράματος F/2. Η κατανομή των τιμών του φθορισμού (από μεγαλύτερες τιμές σε μικρότερες) στα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων ακολούθησε την κατανομή των τιμών του κυτταρικού αριθμού, γεγονός που ενισχύει το συμπέρασμα ότι η μέτρηση του φθορισμού μπορεί να είναι κατάλληλη για τη εξαγωγή συμπερασμάτων ως προς την αύξηση του. 34

Το είδος P. delicatissima παρουσίασε σημαντικά μεγαλύτερες τιμές μέσου κυτταρικού αριθμού στο πείραμα αναφοράς (F/2) σε σχέση με όλα τα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων. Ανάμεσα στα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων σημαντική διαφορά είχαν τα πειράματα Fe+EDTA/10 και Mn/10 που παρουσίασαν αρνητικό ρυθμό αύξησης. Σύμφωνα με τους Graham et al. (2009) αρνητικός ρυθμός αύξησης σημαίνει ότι ο πληθυσμός μειώνεται σε αριθμό κυττάρων. Μέσα από τη μελέτη της επίδρασης των μειωμένων θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων στην αύξηση των δύο ειδών (P. galaxiae και P. delicatissima), παρατηρήθηκε αρνητική επίδραση της μείωση του σιδήρου (Fe+EDTA), αν και το είδος P. delicatissima, έδειξε μεγαλύτερη επιρροή εμφανίζοντας μηδενική αύξηση στο συγκεκριμένο πείραμα. Ενώ το είδος P. galaxiae δεν παρουσίασε σημαντική διαφοροποίηση της αύξησης του στα υπόλοιπα πειράματα, το είδος P. delicatissima φάνηκε να είναι πιο επιρρεπής στη μείωση θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων λόγω της σημαντικής διαφοροποίσησης όλων των πειραμάτων περιορισμού σε σχέση με το πείραμα αναφοράς. 35

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Anderson, D.M., Glibert, P.M., Burkholder, J.M., 2002. Harmful algal blooms and eutrophication: nutrient sources, composition and consequences. Estuaries 25(4B),704 726. 2. Andersen, T., Færøvig, P.J., Hessen, D.O. 2007. Growth rate versus biomass accumulation: Different roles of food quality and quantity for consumers. Oslo, Norway. Limnol. Oceanogr., 52(5): 2128 2134. 3. Armstrong-Howard, M.D., Cochlan, W.P., Ladzinsky, N.L., Kudela, R.M., 2007. Nitrogenous preference of toxogenic Pseudo-nitzschia australis (Bacillariophyceae) from field and laboratory experiments. Harmful Algae 6, 206 217. 4. Bακιρτζή, Κ.Ι., 2010. Οικολογία επιβλαβών μικροφυκών και επίδραση στο θαλάσσιο βενθικό οικοσύστημα. Διδακτιρική διατριβή. Εθνικό και καποδιστριακό πανεπιστήμιο Αθηνών, τμήμα βιολογίας και ταξινομικής, Αθήνα. 5. Bates, S.S., 2000. Domoic acid-producing diatoms: another genus added! J. Phycol. 36: 978 983. 6. Bates, S. S., Bird, C. J., de Freitas, A. S. W., Foxall, R., Gilgan, M., Hanic, L. A., Johnson, G. R., McCulloch, A. W., Odense, P., Pocklington, R., Quilliam,M. A., Sim, P. G., Smith, J. C., Subba Rao, D. V., Todd, E. C. D.,Walter, J. A. &Wright, J. L. C. 1989. Pennate diatom Nitzschia pungens as the primary source of domoic acid, a toxin in shellfish from eastern Prince Edward Island, Canada. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 46:1203 15. 7. Bates, S.S., Garrison, D.L., Horner, R.L., 1998. Bloom dynamics and physiology of domoic-acid-producing Pseudo-nitzschia species. In: Anderson, D.M., Cembella, A.D., Hallegraeff, G.M. (Eds.), Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms. NATO ASI Series, vol. G 41. Springer-Verlag, Berlin, pp. 131 267. 8. Bates S.S. and Trainer, V.L. 2006. The ecology of Harmful Diatoms. In Gréli, E. and Turner, J.T. (Eds) Ecology aof Harmful algae. Ecological Studies, 189, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New york, pp. 81-93. 9. Blanco, J., Acosta, C.P., Marino, C., Muniz, S., Martin, H., Morono, A., Correa, J., Arevalo, F., and Salgado, C. 2006a. Depuration of domoic acid from different body compartments of the king scallop Pecten maximus grown in raft culture and natural bed. Aquatic Living Resources, 19(3), 257-265. 36

10. Bodenau, N., 1993. Microbial blooms in the Romanian area of the Black Sea and contemporary eutrophication conditions. In: Smayda, T.J., Shimizu, Y. (Eds.), Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea. Elsevier, Amsterdam, pp. 203 209. 11. Boesch, D.F., 2002. Challenges and opportunities for science in reducing nutrient over-enrichment of coastal ecosystems. Estuaries 25: 744 758. 12. Burkholder, J.M., 2002. Cyanobacteria. In: Bitton, G. (Ed.), Encyclopedia of Environmental Microbiology. Wiley Publishers, New York, pp. 952 982. 13. Butrón, A., Emma Orive, E., Madariaga., I. 2011. Potential risk of harmful algae transport by ballast waters: The case of Bilbao Harbour Butrón, A., Emma Orive, E., Madariaga., I. Marine Pollution Bulletin 62: 747 757. 14. Caropo, C., Congestri R., Bracchini, L., and Albertano, P. 2005. On the presence of Pseudo-nitzschia calliantha (Lundholm, Møestrup et Hasle) and Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve) Heiden in the Southern Adriatic Sea (Mediterranean Sea, Italy). Journal of Plankton Research 27:763-774. 15. Cerino, F., Orsini, L., Sarno D., Dell Aversano, C., Tartaglione, L., and Zingone, A. 2005. The alteration of different morphotypes in the seasonal cycle of the toxic diatom Pseudo-nitzschia galaxiae. Harfull Algae 4:33-48. 16. Cochlan, W.P., Herndon, J., Kudela, R.M. 2008. Inorganic and organic nitrogen uptake by the toxigenic diatom Pseudo-nitzschia australlis (Bacillariophycae). Harmful Algae 8:111-118. 17. Cochlan W.P., Herndon J., Ladizinsky N.L., Kudela RM., 2005. Nitrogen uptake by the toxigenic diatom Pseudo-nitzschia australis. GEOHAB Open Science Meeting: HABs and Eutrophication, Baltimore, MD, USA. 18. De Jonge VN, Elliott M, Orive E. 2002. Causes, historical development, effects and future challenges of a common environmental problem: eutrophication. Hydrobiologia 475:1-19. 19. Fehling, I., Davidson, K., Bates S.S. 2005. Growth dynamics of non-toxic Pseudo-nitzschia delicatissima and toxic P. seriata (Bacillariophycae) under stimulated spring and summer photoperiods. Harmful Algae 4: 763-769. 20. Fehling, J., Davidson, K., Bolch, C. J., Bates, S. S. 2004a. Growth and domoic acid production by Pseudo-nitzschia seriata (Bacillariophyceae) under phosphate and silicate limitation. Journal of phycology 40:674-683. 21. GEOHAB (Global Ecology and Oceanography of Harmful Algal Blooms Programme), 2001. Science Plan. Glibert, P., G. Pitcher (eds.). SCOR and IOC, Baltimore, MD, and Paris, France. 37