ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΚΛΑΜΑΝΟΥ Π. ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΚΛΑΜΑΝΟΥ Π. ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΡΜΟΝΩΝ ΜΕ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ-ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 009

AΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΚΛΑΜΑΝΟΥ Π. ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΡΜΟΝΩΝ ΜΕ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ-ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του Τομέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης σε συνεργασία με το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Σερρών του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων. Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: 3-10-009 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Ιωάννης Παπαδογιάννης - (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης (Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών) Καθηγήτρια Ελένη Τσούκαλη - (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Αναπλ. Καθηγητής Δημήτριος Φλετούρης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσ/νίκης) Επικ. Καθηγήτρια Βικτώρια Σαμανίδου (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσ/νίκης) Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Θεοδωρίδης - Επιβλέπων Καθηγητής Επικ. Καθηγητής Νικόλαος Θωμαΐδης (Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών)

Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής του Γεώργιου Κακλαμάνου, χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την Παρασκευή 3-10-009, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής με τίτλο «Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορμονών με αυξητική δράση σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών». Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της Επιστήμης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Καθηγητής Ιωάννης Παπαδογιάννης Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης Καθηγήτρια Ελένη Τσούκαλη Αναπλ. Καθηγητής Δημήτριος Φλετούρης Επικ. Καθηγήτρια Βικτώρια Σαμανίδου Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Θεοδωρίδης Επικ. Καθηγητής Νικόλαος Θωμαΐδης

Γεώργιος Π. Κακλαμάνος Α.Π.Θ. «Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορμονών με αυξητική δράση σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών» ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας τη Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Ν. 5343 / 193, άρθρ. 0, παρ. )

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ........4 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ.....4 1.. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ....5 1.3. ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ...6 1.4. ΠΗΓΗ ΙΟΝΤΩΝ....7 1.4.1. Ιοντισμός με ηλεκτρόνια (Electron Impact)........8 1.4.. Χημικός ιοντισμός (Chemical Ionisation)....... 9 1.4.3. Ψεκασμός σε ηλεκτρικό δυναμικό (Electrospray)....10 1.4.4. Ιοντισμός με laser και υποβοήθηση υποστρώματος.. 1 1.5. ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΜΑΖΩΝ...13 1.5.1. Αναλυτής απλής εστίασης......... 14 1.5.. Αναλυτής διπλής εστίασης......16 1.5.3. Τετραπολικός αναλυτής (Quadrupole).17 1.5.4. Παγίδα ιόντων (Ion Trap)..... 1.5.5. Αναλυτής χρόνου πτήσης (Time of Flight, TOF).....3 1.5.6. Υβριδικός αναλυτής Orbitrap........6 1.6. ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ..9 1.6.1. Φαρανταϊκό κύπελλο (Faraday cup)...9 1.6.. Ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής (Electron multiplier). 9 1.7. ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΕΝΟΥ 31 1.8. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ Η/Υ..31 1.9. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..3. Η ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ.....33.1. ΦΑΣΜΑ ΜΑΖΩΝ 33.. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΑΖΩΝ.34..1. Προσδιορισμός μοριακών τύπων-μοριακής δομής...34... Ταυτοποίηση με σύγκριση φασμάτων (Data Libraries)....35 I

.3. ΣΥΖΕΥΞΗ ΜΕ LC ή GC.......36.4. ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΣΕ ΣΕΙΡΑ (Tandem MS)...38.5. EΦΑΡΜΟΓΕΣ..40.5.1. Ταυτοποίηση και μελέτη δομής 40.5.. Έλεγχος προσμίξεων. 40.5.3. Ποσοτική ανάλυση μίγματος...41.5.4. Ισοτοπική επισήμανση με σταθερά ισότοπα.4.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...43 3. ΣΥΣΤΗΜΑ LC-ΜS/MS......44 3.1. ΓΕΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ... 44 3.. ΓΕΝΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ.. 46 3.3. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΠΗΓΗΣ API-ΙΟΝΙΣΜΟΣ APCI...49 3.4. ΙΟΝΙΣΜΟΣ ESI 5 3.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...54 4. ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ ΑΝΑΒΟΛΙΚΑ...55 4.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ.... 55 4.. ΔΟΜΕΣ, ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΤΥΠΟΙ, ΔΡΑΣΗ, ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ...58 4.3. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...63 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ......64 5.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 64 5.. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΜΕ GC-MS. 66 5..1. Mυϊκός ιστός (κρέας).... 66 5... Λίπος.. 67 5..3. Ούρα και ορός.....68 5.3. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΜΕ LC-MS.........71 5.3.1. Μυϊκός ιστός (κρέας).... 71 5.3.. Λίπος.7 5.3.3. Ούρα και ορός...73 5.4. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΣΕ ΤΡΙΧΕΣ.77 5.4.1. Εισαγωγή 77 II

5.4.. Χημική σύσταση της τρίχας... 80 5.4.3. Υφή της τρίχας...81 5.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...85 6. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 89 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΥΛΙΚΑ...93 7.1. ΟΡΓΑΝΑ 93 7.. ΣΥΣΚΕΥΕΣ......95 7.3. ΥΛΙΚΑ... 97 8. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ..99 8.1. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ..99 8.. ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ...99 8.3. ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ....101 8.4. ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ....104 8.5. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ 107 8.6.ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΤΟ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΟ ΜΑΖΩN...108 8.6.1. Βελτιστοποίηση παραμέτρων στην πηγή ιοντισμού... 108 8.6.. Ρύθμιση του συστήματος για APCI/MS/MS...110 8.6.3. Συνθήκες του συστήματος MS...114 8.7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ....116 9. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΕ ΜΥΙΚΟ ΙΣΤΟ (ΚΡΕΑΣ)...117 9.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..... 117 9.. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.. 119 9..1. Ενζυμική πέψη.........119 9... Εκχύλιση υγρού-υγρού....119 9..3. Αφαίρεση λίπους...119 9..4. Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλη Οasis (60 mg, 3 ml) 10 III

9..5. Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλη Αmino (500 mg, 3 ml) 10 9.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ....... 1 9.3.1. Συνθήκες LC-MS/MS.........1 9.3.. Βελτιστοποίηση προκατεργασίας....14 9.3.3. Επικύρωση της μεθόδου με βάση την Κοινοτική Απόφαση 00/657/EC..130 9.3.3.1. Βασικές αρχές του προγράμματος ResVal.1...130 9.3.3.. Έλεγχος γραμμικότητας-χάραξη καμπυλών αναφοράς...131 9.3.3.3. Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου......139 9.3.3.4. Ειδικότητα/ανθεκτικότητα........144 9.3.3.5. Όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης.....146 9.3.3.6. Αβεβαιότητα στην τιμή μέτρησης.........149 9.3.3.7. Μέθοδος επιβεβαίωσης.........15 9.3.4. Εφαρμογή μεθόδου σε μυϊκό ιστό (κρέας).....155 9.4. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.........156 9.5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...158 10. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΟΓΕΣΤΑΓΟΝΩΝ ΣΕ ΛΙΠΟΣ....160 10.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ.......160 10.. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 16 10..1. Προετοιμασία δείγματος για έγχυση στο GPC......16 10... Προγραμματισμός του GPC..16 10..3. Εξάτμιση....16 10.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ..... 164 10.3.1. Συνθήκες LC-MS/MS.........164 10.3.. Βελτιστοποίηση προκατεργασίας δείγματος.....165 10.3.3. Επικύρωση της μεθόδου με βάση την Κοινοτική Απόφαση 00/657/EC...169 10.3.3.1. Έλεγχος γραμμικότητας-χάραξη καμπυλών αναφοράς...170 10.3.3.. Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου......173 10.3.3.3. Ειδικότητα/ανθεκτικότητα........174 10.3.3.4. Όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης.....175 10.3.3.5.Αβεβαιότητα στην τιμή μέτρησης......176 10.3.3.6.Μέθοδος επιβεβαίωσης......176 IV

10.3.4. Εφαρμογή μεθόδου σε λίπος..177 10.4. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΟΚΙΜΗ (Δ.Δ.)...178 10.4.1. Εισαγωγή......178 10.4.. Προετοιμασία δειγμάτων...179 10.4.3. Παραγωγή δειγμάτων....181 10.4.4. Λίστα συμμετεχόντων εργαστηρίων......181 10.4.5. Αναλυτική διαδικασία που ακολουθήθηκε από τους συμμετέχοντες...181 10.4.6. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων...184 10.4.7. Αποτελέσματα ανάλυσης των συμμετεχόντων.....185 10.5. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.......191 10.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...193 11. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΕ OΥΡΑ.....194 11.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 194 11.. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 195 11..1. Ενζυμική υδρόλυση....195 11... Εκχύλιση υγρού-υγρού..195 11..3. Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE)...195 11.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ..... 198 11.3.1. Συνθήκες LC-MS/MS.........198 11.3.. Βελτιστοποίηση προκατεργασίας..0 11.3.3. Επικύρωση της μεθόδου με βάση την Κοινοτική Απόφαση 00/657/EC...0 11.3.3.1. Έλεγχος γραμμικότητας-χάραξη καμπυλών αναφοράς...0 11.3.3.. Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου......09 11.3.3.3. Ειδικότητα/ανθεκτικότητα........1 11.3.3.4. Όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης.....1 11.3.3.5. Αβεβαιότητα στην τιμή μέτρησης.........14 11.3.3.6. Μέθοδος επιβεβαίωσης.........15 11.3.4. Εφαρμογή μεθόδου σε ούρα...16 11.4. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΟΚΙΜΗ (Δ.Δ.)...17 11.4.1. Εισαγωγή............17 11.4.. Προετοιμασία δειγμάτων...17 V

11.4.3. Παραγωγή δειγμάτων....17 11.4.4. Λίστα συμμετεχόντων εργαστηρίων......17 11.4.5. Αναλυτική διαδικασία που ακολουθήθηκε από τους συμμετέχοντες...18 11.4.6. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων...0 11.4.7. Αποτελέσματα ανάλυσης των συμμετεχόντων.....0 11.5. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...5 11.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...6 1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΕ ΟΡΟ ΑΙΜΑΤΟΣ........8 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 8 1.. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 30 1..1. Προετοιμασία δείγματος........30 1... Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλη Οasis (60 mg, 3 ml)..30 1..3. Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλη Αmino (500 mg, 3 ml)..30 1.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ..... 3 1.3.1. Συνθήκες LC-MS/MS.........3 1.3.. Βελτιστοποίηση προκατεργασίας..33 1.3.3. Επικύρωση της μεθόδου με βάση την Κοινοτική Απόφαση 00/657/EC... 34 1.3.3.1. Έλεγχος γραμμικότητας-χάραξη καμπυλών αναφοράς...35 1.3.3.. Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου......4 1.3.3.3. Ειδικότητα/ανθεκτικότητα........45 1.3.3.4. Όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης.....46 1.3.3.5. Αβεβαιότητα στην τιμή μέτρησης.........46 1.3.3.6. Μέθοδος επιβεβαίωσης......47 1.3.4. Εφαρμογή μεθόδου σε ορό αίματος...48 1.4. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΟΚΙΜΗ (Δ.Δ.)...49 1.4.1. Εισαγωγή............49 1.4.. Προετοιμασία δειγμάτων...50 1.4.3. Παραγωγή δειγμάτων....50 1.4.4. Λίστα συμμετεχόντων εργαστηρίων......51 1.4.5. Αναλυτική διαδικασία που ακολουθήθηκε από τους συμμετέχοντες...51 1.4.6. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων...53 VI

1.4.7. Αποτελέσματα ανάλυσης των συμμετεχόντων.....53 1.5. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...57 1.6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...58 13. ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΕ ΤΡΙΧΕΣ ΒΟΟΕΙΔΩΝ...59 13.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..59 13.. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ..60 13..1. Ενζυμική υδρόλυση..60 13... Εκχύλιση υγρού-υγρού...60 13..3. Αφαίρεση μη πολικών παρεμποδίσεων 60 13..4. Εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλη Οasis (60 mg, 3 ml)...61 13.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ....... 63 13.4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 69 14. ΠΕΡΙΛΗΨΗ..71 15. ABSTRACT..75 16. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ..79 ΠΙΝΑΚΑΣ Π1. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΡΕΑΤΟΣ ΠΟΥ ΑΝΑΛΥΘΗΚΑΝ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΟΥ ΕΠΕΚ 008.....79 ΠΙΝΑΚΑΣ Π. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΛΙΠΟΥΣ ΠΟΥ ΑΝΑΛΥΘΗΚΑΝ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΟΥ ΕΠΕΚ 008... 85 ΠΙΝΑΚΑΣ Π3. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΥΡΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΛΥΘΗΚΑΝ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΟΥ ΕΠΕΚ 008...87 ΠΙΝΑΚΑΣ Π4. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΑΝΑΛΥΘΗΚΑΝ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΟΥ ΕΠΕΚ 008...... 9 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ. 95 ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ.96 VII

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σκοπός αυτής της Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθόδων με σύζευξη υγρής χρωματογραφίας (LC) με φασματομετρία μαζών (MS) για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό καταλοίπων ορμονών και άλλων ουσιών με ορμονική δράση, σε ποικιλία υποστρωμάτων όπως μυϊκό ιστό, ούρα, λίπος και ορό αίματος. Η ανάπτυξη των μεθόδων που περιγράφονται έγινε σύμφωνα με τη νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Ε.Ε.), και συγκεκριμένα σύμφωνα με την Κοινοτική Απόφαση 00/657/ΕC, η οποία προβλέπει κανόνες σχετικά με την επίδοση των αναλυτικών μεθόδων και καθορίζει τα κριτήρια για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Το ζήτημα της χρήσης των στεροειδών αναβολικών ως αυξητικών παραγόντων στην κτηνοτροφία άρχισε να απασχολεί την επιστημονική κοινότητα και την κοινή γνώμη πριν από 30 περίπου χρόνια. Έκτοτε και μέχρι σήμερα υπήρξαν διάφορες προσεγγίσεις, αλλά το θέμα εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά μέχρι σήμερα τόσο τους επιστήμονες όσο και τους πολίτες ως καταναλωτές. Τα στεροειδή αναβολικά χρησιμοποιούνται ως μέσο αύξησης της μυϊκής μάζας των ζώων, με αποτέλεσμα την παρουσία των καταλοίπων τους σε διάφορα τρόφιμα ζωικής προέλευσης, θέτοντας σε κίνδυνο την υγεία των καταναλωτών. Η Ευρωπαϊκή Ένωση απαγόρευσε τη χρήση των στεροειδών αναβολικών στην εκτροφή των παραγωγικών ζώων από το 1986, ενώ σύμφωνα με την Κοινοτική Οδηγία 98/179/EC όλα τα κράτη-μέλη θα πρέπει να ορίσουν Εθνικά Εργαστήρια Αναφοράς και να αναπτύξουν Προγράμματα Ελέγχου Καταλοίπων, για την παρακολούθηση της παρουσίας ενός ευρέος φάσματος στεροειδών αναβολικών, γεγονός που καθιστά επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αναλυτικών μεθόδων με την απαιτούμενη ευαισθησία για την αναμφισβήτητη ανίχνευση και επιβεβαίωση των ουσιών αυτών. Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή χωρίζεται σε δύο τμήματα: το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο θεωρητικό μέρος της Διατριβής γίνεται αναφορά στη φασματομετρία μαζών, στη σύζευξή της με τη χρωματογραφία, στον αναλυτή μαζών καθώς και στην εφαρμογή της στη χημική ανάλυση. Περιγράφεται επίσης συνοπτικά το όργανο υγρής χρωματογραφίας - φασματομετρίας μαζών TSQ Quantum AM, στο οποίο πραγματοποιήθηκε η ανάλυση. Ακόμη στο τμήμα αυτό της εργασίας παρατίθενται πληροφορίες για τη χημεία και τη δομή των συγκεκριμένων στεροειδών αναβολικών, καθώς επίσης γίνεται αναφορά στη σχετική βιβλιογραφία. 1

Στο πειραματικό μέρος περιγράφονται αναλυτικά τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκαν για την εύρεση και βελτιστοποίηση των χρωματογραφικών συνθηκών, καθώς και των παραμέτρων του φασματομέτρου μαζών για την εφαρμογή τους σε ποικιλία υποστρωμάτων όπως μυϊκό ιστό, ούρα, ορό αίματος και λίπος αλλά και για την επικύρωση των μεθόδων σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Απόφαση 00/657/EC. Τα αποτελέσματα από τη στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων και δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν παρατίθενται με τη μορφή πινάκων, σχημάτων και γραφημάτων. Οι ερευνητικές εργασίες της Διδακτορικής Διατριβής πραγματοποιήθηκαν στο Τμήμα Καταλοίπων του Κτηνιατρικού Εργαστηρίου Σερρών (Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων) σε συνεργασία με το Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσ/νίκης. Κατά τη διάρκεια της διατριβής μου ευτύχησα να έχω δίπλα μου καταξιωμένους καθηγητές που με υπομονή και κατανόηση, πνεύμα αλληλεγγύης και πραγματική διάθεση προσφοράς, μου προσέφεραν ανεκτίμητη βοήθεια μέσα από τη θαυμαστή επιστημονική τους κατάρτιση και την πολύχρονη εμπειρία τους. Γι αυτό θεωρώ υποχρέωσή μου να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα Επικ. Καθ. του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. κ. Γεώργιο Θεοδωρίδη, τόσο για τον καθορισμό του θέματος, όσο και για την πολύπλευρη, ουσιαστική και αποτελεσματική επιστημονική του καθοδήγηση και αρωγή. Θερμές ευχαριστίες θέλω επίσης να εκφράσω προς τον Δ/ντή του Κτηνιατρικού Εργαστηρίου Σερρών Δρ. κ. Θεμιστοκλή Δαμπάλη για την πολύτιμη καθοδήγηση και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε, αλλά και για το πνεύμα κατανόησης και συναντίληψης που επέδειξε καθ όλο το διάστημα της πειραματικής έρευνας. Ακόμη ευχαριστώ θερμά τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Παπαδογιάννη και την Καθηγήτρια κ. Ελένη Τσούκαλη, μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής για την πολύπλευρη συμβολή τους και τις εύστοχες παρατηρήσεις και υποδείξεις τους ως προς τη μορφή του κειμένου της διατριβής. Δε θα παραλείψω να ευχαριστήσω και τα λοιπά μέλη της εξεταστικής επιτροπής, γιατί όλοι μαζί και ο καθένας χωριστά με το δικό του τρόπο συνέβαλαν στην επίτευξη του επιδιωκόμενου αποτελέσματος. Τελευταία, αλλά όχι και λιγότερο θερμά, θα ευχαριστήσω τον πατέρα μου Πέτρο και τη σύζυγό μου MSc Κτηνίατρο κ. Ηλιάνα Ατρέα, για την ποικιλόμορφη βοήθεια και συμπαράστασή τους, αλλά και για τη συγκατάβαση που επέδειξαν κατά το χρονικό διάστημα της επιστημονικής μου διατριβής. Θεσσαλονίκη, Οκτώβριος 009

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3

1. ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ (Mass Spectrometry, MS) 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την πρόσκρουση ηλεκτρονίων σχετικά υψηλής ενεργειακής στάθμης, σε μόρια μιας ένωσης, που βρίσκεται σε αέρια φάση και σε συνθήκες υψηλού κενού, τα μόρια της ένωσης μετατρέπονται σε ιόντα με θετικό, συνήθως, φορτίο. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια ηλεκτρικών πεδίων τα παραχθέντα ιόντα ευθυγραμμίζονται σε λεπτή δέσμη. Η δέσμη διέρχεται μέσω ηλεκτρικού ή μαγνητικού πεδίου, οπότε το κάθε ιόν, ανάλογα με το λόγο μάζα προς ηλεκτρικό φορτίο (m/z), αποκλίνει από την αρχική κατεύθυνση. Με κατάλληλο ανιχνευτή μπορεί να μετρηθεί το ηλεκτρικό ρεύμα, που παράγουν τα ιόντα με διαφορετικό λόγο m/z. Το διάγραμμα, που δείχνει τη σχετική ένταση του μετρούμενου ρεύματος, ως συνάρτηση του λόγου m/z, ονομάζεται φάσμα μαζών (mass spectrum) της ένωσης. Επειδή τα ιόντα που παράγονται φέρουν κατά κανόνα ένα φορτίο, ο λόγος m/z αντιστοιχεί αριθμητικά με το μοριακό βάρος του ιόντος. Το μοριακό βάρος εκφράζεται στις συνήθεις μονάδες ατομικής μάζας (amu, atomic mass units), με βάση το ισότοπο 1 C που, κατά συνθήκη, αντιστοιχεί ακριβώς σε 1,000000 amu. Η αναλυτική τεχνική ταυτοποίησης και προσδιορισμού της αρχικής ένωσης από τις πληροφορίες που παρέχει το φάσμα μαζών της, ονομάζεται φασματομετρία μαζών (mass spectrometry, MS). Η μορφή του φάσματος μαζών, που λαμβάνεται κάτω από αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες, είναι χαρακτηριστική της αρχικής ένωσης και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή της. Σήμερα η φασματομετρία μαζών χρησιμοποιείται ευρύτατα, κυρίως για την επαλήθευση ή διερεύνηση της δομής των διαφόρων οργανικών ενώσεων κατά τη διαδικασία σύνθεσης (όπως π.χ. νέων φαρμάκων), για την εξακρίβωση της δομής πολλών φυσικών ενώσεων, για τη διερεύνηση της παρουσίας και του ποσοστού ισοτόπων καθώς και στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση αγνώστων μιγμάτων ανόργανων και οργανικών ενώσεων. Η φασματομετρία μαζών μπορεί να συνδυασθεί με την αέρια χρωματογραφία (GC) ή με την υγρή χρωματογραφία (LC) και έτσι παρέχει στον αναλυτή τις ονομαζόμενες συνδυασμένες τεχνικές GC-MS ή LC-MS, αλλά και άλλες συνδυασμένες τεχνικές, η συμβολή των οποίων τόσο στην έρευνα, όσο και σε εφαρμογές ρουτίνας θεωρείται ανεκτίμητη [1]. 4

1.. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Ένα τυπικό φασματόμετρο μαζών αποτελείται από τα εξής επιμέρους τμήματα: i. Το σύστημα της εισαγωγής του δείγματος. Ο σκοπός αυτού του τμήματος είναι η εισαγωγή μικρών ποσοτήτων δείγματος στο όργανο. Το δείγμα εισάγεται στην αέρια ή στην υγρή του μορφή. ii. Την πηγή ιόντων. Εδώ τα εισερχόμενα συστατικά μετατρέπονται σε ιόντα, είτε με βομβαρδισμό με ηλεκτρόνια, ιόντα, μόρια ή φωτόνια, είτε με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου ή υψηλής θερμοκρασίας. Συχνά το σύστημα εισαγωγής συνενώνεται με την πηγή ιόντων. Το προϊόν του ενιαίου αυτού τμήματος είναι ένα ρεύμα ιόντων (συνήθως θετικά φορτισμένων) τα οποία στη συνέχεια επιταχύνονται και εισέρχονται στον αναλυτή μαζών. iii. Τον αναλυτή μαζών. Εδώ γίνεται διαχωρισμός των ιόντων ανάλογα με το λόγο m/z που φέρουν. Είναι η πραγματική "καρδιά" του συστήματος. Υπάρχουν διάφορες κατηγορίες αναλυτών μαζών, των οποίων η λειτουργία βασίζεται σε διαφορετικές αρχές. iv. Τον ανιχνευτή. Σκοπός της διάταξης αυτής είναι να συλλάβει τα διαχωριζόμενα ιόντα και να τα μετατρέψει σε ηλεκτρικό σήμα. Στη συνέχεια γίνεται επεξεργασία του σήματος με ειδικό λογισμικό σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. v. Το σύστημα κενού. Ολόκληρο το φασματόμετρο (πέραν του συστήματος επεξεργασίας δεδομένων) βρίσκεται υπό κενό που δημιουργείται από εσωτερικές και εξωτερικές αντλίες κενού. Στο σχήμα 1.1 δίνεται ένα διάγραμμα των τμημάτων ενός τυπικού φασματόμετρου μαζών []. Δείγμα Σύστημα Κενού 10-5 - 10-8 Torr Επεξεργασία Δεδομένων PC Σύστημα Εισαγωγής Πηγή Ιόντων Αναλυτής Μαζών Ανιχνευτής Σχήμα 1.1 Σχηματικό διάγραμμα των τμημάτων ενός φασματόμετρου μαζών []. 5

1.3. ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Ο σκοπός του συστήματος εισαγωγής δείγματος είναι η προετοιμασία του δείγματος για εισαγωγή του στο χώρο ιοντισμού (πηγή ιόντων), κάτω από συνθήκες σταθερής ροής και σε αέρια πάντοτε κατάσταση. Η εξαέρωση δειγμάτων που περιέχουν ενώσεις με περιορισμένη πτητικότητα ή στερεών δειγμάτων, διευκολύνεται με θέρμανση σε συνθήκες υψηλού κενού. Στο δοχείο δείγματος η πίεση που επικρατεί είναι της τάξης των 10 - Torr. Με κατάλληλο στόμιο εισαγωγής το αέριο δείγμα εισάγεται σε ενδιάμεσο χώρο με ακόμη μικρότερη πίεση (τυπικά 10-5 Torr) από όπου, με σταθερή παροχή, εισάγεται στο χώρο ιοντισμού, όπου επικρατεί ακόμη χαμηλότερη πίεση (τυπικά 10-7 Torr), ώστε να αποφεύγονται οι συγκρούσεις μεταξύ των παραγόμενων ιόντων. Στη συνδυασμένη τεχνική LC-MS, το υγρό που εκλούεται από τη χρωματογραφική στήλη οδηγείται στην πηγή ιόντων, αφού προηγουμένως απαλλαγεί από τη μεγαλύτερη ποσότητα διαλύτη [1]. 6

1.4. ΠΗΓΗ ΙΟΝΤΩΝ Κάθε διακριτό τμήμα του φασματόμετρου μαζών παίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία και απόδοση του συνόλου. Έτσι η επιλογή της τεχνικής ιοντισμού που θα εφαρμοσθεί είναι μεγάλης σημασίας για την ανάλυση που θα ακολουθήσει. Ένας διαχωρισμός των τεχνικών ιοντισμού μπορεί να γίνει μεταξύ "μαλακών" και "σκληρών" τεχνικών. "Σκληρές" καλούνται οι τεχνικές στις οποίες χρησιμοποιείται υψηλή ενέργεια, η οποία μεταφέρεται στην προσδιοριζόμενη ένωση κατά τον ιοντισμό, προκαλώντας τις περισσότερες φορές διάσπασή της σε θυγατρικά ιόντα (θραύση). "Μαλακές" καλούνται οι τεχνικές που επιτυγχάνουν τον ιοντισμό σε ηπιότερες συνθήκες με μικρή ή μηδαμινή θραύση. Στον πίνακα 1.1. δίνονται συνοπτικά οι κύριες τεχνικές ιοντισμού και η συμβατότητά τους με αναλυτές μαζών και η εφαρμοσιμότητά τους στην ανάλυση. Πίνακας 1.1. Kύριες τεχνικές ιοντισμού και δυνατοί συνδυασμοί μεθόδων []. Τεχνική Ιοντισμού Κύρια Ιόντα Αναλυτής Μαζών Τάξεις ενώσεων Ιοντισμός ηλεκτρονίων M +. Θυγατρικά ιόντα B a, Q b, TRAP c Μη πολικές, κάποιες πολικές <1.000 dalton Χημικός Ιοντισμός [M+H] + M -, [M-H] -, M -. B, Q, TRAP Μη πολικές, κάποιες πολικές <1.000 dalton Βομβαρδισμός με άτομα (FAB) [M+H] + B, Q Πολικές οργανικές, πρωτεΐνες, [M-H] - οργανομεταλλικές <10.000 dalton B, Q Πολικές, κάποιες μη πολικές TOF Πολικές, κάποιες μη πολικές, Thermospray [M+H] + [M+NH 4 ] + οργανικές <1.000 dalton MALDI [M+H] + [M-H] - βιοπολυμερή, συνθετικά πολυμερή <10 6 dalton Electrospray [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - B, Q, TOF d, ORBITRAP, QTOF, TRAP, FTMS e Πολικές, κάποιες μη πολικές οργανικές, πρωτεΐνες <00.000 dalton a B : Magnetic Sector b Q : Quadrupole c TRAP : Ion Trap d TOF : Time of flight e FTMS : Fourier Transform Mass Spectrometer Η πλειονότητα των φασματόμετρων μαζών εφαρμόζει ιοντισμό σε αέρια φάση. Οι τεχνικές που περιγράφονται στη συνέχεια εφαρμόζονται κατά προτίμηση σε ενώσεις 7

σταθερές στη θέρμανση και με σημείο ζέσης κάτω από ~500 o C. Συχνά μάλιστα περιορίζονται σε ενώσεις με σχετική μοριακή μάζα κάτω από 1.000 dalton. Εξαίρεση αποτελεί η τεχνική ψεκασμού σε ηλεκτρικό πεδίο όπου μόρια με μάζα έως και 00.000 dalton μπορούν να αναλυθούν εφόσον φορτιστούν πολλαπλώς []. 1.4.1. Ιοντισμός με ηλεκτρόνια (Electron Impact) Ο ιοντισμός με βομβαρδισμό με δέσμη ηλεκτρονίων ήταν η πρώτη τεχνική που εφαρμόστηκε, η οποία παρά τους περιορισμούς της, εφαρμόζεται ακόμη αφού παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα. Η διάταξη του σχήματος 1. δίνει μια τυπική σχεδίαση EI ιοντισμού. Με την εισαγωγή τους στην πηγή ιόντων τα προς ανάλυση μόρια εστιάζονται περνώντας μέσα από μεταλλικές πλάκες απώθησης (repellers). Στη συνέχεια βομβαρδίζονται με ηλεκτρόνια που εκλύονται από θερμαινόμενο νήμα Βολφραμίου ή Ρηνίου. Με τη σύγκρουση των μορίων με τη δέσμη των ηλεκτρονίων παράγονται θετικά φορτισμένες ρίζες: M +. + e M + e Σχήμα 1. Σχηματική διάταξη Ιοντισμού με Ηλεκτρόνια []. Το ιόν Μ +. καλείται μοριακό ιόν, αφού ο λόγος m/z ανταποκρίνεται στη σχετική μοριακή μάζα της ένωσης. Τα ιόντα που παράγονται με τον τρόπο αυτό είναι συνήθως μονά φορτισμένα, ενώ χαρακτηρίζονται από μεγάλη διασπορά της εσωτερικής τους ενέργειας. Η δέσμη των ηλεκτρονίων έχει ενέργεια της τάξης των 60 έως 80 ev, ενώ η ενέργεια ιοντισμού πολλών ενώσεων είναι της τάξης των 6 έως 10 ev. Η επιπλέον 8

εσωτερική ενέργεια και το γεγονός ότι το μοριακό ιόν έχει χαρακτήρα ρίζας, είναι οι αιτίες που προκαλούν περαιτέρω διάσπαση της ρίζας προς θυγατρικά ιόντα (θραύσματα). Θεωρώντας το αναλυόμενο μόριο ABCD, τυπικές αντιδράσεις που μπορεί να συμβούν είναι: ABCD ABCD ABCD ABCD +. +. + + A A + AB +. ΑB.. + BCD + BCD + CD +. + CD + BC + + D Η θραύση στον ιοντισμό με ηλεκτρόνια είναι εξαιρετικά επαναλήψιμη. Αυτό σημαίνει ότι μια ένωση διασπάται με τον ίδιο τρόπο και δίνει τα ίδια χαρακτηριστικά ιόντα σε διαφορετικά όργανα και σε διαφορετικά εργαστήρια σε πειράματα που λαμβάνουν χώρα σε διάφορες χρονικές στιγμές. Το γεγονός αυτό επιτρέπει το σχηματισμό βάσεων δεδομένων που διατηρούνται και ανανεώνονται από πολλούς ερευνητές σε διάφορα εργαστήρια, όπου καταγράφονται τα χαρακτηριστικά ιόντα για πολλές χιλιάδες ενώσεων. Γι αυτό το λόγο η τεχνική αυτή ιοντισμού είναι η μέθοδος επιλογής για την ταυτοποίηση της δομής αγνώστων ενώσεων. Πλεονεκτήματα του ιοντισμού με ηλεκτρόνια είναι η απλότητα, η ευκολία και η μεγάλη απόδοση του ιοντισμού και η παραγωγή θυγατρικών ιόντων, που βοηθά τα μέγιστα στην ταυτοποίηση ενώσεων με περίπλοκη δομή. Όμως αυτή η θραύση μπορεί να αποτελεί και μειονέκτημα σε άλλες περιπτώσεις, όπου το μοριακό (μητρικό) ιόν ουσιαστικά εξαφανίζεται, λόγω της ολικής θραύσης. Ένας σημαντικός περιοριστικός παράγοντας είναι η εξάτμιση του δείγματος, που είναι απαραίτητη για τη λειτουργία της διάταξης. Μη πτητικές ενώσεις (μεγαλομόρια, πολικές ενώσεις) μπορεί να διασπαστούν κατά τη θέρμανσή τους και πριν τον ιοντισμό τους. Ως αποτέλεσμα η ανάλυση μακρομορίων ή πολικών ενώσεων δεν είναι δυνατή με την τεχνική αυτή []. 1.4.. Χημικός ιοντισμός (Chemical Ionisation) Ο χημικός ιοντισμός πραγματοποιείται συνήθως σε σχετικά υψηλή πίεση (0.1-100 Pa) και γι αυτό το λόγο συνδυάζεται με σύγχρονες διατάξεις σύζευξης LC-MS ατμοσφαιρικής πίεσης. Η υψηλή πίεση έχει ως αποτέλεσμα συχνές συγκρούσεις των προσδιοριζόμενων μορίων, είτε μεταξύ τους, είτε με ιόντα που διοχετεύονται στο σύστημα και προέρχονται από αέριο αντιδραστήριο (π.χ. αμμωνία ή μεθάνιο). Το αέριο αντιδραστήριο που βρίσκεται 9

σε περίσσεια ιονίζεται αρχικά, είτε με βομβαρδισμό με ηλεκτρόνια, είτε λόγω της ροής του πάνω από φορτισμένο ηλεκτρόδιο εκκένωσης (6 kv). Στη συνέχεια τα ιόντα του αερίου αντιδραστηρίου αντιδρούν με τα μόρια της προσδιοριζόμενης ένωσης ιονίζοντάς τα. Χαρακτηριστικές αντιδράσεις (που γίνονται στην αέρια φάση) για την περίπτωση όπου R-CH 3 είναι η προσδιοριζόμενη ένωση και αέριο αντιδραστήριο είναι το μεθάνιο δίνονται παρακάτω: CH 4 + e CH + 4 + e CH + 4 + CH 4 CH + 5 + CH 3 CH + 5 + R CH3 R CH + 4 + CH Τα φάσματα που λαμβάνονται με χρήση χημικού ιοντισμού περιέχουν μικρότερο αριθμό σημάτων (είναι "καθαρότερα") σε σύγκριση με αυτά που λαμβάνονται όταν εφαρμόζεται ιοντισμός με ηλεκτρόνια. Η κύρια κορυφή δίνει πολύ δυνατότερο σήμα και ο προσδιορισμός της σχετικής μοριακής μάζας καθίσταται ευκολότερος λόγω της παρουσίας δύο κορυφών []. 4 1.4.3. Ψεκασμός σε ηλεκτρικό δυναμικό (Electrospray) Η τεχνική του ψεκασμού σε ηλεκτρικό πεδίο χρησιμοποιείται ως η κυριότερη μέθοδος σύζευξης υγρής χρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών. Βασίζεται στην παρατήρηση κατά την οποία όταν ένα υγρό ψεκάζεται μέσω ενός τριχοειδούς σωλήνα μέσα σε πεδίο μερικών χιλιάδων V, το υγρό διασπείρεται σε ένα νέφος από πολύ μικρές φορτισμένες σταγόνες. Η διάταξη περιγράφεται στο σχήμα 1.3 και ο τρόπος λειτουργίας αναλύεται ως εξής: Η είσοδος του διαλύματος στο σύστημα γίνεται εν ροή μέσα από τριχοειδή σωλήνα. Παράλληλα με τον τριχοειδή βρίσκεται εξωτερικός σωλήνας μέσα από τον οποίο διαβιβάζεται αέριο που σκοπό έχει τη δημιουργία εκνεφώματος στην άκρη του τριχοειδούς. Ο τριχοειδής είναι γειωμένος, ενώ στο απέναντι ηλεκτρόδιο (counter electrode) εφαρμόζεται δυναμικό της τάξης των 3.5-5 KV. Κατά τον ψεκασμό του διαλύματος σε περιβάλλον υψηλού δυναμικού ο διαλύτης εξατμίζεται ταχύτατα ιονίζοντας τις διάφορες ενώσεις, όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.4. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται εξάτμιση με ιοντισμό (ion evaporation) και εντάσσεται στις μαλακές / ήπιες τεχνικές ιοντισμού. Κατά τον ιοντισμό πολύ μικρό ποσοστό θραύσης λαμβάνει χώρα και τα electrospray φάσματα είναι απλά, καθαρά και εύκολα για εκτίμηση. Για τους λόγους αυτούς η τεχνική αυτή έχει διαδοθεί ιδιαίτερα και απαντάται στα περισσότερα νέα όργανα. 10

Σχήμα 1.3 Σχηματική διάταξη ψεκασμού σε ηλεκτρικό πεδίο[]. Σχήμα 1.4 Σχηματισμός ιόντων κατά τον ψεκασμό σε ηλεκτρικό πεδίο []. Ένας άλλος λόγος της διάδοσής της είναι το γεγονός ότι επιτρέπει τον προσδιορισμό μεγαλομορίων (πρωτεΐνες, νουκλεοτίδια κλπ). Κατά τον ιοντισμό της σε electrospray μια πρωτεΐνη, δε διασπάται, αλλά φορτίζεται πολλαπλώς μειώνοντας έτσι το λόγο m/z, π.χ. ένα πολυ-πεπτίδιο με σχετική μοριακή μάζα στα 5.000 dalton, φορτιζόμενο σε 10 σημεία στο μόριο του, θα εμφανίσει κορυφή σε m/z 500. Μοριακά βάρη έως και 00.000 έχουν αναλυθεί με electrospray. Το electrospray είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική σύζευξης υγρής χρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών (LC-MS interface) []. 11

1.4.4. Ιοντισμός με laser και υποβοήθηση υποστρώματος Ο Ιοντισμός με Laser και Υποβοήθηση Υποστρώματος (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation ή MALDI), είναι μια τεχνική που βοήθησε τα μέγιστα στην ανάλυση μεγαλομορίων, επιτρέποντας τη μέτρηση μαζών πάνω από 10 6 Dalton. Το 1988 παρουσιάστηκαν τα δύο πρώτα συστήματα MALDI-TOF. Κατά τη μέθοδο αυτή, συνήθως χρησιμοποιείται νικοτινικό οξύ ως υπόστρωμα (matrix) με το οποίο αναμιγνύεται το προς ανάλυση δείγμα. Μικροποσότητα από το διάλυμα που προκύπτει τοποθετείται σε ειδική πλάκα πολλαπλών θέσεων (96 ή και παραπάνω) όπου και εξατμίζεται. Στη συνέχεια, η πλάκα τοποθετείται στην πηγή ιόντων, όπου το δείγμα ακτινοβολείται με δέσμη Laser (N εκπομπής στα 337 nm, είτε Nd-YAG). Η εστίαση της δέσμης του Laser γίνεται σε ακτίνα 50-500 μm, και η σκόπευση στην πλάκα γίνεται πλέον αυτόματα με τη βοήθεια μικροσκοπίου. Το υπόστρωμα (νικοτινικό οξύ) εξυπηρετεί τρεις σκοπούς: i. την απομάκρυνση των μεγαλομορίων του δείγματος και τη μείωση μοριακών δυνάμεων μεταξύ τους ii. την απορρόφηση της ενέργειας της ακτινοβολίας και iii. τον ιοντισμό των μεγαλομορίων. Οι αρχές αυτής της τεχνικής ιοντισμού είναι οι εξής: τα μόρια του νικοτινικού οξέος απορροφώντας την ενέργεια του Laser εξαχνώνονται ταχύτατα σχηματίζοντας ένα πυκνό νέφος πάνω από το στόχο. Το νέφος εκτονώνεται ταχύτατα (υπερηχητικά) λόγω του κενού μεταφέροντας τα μόρια του μεγαλομορίου στην αέρια φάση. Ο ιοντισμός των μεγαλομορίων γίνεται κατά την εκτόνωση του νέφους ως αποτέλεσμα αντιδράσεων του νικοτινικού οξέος. Ο ακριβής μηχανισμός ιοντισμού δεν έχει διευκρινιστεί ακόμη και οι δύο επικρατέστερες θεωρίες είναι: 1) του φωτοχημικού ιοντισμού, όπου ο σχηματισμός δραστικότατων ριζών των μορίων του υποστρώματος ακολουθείται από αντιδράσεις των ριζών με τα μόρια του μεγαλoμορίου και ) της μεταβατικής φάσης, όπου μόρια του νικοτινικού οξέος διεγείρονται και δρουν ως δότες πρωτονίων προς το μεγαλομόριο []. 1

1.5. ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΜΑΖΩΝ Θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι ο αναλυτής μαζών χρησιμεύει σε κάποιες περιπτώσεις όπως ο μονοχρωμάτορας στα φασματοφωτόμετρα οπτικών τεχνικών. Η βασική λειτουργία του φασματόμετρου μαζών είναι να διαχωρίσει τα ιόντα, που παράγονται στην πηγή ιόντων, ανάλογα με τις διαφορετικές τιμές των λόγων m/z. Ο διαχωρισμός είναι απαραίτητος, έτσι ώστε το μετρούμενο ιοντικό ρεύμα στον ανιχνευτή ιόντων, που ακολουθεί τον αναλυτή μαζών, να αντιστοιχεί σε ιόντα με συγκεκριμένο λόγο m/z. Από τον τύπο του αναλυτή μαζών εξαρτάται η διαχωριστική ικανότητα (resolution) του οργάνου, που είναι το σπουδαιότερο χαρακτηριστικό ποιότητας ενός φασματόμετρου μαζών. Η διαχωριστική (ή διακριτική) ικανότητα (R) ορίζεται από τη σχέση 1.1. R = Μ/ΔΜ (1.1) όπου: Μ είναι η μάζα της πρώτης κορυφής και ΔΜ η διαφορά μαζών δύο διαδοχικών κορυφών. Κατά συνθήκη, ικανοποιητικός διαχωρισμός θεωρείται ότι πετυχαίνεται, όταν δύο περίπου ισοϋψείς κορυφές επικαλύπτονται σε ύψος που δεν υπερβαίνει το 10% του ύψους των κορυφών όπως φαίνεται στο σχήμα 1.5. Σχήμα 1.5 Διαχωριστική Ικανότητα στη Φασματομετρία Μαζών [1]. 13

Για παράδειγμα, R=1000 σε μάζα 100,0 σημαίνει ότι το φασματόμετρο μπορεί να διαχωρίσει τη μάζα 100 από τη μάζα 100,1 (ΔΜ = 0,1). Τα φασματόμετρα μαζών διακρίνονται σε φασματόμετρα χαμηλής και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας. Με τα πρώτα, που έχουν διαχωριστική ικανότητα από 100 έως 1.000, τα διάφορα ιόντα διακρίνονται με βάση την ονομαστική μάζα (nominal mass), που αντιστοιχεί στην πλησιέστερη ακέραιη τιμή προς τη μοριακή μάζα. Με ένα τέτοιο φασματόμετρο, δε διακρίνεται το CO από το Ν, γιατί και τα δύο έχουν τον ίδιο αριθμό ακέραιων μονάδων μοριακής μάζας (8). Με τα φασματόμετρα υψηλής διαχωριστικής ικανότητας όμως (R=10 4-10 6 ) μπορούν να διαχωριστούν ιόντα με ίδια ονομαστική μάζα, αλλά με διαφορετικές τιμές ακριβούς μάζας (exact mass), που διαφέρουν στο τρίτο ή και στο τέταρτο δεκαδικό ψηφίο. Για παράδειγμα, με φασματόμετρα μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας μπορούν να διακριθούν οι κορυφές, που αντιστοιχούν στα ιόντα CO +, N +, CH N + και C H + 4, με ονομαστική μάζα 8 και ακριβείς μάζες 7,995, 8,006, 8,019 και 8,031. Στο συγκεκριμένο παράδειγμα, η απαιτούμενη διαχωριστική ικανότητα είναι R=8/0,011 500. H κύρια διαφορά μεταξύ των διαφόρων φασματόμετρων μαζών έγκειται στους αναλυτές που χρησιμοποιούν για το διαχωρισμό των ιόντων. Στη συνέχεια εξετάζονται οι συνηθέστεροι τύποι αναλυτών μαζών [1]. 1.5.1. Αναλυτής απλής εστίασης Ο αναλυτής απλής εστίασης περιλαμβάνει ένα μαγνήτη (ηλεκτρομαγνήτη συνήθως) ο οποίος δίνει στα αναλυόμενα ιόντα μια κυκλική τροχιά 90 μοιρών, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.6. Στη διάταξη αυτή τα ιόντα εισέρχονται μέσω σχισμής (slit Α) και επιταχύνονται έως τη σχισμή Β και στη συνέχεια στον αναλυτή απλής εστίασης. Ιόντα διαφορετικών m/z σαρώνονται μέχρι τη σχισμή εξόδου, με σάρωση της ισχύος του μαγνητικού πεδίου ή με αλλαγή του δυναμικού επιτάχυνσης μεταξύ των σχισμών Α και Β. Η κινητική ενέργεια ιόντος που κινείται στον αναλυτή δίνεται από την εξίσωση 1.: Ε κιν = zev = ½ m U (1.) όπου: V το δυναμικό επιτάχυνσης, U η ταχύτητα που αναπτύσσει στον τομέα και e το φορτίο του ιόντος (1.6 10-19 C). 14

Γίνεται η παραδοχή ότι ιόντα με ίσο φορτίο λαμβάνουν ίση κινητική ενέργεια κατά την επιτάχυνσή τους, ανεξαρτήτως της μάζας τους. Επομένως τα ελαφρύτερα ιόντα κινούνται με μεγαλύτερη ταχύτητα από τα βαρύτερα μέσα στον αναλυτή. Κατά τη διαδρομή τους μέσα στον αναλυτή τα ιόντα δέχονται δύο δυνάμεις: του μαγνητικού πεδίου (F M ) και την κεντρομόλο δύναμη (F C ). Σχήμα 1.6 Αναλυτής απλής εστίασης [3]. Για να διαπεράσει ένα ιόν τον αναλυτή πρέπει να ισχύει η σχέση 1.3: όπου: r η ακτίνα του τομέα, B η μαγνητική επαγωγή. F C =F M mu = BzeV (1.3) r Από την εξίσωση αυτή προκύπτει με χρήση της εξίσωσης (1.): m B r e = (1.4) z V Από την εξίσωση αυτή φαίνεται ότι η τιμή m/z που επιτρέπει ο αναλυτής να περάσει μπορεί να καθοριστεί από τρεις παραμέτρους: B, r και V. Διατηρώντας λοιπόν τις δύο από αυτές σταθερές και μεταβάλλοντας την τιμή της μίας μπορεί ο αναλυτής να σαρώσει τα ιόντα ανάλογα με το m/z που φέρουν. Συνήθως διατηρείται σταθερό το r (λόγω 15

κατασκευής) και το δυναμικό V και η σάρωση γίνεται με μεταβολή της τιμής της μαγνητικής επαγωγής Β. Σε μια πηγή ιόντων τα μόρια από τα οποία θα προέλθουν τα ιόντα παρουσιάζουν κατανομή των Ε κιν κατά Boltzman, λόγω ανομοιογενειών στο πεδίο στο οποίο κινούνται. Όταν στη συνέχεια μια μάζα ιόντων με τον ίδιο λόγο m/z, αλλά με σχετικές διαφορές στην κινητική ενέργεια εισέρχεται στον αναλυτή, θα εξέλθει τελικά από αυτόν με συγκλίνουσες τιμές Ε κιν. Αυτή η σύγκλιση πραγματοποιείται λόγω της ικανότητας του μαγνητικού πεδίου να εστιάσει τα κινούμενα προς διαφορετικές κατευθύνσεις ιόντα. Σε τέτοια περίπτωση η διαχωριστική ικανότητα του φασματόμετρου περιορίζεται σε τιμές περί τις.000, αφού οι διαφορές στην κινητική ενέργεια έχουν ως αποτέλεσμα τη διεύρυνση της δέσμης των ιόντων που φτάνουν στον ανιχνευτή και ουσιαστικά προκαλούν διεύρυνση της κορυφής του ιόντος. Λύση στο πρόβλημα αυτό δόθηκε με το σχεδιασμό οργάνων που έχουν δυνατότητα διόρθωσης της κατανομής της τιμής, αλλά και της κατεύθυνσης της Ε κιν των ιόντων [-4]. 1.5.. Αναλυτής διπλής εστίασης Αναλυτές διπλής εστίασης κατασκευάζονται με κατάλληλο συνδυασμό ηλεκτροστατικών και μαγνητικών πεδίων όπως φαίνεται στο σχήμα 1.7. Ο τύπος αυτός θεωρείται όργανο αναφοράς σε ορισμένες περιπτώσεις που απαιτείται υψηλή διαχωριστική ικανότητα (100.000 R 30.000). Δυστυχώς λόγω κατασκευής τα όργανα αυτά είναι ιδιαιτέρως ακριβά και ογκώδη. Σχήμα 1.7 Αναλυτής διπλής εστίασης []. 16

Η δέσμη ιόντων διαπερνά έναν ηλεκτροστατικό αναλυτή (ESA), που αποτελείται από δύο κυρτές μεταλλικές πλάκες υπό συνεχές ηλεκτρικό δυναμικό / ρεύμα. Υπό την επίδραση του δυναμικού εστιάζονται τα ιόντα ανάλογα με την Ε κιν τους. Ορισμένα μόνο ιόντα περνούν και φτάνουν στο μαγνητικό τομέα. Ιόντα με μεγαλύτερη ενέργεια από την καθορισμένη χτυπούν στο άνω μέρος της σχισμής της εξόδου του ESA, εξουδετερώνονται και απομακρύνονται. Ιόντα με μικρότερη από την καθορισμένη ενέργεια χτυπούν στο κάτω μέρος της σχισμής, και ομοίως απομακρύνονται. Ας υποθέσουμε ότι η εστίαση της κατεύθυνσης της κίνησης των ιόντων λαμβάνει χώρα στο μαγνητικό τομέα κατά το επίπεδο d, ενώ η εστίαση της τιμής της Ε κιν γίνεται στο επίπεδο e. Στο σημείο τομής των δύο επιπέδων τοποθετείται η διάταξη συλλογής και ανίχνευσης των ιόντων. Στο σημείο αυτό θα εστιασθούν μόνο ιόντα ενός συγκεκριμένου m/z για οποιαδήποτε τιμή V και B [, 3]. 1.5.3. Τετραπολικός αναλυτής (Quadrupole) Οι τετραπολικοί αναλυτές είναι οι πιο διαδεδομένοι αναλυτές μαζών γιατί παρουσιάζουν μια σειρά από πλεονεκτήματα: χαμηλή σχετικά τιμή, συμπαγή κατασκευή, μεγαλύτερες ανοχές, ταχύτερη σάρωση (< 100 ms), δυνατότητα συνδυασμών σε υβριδικά όργανα (όργανα με άνω του ενός αναλυτή μαζών π.χ. QTOF) και τέλος αμεσότερη συμβατότητα με χρωματογραφικές τεχνικές. Ο τετραπολικός αναλυτής λειτουργεί ανάλογα με τα οπτικά φίλτρα επιτρέποντας σε ιόντα μίας μόνο τιμής m/z να περάσουν και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Όλα τα άλλα ιόντα εξουδετερώνονται και απομακρύνονται. Για το λόγο αυτό ο τετραπολικός αναλυτής αποκαλείται συχνά και φίλτρο μαζών. Ένα απλοποιημένο διάγραμμα τετραπολικού αναλυτή δίνεται στο σχήμα 1.8. Τέσσερις μεταλλικές κυλινδρικές ράβδοι (πόλοι) βρίσκονται φορτισμένες ανά απέναντι ζεύγη στο ίδιο συνεχές ηλεκτρικό ρεύμα. Στο σύστημα εφαρμόζεται με διαφορά φάσης 180 μοίρες εναλλασσόμενο ρεύμα υψηλής συχνότητας (ραδιοσυχνότητα). Τα ιόντα εισέρχονται στο τετράπολο μετά από επιτάχυνση σε δυναμικό 5-15 V. 17

Σχήμα 1.8 Τετραπολικός Αναλυτής [4]. Ο συνδυασμός της λειτουργίας των τεσσάρων πόλων επιτρέπει σε ιόντα συγκεκριμένου μόνο m/z να περάσουν τον αναλυτή και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Για τη σάρωση σε ένα τετραπολικό αναλυτή τα δυναμικά των δύο ρευμάτων (εναλλασσόμενου και συνεχούς) αυξάνονται από τιμή 0 έως μια μέγιστη τιμή, με το λόγο των δύο περίπου στο 6. Με τον τρόπο αυτό το δυναμικό μεταβάλλεται από 0 έως περί τα + 50 V για το συνεχές ρεύμα και από 0 έως + 1500 V για το εναλλασσόμενο. Η σάρωση αυτή των δυναμικών επηρεάζει την κίνηση των ιόντων με τρόπο που ορίζεται από περίπλοκες διαφορικές εξισώσεις. Τα ιόντα ουσιαστικά κινούνται διαγράφοντας ελικοειδείς πορείες μέσα στο τετράπολο. Η διαχωριστική ικανότητα τέτοιων οργάνων φτάνει τις 3.000, ενώ έχουν δυνατότητα ανάλυσης ιόντων με m/z έως τις 3.000. Το τριπλό τετράπολο είναι ένας συνδυασμός τριών τετραπόλων, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.9. Τριπλά τετράπολα απαντώνται συχνότατα, για την εκμετάλλευση των θετικών στοιχείων του τετραπόλου (ταχεία σάρωση, δυνατότητα εφαρμογής φασματομετρίας μαζών σε σειρά/tandem MS). Όταν το τριπλό τετράπολο λειτουργεί ως απλός αναλυτής ρυθμίζεται ώστε δύο τετράπολα να συνεισφέρουν μόνο στον εστιασμό της δέσμης των ιόντων (Q και Q3, ή Q1 και Q, αντίστοιχα) και ο διαχωρισμός να γίνεται στο τρίτο τετράπολο (στον τύπο σάρωσης Q1MS, το Q1 χρησιμοποιείται ως ο αναλυτής μαζών, ενώ στον τύπο σάρωσης Q3MS, το Q3 χρησιμοποιείται ως ο αναλυτής μαζών). 18

Σχήμα 1.9 Αναλυτής Μαζών με Τριπλό Τετράπολο (QQQ) [5]. Η μεγάλη χρησιμότητα του συστήματος έγκειται στη δυνατότητα της διαδοχικής φασματομετρίας μαζών MS-MS. Αρχικά επιλέγεται στο πρώτο τετράπολο (Q1) μόνο ένα ιόν. Στη συνέχεια το μητρικό ιόν οδηγείται στο δεύτερο τετράπολο (Q), όπου συγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (αργό ή ήλιο) και διασπάται παράγοντας θυγατρικά ιόντα. Το δεύτερο τετράπολο (Q) αποτελεί την κυψελίδα συγκρούσεων (collision cell) και λειτουργεί ως χώρος θραυσματοποίησης του μητρικού ιόντος. Ο διαχωρισμός και η μέτρηση των θυγατρικών ιόντων πραγματοποιείται στο τρίτο τετράπολο (Q3). Η παρακολούθηση των ιόντων μπορεί να πραγματοποιηθεί με διάφορους τύπους σάρωσης: την πλήρη σάρωση (Full Scan), την παρακολούθηση επιλεγμένου ιόντος (Single Ion Monitoring-SIM), την παρακολούθηση επιλεγμένης αντίδρασης (Selected Reaction Monitoring-SRM ή Multiple Reaction Monitoring-MRM), τη σάρωση θυγατρικών ιόντων (Product Ion Scanning) και τη σάρωση μητρικού ιόντος (Precursor Ion Scanning). Στο σχήμα 1.10 απεικονίζονται οι διάφοροι τύποι σάρωσης. Ο τύπος πλήρους σάρωσης παρέχει ένα φάσμα πλήρους σάρωσης για κάθε ουσία. Η πλήρης σάρωση βοηθάει στον προσδιορισμό της ταυτότητας μιας άγνωστης ουσίας (προσδιορισμό μοριακού βάρους). Μπορεί να δώσει περισσότερες πληροφορίες από άλλους τύπους σάρωσης, αλλά υστερεί σε ευαισθησία και δεν ευνοεί την ποσοτικοποίηση της ουσίας. 19

Στον τύπο SIM παρακολουθείται ένα συγκεκριμένο ιόν ή ομάδα ιόντων. Είναι αποτελεσματικός στην ανίχνευση μικρών ποσοτήτων (σε ίχνη) μιας γνωστής ουσίας σε πολύπλοκα μίγματα όταν το φάσμα μαζών της ουσίας είναι γνωστό. Επειδή παρακολουθούνται συγκεκριμένα ιόντα μπορούν να επιτευχθούν χαμηλότερα όρια ανίχνευσης και μεγαλύτερες ταχύτητες σάρωσης από τον τύπο της πλήρους σάρωσης. Όμως ενδέχεται να μειωθεί η εκλεκτικότητα, διότι οποιαδήποτε ουσία δίνει το συγκεκριμένο ιόν θα εμφανιστεί ως η ουσία στόχος οδηγώντας σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Στον τύπο SRM (ή MRM) παρακολουθείται μια συγκεκριμένη αντίδραση ή ομάδα αντιδράσεων, όπως η αντίδραση θραυσματοποίηση ενός ιόντος. Στην περίπτωση αυτή παρακολουθείται συγκεκριμένος αριθμός μητρικών / θυγατρικών ιόντων, επιτρέποντας γρήγορη σάρωση και υψηλή εκλεκτικότητα. Οποιαδήποτε παρεμποδίζουσα ουσία θα πρέπει να σχηματίσει όχι μόνο ένα μητρικό ιόν του ίδιου λόγου m/z με την ουσία στόχο, αλλά θα πρέπει να διασπαστεί και να σχηματίσει και τα ίδια θυγατρικά ιόντα. Επίσης, το υπόβαθρο θορύβου είναι πολύ χαμηλό, άρα ένα συγκεκριμένο σήμα αντιστοιχεί σε πολύ υψηλότερη ανιχνευσιμότητα, αυξάνοντας ιδιαίτερα την ευαισθησία της μεθόδου. Η σάρωση θυγατρικών ιόντων πραγματοποιείται σε δύο στάδια ανάλυσης. Στο πρώτο στάδιο, ιόντα με συγκεκριμένο λόγο m/z εισέρχονται στο τετράπολο Q1. Στη συνέχεια, τα επιλεγμένα ιόντα m/z εισέρχονται στο τετράπολο Q, όπου υπόκεινται σε διάσπαση σχηματίζοντας θυγατρικά ιόντα. Τα θυγατρικά ιόντα μπορούν να παραχθούν με αποσύνθεση μετασταθών ιόντων ή με αλληλεπιδράσεις με αέριο αργό. Τα σχηματιζόμενα ιόντα εισέρχονται στο τετράπολο Q3 για το δεύτερο στάδιο ανάλυσης. Το φάσμα μαζών που προκύπτει δείχνει τα θυγατρικά ιόντα που παρήχθησαν από τη θραυσματοποίηση του επιλεγμένου μητρικού ιόντος. Ο τύπος αυτός σάρωσης παρέχει πληροφορίες για τη δομή μιας ουσίας και χρησιμοποιείται για την εξέταση πολύπλοκων οργανικών μιγμάτων (π.χ. βιολογικά δείγματα) υστερεί όμως λόγω της αργής σάρωσης, με αποτέλεσμα να μην ευνοείται η εφαρμογή του σε ποσοτικές αναλύσεις. Η σάρωση μητρικού ιόντος πραγματοποιείται σε δύο στάδια ανάλυσης. Στο πρώτο στάδιο, τα ιόντα που παράγονται στην πηγή εισέρχονται στο τετράπολο Q1 που λειτουργεί σε σάρωση. Στη συνέχεια, τα ιόντα εισέρχονται στο τετράπολο Q, όπου υπόκεινται σε διάσπαση σχηματίζοντας θυγατρικά ιόντα. Το τετράπολο Q3 στο δεύτερο στάδιο ανάλυσης επιτρέπει μόνο σε θυγατρικά συγκεκριμένου λόγου m/z να εξέλθουν από τον ανιχνευτή. Το φάσμα μαζών που προκύπτει δείχνει τα μητρικά ιόντα που διασπάστηκαν για την παραγωγή του επιλεγμένου θυγατρικού ιόντος. Ο τύπος αυτός σάρωσης μπορεί να 0

χρησιμοποιηθεί για μελέτες σχετικά με τη δομή και τη θραυσματοποίηση μιας ουσίας [, 4, 5]. Σχήμα 1.10 Απεικόνιση των διαφόρων τύπων σάρωσης [5]. 1

1.5.4. Παγίδα ιόντων (Ion Trap) Η παγίδα ιόντων λειτουργεί με τη δημιουργία τρισδιάστατου πεδίου στο οποίο παγιδεύονται τα προσδιοριζόμενα ιόντα και εστιάζονται σε ένα επίπεδο. Τα ιόντα ουσιαστικά περιορίζονται από ηλεκτρομαγνητικό πεδίο τεσσάρων πόλων [δύο ημικυλινδρικά ηλεκτρόδια (ring electrode) και δύο ελάσματα (end cap). Τα εισερχόμενα ιόντα κυκλοφορούν στον τρισδιάστατο χώρο που ορίζεται από τα τέσσερα ηλεκτρόδια και εστιάζονται στο επίπεδο που ορίζεται από τον ανιχνευτή και το πλέγμα ιοντισμού. Στη συνέχεια εφαρμόζεται δυναμικό ραδιοσυχνότητας που αυξάνει γραμμικά προσφέροντας αυξανόμενη κινητική ενέργεια στα ιόντα. Όλα τα ιόντα του ίδιου φορτίου λαμβάνουν την ίδια ενέργεια, αλλά ιόντα μικρού m/z επιταχύνονται περισσότερο σε σχέση με τα βαρύτερα ιόντα. Ως αποτέλεσμα τα μικρότερα ιόντα αρχίζουν να ξεφεύγουν από την παγίδα και να οδηγούνται στον ανιχνευτή και ακολουθούν τα μεγαλύτερα ιόντα ανάλογα με τη μάζα τους, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.11. Σχήμα 1.11 Παγίδα Ιόντων [6]. Οι παγίδες ιόντων είναι μικρά συμπαγή όργανα που μπορούν να εφαρμοσθούν άμεσα και να δώσουν ικανοποιητικά αποτελέσματα για αναλύσεις μαζών έως 1.000 dalton. Η διαχωριστική τους ικανότητα περιορίζεται κάτω της τιμής των 10.000, είναι όμως οικονομικά και αξιόπιστα όργανα που λειτουργούν πολύ ικανοποιητικά ως ανιχνευτές αέριας και υγρής χρωματογραφίας. Η παγίδα ιόντων προσφέρει πολύ μεγάλες δυνατότητες λειτουργίας MS/MS και γι αυτό το λόγο βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στη βιοανάλυση πεπτιδίων-νουκλεοτιδίων [, 6].

1.5.5. Αναλυτής χρόνου πτήσης (Time of Flight, TOF) Στον αναλυτή χρόνου πτήσης (TOF), ο λόγος m/z ενός ιόντος προσδιορίζεται με μέτρηση του χρόνου της πτήσης του. Τα ιόντα σχηματίζονται σε ακροσωλήνα σε υψηλό δυναμικό ή με βομβαρδισμό με ιόντα ή με το συνδυασμό MALDI. Στη συνέχεια τα ιόντα επιταχύνονται προς γειωμένο μεταλλικό πλέγμα και περνώντας από διατάξεις εστίασης (Ion Lens) εισέρχονται σε (ελεύθερο πεδίου) ευθύγραμμο σωλήνα μήκους D. Επειδή τα ιόντα επιταχύνονται κάτω από το ίδιο δυναμικό, θα προσλάβουν την ίδια Ε κιν, η οποία δίνεται από τον τύπο 1.5: Ε κιν =1/ (m/z)u (1.5) όπου: U, η ταχύτητα με την οποία τα ιόντα κινούνται στον ελεύθερο πεδίου σωλήνα. Κατά την κίνησή τους στο σωλήνα, τα ιόντα διαχωρίζονται στο χώρο σε ομάδες που κινούνται με διαφορετική ταχύτητα χαρακτηριστική του m/z και τελικά ανιχνεύονται στο τέλος της διαδρομής, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.1. Η διαφορά του χρόνου από τη στιγμή του ιοντισμού έως την ανίχνευση ενός ιόντος δίνει το χρόνο πτήσης, ο οποίος μετράται για τον προσδιορισμό του m/z από τις παρακάτω εξισώσεις: m 1/ t = ( ) D (1.6) ze και τελικά m t = (1.7) z E( ) D Τυπικοί χρόνοι πτήσης των ιόντων είναι 1-30 μs (H + 1.58 μs, N + 8.37 μs, Xe + 18.17 μs). Επομένως είναι απαραίτητη η χρήση ταχύτατων ηλεκτρονικών συστημάτων μέτρησης του χρόνου και συλλογής πληροφοριών. 3

Σχήμα 1.1 Reflector TOF Αναλυτής Μαζών [3]. Η διαχωριστική ικανότητα γραμμικών TOF αναλυτών είναι σχετικά περιορισμένη, αλλά βελτιώνεται στα όργανα ανάκλασης. Παρέχουν τη δυνατότητα ανάλυσης ευπαθών μορίων και μεγαλομορίων χωρίς περιορισμό λόγω του μεγέθους του μορίου (πεπτίδια, πρωτεΐνες, DNA, πολυσακχαρίτες, πολυμερή κλπ). Ο συνδυασμός MALDI-TOF είναι ένα πανίσχυρο όργανο που έχει αλλάξει τα δεδομένα στην ανάλυση μεγαλομορίων. Πρωτεΐνες, πεπτίδια, ολιγονουκλεοτίδια, πολυμερή των οποίων ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους ήταν μια επίπονη διαδικασία, αναλύονται με χρήση MALDI-TOF σε μίγματα ή σε πραγματικά δείγματα και γίνεται προσδιορισμός μοριακών βαρών. Η σημασία των δυνατοτήτων αυτών για τη σύγχρονη διαγνωστική, αλλά και τη χημεία των μεγαλομορίων είναι πολύ μεγάλη. Η εκμετάλλευση των πλεονεκτημάτων αυτών είναι ακόμα σε εξέλιξη. Ο προσδιορισμός τόσο υψηλών σχετικών μοριακών μαζών σε τόσο περίπλοκα δείγματα είναι κάτι που μόνο η συγκεκριμένη τεχνική μπορεί να επιτύχει. Στην ανάλυση μεταβολιτών και ιδιαίτερα με τη μη στοχευμένη προσέγγιση αυτής, σημαντικής αποδοχής έτυχε ο αναλυτής χρόνου πτήσης σε συνδυασμό με τετράπολο (Q- TOF). Η υψηλή απόδοση του αναλυτή αυτού τόσο σε πειράματα MS όσο και MS/MS καθώς και η δυνατότητα χρήσης πηγών ιοντισμού, όπως APCI και ESI, τον κατέστησαν αρκετά δημοφιλή. Αρχικά είχε σχεδιαστεί για ανάλυση πεπτιδίων, αλλά γρήγορα 4

χρησιμοποιήθηκε σε ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών που εκτείνεται από τη νάνο-ανάλυση βιολογικών δειγμάτων μέχρι και τη φαρμακευτική ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Η υψηλή ακρίβεια και ευαισθησία που απέδειξε σε συνδυασμό με την εύκολη λειτουργία για επιστήμονες με εμπειρία στην ενόργανη ανάλυση με αναλυτές μαζών τριπλού ή απλού τετραπόλου(qqq, Q) οδήγησαν στη γρήγορη διάδοσή του. Οργανολογικά ο αναλυτής μαζών Q-TOF μπορεί να θεωρηθεί ως η προσθήκη ενός τετραπόλου σε ένα TOF ή ως η αντικατάσταση του Q3 ενός τριπλού τετραπόλου με ένα TOF, (σχήμα 1.13). Tα συγκριτικά πλεονεκτήματα (ευαισθησία, ακρίβεια, διακριτική ικανότητα) σε σχέση με το Q ή QQQ για σάρωση MS και ΜS/MS δεν υφίστανται στην περίπτωση σάρωσης παρακολούθησης πολλαπλής αντίδρασης MRM και σάρωσης neutral loss. Σχεδιάστηκε για ποιοτικές αναλύσεις, σύντομα όμως επεκτάθηκε και σε ποσοτικούς προσδιορισμούς. Ακόμη και σήμερα που η μέγιστη ευαισθησία στην ανάλυση ενός συγκεκριμένου ιόντος επιτυγχάνεται με QQQ, η αυξανόμενη ειδικότητα των υψηλής διακριτικής ικανότητας QqTOF οργάνων, συχνά παρέχει καλύτερη αναλογία σήματοςθορύβου (S/N) σε πολλές εφαρμογές. Σχήμα 1.13 Απεικόνιση αναλυτικής διάταξης UPLC-Q-TOF και οργανολογίας Q-TOF [3]. Η ευρεία αποδοχή του συνδυασμού QqTOF έχει σημαντικά προαχθεί και από την ταχεία ανάπτυξη συστημάτων ημιαυτόματου ελέγχου και επεξεργασίας δεδομένων, αλλά και από τη συνεχή βελτίωση των βασικών χαρακτηριστικών της φασματομετρίας μαζών (διακριτική ικανότητα και ευαισθησία). Η σύζευξη με νέες πηγές ιοντισμού (MALDI) διεύρυναν ακόμη περισσότερο το πεδίο των εφαρμογών του [,3]. 5

1.5.6. Υβριδικός αναλυτής Orbitrap O υβριδικός αναλυτής Orbitrap είναι συνδυασμός γραμμικής και ηλεκτροστατικής παγίδας ιόντων. Πρόκειται για καινοτόμο αναλυτή μαζών που κατασκεύασε η Thermo Electron παρουσιάζοντας το σύστημα LTQ Orbitrap, σχήμα 1.14. Σχήμα 1.14 Απεικόνιση αναλυτικής διάταξης LTQ Orbitrap [7]. O αναλυτής μαζών είναι τεχνολογίας τροχιακής παγίδας ιόντων (Orbitrap Analyzer). Προσφέρει υψηλή ευαισθησία, διαχωριστική ικανότητα, ακρίβεια μάζας, δυναμικό εύρος και υψηλή σταθερότητα. Είναι ιδανικός για ανάλυση μεταβολιτών και αγνώστων ενώσεων. H ακρίβεια μάζας φτάνει το 3 ppm με εξωτερική βαθμονόμηση του οργάνου και το 1 ppm με εσωτερική βαθμονόμηση. Η διακριτική ικανότητα είναι 60.000 σε m/z 400 με ταχύτητα σάρωσης 1 Hz και φτάνει μέχρι και 100.000. Η δυναμική περιοχή είναι μεγαλύτερη από 4.000 σε μια σάρωση διατηρώντας την επιλεχθείσα ακρίβεια μάζας. Το εύρος μάζας κυμαίνεται από 50-.000 amu και από 00-4.000 amu. Η ευαισθησία φτάνει και σε επίπεδα fmol σε πεπτίδια. Ο αναλυτής τροχιακής παγίδας ιόντων διαθέτει: Πολυπολικούς φακούς μεταφοράς ιόντων υπό υψηλό κενό. Κελί θραυσματοποίησης με άζωτο (C-Trap). 6