Η σημασία του περιορισμού θρεπτικών και ιχνοστοιχείων. στην αύξηση του Pseudo- nitzschia delicatissima. με χρήση κλειστών συστημάτων καλλιέργειας

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ Σχολή Περιβάλλοντος Τμήμα Επιστημών της Θάλασσας ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΤΙΤΛΟ: Η σημασία του περιορισμού θρεπτικών και ιχνοστοιχείων στην αύξηση του Pseudo- nitzschia delicatissima με χρήση κλειστών συστημάτων καλλιέργειας ΠΑΛΑΜΑΥΤΗ ΕΛΕΝΗ, ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Καρύδης Μιχαήλ, Τακτικός Καθηγητής Τσιρτσής Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής Σπαθάρη Σοφία, Λέκτορας επί σύμβαση 407/80 ΜΥΤΙΛΗΝΗ, ΛΕΣΒΟΣ, 2011.

2 Humanity do not appreciate the Ocean, but Harmful Algal Blooms is an opportunity for tuition -B. Reguera, Κρήτη,

3 Στην Κική Σαλταφέρου Τσακαλία που πρότεινε το ταξείδι, μα & στον πατέρα μου που με στήριξε σε όλη την πορεία. 3

4 Περίληψη Το δυνητικά τοξικό διάτομο Pseudo-nitzschia delicatissima είναι ένα από τα πιο μελετημένα είδη τόσο στο πεδίο όσο και σε εργαστηριακά πειράματα, μιας και έχει κοσμοπολίτικη εξάπλωση και ευκολία στην καλλιέργειά του. Το είδος αυτό έχει θεωρηθεί υπεύθυνο για την πρόκληση περιστατικών αμνησιακής δηλητηρίασης (ASP) στον άνθρωπο και δυσμενής συνέπειες στην οικονομία. Ωστόσο, λίγες είναι οι μελέτες που εξετάζουν την επίδραση του περιορισμού θρεπτικών αλάτων και μεταλλικών ιχνοστοιχείων στην αύξηση του είδους. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να διερευνήσει την αύξηση του P. delicatissima στα όλο ένα αυξανόμενα περιστατικά του είδους στα παράκτια οικοσυστήματα κάνοντας χρήση διαφορετικών συγκεντρώσεων θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων, έτσι ώστε να διεξαχθούν συμπεράσματα για τους δυνητικούς παράγοντες που επιδρούν στην εμφάνιση και τις ανθίσεις αυτού του είδους στα παράκτια οικοσυστήματα. Το είδος μελετήθηκε σε καλλιέργειες, κάνοντας χρήση του θρεπτικού μέσου f/2 ενώ σε κάθε πείραμα μεταβάλλονταν ένα από τα συστατικά του, ως εξής: μέσο f/2 χωρίς περιορισμό, NO 3 /4, NO 3 /8 (περιορισμός νιτρικών), PO 4 /4 PO 4 /8 (περιορισμός φωσφορικών), και metals/10 (περιορισμός μεταλλικών ιχνοστοιχείων). Τα αποτελέσματα έδειξαν μέγιστο κυτταρικό αριθμό των ειδών υπό υπό συνθήκες f/2, απουσία περιοριστικών παραγόντων. Ενώ οι συγκεντρώσεις περιορισμού NO 3 και PO 4 εμφανίστηκαν ως ένας σημαντικός παράγοντας κυτταρικής μείωσης όπου εκφράστηκε μέσω του κυτταρικού αριθμού μα και ως συγκέντρωση Chl a. Καμία αύξηση δεν παρατηρήθηκε για τον περιορισμό μεταλλικών ιχνοστοιχείων. Με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των επιμέρους μετάλλων στην αύξηση, διεξήχθησαν έξι πειραματικές συνθήκες όπου το μέσο καλλιέργειας f/2 διαφοροποιούνταν ως προς την συγκέντρωση του μετάλλου όπου εξετάζονταν: Zn/10, Co/10, Mo/10, Mn/10, Cu/10, Fe+EDTA/10. Καμία αύξηση δεν παρατηρήθηκε για τα πειράματα με περιορισμό Mn και Fe+EDTA, ενώ ο ρυθμός αύξησης για τον Zn ήταν χαμηλότερος από τις δοκιμές Co, Mo, και Cu. Τα αποτελέσματα τις παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι η αύξηση του P. delicatissima περιορίζεται από τα NO 3 και τα PO 4 ενώ ο περιορισμός του Mn και του Fe μπορεί να υποδηλώνουν έναν μείζων ρόλο στο σχηματισμό ανθίσεων του είδους στο φυσικό περιβάλλον. 4

5 ΛΙΣΤΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Τοξικά είδη Pseudo- nitzschia, η δράση τους καθώς και οι περιοχές όπου τα είδη αυτά έχουν προκαλέσει προβληματικά περιστατικά, σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές αναφορές. Πίνακας 2: Περιοχές που το είδος P. delicatissima προκάλεσε σύμφωνα με ερευνητές. περιστατικά επιβλαβών ανθίσεων (HABs) Πίνακας 3: Χαρακτηριστικές συγκεντρώσεις των τιμών θρεπτικών αλάτων, κυτταρικής πυκνότητας και Chl a, από μελέτες πεδίου σε διάφορες περιοχές της Μεσογείου όπου έχουν καταγραφεί περιστατικά ανθίσεων του είδους Pseudo-nitzschia delicatissima. Πίνακας 4: Παρουσίαση των θρεπτικών συστατικών, ιχνοστοιχείων και βιταμινών που ήταν απαραίτητα για την παρασκευή του μέσου καλλιέργειας (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975). Πίνακας 5: Πειράματα για την διερεύνηση του περιορισμού θρεπτικών συστατικών στην αύξηση του P. delicatissima. Ως πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν οι αναλογίες του μέσου f/2 (πείραμα 1) ενώ στα υπόλοιπα πειράματα περιορισμού θρεπτικών χρησιμοποιήθηκε το μέσο f/2 με μειωμένη συγκέντρωση του εκάστοτε θρεπτικού. Οι μονάδες μέτρησης της συγκέντρωσης είναι σε (Μμ) Ο πίνακας παρουσιάζει τον λόγο Ν : Ρ κατά Redfield που προέκυψε από τις αρχικές συγκεντρώσεις του εκάστοτε εργαστηριακού πειράματος. Πίνακας 6: Πειράματα για την διερεύνηση του περιορισμού μετάλλων στην αύξηση του P. delicatissima. Ως πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν οι αναλογίες του μέσου f/2 (πείραμα 1) ενώ στα έξι πειράματα περιορισμού επιμέρους μετάλλων χρησιμοποιήθηκε το μέσο f/2 με τη συγκέντρωση του εκάστοτε μετάλλου μειωμένη κατά 5 φορές. Πίνακας 7: Παρουσίαση του ρυθμού αύξησης, των διαιρέσεων ανά ημέρα και του χρόνου γενεάς για όλα τα πειράματα. ΛΙΣΤΑ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: (a) Οι συνολικές ευτροφικές συνθήκες, που σχετίζονται με τα ευτροφικά συμπτώματα και τους παράγοντες επιρροής (b) Οι παράγοντες επιδρασης, ευτροφικών συμπτωμάτων και μελλοντικές βλέψεις (Bricker et al. 2008). Εικόνα 2: Απεικόνιση των πιο μελετημένων ειδών της οικογένειας. Αριστερά το P. australis (5 mm) με εμφανή την καφέ απόχρωση των χλωροπλαστών και δεξιά το P. multiseries (20μm και 2 μm). (Φωτογραφίες των Holtermann, K., και Miler, P., US SC). Εικόνα 3: Απεικόνιση των αλυσίδων που σχηματίζει το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima (40x) Εικόνα 4: Το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima φωτογραφίες μικροδομής από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΤΕΜ), σε μεγέθυνση 100x (Caroppo, 2005). Εικόνα 5: Τα τριπλότυπα μέσα στο θάλαμο σταθερών συνθηκών. Εικόνα 6: Τα διπλότυπα επαναληπτικά πειράματα, διπλότυπες καλλιέργειες των πειραμάτων περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων, μέσα στο θάλαμο σταθερών συνθηκών.

6 ΛΙΣΤΑ ΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ Γράφημα 1: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-pο 4 /4 και f/2- NΟ 3 /4. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Γράφημα 2: Οι συγκεντρώσεις Chl a σε mgr/l, που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Γράφημα 3: Οι συγκεντρώσεις νιτρικών (NO 3 σε μm) που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση ΝΟ 3, σε μμ. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Γράφημα 4: Οι συγκεντρώσεις νιτρωδών (NO 2 σε μm) που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση ΝΟ 2, σε μμ. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Γράφημα 5: Οι συγκεντρώσεις νιτρικών (ΝΟ 3 ) και νιτρωδών (ΝΟ 2 ) σε μμ, για τα πειράματα (α): f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, (β) f/2-po 4 /4 και (γ) f/2 - NO 3 /4, στο πέρας του χρόνου. Γράφημα 6 : Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής αναλύσεις για τη συγκέντρωση των Si0 2 σε μm, που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2- PO 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 7 : Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής αναλύσεις για τη συγκέντρωση των PO 4 σε μm, που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2- PO 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 8: Οι χαρακτηριστικές συγκεντρώσεις των PO 4 (μm) σε σχέση με τον κυτταρικό αριθμό (Cell N). Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας (παράγοντας) για τo πείραμα f/2 χωρίς κανένα περιορισμό. Γράφημα 9: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-pο 4 /8 και f/2- NΟ 3 /8. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. (Kruskal-Wallis Test = 12,7859 P<0,05). Γράφημα 10: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-po 4 /8, (επάνω) και αντίστοιχα f/2, f/2-νo 3 /4 και f/2-νo 3 /8 (κάτω). Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Γράφημα 11: Σύγκριση των θρεπτικών συνθηκών του πειράματος με f/2 (1) και f/2-metals/10 (7). Αριστερά παρουσιάζονται οι κατανομές του κυτταρικού αριθμού (Log Cell N) στο χρόνο. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. (Kruskal-Wallis Test = 151,226 με P=0,0). Δεξιά το Box and Whisker Plot που διεξήχθη από την στατιστική ανάλυση. Γράφημα 12: Ο λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος (Test statistic = 151,226 P-Value =0). Γράφημα 13: Ο κυτταρικός αριθμός και οι μέσοι όροι των διαφορετικών πειραμάτων περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων οριζόντια. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος απόκλισεων (Test statistic = 151,226 P-Value =0). Γράφημα 14 : Ο ρυθμός ανάπτυξης (Growth Rate) με μονάδες μέτρησης log κυτταρικός αριθμός ανά ημέρα, υπολογισμένος κατά την διάρκεια εκθετικής φάσης των πειραμάτων.

7 Γράφημα 15: Το LSD για τις συγκεντρώσεις Chl a των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 16: Τα αποτελέσματα των εργαστηριακών αναλύσεων για τις συγκέντρωσης Chl c που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 17: Το LSD για τις συγκεντρώσεις Chl c των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 18: Το LSD για τις συγκεντρώσεις NO 2 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 19: Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις NO 3 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 20: Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις SiO 2 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 21: Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις PO 4 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Γράφημα 22: Οι εκτιμήσεις του ρυθμού αύξησης όλων των πειραμάτων κατά την εκθετική φάση με εφαρμογή παλινδρόμησης ελαχίστων τετραγώνων. Γράφημα 23 : Ο χρόνος γενεάς ανά ημέρα, πειραμάτων. υπολογισμένος κατά την εκθετική φάση των όλων των Γράφημα 24 : Οι διαιρέσεις ανά ημέρα, υπολογισμένες κατά την εκθετική φάση των όλων των πειραμάτων. 7

8 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ΛΙΣΤΑ ΠΙΝΑΚΩΝ... 5 ΛΙΣΤΑ ΕΙΚΟΝΩΝ... 5 ΛΙΣΤΑ ΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΥΤΡΟΦΙΣΜΟΣ HARMFUL ALGAL BLOOM S (HABS) PSEUDO-NITZSCHIA ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΟΙ ΜΕ PSEUDO-NITZSCHIA PSEUDO-NITZSCHIA DELICATISSIMA (CLEVE) ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΕΔΙΟΥ ΜΕ PSEUDO-NITZSCHIA DELICATISSIMA ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ P. DELICATISSIMA TO ΜΕΣΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ F MEDIUM ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΙΧΝΟ-ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΡΥΘΜΟΥ ΑΥΞΗΣΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΕΚΤΑΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... ΣΦΑΛΜΑ! ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΟΡΙΣΤΕΙ ΣΕΛΙΔΟΔΕΙΚΤΗΣ. 8

9 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ευτροφισμός Ο ευτροφισμός, στον πιο γενικό του ορισμό, που ισχύει τόσο για τα εσωτερικά ύδατα όσο και για την θάλασσα, είναι η διεργασία εμπλουτισμού των υδάτων με θρεπτικά άλατα, που οδηγούν στην αύξηση της πρωτογενούς παραγωγής (Karydis, 1996). Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί αύξηση του παράκτιου ευτροφισμού σε παγκόσμιο επίπεδο. Η αύξηση του πληθυσμού και η οικονομική ανάπτυξη έχει προκαλέσει δραματικές αλλαγές στο τοπίο, αυξημένη απορροή θρεπτικών από τη χέρσο καθώς και μεγάλες εισροές λυμάτων στα παράκτια ύδατα (Glibert, 2008). Οι επιπτώσεις του ευτροφισμού συνήθως αρχίζουν με την παρατήρηση υψηλών συγκεντρώσεων Chl-a και/ή τον πολλαπλασιασμό μακροφυκών, αυξάνοντας την φυτική βιομάζα μέσα σε ένα οικοσύστημα (Bricker, 2008; Jorgensen, 1996). Αυτό μπορεί να επιφέρει διάδοση φαινομένων υποξίας όταν οι συγκεντρώσεις του οξυγόνου βρίσκονται σε επίπεδα χαμηλότερα του κορεσμού αέρα (εικόνα 1), ενώ σε εξαιρετικά ακραίες περιπτώσεις εμφανίζεται το φαινόμενο της ανοξίας. Αν και θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι ο πολιτισμικός ευτροφισμός δεν οφείλεται πάντα στην άνθιση φυτοπλαγκτού. Οι δευτερογενείς επιπτώσεις του ευτροφισμού περιλαμβάνουν μείωση του βάθους όπου φτάνει το φώς στη θαλάσσια στήλη τη διαδοχική μείωση της βενθικής κατανομής των βενθικών φυτών, και την τελική κυριαρχία συγκεκριμένων ειδών (Jorgensen, 1996). Εικόνα 1: (a) Οι συνολικές ευτροφικές συνθήκες, που σχετίζονται με τα ευτροφικά συμπτώματα και τους παράγοντες επιρροής (b) Οι παράγοντες επιρροής, ευτροφικών συμπτωμάτων και μελλοντικές βλέψεις (Bricker et al. 2008). Μια ακόμα δευτερογενής επίπτωση του ευτροφισμού μπορεί να είναι αυτή της άνθισης φυτοπλαγκτού blooms. Η άνθιση φυτοπλαγκτού έχει οριστεί ως η αλματώδης αύξηση και υψηλή συγκέντρωση βιομάζας ενός μοναδικού είδους φυτοπλαγκτού (Smayda, 1997). Είναι πλέον

10 κατανοητό ότι ο παράκτιος ευτροφισμός εμφανίζεται εξ αιτίας των εισροών αζώτου και φωσφόρου από αστικά γεωργικά και βιομηχανικά απόβλητα, προς στο θαλάσσιο περιβάλλον. Εξαιτίας αυτών των εισροών, η αφθονία των μικροφυκών μπορεί να αυξάνεται σημαντικά, ενώ τα μικροφύκη που φαίνεται να ευνοούνται περισσότερο σε αυτές τις συνθήκες φαίνεται να είναι τα επιβλαβή. Το γεγονός αυτό ενισχύει την εμφάνιση επιβλαβών ανθίσεων φυτοπλαγκτού και των πιέσεων που αυτά προκαλούν (Βαρκιζή, 2010; Glibert, 2008; Beman, 2005). Πιο συγκεκριμένα η παρούσα εργασία εστιάζει σε γεγονότα επιβλαβών ανθίσεων φυτοπλαγκτού γνωστά ως Harmful Algal Bloom s (HABs) τα οποία και αποτελούν μια ακόμα έκφραση του ευτροφισμού σύμφωνα με τους Bricker, 2008 και Howarth, Harmful Algal Bloom s (HABs) Με τον όρο επιβλαβή φύκη (Harmful algae) χαρακτηρίζεται μια μεγάλη ομάδα μικροφυκών και μακροφυκών, τα οποία υπό συγκεκριμένες συνθήκες μπορούν να γίνουν επιβλαβή για άλλους οργανισμούς ενός οικοσυστήματος (Granelli, 2006). Ενώ με τον όρο επιβλαβείς εξάρσεις /ή ανθίσεις φυκών, (Harmful Algal Blooms, HABs) γίνεται αναφορά σε φαινόμενα κατά τα οποία η αφθονία ή η τοξικότητα των επιβλαβών φυκών στο φυσικό περιβάλλον αυξάνεται τόσο ώστε να προκαλεί προβλήματα (Anderson, 2008). Η μαζική αύξηση των επιβλαβών φυκών διαταράσσει σε μεγάλη κλίμακα την οικολογική ισορροπία των παράκτιων οικοσυστημάτων και προκαλεί σοβαρά προβλήματα στην ανθρώπινη υγεία και στην οικονομία. Οι επιπτώσεις των HAB s είναι αισθητές στο παράκτιο οικοσύστημα, την ανθρώπινη υγεία και την οικονομία. Οι επιβλαβείς εξάρσεις μεταβάλλουν τα αβιοτικά και βιοτικά χαρακτηριστικά ενός παράκτιου οικοσυστήματος με συνέπεια την τροποποίηση της σύνθεσης και της αφθονίας των παράκτιων βιοκοινωνιών καθώς και της δυναμικής των παράκτιων τροφικών πλεγμάτων. Η Βαρκιζή (2010), στην διδακτορική της διατριβή αναφέρει επίσης ότι προκαλούν υποξικές και ανοξικές συνθήκες στην υδάτινη στήλη και τον πυθμένα, μειωμένη διείσδυση ηλιακής ακτινοβολίας, ανασταλτική επίδραση στην φυσιολογία και ανάπτυξη άλλων ειδών, (αλληλοπάθεια), μείωση θήρευσης παραγωγής αυγών εκκόλαψης και επιβίωσης του ζωοπλαγκτού, ενώ οι επηρεασμένες περιοχές και οι αλιευτικοί πόροι που έχουν υποστεί κρούση και οικονομικές ζημίες είναι πολλές. Άλλες επιδράσεις περισσότερο άμεσου ενδιαφέροντος για τον άνθρωπο, είναι η παραγωγή φυκοτοξινών κατά την διάρκεια τοξικών φυτοπλαγκτονικών ανθίσεων (blooms) που εισέρχονται στη τροφική αλυσίδα όπου μερικές φορές φθάνει στον άνθρωπο. Η συσσώρευση φυκοτοξινών στους ιστούς συχνά επιφέρει περιστατικά δηλητηριάσεων όπως: νευροτοξικές δηλητηρίασης οστρακοειδών, αμνησιακή δηλητηρίαση των μαλακίων, σιγκουατοξίνη δηλητηρίαση των ψαριών καθώς και διάφορα άλλα φαινόμενα όπως θάνατος ψαριών, απώλεια της υδρόβιας βλάστησης, θνησιμότητα οστράκων και ευρεία εξάπλωση θανάτου θαλάσσιων θηλαστικών (Anderson, 2008; Βαρκιζή, 2010). Όταν οι φυκοτοξίνες εισέλθουν στον ανθρώπινο οργανισμό, π.χ. μέσω ενός δίθυρου προκαλείται μια σειρά σοβαρότατων συμπτωμάτων όπως ναυτία, εμετός, συσπάσεις κοιλιακών μυών, διάρροια, αμνησία, αποπροσανατολισμός, διάλειψης, αναπνευστικά προβλήματα, κώμα ακόμα και θάνατος (Βαρκιζή, 2010). Ένας από τους σημαντικότερους λόγους που αξίζει να μελετώνται τα Harmful Algal και οι εξάρσεις τους, είναι οι επιπτώσεις που προκαλούν. Οι συνέπειες στην ανθρώπινη υγεία είναι σημαντικές όπως προλέχθηκε. Τα HAB εκτός από τη μεταφορά τοξινών μέσω της τροφικής αλυσίδας είναι ικανά να προκαλέσουν σημαντικές απώλειες σε υδατοκαλλιέργειες, τουρισμό και αλιεία, πλήττοντας τοπικές και διεθνείς οικονομίες (Klein, et al., 2010). 10

11 Η πρώτη γραπτή αναφορά HABs εμφανίζεται στη Βίβλο και τοποθετείται περίπου στο 1000 π.χ. όπου και αναφέρει ότι όλο το νερό του ποταμού έγινε αίμα. Και τα ψάρια που ήταν στο ποτάμι πέθαναν, και το ποτάμι εξέπεμπε δυσωδία, και οι Αιγύπτιοι δεν μπορούσαν να πιούν από το νερό του ποταμού (Έξοδος 7: 20-21). Από τότε μέχρι και σήμερα τα προβλήματα παρουσιάζουν αυξανόμενη πίεση με ενώ τα φαινόμενα εντάθηκαν το Από τότε μέχρι και ένταση. στις μέρες μας, σχεδόν κάθε παράκτιο κράτος έχει επηρεαστεί από επιβλαβείς εξάρσεις φυτοπλαγκτού. Παρόλα αυτά, η έρευνα για τα HABs πραγματοποιείται εδώ και 20 χρόνια στην Μεσόγειο αλλά και στον Ελληνικό θαλάσσιο χώρο, ενώ διάφοροι συγγραφείς έχουν διερευνήσει πιθανές διασυνδέσεις μεταξύ HABs και ευτροφισμού σε παγκόσμιο επίπεδο, όπως οι: Smayda, 1997; Anderson, 2008; Glibert, 2006 και Glibert, Η μεγάλη αύξηση του ευτροφισμού στα παράκτια οικοσυστήματα έχει αυξήσει τη συχνότητα, την έκταση και την διάρκεια των HABs. Αν και οι επηρεασμένες περιοχές και οι αλιευτικοί πόροι που έχουν υποστεί κρούση και οικονομικές ζημίες είναι πολλές ο ευτροφισμός θεωρείται ένας από τους κυριότερους πιθανούς μηχανισμούς πρόκλησης τους σε παγκόσμια κλίμακα. Ο μηχανισμός που συνδέει τον ευτροφισμό με την επέκταση των HAB s δεν είναι ακόμα σαφής (Βαρκιζή, 2010), ενώ η σχέση μεταξύ ανθρωπογενούς ευτροφισμού και άνθισης των HABs, δεν έχει πλήρως κατανοηθεί (Jorgensen, 1996) και αποτελεί αντικείμενο της σύγχρονης έρευνας. Η σύνδεση μεταξύ HABs και ευτροφισμού αξίζει να μελετηθεί μιας και προωθεί την κατανόηση σχετικά με την πολυπλοκότητα τους, με απώτερο σκοπό την επίλυση προβλημάτων και τη μείωση των επιπτώσεων τους. Ιστορικά, οι επιστήμονες βασίστηκαν στην απλοϊκή αντίληψη ότι όσο πιο πολλά θρεπτικά τόσο και υψηλότερη η βιομάζα. Το πλαίσιο αναφορών περιοριζόταν σε ανθίσεις οι οποίες ήταν γραμμικώς εξαρτημένες με τα θρεπτικά. Συγκεκριμένα αν δεν εμφανίζονταν υψηλή βιομάζα φυτοπλαγτού, το εκάστοτε HAB είδος κρινόταν ασυσχέτιστο με τα θρεπτικά συστατικά εμπλουτισμού. Μέσα στην περασμένη δεκαετία, η πρόβλεψη έχει προοδεύσει και υπάρχει μεγαλύτερη εκτίμηση για διαδραστικές επιρροές της σύνθεσης και της σχετικής αναλογίας διαθεσιμότητας θρεπτικών, το φάσμα των φυσιολογικών αντιδράσεων από διαφορετικά είδη φυτοπλαγκτού μα και λειτουργικές ομάδες, λαμβάνοντας υπόψη και αλληλεπιδράσεις άλλων δυναμικών παραγόντων όπως οι φυσικοί παράγοντες και η θήρευση για τον έλεγχο ευτροφισμού από HAB και άλλων φυτοπλαγκτικών πληθυσμών (Glibert, 2008). Είναι πλέον αναγνωρισμένο ότι τα HAB είδη μπορούν να διεγερθούν (άμεσα ή έμμεσα) από τον υπέρ-εμπλουτισμό των θρεπτικών, και ότι η χρόνια, ανεπαίσθητη επίδραση μπορεί να είναι περισσότερο ή εξίσου σημαντική από τις οξείες επιπτώσεις (Glibert, 2008). Τελικά είναι κοινή διαπίστωση ότι η εισαγωγή μεγάλης κλίμακας HABs κατά μήκος των ακτών, φαίνεται να σχετίζεται με ανθρωπογενή θρεπτικά συστατικά (Anderson, 2008). Παρόλα αυτά η καθιέρωση μίας άμεσης σχέσεις μεταξύ ευτροφισμού και HABs ήταν και είναι συχνά δύσκολη διότι δεν υποστηρίζουν όλα τα ευτροφικά ύδατα την παρουσία HABs, και επίσης δεν συμβαίνουν όλα τα HABs σε ύδατα πλούσια σε θρεπτικά συστατικά (Glibert, 2008). Η σχέση των HAB με τον ευτροφισμό είναι πολύπλοκη, και αποτελεί κινητήριο έναυσμα για περαιτέρω μελέτη με σκοπό την κατανόηση της φύσης και των λειτουργιών της. 11

12 1.3 Pseudo-nitzschia Το επιβλαβές φυτοπλαγκτόν αποτελείται κυρίως από μικροφύκη, τα οποία περιλαμβάνουν περίπου 300 είδη, που εξαπλώνονται σε θαλάσσια και γλυκά ύδατα κυρίως με πλαγκτικούς αλλά και βενθικούς αντιπροσώπους. Από αυτά ~40 παράγουν τοξίνες. Ενώ είδη τις οικογένειας Pseudonitzschia είναι ικανά να προκαλέσουν περιστατικά επιβλαβών φυτοπλαγκτικών ανθίσεων (HABs) (Granelli, 2006). Η μελέτη του γένους αυτού απασχολεί τους ερευνητές εξαιτίας της ικανότητάς τους να παράγουν την νευροτοξίνη του δομοϊκού οξέος (Domoic Acid- DA) ενώ μέχρι σήμερα έχουν παρατηρηθεί δεκατρία με δεκατέσσερα αποκλειστικά θαλάσσια είδη τα οποία συνθέτουν δομοϊκό οξύ και ανήκουν στα γένη Pseudo-nitzschia, Amphora και Nitzschia εκ των οποίων περίπου δώδεκα ανήκουν στo γένος Pseudo-nitzschia (Βαρκιζή, 2010). Η ουσιαστική έρευνα του γένους ξεκινά το 1987 στον Καναδά όταν το διάτομο Pseudo-nitzschia multiseries προκάλεσε τρείς θανάτους και τη νοσηλεία πολλών ανθρώπων πλήττοντας σημαντικά την τοπική βιομηχανία οστρεοκαλλιεργειών. Η δραστική ουσία που εντοπίστηκε τότε στους ιστούς του Mytilus edulis ήταν το δομοικό οξύ (Bates, 1989). Γενικεύοντας μπορεί να ειπωθεί ότι το γένος αυτό παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον τόσο για την μελέτη της οικολογίας των παράκτιων οικοσυστημάτων όσο και για θέματα δημόσιας υγείας και οικονομίας. Μετά το περιστατικό στον Καναδά, και άλλα είδη Pseudo-nitzschia, έχουν γίνει γνωστά, λόγω της παραγωγής του DA. Τα είδη που απαρτίζουν το γένος και μέχρι τώρα έχουν αναγνωριστεί είναι τα P. arenysensis P. americana, Ρ. australis, P. brasiliana, P. cuspidate, Ρ. calliantha, P. delicatissima, P. fossilis P. fraudulenta, Ρ.granii, Ρ. heimii, P. mannii, P. inflatula, P. linea, P. lineola, P. pungens, P. multiseries, Ρ.multistriata, P. prolongatoides, P. pseudodelicatissima, P.pungens, P. pungiformis, P. seriata, P. subcurvata, P. subfraudulenta, P. subpacifica, P. turgidula και P. turgiduloides * 1. Αν και κατά την Granelli et al. (2006) θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι υπάρχουν στελέχη που η παραγωγή DA δεν είναι σε ανιχνεύσιμα επίπεδα, ενώ άλλα εμφανίζονται τοξικά υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Τα τοξικά είδη Pseudo-nitzschia φαίνεται να εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα χωρικής κατανομής, τα οποία εξαρτώνται από φυσικούς, χημικούς και βιολογικούς παράγοντες. Οι έρευνες στο πεδίο έχουν δείξει ότι τα είδη Pseudo-nitzschia απαντώνται κατά μήκος συγκεκριμένων περιοχών και εποχών (Granelli, 2006). Αρκετά από τα είδη έχουν χαρακτηριστεί ως κοσμοπολίτικα με καταγραφές από υποπολικά ως και τροπικά ύδατα (πίνακας 1), ενώ είναι αρκετά διαδεδομένο στη λεκάνη της Μεσογείου (Orsini, 2002) και είναι σχεδόν πάντα παρόν σε συναθροίσεις φυτοπλαγκτού κατά μήκος των ιταλικών ακτών, με πυκνότητα κυττάρων έως 10 7 κύτταρα L -1. Αξιοσημείωτο είναι ότι στις παράκτιες περιοχές του Β. Ιονίου είδη Pseudonitzschia είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη μίας χειμερινής έξαρσης, που έχει εκτιμηθεί ότι αντιπροσωπεύει έως και 68% της συνάθροισης του φυτοπλαγκτού (Caroppo, 2005). Ενώ γενικά στην Ελλάδα σποραδική έχει χαρακτηριστεί η εμφάνιση τοξικών ειδών, με αναφορές που περιλαμβάνουν δυνητικά τοξικά στελέχη, να έχουν ανευρεθεί σε ελληνικές παράκτιες περιοχές, όπως στο Θερμαϊκό κόλπο και στον κόλπο της Καλλονής. Επίσης έχουν ανευρεθεί τοξίνες διατόμων σε εμπορικά δίθυρα στον Θερμαϊκό κόλπο, στη Λέσβο και τη Φωκίδα (Spatharis, 2007; Βαρκιζή, 2010; Moschandreou, 2010). Τα είδη που έχουν καταγραφεί σε περιοχές παραγωγικής καλλιέργειας και συγκομιδής μαλακίων είναι τα: P. delicatissima, P. fraudulenta, P. galaxiae, P. mannii, P. multistriata, P. pseudodelicatissima, P. pungens, P. subfraudulenta, P. calliantha και το P. multiseries (Moschandreou, 2010). Αρκετές φορές οι εξάρσεις τοξικών ειδών του γένους Pseudo-nitzschia εντοπίστηκαν σε παράκτιες περιοχές με αναβλύσεις. Σε αυτές τις περιοχές, οι συνθήκες είναι ευνοϊκές για την εξάπλωση των 1 * Με έντονη γραφή εμφανίζονται τα είδη που έχουν χαρακτηριστεί ως δυνητικώς τοξικά.

13 διατόμων καθώς επικρατούν υψηλές συνθήκες θρεπτικών και ισχυρά ρεύματα που διατηρούν τα διάτομα εν αιώρηση (Granelli, 2006; Loureiro, 2009). Πίνακας 1: Τοξικά είδη Pseudo- nitzschia, η δράση τους καθώς και οι περιοχές όπου τα είδη αυτά έχουν προκαλέσει προβληματικά περιστατικά, σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές αναφορές. Είδος Επιπτώσεις Περιοχές περιστατικών Αναφορά Ρ. australis Συσσώρευση DA: δίθυρα, ψάρια, φάλαινες Ισπανία, Πορτογαλία, Καναδά Ιρλανδία, Ζηλανδία Λος Άντζελας, California P. calliantha Συσσώρευση φυκοτοξίνης σε δίθυρα Μαύρη Θάλασσα Δανία, Καναδά Blanko et al., 2006 Holland, 2005 Schnetzer, 2007 Lundholm, 2005 P. cuspidata >> Δ. Ακτή ΗΠΑ Bill et al., 2005 P. fraudulenta >> Νέα Ζηλανδία Rhodes et al., 2006 P. galaxiae >> -- Cerino, 2005 Sarno et al., 2000 P. multiseries >> κωπήποδα Γαλλία Δ. ακτή ΗΠΑ Amzil et al., 2001 Rhodes et al., 2006 συμπεριφορά φυσιολογία δίθυρων Κόλπος Μεξικού Καναδάς Ιαπωνία Νέα Ζηλανδία P. multistriata -- Ιταλία Orsini et al P. pseudodelicatissima Συσσώρευση φυκοτοξίνης Δίθυρα Κόλπος Μεξικού HΠΑ Καναδά Person et al., 1999 Pan et al., et al. 1996a Bates et al., 1989 P. pungens >> Δ. Ακτή ΗΠΑ Νέα Ζηλανδία Trainer et al., 2007 Rhodes et al., 2000 P. seriata >> Δανία Σκωτία Καναδά Lundholm, 2005 Fehling et al., 2004 P. turgitula >> Νέα Ζηλανδία Rhodes et al., 2000 Ο ακριβής μηχανισμός που οδηγεί τα Pseudo-nitzschia σε ανθίσεις είναι αβέβαιος και μπορεί να προκληθεί από διάφορους λόγους. Προκειμένου να καθοριστούν οι περιβαλλοντικοί παράγοντες (triggering factors) οι οποίοι οδηγούν σε ανθίσεις των ειδών Pseudo-nitzschia στα παράκτια οικοσυστήματα είναι απαραίτητη η συχνή παρακολούθηση (monitoring) παράλληλα με τη διεξαγωγή ελεγχόμενων εργαστηριακών πειραμάτων. 1.4 Πειραματισμοί με Pseudo-nitzschia Ως αποτέλεσμα των περιστατικών επιβλαβών εξάρσεων, πλήθος εργαστηριακών ερευνών έχει πραγματοποιηθεί στα είδη Pseudo-nitzschia. Πολλά από αυτά που γνωρίζουμε όσον αφορά τη φυσιολογία του φυτοπλαγκτού προέρχεται από πειράματα χρησιμοποιώντας εργαστηριακές καλλιέργειες. Στις καλλιέργειες αυτές γίνεται χρήση απομονωμένων στελεχών (strains) συγκεκριμένων ειδών Pseudo-nitzschia και οι πειραματισμοί περιλαμβάνουν τον έλεγχο συγκεκριμένων παραμέτρων στην αύξηση του είδους, διατηρώντας όλες τις υπόλοιπες συνθήκες σταθερές. Αρκετές μελέτες έχουν επισημάνει τη σημασία μίας πληθώρας παραμέτρων καθοριστικών για την αύξηση και την κατανομή των ειδών Pseudo-nitzschia, (Kaczmarska et al. 2008; Schnetzer et al. 2007; Almandoz et al. 2008). Η φωτοπερίοδος (Fehling et al. 2005), η αλατότητα (Thessen et al. 13

14 2005), το ph είναι ορισμένοι από τους παράγοντες. Ενώ οι συγκεντρώσεις των θρεπτικών αλάτων (Bates et al. 1993; Caroppo et al. 2005; Spatharis et al. 2007b; Loureiro et al. 2009) έχουν βρεθεί ως οι σημαντικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την αύξηση των ειδών, οι οποίοι πιθανότατα συμβάλουν καθοριστικά στην αύξηση και τις φυτοπλαγκονικές εξάρσεις. Ενώ έχει αποδειχθεί πως οι ανθίσεις των ειδών Pseudo-nitzschia μπορούν να πυροδοτηθούν με τα θρεπτικά μέσω δύο πηγών: περιστατικά upwelling ή διεργασιών ανάμιξης καθώς και μέσω ποτάμιων εισροών. Και οι δύο πηγές είναι ικανές να πυροδοτήσουν bloom Pseudo-nitzschia σε συγκεντρώσεις 8-22 μm NO 3, μm Si, μm PO 4 (Dortch et al. 1997; Scholin et al. 2000; Trainer et al. 2000; Loureiro et al. 2005), αλλά σε διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας και αλατότητας. Οι περισσότερες μελέτες που έχουν γίνει σε καλλιέργειες Pseudo-nitzschia έχουν επικεντρωθεί στο είδος P. multiseries, (Εικ.2) ενώ αρκετές είναι οι αναφορές στο P. seriata, P. australis και P. pugens. Εικόνα 2: Απεικόνιση των πιο μελετημένων ειδών της οικογένειας. Αριστερά το P. australis (5 mm) με εμφανή την καφέ απόχρωση των χλωροπλαστών και δεξιά το P. multiseries (20μm και 2 μm). (Φωτογραφίες των Holtermann, K., και Miler, P., US SC). Η διάρκεια της διαθεσιμότητας του φωτός είναι ένας από τους κύριους παράγοντες της αύξησης των Pseudo-nitzschia, ικανός να επιδράσει στον ανταγωνισμό (Fehling et al. 2005). Ωστόσο, ο χαμηλός φωτισμός μπορεί να υποβαθμίσει τις φθινοπωρινές ανθίσεις (Bates et al. 1989). Το μήκος της ημέρας είναι ικανό να επηρεάσει τον ρυθμό αύξησης, την κυτταρική απόδοση, την παραγωγή τοξινών και επιδρά στο ποια είδη Pseudo-nitzschia τελικά κυριαρχούν (Fehling et al. 2005). Όσον αφορά την επίδραση της αλατότητας έχει αποδειχθεί ότι τα είδη Pseudo-nitzschia είναι ευρύαλα, και ικανά να αναπτύσσονται σε καλλιέργειες με 6-45 PSU ενώ στο πεδίο έχουν παρατηρηθεί από 1 έως ~ 35 PSU, αν και κάθε είδος εμφανίζει διαφορετικές προτιμήσεις αλατότητας (Thessen et al. 2005). Επίσης έχει βρεθεί ότι το υψηλό ph είναι αποτέλεσμα πυκνής άνθισης, όμως μπορεί να οδηγήσει και σε μείωση του bloom. Εργαστηριακές καλλιέργειες σε 11 είδη Pseudo-nitzschia δεν μπορούσαν να παρατείνουν την εκθετική ανάπτυξή τους όταν το ph κυμαίνονταν από 8.7 ώς 9.3. Ωστόσο, για το P. delicatissima το όριο του ph ήταν 9.3 (Lundholm et al. 2004). Άλλες έρευνες έχουν εστιάσει στην αλληλεπίδραση που υπάρχει με άλλους οργανισμούς και έχουν καταλήξει ότι οι παρασιτικοί μύκητες και ιοί μπορεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη δυναμική άνθιση των Pseudonitzschia (Granelli, 2006). Τέλος αξίζει να σημειωθεί ότι ίδια είδη μπορούν να αντιδράσουν διαφορετικά στους περιβαλλοντικούς παραμέτρους (Caroppo et al. 2005; Lundholm et al. 2004; Klein et al. 2010). 14

15 Αρκετές είναι οι εργασίες που μελετούν σταθερές κινητικής των θρεπτικών συστατικών με βασικότερες από αυτές του Tilman (1976) ενώ έχει περιγραφεί η δυνατότητα πρόσληψης οργανικού και ανόργανου Ν από το P. australis, αποδεικνύοντας τη δυναμική σημασία του οργανικού Ν ως υπόστρωμα που ευνοεί την αύξηση των τοξινογόνων διατόμων σε συνθήκες ευτροφισμού (Cochlan et al., 2008) ενώ είναι πλέον αποδεκτό ότι ο εμπλουτισμός θρεπτικών συστατικών είναι ένας κύριος παράγοντας που επιδρά στην κυτταρική τοξικότητα (Pan et al. 1996a; 1996b; 1996c; Bates et al. 1989) αλλά και το ρυθμό αύξησης (Leynaert et al. 2004). Αν και αξίζει να αναφερθεί ότι μελετώντας διαφορές στην ανάπτυξη σε είδη Pseudo-nitzschia, υπό διαφορετικές πηγές αζώτου (NH 4 +, NO 3 και ουρίας) και υπολογίζοντας τον ρυθμό αύξησης εξήχθη το συμπέρασμα ότι πολλά από τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά διαφέρουν ανάμεσα στα στελέχη των ίδιων ειδών, με διαφορετικό ρυθμό αύξησης σε κάθε πηγή αζώτου (Thessen et al. 2009). Όσον αφορά τα μεταλλικά ιχνοστοιχεία υπάρχουν μελέτες που έχουν εστιάσει στον περιορισμό σιδήρου και χαλκού στην αύξηση των P. multiseries και του P. australis, όπου με χρήση κλειστών συστημάτων καλλιέργειας εκτίμησαν, μεταξύ άλλων και το ρυθμό αύξησης των ειδών. Φανερώνοντας ότι οι ρυθμοί αύξησης διέφεραν σημαντικά, όταν τα είδη καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες επάρκειας και περιορισμού, Fe και Cu. Η έρευνα αυτή προτείνει ότι οι αλλαγές στις εισροές Fe που σχετίζονται με τις εκροές και την επαναιώρηση ιζημάτων, μπορεί να είναι οι κυρίαρχοι παράγοντες που ελέγχουν την τοξικότητα μίας φυτοπλαγκτονικής άνθισης. Επειδή ο Fe είναι απαραίτητος για την πρόσληψη θρεπτικών και την αφομοίωση, τα τοξικά είδη Pseudo-nitzschia θα πρέπει να έχουν χαμηλές απαιτήσεις σε Fe αν αυξάνουν κυρίως σε αμμωνιακά (Maldonado et al. 2002). Τέλος, οι περισσότερες εργαστηριακές μελέτες για αυτήν την οικογένεια διατόμων, έχουν εστιάσει στην επίδραση των περιβαλλοντικών παραμέτρων σε σχέση στην παραγόμενη συγκέντρωση DA και την τοξικότητα των ειδών. Τα επίπεδα Si(OH) 4 και PO 4, αυξάνουν τα επίπεδα DA ορισμένες φορές (Fehling et al. 2004) ενώ τα επίπεδα NO 3 φαίνεται να το μειώνουν (Bates et al., 1991). Σε άλλες μελέτες καλλιέργειας, έχει περιγραφεί ότι τα επίπεδα Fe και Cu, μα και συγκεντρώσεις με υψηλό Cu, προξενούν παραγωγή DA σε ορισμένα είδη (Maldonado, 2002). Τα πειράματα που ως στόχο έχουν την εύρεση της επίδρασης των θρεπτικών συστατικών αλλά και των μετάλλων στη αύξηση των ειδών Pseudo-nitzschia είναι καθοριστικής σημασίας για την κατανόηση της δυναμικής συμπεριφοράς. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών έχουν φανεί χρήσιμα κατά το παρελθόν στη διαχείριση των ανθρωπογενών εισροών στα παράκτια και ωκεάνια οικοσυστήματα. Παρόλη την σπουδαιότητα των συγκεκριμένων πειραμάτων, η επιστήμη αλλά και οι διαχειριστικοί φορείς έχουν ακόμη έλλειψη αποτελεσμάτων για τα Pseudo-nitzschia και ειδικότερα για το είδος P. delicatissima. 1.5 Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve) Η παρούσα διπλωματική εργασία επικεντρώνει το ενδιαφέρον της στο δυνητικά τοξικό είδος Pseudo-nitzschia delicatissima το οποίο είναι ένα πολύ καλά μελετημένο είδος τόσο στο πεδίο μα και στο εργαστήριο εξαιτίας της ευκολίας που παρουσιάζει στην καλλιέργεια του και λόγω της κοσμοπολίτικης εμφάνισης του. Το συγκεκριμένο είδος έχει τοξικά στελέχη τα οποία έχουν πλήξει τοπικές οικονομίες. Αφενός λοιπόν το επιστημονικό ενδιαφέρον είναι μεγάλο αφετέρου δεν υπάρχει πληθώρα δεδομένων για την επίδραση του περιορισμού θρεπτικών και μεταλλικών ιχνοστοιχείων στην αύξηση του είδους, σύμφωνα με την βιβλιογραφική ανασκόπηση που έγινε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. 15

16 Το είδος P. delicatissima είναι ένα πτεροειδές διάτομο και τα κύτταρά του σχηματίζουν αλυσίδες, με λογχοειδές σχήμα (εικόνα 3) και από-στρογγυλεμένα άκρα (Caroppo, et al., 2005). Το πλάτος των κυττάρων κυμαίνεται από 1.2 μm έως 2.3 μm, με μέσο πλάτος 1.8± 0.2 SD μm (Βαρκιζή, 2010). Το μήκος των κυττάρων κυμαίνεται από 15.2 μm έως 22.8μm, με μέσο μήκος 19.3 ±1.8 SD μm (Kaczmarska et al. 2008). Εικόνα 3: Απεικόνιση των αλυσίδων που σχηματίζει το είδος Pseudo nitzschia delicatissima (40x)- Οι αλυσίδες του εμφανίζουν στενά κελιά περίπου 0,6 έως 1,8 μm, και εύρους mm ενώ έχει μια επικάλυψη με περικομμένες και στρογγυλεμένες κορυφές, χαρακτηριστικό γνώρισμα των P. delicatissima (εικ.4α). Επιπλέον, εμφανίζει δύο σειρές με τριγωνικούς ως και εξαγωνικούς πόρους (8-9/1mm) με χαρακτηριστικό λεπτό μεμβρανώδη υμένα (εικ. 4β) που εμφανίζεται σε κάθε ράβδωση. Οι χλωροπλάστες του εμφανίζονται ως κίτρινες οπές μέσα στα κύτταρα. (Βαρκιζή, 2010). Ο πυρήνας βρίσκεται στο κέντρο του κυττάρου και καταλαμβάνει περίπου τα τρία τέταρτα του πλάτους του. Περιβάλλεται από ένα στρώμα κυτταροπλάσματος, το οποίο γίνεται πολύ πυκνό κοντά στον πυρήνα. Μέσα από τον πυρήνα ένα μικρότερο όργανο (ο πυρηνίσκος) μπορεί μερικές φορές να φαίνεται, και είναι χρήσιμο στην παραγωγή πρωτεϊνών. Εικόνα 4: Το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima: φωτογραφίες μικροδομής από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΤΕΜ), σε μεγέθυνση 100x (Caroppo, 2005) 16

17 1.5.1 Μελέτες πεδίου με Pseudo-nitzschia delicatissima Το Pseudo-nitzschia delicatissima είναι ένα αποκλειστικά θαλάσσιο είδος, το οποίο εξαπλώνεται κυρίως σε εύκρατα γεωγραφικά πλάτη (Βαρκιζή, 2010). Στελέχη του είδους αναφέρονται σε πολλές παράκτιες περιοχές του Ατλαντικού και Ειρηνικού ωκεανού, καθώς και της Μεσογείου. Ορισμένα στελέχη του είδους P. delicatissima έχουν αναφερθεί ως τοξικά και σύμφωνα με τον Smith (1991) το είδος αυτό είναι ικανό να παράγει DA, αν και υπάρχουν και μη τοξικά στελέχη. Ωστόσο μέχρι σήμερα, έχει επιβεβαιωθεί η τοξικότητά κάποιων στελεχών του από την Σκωτία τη Νορβηγία, τη δυτική ακτή των ΗΠΑ, την Ανατολική ακτή του Καναδά και την Νέα Ζηλανδία (Fehling et al. 2004). Ενώ η παρουσία του έχει συσχετιστεί με τον παράκτιο ευτροφισμό, χαρακτηριστικό είναι ότι οι συγκεντρώσεις νιτρικών και νιτρωδών παίζουν ένα σημαντικότατο ρόλο στη αφθονία του P. delicatissima στο κόλπο του Fundy, Canada (Kaczmarska et al., 2007). Πίνακας 2: Περιοχές που το είδος Pseudo- nitzschia delicatissima προκάλεσε περιστατικά επιβλαβών ανθίσεων (HABs) Περιοχές Περιστατικών Αναφορά Καταλανική ακτή McDonald et al., 2007 La Rαpita, Ebro s delta Μεξικό Κόλποι Αlfans & Faug Κόλπος Naples, Mare Chiara Quijano-Schecggia et al., 2008 Hasle, 2002 Καναδάς Kaczmarska et al., 2007 Νέα Ζηλανδία Trainer et al., 2007 Κόλπος Νεάπολης Νότια Αδριατική Γαλλία Μεσόγειος Carropo et al., 2005 Νότια ακτή Ιταλίας Αδριατική Cerino et al., 2005 Σκωτία, Νορβηγία, Καναδά, Νέα Ζηλανδία Fehling et al., 2010 Baie des Veys (Γαλλία) Klein et al., 2010 Τυρρηνικό πέλαγος Orsini et al., 2002 Αρκετές είναι οι μελέτες που έχουν γίνει στο πεδίο και έχουν συμβάλει τόσο στη χωρική (Fehling et al., 2004; Kaczmarska et al., 2007) αλλά και στη χρονική κατανομή του είδους (Quijano-Scheggia, 2008). Η εμφάνιση και η δυναμική πληθυσμού του P. delicatissima έχει εμφανιστεί χρονικά εξαρτημένη και ανεξάρτητη από τους κύριες περιβαλλοντικές συνθήκες στην Ιταλία. Αν και γενικότερα στη Μεσόγειο έχει πιο εκτεταμένη χωροχρονική κατανομή, με την αφθονία του να παρουσιάζει έντονες διακυμάνσεις και ετήσια μεταβλητότητα που εξαρτάται από την χώροχρονική κλίμακα και τα χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούν τα ενδογενή είδη (Caroppo et al. 2005). Οι μηχανισμοί που ευνοούν την αύξησή του στη Μεσόγειο είναι οι συνθήκες πολύ υψηλών συγκεντρώσεων των θρεπτικών το χειμώνα, με σταθερή Chl a κάτω του 0,34 mg m -3, με μέση πυκνότητα του φυτοπλαγκτού κάτω του 1,0*10 5 κύτταρα L -1 (Caroppo, 2005). Στο Baie des Veys (Γαλλία) αναγνωρίστηκε το P. delicatissima, ενώ η άνθισή του συσχετίστηκε με τους φυσικούς, χημικούς και βιολογικούς παράγοντες. Το είδος παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια ολόκληρου του 17

18 χρόνου, με την υψηλότερη τιμή αφθονίας (38*10 3 cell L -1 ) και ποικιλότητας κατά το μήνα Σεπτέμβριο ενώ η χαμηλότερη (0.9*10 3 cell L -1 ) παρατηρήθηκε από τον Οκτώβριο έως και τα τέλη του Φεβρουαρίου (Klein, 2010). Ενώ εμφανίστηκε περισσότερο άφθονο σε υψηλές συγκεντρώσεις NO 3 και χαμηλές Si(OH) 4 και συσχετίστηκε με χαμηλές τιμές χλωροφύλλης (Klein et al. 2010). Στη Βορειοδυτική Μεσογείο, κατά την διάρκεια περιστατικών άνθισης του είδους, προσδιορίστηκαν δύο ομάδες, η πρώτη ομάδα χαρακτηρίστηκε από την υψηλή συγκέντρωση νιτρικών και χαμηλή συγκέντρωση αμμωνίας, συνθήκες που δραν συνεργατικά με υψηλή αφθονία του P. delicatissima. Η δεύτερη ομάδα εξέφρασε τα αντίθετα χαρακτηριστικά (Quijano-Scheggia et al. 2008). Τελικά οι κυρίαρχες περιβαλλοντικές συνθήκες που δρουν στην αύξηση του πληθυσμού είναι η χαμηλή θερμοκρασία, η υψηλή αλατότητα και θρεπτικά επίπεδα που είναι χαρακτηριστικά της χειμερινής περιόδου. Πίνακας 3: Χαρακτηριστικές συγκεντρώσεις των τιμών θρεπτικών αλάτων, κυτταρικής πυκνότητας και Chl a, από μελέτες πεδίου σε διάφορες περιοχές της Μεσογείου όπου έχουν καταγραφεί περιστατικά ανθίσεων του είδους Pseudo-nitzschia delicatissima. Περιοχή ΝΟ 3 mmol L -1 NH 4 mmol L -1 Si μm PO 4 mmoll -1 Πυκνότητα Chl-a Αναφορά cell L -1 N. Ιταλία 0,4-148*10 3 0,34 mg m -3 Caroppo et al Baie des Veys, Γαλλία * ,9 mg L -1 Klein et al., 2010 Τυρρηνικό ~10 7 Orsini et al., 2002 Alfacs Bay 8.91± ± ± ± * ±2.1 μg L -1 Quijano- Scheggia et al., 2008 Fangar Bay 1.67 ± ± ± ± ±2.8 μg << Οι μελέτες πεδίου που διασαφηνίζουν τις απαιτήσεις σε θρεπτικά αλλά και τις φυσικές απαιτήσεις, καθώς και τις βιοτικές αλληλεπιδράσεις των ειδών Pseudo-nitzschia, τόσο σε τοπική όσο και σε παγκόσμια κλίμακα και είναι ουσιαστικής σημασίας για την πρόβλεψη και την πρόληψη της μαζικής εμφάνισης στα παράκτια οικοσυστήματα Πειράματα εργαστηρίου με Pseudo-nitzschia delicatissima Η γνώση της επίδρασης των βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων είναι απαραίτητη στην κατανόηση και στην καλύτερη πρόβλεψη των παραγόντων που οδηγούν στην δημιουργία ανθίσεων αλλά και της τοξικότητας των ανθίσεων αυτών. Για το λόγο αυτό η επιστημονική κοινότητα έχει προχωρήσει σε πειραματικές διαδικασίες που προωθούν τη γνώση γύρω από το συγκεκριμένο είδος. Τα περισσότερα πειράματα στο P. delicatissima έχουν εστιάσει στο δομοικό οξύ, οι Quijana- Scheggia et al., (2010) ανέλυσαν τις παραγόμενες τοξίνες του είδους και η Βαρκιζή (2010) στη διδακτορική της διατριβή εξέτασε διάφορα χαρακτηριστικά του DA σε ιστούς δίθυρων κατά την επώαση με καλλιέργειες ενός στελέχους του Pseudo-nitzschia delicatissima. Ενώ η φωτοπερίοδος (Fehling et al. 2005), η επιρροή του οργανικού υλικού στην εξέλιξη του είδους (Loureiro et al. 2009) και οι περιβαλλοντικοί παράμετροι (Hinga, 2002; Lundholm et al.,2004; Quijano-Scheggia et al. 2009; Caroppo et al., 2005) έχουν αποτελέσει το επίκεντρο της μέχρι τώρα πειραματική έρευνας. Η φωτοπερίοδος είναι ένας σημαντικός συντελεστής που επηρεάζει τη σύνθεση των ειδών, το χρόνο, την πυκνότητα και την τοξικότητα μίας άνθισης. Με χρήση κλειστών συστημάτων 18

19 καλλιέργειες αποδείχθηκε ότι το είδος μπορεί να αναπτυχθεί απουσία νυχτερινής φάσης αν και η ευρύτερη περιοχή κυτταρικής πυκνότητας που έχει επιτευχθεί ήταν με φωτοπεριόδο 9h φως και 15h σκοτάδι ( ), ενώ η μικρότερη πυκνότητα σε 18h φως - 6h σκοτάδι ( ), εμφανίζοντας 0,49 και αντίστοιχα 0,89 κυτταρικές διαιρέσεις ανά ημέρα. Έχει παρατηρηθεί μία αξιοπρόσεκτη εξιδανίκευση είδους, με άμεση επιρροή στην διάρκεια του φωτός, τόσο στα κύτταρα τόσο και στην βιομάζα (Fehling et al. 2005). Η επιρροή του διαλυμένου οργανικού υλικού στην εξέλιξη του P. delicatissima έχει ερευνηθεί σε πειράματα εμπλουτισμού με χρήση του θρεπτικού μέσου L1. Με την δημιουργία διαφορετικών θρεπτικές συνθηκών που αφορούσαν περιορισμό και επάρκεια νιτρικών, απουσία νιτρικών, καθώς και περιορισμό και επάρκεια διαλυμένου σωματιδιακού υλικού βρέθηκε ότι ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν ίδιος παντού ίδιος, με 1.64 ± 0.05 divisions day 1. Αν και έχει φανεί ότι το άζωτο χρειάζεται για την ανάπτυξη των κύτταρων και πιθανόν η κυτταρική αύξηση γίνεται εξαιτίας του DOM. Επίσης το P. delicatissima προσλαμβάνει ευκολότερα αμμωνία παρά ουρία, ενώ υπό χαμηλές συνθήκες Ν, το P. delicatissima μπορεί να χρησιμοποιήσει την ουρία σαν εναλλακτική πυγή αζώτου. Γενότερα υπάρχει μία θετική επίπτωση των οργανικών θρεπτικών στην ανάπτυξη του P. delicatissima (Loureiro 2009). Όσον αφορά την δυναμική του P. delicatissima έχει εμφανιστεί να έχει χαμηλή συσχέτιση με τους περιβαλλοντικούς παράγοντες γεγονός που έχει στηριχτεί στην υπόθεση ότι μία δυνατή ενδογενής ρύθμιση μπορεί να δρα στον έλεγχο της κατανομής του στη χωροχρονική κλίμακα (Caroppo et al., 2005). Οι μορφολογικές και φυλογενετικές μελέτες συγκρίσεις διαφορετικών γενεών από διαφορετικά μέρη του κόσμου έχουν δείξει ότι η P. delicatissima είναι ένα είδος με πολύπλοκο περιεχόμενο, με τουλάχιστον δύο διαφορετικούς γενοτύπους, όπου και οι δύο εμφανίζονται κοσμοπολίτικοι, με κοινού εμφάνιση στη Μεσόγειο θάλασσα. Έχει υποτεθεί ότι οι γενότυποι πιθανόν να διαχωρίζονται εξ αιτίας αναπαραγωγικών φραγμών που σχετίζονται με σεξουαλισμό και που λαμβάνει χώρα σε διαφορετικές θερμοκρασίες και εποχές. Οι διαφορές στη δυνατότητα ανάπτυξης των καλλιεργειών που έχουν παρατηρηθεί σε σχέση με το κυτταρικό μέγεθος και το φυσιολογικό επίπεδο έδειξαν μια μη γραμμική σχέση μεταξύ του κυτταρικού μεγέθους και της αύξησης, και πιθανόναυ το να συνδέεται με την εμφάνιση ση αλλά και στην δυναμική του φυτοπλαγκτού (Quijano-Scheggia et al. 2009). Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν πολλές μελέτες που αφορούν στην παραγωγή τοξίνης σε σχέση με τον περιορισμό θρεπτικών, αντιθέτως πολύ λίγες μελέτες έχουν αποτιμήσει το ρυθμό αύξησης ειδών Pseudo-nitzschia spp. σε διαφορετικές συγκεντρώσεις θρεπτικών, μετάλλων ή και βιταμινών. Συγκεκριμένα, όσον αφορά στο Pseudo-nitzschia delicatissima, πέρα από την εργασία της Loureiro (2001) που εστιάζει στη καλλιέργεια του είδους σε οργανικά θρεπτικά, καμιά άλλη εργασία δεν έχει υπάρξει που να εξετάζει την επίδραση του είδους στον περιορισμό θρεπτικών και ιχνοστοιχείων. 19

20 1.9 Στόχοι της διατριβής Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στο δυνητικά τοξικό είδος Pseudo-nitzschia delicatissima. Μέχρι σήμερα ελάχιστες είναι οι εργασίες που έχουν εξετάσει εργαστηριακά την απόκριση του ρυθμού αύξησης του συγκεκριμένου είδους. Ο βασικός στόχος της διατριβής ήταν η διερεύνηση των επιπτώσεων που έχει ο περιορισμός ορισμένων βασικών θρεπτικών αλάτων, όπως είναι το Άζωτο (Ν) και ο Φωσφόρος (Ρ), στη αύξηση του είδους. Επιπλέον έγινε προσπάθεια μέσω του πειραματικού σχεδιασμού να εκτιμηθεί ο ρυθμός αύξησης του Pseudo-nitzschia delicatissima υπό συγκεκριμένες συγκεντρώσεις μεταλλικών ιχνοστοιχείων Χαλκού (Cu), Σιδήρου (Fe), Μολυβδαινίου (Mo), Κοβαλτίου (Co), Mαγγανίου (Mn) και Ψευδαργύρου (Zn). Τα αποτελέσματα της διατριβής επιτρέπουν τον εντοπισμό των παραγόντων που πυροδοτούν την άνθιση του Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve). Γενικότερα η συσσώρευση δεδομένων, μέσω παρόμοιων μελετών είναι εξαιρετικά χρήσιμη, μιας και διευκολύνουν στη διεξαγωγή συμπερασμάτων που αφορούν τους δυνητικούς παράγοντες επίδρασης της εμφάνισης αλλά και άνθισης/έξαρσης του είδους στα παράκτια οικοσυστήματα. 20

21 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Καλλιέργεια του P. delicatissima Το είδος που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ανήκει σύμφωνα με την συστηματική κατάταξη του Hasle (1995) στο άθροισμα: Bacillariophyta, Κλάση: Bacillariophyceae, Τάξη: Bacillariales, Οικογένεια: Bacillariaceae, Γένος: Pseudo-nitzschia (M. Peragallo, ) Είδος: Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve) Heiden, Η απομόνωση του είδους έγινε στο τμήμα Οικολογίας και Συστηματικής του Πανεπιστήμιου Αθηνών. Η αναγνώριση του είδους P. delicatissima έγινε σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (Transmission Electron Microscopy) (TEM) στον τομέα Βοτανικής του Βιολογικού Τμήματος Αθηνών. Το είδος μεταφέρθηκε και διατηρήθηκε στην συλλογή καλλιεργειών μικροφυκών του εργαστηρίου Θαλάσσιας Οικολογίας του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας. Για την δημιουργία των μη ξενικών, στατικών καλλιεργειών (batch cultures) αναπτύχθηκαν μονοκαλλιέργειες κλειστού τύπου του είδους Pseudo-nitzschia delicatissima για τις ανάγκες των πειραμάτων (βλ. κεφ. 2.3). Αυτές οι μονοκαλλιέργειες χρησίμευσαν ως μητρικές και αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας f/2 (Guillard, 1975). Οι μητρικές καλλιέργειες υπέστησαν αναγέννηση ακολουθώντας χρήση ασηπτικών τεχνικών, με χρήση λύχνου Bunsen και αποστειρωμένων σκευών. Η ανακαλλιέργεια έγινε κατά την διάρκεια της εκθετικής φάσης, εξασφαλίζοντας υγιή κύτταρα. Οι μητρικές καλλιέργειες χρησίμευσαν στη δημιουργία των θυγατρικών καλλιεργειών (πειράματα 1-13 στους πίνακες 5 & 6) και των επαναληπτικών τους (replicates). Όλες οι καλλιέργειες περιείχαν ίδιο αρχικό κυτταρικό αριθμό που ανέρχονταν στα 5000 cells / ml κατά την αρχική ημέρα των πειραμάτων. 2.2 To μέσο καλλιέργειας f medium Το Medium f/2 είναι ένα κοινό και ευρέως χρησιμοποιούμενο θρεπτικό μέσο γενικού εμπλουτισμού για την ανάπτυξη θαλάσσιων φυτοπλαγκτικών οργανισμών και ειδικότερα για παράκτια διάτομα. Οι συγκεντρώσεις της πρωτότυπης συνταγής, που καλείται "f Medium" (Guillard and Ryther 1962), μειώθηκαν κατά το ήμισυ. Για την προετοιμασία του θρεπτικού μέσου, έγινε χρήση φιλτραρισμένου παλαιωμένου θαλασσινού νερού όπου και προστέθηκαν θρεπτικά συστατικά, ιχνοστοιχεία και βιταμίνες όπως προβάλλονται (πίνακα 4) παρακάτω. Για την δημιουργία παλαιωμένου θαλασσινού νερού έγινε δειγματοληψία από ολιγοτροφική περιοχή του Στενού της Μυτιλήνης, κατά το μήνα Φεβρουάριο του Το νερό παρέμεινε 4 μήνες σε πλαστική δεξαμενή, υπό συνθήκες παντελής απουσία φωτός. Πριν από τη χρήση του το παλαιωμένο νερό επέστη φιλτραρισμό και κλιβανισμό. Η αποστείρωση έγινε με χρήση κλιβάνου του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας. Ο κλιβανισμός διαρκούσε 15min στους 121 ο C. Να σημειωθεί ότι οι βιταμίνες προστέθηκαν στο κάθε πείραμα μετά την αποστείρωση ενώ τα θρεπτικά συστατικά πριν την αποστείρωσή τους (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975).

22 Πίνακας 4: Παρουσίαση των θρεπτικών συστατικών, ιχνοστοιχείων και βιταμινών που ήταν απαραίτητα για την παρασκευή του μέσου καλλιέργειας (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975). Συστατικό Πρωτογενές αποθεματικό διάλυμα Ποσότητα Μοριακή συγκέντρωση στο τελικό μέσο σε (μμ) NaNO 3 75 g/l H 2O 1 ml 882 NaH 2 PO 4 H 2 O 5 g/l H 2 O 1 ml 36,2 Na 2 SiO 3 9H 2 O 30 g/l H 2 O 1 ml 106 FeCl 3 6H 2 O --- 3,15 g 11,7 Na 2 EDTA2H 2 O --- 4,36 g 11,7 CuSO 4 5H 2 O 9,8 g/l H 2 O 1 ml 0,0393 Na 2 MoO 4 2H 2 O 6,3 g/l H 2 O 1 ml 0,026 ZnSO4 7H 2 O 22,0 g/l H 2 O 1 ml 0,0765 CoCl 2 6H 2 O 10,0 g/l H 2 O 1 ml 0,0422 MnCl 2 4H 2 O 180,0 g/l H 2 O 1 ml 0,091 Thiamine HCl -B mg 0,292 Biotin 0,1 g/l dh 2 O 10 ml 0,00205 cyanocobalamin (vit. B 12 ) 1,0 g/l dh 2 O 1 ml 0, Πειραματικός σχεδιασμός Για τους σκοπούς της παρούσας εργαστηριακής μελέτης δημιουργήθηκαν συνολικά 5 πειράματα περιορισμού θρεπτικών, με τρείς επαναλήψεις (εικόνα 5). Για την μελέτη του περιορισμού μετάλλων έγιναν 7 πειράματα με 2 επαναλήψεις το κάθε ένα. Όλα τα πειράματα διεξήχθηκαν σε θάλαμο σταθερών συνθηκών του Εργαστηρίου Θαλάσσιας Βιολογίας & Οικολογίας του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας. Ο θάλαμος εξασφάλιζε τον έλεγχο συγκεκριμένων αβιοτικών παραμέτρων. Συγκεκριμένα η θερμοκρασία του θαλάμου ήταν ρυθμισμένη στους 19 o C. Ο φωτισμός ήταν συνεχής (φωτοπερίοδος 24h Light:0h Dark) και επετεύχθην με λάμπες λευκού φωτός, ακτινοβολίας 0.3 MJ/m2.day. Η ανάδευση των πειραμάτων έγινε με συνεχή αερισμό, (φυσαλίδες) ο οποίος ταυτόχρονα παρεμπόδιζε την δημιουργία συσσωματωμάτων. Οι συνθήκες ελέγχονταν καθημερινά και διατηρήθηκαν πανομοιότυπες κατά την διάρκεια όλων των πειραμάτων. Εικόνα 5: Τα τριπλότυπα μέσα στο θάλαμο σταθερών συνθηκών. 22

23 Πειράματα περιορισμού θρεπτικών Για να εντοπιστούν τα όρια συγκεντρώσεων που επηρεάζουν την αύξηση του κυτταρικού αριθμού δημιουργήθηκαν αρχικά προκαταρκτικές μονοκαλλιέργειες. Στις προκαταρκτικές καλλιέργειες το μέσο f/2 μειώθηκε κατά 20 και κατά 10 φορές. Η μετρούμενη παράμετρος ήταν ο κυτταρικός αριθμός. Για να διερευνηθεί ο ρόλος του περιορισμού θρεπτικών στην αύξηση του είδους, πέντε πειράματα δημιουργήθηκαν. Το κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρείς επαναλήψεις σε κωνικές φιάλες των 5 λίτρων Η ποσότητα της καλλιέργειες σε κάθε κωνική φιάλη ήταν 4,500 λίτρα ώστε να εξασφαλίζεται αρκετή ποσότητα για τις απαιτούμενες αναλύσεις θρεπτικών και κυτταρικού αριθμού. Πιο αναλυτικά, στο πρώτο πείραμα δεν έγινε κανένας περιορισμός θρεπτικών. Ενώ στα υπόλοιπα πειράματα εξετάστηκε ο ρόλος του περιορισμού των φωσφορικών (PO 4 ) και των νιτρικών (NO 3 ). Για την επίτευξη αυτού έγινε μείωση της συγκέντρωσης του θρεπτικού συστατικού που εξετάζονταν κάθε φορά (πίνακας 5). Πίνακας 5: Πειράματα για την διερεύνηση του περιορισμού θρεπτικών συστατικών στην αύξηση του P. delicatissima. Ως πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν οι αναλογίες του μέσου f/2 (πείραμα 1) ενώ στα υπόλοιπα πειράματα περιορισμού θρεπτικών χρησιμοποιήθηκε το μέσο f/2 με μειωμένη συγκέντρωση του εκάστοτε θρεπτικού. Οι μονάδες μέτρησης της συγκέντρωσης είναι σε (Μμ) Ο πίνακας παρουσιάζει τον λόγο Ν : Ρ κατά Redfield που προέκυψε από τις αρχικές συγκεντρώσεις του εκάστοτε εργαστηριακού πειράματος. Πείραμα f/2 f/2-po 4 /4 f/2-no 3 /4 f/2-po 4 /8 f/2-no 3 /8 Συστατικό (μμ) NaNO , ,25 NaH 2 PO 4 H 2 O 36,2 9,05 36,2 4,525 36,2 Redfield N:P 24,3:1 97,5:1 6,1:1 195:1 3,04:1 Περιορισμός Επάρκεια Ν Επάρκεια Ν Επάρκεια P Επάρκεια Ν Επάρκεια P θρεπτικού Οι συγκεντρώσεις των υπόλοιπων συστατικών, βιταμινών και ιχνο-μέταλλων παρέμειναν όπως ορίστηκαν προηγουμένως για το θρεπτικό μέσο f/2 (πίνακας 4). Οι μετρούμενοι παράμετροι αυτών των πειραματικών καλλιεργειών ήταν ο κυτταρικός αριθμός όπου επιτευχθεί με χρήση μικροσκοπίου ( 2.4) καθώς επίσης οι συγκεντρώσεις χλωροφύλλης a, c μα και οι συγκεντρώσεις NO 3, NO 2, PO 4 και SiO 2 που έγιναν με εργαστηριακές αναλύσεις ( 2.5). Εικόνα 6: Τα διπλότυπα επαναληπτικά πειράματα, διπλότυπες καλλιέργειες των πειραμάτων περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων, μέσα στο θάλαμο σταθερών συνθηκών. 23

24 2.3.2 Πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων Για να διερευνηθεί ο ρόλος του περιορισμού των ίχνο-μετάλλων στην αύξηση του είδους P. delicatissima, έγινε παρασκευή εφτά πειραματικών μονοκαλλιεργειών. Στο θρεπτικό μέσο f/2 η μεταβαλλόμενη συγκέντρωση ήταν αυτή των μετάλλων. Κάθε μονοκαλλιέργεια επαναλήφτηκε σε διπλότυπο των 0,5liter (εικ. 3). Ο μετρούμενος παράγοντας ήταν ο κυτταρικός αριθμός. Σε κάθε αποστειρωμένη φλάσκα χωρητικότητας 500 ml προστέθηκαν φιλτραρισμένο νερό παλαίωσης 4 μηνών, 2 ml του Medium f/2 και η ανάλογη περιοριστική συγκέντρωση του κάθε εξεταζόμενου μετάλλου (πίνακας 6). Πίνακας 6: Πειράματα για την διερεύνηση του περιορισμού μετάλλων στην αύξηση του P. delicatissima. Ως πείραμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν οι αναλογίες του μέσου f/2 (πείραμα 1) ενώ στα έξι πειράματα περιορισμού επιμέρους μετάλλων χρησιμοποιήθηκε το μέσο f/2 με τη συγκέντρωση του εκάστοτε μετάλλου μειωμένη κατά 5 φορές. Συστατικό (μμ) f/2 Μέταλ./10 Cο/10 Μο/10 Cu/10 Zn/10 Mn/10 Fe+EDTA/10 Κωδικός πειράματος FeCl 3 6H 2 O 11,7 1,17 11,7 11,7 11,7 11,7 11,7 1,17 Na 2 EDTA2H 2 O 11,7 1,17 11,7 11,7 11, ,7 CuSO 4 5H 2 O 0,0393 0, ,0393 0,0393 0, ,0393 0,0393 0,0393 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,026 0,0026 0,026 0,0026 0,026 0,026 0,026 0,026 ZnSO4 7H 2 O 0,0765 0, ,0765 0,0765 0,0765 0, ,0765 0,0765 CoCl 2 6H 2 O 0,0422 0, , ,0422 0,0422 0,0422 0,0422 0,0422 MnCl 2 4H 2 O 0,091 0,0091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,0091 0, Μικροσκόπιο Για την καταμέτρηση του κυτταρικού αριθμού συλλέγονταν ασηπτικά 2.5ml δείγματος από κάθε κωνική φιάλη, επί καθημερινής βάσης από την ημέρα 0 έως την τελευταία ημέρα κάθε πειράματος (στάσιμη φάση). Για την σταθεροποίηση των δειγμάτων προστίθεται ~0,1ml ουδέτερου διαλύματος Ιωδίνης Lugol, και ομογενοποιούταν σε Vortex. Το δείγμα τοποθετούνταν σε καληπτρίδα Palmer Malone (Διαμέτρου 0,4 mm,βάθους 0,4 mm, επιφάνειας 252 mm 2 και όγκου 0,1 ml) και με χρήση μικροσκοπίου επιλέγονταν από 1 έως 9 τυχαίες συντεταγμένες και μετρούνταν τα κύτταρα που βρίσκονταν εντός πεδίου. Η μικροσκοπική παρατήρηση πραγματοποιήθηκε με ανάστροφο μικροσκόπιο Motic ΑΕ31 με 400x μεγέθυνση, το οποίο ήταν εξοπλισμένο με φωτογραφική συσκευή πραγματικού χρόνου Olympus?.., συνδεδεμένη με ηλεκτρονικό υπολογιστή και το λογισμικό Image Pro καθώς και το Scope photo. Τα προγράμματα αυτά αναμετέδιδαν την εικόνα της καλυπτρίδας, επιτρέποντας την δημιουργία ενός φωτογραφικού αρχείου. Με τη χρήση του λογισμικού Image-J έγινε η καταμέτρηση των κυττάρων. Μετρήσιμα είδη θεωρήθηκαν αυτά με εμφανή ενδοκυτταρικό περιεχόμενο (ζωντανά). Στο τέλος έγινε αναγωγή με σκοπό να βρεθεί ο τελικός αριθμός κυττάρων ανά λίτρο. Η μετρήσεις του κυτταρικού αριθμού έγιναν επί καθημερινής βάσης, μέχρις ότου να παρατηρηθεί η στάσιμη φάση (15 η -24 η ημέρα). 24

25 Ο μαθηματικός τύπος που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της πυκνότητας των μικροφυκών σε κάθε δείγμα ήταν του Hasle, 1978 κατά (Βαρκιζή, 2010): C = (N * K n ) / n * V Όπου C= η πυκνότητα των κυττάρων (κύτταρα L -1 ) Ν = το σύνολο του αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν σε n τα πεδία n = ο αριθμός των πεδίων που μετρήθηκαν V = ο όγκος του δείγματος μέσα στο θαλαμίσκο της καλυπτρίδας K n = συντελεστής πεδίου (1=16800, 2=8400, 3=5600, 4=4200, 5=3360, 6=2800, 7=2400, 8= 2100, 9=1867) 2.5 Εργαστηριακές αναλύσεις Εργαστηριακές αναλύσεις έγιναν με σκοπό τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των ανόργανων αλάτων (νιτρικά, νιτρώδη, φωσφορικά και πυριτικά) καθώς και των συγκεντρώσεων χλωροφύλλης a, και c. Οι εργαστηριακές αναλύσεις νερού έγιναν σύμφωνα με τον οδηγό χημικών και βιολογικών μεθόδων του (Parsons, 1984). Για την επίτευξη των αναλύσεων, δημιουργήθηκαν καλλιέργειες του είδους κατά την διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων. Αρχικά, πάρθηκαν δείγματα νερού, (~100ml) από τις πειραματικές κωνικές φιάλες, ακολουθώντας πάντοτε άσηπτες τεχνικές, με φιαλίδια και σκεύη που ήταν προκατεργασμένα με διάλυμα HCl. Οι δειγματοληψίες έγιναν με χρήση αντλίας που ήταν προσαρμοσμένη σε συσκευή διήθησης νερού. Από κάθε ένα πείραμα, πάρθηκε ένα δείγμα νερού, όπου συσκευάστηκε σε πλαστικά φιαλίδια και τοποθετήθηκε αμέσως στη κατάψυξη ως και την ημέρα της ανάλυσής τους. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνονταν κάθε 3 ημέρες για κάθε πείραμα και για κάθε επανάληψη αυτού. Με σκοπό την εύρεση των συγκεντρώσεων Chl-a και c, έγινε διήθηση δειγμάτων γνωστού όγκου νερού, μέσω ηθμών Millipore GF 45mm. Τα φίλτρα τοποθετήθηκαν διπλωμένα σε αλουμινόχαρτο και φυλάχθηκαν σε σκοτεινό καταψύκτη μέχρι και την ανάλυσή τους. Η βιομάζα του φυτοπλαγκτού υπέστη εκχυλισμό με διάλυμα ακετόνης 90 %. Έγινε φυγοκέντριση σε Sigma στα rpm για 15min, και πάρθηκε το υπερκείμενο διάλυμα. Οι μετρήσεις απορρόφησης έγιναν σε καθορισμένα μήκη κύματος (750, 664, 647, 630 nm), με κυβέτα 1cm, σε φασματοφωτόμετρο (Hitachi Digilab U- 1800). Με βάση τις διορθωμένες τιμές απορρόφησης έγινε υπολογισμός των συγκεντρώσεων χλωροφύλλης. Για τον προσδιορισμό των νιτρικών εφαρμόστηκε αναγωγή των νιτρικών σε νιτρώδη εφαρμόζοντας την μέθοδο του Parsons (1984), διαφοροποιημένη ως προς την αναγωγή, η οποία πραγματοποιήθηκε με ισχυρή ανάδευση (για 1min), των νιτρικών ιόντων μέσα σε φιαλίδια πολυαιθυλενίου τα οποία περιείχαν κόκκους καδμίου επικαλυμμένους με θεϊκό χαλκό. Τα νιτρικά ιόντα μετατράπηκαν ποσοτικά σε νιτρώδη. Η μέθοδος βασίστηκε στη διαζώτωση του σουλφανιλαμιδίου με τα νιτρώδη και τη σύζευξη της υδροχλωρικής νάφθυλοαιθυλενοδιαμίνης. Το ροζ χρώμα που σχηματίστηκε με την παρουσία νιτρωδών, προσδιορίστηκε στα 543nm. 25

26 Ο προσδιορισμός των φωσφορικών ιόντων πραγματοποιήθηκε με κατεργασία των δειγμάτων με το όξινο αντιδραστήριο μολυβδαινικού ιόντος που περιείχε ασκορβικό οξύ και μικρή ποσότητα τρυγικού κάλιοχαντιμονυλίου. Το φωσφορομολυβδαινικό οξύ, έδωσε ένα μπλε-μωβ σύμπλοκο, και μετρήθηκε η απορρόφησή του στα 690nm. Ενώ η μέτρηση των πυριτικών ιόντων στηρίχθηκε στον σχηματισμό ενός πυριτιομολυβδαινικού συμπλόκου. Το πυριτιομολυβδαινικό σύμπλοκο ανάχθηκε με την προσθήκη διαλύματος που περιείχε μεταλλοθειϊκό ιόν, σχηματίζοντας κυανή ένωση η οποία προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά στα 810nm (Parsons, 1984) Υπολογισμός ρυθμού αύξησης Ο ρυθμός αύξησης GR (Growth Rate) βασίστηκε στο κλασικό τύπο ανάλυσης που εισήγαγε το 1973 ο Guillard (Andersen, 2005): GR = (lnν 2 lnν 1 ) / (t 2 t 1 ) Όπου Ν 1 και Ν 2 είναι ο κυτταρικός αριθμός, τις χρονικές στιγμές t 1 και t 2. Για τον υπολογισμό αυτού στο σύνολο των παρατηρήσεων, έγινε εφαρμογή γραμμικής παλινδρόμησης με χρήση του τύπου ελαχίστων τετραγώνων και προσαρμογή της τυπικής απόκλισης. Ο ρυθμός αύξησης υπολογίστηκε τόσο κατά την (exponential phase) εκθετική περίοδο κυτταρικής αύξησης όσο και κατά την στατική φάση του κάθε πειράματος (Stationary phase). Ενώ ο υπολογισμός του χρόνου γενεάς & διαιρέσεων (Divisions per day & Generation time) βασίστηκε στους παρακάτω τύπους: Div.day -1 = GR / Ln2 Gen. time = 1 / Div.day Επεξεργασία δεδομένων Τα δεδομένα από τις καταμετρήσεις του κυτταρικού αριθμού επεξεργάστηκαν αρχικά κάνοντας χρήση του λογαριθμημένου (log) μέσου όρου των επαναλήψεων ενώ για την εύρεση αποκλίσεων έγινε προσαρμογή του τυπικού σφάλματος. Για την στατιστική επεξεργασία των δεδομένων έγινε χρήση του στατιστικού λογισμικού STATGRAPHICS Centurion XV.I. Με το πακέτο αυτό έγινε έλεγχος για να διαπιστωθεί εάν οι πληθυσμοί ακολουθούσαν κανονική κατανομή ή μία προσέγγιση αυτής. Οι στατιστικοί έλεγχοι που έγιναν ήταν το Goodness-of-Fit Tests και το Kolmogorov-Smirnov Test. Όταν τα δείγματα ακολουθούσαν κανονική κατανομή γινόταν χρήση παραμετρικών μεθόδων (τυπική απόκλιση, μέση τιμή), με χρήση του στατιστικού ελέγχου ANOVA (Analysis Of Variance). Για τον εντοπισμό των ομάδων που διέφεραν έγινε χρήση του Fisher s LSD (Least Significant Differences). Στα δείγματα όπου δεν ακολουθούσαν κανονική κατανομή έγινε χρήση μη-παραμετρικών μεθόδων (ενδοτεταρτημόριο, διάμεσος), και έγινε χρήση του στατιστικού ελέγχου Kruskal-Wallis.Το Box και Whisker Plot εντοπίζε τους διάμεσους που ήταν στατιστικά σημαντικοί από τους άλλους 26

27 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Πειράματα περιορισμού θρεπτικών Oι προκαταρκτικές καλλιέργειες με μειωμένα τα θρεπτικά συστατικά κατά 20 και κατά 10 φορές δεν παρουσίασαν κυτταρική ανάπτυξη. Αντιθέτως, στο πείραμα, όπου τα κύτταρα αναπτύχθηκαν χωρίς περιορισμό σε θρεπτικά αλλά και μεταλλικά ιχνοστοιχεία, (f/2) ο κυτταρικός αριθμός παρουσίασε την τυπική σιγμοειδή καμπύλη ανάπτυξης φυτοπλαγκτού. Η εκθετική φάση ξεκίνησε από την πρώτη μέρα τις πειραματικής διαδικασίας και η καταγραφή του κυτταρικού αριθμού ακολούθησε ραγδαία αύξηση καταλήγοντας στην ύστερη ή πτωτική εκθετική φάση την 5 η ημέρα. Στη συνέχεια εμφανίστηκε η στατική φάση η οποία και διήρκησε ως και την 12 η ημέρα. Στις 25 ημέρες καλλιέργειας δεν εμφανίστηκε φάση κατάρρευσης. Στα πειράματα όπου υπήρξε θρεπτικός περιορισμός η πρότυπη κατανομή ανάπτυξης φυτοπλαγκτού ακολουθήθηκε, με απουσία των φάσεων προσαρμογής και κατάρρευσης. Πιο συγκεκριμένα όταν το μέσο καλλιέργειας είχε περιορισμό PO 4 /4 η διάρκεια της εκθετικής φάσης ήταν δύο ημέρες ενώ η στατική φάση ξεκίνησε την 3 η ημέρα και διήρκησε ως και την 13 η ημέρα. Ενώ στη καλλιέργεια που στο θρεπτικό της μέσο υπήρξε περιορισμός NO 3 /4, κατεγράφησαν τρείς ημέρες εκθετικής φάσης και έναρξη στατικής φάσης την 3 η ημέρα. Οι κυτταρικοί αριθμοί (cell number) για τα τρία πρώτα πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό θρεπτικών, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4 παρουσιάζονται στο γράφημα 1. Ο κυτταρικός αριθμός του πειράματος με μέσο καλλιέργειας f/2 χωρίς περιορισμό θρεπτικών ήταν στατιστικά υψηλότερος από τα πειράματα με περιορισμό σε PO 4 /4 και στα NO 3 /4 (ANOVA, F=20.68, P<0.05). Cell N 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 f/2 - PO4/4 f/2 - N03/4 f/ Ημέρες 15 Γράφημα 1: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-pο 4 /4 και f/2-nο 3 /4. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Το πείραμα χωρίς κανέναν περιορισμό θρεπτικών παρουσίασε στατιστικά υψηλότερες συγκεντρώσεις Chl a (ΑNOVA, F=11,89 P<0,05) σε σχέση με τα δύο άλλα πειράματα περιορισμού θρεπτικών (f/2-ρo 4 /4 και f/2-no 3 /4), εμφανίζοντας μέσο όρο 192,7 mg/l και μέγιστη τιμή 357,7 mg/l την 9 η ημέρα του πειράματος. Οι παρόμοιες παρατηρήσεις σημειώθηκαν για τις μετρήσεις τις Chl c, εμφανίζοντας ελαφρώς χαμηλότερη στατιστική διαφορά (ΑNOVA, F=8,99. P<0,05) και υψηλότερες τιμές τυπικού σφάλματος σε σχέση με αυτές της Chl a. Οι μέσοι όροι των συγκεντρώσεων Chl a για τα υπόλοιπα δύο πειράματα κυμάνθηκαν σε παρόμοια επίπεδα, με 74,4 mg/l και 78,1 mg/l για το f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4 ενώ οι μέγιστες συγκεντρώσεις τους παρουσιάστηκαν κατά την 6 η ημέρα με 127,5 mg/l και κατά την 9 η ημέρα 180,4 αντιστοίχως. 27

28 500 f/2 f/2 - PΟ4/4 f/2 - NΟ3/4 400 Chl a Ημέρες Γράφημα 2: Τα αποτελέσματα Chl a σε mgr/l, που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Συγκρίνοντας την κατανομή του κυτταρικού αριθμού με την κατανομή της συγκέντρωσης της Chl a, στους τρείς αυτούς πειραματισμούς με διαφορετικές θρεπτικές συνθήκες έγινε φανερό ότι οι μέγιστες τιμές συγκεντρώσεων εμφανίστηκαν κατά την διάρκεια της στατικής φάσης των καλλιεργειών και συγκεκριμένα κατά την 9 η ημέρα διεξαγωγής των πειραμάτων. Συγκεκριμένα η μέγιστη τιμή στο f/2 ήταν 357,8 ±38,6 mgr/l, ενώ οι μέγιστες συγκεντρώσεις των πειραμάτων περιορισμού ήταν 113,5 ±10,9 mgr/l και 180,4 ±23,7 mgr/l για τα πειράματα f/2-po 4 /4 και f/2- NO 3 /4 αντιστοίχως. Οι συγκεντρώσεις των ΝΟ 3 (γράφημα 3) παρουσίασαν σε όλες τις καλλιέργειες μέγιστες τιμές κατά την διάρκεια της πρώτης ημέρας της διεξαγωγής των πειραμάτων (αντίθετα με τα NO 2 που ήταν ελάχιστες οι συγκεντρώσεις). Οι μέσες τιμές των τριών πειραμάτων έδειξαν στατιστική διαφορά στο πείραμα με f/2- PO 4 /4 ο οποίος είχε υψηλότερο μέσο από τα άλλα δύο πειράματα (Kruskal-Wall Test= 22,88 P<0,05) PO4/4 NO3/4 f/2 400 NO Ημέρες 15 Γράφημα 3: Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής ανάλυσης για τις συγκέντρωσης νιτρικών (NO 3 σε μm) που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση ΝΟ 3, σε μμ. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. 28

29 Box-and-Whisker Plot NO3 1 experiment NO3 _ìm_ Γράφημα 19: Το Το Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις NO 3 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Όπως φάνηκε και στο παραπάνω γράφημα, τα νιτρικά παρουσίασαν απότομη πτώση εμφανίζοντας κατακόρυφη πρόοδο μέχρι και την 6 η ημέρα και για τις τρείς θρεπτικές συνθήκες. Το f/2 παρουσίασε μέγιστη τιμή στα 530,95 ±13,3 μμ ενώ σε σχέση με το πείραμα f/2-no 3 /4 η συγκέντρωση ήταν σχεδόν τρείς φορές υψηλότερη για την 1 η ημέρα όπου μετρήθηκε στα 173,83 ± 46,2 μμ. Τέλος να σημειωθεί ότι το πείραμα με μειωμένα PO 4 παρουσίασε παρόμοια κατανομή εμφανίζοντας όμως ελαφρώς χαμηλότερες συγκεντρώσεις NO 3 από το πρότυπο μέχρι και την 6 η ημέρα, όπου και σταθεροποιήθηκε από εκεί και μετά. Όσον αφορά τις εργαστηριακές ανάλυσης των νιτρωδών φάνηκε ότι στο πείραμα με f/2-po 4 /4, οι συγκεντρώσεις έχουν αυξητική τάση μέχρι την 9 η ημέρα όπου και εμφάνισαν τις μέγιστες τιμές τους (γράφημα 4). Ωστόσο, αποδείχτηκε (μέσω του στατιστικού ελέγχου LSD) ότι ο μέσος όρος του πειράματος ήταν σημαντικά διαφορετικός σε σχέση με τα υπόλοιπα πειράματα (n=18, mean=3,35). Η καλλιέργεια που περιείχε το θρεπτικό μέσο χωρίς κανένα περιορισμό εμφάνισε δύο μέγιστα (6 η και 9 η ημέρα), ενώ το μέγιστο του πειράματος f/2 ΝO 3 /4 παρουσιάστηκε στα μέσα της εκθετικής αύξησης. 6 F/2 PO4/4 N03/4 5 4 NO Ημέρες Γράφημα 4: Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής αναλύσεις για τη συγκέντρωση νιτρωδών (NO 2 σε μm) που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας, ενώ ο κατακόρυφος άξονας αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση ΝΟ 2, σε μμ. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Means and 95,0 Percent LSD Intervals 4,2 3,8 3,4 N02 3 2,6 2,2 1, experiment Γράφημα 18: Το LSD για τις συγκεντρώσεις NO 2 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. 29

30 600 NO3 NO2 6 (α) N03 (μμ) N02 (μμ) (β) N03 (μμ) N02 (μμ) N03 (μμ) Ημέρες N02 (μμ) (γ) Γράφημα 5: Στους κατακόρυφους άξονες παρουσιάζονται οι κατανομές των συγκεντρώσεων νιτρικών (ΝΟ 3 ) και νιτρωδών (ΝΟ 2 ) σε μμ, για τα πειράματα (α): f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, (β) f/2-po 4 /4 και (γ) f/2 - NO 3 /4, στο πέρας του χρόνου. Μετά από τις εργαστηριακές αναλύσεις, φάνηκε ότι οι συγκεντρώσεις SiΟ 2 (μμ) σε όλες τις καλλιέργειες παρουσίασαν μέγιστες τιμές κατά την διάρκεια των πρώτων ημερών της πειραματικής διαδικασίας (γράφημα 6). Ενώ εμφανίστηκε παρόμοια κατανομή του SiΟ 2 για τα πειράματα περιορισμού f/2-po 4 /4 & f/2-no 3 /4. Οι μέσες τιμές των τριών πειραμάτων έδειξαν στατιστική διαφορά στο πείραμα με f/2-po 4 /4 το οποίο είχε σχεδόν διπλάσιο μέσο όρο από τα άλλα δύο πειράματα (Kruskal-Wall Test= 11,24 P< 0,05) F/2 P04/4 NO3/ SiO Ημέρες Γράφημα 6 : Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής αναλύσεις για τη συγκέντρωση των Si0 2 σε μm, που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. 30

31 Box-and-Whisker Plot 1 experiment SiO2 _ìm_ Γράφημα 20: Το Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις SiO 2 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Όσον αφορά τις συγκεντρώσεις PO 4 (μμ) σε όλες τις καλλιέργειες παρουσίασαν μέγιστες τιμές κατά την διάρκεια των πρώτων ημερών της πειραματικής διαδικασίας ενώ οι τιμές γίνονται σχεδόν μηδενικές μετά την 6 η ημέρα. Μεταξύ των τριών πειραμάτων που διεξήχθησαν και σύμφωνα με τις εργαστηριακές αναλύσεις των θρεπτικών συστατικών φάνηκε ότι η υψηλότερη συγκέντρωση PO 4 (γράφημα 7) εμφανίστηκε στο πείραμα f/2 - NO 3 /4 (Kruskal-Wall Test= 12,96 P<0,05). Οι συγκεντρώσεις εμφάνισαν μέγιστο την 3 η ημέρα της πειραματικής διαδικασίας με συγκέντρωση 38,2 ± 0,9 μm, ενώ στο συγκεκριμένο πείραμα τα PO 4, άγγιξαν μηδενικές συγκεντρώσεις κατά την 12 η ημέρα, και μετά από αυτό η πορεία τους συνέχισε ανοδικά με 4,15 ±1,11μM την 15 η ημέρα. 50 F/2 PO4/4 NO3/4 40 PO4 (mm) Ημέρες Γράφημα 7 : Τα αποτελέσματα της εργαστηριακής αναλύσεις για τη συγκέντρωση των PO 4 σε μm, που προήλθαν από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. Box-and-Whisker Plot 1 experiment P04 _ìm_ Γράφημα 21: Το Το Box and Whisker Plot για τις συγκεντρώσεις PO 4 των πειραμάτων f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4. 31

32 Η μελέτη της σχέσης του κυτταρικού αριθμού με την κατανομή των PO 4 φανέρωσε μία πτώση των συγκεντρώσεων του θρεπτικού όταν αυξάνει ο κυτταρικός αριθμός και μάλιστα τα μέγιστα του κυτταρικού πληθυσμού συμπίπτουν με τις ελάχιστες τιμές συγκεντρώσεων. 35 [PO4] Cell N PO Cell N Ημέρες Γράφημα 8: Στους κατακόρυφους άξονες παρουσιάζονται οι χαρακτηριστικές συγκεντρώσεις των PO 4 (μm) σε σχέση με τον κυτταρικό αριθμό (Cell N). Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις ημέρες της πειραματικής διαδικασίας (παράγοντας) για τo πείραμα f/2 χωρίς κανένα περιορισμό. 0 Στα πειράματα όπου υπήρξε θρεπτικός περιορισμός (f/2-pο 4 /8 και f/2-nο 3 /8) η πρότυπη κατανομή ανάπτυξης φυτοπλαγκτού ακολουθήθηκε, με απουσία των φάσεων προσαρμογής και κατάρρευσης (γράφημα 9) και με παρόμοια καταγραφή κυτταρικών αριθμών στην πάροδο του χρόνου. Όταν το μέσο καλλιέργειας είχε περιορισμό PO 4 /8 η διάρκεια της εκθετικής φάσης ήταν μέχρι και την 4 η ημέρα ενώ η στατική φάση διήρκησε ως και την 12 η ημέρα. Επίσης η κατανομή του κυτταρικού αριθμού του πειράματος όπου το θρεπτικό μέσο υπέστη περιορισμός NO 3 /8, παρουσίασε 5 ημέρες εκθετικής φάσης, εντούτοις αξίζει να σημειωθεί ότι ακολούθησε παρόμοια συμπεριφορά με την καμπύλη ανάπτυξης του πειράματος f/2-no 3 /4. 6,5 f/2 f/2 - PO4/8 f/2 - NO3/8 6 Cell N 5,5 5 4,5 4 3, Ημέρες Γράφημα 9: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-pο 4 /8 και f/2-nο 3 /8. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. (Kruskal-Wallis Test = 12,7859 P<0,05). Ο κυτταρικός αριθμός των τριών πειραμάτων (f/2 χωρίς κανένα περιορισμό, f/2-pο 4 /8 και f/2- NΟ 3 /8) εμφάνισε σημαντική στατιστική διαφορά μεταξύ των διαμέσων με 95,0% βαθμό εμπιστοσύνης (P<0.05). Στη συνέχεια το Box και Whisker Plot εντόπισε ότι το πείραμα f/2 είχε μεγαλύτερο κυτταρικό αριθμό από τα άλλα δύο (n=75, Average= 72,7267). Πιο αναλυτικά, φάνηκε ότι τα πειράματα περιορισμού εμφάνισαν παρόμοιες τιμές κυτταρικού αριθμού ενώ είχαν και ταυτόσημο τυπικό σφάλμα. Συγκεκριμένα το με f/2-pο 4 /8 εμφάνισε μέσο 55 cell/ml σε πλήθος δειγμάτων n=25 ενώ το f/2-nο 3 /8 είχε μέσο 45 cell/ml με ίδιο αριθμό δειγμάτων, τα δύο αυτά πειράματα δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτες διαφορές στον κυτταρικό αριθμό τους (γράφημα 10). 32

33 6,5 f/2 f/2 - PO4/4 f/2 - PO4/8 6 5,5 Cell N 5 4,5 4 3, ,5 f/2 NO3/4 NO3/8 6 Cell N 5,5 5 4,5 4 3, Ημέρες10 12 Γράφημα 10: Λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός (Cell N), που προήλθε από το μέσο όρο των τριών επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα τρία πειράματα: f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-po 4 /8, (επάνω) και αντίστοιχα f/2, f/2-νo 3 /4 και f/2-νo 3 /8 (κάτω). Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. Όταν το θρεπτικό μέσο δεν περιείχε κανένα περιορισμό ως προς τα θρεπτικά του ο λόγος Redfield N:P ήταν 24,3:1. Περιορίζοντας τα PO 4 το πείραμα με f/2-po 4 /4, ο λόγος Redfield N:P έγινε 97,5:1, ενώ στο πείραμα όπου f/2 PO 4 /8 ό λόγος ήταν 195:1. Και στις τρείς αυτές περιπτώσεις το στοιχείο που έλεγχε την κυτταρική ανάπτυξη ήταν το Ρ, δρώντας ως περιοριστικό θρεπτικό. Όταν το Ν έδρασε ως περιοριστικό θρεπτικό οι λόγοι Redfield N:P που καταγράφηκαν ήταν 6,1:1 για το πείραμα f/2 - NO 3 /4 και 3,04:1 στο πείραμα με f/2 - NO 3 /8. Ενώ οι λόγοι Redfield Si:N και Si:P για όλα τα πειράματα ήταν πάντα > 0.1 γεγονός που φανερώνει έλλειμμα Si κατά την ημέρα έναρξης των πειραμάτων. 3.2 Πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων Η διερεύνηση του ρόλου του περιορισμού όλων των μεταλλικών ιχνοστοιχείων στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, δεν εμφάνισε αύξηση του κυτταρικού αριθμού (γράφημα 4). Μια μεγάλη στατιστική διαφορά εντοπίστηκε όταν συγκρίθηκαν τα πειράματα f/2 και f/2-metals/10 (Kruskal-Wallis151,226 με P=0). Η κατανομή του κυτταρικού αριθμού στη πάροδο των ημερών και το γράφημα που προέκυψε από την στατιστική ανάλυση παρουσιάστηκαν στο γράφημα

34 6,5 f/2 f/2 - Metals/10 Box-and-Whisker Plot Cell N 6 5,5 5 4,5 4 experiment 1 7 3, ημέρες (X ,) Cell number Γράφημα 11: Σύγκριση των θρεπτικών συνθηκών του πειράματος με f/2 (1) και f/2-metals/10 (7). Αριστερά παρουσιάζονται οι κατανομές του κυτταρικού αριθμού (Log Cell N) στο χρόνο. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος. (Kruskal-Wallis Test = 151,226 με P=0,0). Δεξιά το Box and Whisker Plot που διεξήχθη από την στατιστική ανάλυση. Η καταγραφή του κυτταρικού αριθμού φανέρωσε απόκλιση από την τυπική καμπύλη ανάπτυξης φυτοπλαγκτού, παρουσιάζοντας ασαφή όρια μεταξύ εκθετικής και στάσιμης φάσης. Ο μέγιστος κυτταρικός αριθμός του f/2-metalls/10 εμφανίστηκε την 4 η ημέρα με κύτταρα, αριθμός σχεδόν 100 φορές μικρότερος από τον μέγιστο που εμφανίστηκε στο f/2. Τα αποτελέσματα τις περεταίρω διερεύνησης των μεταλλικών ιχνοστοιχείων όπου απαρτίζουν το μέσο καλλιέργειας, παρουσίασαν διαφορετικές καμπύλες ανάπτυξης. Συγκεκριμένα στα πειράματα με f/2-(fe+edta)/10 και f/2-mn/10 δεν καταγράφηκε αξιοσημείωτη κυτταρική αύξηση ενώ ήταν εμφανής η απόκλιση από την τυπική καμπύλη ανάπτυξης φυτοπλαγκτού, με ξεκάθαρα ασαφή όρια μεταξύ εκθετικής και στάσιμης φάσης (γράφημα 12). Ο στατιστικός έλεγχος στήριξε το πρωταρχικό αυτό αποτέλεσμα, δείχνοντας ότι οι χαμηλότεροι κυτταρικοί αριθμοί παρουσιαστήκαν στα πειράματα αυτά με μέσους 26,3 και 37,5 για το f/2-(fe+edta)/10 και το f/2-mn/10 αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά οι πειραματικές δοκιμασίες με θρεπτικές συνθήκες που περιείχαν μειωμένα τα: f/2-co/10, f/2-mo/10, f/2-zn/10 και f/2-mn/10 είχαν κατά μέσο όρο διάμεσους κυτταρικού αριθμού περίπου 113 cell N/ ml. Ενώ αξίζει να σημειωθεί ότι οι καλλιέργειες αυτές ακολούθησαν με ελαφρές διακύμανσης το πρότυπο της φυτοπλαγκτονικής ανάπτυξης (γράφημα 12). Γενικότερα ο έλεγχος των διαμέσων των λογαριθμημένων κυτταρικών αριθμών που προήλθαν από το μέσο όρο των επαναληπτικών δοκιμών για το καθένα από τα επτά πειράματα παρουσίασαν στατιστική διαφορά ίση με 151,2 με τιμή P=0 σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95,0%. Ο λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός που προέκυψε μετά από παρατήρηση με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του περιορισμού των επιμέρους μεταλλικών ιχνοστοιχείων του θρεπτικού μέσου στα πειράματα αυτά παρουσιάζεται στο γράφημα

35 Mo/10 Cu/10 Zn/10 Mn/10 Fe/10 Co/10 6 5,5 Cell N 5 4,5 4 3, Ημέρες 12 Γράφημα 12: Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται ο λογαριθμημένος κυτταρικός αριθμός που προήλθε μετα από παρατήρηση στο μικροσκόπιο ενώ ο οριζόντιος άξονας εκφράζει τις 12 ημέρες τις διεξαγωγής των πειραμάτων. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος του τυπικού σφάλματος (Test statistic = 151,226 P-Value =0). Το Box-and-Whisker Plot διευκρίνισε ότι η διερεύνηση του ρόλου των συγκεκριμένων ιχνομετάλλων δεν εμφάνισε ανάπτυξη υπό περιορισμό Mn και Fe+EDTA. Το εύρος ανάπτυξης στο περιορισμό Zn ήταν πολύ χαμηλότερο σε σχέση με τους περιορισμούς Co, Mo, και Cu (γράφημα 13). 6,8 Means and 95,0 Percent LSD Intervals Log Cell number 5,8 4,8 3,8 2,8 f/2 Co Mo Cu Zn Mn Fe experiment Γράφημα 13: Στον κάθετο άξονα παρουσιάζονται ο κυτταρικός αριθμός ενώ οι μέσοι όροι των διαφορετικών πειράματων περιορισμού ιχνο- μετάλλων οριζόντια. Οι μπάρες υποδεικνύουν το μέγεθος απόκλισεων (Test statistic = 151,226 P-Value =0). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η καλλιέργεια με το f/2 που δεν περιείχε κανένα περιορισμό, είναι ικανή να λειτουργήσει ως μάρτυρας/πρότυπο (control) προσδίδει τη χρησιμότητα της σύγκρισης αυτής με τις υπόλοιπες πειραματικές καλλιέργειες. Συγκεκριμένα, μετρήθηκε ότι οι μέγιστοι κυτταρικοί αριθμοί εμφανίστηκαν στο πείραμα f/2. Ο ρυθμός αύξησης ήταν 1,19 ±0,05 Cells day -1, για τις πρώτες πέντε ημέρες όπου διαρκούσε η εκθετική φάση. Στο δεύτερο πείραμα ο εκθετικός ρυθμός αύξησης έδειξε ότι το πείραμα με f/2-po 4 /4 εμφάνισε την υψηλότερη τιμή του με 2,39 ± 0,16 Cells day -1 κατά τις δύο πρώτες ημέρες όπου και διήρκησε η εκθετική φάση, εμφανίζοντας τις υψηλότερες τιμές διαιρέσεων ανά ημέρα. Το αποτέλεσμα αυτό συνηγορεί στο ότι η μείωση των PO 4 στο θρεπτικό μέσο δρα με θετικό τρόπο στην αύξηση του είδους, για τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Επίσης και ο περιορισμός NO 3 δρα θετικά στην αύξηση του είδους αλλά με μικρότερο ρυθμό από αυτόν του περιορισμού PO 4. 35

36 Ln Cell N 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Exponential Growth Rate f/ Days Growth rate f/2 -PO4/4 Σειρά1 Σειρά2 Σειρά3 y = 1,1418x + 9,001 R 2 = 0,9652 y = 1,2308x + 8,4874 y = 1,2092x + 8,2217 R 2 = 0,9522 R 2 = 0,9274 Ln Cell N 15,00 10,00 5,00 0,00 Exponential Growth rate f/2 - NO3/ ημέρες Exponential Growth rate f/2 - NO3/8 Ln 1 Ln 2 Ln 3 Γραμμική (Ln y = 1,7368x + 8,5819 R 2 = 0,9884 y = 1,4237x + 8,403 y = 1,6988x R 2 = 0, ,4088 R 2 = 0,9486 Ln Cell N 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0 0,5 1 ημέρες1,5 2 2,5 Σειρά1 Σειρά2 Σειρά3 y = 2,524x + 8,6646 R 2 = 0,9899 y = 2,4378x + 8,4492 R 2 = 0,9977 y = 2,211x + 9,2342 R 2 = 0,7602 Ln Cell N 16,00 14,00 Ln 1 12,00 Ln 2 10,00 Γραμμική (Ln 1) 8,00 Γραμμική (Ln 2) 6,00 4,00 y = 1,0671x + 8,7892 R 2 = 0,9586 2,00 y = 1,2546x + 8,0302 0,00 R 2 = 0, ημέρες Exponential Growth rate f/2 - PO4/8 Exponential Growth Rate f/2 - Μo/10 Ln Cell N 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Ln 1 Ln 2 Γραμμική (Ln 1) Γραμμική (Ln 2) y = 1,4077x + 8,0877 R 2 = 0,9728 y = 1,3308x + 8, Ημέρες R 2 = 0,9938 Ln Cell N 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική y = 0,7871x + 8,6011 R 2 = 0, y = 0,7531x + 8,2337 Ημέρες R 2 = 0,9294 Exponential Growth Rate f/2 - Metals/10 Exponential Growth Rate f/2 - Zn/10 Ln Cell N 12,00 10,00 Σειρά1 8,00 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά1) 6,00 Γραμμική (Σειρά2) 4,00 2,00 0,00 y = 0,2748x + 8,651 R 2 = 0,4591 y = 0,3699x + 8, Ημέρες R 2 = 0,8443 Exponential Growth Rate f/2 - Cu/10 Ln Cell N 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Ημέρες Growth Rate f/2 - Fe/10 Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά2) Γραμμική (Σειρά1) y = 0,6741x + 7,8052 R 2 = 0,8291 y = 0,7133x + 7,6849 R 2 = 0,9408 Ln Cell N 15,00 10,00 5,00 0, Ημέρες Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά2) Γραμμική (Σειρά1) y = 0,9316x + 7,3187 R 2 = 0,8239 y = 0,7543x + 8,8344 R 2 = 0,8951 Ln Cell N 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Ημέρες Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά2) Γραμμική (Σειρά1) y = -2,5552x + 10,075 R 2 = 0,6277 y = -0,1282x + 8,5917 R 2 = 0,6415 Exponential Growth Rate f/2 - Mn/10 Exponential Growth Rate f/2 - Co/10 Ln Cell N 9,60 9,40 9,20 9,00 8,80 8,60 8,40 8,20 8, Ημέρες Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά2) Γραμμική (Σειρά1) y = -0,0226x + 8,8296 R 2 = 0,0158 y = -0,1491x + 8,8553 R 2 = 0,3096 Ln Cell N 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Ημέρες Σειρά1 Σειρά2 Γραμμική (Σειρά1) Γραμμική (Σειρά2) y = 0,8087x + 7,9209 R 2 = 0,9066 y = 0,7713x + 8,4541 R 2 = 0,9719 Γράφημα 22: Οι εκτιμήσεις του ρυθμού αύξησης όλων των πειραμάτων κατά την εκθετική φάση με εφαρμογή παλινδρόμησης ελαχίστων τετραγώνων. 36

37 Ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης εμφανίστηκε στο f/2-po4/4, ενώ ο μέγιστος κυτταρικός αριθμός του f/2-metalls/10 εμφανίστηκε την 4 η ημέρα με κύτταρα, αριθμού σχεδόν 100 φορές μικρότερος από τον μέγιστο που εμφανίστηκε στο πρότυπο ενώ ο ρυθμός αύξησης της δοκιμασίας βρέθηκε να είναι -0,89 ±0,29 ενώ στο f/2 παρουσίασε ρυθμό αύξησης 1,19 ± 0,05 με 1,72 διαιρέσεις ανά ημέρα (γράφημα 14). Exponential Growth Rate Πειράματα f/2 - Fe/10 f/2 - Mn/10 f/2 - Zn/10 f/2 - Cu/10 f/2 - Mo/10 f/2 - Co/10 f/2 - Metalls/10 f/2 - NO3/8 f/2 - PO4/8 f/2 - NO3/4 f/2 - PO4/4 f/2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 Growth Rate (Cell N / Day) Γράφημα 14 : Ο ρυθμός ανάπτυξης (Growth Rate) με μονάδες μέτρησης log κυτταρικός αριθμός ανά ημέρα, υπολογισμένος κατά την διάρκεια εκθετικής φάσης των πειραμάτων. Τις περισσότερες διαιρέσεις ανά ημέρα εμφάνισε το πείραμα f/2-po4/4 ενώ στα πειράματα περιορισμού μεταλλικών ιχνοστοιχείων σημειωθήκαν οι χαμηλότεροι ρυθμοί αύξησης στα πειράματα f/2-mn/10 και f/2-(fe+edta)/10 (πίνακας 7). Πίνακας 7: Παρουσίαση του ρυθμού αύξησης, των διαιρέσεων ανά ημέρα και του χρόνου γενεάς για όλα τα πειράματα. Πείραμα Ρυθμός Αυξησης Τυπική απόκλιση Διαιρέσεις /ημέρα Χρόνος Γενεάς f/2 1,19 0,05 1,72 0,58 f/2-po4/4 2,39 0,16 3,45 0,29 f/2-no3/4 1,62 0,17 2,34 0,43 f/2-po4/8 1,37 0,05 1,98 0,51 f/2-no3/8 1,15 0,12 1,66 0,60 f/2-metalls/10 0,96 0,00 1,39 0,72 f/2-co/10 0,75 0,02 1,08 0,93 f/2-mo/10 0,77 0,02 1,11 0,90 f/2-cu/10 0,84 0,13 1,22 0,82 f/2-zn/10 0,69 0,28 1,00 1,00 f/2-mn/10-0,08 0,40-0,98-0,81 f/2-(fe+edta)/10-0,89 0,29-1,29-0,78 37

38 Χρόνος γενεάς Πειράματα f/2 - Fe/10 f/2 - Mn/10 f/2 - Zn/10 f/2 - Cu/10 f/2 - Mo/10 f/2 - Co/10 f/2 - Metalls/10 f/2 - NO3/8 f/2 - PO4/8 f/2 - NO3/4 f/2 - PO4/4 f/2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Γράφημα 23 : Ο χρόνος γενεάς ανά ημέρα, υπολογισμένος κατά την εκθετική φάση των όλων των πειραμάτων. Διαιρέσεις ανα ημέρα Πειράματα f/2 - Fe/10 f/2 - Mn/10 f/2 - Zn/10 f/2 - Cu/10 f/2 - Mo/10 f/2 - Co/10 f/2 - Metalls/10 f/2 - NO3/8 f/2 - PO4/8 f/2 - NO3/4 f/2 - PO4/4 f/2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Γράφημα 24 : Οι διαιρέσεις ανά ημέρα, υπολογισμένες κατά την εκθετική φάση των πειραμάτων. 38

39 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι λογαριθμημένοι κυτταρικοί αριθμοί που προήλθαν από τους μέσους όρους των επαναληπτικών δοκιμών για τα εργαστηριακά πειράματα: (f/2; f/2-po 4 /4; f/2-no 3 /4; f/2-po 4 /8; και f/2-no 3 /8) παρουσίασαν την τυπική σιγμοειδή καμπύλη ανάπτυξης φυτοπλαγκτού. Γενικότερα το γεγονός ότι εμφάνισαν σιγμοειδή καμπύλη αύξησης κατά τη διάρκεια καλλιέργειας ήταν επιθυμητό, επιτρέποντας την διεξαγωγή συμπερασμάτων, την σύγκριση των αποτελεσμάτων με άλλες μελέτες και τελικά την διερεύνηση των επιπτώσεων που έχει ο περιορισμός των θρεπτικών στο είδος P. delicatissima. Ενώ έγινε προσπάθεια διεξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν τους δυνητικούς παράγοντες επίδρασης της εμφάνισης αλλά και άνθισης/έξαρσης του είδους στα παράκτια οικοσυστήματα. Να σημειωθεί ότι στις 25 ημέρες καλλιέργειας δεν εμφανίστηκε φάση κατάρρευσης, γεγονός που μάλλον ήταν εξαρτημένο κυρίως από το μέγεθος εμβολιασμού. Ο περιορισμός Ρ & Ν εμφάνισε διαφορετική επιρροή στις αντίστοιχες θρεπτικές συνθήκες. Γενικότερα παρατηρήθηκε ότι ο περιορισμός του P και του N στο μέσο καλλιέργειας επηρέασε τον κυτταρικό αριθμό. Ο μέγιστος κυτταρικός αριθμός παρατηρήθηκε στο μέσο καλλιέργειας όπου δεν υπήρξε κανένας περιορισμός, ενώ ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης εντοπίστηκε στις θρεπτικές συνθήκες f/2-po 4 /4 όπου και υπολογίστηκε 2,39 ±0,16 δηλαδή διπλάσιος από τον ρυθμό του πρότυπου. Το γεγονός αυτό μαρτυρά ότι το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima αναπτύσσεται βέλτιστα υπό αυτές τις συνθήκες. Ενώ ο περιορισμός των βασικών θρεπτικών στο θρεπτικό μέσο, παρουσίασε πολύ διαφορετικές κατανομές των συγκεντρώσεων NO 2. Ο περιορισμός θρεπτικών συνέργησε στη μείωση των συγκεντρώσεων Chl a κατά τρείς περίπου φορές από αυτές που παρουσίασε το πρότυπο μέσο καλλιέργειας. Συγκεκριμένα τα αποτέλεσμα των συγκεντρώσεων των νιτρικών μπορούν να χαρακτηριστούν ως λογικά και εν μέρει αναμενόμενα, μίας και οι ελάχιστες συγκεντρώσεις ΝΟ 3 καταμετρήθηκαν στο μέσο καλλιέργειας όπου ο περιορισμός γίνονταν στο Ν. Ενώ όσον αφορά τις συγκεντρώσεις των ΝΟ 2 δεν μειώνονται στο μέσο που έχει περιορισμό P, αντιθέτως έχουν μια αυξητική τάση, ενώ οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις ΝΟ 2 παρουσιάστηκαν, όπως ήταν αναμενόμενο στο θρεπτικό μέσο με περιορισμό Ν. Τα αποτελέσματα των προκαταρκτικών καλλιεργειών, όπου τα θρεπτικά συστατικά επέστησαν μείωση κατά 20 και κατά 10 φορές δεν παρουσίασαν κυτταρική ανάπτυξη. Το γεγονός αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της έρευνας του Thessen (2009), όπου η μείωση του μέσου f/2 κατά 20 φορές εμφάνισε αξιοσημείωτους ρυθμούς αύξησης σε 4 είδη της οικογένειας Pseudonitzschia. Αν και από το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνεται η γενική βιολογική αρχή η οποία αναφέρει ότι κάθε είδος μπορεί να αναπτύσσεται υπό διαφορετικό εύρος συνθηκών αλλά και ότι κάθε είδος εμφανίζει διαφορετικούς ρυθμούς ανάπτυξης ανάλογα με το υπόστρωμα του (Anderson, 2008). Επίσης μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima πιθανόν δεν είναι ικανό να ανθίζει σε ολιγοτροφικές συνθήκες όπως αυτές που εκφράστηκαν μέσω των προκαταρκτικών καλλιεργειών. Όσον αφορά τις συγκεντρώσεις Chl a που έχουν μετρηθεί στο πεδίο, σε περιοχές της Μεσογείου όπου έχουν καταγραφεί περιστατικά ανθίσεων του είδους Pseudo-nitzschia delicatissima, διαπιστώθηκε ότι αυτές ήταν αρκετά χαμηλότερες από τις μετρούμενες όπου παρατηρήθηκαν στα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν τα ευρήματα της Quijano-Scheggia σε δυο κόλπους της Ισπανίας, όπου οι τιμές κυμαίνονται στα 4.8 ± 2.8 μg L -1 με κυτταρική πυκνότητα της τάξεως των 2*10 6 κυττάρων ανά λίτρο. Ενώ οι Klein et al. (2010) κατέγραψαν 13,4 ± 0,9 mg L -1 για κυτταρική πυκνότητα της τάξεως των 10 3 cell L

40 Φυσικά θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι στο εργαστηριακό πείραμα των Loureiro et al (2009), οι εργαστηριακές μετρήσεις της Chl a σε τρείς διαφορετικές οργανικές θρεπτικές συνθήκες, σε καλλιέργειες του Pseudo-nitzschia delicatissima, παρουσίασαν διαφοροποιήσεις ως προς τις μετρήσεις Chl a, στο χρόνο, συγκρινόμενες με αυτές της παρούσας εργασίας. Τα αποτελέσματα της Loureiro εμφάνισαν αύξηση που ήταν σχεδόν παρόμοια στις διαφορετικές καλλιέργειες (1,64 διαιρέσεις ανά ημέρα), και αντίστοιχα οι τιμές της Chl a ήταν ίδιες για τις 4 πρώτες ημέρες των πειραμάτων της, παρουσιάζοντας διαφορές μετά την 4 η ημέρα. Συγκεκριμένα oι υψηλότερες συγκεντρώσεις εμφανίστηκαν την 10 η ημέρα με 32,6 mg/l και οι χαμηλότερες στα (-N+DOM) 7,1 mg/l πάλι την 10 η ημέρα. Αν και θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποίησε περιείχε περισσότερα μεταλλικά ιχνοστοιχεία (μέσο L1) από το f/2. Μέσω της σύγκρισης των αποτελεσμάτων της παρούσας εργασίας με άλλες μελέτες έγινε φανερό ότι έχουν μετρηθεί συγκεντρώσεις Chl a πολύ πιο υψηλές από αυτές που έχουν παρατηρηθεί τόσο σε εργαστηριακά πειράματα όσο και στα φυσικά θαλάσσια οικοσυστήματα. Αν και θεωρήθηκε λογικό να είναι χαμηλότερες οι συγκεντρώσεις στο πεδίο, μιας και οι παράγοντες επιρροής είναι πολύ πιο σύνθετοι (π.χ. ανταγωνισμός, θήρευση κ.α.) σε σχέση με τις εργαστηριακά ελεγχόμενες συνθήκες, με αποτέλεσμα των υποβάθμιση αυτή. Επίσης οι υψηλές συγκεντρώσεις Chl a (357,8 ±38,6 mgr/l) πιθανότατα να μαρτυρούν βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης του είδους στο μέσο καλλιέργειας f/2. Στην συνέχεια και όσον αφορά το άζωτο έχει αποδειχθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό ανθίσεων για αρκετά είδη Pseudo-nitzschia (π.χ. P. pungens κατά Smith et al., 1990). Το Άζωτο εμφανίζεται σε πολλές διαθέσιμες μορφές στο θαλάσσιο περιβάλλον: ως ανόργανο αμμώνιο, νιτρικά, νιτρώδη ή ως οργανική ουρία, ή αμινοξέα. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι μορφές NO 3 και NO 2 όπου και μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις αυτών στο πέρας των ημερών. Συγκεκριμένα οι κατανομές NO 2 (γράφημα 3) των τριών πειραμάτων (f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4) διέφεραν μεταξύ τους αλλά όπως ήταν αναμενόμενο, οι μικρότερες συγκεντρώσεις εμφανίστηκαν κατά την διάρκεια έναρξης των πειραμάτων και για τα τρία πειράματα, ενώ θεωρήθηκε λογικό το γεγονός ότι η μικρότερη συγκέντρωση NO 2 εμφανίστηκε στο πείραμα όπου το Ν ήταν μειωμένο (f/2- NO 3 /4). Όσον αφορά τις κατανομές των NO 3, (γράφημα 4) εμφάνισαν παρόμοιες τάσεις με πιο ισορροπημένες κατανομές σε σχέση με αυτές των NO 2, χωρίς παρουσία αποκλίσεων, ενώ οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις καταγράφηκαν στο πείραμα όπου το Ν ήταν μειωμένο (f/2-no 3 /4). Τέλος να σημειωθεί ότι όσον αφορά το πείραμα με μειωμένο Ρ (f/2-ρo 4 /4) παρουσίασε παρόμοια κατανομή με το πείραμα χωρίς περιορισμούς (f/2) εμφανίζοντας όμως ελαφρώς χαμηλότερες συγκεντρώσεις NO 3 από το πρότυπο μέχρι και την 6 η ημέρα, όπου και σταθεροποιήθηκε από εκεί και μετά. Το γεγονός αυτό συνηγορεί στο ότι η μείωση P στο μέσο καλλιέργειας δεν επιδρά στην συγκέντρωση NO 3. Οι κατανομές NO 3 και NO 2 που έδωσαν οι εργαστηριακές μετρήσεις για τις τρείς πειραματικές θρεπτικές συνθήκες (f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4) οι οποίες παρουσιάστηκαν παραπάνω, μπορούν να ερμηνευτούν εν μέρει με τις διεργασίες που συμβαίνουν στα φυσικά οικοσυστήματα και συγκεκριμένα κατά την διάρκεια ευτροφικών συνθηκών. Το διαθέσιμο άζωτο καταναλώνεται από τους οργανισμούς υπό μορφή NO 3 και ως δευτερογενές υλικό εμφανίζεται μια ταυτόχρονη αύξηση των NO 2. Η συμπεριφορά αυτή εμφανίστηκε κατά την διάρκεια των πειραμάτων όπου έγινε φανερό πως η αύξηση του πληθυσμού των Pseudo-nitzschia delicatissima συνεπαγόταν με υποβάθμιση των συγκεντρώσεων NO 3, πιθανότατα λόγο των αυξημένων θρεπτικών αναγκών, ενώ καταγράφηκε μια ταυτόχρονη μείωση των NO 2 (γράφημα 5). Από μελέτες πεδίου έχει πλέον αποδειχθεί ότι τα νιτρικά και τα νιτρώδη παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη αφθονία του Pseudo-nitzschia delicatissima. Για παράδειγμα στον κόλπο Fundy στον 40

41 Καναδά, η αφθονία του είδους συσχετίστηκε θετικά με τις ποτάμιες εισροές Αζώτου. Η ανάλυση της δυναμικής των P. delicatissima (και P. pseudodelicatissima) και των περιβαλλοντικών παραμέτρων της περιοχής, έδειξε την σημασία των συγκεντρώσεων NO 3 και NO 2 στην αφθονία αυτών των ειδών (Kaczmarska et al. 2008). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των διατόμων και των υπολοίπων φυτοπλαγκτικών ειδών είναι ότι τα διάτομα έχουν ανάγκη από πυρίτιο ώστε να σχηματίσουν το κυτταρικό τους τοίχωμα. Οι απαιτήσεις για την δημιουργία αυτού του πυριτικού τοιχώματος κάνουν τα διάτομα μοναδικώς εξαρτημένα από την διαθεσιμότητα του πυριτίου για τη συνεχή τους αύξηση και ανάπτυξη. Ο περιορισμός του Si είναι ικανός να επηρεάσει τον κυτταρικό κύκλο και συγκεκριμένα το στάδιο ανάμεσα της μίτωσης και της θυγατρικής κυτταρικής διαίρεσης, όπου είναι η στιγμή αυτή κατά την οποία γίνεται η πρόσληψη του Si και η καθίζηση του νέο-σχηματισμένου τοιχώματος. Έχει επίσης αναγνωριστεί ότι το Si είναι ένα σημαντικό συστατικό των κυτταρικών διαδικασιών των διατόμων όπως είναι η διαδικασία αντιγραφής DNA και η πρωτεΐνοσύνθεση (Sullivan et al. 1981). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων συμφωνούν με άλλα εργαστηριακά πειράματα όπου έχει αποδειχθεί ότι οι πληθυσμοί διατόμων μειώνουν τις συγκεντρώσεις πυριτίου. Ενώ στα παράκτια ύδατα είναι γνωστό ότι η κυτταρική αύξηση περιορίζεται σημαντικά από την έλλειψη πυριτικών μόνο όταν τα περισσότερα από τα πυριτικά εξαντληθούν εξαιτίας της άνθισης (Paasche et al., 1973). Από τα προαναφερθέντα φαίνεται λογικό ότι η διαθεσιμότητα του Si ρυθμίζει την αύξηση των διατόμων στα φυσικά οικοσυστήματα και πιθανότατα και στις ισχύουσες πειραματικές δοκιμασίες. Το συνολικό ποσό του διαθέσιμου πυριτίου θα πρέπει να ορίζει ένα ανώτατο όριο στο μέγεθος της άνθισης/έξαρσης. Επίσης υπάρχει η πιθανότητα ότι τα επίπεδα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μπορεί να περιορίζονται από τις πρωταρχικές συγκεντρώσεις πυριτίου ακόμα και πριν εξαντληθούν τα χρησιμοποιούμενα πυριτικά. Στη παρούσα περίπτωση το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας περιείχε το συστατικό Na 2 SiO 3 9H 2 O το οποίο ήταν η μοναδική πηγή Si με μοριακή συγκέντρωση στο τελικό μέσο με 106 μμ, για όλες τις πειραματικές διαδικασίες, και πιθανότατα ορίζει το ανώτατο όριο της κυτταρικής αύξησης. Το γεγονός ότι οι συγκεντρώσεις SiΟ 2 (μμ) παρουσίασαν μείωση σε όλες τις καλλιέργειες κατά διάρκεια της εκθετικής αύξησης των πρώτων ημερών της πειραματικής διαδικασίας είναι άμεσα συσχετιζόμενο με το σχηματισμό των κυτταρικών τοιχωμάτων. Αν και πρέπει να σχολιαστεί το γεγονός ότι για τις πειραματικές διεργασίες όπου επετεύχθησαν στη παρούσα μελέτη οι αρχικές συγκεντρώσεις της πηγής του πυριτίου ήταν στα 106 μμ, όμως στο πείραμα χωρίς κανένα περιορισμό (f/2) η μετρούμενη συγκέντρωσή που καταγράφηκε για την πρώτη ημέρα, ήταν μεγαλύτερη από την αρχική που περιείχε το μέσο. Το γεγονός αυτό ίσως να μπορεί να σημαίνει ότι έχει επέλθει σφάλμα κατά την διάρκεια των εργαστηριακών αναλύσεων πιθανότατα εξαιτίας επιμόλυνσης. Αν και θα ήτο φρόνιμο να γίνει επανάληψη των μετρήσεων αυτών ώστε να εξαλειφθούν οι υποψίες στοχαστικότητας. Η Quijano-Scheggia (2008 & 2009) μετά από δειγματοληψίες πεδίου κατά την διάρκεια άνθισης του Pseudo-nitzschia delicatissima (σε δύο κόλπους της B.Δ. Μεσόγειο) βρήκε ότι οι συγκεντρώσεις SiO 2 κυμαίνονταν από 13,54 έως 0,25 μμ με μέσο 5,31 ± 3,7 μμ στο κόλπο Alfacs και από 37,73 ως 3,58 μμ με μέσο 12,45 ± 8,47 μμ στον κόλπο Fanqar. Ενώ σε πειραματικές καλλιέργειες του είδους, ο μέσος όρος των πυριτικών για καλλιέργεια σε παρόμοιες συνθήκες μα με διαφορετικό θρεπτικό μέσο εμφάνισαν μέσο όρο 70 μμ, με μια αρχική αλλά και μια τελική μείωση κατά τις πρώτες και τις τελευταίες ημέρες (Loureiro, 2009). Διαπιστώνεται λοιπόν ότι στα πειράματα f/2 και f/2-po4 οι μετρήσεις των συγκεντρώσεων SiO 2 παρουσίασαν πολύ πιο υψηλές τιμές από αυτές που έχουν παρατηρηθεί σε φυσικά θαλάσσια οικοσυστήματα όπου έχει παρατηρηθεί άνθιση του συγκεκριμένου είδους. Ενώ τα αποτελέσματα μας είναι παρόμοια με αυτά της Loureiro (2009). 41

42 Όσον αφορά τις συγκεντρώσεις των φωσφορικών για τα πειράματα (f/2, f/2-po 4 /4 και f/2-no 3 /4), η μελέτη της σχέσης του κυτταρικού αριθμού με την κατανομή των PO 4 φανέρωσε μία πτώση των συγκεντρώσεων του θρεπτικού όταν αυξάνει ο κυτταρικός αριθμός και μάλιστα τα μέγιστα του κυτταρικού πληθυσμού συμπίπτουν με τις ελάχιστες τιμές συγκεντρώσεων (γράφημα 8) όπου πιθανόν αυτό οφείλεται στο ότι τα κύτταρα χρησιμοποιούν Τρι-φωσφορική αδενοσίνη - ATP, αποσυνθέτοντας πρωτεΐνες και αμινοξέα ώστε να απελευθερώσουν την απαιτούμενη ενέργεια για τις διαδικασίες της ζωής. Οι πρωτεΐνες και τα αμινοξέα είναι οργανικά συστατικά τα οποία περιέχουν φώσφορο (P). Όταν τα NO 3 δεν περιορίζονται στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας τότε τα οργανικά αυτά συστατικά βρίσκονται σε αφθονία μέσα στα κύτταρα. Όταν όμως τα NO 3 περιορίζονται στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας τότε δεν υπάρχει περίσσεια Ρ ώστε να συντεθούν πρωτεΐνες και αμινοξέα. Είναι λοιπόν πιθανόν ότι τα κύτταρα ξεκινούν να καταναλώνουν πρωτεΐνες και αμινοξέα πού είναι βασικά για το κύτταρο. Για να γίνει όμως αυτό υπάρχει ανάγκη περισσότερου ATP, δηλαδή P, και πιθανόν η ανάγκη αυτή καλύπτεται με την εξάντληση του διαθέσιμου Φωσφόρου στο θρεπτικό μέσο. Είναι πλέον αποδεδειγμένο από αρκετούς ερευνητές ότι οι ανθίσεις των ειδών Pseudonitzschia blooms μπορούν να διεγερθούν και εν μέρει να προκληθούν από τα θρεπτικά μέσω δύο πηγών: από περιστατικά ανάδυσης υδάτων (upwelling) ή από συνδυασμό περιστατικών και ποτάμιων εισροών. Όμως και οι δύο αυτές πηγές είναι ικανές να πυροδοτούν εξάρσεις Pseudonitzschia σε συγκεντρώσεις των 8-22 μm NO 3, 2,4-35 μm Si, μm PO 4 (Loureiro et al., 2009), αλλά σε διαφορετικά καθεστώτα θερμοκρασίας και αλατότητας. Τα μάκροθρεπτικά που έχουν υψηλή δυναμική, και μπορούν να γίνουν περιοριστικά της ανάπτυξης, απαιτούνται συνήθως σε υψηλές συγκεντρώσεις από τους οργανισμούς. Ο Ρ και το Ν είναι τα κυριότερα κυτταρικά συστατικά των οργανισμών. Δοθέντος του ότι η διαθεσιμότητα αυτών μπορεί να είναι μικρότερη από την βιολογικά απαιτούμενη, οι περιβαλλοντικοί πόροι μπορούν να ρυθμίσουν ή να περιορίσουν την παραγωγικότητα των οργανισμών στα υδατικά οικοσυστήματα (Brzezinski, 1985),(θρεπτικός περιορισμός). Η δυναμική του φυτοπλαγκτού σχετίζεται πρωτίστως με τη χωρική και χρονική μεταβολή των κυρίων μεταλλικών (ανόργανων) θρεπτικών ιόντων. Ο Redfield (1958) όρισε ότι το θαλάσσιο φυτοπλαγκτόν που αναπτύσσεται στα μέγιστα τάχη αύξησης, κατείχε μια χαρακτηριστική αναλογία κυρίων θρεπτικών στοιχείων του τύπου C:Ν:P:S = 106:16:1:0.7. Το φυτοπλαγκτόν θα πρέπει να τηρεί την αναλογία Redfield (Redfield ratio), αναπτυσσόμενο πολύ κοντά στο μέγιστο τάχος αύξησης των ειδών, όταν τα θρεπτικά δεν είναι περιοριστικά. Αντιστρόφως, το φυτοπλαγκτόν θα παρεκκλίνει από την αναλογία Redfield, όταν κάποιο από τα κύρια θρεπτικά στοιχεία είναι περιοριστικό και τα είδη θα αυξάνονται με ρυθμό μικρότερο του μεγίστου τάχους αύξησής τους. Ο περιορισμός της αύξησης λόγω ενός επιμέρους θρεπτικού μπορεί να αποδειχθεί με την εφαρμογή μιας απλής δοκιμής. Εάν η προσθήκη ενός θρεπτικού προκαλεί τον πολλαπλασιασμό του φυτοπλαγκτικού πληθυσμού, τότε το θρεπτικό αυτό ήταν περιοριστικό για την αύξηση του πληθυσμού (Graham et al., 2009). Όπως υποδεικνύεται από την αναλογία Redfield, το φυτοπλαγκτόν απαιτεί φώσφορο σε σχετικώς μικρές ποσότητες σε αντιδιαστολή με τον άνθρακα, το άζωτο και το πυρίτιο. Ωστόσο, ο φώσφορος είναι συχνά περιοριστικός της αύξησης στα γλυκέων-υδάτων οικοσυστήματα, επειδή συχνά περιέχεται σε μικρές ποσότητες σε πολλές λεκάνες απορροής και επειδή ενώνεται με ιόντα μετάλλων προς σχηματισμό κατακρημνισμάτων στα λιμναία ιζήματα. Στην παρούσα εργασία όταν το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας δεν υπέστη κανένα περιορισμό ως προς τα θρεπτικά του ο λόγος Redfield N:P ήταν 24,3:1, ενώ όταν περιορίζονταν τα PO 4 στο πείραμα με f/2-po 4 /4, ο λόγος Redfield N:P έγινε 97,5:1, ενώ στο πείραμα όπου f/2-po 4 /8 ο λόγος ήταν 195:1. Και στις τρείς αυτές περιπτώσεις το στοιχείο που έλεγχε την κυτταρική ανάπτυξη ήταν το Ρ, δρώντας ως περιοριστικό θρεπτικό. Αντιθέτως όταν το Ν έδρασε ως περιοριστικό θρεπτικό οι λόγοι Redfield N:P που 42

43 καταγράφηκαν ήταν 6,1:1 για το πείραμα f/2-no 3 /4 και 3,04:1 στο πείραμα με f/2 - NO 3 /8. Οι αποκλίσεις αυτές, του λόγου αζώτου προς φώσφορο από το λόγο του Redfield (Ν:Ρ < 16:1 ή Ν:Ρ > 16:1) που υποδεικνύουν έλλειμμα του αζώτου ως προς το φώσφορο και αντίστροφα, έχει διαπιστωθεί ότι επηρεάζουν την φυσιολογία των επιβλαβών μικροφυκών, και ως εκ τούτου και το Pseudo-nitzschia delicatissima όπου για παράδειγμα προκαλούν επιβράδυνση της κυτταρικής αύξησης (Granelli et al., 2006) αν και ο προτεινόμενος λόγος Redfield-Brzezinski θρεπτικών για τα διάτομα είναι C:Si:N:P = 106:15:16:1 (Brzezinski, 1985). Αν και κρίνεται αναγκαία η περεταίρω μελέτη του λόγου Redfield, ώστε να διεξαχθούν αποτελέσματα τις εξέλιξης του στο χρόνο, και σύγκριση αυτών με το ρυθμό αύξησης της κάθε πειραματικής καλλιέργειας. Ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει η σύγκρισή αυτού με τα αποτελεσματα τις εργασίας των Hillebrand et al., (1996). Η Smayda (1997) υποστήριξε ότι οι χαμηλές τιμές των λόγων πυριτίου προς άζωτο (Si:N < 1:1) και πυριτίου προς φώσφορο (Si:P < 16:1) υποδεικνύουν έλλειμμα του πυριτίου ως προς το άζωτο και ως προς τον φώσφορο αντίστοιχα και απαντούν συχνά σε ευτροφικές παράκτιες περιοχές. Τα αποτελέσματα της παρούσας πτυχιακής φανέρωσαν ότι οι λόγοι Redfield Si:N και Si:P για όλα τα πειράματα ήταν πάντα > 0.1 γεγονός που φανερώνει έλλειμμα Si κατά την ημέρα έναρξης των πειραμάτων. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω μπορεί να διεξαχθεί το συμπέρασμα ότι οι θρεπτικές συνθήκες όπου και χρησιμοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπαριστούν ευτροφικές συνθήκες καλλιέργειας. Η εμφάνιση ανθίσεων/εξάρσεων που αποτελούνται από είδη της οικογένειας Pseudo-nitzschia, έχει συσχετιστεί με υψηλές συγκεντρώσεις θρεπτικών σε αρκετές περιοχές (Spatharis et al., 2007). Οι ανθρωπογενείς προσθήκες αζώτου ή/και φωσφόρου σε παράκτιες περιοχές αλλάζουν τη σχετική αναλογία του αζώτου (Ν) προς τον φώσφορο (Ρ) και το πυρίτιο (Si) σε σύγκριση με το λόγο του Redfield (Si:N:P = 16:16:1) με αποτέλεσμα να μεταβάλλεται η σύνθεση, η αφθονία και η διαδοχή των ειδών στις κοινωνίες του φυτοπλαγκτού. Για παράδειγμα εξαιτίας των εισροών Ν ή/και Ρ, η αφθονία των διατόμων μπορεί να αυξάνεται σημαντικά σε μία παράκτια περιοχή, με συνέπεια την μείωση των συγκεντρώσεων Si και επομένως την μείωση των διατόμων στη συνέχεια, την οποία συχνά διαδέχονται επιβλαβή δινομαστιγωτά (Anderson et al. 2008). Ενώ είναι δυνατόν να πρέπει να ληφθεί υπόψη και ο παράγοντας του συμπεριορισμού ο οποίος έχει ανιχνευτεί σε ορισμένα υδατικά οικοσυστήματα. Παράδειγμα περιοριστικού παράγοντα για την αύξηση του φυτοπλαγκτού στη δυτική λίμνη Superior των ΗΠΑ είναι γενικώς ο φώσφορος. Ωστόσο, η προσθήκη φωσφόρου είχε ως αποτέλεσμα ελάχιστη μόνον αύξηση, επειδή ο σίδηρος έγινε περιοριστικός παράγοντας για το φυτοπλαγκτόν. Κατά διαστήματα, τα στοιχεία άζωτο, φώσφορος και σίδηρος ενδέχεται να είναι συμπεριοριστικά στη λίμνη Erie. Προσθήκη αυτών των τριών θρεπτικών αύξησε τη βιομάζα του φυτοπλαγκτού περισσότερο από ό,τι ο επιμέρους εμπλουτισμός με N, P και Fe. Ο συμπεριορισμός των θρεπτικών ίσως αποδειχθεί ευρύτατα διαδεδομένος στα υδατικά οικοσυστήματα (Graham et al., 2009). Η εξέταση της επιρροής του περιορισμού των μεταλλικών ιχνοστοιχείων στο πείραμα με f/2- metals/10 έδειξε μία εμφανή πτώση της τυπικής καμπύλης ανάπτυξης με μειωμένους κυτταρικούς αριθμούς σχεδόν και 100 φορές μικρότερες από αυτές του πειράματος f/2. Το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με την γενική βιολογική αρχή που αναφέρει ότι αρκετά ιχνοστοιχεία και συγκεκριμένα τα μεταλλικά ιχνοστοιχεία είναι απαραίτητα για τις βιολογικές απαιτήσεις των φυτοπλαγκτονικών κυττάρων (Wang et al., 2001), μιας και ο περιορισμός συντέλεσε στη μείωση του κυτταρικού αριθμού (γράφημα 11). Σε αυτή την πειραματική δοκιμασία το f/2-metals/10 περιείχε έξι (Fe, Zn, Cu, Mo, Co, Mn) ιχνοστοιχεία εκ των οποίων η πιθανότατα κάποια από αυτά, να μην είχαν καμία δράση στο παραπάνω συμπέρασμα λήφθηκε σοβαρά υπόψη. Για τον λόγο αυτό κρίθηκε απαραίτητη η μεμονωμένη εξέταση αυτών και τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν στο γράφημα 12, 43

44 φανέρωσαν διαφορετικές καμπύλες ανάπτυξης σε σχέση με το f/2 αλλά και μεταξύ τους, επιβεβαιώνοντας την αρχική υπόθεση της μεμονωμένης επιρροής. Συγκεκριμένα έγινε αντιληπτό ότι οι πειραματικές δοκιμασίες με θρεπτικές συνθήκες που περιείχαν μειωμένα τα: f/2-co/10, f/2-mo/10, f/2-zn/10 και f/2-cu/10 είχαν στατιστικά όμοιους διάμεσους με μέσο όρο κυτταρικού αριθμού περίπου 113 cell N/ ml ενώ οι αντίστοιχοι ρυθμοί αύξησης ήταν: 0,75 ±0,02; 0,77 ±0,02; 0,69 ±0,28 και 0,84 ±0,13 κύτταρα ανά ημέρα. Ενώ διαπιστώθηκε μετά από σύγκριση με το πρότυπο πείραμα f/2, ότι οι διαφοροποιήσεις ήταν ναι μεν αξιοσημείωτες μα χωρίς να παρουσιάζουν ακραίες διακυμάνσεις ως προς αυτό. Έγινε αντιληπτό ότι η αύξηση του Pseudonitschia delicatissima δεν επηρεάζεται πολύ από αυτά τα ιχνοστοιχεία αν και οι ρυθμοί αύξησης ήταν χαμηλότεροι από το f/2 (1,19 ± 0,05). Τα αποτελέσματα φανέρωσαν ότι την μεγαλύτερη επιρροή στην αύξηση του μελετώμενου είδους άσκησαν οι πειραματικές θρεπτικές συνθήκες με το f/2-(fe+edta)/10 και το f/2-mn/10. Οι χαμηλότεροι κυτταρικοί αριθμοί παρουσιαστήκαν στα πειράματα αυτά με μέσους 26,3 και 37,5 για το f/2-(fe+edta)/10 και το f/2-mn/10 αντίστοιχα. Συγκεκριμένα στα πειράματα αυτά δεν υπήρξε αξιοσημείωτη κυτταρική αύξηση ενώ ήταν εμφανής η ακραία απόκλιση από την τυπική καμπύλη ανάπτυξης φυτοπλαγκτού, με ξεκάθαρα ασαφή όρια μεταξύ εκθετικής και στάσιμης φάσης. Ο ρυθμός αύξησης για το f/2-(fe+edta)/10 εμφανίστηκε αρνητικός, γεγονός που σημαίνει ότι ο περιορισμός ασκεί τεράστια επιρροή στην αύξηση του Pseudo-nitschia delicatissima με καθαρά περιοριστικό τρόπο, ασκώντας την πιο έντονη επιρροή σε σχέση με τις συνθήκες που μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Αν και στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι στη φύση ο σίδηρος έχει συχνά αναφερθεί ως περιοριστικός παράγοντας, και ειδικά στους ωκεανούς. Στον υπαρκτικό και ισημερινό Ειρηνικό Ωκεανό και στον Νότιο Ωκεανό πέριξ της Ανταρκτικής, αραιοί φυτοπλαγκτικοί πληθυσμοί εντοπίζονται παρουσία σχετικώς υψηλών επιπέδων αζώτου και φωσφόρου. Στους ωκεανούς αυτούς, έχει διαπιστωθεί ότι ο σίδηρος περιορίζει την παραγωγικότητα. (Graham et al., 2009). Ο Graham αναφέρει στο βιβλίο του ότι ο αμιγής ρυθμός αύξησης ενδέχεται να είναι είτε θετικός είτε αρνητικός. Ό αρνητικός ρυθμός αύξησης που παρουσιάστηκε τόσο στο πείραμα f/2-(fe+edta)/10 μα και στο f/2-mn/10 σημαίνει ότι πιθανότατα ο πληθυσμός μειώνεται σε αριθμούς κυττάρων. Γενικότερα οι πληθυσμοί καταλαμβάνουν χώρο, επιδεικνύουν διάφορα επίπεδα κινητικότητας και κατανέμονται με ποικίλα πρότυπα στον χρόνο και στον χώρο. Οι πληθυσμοί χαρακτηρίζονται από το γεγονός ότι αναπτύσσονται, δηλαδή μεταβάλλονται σε μέγεθος και πυκνότητα. έννοια του ρυθμού αύξησης είναι ουσιώδης για την περιγραφή της δυναμικής των πληθυσμών. Ο ρυθμός αύξησης είναι μια μέτρηση της ταχύτητας ανάπτυξης ή ένας δείκτης αναφοράς πολλαπλασιασμού στο χρόνο. Στα περισσότερα πειράματα ο ρυθμός αύξησης ήταν θετικός, το γεγονός αυτό σημαίνει ότι οι πληθυσμοί του P. delicatissima αυξάνονταν σε κυτταρικούς αριθμούς. Επίσης οι διαφορετικές θρεπτικές συνθήκες που δοκιμάστηκαν μέσω των διαφορετικών πειραμάτων παρουσίασαν διαφορετικά πρότυπα καμπυλών ανάπτυξης. Είναι γνωστό ότι η εκθετική φάση αύξησης είναι ένα πρότυπο ισορροπημένης ανάπτυξης όπου όλα τα κύτταρα διαιρούνται ανελλιπώς με διάδικο διαχωρισμό και αυξάνουν με γεωμετρική πρόοδο (Andersen, 2005), το γεγονός αυτό επιβεβαιώθηκε στην παρούσα εργασία. Στα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν φάνηκε ότι τα κύτταρα διαιρούνταν με ένα σταθερό ρυθμό και ήταν πάντα εξαρτημένα από την σύνθεση του θρεπτικού μέσου και της συνθήκες εμβολιασμού. Αν και η λογαριθμική φάση των καλλιεργειών εξαρτάται από το είδος που εμβολιάστηκε, έγινε φανερό ότι η διάρκεια της εκθετικής φάσης διέφερε σε κάθε θρεπτική συνθήκη. Ο ρυθμός εκθετικής αύξησης των καλλιεργειών όταν εκφράστηκε με το χρόνο γενεάς, φάνηκε ότι δεν παρουσίασε ανάλογες τιμές με αυτές του ρυθμού αύξησης. 44

45 Σε όλες τις θρεπτικές συνθήκες καταγράφηκε περιορισμός της αύξησης των πληθυσμών γεγονός που μπορεί να ερμηνευτεί με τους εξής πιθανούς παράγοντες: απο εξάντληση των διαθέσιμων θρεπτικών ουσιών, από συσσώρευση ανασταλτικών μεταβολιτών και προϊόντων, ή από εξάντληση χώρου, αυτή η περίπτωση ονομάζεται κενό βιολογικού χώρου. Το σημείο αυτό καλείται στάσιμη φάση (Stationary Phase). Σε όλες τις πειραματικές δοκιμασίες της παρούσας εργασίας παρουσιάστηκε στατική φάση, χωρίς όμως να είναι δυνατό να διακριθεί αν ορισμένα κύτταρα πεθαίνουν ή αν ισάριθμα κύτταρα δημιουργούνται, ή αν ο πληθυσμός των κυττάρων έχει απλά σταματήσει την αύξηση και τη διαίρεση. Η στάσιμη όπως και η εκθετική φάση δεν είναι απαραίτητα μια περίοδος απραξίας. Οι οργανισμοί όπου παράγουν δευτερογενείς μεταβολίτες, το κάνουν κατά την διάρκεια αυτής της φάσης του κύκλου αύξησης τους (Andersen, 2005). Ως εκ τούτο συνεπάγεται ότι κατά τη διάρκεια της στατικής φάσης ο ρυθμός αύξησης όλων των πειραμάτων μειώθηκε, και πιθανότατα αυτό εμφανίστηκε ως αποτέλεσμα της εξάντλησης θρεπτικών και την πιθανή παραγωγή τοξινών. Αν και πιθανόν να αξίζει να ληφθεί υπόψη σε επόμενες μελέτες και η ουρία μιας και έχει βρεθεί τόσο στο πεδίο μα και σε πειράματα εργαστηρίου που διεξήχθησαν από τους Howard et al. 2007) ώστε να προσδιοριστεί η διαφορετική απόκριση στην αύξηση, όταν γίνεται προσθήκη οργανικών και ανόργανων θρεπτικών σε είδη Pseudo-nitzschia. Η εργασία αυτή φανέρωσε ότι το P. australis είναι ικανό να αυξάνει αποτελεσματικά σε ουρία. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι η ουρία που προέρχεται από παράκτιες απορροές μπορεί να είναι ένας πιο σημαντικός λόγος για τη διατήρηση τοξικών ανθίσεων (blooms) και ότι η πηγή των θρεπτικών μπορεί να είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της τοξικότητας του P. australis. Ο εκθετικός ρυθμός αύξησης έδειξε ότι το πείραμα με f/2-po 4 /4 εμφάνισε την υψηλότερη τιμή του με 2,39 ±0,16 Cells day -1 κατά τις δύο πρώτες ημέρες όπου και διήρκησε η εκθετική φάση, εμφανίζοντας τις υψηλότερες τιμές διαιρέσεων ανά ημέρα. Το αποτέλεσμα αυτό συνηγορεί στο ότι η μείωση των PO 4 στο θρεπτικό μέσο δρα με θετικό τρόπο στην αύξηση του είδους, για τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Επίσης και ο περιορισμός NO 3 δρα θετικά στην αύξηση του είδους αλλά με μικρότερο ρυθμό από αυτόν του περιορισμού PO 4. Επίσης έγινε φανερό ότι ο περιορισμός Ρ και ο περιορισμός Ν επηρεάζουν τον κυτταρικό αριθμό, μα και το ρυθμό αύξησης αυτού. Ο τρόπος επιρροής όμως είναι αντίθετος από τον αναμενόμενο μιας και περιμέναμε η κυτταρική κατανομή να είναι αντίστοιχή του εκάστοτε βαθμού πίεσης που ασκεί το θρεπτικό. Ενδεικτικό είναι το γεγονός ότι στην εργασία της Quijano-Scheggia (2008) όπου και καλλιεργήθηκε το είδος Pseudo-nitzschia delicatissima σε παρόμοιες πειραματικές συνθήκες με αυτές τις παρούσας εργασίας, αλλά με την διαφορά στον κύκλο ημέρας νύχτας (12:12 L:D) βρήκε ότι ο ρυθμός αύξησής του ήταν 1,61 Cells day -1, σχεδόν παρόμοιος με τα αποτελέσματα του ρυθμού αύξησης του πειράματος με f/2-no 3 /4 της παρούσας εργασίας. Η εξέταση της επίδρασης του αζώτου στην αύξηση ορισμένων ειδών Pseudo-nitzschia, που εφαρμόστηκε από τον Thessen (2009), κάνοντας χρήση μέσου f/2 (αλλά με διαφορετικές συνθήκες από την παρούσας εργασίας 15 ο C και με κύκλο ημέρας νύχτας 14:10), έδειξε ότι κάθε ένα είδος παρουσίασε διαφορετική επιρροή ρυθμού αύξησης για παρόμοιες πειραματικές συνθήκες. Όπως προλέχθηκε ο ρυθμός αύξησης κατά την διάρκεια της εκθετικής αύξησης, υπό σταθερές θρεπτικές συνθήκες (θρεπτικό μέσο, θερμοκρασίας, κτλ.), ορίζει το χρόνο γενεάς ενός οργανισμού. Ο χρόνος γενεάς όπως σε όλα τα ειδή έτσι και σε αυτά τις οικογένειας Pseudo nitzschia ποικίλει από είδος σε είδος (Bates, 1989). Τα αποτελέσματα φανέρωσαν ότι ο χρόνος γενεάς του P. delicatissima εξαρτάται από το υπόστρωμα καλλιέργειας, ενώ φάνηκε ότι είδη με μεγάλο ρυθμό αύξησης δεν έχουν απαραίτητα και γρήγορο χρόνο γενεάς (π.χ. f/2-po 4 /4). Να σημειωθεί ότι οι αρνητικές τιμές του χρόνου γενεάς δεν έχουν υπόσταση ως μετρούμενο μέγεθος (χρόνος σε ημέρες) αλλά ενισχύουν εμμέσως την μείωση της αρχικής κυτταρικής πυκνότητας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι περισσότερες εκτιμήσεις του ρυθμού αύξησης βασίστηκαν στην περίοδο εκθετικής φάσης. 45

46 Οι περισσότερες εργαστηριακές καλλιέργειες που χουν γίνει με το Pseudo-nitzschia delicatissima έχουν κάνει χρήση του θρεπτικού μέσου f/2 ή του μέσου L1. Η παρασκευή του μέσου L1 βασίζεται στο f/2 αλλά με επιπρόσθετα μεταλλικά ιχνοστοιχεία (Guillard et al., 1962). Οι Loureiro et al. (2009) όταν καλλιέργησαν το Pseudo-nitzschia delicatissima βρήκαν ότι τα κύτταρα παρουσίασαν παρόμοιο ρυθμό αύξησης σε διαφορετικές θρεπτικές συνθήκες όπου έδωσαν μέσο όρο 1,64 ± 0,05 κυτταρικών διαιρέσεων ανά ημέρα. Ενώ η καλλιέργεια που περιείχε το θρεπτικό μέσο f/2 παρουσίασε ρυθμό αύξησης 1,19 ±0,05. Δηλαδή παρατηρήθηκε μεγαλύτερος ρυθμό αύξησης όταν η συγκέντρωση των μεταλλικών ιχνοστοιχείων ήταν μεγαλύτερη. Φυσικά ο τρόπος δράσης και η πιθανότητα περιορισμού του EDTA θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω, μιας και υπάρχει η πιθανότητα να έχει τοξική δράση στο P. delicatissima με τρόπο που να επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη ή τον ρυθμό αύξησης. Επίσης απαραίτητη κρίνεται η επίτευξη αξενικών συνθηκών καλλιέργειας μιας και η πιθανότητα να εμφανίζονται και άλλες μορφές ζωής μέσα στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας είναι ισχυρή και ικανή να επιφέρει σφάλματα. Ενδεικτικό είναι το παράδειγμα του κυανοβακτηρίου Prochlorococcus (στέλεχοςmed4-ax) το οποίο απαιτεί Κοβάλτιο για τις βιολογικές του ανάγκες. Το είδος αυτό είναι άφθονο στα θαλάσσια οικοσυστήματα και συχνά έχει βρεθεί σε θρεπτικά μέσα καλλιέργειας επιφέροντας στοχαστικότητα αποτελεσμάτων (Saito et al., 2002). Ενώ διάφοροι μύκητες αλλά και ιοί έχει αποδειχθεί ότι παίζουν έναν σημαντικότατο ρόλο στη δυναμική της άνθισης των ειδών Pseudo-nitzschia, με τρόπο που αυξάνουν τον ρυθμό θανάτου (Bates et al. 1998). 4.1 Προτάσεις για βελτιστοποίηση και επέκταση της παρούσας διατριβής Τα ερευνητικά ερωτήματα που έχει θέσει το Global Ecology and Oceanography of Harmful Algal Blooms Program (GEOHAB, 2006) εστιάζουν στον προσδιορισμό ομάδων ή συγκεκριμένων τύπων ειδών HAB που να υποδεικνύουν/μαρτυρούν την αύξηση θρεπτικών. Επίσης σημαντικό είναι να απαντηθεί το πώς οι ανθρωπογενείς αλλαγές στη χρήση γης, η τη χρήση των γεωργικών λιπασμάτων επηρεάζουν την εισροή και παραλαβή θρεπτικών ουσιών στα παράκτια ύδατα και τα συνακόλουθα συμβάντα HABs. Επειδή οι μελέτες που έχουν αποτιμήσει την θρεπτική προτίμηση των Pseudo-nitzschia είναι λίγες, η κατανόηση της αζωτούχου διατροφής των ειδών αυτών είναι ακόμα περιορισμένη. Δεν είναι γνωστό κατά πόσον η αύξηση των πηγών Ν έχει κάποια επίπτωση στη πρόσληψη Ν και τους ρυθμούς αφομοίωσης σε κάποιο από τα είδη Pseudo-nitzschia. Οι μετρήσεις των ρυθμών πρόσληψης θρεπτικών από φυσικές ανθίσεις των Pseudo-nitzschia spp. είναι ακόμα ελλιπής. Ενώ αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχουν δημοσιευμένες αναφορές για διαφορετικές ανταποκρίσεις που αφορούν το ρυθμό αύξησης σε οργανικά και ανόργανα υποστρώματα φυσικών πληθυσμών των Pseudo-nitzschia. Για την επίτευξη ακριβέστερων αποτελεσμάτων και μείωση των πιθανών σφαλμάτων κρίνεται αναγκαία η χρήση αξενικών καλλιεργειών, μιας και μπορούν να εξαλειφθούν οι επιρροές που ασκούν τα βακτηρία οι ιοί και οι μύκητες που πιθανόν ανευρίσκονται στις καλλιέργειες. Επίσης η χρήση αξενικών συνθηκών είναι ικανή να εξετάσει με μεγάλη ευκολία την επίδραση του περιορισμού βιταμινών του είδους. Η καταμέτρηση του κυτταρικού μεγέθους μπορεί να φανεί χρήσιμη στη σύγκριση αποτελεσμάτων μιας και αρκετές είναι οι εργασίας που το χρησιμοποιούν. Όσον αφορά την μελέτη των μεταλλικών ιχνοστοιχείων κρίνεται αναγκαία η περαιτέρω πειραματική δοκιμασία του EDTA. Ενώ μέγιστο ενδιαφέρον πιθανόν να επιφέρουν εργαστηριακές μελέτες 46

47 κάνοντας χρήση αποβλήτων ελαιουργείων (κατσίγαρος) τα οποία είναι πλούσια σε μεταλλικά ιχνοστοιχεία και πιθανόν να σχετίζονται με εξάρσεις του είδους, κατά του μήνες όπου γίνεται η επεξεργασία των προϊόντων ελιάς και αυξάνουν οι εισροές στο θαλάσσιο περιβάλλον. Τέλος, η εξέταση παραγωγής τοξινών (π.χ. δομοικού οξέος), παρουσιάζει μέγιστο ενδιαφέρον. Ενώ ο ακριβής προσδιορισμός του στελέχους κρίνεται απαραίτητος. Η εξέταση των πειραματικών καλλιεργειών υπό διαφορετικούς λόγους N:P μπορούν να συνεισφέρουν στη προσέγγιση για την να αξιολόγηση της δυναμικής του θρεπτικού περιορισμού. Αυτό είναι δυνατό να επιτευχθεί με χρήση της θεωρητικής σταθεράς ήμι-κορεσμού (K s ) για την πρόσληψη και για την σύγκριση τις στοιχειομετρίας σε σχέση με τα αναμενόμενα ποσοστά Redfield. Το γεγονός αυτό μπορεί να συνδράμει πιθανόν σε μια αξιόπιστη προσέγγιση για τον προσδιορισμό των θρεπτικών συστατικών που δρουν περιοριστικά. Ενώ το μοντέλο Michaelis- Menten, το οποίο βασίζεται στην κινητική της ενζυμικής λειτουργίας μπορεί να περιγράψει τη διαδικασία κατά την οποία τα θρεπτικά προσλαμβάνονται από το περιβάλλον και μεταφέρονται εντός του κυττάρου των φυκών. Είναι λοιπόν δυνατό τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας να συμβάλουν ως δεδομένα επαλήθευσης για την εκτίμηση παραμέτρων κινητικής, επιπλέον θρεπτικών συγκεντρώσεων που ακόμα δεν έχουν δοκιμαστεί εργαστηριακά. Επιπλέον, μεγάλο ενδιαφέρον θα παρουσίαζε η σύγκριση των συγκεκριμένων αποτελεσμάτων από τα πειράματα κλειστών συστημάτων καλλιέργειας με πειράματα συνεχών συστημάτων όπου το μέσο καλλιέργειας προστίθεται μειώνοντας ανάλογο όγκο κυττάρων, κάνοντας χρήση χημειοστάτων. Το εύρος παροχής του περιοριστικού θρεπτικού μέσου καθορίζει την κυτταρική πυκνότητα. Γενικότερα η κατανόηση του περιορισμού θρεπτικών του φυτοπλαγκτού έχει επέλθει μέσα από εργαστηριακές μελέτες που αφορούν μονοκαλλιέργειες. Μέσω αυτού έχουν κατανοηθεί από την επιστημονική κοινότητα οι μηχανισμοί του περιορισμού θρεπτικών σε κυτταρικό επίπεδο. Λαμβάνοντας υπόψη ολόκληρο το οικοσύστημα και τις δυνητικές επιπτώσεις του ευτροφισμού σε αυτό, είναι απαραίτητο να περιλαμβάνονται οι επιπτώσεις του περιορισμού θρεπτικών σε επίπεδα υψηλότερα από αυτά του μοναδικού κυττάρου (Jorgensen et al., 1996). Εν κατακλείδι και σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή πρωτοβουλία έρευνας για τα HABs EUROHAB η έμφαση θα πρέπει να είναι στην αναζήτηση λύσεων στα προβλήματα που προκαλούν τα ΗΑΒς και όχι απλά στην έρευνα των προβλημάτων. 47

48 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα τις παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι ο ρυθμός αύξησης του P. delicatissima επηρεάζεται με την μείωση της πηγής Αζώτου (Ν) και της πηγής Φωσφόρου (Ρ) στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας medium f/2. Ακόμα και όταν αυτές οι συγκεντρώσεις διάφεραν κατά μία τάξη μεγέθους (αρχικές συγκεντρώσεις της πηγής του Ν ήταν περίπου 10 φορές υψηλότερες από την πηγή Ρ), έγινε φανερό ότι οι υψηλότερες ενεργειακές απαιτήσεις του P. delicatissima για Άζωτο, ισορροπούν αυτήν την διαφορά. Κάτω από συνθήκες περιορισμού Ν, τα φωσφορικά ήταν εξαντλημένα στο θρεπτικό μέσο. Κάτω από συνθήκες περιορισμού Ρ, αρκετά νιτρικά παρέμεναν στο θρεπτικό μέσο. Είναι πιθανό ότι υπό συνθήκες περιορισμού Ν, ο Ρ καταναλώνεται με ευκολία για την αποσύνθεση (κατάλυση) των συστατικών που είναι πλούσια σε Ν όπως οι πρωτεΐνες και τα αμινοξέα. Ο περιορισμός των μεταλλικών ιχνοστοιχείων στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας είναι ικανός να μειώσουν τον κυτταρικό αριθμό αλλά και τον ρυθμό αύξησης του Pseudonitzschia delicatissima. Όπως έχει φάνει και σε προηγούμενες μελέτες σε διάτομα, τα αποτελέσματα τις παρούσας εργασίας έδειξαν ότι το Mn, ο Fe, και ο Zn πιθανόν να είναι σημαντικότατοι παράγοντες για την άνθιση του είδους στο πεδίο. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι ο περιορισμός των θρεπτικών μα και των μεταλλικών ιχνοστοιχείων επηρεάζουν την αύξηση του Pseudo-nitzschia delicatissima σε συστήματα κλειστών καλλιεργειών και πιθανόν αυτό έχει αντίκτυπο στα θαλάσσια οικοσυστήματα και ειδικότερα σε περιοχές όπου δέχονται χερσαίες απορροές.

49 6. Συνέδριο Spatharis, S., Palamafti, E., Dolapsakis, P., & Danielidis, D., (2010): The significance of nutrient and metal limitation on the growth of Pseudo-nitzschia delicatissima. Population Dynamics. Hersonissos-Crete, 1-5 November 2010.