ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ «ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ»...48

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ «ΠΕΡΙΛΗΨΗ»...3 «ΕΙΣΑΓΩΓΗ»...5 Α. ΑΠΟΠΤΩΣΗ 6 Α1. ΓΕΝΙΚΑ...6 Α2. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ... 8 Κασπάσες 8 Μέλη της οικογένειας των κασπασών και δομικά χαρακτηριστικά τους 9 Ενεργοποίηση των κασπασών 13 Ρύθμιση της ενεργοποίησης των κασπασών 17 Εξερχόμενα τοξικά πολυπεπτίδια από τα μιτοχόνδρια 22 Υποστρώματα των κασπασών κατά την απόπτωση 23 Β. ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ 27 Β1. ΓΕΝΙΚΑ... 27 Β2. ΟΙ ΦΑΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ... 27 Β3. Η ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ... 29 Β4. ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ... 31 Β5. ΤΟ ΠΡΟ-ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ... 32 Β6. ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΚΥΚΛΙΝΟ-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ (CDKS)... 33 Β7. ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΠΡΟ-ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ... 34 Σύμπλεγμα αναγνώρισης των αφετηριών (ORCs ή Origin Recognition Complex) 34 Πρωτεΐνη Cdc6/18 36 Cdt1 (Cdc10-dependent transcript 1) 37 Πρωτεΐνες MCM (Mini-Chromosome Maintenance Proteins) 38 Β8. ΑΔΕΙΟΔΟΤΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ (LICENSING)... 40 Β9. GEMININ: ΕΝΑΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΡΥΘΜΙΣΤΗΣ ΤΟΥ CDT1 ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΔΕΙΟΔΟΤΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ... 42 «ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ»...48 «ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ»...50 ΜΕΘΟΔΟΙ 51 Α. ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ... 51 Α1. Αραίωση των κυττάρων 51 Α2. «Αναζωογόνηση» των κυττάρων 51 Α3. Κατάψυξη των κυττάρων 51 Β. ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ... 52 Β1. Επικάλυψη καλυπτρίδων με poly-d-λυσίνη: 52 Β2. Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού 52 Γ. ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN (WESTERN BLOTTING)... 54 Γ1. Παρασκευή ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος από ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια 54 Γ2. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis): 54 Γ3. Ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF (transfer) 57 Δ. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ CDNA ΤΗΣ ΠΡΟΚΑΣΠΑΣΗΣ-3 ΣΤΟΝ ΦΟΡΕΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΙΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ, PCDNA 3.1... 59 1

Δ1. Στρατηγική κλωνοποίησης του cdna της προκασπάσης-3, από το πλασμίδιο puc στον φορέα έκφρασης για ευκαρυωτικά κύτταρα pcdna 3.1 60 Δ2. Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5A με τη μέθοδο του θερμικού σοκ 61 Δ3. Απομόνωση μεσαίας κλίμακας πλασμιδικού DNA (midi preparation) 61 Δ4. Κατάτμηση του πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού 62 Δ5. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 62 Δ6. Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης (gel extraction) 62 Δ7. Αντίδραση συνδετάσης (ligation) 63 Δ8. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (minipreps) - Πρωτόκολλο Ι (C. Norburry) 63 Δ9. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (Minipreps) - Πρωτόκολλο ΙΙ 64 Δ10. Παρασκευή βακτηριακών καλλιεργειών διατήρησης (stock γλυκερόλης) 65 Δ11. Παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών MCF7 κυττάρων με λιποδιαμόλυνση (lipofection) 65 Ε. ΙN VITRO ΕΠΩΑΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ GEMININ ΜΕ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ CASPASE-3.... 65 Ε1. Έλεγχος της καρβοξυτελικής ή αμινοτελικής κατάτμησης της πρωτεΐνης Geminin, μέσω της αλληλεπίδρασής των προϊόντων κατάτμησής της, με σφαιρίδια ρητίνης Ni-NTA (νικελίου-νιτριλοτριοξικού οξέος). 67 ΥΛΙΚΑ 69 Α. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ... 69 Β. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ... 70 Γ. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟ... 70 Δ. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN... 71 Ε. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ CDNA ΤΗΣ ΠΡΟΚΑΣΠΑΣΗΣ-3 ΣΤΟΝ ΦΟΡΕΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΙΑ ΤΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ PC DNA 3.1... 75 ΣΤ. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ IN VITRO ΕΠΩΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ GEMININ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ CASPASE-3... 78 «ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ»...80 1. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ GEMININ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ ΣΕ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HELA 81 2. Η GEMININ ΣΤΟΧΕΥΕΤΑΙ ΚΑΙ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ IN VIVO ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3 84 3. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ GEMININ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3 IN VITRO 86 4. Η ΘΕΣΗ ΤΟΜΗΣ ΤΗΣ GEMININ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3 ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΕΙΤΑΙ ΚΟΝΤΑ ΣΤΟ ΚΑΡΒΟΞΥΤΕΛΙΚΟ ΤΗΣ ΑΚΡΟ 88 «ΣΥΖΗΤΗΣΗ»...99 ΓΕΝΙΚΑ 100 1. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ GEMININ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ ΣΕ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HELA... 101 2. Η GEMININ ΣΤΟΧΕΥΕΤΑΙ ΚΑΙ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ IN VIVO ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3... 103 3. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ GEMININ ΚΑΤΑΤΜΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3 IN VITRO... 105 4. Η ΘΕΣΗ ΤΟΜΗΣ ΤΗΣ GEMININ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΣΠΑΣΗ-3 ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΕΙΤΑΙ ΚΟΝΤΑ ΣΤΟ ΚΑΡΒΟΞΥΤΕΛΙΚΟ ΤΗΣ ΑΚΡΟ... 106 «ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ»...111 2

περίληψη «Περίληψη» 3

περίληψη Η απόπτωση είναι μια βασικής σημασίας βιολογική διαδικασία η οποία απαιτείται για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αντίθετα, δυσλειτουργία της αποπτωτικής διαδικασίας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια μιας ευρείας κλίμακας ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένων νευροεκφυλιστικών διαταραχών και καρκίνο. Η αποπτωτική διαδικασία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ενός αρκετά συντηρημένου μεταξύ των οργανισμών βιοχημικού μονοπατιού, στο τελευταίο στάδιο του οποίου βρίσκεται η ενεργοποίηση μιας οικογένειας πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες. Οι πρωτεάσες αυτές κατατμούν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών στόχων, η κατάτμηση των οποίων και η αλλαγή των λειτουργικών χαρακτηριστικών τους προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο. Στις πρωτεΐνες-στόχους της αποπτωτικής διαδικασίας περιλαμβάνονται δομικές πρωτεΐνες του πυρήνα και του κυτταροσκελετού, πρωτεΐνες που ενέχονται άμεσα στην αποπτωτική διαδικασία, στην κυτταρική σηματοδότηση, στην αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση των βλαβών του, αλλά και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι μια διαδικασία η οποία εξασφαλίζει πως μόνο μετά από τη διαμεσολάβηση της φάσης της μίτωσης η χρωματίνη καθίσταται ικανή για έναν νέο κύκλο αντιγραφής του DNA. Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών ρυθμίζει τη διαδικασία αυτή, μείζον συστατικό του οποίου είναι η πρωτεΐνη Cdt1 η οποία είναι συντηρημένη από τις ζύμες έως τα θηλαστικά. Στα σπονδυλωτά, η πρωτεΐνη Geminin, είναι ο αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 προσφέροντας ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1. Στις πρωτεΐνες που ενέχονται στην παραπάνω διαδικασία συμπεριλαμβάνονται οι πρωτεΐνες Orc1-6, Cdc6, MCM2-7, από τις οποίες οι πρωτεΐνες Cdc6 και MCM3 έχει δειχθεί ότι αποτελούν στόχους των κασπασών και της αποπτωτικής διαδικασίας. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν ο έλεγχος μιας πιθανής στόχευσης του μέλους του προαντιγραφικού συμπλόκου Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή του Geminin κατά την απόπτωση. Διαπιστώθηκε πως σε αποπτωτικά κύτταρα η πρωτεΐνη Geminin στοχεύεται και κατατμείται. Η κατάτμηση αυτή προκύπτει μετά από στόχευση της Geminin από την κασπάση-3 και παρατηρήθηκε τόσο σε in vivo συνθήκες όσο και μετά την in vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin με ανασυνδυασμένη κασπάση-3. Η χαρτογράφηση της θέσης της κατάτμησης της Geminin από την κασπάση-3 επέδειξε το καρβοξυτελικό της άκρο της Geminin ως τον πρωτεολυτικό στόχο της κασπάσης-3, προτείνοντας υποθετικές αλλαγές στη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. 4

εισαγωγή «Εισαγωγή» 5

εισαγωγή Α. Απόπτωση Α1. Γενικά Η απόπτωση ή αλλιώς ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, είναι μια θεμελιώδης, φυσιολογική διαδικασία που παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο του αριθμού των κυττάρων κατά την ανάπτυξη και κατά τη διάρκεια της ζωής των οργανισμών, απομακρύνοντας τα κύτταρα την κατάλληλη στιγμή. Η σηματοδότηση των κυττάρων προς τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο λαμβάνει χώρα για παράδειγμα κατά την εμβρυογένεση, όταν τα κύτταρα παράγονται σε υπεραφθονία (Lockshin et al., 1991), κατά την μεταμόρφωση (Kerr et al., 1974) ή την ενηλικίωση (Newman et al., 1982), όταν τα κύτταρα δεν είναι πια χρήσιμα ή λειτουργικά αντίστοιχα. Επίσης κύτταρα με δυναμική πρόκλησης βλάβης στον οργανισμό, όπως είναι μολυσμένα με ιούς κύτταρα ή κύτταρα με βλάβες στο γενετικό τους υλικό, μπορούν να σηματοδοτηθούν προς κυτταρικό θάνατο. Έτσι, η κύρια συμβολή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου κατά την ανάπτυξη περιλαμβάνει την απαλοιφή ανεπιθύμητων κυττάρων (ανασκόπηση, Jacobson et al., 1997). Δυσλειτουργία της αποπτωτικής διαδικασίας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια μιας ευρείας κλίμακας ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων (Thompson, 1995). Για παράδειγμα, μια μειωμένη τάση προς αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο φαίνεται να είναι σημαντική για την ανάπτυξη όγκων, αλλά και για επίκτητη αντίσταση στη χημειοθεραπεία (Hanahan and Weinberg, 2000), (Tamm et al., 2001). Η μειωμένη τάση για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο έχει σχετισθεί επίσης με αυτοάνοσα σύνδρομα, ενώ η αυξημένη τάση προς απόπτωση έχει εμπλακεί σε νευροεκφυλιστικές νόσους όπως η Alzheimer s, η Huntington s και η Parkinson s, καθώς και μερικώς στην ιστική καταστροφή που λαμβάνει χώρα μετά από αγγειακά εμφράγματα στον εγκέφαλο και την καρδιά (Nicholson, 1996), (Tatton et al., 2003). Οι πρώτες, κλασικές μορφολογικές-δομικές μελέτες στον κυτταρικό θάνατο έλαβαν χώρα από τον Kerr και τους συνεργάτες του το 1972 (Kerr et al., 1972). Οι μελέτες αυτές υποδείκνυαν ότι τα κύτταρα πιθανόν να υπόκεινται σε τουλάχιστον δύο τύπους κυτταρικού θανάτου: ο πρώτος τύπος γνωστός ως νέκρωση (necrosis), είναι μια βίαιη και ταχεία μορφή εκφυλισμού που επιδρά σε εκτεταμένους κυτταρικούς πληθυσμούς. Χαρακτηρίζεται από διόγκωση (οίδημα) του κυτταροπλάσματος, 6

εισαγωγή καταστροφή των οργανιδίων, διάρρηξη της πλασματικής μεμβράνης που οδηγεί στην απελευθέρωση του ενδοκυτταρικού περιεχομένου στον εξωκυττάριο χώρο και επακόλουθη φλεγμονή (εικόνα 5). Ένας δεύτερος τύπος κυτταρικού θανάτου, καθαρά ευδιάκριτος από τη νέκρωση, που ονομάστηκε απόπτωση (apoptosis) ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, αναγνωρίσθηκε σε μονήρη κύτταρα που συνήθως περιβάλλονταν από υγιή γειτονικά κύτταρα και χαρακτηρίστηκε από κυτταρική συρρίκνωση, τη δημιουργία κυστών (blebbing), τη συμπύκνωση της χρωματίνης, τον κατακερματισμό του πυρήνα και την απώλεια προσκόλλησης των κυττάρων (εικόνα 1). Περαιτέρω βιοχημικές μελέτες έδειξαν πως στα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την απόπτωση περιλαμβάνονται η κατάτμηση του DNA μεταξύ των νουκλεοσωμάτων που οδηγεί σε ολιγονουκλεοσωμική κλίμακα (laddering) (Cohen et al., 1994), η μερική αναστροφή της κυτταρικής μεμβράνης με την εμφάνιση του φωσφολιπιδίου φωσφατιδυλοσερίνη (PS), (Martin et al., 1995), και η πρωτεολυτική κατάτμηση ενός αριθμού ενδοκυτταρικών υποστρωμάτων (Martin και Green, 1995a). Ως αποτέλεσμα των αλλαγών της πλασματικής μεμβράνης, τα αποπτωτικά κύτταρα γρήγορα φαγοκυτταρώνονται, πριν την απελευθέρωση του ενδοκυτταρικού περιεχομένου και χωρίς την επαγωγή φλεγμονώδους απόκρισης. Κατά τη διάρκεια των τριάντα τελευταίων ετών, ο κυτταρικός θάνατος θεωρήθηκε ότι λαμβάνει χώρα με έναν από τους δύο παραπάνω τύπους. Η εργασία του Kerr και των συνεργατών του, κέντρισε το ενδιαφέρον για τον κυτταρικό θάνατο, επειδή αφενός καταδείκνυε ένα αναγνωρίσιμο πρότυπο, τον αποπτωτικό φαινότυπο, αφετέρου έδινε ενδείξεις ελεγχόμενης διαδικασίας, που δικαιολογούν τον λειτουργικό ορισμό του «προγραμματισμένου γεγονότος» (Lockshin and Zakeri, 2001). Αντίθετα, η νέκρωση θεωρήθηκε ένας συμπτωματικός μη ελεγχόμενος εκφυλισμός, σε αντίθεση με την απόπτωση που παρουσίαζε καθορισμένα χαρακτηριστικά ενός προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Πράγματι, πολλές ερευνητικές ομάδες ξεκίνησαν να θεωρούν την απόπτωση και τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο ως ταυτόσημη έννοια, παρά την έξυπνη κριτική πρωτοπόρων στο πεδίο (Lockshin and Zakeri, 1991). Παρ όλα αυτά, αυτό το απλοποιημένο και γενικευμένο σχήμα αγνοεί τις εξαιρέσεις, όπως για παράδειγμα μορφολογίες κυτταρικού θανάτου που δεν ανταποκρίνονται στην πρωτότυπη ταξινόμηση (ανασκόπηση, Clarke, 1990). Επίσης, ενδείξεις είναι τώρα διαθέσιμες για πολλαπλά εναλλακτικά μονοπάτια κυτταρικού θανάτου, όπως ο αυτοφαγικός κυτταρικός θάνατος και η προγραμματισμένη νέκρωση, καθώς και για 7

εισαγωγή αλληλεπιδράσεις των ενδοκυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται σε ξεχωριστές όψεις του κυτταρικού εκφυλισμού (ανασκόπηση, Guimarães and Linden, 2004). Εικόνα 1: φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποπτωτικού κυττάρου (αριστερά) και νεκρωτικού κυττάρου (δεξιά). (από «Molecular Biology of the Cell», Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts, Watson, τροποποιημένη). Α2. Μηχανισμός απόπτωσης Κασπάσες Η απόπτωση είναι ένας τύπος προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, ο οποίος πραγματοποιείται μέσω ενός εξειδικευμένου κυτταρικού μηχανισμού. Πολλά από τα μόρια που συμμετέχουν στο υψηλά συντηρημένο βιοχημικό μονοπάτι με το οποίο εκτελείται η απόπτωση έχουν αναγνωρισθεί τα τελευταία μόλις έτη. Στην καρδιά του παραπάνω μονοπατιού βρίσκεται μια οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης, οι κασπάσες. Οι κασπάσες, οι οποίες φέρουν το αμινοξύ κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο και διασπούν τα υποστρώματά τους κατατμώντας τα μετά από ασπαρτικό οξύ 8

εισαγωγή (c-asp-ases: c-ysteine, asp-artic acid), φαίνεται να είναι το κύριο μονοπάτι με το οποίο «ενορχηστρώνεται» ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (Martin and Green, 1995a). Το μετατρεπτικό ένζυμο της ιντερλευκίνης-1β (ICE, caspase-1), είναι η πρώτη κασπάση που αναγνωρίσθηκε, και αρχικά ταυτοποιήθηκε ως η υπεύθυνη πρωτεάση για την ωρίμανση της προ-ιντερλευκίνης (IL)-1β στην προ-φλεγμονώδη, βιολογικά ενεργή μορφή της (Cerreti et al., 1992), (Thornberry et al., 1992). Την ίδια χρονική περίοδο, προσδιορίσθηκε το γενετικό μονοπάτι για τον κυτταρικό θάνατο στο νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans (Ellis et al., 1991). Ένα από τα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν, το ced-3, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που είναι απαραίτητη για τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο των 131 κυττάρων που οδηγούνται σε απόπτωση κατά την ανάπτυξη του ερμαφρόδιτου. Όταν το γονίδιο ced-3 του elegans κλωνοποιήθηκε και αναλύθηκε η νουκλεοτιδική του αλληλουχία, βρέθηκε να είναι το ομόλογο του ICE - caspase 1 (κασπάση 1), των θηλαστικών (Yuan et al., 1993), (Xue et al., 1996). Έτσι, η κασπάση 1 ήταν το πρώτο μέλος που ταυτοποιήθηκε από την μεγάλη αυτή οικογένεια των πρωτεασών (ανασκόπηση, Zimmermann et al., 2001). Μέλη της οικογένειας των κασπασών και δομικά χαρακτηριστικά τους Μέχρι σήμερα, τουλάχιστον 14 διαφορετικές κασπάσες έχουν ταυτοποιηθεί, με τα ορθόλογα γονίδιά τους να είναι παρόντα σε είδη όπως ο νηματώδης σκώληκας Caenorhabditis elegans, το δίπτερο Drosophila melanogaster και το λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda. Αν και η πρώτη κασπάση των θηλαστικών, η κασπάση-1 (caspase-1 ή ICE), συμμετέχει στη φλεγμονώδη απόκριση, τουλάχιστον 8 από τις 14 κασπάσες των θηλαστικών διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της απόπτωσης (Budihardjo et al., 1999), (Earnshaw et al., 1999), (Fesik and Shi, 2001), (Salvesen and Dixit, 1997), (Thornberry and Lazebnik, 1998). Οι κασπάσες που συμμετέχουν στην απόπτωση χωρίζονται γενικά σε δύο κατηγορίες: τις εναρκτήριες κασπάσες (initiator), στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι κασπάσες-2, -8, -9, και 10, και τις τελεστικές κασπάσες (effector), στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι κασπάσες-3, -6, και -7 (εικόνα 6). Οι κασπάσες παράγονται στα κύτταρα ως καταλυτικά ανενεργά προένζυμα που περιέχουν τρεις διακριτές περιοχές (domains): μια αμινοτελική πρόδρομη περιοχή (prodomain), μια μεγάλη υπομονάδα που περιέχει το ενεργό κέντρο κυστεΐνης μέσα στο συντηρημένο μοτίβο 9

εισαγωγή αμινοξέων QACXG, και μια μικρή καρβοξυτελική υπομονάδα (ανασκόπηση, Zimmermann et al., 2001). Οι κασπάσες ενεργοποιούνται σε πλήρως λειτουργικές πρωτεάσες μετά από δύο γεγονότα κατάτμησης, τα οποία συμβαίνουν μετά από κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος (Asp) (Stennicke and Salvesen, 1998). Η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα μέσω κατάτμησης από τον εαυτό τους ή από άλλες κασπάσες: μετά από κατάτμηση διαχωρίζεται η πρόδρομη περιοχή (prodomain) από τη μεγάλη υπομονάδα, ενώ μια εσωτερική θέση σύνδεσης που περιέχει μία ή δύο θέσεις κατάτμησης, διαχωρίζει τη μεγάλη από τη μικρή υπομονάδα. Η πρώτη πρωτεολυτική κατάτμηση διαχωρίζει την αλυσίδα σε μεγάλη και μικρή υπομονάδα, και η δεύτερη κατάτμηση απομακρύνει την αμινοτελική πρόδρομη περιοχή (prodomain). Η ύπαρξη κατάλοιπων ασπαρτικού οξέος στις περιοχές κατάτμησης είναι απαραίτητη για την ικανότητα των κασπασών να αυτοενεργοποιούνται ή να ενεργοποιούνται από άλλες κασπάσες ως μέρος ενός καταρράκτη ενίσχυσης (ανασκόπηση, Zimmermann et al., 2001). Η δραστική κασπάση είναι ένα τετραμερές δύο μεγάλων και δύο μικρών υπομονάδων, δύο ετεροδιμερή δηλαδή, με δύο ενεργά κέντρα. Κάθε ενεργό κέντρο περιέχει μια θετικά φορτισμένη υποπεριοχή S 1 η οποία δεσμεύεται με την αρνητικά φορτισμένη περιοχή P 1 του ασπαρτικού οξέος του υποστρώματος (ανασκόπηση, Wolf and Green, 1999). Κάθε κασπάση αναγνωρίζει τουλάχιστον τέσσερα συνεχόμενα αμινοξέα, P 4 -P 3 -P 2 -P 1 του υποστρώματος τα οποία αναγνωρίζονται από τις αντίστοιχες S 4 -S 3 -S 2 -S 1 θέσεις της κασπάσης. Οι διαφορετικές κασπάσες διαθέτουν δύο σημαντικές δομικές διαφορές. Πρώτον, ποικίλουν τα μήκη των πρόδρομων περιοχών (prodomains), όπως και η αμινοξική τους αλληλουχία. Μεγάλα prodomains των κασπασών λειτουργούν ως διαμεσολαβητές σημάτων για προ-φλεγμονώδη ή αποπτωτικά σήματα, και διαθέτουν αλληλουχικά μοτίβα που προάγουν την αλληλεπίδραση με ενεργοποιητικά μόρια [caspase-recruitment domain (CARD) or death effector domain (DED)] (Hofmann et al., 1997), (Ashkenazi and Dixit, 1998). Οι εναρκτήριες κασπάσες (κασπάση-2, -8, -9, και 10) χαρακτηρίζονται από μια εκτεταμένη αμινοτελική προ-περιοχή (prodomain) (>90 αμινοξέα) σημαντική για τη λειτουργία τους, ενώ οι τελεστικές κασπάσες περιέχουν μικρές πρόδρομες περιοχές (prodomains) των 20-30 αμινοξέων (ανασκόπηση, Shi, 2002). Δεύτερον, οι πρωτεάσες αυτές μπορούν να υποκατηγοριοποιηθούν με βάση την ειδικότητα που παρουσιάζουν για τα υποστρώματά τους (Thornberry et al., 1997). Οι προβλεπόμενες S 2, S 3, και S 4 θέσεις σύνδεσης της 10

εισαγωγή κασπάσης με το υπόστρωμα ποικίλουν σημαντικά, έχοντας ως αποτέλεσμα μια ποικίλη ειδικότητα για το υπόστρωμα στις θέσεις P 2, P 3, P 4, ανεξάρτητα από την απόλυτη απαίτηση για ασπαρτικό οξύ στην P 1 θέση (Van de Craen et al., 1997), (Humke et al., 1998), (Cohen, 1997), (Walker et al., 1994), (Wilson et al., 1994), (Rotonda et al., 1996), (Mittl et al., 1997). Η ειδικότητα αυτή για το υπόστρωμα είναι ακόμη πιο περιοριστική, αφού δεν κατατμούνται όλες οι πρωτεΐνες που διαθέτουν τη βέλτιστη τετραπεπτιδική αλληλουχία P 4 -P 3 -P 2 -P 1, υπονοώντας πως τριτοταγή δομικά στοιχεία μπορεί να επηρεάζουν την αναγνώριση του υποστρώματος (Thornberry and Lazebnik, 1998). Επιπρόσθετα, πρόσφατες μελέτες, υποδεικνύουν την ύπαρξη κάποιων κασπασών οι οποίες κατατμούν τα υποστρώματά τους μετά από γλουταμινικό οξύ (Glu) (Hawkins et al., 2000), (Srinivasula et al., 2001). 11

εισαγωγή Εικόνα 2: Σχηματικό διάγραμμα των κασπασών στα θηλαστικά Εκτός από την κασπάση-11 (ποντικός), την κασπάση-12 (ποντικός) και την κασπάση-13 (βόδι), όλες οι κασπάσες της εικόνας απαντούνται στον άνθρωπο. Η φυλογενετική τους σχέση (αριστερά), φαίνεται να συσχετίζει τη λειτουργία τους κατά τη φλεγμονή ή την απόπτωση. Οι εναρκτήριες (initiator) κασπάσες και οι τελεστικές (effector) είναι χρωματισμένες μωβ και κόκκινες, αντίστοιχα. Η θέση της πρώτης ενεργοποιητικής κατάτμησης (μεταξύ των μεγάλων και των μικρών υπομονάδων) τονίζεται με τα μεγάλα βέλη, ενώ οι επιπρόσθετες περιοχές κατάτμησης παρουσιάζονται με τα ενδιαμέσου μήκους και τα μικρά βέλη. Σε αντίθεση με άλλα πρωτεολυτικά προένζυμα, η απομάκρυνση του prodomain από την κασπάση δεν είναι απαραίτητη για την καταλυτική του δραστικότητα. Το καταλυτικό κατάλοιπο κυστεΐνης υποδεικνύεται ως κόκκινη γραμμή. Το διάγραμμα αυτό παρουσιάζεται σε κλίμακα σύμφωνα με το πραγματικό μήκος των κασπασών και τη θέση των λειτουργικών τμημάτων (Shi, 2002). 12

εισαγωγή Ενεργοποίηση των κασπασών Έχουν περιγραφεί δύο κύρια μονοπάτια που ενεργοποιούν τις κασπάσες (εικόνα 3), το μονοπάτι των «υποδοχέων θανάτου» (death receptor pathway) και το μιτοχονδριακό μονοπάτι (mitochondrial pathway) (ανασκόπηση, Earnshaw et al., 1999), (ανασκόπηση, Budihardjo et al., 1999). Το πρώτο, ξεκινά με τη σύνδεση ειδικών προσδετών σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφανείας που ονομάζονται «υποδοχείς θανάτου» ή death receptors (DRs). Στα μέλη της οικογενείας αυτής συγκαταλέγονται ο υποδοχέας Fas/CD95, ο υποδοχέας του παράγοντα νέκρωσης όγκων [tumor necrosis factor-α (TNF-α)], και δύο υποδοχείς, οι DR4 και DR5, οι οποίοι δεσμεύονται στον σχετιζόμενο με τον TNF-α επαγωγέα απόπτωσης προσδέτη (TNF-α-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), (Ashkenazi and Dixit, 1999). Το κοινό εξέχον χαρακτηριστικό των διαμεμβρανικών αυτών πρωτεϊνών είναι η παρουσία ενός συντηρημένου κυτταροπλασματικού μοτίβου που ονομάζεται «περιοχή θανάτου» (death domain), το οποίο είναι ικανό να προσδένεται σε ομόλογες περιοχές κυτταροπλασματικών προσαρμοστικών μορίων, κάτω από καθορισμένες συνθήκες. Για παράδειγμα, η σύνδεση της εξωκυτταρικής περιοχής του Fas υποδοχέα με τον Fas προσδέτη ή με αγωνιστικά αντισώματα κατά του υποδοχέα, οδηγούν στην πρόσδεση του προσαρμοστικού μορίου FADD (Fas-associated protein with death domain) στον Fas υποδοχέα, διαμέσου αλληλεπιδράσεων ομόλογων «περιοχών θανάτου» στα δύο μόρια (Strasser et al., 2000), (Hengartner, 2000), (Ashkenazi and Dixit, 1999). Ο τρόπος με τον οποίο η «στρατολόγηση» αυτή λαμβάνει χώρα -για παράδειγμα, διαμέσου μιας επαγόμενης από τον προσδέτη αλλαγής της διαμόρφωσης της «περιοχής θανάτου» του Fas υποδοχέα ή διαμέσου της απώλειας ενός ανασταλτικού προσδεμένου μορίου, ή και των δύο παραμένει άγνωστος. Παρ όλα αυτά, μετά την πρόσδεση του FADD στον Fas υποδοχέα και τη διαμόρφωση του ονομαζόμενου DISC (death-inducing signaling complex), η FADD πρωτεΐνη προσδένεται στην πρόδρομη περιοχή (prodomain) της προκασπάσης-8, αυτή τη φορά μέσω ομοτυπικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ περιοχών που καλούνται «τελεστικές περιοχές θανάτου» (death effector domains). Σύμφωνα με τις μέχρι τώρα έρευνες, η «στρατολόγηση» των μορίων προκασπάσης-8 στο σύμπλοκο Fas-FADD αντιπαραθέτει πολλαπλά προένζυμα προκασπάσης-8, έχοντας ως αποτέλεσμα την αυτοκαταλυτική απελευθέρωση ενεργών μορίων κασπάσης-8 (Salvesen and Dixit, 1999). Άλλοι «υποδοχείς θανάτου» (DRs) φαίνεται να ενεργοποιούν την κασπάση-8 13

εισαγωγή με τον ίδιο μηχανισμό εγγύτητας, αν και διαφορετικές προσαρμοστικές πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται από κάποιους υποδοχείς (ανασκόπηση, Kaufmann and Hengartner, 2001). Ενώ αυτός ο επαγόμενος μηχανισμός εγγύτητας είναι επαρκής για την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 σε τεχνητά συστήματα, είναι πιθανό άλλοι παράγοντες, διαφορετικοί από την τοπική συγκέντρωση, όπως για παράδειγμα, αλλαγές διαμόρφωσης που επάγονται από το FADD, να παίζουν ρόλο στην επαγόμενη από τους «υποδοχείς θανάτου» (DRs) ενεργοποίηση της προκασπάσης-8 κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (ανασκόπηση, Kaufmann and Hengartner, 2001). Στο σημείο αυτό, η σηματοδότηση που ξεκινά από τους «υποδοχείς θανάτου» αποκλίνει σε διαφορετικά κύτταρα. Σε κύτταρα τύπου Ι, τα οποία αντιπροσωπεύονται από έναν αριθμό λεμφοειδών κυτταρικών σειρών, η σύνδεση των «υποδοχέων θανάτου» οδηγεί σε ισχυρή ενεργοποίηση της κασπάσης-8, η οποία στη συνέχεια κατατμεί και ενεργοποιεί την προκασπάση-3. Σε όλα τα υπόλοιπα κύτταρα (τύπου ΙΙ), η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 είναι πολύ λιγότερο ισχυρή από αυτή του τύπου Ι κυττάρων, και γενικά μη ικανή για την απευθείας ενεργοποίηση της προκασπάσης-3. Αντίθετα, η κασπάση-8 κατατμεί την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Bid, προκαλώντας τη δημιουργία ενός θραύσματος που ενεργοποιεί το «μιτοχονδριακό μονοπάτι», το δεύτερο κύριο μονοπάτι ενεργοποίησης των κασπασών (Budihardjo et al., 1999). Το μιτοχονδριακό μονοπάτι ενεργοποίησης των κασπασών, είτε ενεργοποιείται από το κατατμημένο θραύσμα της πρωτεΐνης Bid είτε από άλλα σήματα, περιλαμβάνει την απελευθέρωση πολλαπλών πεπτιδίων από τα μιτοχόνδρια (εικόνα 7). Ένα από αυτά είναι η πρωτεΐνη μεταφορέας ηλεκτρονίων κυτόχρωμα c. Το κυτόχρωμα c συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, όπου δεσμεύεται με την πρωτεΐνη Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1), προκαλώντας εξαρτώμενη από ATP (ή datp) αλλαγή της διαμόρφωσης της Apaf-1 που οδηγεί στον ολιγομερισμό της. Η δέσμευση της προκασπάσης-9 στα ολιγομερή της Apaf-1, διαμεσολαβούμενη από ομοτυπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ περιοχών που καλούνται «περιοχές προσέλκυσης κασπασών» [caspase recruitment domains (CARDs)], έχουν ως αποτέλεσμα στη διαμόρφωση ενός μεγαλομοριακού συμπλόκου που ονομάζεται αποπτώσωμα (apoptosome). Η αλληλεπίδραση αυτή μεταξύ Apaf-1 και προκασπάσης-9 αυξάνει σημαντικά την ενζυμική ενεργότητα της προκασπάσης-9 14

εισαγωγή (Ashkenazi and Dixit, 1999) μέσω ενός μηχανισμού που δεν είναι γνωστός. Η κασπάση-9 με τη σειρά της, ενεργοποιεί πρωτεολυτικά την κασπάση-3. Μια πληθώρα βιοχημικών και γενετικών πειραμάτων (ανασκοπήσεις, Earnshaw et al., 1999), (Starasser et al., 2000), (Hengartner, 2000), (Budihardjo et al., 1999), υποστηρίζουν πως τα μονοπάτια των «υποδοχέων θανάτου» και των μιτοχονδρίων είναι ξεχωριστά. Στοχευμένη καταστολή των γονιδίων της πρωτεΐνης FADD και της προκασπάσης-8 καθιστά κύτταρα σε καλλιέργεια ανθεκτικά στη σύνδεση προσδεμάτων στους «υποδοχείς θανάτου», αλλά όχι και στην ιονίζουσα ακτινοβολία και τη χρήση αντικαρκινικών φαρμάκων. Αντίθετα, στοχευμένη καταστολή των γονιδίων που κωδικοποιούν την προκασπάση-9, την Apaf-1 ή το κυτόχρωμα c, πρωτογενώς επιδρούν στην απόκριση σε παράγοντες που θεωρούνται πως δρουν μέσω του μιτοχονδριακού μονοπατιού. Έχουν επίσης προταθεί επιπρόσθετα μονοπάτια για την ενεργοποίηση των κασπασών. Η Granzyme B, είναι μια ειδική πρωτεάση σερίνης που βρίσκεται στα κοκκία των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Η πρωτεάση αυτή η οποία στοχεύει και κατατμεί πρωτεΐνες μετά από ασπαρτικό οξύ, είχε αρχικά θεωρηθεί πως ενεργοποιούσε απευθείας την κασπάση-3. Πιο πρόσφατες ενδείξεις πάντως, προτείνουν πως η granzyme B κατατμεί την πρωτεΐνη Bid, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί το μιτοχονδριακό μονοπάτι. Επίσης, έχει περιγραφεί πρόσφατα σε κύτταρα ποντικού ένα μονοπάτι που εμπλέκει την ενεργοποίηση της προκασπάσης-12 στο ενδοπλασματικό δίκτυο, αλλά η έλλειψη πληροφοριών σχετικά με την ομόλογη πρωτεΐνη της προκασπάσης-12 σε ανθρώπινα κύτταρα, καθιστά δύσκολη την αποτίμηση της σημαντικότητας του μονοπατιού αυτού (Nakagawa et al., 2000). 15

εισαγωγή Εικόνα 3: πολλαπλά μονοπάτια στην ενεργοποίηση των κασπασών Το μονοπάτι των «υποδοχέων θανάτου» (death receptor) (αριστερό μισό εικόνας), ενεργοποιείται από την πρόσδεση ενός συνδέτη στους υποδοχείς. Η πρόσδεση του FasL στον Fas/CD95, έναν πρωτοτυπικό «υποδοχέα θανάτου» που επιλέχθηκε για τις ανάγκες της απεικόνισης, έχει ως αποτέλεσμα την επακόλουθη δέσμευση του FADD και της προκασπάσης-8 μέσω ομοτυπικών αλληλεπιδράσεων που συμπεριλαμβάνουν τις «περιοχές θανάτου» [death domains (DDs)] και τις «περιοχές επιτέλεσης θανάτου» [death effector domains (DEDs)], αντίστοιχα. Η επαγόμενη από την πρόσδεση του συνδέτη συγκρότηση του συμπλόκου αυτού, προκαλεί τελικά ενεργοποίηση της προκασπάσης-8. Ανάλογα με το κυτταρικό της περιβάλλον, η κασπάση-8 μπορεί στη συνέχεια να προκαλέσει την πρωτεολυτικά-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3 η οποία προκαλεί την αποικοδόμηση ποικίλων υποστρωμάτων ή την κατάτμηση του μέλους της προαποπτωτικής οικογενείας Bcl-2, Bid, το καρβοξυτελικό θραύσμα του οποίου προκαλεί την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια (εικόνα 5, πιο κάτω). Το μιτοχονδριακό μονοπάτι (δεξί μισό της εικόνας) περιλαμβάνει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c και άλλων μιτοχονδριακών πεπτιδίων. Επιπροσθέτως της κασπάσης-8, η κυτταροτοξική πρωτεάση των λεμφοκυττάρων granzyme B (Barry et al., 2000) και κάποιες λυσοσωματικές πρωτεάσες που ονομάζονται καθεψίνες (cathepsins), μπορούν να ενεργοποιήσουν πρωτεολυτικά το Bid, το οποίο μεταφέρεται στα μιτοχόνδρια όπου και προκαλεί την απελευθέρωση κυτοχρώματος c. Άλλα ερεθίσματα, όπως βλάβες του DNA και αναστολείς της μιτωτικής ατράκτου, προκαλούν την απελευθέρωση κυτοχρώματος c ανεξάρτητα από την κατάτμηση του Bid. Μετά την απελευθέρωσή του στο κυτταρόπλασμα, το κυτόχρωμα c προάγει τη σύνδεση της πρωτεΐνης Apaf-1 με την προκασπάση-9, σε ένα σύμπλοκο που ονομάζεται αποπτώσωμα (apoptosome), και το οποίο περιέχει την ενεργοποιημένη μορφή της κασπάσης-9, η οποία πρωτεολυτικά ενεργοποιεί, με τη σειρά της, την κασπάση-3. Επιπλέον του κυτοχρώματος c, οι 16

εισαγωγή μιτοχονδριακές πρωτεΐνες AIF (apoptosis-inducing factor) και η ενδονουκλεάση G (endo G) μετά την απελευθέρωσή τους, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά την απόπτωση, ασκώντας τις επιδράσεις τους στον πυρήνα, ενώ οι SMAC/Diablo πρωτεΐνες απομακρύνουν τις IAPs (inhibitory of apoptosis proteins) μακριά από τις κασπάσες, διευκολύνοντας την ενεργοποίηση και τη δράση των κασπασών (εικόνα από Kaufmann and Hengartner, 2001, τροποποιημένη). Ρύθμιση της ενεργοποίησης των κασπασών Η μεγαλύτερη πρόοδος των ερευνών στο διαχωρισμό των αποπτωτικών μονοπατιών προήλθε από μελέτες στο νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans, έναν οργανισμό που προσφέρεται για γενετικές μελέτες και αποτελείται από 1090 κύτταρα, η μοίρα των οποίων κατά τη διάρκεια της οντογένεσής του, είναι καλά ορισμένη. Μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας σε δύο γονίδιά του, το ced-3 και το ced-4, προκαλούσαν την επιβίωση των 131 σωματικών κυττάρων τα οποία φυσιολογικά πεθαίνουν κατά την ανάπτυξη του C. elegans. Η απόδειξη πως το γονίδιο ced-3 κωδικοποιεί μια κασπάση και το ced-4 ένα πολυπεπτίδιο ομόλογο προς την πρωτεΐνη Apaf-1, δημιούργησε αξιοσημείωτο ενδιαφέρον στην κατανόηση της ρύθμισης της ενεργοποίησης των κασπασών στον οργανισμό αυτό. Επακόλουθες αναλύσεις έδειξαν πως μέλη της οικογένειας Bcl-2 διαδραματίζουν κύριο ρόλο στη διαδικασία αυτή. Τα μέλη της οικογενείας Bcl-2 είναι οι ρυθμιστές κλειδιά στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και των άλλων μιτοχονδριακών παραγόντων που προάγουν απόπτωση. Επειδή τα πολυπεπτίδια αυτά επιδρούν σε μεγάλο αριθμό αποπτωτικών διαδικασιών, μεταλλάξεις στα γονίδια των μελών της οικογένειας προκαλούν σημαντικότατες επιδράσεις στην εμβρυονική ανάπτυξη και στην παθογένεια ασθενειών (Ranger et al., 2001). Με βάση λειτουργικά και δομικά κριτήρια, η οικογένεια Bcl-2 έχει διαχωριστεί σε τρεις ομάδες (εικόνα 8). Η ομάδα Ι περιέχει τα Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl1, Boo/Diva και Nrf3 (Adams and Cory, 1998), (Gross et al., 1999). Όλες οι παραπάνω αντι-αποπτωτικές πρωτεΐνες, χαρακτηρίζονται από τέσσερις μικρές σε μήκος συντηρημένες περιοχές ομολογίας μεταξύ των μελών (Bcl-2 homology, BH), γνωστές ως BH1-BH4. Τα περισσότερα μέλη της ομάδας Ι διαθέτουν μια 17

εισαγωγή καρβοξυτελική υδρόφοβη ουρά με την οποία προσδένονται στην κυτοσολική επιφάνεια πολλών ενδοκυτταρικών μεμβρανών, όπως η εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και το ενδοπλασματικό δίκτυο. Ο πιο καταφανής μηχανισμός με τον οποίο τα μέλη της ομάδας Ι εμποδίζουν τον κυτταρικό θάνατο περιλαμβάνει τη δέσμευση και απομόνωση των προ-αποπτωτικών μελών της οικογένειας Bcl-2, τα οποία ανήκουν στις ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ, ενώ και διαφορετικοί μηχανισμοί που βασίζονται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών έχουν περιγραφεί (Huang and Strasser, 2000). Η ομάδα ΙΙ περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Bax, Bak και Bok/Mtd (Adams and Cory, 1998), (Gross et al., 1999). Αυτά τα πολυπεπτίδια παρουσιάζουν ομοιότητες στη δομή και την αλληλουχία με τα μέλη της ομάδας Ι, με διαφορά την απώλεια της αμινοτελικής BH4 περιοχής (εικόνα 4). Η λειτουργική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, ωστόσο, είναι δραματική: οι Bax και Bak πρωτεΐνες είναι προ-αποπτωτικές. Επιπλέον, η ενεργότητά τους είναι απαραίτητη και πιθανόν ικανή να επάγει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Η ομάδα ΙΙΙ αποτελείται από μεγάλη και ετερογενή ομάδα πολυπεπτιδίων τα οποία περιέχουν μια μόνο BH3 περιοχή. Τα προ-αποπτωτικά αυτά πεπτίδια στα οποία συμπεριλαμβάνονται τα Bid, Bad, Bik, Bim, Blk, Bmf, Hrk, Bnip3, Nix, Noxa, Puma (Huang and Strasser, 2000), (Nakano and Wousden, 2001), (Yu et al., 2001), δρουν με το να συνδέονται στα μέλη των ομάδων Ι ή/και ΙΙ, μέσω των BH3 περιοχών τους. Τα πολυπεπτίδια της ομάδας ΙΙΙ αποκρίνονται σε ένα εύρος προ-αποπτωτικών ερεθισμάτων (από την απομάκρυνση τροφικών παραγόντων έως την απότομη ρήξη του κυτταροσκελετού ή βλάβες στο DNA), προτείνοντας τη συμμετοχή τους στην προσπάθεια του κυττάρου να ενσωματώσει τον υπερμεγέθη αριθμό των γνωστών προ- και αντι-αποπτωτικών σημάτων σε μία μοναδική απόδοση ζωής ή θανάτου. Στο μοντέλο αυτό, τα πολυπεπτίδια της ομάδας ΙΙΙ αναπαριστούν τους αισθητήρες, τα μέλη της ομάδας Ι τους ρυθμιστές της διαδικασίας και οι πρωτεΐνες της ομάδας ΙΙ την τελική έξοδο της ενσωμάτωσης των σημάτων. 18

εισαγωγή Εικόνα 4: οι ομάδες της Bcl-2 οικογενείας με τις χαρακτηριστικές δομικές BCL-2 ομόλογες περιοχές (BHs) (εικόνα από Kaufmann and Hengartner, 2001, τροποποιημένη). Πολλές δημοσιεύσεις των τελευταίων ετών παρείχαν πληροφορίες για τη διαδικασία της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια κατά την απόπτωση των κυττάρων θηλαστικών (εικόνα 9). Είναι τώρα γνωστό πως τα προαποπτωτικά μέλη της Bcl-2 οικογένειας, Bax και Bak, τα οποία φυσιολογικώς εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα, μετατοπίζονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη όπου και υπόκεινται σε αλλαγή της διαμόρφωσής τους, ολιγομερίζονται, εισέρχονται στη μεμβράνη και διευκολύνουν την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (Nomura et al., 1999), (Eskes et al., 2000), (Wie et al., 2000), (Suzuki et al., 2000), (Antonsson et al., 2001). Η σημασία της μετατόπισης αυτής διαφαίνεται από την ανθεκτικότητα κυττάρων, που έχουν υποστεί διπλή καταστολή στα γονίδια Bax και Bak (Bax -/-, Bak -/- ), σε αποπτωτικά ερεθίσματα, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, η στέρηση αυξητικών παραγόντων και η επίδραση μιας ποικιλίας φαρμάκων (Wei et al., 2001). Αντίθετα, αντι-αποπτωτικά μέλη της Bcl-2 οικογένειας, όπως το Bcl-2 και το αδενοϊικό πολυπεπτίδιο Ε1Β 19Κ, φαίνεται να δρουν, τουλάχιστον κατά μέρος, με το να προσδένονται ειδικά στην ενεργοποιημένη διαμόρφωση του Bax, κι έτσι να 19

εισαγωγή εμποδίζουν την ένθεση του Bax στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (Perez και White, 2000). Ενώ οι παρατηρήσεις αυτές προτείνουν ένα μοντέλο εργασίας πάνω στο οποίο μπορούν να στηριχθούν επακόλουθες ερευνητικές προσπάθειες, σημαντικά ερωτήματα παραμένουν. Πρώτον, ποια είναι η ακολουθία των γεγονότων που οδηγούν στην εισχώρηση των Bak και Bax στη μιτοχονδριακή μεμβράνη; Αν και τα πολυπεπτίδια αυτά συνδέονται χαλαρά με τη μιτοχονδριακή επιφάνεια σε μερικούς κυτταρικούς τύπους, παραμένουν στο κυτταρόπλασμα σε άλλους (Desagher and Martinou, 2000). Επομένως, είναι πιθανόν πως η αλλαγή της διαμόρφωσης ή κάποιες άλλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις είναι απαραίτητες πριν τα μόρια αυτά προσεγγίσουν τη μιτοχονδριακή μεμβράνη (ανασκόπηση, Kaufmann and Hengartner, 2001). Δεύτερον, τι οδηγεί στον ολιγομερισμό και την εισχώρηση των Bak και Bax; Μολονότι, το t-bid, το κατατμημένο καρβοξυτελικό τμήμα του Bid - όταν η κασπάση-8 το κατατμεί - είναι ικανό να επάγει τον ολιγομερισμό και την εισχώρηση των Bak και Bax (Eskes et al., 2000) in vitro (Wie et al., 2000), άλλοι παράγοντες (όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία και ποικιλία αντικαρκινικών φαρμάκων), φαίνονται να πυροδοτούν την μετατόπιση των Bak και Bax ανεξάρτητα από την ενεργοποίηση της κασπάσης-8. Μια πιθανή εξήγηση είναι πως άλλα μέλη της ομάδας ΙΙΙ της Bcl-2 οικογένειας μπορεί να υποκαθιστούν τη δράση του tbid κάτω από κάποιες συνθήκες. Πιθανοί υποψήφιοι για τον ρόλο αυτό φαίνεται να είναι η πρωτεΐνη Bim, ένα προαποπτωτικό μέλος της οικογένειας Bcl-2 που συνδέεται με τον κυτταροσκελετό (Bouillet et al, 1999), όπως και η πρωτεΐνη Noxa και η PUMA, δύο επαγόμενες από το p53 πρωτεΐνες της ομάδας ΙΙΙ της οικογένειας Bcl-2 (Oda et al., 2000), (Yu et al., 2001). Εναλλακτικά, είναι πιθανόν, πως κάποιες - μη γνωστές μέχρι σήμερα - μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ρυθμίζουν τις μετατοπίσεις των Bak και Bax στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (ανασκόπηση, Kaufmann and Hengartner, 2001). Τρίτον, πώς ρυθμίζονται οι μετατοπίσεις αυτές; Φαίνεται πως η πρωτεΐνη E1B 19K και η Bcl-2 δεσμεύονται ειδικά στην ενεργοποιημένη διαμόρφωση του Bax, εμποδίζοντας τον ολιγομερισμό του και την εισχώρησή του στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Παραμένει να εξακριβωθεί εάν κι άλλα αντιαποπτωτικά μέλη της οικογένειας (για παράδειγμα το Bcl-x L και το Mcl-1), επιδεικνύουν αυτή την ειδικότητα κι εάν η ικανότητά τους να εμποδίζουν το Bax επεκτείνεται και στο Bak. 20

εισαγωγή Τέλος, πώς διευκολύνεται η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από την εισχώρηση των Bak και Bax στην μιτοχονδριακή μεμβράνη; Αν και έχουν προταθεί ποικίλα μοντέλα που κυμαίνονται από μια ενδεχόμενη μιτοχονδριακή ρήξη μέχρι τη διαμόρφωση πόρων με τη συμμετοχή του κυτοχρώματος c (με ή χωρίς τη συμμετοχή μιτοχονδριακών μεμβρανικών πρωτεϊνών), περαιτέρω έρευνες πρέπει να διεξαχθούν ώστε να προσεγγιστεί το παραπάνω ερώτημα, το οποίο βρίσκεται στην καρδιά του μιτοχονδριακού μονοπατιού (ανασκόπηση, Kaufmann and Hengartner, 2001). Εικόνα 5: ο ρόλος των μελών της οικογένειας Bcl-2 στην απόπτωση Τα αντιαποπτωτικά μέλη της Bcl-2 οικογένειας αναστέλλουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια, ενώ τα μέλη της ομάδας ΙΙ της ίδιας οικογένειας τη διευκολύνουν. Τελευταίες ενδείξεις προτείνουν πως τα Bax και Bak μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια, ολιγομερίζονται και εισέρχονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Το κατατμημένο Bid διευκολύνει τη μετατόπιση αυτή. Αντίθετα, τα E1B 19K, Bcl-2 και Bcl-xL αναστέλλουν τη μεμβρανική είσοδο του Bax. Μετά από τις παρατηρήσεις αυτές κανείς υποθέτει πως άλλα μέλη της ομάδας ΙΙΙ (μέλη που διαθέτουν μια μόνο BH3 περιοχή) μπορεί να είναι ικανά να επάγουν αλλαγή της διαμόρφωσης του Bax ή/και του Bak, διευκολύνοντας τον ολιγομερισμό και την είσοδο των πολυπεπτιδίων αυτών στη μεμβράνη, όπου και συμμετέχουν στη διαμόρφωση 21

εισαγωγή πόρων που συμβάλλουν στη απελευθέρωση κυτοχρώματος c και άλλων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (εικόνα από Kaufmann and Hengartner, 2001, τροποποιημένη). Εξερχόμενα τοξικά πολυπεπτίδια από τα μιτοχόνδρια Εκτός από το κυτόχρωμα c, μια ποικιλία πολυπεπτιδίων εξέρχονται από τα μιτοχόνδρια κατά την απόπτωση (Desagher and Martinou, 2000). Η πρωτεΐνη AIF (apoptosis-inducing factor), είναι μια φυλογενετικά συντηρημένη οξειδοαναγωγάση, με άγνωστη μέχρις στιγμής λειτουργία. Απομονώθηκε αρχικά, από την ικανότητά της να επάγει συμπύκνωση της χρωματίνης και κατάτμηση του DNA σε απομονωμένους πυρήνες, ανεξάρτητα από τις κασπάσες (Susin et al., 1999). Ο τρόπος με τον οποίο η πρωτεΐνη αυτή προκαλεί τις αλλαγές αυτές παραμένει άγνωστος. Επιπλέον, περιπλεγμένα αποτελέσματα από πειράματα στόχευσης γονιδίων αποτέλεσαν την απαρχή νέων ερωτημάτων για τον ακριβή ρόλο της πρωτεΐνης αυτής κατά την αποπτωτική διαδικασία. Κύτταρα με στοχευμένη απώλεια των γονιδίων AIF (AIF - / - ), παραμένουν ευαίσθητα σε ποικιλία παραγόντων που επάγουν απόπτωση (Joza et al., 2001), ενώ κύτταρα με έλλειμμα στο κυτόχρωμα c (c - / - ), καθίστανται ανθεκτικά στην επαγωγή της απόπτωσης από πολυάριθμους παράγοντες (Li et al., 2000), προτείνοντας πως, κάτω από τις περισσότερες συνθήκες, η απελευθέρωση του AIF δεν είναι επαρκής ούτε θεμελιώδης για τον κυτταρικό θάνατο. Επιπροσθέτως του AIF, τα μιτοχόνδρια απελευθερώνουν την ενδονουκλεάση G, η οποία πρόσφατα ενεπλάκη στην αποπτωτική αποικοδόμηση του DNA (Li et al., 2001), (Parrish et al., 2001). Αν και πρώιμες μελέτες υποδείκνυαν μια ποικιλία ενδονουκλεασών που μεσολαβούσαν στην αποπτωτική διανουκλεοσωμική κατάτμηση, πιο πρόσφατα, η προσοχή εστιάσθηκε στην Dnase II και στην CAD (caspase-activated deoxyribonuclease)/dff40/cpan. Μελέτες του 2000, υποδεικνύουν πως η Dnase ΙΙ παίζει σημαντικό ρόλο στην πέψη αποπτωτικών σωμάτων από φαγοκύτταρα, αλλά όχι στην κυτταρική αποσυγκρότηση καθεαυτή (McIlroy et al., 2000), αφήνοντας την ενδονουκλεάση CAD ως τον μοναδικό υποψήφιο για τον τίτλο της αποπτωτικής ενδονουκλεάσης στα θηλαστικά. Η ενδονουκλεάση CAD είναι μια δομικά ξεχωριστή, εξαρτώμενη από μαγνήσιο ενδονουκλεάση, η οποία φυσιολογικώς εντοπίζεται στον πυρήνα σε 22

εισαγωγή σύμπλοκο με τη συνοδευτική της πρωτεΐνη και αναστολέα της ICAD (inhibitor of CAD), (Nagata et al., 2000). Καθώς τα κύτταρα αποπίπτουν, η ενεργοποιημένη κασπάση-9 βλάπτει τους πυρηνικούς πόρους, με κάποιον άγνωστο μέχρις στιγμής τρόπο, επιτρέποντας την είσοδο στον πυρήνα της κασπάσης-3 (Martins et al., 1997). Η κασπάση-3 στη συνέχεια, κατατμεί την ICAD, ελευθερώνοντας την ενδονουκλεάση CAD και επιτρέποντας την αποπτωτική πέψη της χρωματίνης (Nagata et al., 2000). Ένα άλλο πολυπεπτίδιο που απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια κατά την απόπτωση είναι το SMAC ( second mitrochondrial activator of caspases ή Diablo), το οποίο απομονώθηκε αρχικά από την ικανότητά του να διευκολύνει την ενεργοποίηση των κασπασών σε σύστημα ελεύθερο κυττάρων που περιείχε τις πρωτεΐνες κυτόχρωμα c, Apaf-1 και την προκασπάση-9 (Du et al., 2000). Επιπρόσθετες αναλύσεις αποκάλυψαν πως η SMAC πρωτεΐνη ρυθμίζει τα αποπτωτικά γεγονότα με το να δεσμεύεται και να απενενεργοποιεί κάποιες πρωτεΐνες που ονομάζονται IAPs (inhibitors of apoptosis), (Verhagen et al., 2000). Οι IAPs είναι μια οικογένεια πολυπεπτιδίων που εμπλέκονται στην ρύθμιση της αποπτωτικής διαδικασίας (Deveraux and Reed, 1999). Μέρος της αντι-αποπτωτικής τους δράσης έχει αποδοθεί στην ικανότητά τους να δεσμεύονται και να απενεργοποιούν τις ενεργοποιημένες κασπάσες-3, -7, και -9. Η SMAC πρωτεΐνη ως εκ τούτου, προάγει την απόπτωση αναστέλλοντας τις (ανασταλτικές) IAPs πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα να απελευθερώνει τις κασπάσες για να επιτελέσουν το «έργο τους». Υποστρώματα των κασπασών κατά την απόπτωση Το 1998, οι Stroh και Schulze-Osthoff, δημοσίευσαν μια λίστα που περιελάμβανε 65 διαφορετικές πρωτεΐνες οι οποίες κατατμούνται από πρωτεάσες της οικογένειας των κασπασών (Stroh and Schulze-Osthoff, 1998). Τα περισσότερα από τα γνωστά ως τότε υποστρώματα, μπορούσαν να κατηγοριοποιηθούν σε μικρό αριθμό λειτουργικών ομάδων, συμπεριλαμβάνοντας πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη στήριξη του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος και τη ρύθμιση της μεταγραφής, πρωτεΐνες ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου καθώς κι άλλες που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και τη διόρθωση βλαβών του. Από τότε, ο αριθμός των υποστρωμάτων των κασπασών έχει σημαντικά 23

εισαγωγή αυξηθεί, φθάνοντας το 2003 στην ταυτοποίηση 280 πρωτεϊνών - στόχων των κασπασών (Fischer et al., 2003). Οι προ- και αντι-αποπτωτικές πρωτεΐνες είναι πιθανόν οι πρώτοι στόχοι των κασπασών μετά από ένα αποπτωτικό ερέθισμα (Cohen, 1997), (Nicholson and Thornberry, 1997), (Cryns and Yuan, 1998). Αυτά τα γεγονότα κατάτμησης συμμετέχουν στην ενίσχυση του σήματος και την αναστολή της απενεργοποίησης. Για παράδειγμα, ενεργοποίηση των προκασπασών παράγει ικανή πρωτεολυτική δραστηριότητα για να αδρανοποιήσει τους ενδογενείς αναστολείς των κασπασών, όπως οι πρωτεΐνες αναστολείς της απόπτωσης (IAPs). Η κασπάση-3 καταμεί τις Bcl-2 και Bcl-xL, γεγονός το οποίο καταστρέφει την αντι-αποπτωτική δράση των πρωτεϊνών αυτών και απελευθερώνει καρβοξυτελικά θραύσματα τα οποία είναι προαποπτωτικά. Ομοίως, όπως έχει προαναφερθεί, η κασπάση-8 κατατμεί την πρωτεΐνη Bid, απελευθερώνοντας ένα καρβοξυτελικό θραύσμα που επάγει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια (Li et al., 1998), (Luo et al., 1998). Η κασπάση-8 καταμεί επίσης την p28bap31, μια πρωτεΐνη εντοπισμένη στο ενδοπλασματικό δίκτυο, συνδεόμενη με την Bcl-2. Το γεγονός την κατάτμησης αυτής μπορεί να ενισχύει την αποπτωτική σηματοδότηση, διότι το αμινοτελικό θραύσμα της p28bap31 επάγει απόπτωση. Συνεπώς, οι ενεργοποιημένες κασπάσες διαθέτουν πολλαπλούς τρόπους για να ενισχύουν την αποπτωτική σηματοδότηση. Καθώς το αποπτωτικό σήμα διαδίδεται, οι κασπάσες ενεργοποιούν άλλα συστατικά της αποπτωτικής μηχανής. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται οι πρωτεΐνες ICAD, gelsolin, PAK2, MEKK1 και η PKCδ (Cohen, 1997), (Nicholson and Thornberry, 1997), (Cryns and Yuan, 1998). Η πρωτεόλυση των πρωτεϊνών αυτών, έχει άμεση επίδραση στον αποπτωτικό φαινότυπο. Για παράδειγμα, η κατάτμηση της πρωτεΐνης ICAD από την κασπάση-3, προκαλεί την απελευθέρωση της ενδονουκλεάσης CAD, η οποία με τη σειρά της κατατμεί το DNA και προάγει τη συμπύκνωση της χρωματίνης. Η κασπάση-3 επίσης κατατμεί και ενεργοποιεί την πρωτεΐνη gelsolin, μια πρωτεΐνη η οποία ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης. Η ενεργοποιημένη μορφή της gelsolin προάγει αποπτωτικό φαινότυπο στο κυτταρόπλασμα αλλά και τον πυρήνα, συμπεριλαμβανομένης και της κατάτμησης του DNA. Η εξαρτώμενη από τις κασπάσες ενεργοποίηση των κινασών PAK2, MEKK1 και PKCδ, επίσης προάγουν απόπτωση, και ιδιαίτερα στην περίπτωση της MEKK1, η ενεργοποίησή της ενισχύει και την ενεργοποίηση των κασπασών, προτείνοντας πως 24

εισαγωγή οι κινάσες μπορεί να ενισχύουν ή και να εμπλέκονται στην έναρξη του καταρράκτη ενεργοποίησης των κασπασών (ανασκόπηση, Wolf and Green, 1999). Οι κασπάσες επίσης κατατμούν δομικές πρωτεΐνες του πυρήνα και του κυτταροσκελετού (Gohring et al., 1997). Η πρωτεόλυση των λαμινών (lamins), της NuMa, της SAF-A κι άλλων, προάγουν τη διάλυση του πυρήνα. Ομοίως, οι κασπάσες διαρρηγνύουν την ακεραιότητα του κυτταροσκελετού με την πρωτεόλυση των πρωτεϊνών όπως η fodrin,η Gas2, οι κερατίνες (keratins), η Rabaptin-5 και η ακτίνη. Η κατάτμηση της β-κατενίνης (β-catenin) και της FAK, φαίνεται να διακόπτει τις μεταξύ των κυττάρων συνδέσεις και την εστιακή προσκόλληση μεταξύ κυττάρων και θεμέλιας ουσίας. Μαζί, οι κατατμήσεις αυτές μπορεί να προκαλούν το «πακετάρισμα» του κυττάρου και τη διευκόλυνση της επακόλουθης φαγοκυττάρωσης. Μια άλλη ομάδα υποστρωμάτων των κασπασών περιλαμβάνει πρωτεΐνες σημαντικές για την κυτταρική σηματοδότηση, τη σύνθεση των μακρομορίων και την επιδιόρθωση βλαβών. Στις πρωτεΐνες αυτές περιλαμβάνονται κινάσες, ένζυμα και παράγοντες απαραίτητοι για τη σύνθεση των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων. Η εξαρτώμενη από τις κασπάσες επίσης πρωτεόλυση προάγει την αποικοδόμηση των Akt-1και Raf-1, δύο πολύ σημαντικών κινασών για την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση (Widmann et al., 1998). Ωστόσο, οι πρωτεΐνες αυτές δεν είναι άμεσα υποστρώματα των κασπασών, γεγονός που υποδηλώνει πως οι κασπάσες μπορούν να ενεργοποιούν κι άλλες πρωτεάσες οι οποίες συμμετέχουν στα αποπτωτικά γεγονότα. Από την άλλη, η αναστολή της επιδιόρθωσης του DNA μέσω της άμεσης στόχευσης πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή, όπως για παράδειγμα η κατάτμηση της πρωτεΐνης PARP-1 (της οποίας η κατάτμηση αποτελεί εξέχοντα δείκτη του αποπτωτικού φαινοτύπου, ανασκόπηση Soldani and Scovassi, 2002), καθώς και των κινασών ATM και DNA-PK, προάγει την αποπτωτική διαδικασία. Οι κασπάσες επίσης κατατμούν τις πρωτεΐνες parkin, presenilin-1 και -2, huntingtin, atrophin-1, καθώς κι άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε νευροεκφυλιστικές νόσους (Widmann et al, 1998), (Wellington et al., 1998), (Goldberg et al., 1996), (Wolozin et al., 1996). Για παράδειγμα, οι κασπάσες-1 και -8 κατατμούν την πρωτεΐνη parkin, απενεργοποιούν την αντιαποπτωτική της δράση ως λιγάση ουβικουϊτίνης και πιθανότατα προκαλούν τη συσσώρευση των τοξικών υποστρωμάτων της parkin επάγοντας τον ντοπαμινεργικό κυτταρικό θάνατο (Kahns et al., 2003). Κάποιες από τις πρωτεΐνες αυτές κατατμούνται κατά την απόπτωση, η 25

εισαγωγή σημαντικότητα όμως των συγκεκριμένων πρωτεολυτικών γεγονότων δεν είναι διασαφηνισμένη πλήρως. Ο Wellington και η ομάδα του, ωστόσο, (Wellington et al., 1998), προτείνουν πως προένζυμα των κασπασών μπορούν να κατατμούν πρωτεΐνες που ενέχονται σε νευροεκφυλιστικές νόσους σε χαμηλά επίπεδα, δημιουργώντας όμως τοξικά θραύσματα που προάγουν απόπτωση και ίσως νευροεκφυλιστικές νόσους. Στις πρωτεΐνες που στοχεύονται κατά την απόπτωση συμπεριλαμβάνονται και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA, όπως η DNA πολυμεράση ε, η πρωτεΐνη MCM3 η οποία είναι ένας αντιγραφικός παράγοντας μέλος του συμπλόκου των MCM πρωτεϊνών, η πρωτεΐνη RFC140 (replication factor C), ενώ τελευταία έχουν αναφερθεί και αρκετές πρωτεΐνες που ενέχονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου όπως η κινάση τυροσίνης c-abl, η κυκλίνη E, η MDM2 πρωτεΐνη που ρυθμίζει την αποικοδόμηση του p53, ο αναστολέας της κινάσης Cdk2 p21 waf1, η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος Rb (ανασκόπηση, Fischer et al., 2003), αλλά και το μέλος του προαντιγραφικού συμπλόκου Cdc6 (Pelizon et al., 2002). 26

εισαγωγή Β. Κυτταρικός Κύκλος Β1. Γενικά Το κύτταρο είναι η θεμελιώδης δομική και λειτουργική μονάδα από την οποία απαρτίζονται οι ζώντες οργανισμοί. Τα κύτταρα εμφανίζουν όλες τις λειτουργίες που είναι συνυφασμένες με τη ζωή, μεταξύ των οποίων είναι η «διαφύλαξη» των κληρονομήσιμων γενετικών πληροφοριών σε κατάλληλες γενετικές δομές (DNA) και η μεταβίβασή τους στην επόμενη γενιά κυττάρων (κληρονομικότητα). Η μεταβίβαση αυτή επιτυγχάνεται μέσω μιας διαδικασίας κατά την οποία ένα μητρικό κύτταρο δίνει γένεση σε δύο νέα θυγατρικά κύτταρα, μία διαδικασία γνωστή ως κυτταρική διαίρεση. Η κυτταρική διαίρεση έχει χαρακτηριστεί ως η θεμελιώδης αρχή που διέπει την αύξηση και ανάπτυξη όλων των ζωικών και φυτικών οργανισμών και αποτελεί τη βάση της κληρονομικότητας (ανασκόπηση: Nurse, 2000α, Nurse, 2000β) και αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ελεγχόμενης διαδικασίας που ονομάζεται κυτταρικός κύκλος. Β2. Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου Η πρώτη διάκριση του κυτταρικού κύκλου σε επιμέρους χρονικά διαστήματα ή φάσεις έγινε με την παρατήρηση κυτταρικών διαιρέσεων στο μικροσκόπιο. Έτσι, διακρίθηκαν δύο φάσεις που αντιστοιχούν σήμερα στη μίτωση-κυτταροκίνηση και τη μεσόφαση, κατά την οποία μπορούσε να παρατηρηθεί μόνο η αύξηση του μεγέθους του κυττάρου. Η παρατήρηση της εμφάνισης και του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων από τον Flemming το 1879 οδήγησε στην πρώτη απόπειρα διάκρισης της κυτταρικής διαίρεσης σε τρεις φάσεις, που οριοθετούνταν από την εμφάνιση των χρωμοσωμάτων, τον αποχωρισμό των αδερφών χρωματίδων, την κίνησή τους προς τους αντίθετους πόλους του κυττάρου και τέλος την εξαφάνισή τους - καθώς η χρωματίνη μεταπίπτει σε λιγότερο συμπυκνωμένη μορφή. Μόνο όταν ανακαλύφθηκε η χημική σύσταση του γενετικού υλικού (Avery et al., 1944) κατέστη δυνατή η χρονική τοποθέτηση του διπλασιασμού του μέσα στον κυτταρικό κύκλο. Η μέτρηση της ποσότητας του DNA του κυττάρου με τη χρήση 27

εισαγωγή ραδιενεργών ισοτόπων κατά τη διάρκεια του κύκλου (Swift, 1950), (Howard and Pelc, 1953), ανέδειξε ότι το γενετικό υλικό διπλασιάζεται σε μια συγκεκριμένη χρονική φάση η οποία προηγείται αρκετά του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων (Walker and Yates, 1952), (ανασκόπηση, Nasmyth 2001). Έτσι, ο κυτταρικός κύκλος διαιρέθηκε πλέον στις 4 φάσεις που αναγνωρίζουμε ως σήμερα: τη φάση S (Synthesis) κατά την οποία συμβαίνει η σύνθεση του DNA, τη φάση Μ η οποία περιλαμβάνει τη μίτωση (διαίρεση χρωμοσωμάτων) και την κυτταροκίνηση (κυτταροπλασματική διαίρεση), και στις φάσεις G 1 και G 2 (Gap 1 και Gap 2), που αποτελούν τα διαστήματα μεταξύ των φάσεων Μ και S (Εικόνα 1). Επειδή η μίτωση αποτελεί τη φάση με τα πιο δραματικά γεγονότα που καταλήγει -συνήθως- στο διαχωρισμό των δυο κυττάρων κατά την κυτταροκίνηση και είναι η μόνη που αναγνωρίζεται στο μικροσκόπιο, όλες οι υπόλοιπες φάσεις (G 1, S και G 2 ) αναφέρονται συνολικά και ως μεσόφαση. Η διάκριση μεταξύ τους βασίζεται σε βιοχημικά κριτήρια, όπως η ενσωμάτωση ραδιενεργού θυμιδίνης ή βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) ή η μέτρηση του περιεχόμενου DNA ανά κύτταρο με FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Η μίτωση διακρίνεται σε τέσσερις επιμέρους φάσεις: την πρόφαση, τη μετάφαση, την ανάφαση και την τελόφαση. Εικόνα 6. Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου. 28