Άσκηση Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας

Άσκηση Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας Χαρακτηρισμός Φαρμακογενετικών δεικτών με PCR-ARMS Θεωρητικό μέρος 1. Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR, amplification) είναι μια μέθοδος που αναπτύχθηκε το 1985 από τους Mullis και Silverstein και άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως το 1987 με την χρήση θερομοανθεντικών DNA πολυμερασών. Με τη μέθοδο αυτή συντίθεται μεγάλος αριθμός αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA σε μια ενζυματική αντίδραση in vitro. Η ευαισθησία και ταχύτητα της μεθόδου αυτής έχει επιφέρει επανάσταση στη Μοριακή Γενετική δίνοντας καινούργιες προοπτικές για τη μελέτη και ανάλυση γονιδίων. Η PCR βασίζεται στον ενζυμικό πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που οριοθετείται δεξιά και αριστερά από δύο εκκινητές - ολιγoνουκλεοτίδια (primers). Η αλληλουχία του κάθε εκκινητού είναι συμπληρωματική προς τη μία από τις δύο αλυσίδες του δίκλωνου DNAεκμαγείου. Η αντίδραση περιλαμβάνει 25-35 επαναλαμβανόμενους κύκλους. Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια: 1. Αποδιάταξη του μήτρας DNA (denaturation of DNA template) Συνήθεις συνθήκες: 94 o C- 96 o C, 20"-60" 2. Πρόσδεση των εκκινητών με τις συμπληρωματικές προς αυτούς ακολουθίες (primer annealing). Συνήθεις συνθήκες: 37 o C-65 o C, 20"-60". 3. Επιμήκυνση των συνδεδεμένων εκκινητών και σύνθεση DNA με κατεύθυνση 5' 3' (elongation). Συνήθεις συνθήκες: 72 o C, 0.5-2 min. Το προϊόν επιμήκυνσης του κάθε εκκινητού από τον πρώτο κύκλο της αντίδρασης αποτελεί εκμαγείο για τον άλλο εκκινητή στον επόμενο κύκλο. Μετά

από n κύκλους το προιόν PCR περιέχει 2 n δίκλωνα μόρια DNA που είναι αντίγραφα της αλληλουχίας που ορίζεται από τους εκκινητές. Η αντίδραση πολυμερισμού γίνεται συνήθως σε όγκους 25-100 μl σε ένα σωληνάριο eppendorf και περιλαμβάνει : - εκμαγείο DNA (0.1-1 μg ανθρώπινου γονιδιώματος) - 1x ρυθμιστικό διάλυμα (20mM Tris-HCl ph 8.0, 50mM KCl, 0.01% ζελατίνη) - 1.5 mm - 2.5mM MgCl 2-10 -100 pmol από κάθε εκκινητή - ίση ποσότητα (200μΜ) από κάθε δεοξυνουκλεοτίδιο (datp, dctp, dgtp, dttp) - DNA πολυμεράση (Taq πολυμεράση) (συνήθως 2.5 μονάδες) Ανάλογα με τον θερμικό κυκλοποιητή, το μίγμα καλύπτεται από 2-3 σταγόνες παραφινέλαιο για να εμποδίζεται η εξάτμιση των αντιδραστηρίων κατά το στάδιο της αποδιάταξης. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε ειδικές συσκευές που ονομάζονται θερμικοί κυκλοποιητές (thermal cycler) που εναλλάσσουν τη θερμοκρασία βάσει προγραμματισμού. Η επιτυχία της αντίδρασης πιστοποιείται μετά από ηλεκτροφόρηση ενός μικρού κλάσματος προϊόντος της αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Στη συνέχεια τις περισσότερες φορές ακολουθεί είτε μεταφορά του DNA σε μεμβράνη και υβριδισμός με σημασμένα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (ανιχνευτές) είτε ανάλυση της αλληλουχίας του προϊόντος PCR με ανάλυση αλληλουχίας βάσεων (sequencing) είτε ανίχνευση μεταλλαγμένων αλληλουχιών με περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Οι παράμετροι που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού (PCR) είναι: Η συγκέντρωση των εκκινητών πρέπει να είναι αρκετά υψηλή ώστε η σύνδεσή τους με την αντίστοιχη μονόκλωνη αλυσίδα να γίνεται γρήγορα και κατά την εξέλιξη της αντίδρασης η σύνδεση αυτή να είναι γρηγορότερη από την επανασύνδεση εκμαγείου- εκμαγείου. Η εκλογή κατάλληλης θερμοκρασίας και χρόνου σε κάθε στάδιο της αντίδρασης βοηθά την ειδικότητα της αντίδρασης.

Η ειδικότητα και απόδοση της μεθόδου αυξήθηκε με τη χρήση της Taq πολυμεράσης, αφού χρησιμοποιούνται υψηλότερες θερμοκρασίες στα στάδια σύνδεσης και επιμήκυνσης. Εικόνα 1. Αρχή της PCR (Πηγή: Patrinos GP, Ansorge W, eds. Molecular Diagnostics 2 nd edition, Elsevier/Academic Press, 2009) Στην αρχή, ως ένζυμο της PCR χρησιμοποιήθηκε ένα τμήμα του μορίου της DNA πολυμεράσης της E. coli, το "τμήμα Klenow" (Klenow fragment). Η αδρανοποίηση του ενζύμου αυτού σε υψηλές θερμοκρασίες απαιτούσε την προσθήκη ενζύμου μετά το στάδιο αποδιάταξης σε κάθε κύκλο. Το πρόβλημα αυτό λύθηκε με την ανακάλυψη και χρήση της θερμοανθεκτικής DNA πολυμεράσης, Taq πολυμεράσης, που απομονώθηκε από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus. Η Taq πολυμεράση έχει μοριακό βάρος 94 kda και ειδική ενεργότητα 200.000 μονάδες/mg ενζύμου. Το ένζυμο αυτό διαθέτει

μόνο 5 3 και όχι 3 5 εξωνουκλεοτιδική δράση. Η καλύτερη θερμοκρασία δράσης του ενζύμου (temperature optimum) είναι 75-80 0 C και ο ρυθμός επιμήκυνσης είναι >60 νουκλεοτίδια /sec στους 70 0 C χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο το DNA του Μ13 φάγου. Η πιστότητα (fidelity) του ενζύμου, δηλαδή η σύνθεση DNA απόλυτα συμπληρωματικού προς το εκμαγείο, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των νουκλεοτιδίων στην αντίδραση, από τη συγκέντρωση Mg 2+, το μήκος του τμήματος DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε, τον αριθμό των κύκλων της PCR και τη θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητή-μήτρας. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι: (α) παρέχει τη δυνατότητα παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένου τμήματος DNA σε μικρό χρονικό διάστημα, (β) η αντίδραση μπορεί να γίνει με τη χρήση ελάχιστης ποσότητας γενωμικού DNA καθώς και DNA πολύ κακής ποιότητας (σπασμένου ή ακάθαρτου). Παράδειγμα αποτελεί η χρησιμοποίηση υλικού για PCR του DNA κυττάρων που προέρχονται από τη στοματική κοιλότητα, από μια τρίχα ή ακόμα και από ένα μόνο σπερματοζωάριο ή λεμφοκύτταρο (single-cell PCR). Η χρήση της αντίδρασης PCR έχει ανοίξει καινούργιους ορίζοντες τόσο στον ερευνητικό όσο και στο διαγνωστικό τομέα. Στον ερευνητικό τομέα: ι) έλεγχος κλωνοποιημένων τμημάτων DNA σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους με PCR, ιι) ανίχνευση αλληλουχιών ανθρώπινου γονιδιώματος σε υβριδικά κύτταρα, ιιι) εισαγωγή νέων αλληλουχιών σε προϊόντα PCR με την προσθήκη ή αλλαγή των εκκινητών, ιv) ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεϊνης DNA, v) xαρτογράφηση ανθρώπινου γονιδιώματος, vi) δημιουργία φυλογενετικών δένδρων, vii) ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίου μετά από επίδραση διαφόρων παραγόντων, viii) ανίχνευση μεταλλαγών και νέων γονιδίων πολυγονιδιακών οικογενειών. Στο διαγνωστικό τομέα: ι) προγεννητική διάγνωση, π.χ. δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και β- μεσογειακής αναιμίας. Παλιότερα η προγεννητική διάγνωση για τα παραπάνω νοσήματα ήταν έμμεση και γινόταν με τη μελέτη πολυμορφικών θέσεων στην περιοχή του β-γονιδίου (RFLPs). Η χρησιμοποίηση της PCR οδήγησε στην άμεση αναγνώριση των μεταλλαγών της β-μεσογειακής αναιμίας καθώς και άλλων αιμοσφαιρινοπαθειών με τεχνική απλή, σύντομη και ευαίσθητη, ii) προσδιορισμός φύλου στο ανθρώπινο έμβρυο πριν από την γονιμοποίηση in vitro για τη διάγνωση

φυλοσύνδετων ασθενειών, iii) ανάλυση HLA για προσδιορισμό γενετικής προδιάθεσης για ανοσολογικές ασθένειες και ταυτοποίηση ιστών δότη και δέκτη πριν από την μεταμόσχευση, iv) ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών και σωματικών μεταλλαγών συνδεόμενων με διάφορους τύπους καρκίνων, v) διάγνωση λοιμώξεων, vi) ανάλυση πολυμορφικών τμημάτων του ανθρώπινου γονιδιώματος που διαφέρουν σε μέγεθος (VNTRs, variable number tandem repeats). 2. PCR-ARMS Μια βασική εφαρμογή της μοριακής διαγνωστικής είναι η ανίχνευση μεταλλάξεων και μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) που σχετίζονται με συγκεκριμένους φαινότυπους. Μια τέτοια προσέγγιση, γνωστή ως «σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση» (amplification refractory mutation system, PCR-ARMS) βασίζεται στο γεγονός ότι μια ασυμφωνία ζευγαρώματος ανάμεσα στο 3 νουκλεοτίδιο ενός εκκινητή PCR και της μήτρας μειώνει ή εμποδίζει την επιμήκυνση του εκκινητή από την Taq πολυμεράση. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες στρατηγικές που χρησιμοποιούν εκκινητές συμπληρωματικούς με συγκεκριμένα αλληλόμορφα, ώστε να επιτυγχάνεται η ενίσχυση των αλληλομόρφων αυτών. Το 1989, μερικές ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες περιέγραψαν μια εφαρμογή της PCR για την ανάλυση γνωστών σημειακών μεταλλάξεων στο DNA και για τη διάκριση μεταξύ φυσιολογικών, ετερόζυγων και ομόζυγων μεταλλαγμένων γονότυπων. Η μέθοδος αυτή συνήθως αναφέρεται ως PCR-ARMS ή ARMS (Amplification Refractory Mutation System Σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση). Η PCR-ARMS βασίζεται στη διαπίστωση ότι η ενίσχυση DNA με PCR έχει μικρή απόδοση ή και αποτυγχάνει πλήρως εάν υπάρχει ασυμφωνία ζευγαρώματος ανάμεσα στο 3 -τελικό νουκλεοτίδιο του εκκινητή και της αντίστοιχης μήτρας. Η Taq DNA πολυμεράση δεν έχει δράση 3 5 εξωνουκλεάσης, και συνεπώς δεν μπορεί να επιδιορθώσει τυχόν ασυμφωνίες ζευγαρώματος στο 3 άκρο του εκκινητή. Κατά συνέπεια, απαιτείται πλήρης συμπληρωματικότητα στο 3 άκρο του εκκινητή προκειμένου να επιτευχθεί αποδοτική ενίσχυση. Ο βαθμός συμπληρωματικότητας είναι καθοριστικός παράγοντας της ειδικότητας της μήτρας. Η ενίσχυση του φυσιολογικού και όχι

του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου επιτυγχάνεται με χρήση ενός εκκινητή ο οποίος είναι συμπληρωματικός με το φυσιολογικό αλληλόμορφο και εμφανίζει μια ασυμφωνία ζευγαρώματος με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, στο 3 νουκλεοτίδιο. Αντίστοιχα, θα ενισχυθεί ειδικά το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο εάν το 3 νουκλεοτίδιο του εκκινητή είναι συμπληρωματικό με το μεταλλαγμένο και όχι το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Η βασική αρχή της μεθόδου φαίνεται στην εικόνα 2. Εικόνα 2. Αρχή της PCR-ARMS (Πηγή: Patrinos GP, Ansorge W, eds. Molecular Diagnostics 2 nd edition, Elsevier/Academic Press, 2009) Μια κοινή εφαρμογή της PCR-ARMS είναι η ανίχνευση μεμονωμένων σημειακών μεταλλάξεων στο DNA. Οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε να ενισχύουν επιλεκτικά το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, ενώ θα ανθίσταται στην ενίσχυση το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει και ένα δεύτερο ζεύγος εκκινητών, οι οποίοι είναι ειδικοί για έναν ετερόλογο γενετικό τόπο η ενίσχυση του οποίου αποτελεί θετικό μάρτυρα της επιτυχίας της PCR. Χρησιμοποιούνται συμβατικά συστήματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου προκειμένου να διαχωριστεί το αμπλικόνιο ελέγχου από το μεταλλαγμένο αμπλικόνιο. Καθώς η απόδοση της ενίσχυσης είναι αντιστρόφως ανάλογη του μήκους του αμπλικονίου, το αμπλικόνιο ελέγχου θα πρέπει να έχει μήκος μεγαλύτερο ή παρόμοιο με το

μήκος του μεταλλαγμένου αμπλικονίου. Για άλλες εφαρμογές, όπως π.χ. η ανάλυση μεταλλάξεων σε άτομα που έχουν προσβληθεί από μια υπολειπόμενη διαταραχή, πιθανόν να ζητείται ο προσδιορισμός του γονοτύπου των ατόμων που είναι θετικά για τη μετάλλαξη. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τον έλεγχο όλων των θετικών δειγμάτων με εφαρμογή μιας δεύτερης ανάλυσης ARMS, ειδικής για το φυσιολογικό αλληλόμορφο και όχι για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Οι ετεροζυγώτες θα δώσουν θετικό αποτέλεσμα και στις δύο αναλύσεις ARMS, ενώ οι ομοζυγώτες θα δώσουν θετικό αποτέλεσμα μόνο στην ανάλυση ARMS για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Η ειδικότητα της μεθόδου PCR-ARMS είναι τέτοια που επιτρέπει τον έλεγχο μίγματος πολλών δειγμάτων για την αναγνώριση σπάνιων φορέων συγκεκριμένων μεταλλάξεων. Με την προσέγγιση αυτή είναι δυνατόν να εντοπιστεί ένα μοναδικό θετικό δείγμα σε μίγμα 30 ή περισσότερων δειγμάτων. Έτσι μπορεί να περιοριστεί η ανάγκη για μεμονωμένη εξέταση μεγάλου αριθμού δειγμάτων προκειμένου να προσδιοριστεί η συχνότητα συγκεκριμένων μεταλλαγμένων αλληλομόρφων σε έναν πληθυσμό. Πολλές γενετικές διαταραχές χαρακτηρίζονται από ένα μικρό αριθμό κοινών μεταλλάξεων που αντιπροσωπεύουν ένα μεγάλο ποσοστό ή σε ορισμένες περιπτώσεις την πλειονότητα των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμό. Αφού προσδιοριστεί το φάσμα των μεταλλάξεων και η συχνότητα των διάφορων αλληλόμορφων, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η PCR-ARMS για την παράλληλη αναζήτηση των πιο κοινών μεταλλάξεων. Στην πράξη, είναι δυνατόν να αναπτυχθούν εύκολα αναλύσεις για πολλαπλές μεταλλάξεις που επιτρέπουν την ανίχνευση τεσσάρων έως έξι διαφορετικών μεταλλάξεων με μία αντίδραση. Η PCR- ARMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό γονοτύπων για μεμονωμένες μεταλλάξεις ή μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς, δηλαδή για τη διάκριση ετερόζυγων από ομόζυγα άτομα. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση δύο χωριστών αναλύσεων ARMS, από τις οποίες η μία είναι ειδική για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και η άλλη ειδική για το κανονικό αλληλόμορφο. Εναλλακτικά, έχουν αναπτυχθεί συστήματα PCR-ARMS για τον προσδιορισμό του γονοτύπου για συγκεκριμένη μεταλλάξη ή μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό με μία μόνον αντίδραση. Το απλούστερο από τα συστήματα αυτά περιλαμβάνει αμφίδρομη ενίσχυση, με το κανονικό

αλληλόμορφο να ενισχύεται χρησιμοποιώντας τον έναν κλώνο ως μήτρα και το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο να ενισχύεται με βάση τον συμπληρωματικό κλώνο. Οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε τα αμπλικόνια να διακρίνονται εύκολα με συμβατική ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. Η στρατηγική αυτή διαθέτει ενσωματωμένο έλεγχο θετικής αντίδρασης, ο οποίος συνίσταται στην ενίσχυση της αλληλουχίας μεταξύ των εξωτερικών εκκινητών του κανονικού και του μεταλλαγμένου αμπλικονίου. Η PCR-ARMS έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην έρευνα και στη μοριακή διαγνωστική, μετά την πρώτη παρουσίασή του στα τέλη της δεκαετίας του 1980. Η γοητεία της μεθόδου αυτής έγκειται στην απλότητά της και στη δυνατότητα εφαρμογής της στην ανάλυση ουσιαστικά όλων των σημειακών μεταλλάξεων και των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Ένα πρόσθετο πλεονέκτημα είναι ότι δεν χρειάζεται προηγμένο και ακριβό εξοπλισμό. 3. Κατάτμηση του DNA με περιοριστικες ενδονουκλεάσες Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα που αναγνωρίζουν ειδικές δίκλωνες αλληλουχίες DNA και κόβουν το μόριο μέσα ή κοντά στην αλληλουχία αναγνώρισης. Οι αλληλουχίες αναγνώρισης έχουν μήκος συνήθως 4-8 νουκλεοτίδια και συχνά είναι παλίνδρομα, «διαβάζονται» δηλαδή το ίδιο και από τις δύο κατευθύνσεις του DNA (5 >3 και 3 >5 ). Τα τμήματα DNA που παράγονται από την πέψη με μια περιοριστική ενδονουκλεάση έχουν πάντα τα ίδια άκρα, είτε αυτά είναι προεξέχοντα (sticky ends) είτε όχι (blunt ends). Η συχνότητα και η θέση ανεύρεσης των αλληλουχιών αναγνώρισης οποιασδήποτε περιοριστικής ενδονουκλεάσης μέσα σε ένα μόριο DNA εξαρτάται από την ακριβή αλληλουχία του δείγματος που εξετάζεται. Οι παραπάνω ιδιότητες των περιοριστικών ενδονουκλεασών επιτρέπουν: (α) Τη χαρτογράφηση ενός συγκεκριμένου μορίου DNA με βάση τον εντοπισμό των θέσεων αναγνώρισης ενός ή πολλαπλών ενζύμων, (β) Τη δυνατότητα σύνδεσης (ligation) τμημάτων DNA που περιέχουν τα ίδια προεξέχοντα άκρα μεταξύ τους ακόμη και αν αυτά προέρχονται από διαφορετικά άκρα μεταξύ τους ακόμη και αν αυτά προέρχονται από διαφορετικά δείγματα (π.χ. με μόρια φορείς vectors, που μπορούν να

αναπαράγονται σε συγκεκριμένο ξενιστή παρέχοντας πολλά αντίγραφα της υπό μελέτης αλληλουχίας. ιαδικασία κλωνοποίησης), (γ) τη ανίχνευση μεταλλαγών ή πολυμορφισμών (γενετικών δεικτών) σε δείγματα ασθενών ή φυσιολογικών ατόμων. Τα ρυθμιστικά διαλύματα μέσα στα οποία γίνεται η αντίδραση της επώασης περιέχουν συνήθως Mg + που λειτουργεί ως συμπαράγοντας του ενζύμου καθώς και ένα μονοσθενές κατιόν (Νa + ). Τα συστατικά των διαλυμάτων επώασης πρέπει να είναι καθαρά και απαλλαγμένα από νουκλεάσες. Οι σουλφιδρυλικοί παράγοντες, όπως η β-μερκαπτοαιθανόλη και DTT που προστίθενται αποσκοπούν στην αναστολή των νουκλεασών που ενδεχομένως συνυπάρχουν. Η προσθήκη BSA (αλβουμίνη ορού βοός) στην αντίδραση επώασης προφυλάσσει επίσης τα ένζυμα πρωτεάσες ή άλλους παράγοντες. Το DNA (γενωμικό, πλασμιδιακό ή προϊόν PCR) που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι απαλλαγμένο από προσμίξεις όπως EDTA, SDS, φαινόλη, βρωμιούχο αιθίδιο που μπορεί να παρεμποδίσουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Τα ένζυμα φυλάσσονται στους 20 ο C μέσα σε διάλυμα που περιέχει 50% v/v γλυκερόλη. Η συγκέντρωση της γλυκερόλης στον τελικό όγκο επώασης δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% γιατί αναστέλλει τη δράση του ενζύμου.

Σκοπός της άσκησης: Ο προσδιορισμός του γονοτύπου στο γονίδιο SLCO1B1. Η άσκηση θα ολοκληρωθεί σε 2 μέρη: Στο πρώτο μέρος, θα προετοιμαστεί η αντίδραση PCR και στο δεύτερο μέρος θα αναλυθούν τα προϊόντα PCR με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, από όπου θα καθοριστεί και ο γονότυπος των ατόμων με βάση τα ηλεκτροφορητικά τους πρότυπα. Επιπλέον, στο πρώτο μέρος τη άσκησης, θα γίνει καθορισμός (επί χάρτου) του γονοτύπου ατόμων με βάση: - τα πρότυπα ηλεκτοφόρησης τμήματος DNA/προϊόντος PCR το οποίο έχει υποστεί κατάτμιση με περιοριστικές ενδονοκλεάσες για την ανίχνευση φαρμακογενετικών δεικτών στα γονίδια CYP2D6 και CYP2C19, και - τη δοσολογία στο φάρμακο warfarin.

Πειραματικό μέρος (Μέρος Α) Υλικά: Ολικό γενωμικό DNA Εκκινητές (primers) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμου (200mM Tris-HCl ph 8.0, 500mM KCl, 0.1% ζελατίνη) ιάλυμα 50mM MgCl 2 Ένζυμο Taq DNA πολυμεράση (5u/μl) Μίγμα των 4 δεοξυριβονουκλεοτιδίων dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) συγκέντρωσης 40mM ddh 2 O Η διαδικασία των κύκλων της αντίδρασης PCR πραγματοποιείται σε θερμικό κυκλοποιητή τύπου MJR. ιαδικασία: Σε αποστειρωμένο σωληνάριο τύπου eppendorf προστίθενται τα συστατικά της αντίδρασης με βάση το παράρτημα Α (κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας τα υλικά φυλάγονται στον πάγο): Τοποθέτηση δειγμάτων στο θερμικό κυκλοποιητή. Το πρόγραμμα που ακολουθείται είναι: Στάδιο 1: 94 o C 5min Στάδιο 2: 94 o C 1min (αποδιάταξη denaturation) Στάδιο 3: 55 o C 1min (σύνδεση-annealing) Στάδιο 4: 72 o C 1min (επιμήκυνση-extension) Στάδιο 5: επανάληψη των σταδίων 2 μέχρι και 4 επί 30 φορές Στάδιο 6: 72 o C 10min Στάδιο 7: 4 o C Στο τέλος της αντίδρασης PCR, τα πολλαπλασιασμένα τμήματα DNA (προϊόντα PCR) ελέγχονται σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5%.

Πειραματικό μέρος (Μέρος Β) Οι συσκευές που χρησιμοποιούνται σήμερα για ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης είναι οριζόντιες και οι οποίες παρέχουν αρκετά πλεονεκτήματα όπως: α) μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν χαμηλές συγκεντρώσεις αγαρόζης, β) μπορεί εύκολα να φτιαχτεί πήκτωμα των διαστάσεων που θέλουμε, γ) η κατασκευή και χρησιμοποίηση των πηκτωμάτων είναι εύκολη και γρήγορη και δ) η συσκευή που χρησιμοποιείται δύσκολα φθείρεται και είναι φθηνή. Ι. Ρυθμιστικά διαλύματα Χρησιμοποιούνται ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν Tris-οξικόβορικό ή φωσφορικό σε συγκέντρωση 50-100mM και ph περίπου 8. Συνήθως τα διαλύματα παρασκευάζονται σε πενταπλάσια ή δεκαπλάσια συγκέντρωση και διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου. Η ρυθμιστική ικανότητα του Trisοξικού είναι χαμηλή και για το λόγο αυτό προτιμάται το Tris-φωσφορικό ή το Tris-βορικό (TBE) που δίνουν εξίσου καλό διαχωρισμό και έχουν υψηλή ρυθμιστική ικανότητα. Το Tris-φωσφορικό δεν χρησιμοποιείται συνήθως σε παρασκευαστικά πηκτώματα γιατί δημιουργεί τεχνικές δυσκολίες στα επόμενα στάδια της απομόνωσης DNA. Το πήκτωμα αγαρόζης σας παρέχεται έτοιμο. Αφαιρείτε προσεκτικά τη χτένα και το πήκτωμα είναι έτοιμο προς ηλεκτροφόρηση. Βυθίζετε το πήκτωμα αγαρόζης μέσα στο δοχείο ηλεκτροφόρησης όπου περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα. Προσθέτετε σε κάθε δείγμα το διάλυμα χρωστικής (0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol FF/15% Ficoll Type 400 σε ddh 2 O). Σε κάθε θέση του gel φορτώνετε 5μl δείγματος στο οποίο έχετε προσθέσει 12μl χρωστικής. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης μπορείτε να παρακολουθήσετε την ανάδειξη των ζωνών με λάμπα υπεριώδους φωτός (χρησιμοποιούνται ειδικά γυαλιά). Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, με τη βοήθεια του υπεριώδους φωτός, φωτογραφίζετε το gel.